Text
                    УДК 612-083(075.8)
ББК 28.074я73
К55
Рецензенты:
декан медико-профилактического факультета
Московской медицинской академии им. М. С. Сеченова,
д-р мед. наук, профессор Ю. В. Несвижский',
профессор кафедры клинической иммунологии
Московского государственного медико-стоматологического университета,
декан биомедицинского факультета Университета мировой политики и права,
д-р мед. наук С. В. Сучков
Перевод и научное редактирование организованы
филологическим факультетом Санкт-Петербургского государственного университета
Койко Р.
К55 Иммунология : учебное пособие / Р. Койко, Д. Саншайн, Э. Бенджамини; пер. с англ. А. В. Ка-
маева, А. Ю. Кузнецовой под ред. Н. Б. Серебряной. — М. : Издательский центр «Академия», 2008. —
368 с.
ISBN 978-5-7695-4104-9 (рус.)
ISBN 0-471-22689-0 (англ.)
На базе новейших достижений в области биологии и медицины изложены теоретические основы иммунологии.
Рассмотрены важнейшие вопросы развития и функционирования иммунной системы, механизмы врожденного и при-
обретенного иммунитета. Дана характеристика реакций гиперчувствительности. Отдельная глава посвящена иммуноде-
фицитным расстройствам. Рассмотрена проблема трансплантации и выживания трансплантата Приведены сведения об
иммунологии опухолей. Рассказано об иммунизации Приведен словарь терминов, в приложении дан перечень основ-
ных CD-маркеров
Для студентов высших учебных заведений, обучающихся по медицинским, биологическим и ветеринарным специ-
альностям.
УДК 612-083(075.8)
ББК 28.074я73
Оригинал-макет данного издания является собственностью
Издательского центра «Академия», и его воспроизведение любым способом
без согласия правообладателя запрещается
Все права защищены. Авторизованный перевод с английского языка издания,
опубликованного издательством «John Wiley & Sons, Inc.»
© 2003 by John Wiley & Sons, Inc. All Right Reserved
ISBN 978-5-7695-4104-9 (рус.)	© Камаев А.В., Кузнецова А. Ю., перевод на русский язык, 2008
ISBN 0-471-22689-0 (англ.)	© Издание на русском языке, оформление Издательский центр «Академия», 2008

ОГЛАВЛЕНИЕ Предисловие.................................11 Об авторах..................................12 Консультанты................................13 Предисловие к пятому изданию................14 Предисловие к четвертому изданию............16 Предисловие к третьему изданию..............17 Предисловие ко второму изданию..............18 Предисловие к первому изданию...............19 • Глава 1. Вступление и обзор...............21 Введение.................................21 Общий обзор..............................22 Врожденный и приобретенный иммунитет....22 Активная, пассивная и адоптивная иммунизация..............23 Характеристики приобретенного иммунного ответа................................23 Клетки, участвующие в приобретенном иммунном ответе.......................24 Клонально-селекционная теория.........24 Гуморальный и клеточный иммунитет.....26 Клеточно-опосредованный иммунитет.....27 Проявление разнообразия в иммунном ответе.....................28 Успехи иммунологии....................29 Повреждающие эффекты иммунного ответа......................29 Регуляция иммунного ответа............30 Будущее иммунологии ..................30 • Глава 2. Элементы врожденного и приобретенного иммунитета.................32 Введение.................................32 Врожденный иммунитет.....................32 Физические и химические барьеры.......32 Клеточная защита......................34 Фагоцитоз и внеклеточный киллинг......34 Клетки, участвующие в работе врожденной иммунной системы......................35 Воспаление............................37 Лихорадка.............................39 Биологически активные вещества........39 Рецепторы, входящие в систему врожденного иммунитета............................39 Адаптивный (приобретенный) иммунитет.....40 Клетки и органы, вовлеченные в адаптивный иммунный ответ..............40 Лимфатические органы..................41 Рециркуляция лимфоцитов..................45 Судьба антигена после пенетрации..........................45 Взаимодействие между врожденным и приобретенным иммунитетом.................47 • Глава 3. Иммуногены и антигены............49 Введение..................................49 Условия появления иммуногенности..........49 Чужеродность..........................49 Большая молекулярная масса............50 Сложная химическая структура..........50 Способность разрушаться...............51 Гаптены...............................51 Другие условия появления иммуногенности..52 Первичный и вторичный ответы..............52 Антигенность и антигенсвязываюший участок ....53 Эпитопы, распознаваемые В- и Т-клетками...53 Основные классы антигенов.................55 Связывание антигена с антигенспецифичными антителами или Т-клетками.................55 Перекрестная реактивность.................56 Адъюванты.................................56 • Глава 4. Структура антител и их функции...60 Введение..................................60 Обнаружение антител и определение их характеристик..........................61 Структура легких и тяжелых цепей..........61 Домены....................................63 Шарнирная область.........................64 Вариабельная область......................64 Варианты иммуноглобулинов.................65 Изотипы...............................65 Аллотипы..............................65 Идиотипы..............................66 Структурные свойства IgG .................67 Биологические свойства IgG................69 Агглютинация и формирование преципитата...........................69 Прохождение через плаценту и абсорбция у новорожденных.......................69 Опсонизация...........................70 Антителозависимая клеточно-опосредованная цитотоксичность.......................70 Активация комплемента.................70 Нейтрализация токсинов................71 Иммобилизация бактерий................71 Нейтрализация вирусов.................71 Структурные свойства IgM..................71
6 ОГЛАВЛЕНИЕ Биологические свойства IgM...............72 Агглютинация..........................72 Изогемагглютинация....................72 Структурные и биологические свойства IgA.72 Действие IgA при инфекциях слизистых оболочек..............................74 Бактерицидная активность..............74 Противовирусная активность............74 Структурные и биологические свойства IgD..74 Структурные и биологические свойства IgE.74 Важность IgE при паразитарных инфекциях и реакциях гиперчувствительности......74 Кинетика образования антител после иммунизации..............................75 Первичный иммунный ответ..............75 Вторичный иммунный ответ..............75 Суперсемейство иммуноглобулинов..........76 • Глава 5. Взаимодействия антигенов с антителами. Иммунологические исследования и экспериментальные системы ....79 Введение.................................79 Взаимодействия антиген — антитело........79 Первичные взаимодействия между антителом и антигеном .............................81 Константа ассоциации..................81 Аффинность и авидность................81 Вторичные взаимодействия между антителами и антигенами ............................82 Реакции агглютинации .................82 Реакции преципитации..................84 Иммунологические исследования............86 Иммунологические исследования с прямым связыванием...........................86 Твердофазные иммунологические исследования..........................88 Иммунофлуоресценция......................89 Прямая иммунофлуоресценция............89 Непрямая иммунофлуоресценция..........89 Методы сортировки клеток, меченных флуорохромами............................89 Иммуноабсорбция и иммуноадсорбция........91 Исследования с использованием клеток.....91 Методы для оценки функций лимфоцитов ....91 Исследования пролиферации Т- и В-клеток ....91 Продукция антител В-клетками..........92 Исследования эффекторных Т-клеток и натуральных киллеров................92 Клеточные культуры ......................92 Первичные культуры клеток и клонируемые клеточные линии лимфоцитов............92 В-клеточные гибриды и моноклональные антитела..............................93 Т-клеточные гибридомы ................94 Молекулы и рецепторы, полученные методами генной инженерии.............95 Экспериментальные модели на животных.....95 Инбредные линии.......................95 Адоптивный перенос и пассивная иммунизация...........................96 Мыши с тяжелым комбинированным иммунодефицитом.......................96 Тимэктомированные и бестимусные мыши ...96 Трансгенные мыши и манипуляции с генами...96 Трансгенные мыши.......................96 Мыши с «нокаутными» генами.............97 Анализ экспрессии генов...................97 Микромассивы в исследовании экспрессии генов.......................97 • Глава 6. Генетическая основа структуры антител....................................101 Введение.................................101 Краткое описание структуры и экспрессии неиммуноглобулиновых генов ..............101 Генетические изменения при синтезе цепей 1g.................................103 Организация и реаранжировка генов легкой цепи...........................103 Организация и реаранжировка генов тяжелой цепи .........................105 Регуляция экспресии генов 1g..........106 Переключение класса или изотипа..........106 Обеспечение разнообразия антител.........107 Наличие множества V-генов в зародышевой линии.................................107 VJ- и VDJ-комбинаторная ассоциация....108 Случайный выбор тяжелых и легких цепей.... 108 Разнообразие межсегментных соединений и вставки нуклеотидов.................108 Соматический гипермутагенез...........108 Конверсия соматических генов..........108 Редактирование рецепторов.............109 • Глава 7. Биология В-лимфоцита...........112 Введение.................................112 Места ранней дифференцировки В-клеток....112 Онтогенез В-лимфоцитов...................113 Начальные фазы дифференцировки В-клеток: про- и пре-В-клетки.........113 Незрелые В-клетки.....................114 Зрелые В-клетки.......................115 Анатомическое распределение В-клеток..117 В-1-клетки............................117 Мембранные белки В-клеток................117 Антигенсвязывающие молекулы: мембранный иммуноглобулиновый рецептор..............................118 Передача сигналов молекулами, ассоциированными с мембранным иммуноглобулиновым рецептором.........118 Молекулы, участвующие во взаимодействиях Т- и В-клеток......118 • Глава 8. Биология Т-лимфоцитов..........121 Введение.................................121 Природа антигенспецифичного Т-клеточного рецептора...................121 Молекулы, взаимодействующие с антигеном...........................121 Корецепторные молекулы................123 Комплекс Т-клеточного рецептора.......123
ОГЛАВЛЕНИЕ 7 Другие важные молекулы, экспрессируемые на поверхности Т-клетки...............124 Гены, кодирующие Т-клеточные рецепторы....................126 Разнообразие Т-клеточных рецепторов......127 Дифференцировка Т-клеток в тимусе........127 Взаимодействие тимоцитов с тимическими нелимфоидными клетками...................127 Реаранжировка генов Т-клеточных рецепторов .... 128 Тимическая селекция......................129 Позитивная селекция...................129 Негативная селекция...................129 Роль пептидов в тимической селекции ..130 Характеристики Т-клеток, покидающих тимус.................................130 • Глава У. Роль главного комплекса гистосовместимости в формировании иммунного ответа.........................133 Введение.................................133 Гены МНС и их продукты...................133 Номенклатура..........................133 Варианты экспрессии молекул МНС в разных клетках......................134 Вариабельность генов и продуктов МНС.....135 Генетический полиморфизм..............135 Кодоминантная экспрессия..............135 Структура молекул МНС....................136 Структура молекул МНС I класса........136 Структура молекул МНС II класса ......138 Функционирование молекул МНС: процессинг и презентация антигена...................140 Ответы на экзогенные антигены: образование комплексов молекула МНС II класса — пептид.......140 Эндогенные антигены: образование комплексов молекула МНС I класса —пептид..................142 Другие пути процессинга и презентации антигенов.............................142 Какие антигены запускают ответ каких Т-клеток?.............................144 Связывание молекулами МНС пептидов. полученных из собственных молекул.....145 Неспособность отвечать на антиген.....145 Различия в молекулах МНС: связь МНС с устойчивостью или восприимчивостью к заболеваниям...........................146 Другие гены области МНС..................146 • Глава 10. Активация и функционирование Т- и В-клеток..............................149 Введение.................................149 Активация СП4+-Т-клеток..................149 Специализированные клетки, представляющие антиген Т-клеткам......149 Парные взаимодействия на поверхности АПК и СО4+-Т-клетки...................151 Иммунологический синапс...............152 Межклеточные события при активации СЭ4+-Т-клетки.........................152 Роли В7 —CD28 и В7 —CD152 в активации Т-клеток.............................154 Другие пути активации Т-клеток...........155 Суперантигены........................156 Растительные белки и антитела к поверхностным молекулам Т-клеток...156 Липиды...............................156 Функции Т-клеток ........................156 Субпопуляции СD4+-Т-клеток, отличающиеся по выделяемым цитокинам ... 157 Т — В-кооперация.....................159 Функции СП8+-Т-клеток....................160 Активация СО84-Т-клеток..............160 Уничтожение СЭ8+-Т-клетками клеток-мишеней.......................162 Окончание иммунного ответа: индукция клеток памяти........................163 Функции В-клеток при отсутствии помощи Т-клеток.................................164 Внутриклеточные механизмы активации В-клеток.............................164 Модуляция сигнала от BCR.............166 • Глава 11. Цитокины......................170 Введение.................................170 История цитокинов........................171 Общие свойства цитокинов.................171 Общие функциональные свойства........171 Общая системная активность...........172 Общие клеточные источники и каскадность событий..............................172 Общие рецепторные молекулы...........173 Функциональные группы цитокинов.........174 Цитокины, регулирующие иммунный ответ................................174 Цитокины, поддерживающие врожденные иммунные реакции и активирующие воспалительный ответ.................176 Хемокины — цитокины, активирующие движение лейкоцитов..................177 Цитокины, стимулирующие гемопоэз.....179 Рецепторы цитокинов......................179 Семейства цитокиновых рецепторов.....179 Общая у-цепь.........................181 Передача сигнала через цитокиновый рецептор.................................181 Роль цитокинов и цитокиновых рецепторов при заболеваниях.........................182 Синдром токсического шока............182 Бактериальный септический шок........182 Онкологические заболевания...........182 Аутоиммунные и другие иммуноопосредованные заболевания ....182 Терапевтическое и диагностическое применение цитокинов и цитокиновых рецепторов.......183 Ингибиторы цитокинов/Антагонисты.....183 Коррекция клеточных иммунодефицитов .... 184 Лечение иммунодефицитов..............184 Лечение онкологических больных и пациентов, перенесших трансплантацию... 184 Лечение астмы и аллергических заболеваний..........................185
8 ОГЛАВЛЕНИЕ • Глава IX. Толерантность и аутоиммунитет............................188 Введение................................188 Центральная толерантность...............188 Механизмы обеспечения аутотолерантности....................189 Анергия, редактирование рецепторов, делеция и клональное игнорирование...189 Периферическая толерантность............191 Взаимодействие Fas — FasL...............191 Регуляторные/супрессорные Т-клетки......192 Оральная толерантность..................193 Иммунопривилегированные области ........194 Аутоиммунитет и заболевания.............194 Критерии определения аутоиммунного заболевания..........................195 Причины аутоиммунного заболевания....195 Примеры аутоиммунных заболеваний.....198 Аутоиммунные заболевания, при которых доминирующую роль в поражении органа играют антитела......................198 Аутоиммунные заболевания, при которых Т-клетки играют доминирующую роль в повреждении органов................202 Аутоиммунные заболевания, возникающие в связи с дефицитом компонентов комплемента..........................205 Методы лечения.......................205 • Глава 13. Комплемент....................209 Введение................................209 Пути активации комплемента..............209 Классический путь....................210 Лектиновый путь......................210 Альтернативный путь..................210 Активация СЗ и С5....................212 Терминальный путь....................212 Регуляция активности комплемента........213 Биологические эффекты комплемента.......215 Образование опсонинов................215 Образование анафилатоксинов..........216 Лизис клеток.........................217 Усиление ответа В-лимфоцитов на антигены..........................217 Контроль за формированием и удалением иммунных комплексов..................218 Удаление мертвых и погибающих клеток...............................218 Реакции на вирусы....................218 Недостаточность комплемента.............219 • Глава 14. Реакции гиперчувствительности: реакции, опосредованные антителами (I тип).....................................223 Введение.................................223 Определение гиперчувствительности по Джеллу и Кумбсу......................223 Общие характеристики аллергических реакций.................................224 Фаза сенсибилизации.....................224 Зависимость продукции антител IgE от Тн2-клеток........................224 Фаза активации ..........................225 Эффекторная фаза.........................227 Пред существующие медиаторы..........228 Вновь синтезируемые медиаторы........228 Клинические аспекты аллергических реакций..................................231 Аллергический ринит..................231 Пищевая аллергия ....................231 Атопический дерматит.................231 Астма................................232 Клинические методы выявления аллергена. Особенности терапии...........232 Выявление аллергена..................232 Особенности терапии..................233 Защитная роль IgE........................235 • Глава 15. Реакции гиперчувствительности: реакции, опосредованные антителами (II тип), и реакции, обусловленные иммунными комплексами (III тип).......................239 Введение...................................239 Цитотоксические реакции: гиперчувствительность II типа..........239 Реакции, опосредованные комплементом .... 239 Антителозависимая клеточно-опосредованная цитотоксичность ...239 Опосредованные антителами нарушения функции клеток........................241 Примеры цитотоксических реакций гиперчувствительности ....................241 Трансфузионные реакции................241 Реакции, вызванные лекарственными средствами............................241 Реакции при резус-конфликте ..........241 Аутоиммунные реакции с вовлечением рецепторов клеточных мембран..........242 Аутоиммунные реакции с вовлечением детерминант других клеточных мембран..242 Реакции, обусловленные иммунными комплексами: гиперчувствительность III типа ...242 Системное заболевание, вызванное иммунными комплексами.................243 Локализованная болезнь иммунных комплексов............................246 • Глава 10. Реакции гиперчувствительности: опосредованная Т-клетками гиперчувствительность замедленного типа (IV тип)...................................249 Введение...................................249 Общие характеристики и патофизиология гиперчувствительности замедленного типа....249 Механизмы гиперчувствительности замедленного типа.......................249 Последствия гиперчувствительности замедленного типа.......................251 Примеры гиперчувствительности замедленного типа..........................251 Контактная гиперчувствительность........251
ОГЛАВЛЕНИЕ 9 Гранулематозная гиперчувствительность....253 Реакция гиперчувствительности туберкулинового типа....................253 Отторжение аллотрансплантата.............254 Другие примеры гиперчувствительности замедленного типа.......................254 Лечение гиперчувствительности замедленного типа........................................255 • Глава 1 /. Иммунодефицитные расстройства и новообразования лимфоидной системы..........................258 Введение..................................258 Синдромы иммунного дефицита...............259 Синдромы первичного иммунодефицита....260 Вторичные иммунодефицитные заболевания...........................272 Синдром приобретенного иммунодефицита.....273 Общая характеристика и эпидемиология..273 Вирус иммунодефицита человека.........273 Клиническое течение...................275 Профилактика, контроль, диагностика и терапия ВИЧ-инфекции................277 Новообразования лимфоидной системы........279 В-клеточные новообразования...........280 Т-клеточные новообразования...........283 Лимфома Ходжкина (лимфогрануломатоз) ...285 Иммунотерапия.........................285 • Глава 18. Трансплантация.................289 Введение..................................289 Взаимоотношения между донором и реципиентом.............................289 Иммунные механизмы отторжения аллотрансплантата.........................291 Реакции на аллоантигены и отторжение аллотрансплантата.........................291 Сверхострое отторжение................291 Острое отторжение.....................292 Хроническое отторжение................292 Роль молекул МНС в отторжении аллотрансплантата.........................292 Механизм распознавания аллоантигена Т-клетками............................292 Роль цитокинов в отторжении аллотрансплантата.....................294 Лабораторные тесты, используемые при типировании ткани.....................294 Серологическое определение антигенов МНС ..................................294 Генотипирование МНС...................294 Реакция смешанной культуры лейкоцитов....295 Продление сроков выживания аллотрансплантата.........................296 Противовоспалительные лекарственные средства..............................296 Цитотоксические лекарственные средства ...297 Препараты, препятствующие продукции сигнальной функции цитокинов..........297 Иммуносупрессивная терапия антителами....298 Новые стратегии подавления иммунитета....298 Трансплантация костного мозга и гемопоэтических стволовых клеток......298 Реакции «трансплантат против хозяина»...299 Ксеногенная трансплантация..............300 Плод: неотторгаемый аллотрансплантат....300 Пересадка сердца: личное воспоминание...301 • Глава 19. Иммунология опухолей........304 Введение................................304 Опухолевые антигены.....................304 Виды опухолевых антигенов...............305 Продукты генов нормальных клеток.....305 Продукты мутантных клеточных генов...306 Опухолевые антигены, кодируемые онкогенами...........................307 Иммунологические факторы, влияющие на частоту возникновения рака........308 Эффекторные механизмы противоопухолевого иммунитета..............................309 В-клеточные ответы на опухоли........309 Клеточно-опосредованные реакции: прямое разрушение опухолевых клеток цитотоксическими Т-лимфоцитами.......309 Цитокины.............................311 Ограничение эффективности иммунного ответа на опухоли..............................312 Иммунодиагностика.......................313 Выявление миеломных белков, вырабатываемых опухолями из плазматических клеток.............313 Определение у-фетопротеина...........313 Раковоэмбриональный антиген..........314 Определение простатоспецифичного антигена.............................314 Опухолевый антиген 122...............314 Другие маркеры ......................314 Иммунопрофилактика опухолей.............314 Иммунотерапия...........................314 • Глава хи. Сопротивляемость к инфекционным заболеваниям и иммунизация..........................319 Введение...............................319 Защита организма от микробных патогенов.................321 Иммунитет к вирусам.................321 Иммунитет к бактериям...............323 Иммунитет к паразитам...............324 Иммунитет к грибам .................324 Механизмы, с помощью которых патогены избегают иммунного ответа..............325 Инкапсулированные бактерии..........325 Токсины.............................326 Суперантигены.......................326 Антигенное разнообразие.............326 Внутриклеточное выживание...........327 Подавление иммунной системы.........328 Внеклеточные ферменты...............328 Экспрессия белков, связывающих антитела ...328 Принципы иммунизации ..................328 Цели иммунизации.......................329
10 ОГЛАВЛЕНИЕ Активная иммунизация....................329 Рекомендуемая иммунизация............329 Вакцинация отдельных групп населения .329 Основные механизмы защиты...............331 Значимость первичного и вторичного ответов..............................331 Возраст и время иммунизации..........332 Необходимые меры предосторожности.......333 Место введения антигена..............333 Опасности............................334 Новые подходы к созданию вакцин.........335 Вакцины, разработанные с помощью рекомбинантных ДНК...................335 Конъюгированные полисахариды.........335 Вакцины из синтезированных пептидов...335 Антиидиотипические вакцины...........336 Вакцины на основе вируса-носителя....336 Вакцины на основе бактерии-носителя..336 ДНК-вакцины..........................336 Анатоксины..........................337 Пассивная иммунизация...................337 Пассивная иммунизация посредством переноса антител через плаценту..................337 Пассивная иммунизация через молозиво.337 Пассивная терапия с помощью антител и сывороточная терапия..............338 Моноклональные и поликлональные препараты...........................339 Изготовление иммунного сывороточного глобулина человека и его свойства...339 Показания к применению иммуноглобулина.....................340 Предосторожности при иммунотерапии...341 Колониестимулирующие факторы........341 Приложение Некоторые CD-антигены..........344 Словарь терминов..........................347
ПРЕДИСЛОВИЕ Предлагаемое учебное пособие «Иммуноло- гия» («Immunology. A Short Course»), предназна- ченное для студентов медицинских и биологи- ческих вузов, создано специалистами, которых объединяет не только направленность научных исследований, но и огромный педагогический опыт: многие годы они занимались преподава- тельской деятельностью на кафедрах микробио- логии и иммунологии или патологии различных университетов. А это не менее важно, чем опыт исследовательской работы. Именно педагогиче- ский опыт определил важнейшую установку учеб- ного пособия — приоритет понимания сути яв- лений и процессов над знанием фактического ма- териала. Отсюда основная тактика авторов: не столько углубиться в детали, сколько максималь- но доступно изложить материал. Все специалисты, читающие курсы лекций или пишущие учебники по иммунологии, встречают- ся с большими трудностями. Практически невоз- можно излагать материал однонаправлено, линей- но, потому что многие темы постоянно пересека- ются. Например, проявления врожденного имму- нитета нельзя исчерпывающе описать без анали- за влияния на него факторов адаптивного имму- нитета, невозможно рассказать об иммунологи- чески значимых клетках, не упоминая связанные с ними молекулы, и т.д. Остается путь, избран- ный авторами учебного пособия: сначала кратко рассказать обо всем, не вдаваясь в подробности, и тем самым ввести читателя в круг иммунологи- ческих идей и понятий, а затем проанализиро- вать их более детально и полно. Первые две главы учебного пособия как раз и являются таким введением. В них даны определе- ния основных понятий и обозначено фундамен- тальное разделение иммунитета на врожденный и приобретенный. Блок, посвященный фундаментальным основам иммунитета, образуют гл. 3—13. Сначала рассмат- риваются антигены, антитела, их взаимодействия, генетические основы разнообразия распознающих структур. При описании взаимодействия антиге- нов и антител читателей знакомят с иммунологи- ческими методами и базовыми экспериментальны- ми моделями. Далее перечислены основные типы лимфоцитов, молекулы главного комплекса гис- тосовместимости, цитокины, комплемент. Главы 14 — 20 посвящены преимущественно прикладным аспектам иммунологии (иммунопа- тологии, трансплантации, иммуноонкологии, им- мунизации). Особенностью данного блока явля- ется то, что в первую очередь рассматриваются проблемы иммунопатологии. Роли иммунитета в противоинфекционной защите и проблемам вак- цинации посвящена последняя глава учебного по- собия. В этом же блоке отражены проблемы транс- плантации и иммуноонкологии. Материал изложен доступным языком и без чрезмерной детализации. Отражены устоявшиеся факты и представления, принятые научным со- обществом. Все главы завершаются резюме, в ко- торых сконцентрированы наиболее принципиаль- ные положения. Также в конце глав приведены тесты и ситуационные задачи. Надеюсь, что данное учебное пособие поможет студентам постичь такую сложную дисциплину, как иммунология. Эта книга, безусловно, будет полез- на и преподавателям, поскольку многие изложен- ные вопросы в настоящее время рассматриваются только в оригинальной специальной литературе. Зав отделом клеточной иммунологии Института иммунологии Федерального медико-биологического агентства России. д-р мед. наук, профессор А.А.Ярилин
ОБ АВТОРАХ Ричард Койко (Richard Coico) — профессор, руководитель кафедры микробиологии и имму- нологии медицинского факультета Университета Нью-Йорка (CUNY). Последние 8 лет преподает курс микробиологии и иммунологии студентам- медикам, а также аспирантам и слушателям кур- сов помощников врачей Университета Нью-Йор- ка. Р.Койко является президентом Ассоциации кафедр микробиологии и иммунологии медицин- ских факультетов (AMSMIC) и возглавляет Ко- митет по обучению AMSM1C. В область его инте- ресов входят исследования (геномика и протео- мика), направленные на выявление эпитопов, экспрессируемых некоторыми человеческими па- тогенами, неупорядочено связывающимися с раз- личными аллелями МНС I класса. В лаборатории Р. Койко применяют методы компьютерной им- мунологии (биоинформатики) и создают базы дан- ных для изучения перспективных эпитопов, а так- же формируют базы знаний для обмена инфор- мацией. Джеффри Саншайн (Geoffrey Sunshine) — ве- дущий исследователь Кембриджского Института воздействия на здоровье, штат Массачусетс. Об- ласть его научных интересов включает исследо- вания биологического воздействия различных ве- ществ, загрязняющих воздух. Д. Саншайн препо- дает на кафедре патологии медицинского факуль- тета Университета Тафта. В течение нескольких лет он читал курс иммунологии аспирантам-сто- матологам зубоврачебного факультета Универси- тета Тафта, а до этого — студентам ветеринарно- го факультета Университета Тафта. Является чле- ном Саклеровской школы биомедицинских наук для аспирантов Университета Тафта. Д. Саншайн проводит исследования в области презентации антигена и преподает иммунологию студентам старших курсов и аспирантам. Эли Бенджамини (Eli Benjamini) — заслужен- ный профессор в отставке. Преподавал иммуно- логию аспирантам и студентам-медикам на кафед- ре медицинской микробиологии и иммунологии медицинского факультета Калифорнийского уни- верситета в Дейвисе. В течение 10 лет являлся председателем Программы по иммунологии для выпускников в кампусе Дейвиса, созданию кото- рой способствовал. В область его интересов вхо- дят иммунология белковых антигенов, механиз- мы иммунной регуляции и принципы создания синтетических вакцин.
КОНСУЛЬТАНТЫ Артуро Касадевалл (Arturo Casadevall), д-р медицины кафедра терапии Медицинского колледжа Альберта Эйнштейна (Бронкс, Нью-Йорк) Бетти Даймонд (Betty Daimond), д-р философии кафедра микробиологии и иммунологии Медицинского колледжа Альберта Эйнштейна (Бронкс, Нью-Йорк) Сьюзан Р. С. Готтесман (Susan R. S.Gottesman), д-р медицины, д-р философии кафедра патологии Университета штата Нью-Йорк, Бруклинский Центр исследований в области здравоохранения (Бруклин, Нью-Йорк) Линда Спате (Linda Spatz), д-р философии кафедра микробиологии и иммунологии медицинского факультета Университета Нью-Йорка (Нью-Йорк, Нью-Йорк)
ПРЕДИСЛОВИЕ К ПЯТОМУ ИЗДАНИЮ Пятое издание «Иммунологии» подтверждает нашу приверженность девизу «Многое в малом» (Less is тоге), который был нашим основным прин- ципом при работе над всеми предшествующими изданиями. В мире науки со времени публика- ции четвертого издания произошло множество со- бытий (определение последовательности челове- ческого генома, возникновение новых научных областей, таких как геномика, протеомика и био- информатика), и соблюдать этот принцип стано- вится все сложнее и сложнее. Помимо новой ин- формации мы постарались включить в книгу толь- ко то, что, как мы считаем, необходимо знать изу- чающему иммунологию. С момента публикации четвертого издания наши знания о том, как развивается и функцио- нирует иммунная система, а также о том, какие затрагивающие ее физиологические нарушения могут привести к заболеванию, значительно рас- ширились. Чтобы заключить результаты новых исследований в книгу, мы дополнили или пере- писали каждую главу пятого издания. Всю уста- ревшую информацию мы исключили. Например, вопросы толерантности и аутоиммунитета в но- вом издании объединены и обсуждаются в одной главе. Мы чрезвычайно признательны докторам Линде Спате и Бетти Даймонд, которые участво- вали в написании гл. 12 «Толерантность и ауто- иммунитет». Мы также хотели бы поблагодарить докторов Сьюзан Р.С. Готтесман и Артуро Каса- девалла, которые обновили главы «Иммунодефи- цитные расстройства и новообразования лимфо- идной системы» и «Сопротивляемость к инфек- ционным заболеваниям и иммунизация» соответ- ственно. Также мы хотели бы поблагодарить док- тора Джона П.Аткинсона (John Р.Atkinson), ра- ботающего на медицинском факультете Вашинг- тонского университета в Сент-Луисе, штат Мис- сури, за рецензирование полностью переработан- ной в данном издании главы по комплементу. Ричард Койко хотел бы выразить признатель- ность за любовь и постоянную поддержку со сто- роны его семьи во время написания этой книги: Лизе за ее вдохновляющее влияние, Джонатану (подающему надежды писателю) и Дженифер за их терпение и мягкий юмор. Особую благодар- ность он выражает коллегам, которые любезно поделились своим богатым научным опытом и дали много полезных рекомендаций для пятого издания: докторам Итану Шеваку (Ethan Shevach) и Дэвиду Маргулису (David Margulies) (Нацио- нальный институт здоровья), Ллойду Маеру (Lloyd Mayer) и Виере Лиме (Viera Lima) (медицинский факультет Университета Нью-Йорка). Наконец, Ричард Койко хотел бы выразить благодарность своим ныне покойным учителям — доктору Ро- берту А. Гуду (Robert A. Good) — основателю со- временной иммунологии, который приобщил его к иммунологическим экспериментам и исследо- ваниям природы защитных сил организма, а так- же доктору Дж. Жанетте Торбекк (G. Jeanette Thor- becke), которая во многом повлияла на его инте- рес к иммунологии. Джеффри Саншайн хотел бы поблагодарить Питера Бродеура (Peter Brodeur) (медицинский факультет Университета Тафта) за его помощь в подготовке данного издания. Он также благода- рен многочисленным друзьям и коллегам, кото- рые отвечали на возникающие вопросы, касаю- щиеся тех областей, в которых они специализи- руются, особенно Марку Эксли (Mark Exley), Поле Хокман (Paula Hochman) и Антонио да Сильва (Antonio da Silva). Кроме того, Д. Саншайн хотел бы поблагодарить свою жену Айлин и детей Кэро- лайн и Алекса за их постоянную поддержку и понимание. Он также благодарит Роберта А. Гуда за роль, которую тот сыграл в его становлении как ученого, когда Д. Саншайн работал научным сотрудником в Институте доктора Гуда в Нью- Йорке. Авторы благодарят сотрудников компании «John Wiley and Sons Inc.», которые помогли с публикацией пятого издания. Особую признатель- ность авторы выражают секретарям, референтам и другим сотрудникам издательства, которые по- могали в подготовке рукописи. «ИММУНОЛОГИЯ» НА ВЕБ-САЙТЕ Для студентов и преподавателей, пользующихся этой книгой при обучении, был создан веб-сайт (http://www.wiley.com/immuno-shortcourse.com). На сайте для изучения курса on-line используют универсальный управляющий инструмент — WebCT. На сайте размещены:
• оглавление; • информация об авторах; • образец главы; • все рисунки и таблицы, представленные в четвертом издании; • страница с пиктограммами с возможностью загружать клипартовые изображения; • наглядные и регулярно обновляемые таблицы CD-антигенов и цитокинов; • наглядный и регулярно обновляемый словарь терминов; • наглядный и регулярно обновляемый раздел вопросов и ответов; • ссылки на другие полезные веб-сайты. Авторы выбрали именно WebCT в качестве управляющего инструмента, поскольку он, несом- ненно, является лучшим в системе Интернет-обу- чения для высшей школы. Веб-сайт и его WebCT- сопровождение позволяют тем, кто пользуется пятым изданием «Иммунологии», адаптировать его для преподавания конкретного курса. Мы обязуемся регулярно обновлять веб-сайт в помощь преподавателям и студентам, использую- щим для самообразования Интернет-обучение. Первым и главным принципом обновления этого веб-сайта будет предоставление новейшей инфор- мации для обучения в области иммунологии в ясной, сжатой и удобной для студентов форме.
ПРЕДИСЛОВИЕ К ЧЕТВЕРТОМУ ИЗДАНИЮ Со времени третьего издания были проведены биомедицинские исследования, результаты кото- рых позволили понять многие вопросы, касаю- щиеся иммунной системы. Каждая глава четвер- того издания переработана, добавлены новые све- дения и убрана устаревшая информация. Напи- саны несколько новых глав, в том числе посвя- щенных цитокинам, резистентности к инфекци- онным заболеваниям и вакцинации. Кроме того, в гл. 5 добавлен новый подраздел, посвященный экспериментальным системам. Это особенно ак- туально, поскольку в биологии и медицине ис- пользуют разнообразные экспериментальные ме- тоды изучения иммунной системы, и важно для понимания сути иммунологии. Как и в первых трех изданиях, мы придержи- ваемся девиза «Многое в малом». Поэтому при подготовке данного издания нашей целью было предоставление самого необходимого для введе- ния в иммунологию материала в сжатой и легко усваиваемой форме. Дополнительную информа- цию для студентов и преподавателей этого курса можно также найти на веб-сайте. Мы глубоко признательны доктору Сьюзан Р.С. Готтесман, которая помогла в написании гла- вы «Иммунодефициты и другие дисфункции им- мунной системы». Мы также признательны док- тору Карен Я мага (Karen Yamaga), которая обно- вила главу, посвященную аутоиммунитету. Мы благодарим доктора Патрицию Гиклас (Patricia Giclas), внесшую изменения в главу, посвящен- ную комплементу, и доктора Артуро Касадевал- ла, добавившего новую главу, посвященную ре- зистентности к инфекционным заболеваниям и вакцинации. Ричард Койко хотел бы поблагодарить свою семью за любовь и поддержку. Их стойкость, вера и бесконечное терпение помогли в работе над книгой. Особая благодарность выражается тем, кто благородно поделился своими глубокими научны- ми знаниями и дал много полезных советов авто- рам четвертого издания: докторам Итану Шеваку и Дэвиду Маргулису (Национальный институт здоровья), Ллойду Маеру (Медицинская школа горы Синай), Лакшми Тамма (Lakshmi Tamma) и Линде Спате (медицинский факультет CUNY), Лорел Экхардт (Laurel Eckhardt) (Колледж Ханте- ра), Кетлин Барнс (Katheleen Barnes) (Медицин- ская школа Джона Хопкинса), Солдано Ферроне (Soldano Ferrone) (Институт памяти Розуэлла Пар- ка) и Хэрриет Робинсон (Harriet Robinson) (Уни- верситет Эмори). Наконец, Ричард Койко хотел бы выразить признательность своим учителям — докторам Рональду Курлею (Ronald Curley), Сью- зан Краун (Susan Krown), Роберту А. Гуду и Дж. Жанетте Торбекк, которые во многом повли- яли на его приверженность выбранному пути. Джеффри Саншайн хотел бы поблагодарить Питера Бродеура (медицинский факультет Уни- верситета Тафта) и Синди Теодос (Sindy Theodos) (ветеринарный факультет Университета Тафта) за их постоянную помощь во время подготовки дан- ного издания. Они отрецензировали главы как в третьем, так и в четвертом издании и помогли сделать материал доступным для неподготовлен- ного читателя. Он также благодарен своим друзь- ям и коллегам, которые отвечали на вопросы по областям, в которых являются специалистами, особенно Марку Эксли, Сьюзан Каллед (Susan Kalled) и Поле Хокман. Д. Саншайн хотел бы по- благодарить свою семью за постоянную поддерж- ку и понимание. Авторы благодарят сотрудников компании «John Wiley and Sons Inc.», которые помогли с публикацией четвертого издания. Особую призна- тельность авторы выражают секретарям, референ- там и другим сотрудникам издательства, которые помогали в подготовке рукописи. Наконец, мы хотим отметить большой вклад доктора Сиднея Лесковитца (Sidney Leskowitz) в подготовке первых изданий книги. Главы по ги- перчувствительности посвящаем его памяти.
ПРЕДИСЛОВИЕ К ТРЕТЬЕМУ ИЗДАНИЮ Со времени второго издания множество иссле- дований, проводимых учеными по всему миру, привели к новым открытиям, изменившим наше понимание многих аспектов деятельности иммун- ной системы. В связи с этим каждая глава данно- го издания была либо обновлена, либо перерабо- тана, включены новые сведения, исключена уста- ревшая информация. Как и в первом, и во втором изданиях, мы оста- лись привержены девизу «Многое в малом». Мы постарались представить вниманию читателей са- мый необходимый, по нашему мнению, материал в сжатой и легко усваиваемой форме. Именно чи- । атели и будут судить, удалось ли нам это. Мы глубоко признательны доктору Демосте - нису Паппагианису (Demosthenes Pappagianis), который помог в написании главы по иммунно- профилактике и иммунотерапии, и доктору Ка- рен Ямага, внесшей вклад в написание главы о механизмах контроля иммунного ответа и ауто- иммунитете. Мы хотим поблагодарить многих со- трудников и студентов, которые помогли в под- готовке первого и второго изданий, и всех тех, кто оказывал помощь в подготовке третьего изда- ния, в частности Роберта Дж. Сцибенски (Robert J.Scibienski), доктора медицинского факультета Калифорнийского университета в Дейвисе, и док- тора Донну М. Ренник (Donna М. Rennick) из Ин- ститута исследования ДНК, Пало Альто, Кали- форния. Джеффри Саншайн хотел бы поблаго- дарить многих своих друзей, которые терпеливо отвечали на его вопросы во время подготовки третьего издания, особенно Питера Бродеура, Марка Эксли и Полу Хокман. Д. Саншайн также хотел бы поблагодарить свою семью за постоян- ную помощь: Айлин за ее поддержку и участие в общем деле, а также Алекса и Кэролайн за их оптимизм. Свои главы он посвящает отцу Гар- ри, который не дожил до выхода в свет нового издания.
ПРЕДИСЛОВИЕ КО ВТОРОМУ ИЗДАНИЮ Авторам учебников по быстро развивающим- ся дисциплинам приходится постоянно пересмат- ривать старый материал и добавлять новый, ко- торый во время предыдущего издания еще не по- лучил достаточного подтверждения, а теперь стал важным фактом. Действительно, быстро развива- ющаяся область иммунологии требует постоян- ного пересмотра, что и явилось причиной данно- го переиздания. Во втором издании была расширена и обнов- лена информация о многих концепциях и откры- тиях. Были добавлены новые сведения и по та- ким вопросам, как молекулярная биология и гены, контролирующие синтез антител, а также пере- ключение изотипа, дифференциация Т-клеток и Т-рецепторов, процессирование и презентация антигенов, цитокины и лимфокины, новые тера- певтические подходы к лечению иммунодефицит- ных состояний и опухолей и новые аспекты в профилактике и иммунотерапии инфекционных заболеваний. Кроме того, мы добавили подраз- дел, посвященный СПИДу и некоторым методам, таким как Вестерблот и проточная флуоресцент- ная цитометрия. Мы также расширили глоссарий и добавили тесты и несколько подходящих ситуа- ционных задач. Хотя мы сократили и убрали несколько под- разделов, размер книги увеличился за счет рас- ширения и добавления некоторых тем. Однако мы заверяем читателей, что как и в первом издании, мы придерживаемся девиза «Многое в малом» и пытаемся представить принципы иммунологии в сжатой и легко усваиваемой форме. Изменения и дополнения являются постоян- ной «головной болью» авторов, пишущих о быстро развивающейся области науки. Студентам в связи с этим также приходится нелегко. Они должны быть готовы к осознанию того, что наука не сто- ит на месте и нужно постоянно стремиться по- знавать все новое. Пожелаем успеха и нам, и им.
ПРЕДИСЛОВИЕ К ПЕРВОМУ ИЗДАНИЮ С какой целью была написана эта книга? По- чему в то время, когда так много прекрасных до- ступных и отлично иллюстрированных книг, мы предлагаем вашему вниманию еще одну? Все очень просто и понятно. За те 40 лет, которые мы пре- подаем большому числу студентов различных спе- циальностей, мы убедились, что большинство учебных изданий не достигают своей цели Всякий, кто год за годом общается со студен- ыми, не может не знать о той нагрузке, которая южится на их плечи. Во время учебы они долж- ны освоить огромный объем материала по раз- ным дисциплинам, который постоянно расширя- йся. Любой студент может подтвердить вам, что каждый преподаватель рассматривает свой пред- мет как наиболее нужный, поэтому объем необ- ходимого материала все растет и растет. Другое наблюдение стало результатом много- 1сгних опросов студентов: многим из них действи- тельно не интересна иммунология! В то время как ня нас, практикующих иммунологов, эта дина- мично развивающаяся наука чрезвычайно интерес- на, для студентов иммунология — один из пяти- шести одновременно изучаемых предметов. Эта книга задумывалась в соответствии с выс- казыванием архитектора Миеса ван дер Роэ (Mies van der Rohe) «Многое в малом». В ней представ- лены в сжатой форме только самые необходимые сведения, чтобы каждый студент мог вынести ос- новные принципы иммунологии и благополучно изучить курс. Те же, кому нужны более глубокие знания и кто интересуется этой областью, могут найти более полные издания. В книге соблюдены основные правила изло- жения курса иммунологии. Она разделена на гла- вы, отвечающие по размеру и содержанию обыч- ным лекциям. В начале каждой главы приведено кратное вве- дение, а в конце резюме и тесты. Тесты составле- ны таким образом, чтобы студенты смогли оце- нить, насколько хорошо они изучили материал Ответы на тесты также направлены на приобре- тение дополнительных знаний. Новые термины выделены полужирным кур- сивом, поэтому их легко отыскать в тексте и за- помнить. Мы надеемся, что студенты, взявшие в руки эту книгу, не падут духом от огромного количе- ства информации, что часто случается при изуче- нии иммунологии, а наоборот, у них появится интерес к предмету и они выберут его для даль- нейшего изучения.
ОБОЗНАЧЕНИЯ CD45 Т-клеточный рецептор 1k Пептид МНС II класса Т-клеточный рецептор Клеточная мембрана ЦсВ154 Цитокин Цитокиновый рецептор Тирозинкиназа ZAP 70/Syk Тирозинкиназа семейства Src г Тирозинкиназа L цитоплазматического белка G-белок
Глава ВСТУПЛЕНИЕ И ОБЗОР • ВВЕДЕНИЕ Любой, кому посчастливилось услышать оркестр, блестяще исполняющий симфонию, сочиненную одним из великих композиторов, знает, что каж- 1ый из тщательно настроенных музыкальных ин- струментов вносит свою лепту в общий гармонич- ный звук, создаваемый музыкантами. Правильно настроенная иммунная система непрерывно ис- полняет оркестрованную симфонию для поддер- жания гомеостаза в целях защиты организма. Од- нако, как отметил Уильям Шекспир: «мы осла- бим струны — и сразу дисгармония возникнет» («Троил и Крессида»). Так и расстроенная иммун- ная система может создать диссонанс, проявляю- щийся аутоиммунитетом, злокачественными опу- холями или хроническим воспалением. К счастью ыя большинства из нас, иммунная система нахо- штся в постоянной готовности к настройке (ре- |улировке), чтобы обеспечить правильное пове- (ение ее клеточных компонентов и их симбиоти- ческое взаимодействие для организации защит- ных иммунных реакций в целях обеспечения хо- рошего здоровья. В своих глубоких исследованиях ученый Л.То- мас (£. Thomas), рассматривая симбиоз и парази- там, описал силы, которые превратили бы все живущее в огромный шар протоплазмы, не будь механизмов регуляции и распознавания, позво- ляющих отделять свое от чужого. Эти механиз- мы возникли на заре эволюции. Многие из них и шачально были маркерами, позволяющими клеткам распознавать друг друга, реагировать и и 1аимодействовать между собой для образования < имбиотического сообщества. Например, генети- чески родственные колонии губок, помещенные рн юм, будут стараться расти навстречу друг дру- гу и сольются в одну большую колонию. Нерод- 11 венные друг другу колонии будут реагировать иначе, уничтожая чужие клетки, вступившие контакт, и создавая полосу отчуждения между ко лониями. В мире растений существуют сходные спосо бы распознавания У самоопыляющихся видо пыльцевое зерно, попадая на рыльце генетиче ски родственного цветка, отправляет микроспо ру вниз по пестику, к завязи, для оплодотворе ния. Пыльцевое зерно от генетически нерод ственного растения либо не будет прорастать либо, уже сформировавшись в пыльцевую тру бочку, будет разрушено в пестике. В отличие о этого у перекрестно опыляющихся видов пыль цевое зерно, отмеченное как собственное, раз рушается, в то время как чужое вызывает опло дотворение. Природа этих примитивных механизмов рас познавания до конца не расшифрована, но наи более вероятно, что в них участвуют молекулы н поверхности клеток, способные специфическ] связываться и прилипать к другим молекулам н противостоящих клеточных поверхностях. Это простой метод молекулярного распознавания с временем эволюционировал и привел к возник новению очень сложной иммунной системы, ко торая сохранила в качестве основного свойств способность белковой молекулы распознават структуру определенной формы на другой моле куле и специфически связываться с ней. Тако молекулярное распознавание является базовьп принципом, применяемым для разделения на сво и чужое при иммунной реакции. Целью этой кни ги и является описание того, как полностью со зревшая иммунная система, возникшая на тако простой основе, использует указанный принци распознавания все более сложными и изощрен ными способами. В становлении иммунологии как науки можн выделить несколько периодов медленного и ак
22 ГЛАВА 1. ВСТУПЛЕНИЕ И ОБЗОР тивного развития. Последние обычно начинались после введения нового метода исследования или изменения общего подхода к предмету (парадиг- мы). Вероятно, самым сильным катализатором прогресса как в этой области, так и во многих других биомедицинских областях стало появле- ние методов молекулярной биологии Важно от- метить, однако, что некоторые технологические новшества в области молекулярной биологии стали возможными благодаря предшествующему про- грессу в иммунологии. Например, важность им- мунологических методов (см. гл. 5), исполь- зуемых для очистки белков и идентификации специфических клонов комплементарных ДНК (кДНК), не может быть переоценена. Эти до- стижения в значительной мере предопределили Дж. Кёлер (G.Kohler) и Ц. Мильштейн (С. Milstein) (1975) своими замечательными исследованиями, в которых они разработали метод производства моноклональных антител. За достижения им при- судили Нобелевскую премию в области медици- ны. Это открытие привело к революции в иссле- довательских разработках практически во всех областях биомедицинской науки. Некоторые мо- ноклональные антитела, вырабатываемые против так называемых опухольспецифичных антигенов, в настоящее время одобрены Агентством по кон- тролю над продуктами питания и лекарственны- ми средствами США для использования у пациен- тов с определенными видами рака. Технология моноклональных антител, вероятно, — самый яркий пример ого, как иммунологическая на- ука перешла из области медицины в другие сфе- ры жизни, от сельского хозяйства до пищевой промышленности. Учитывая быстрые успехи в иммунологии и многих других биомедицинских науках и, пожа- луй, главный из них — определение последова- тельности человеческого генома, любой современ- ный учебник по биомедицинским наукам сильно рискует устареть до того, как его отправят в пе- чать. Однако мы утешаем себя тем, что новые определения обычно появляются или развивают- ся из старых, а не заменяют и не отрицают их полностью. В ОБЩИЙ ОБЗОР Врожденный и приобретенный иммунитет Английское слово «иммунитет», которым опре- деляют все механизмы, используемые организмом для защиты от чужеродных агентов из окружаю- щей среды, происходит от латинского термина «immunis». означающего «освобожденный». Эти агенты могут представлять собой микроорганиз- мы или их продукты, пищевые продукты, хими- ческие вещества, лекарства, пыльцу или чешуйки и шерсть животных. Иммунитет может быть врож- денным или приобретенным. Врожденный иммунитет Врожденный иммунитет поддерживается всеми элементами, с которыми рождается человек и ко- торые всегда присутствуют и по первому требова- нию доступны для защиты организма от чужерод- ных агрессоров. Большинство этих элементов де- тально описаны в гл. 2. В табл. 1.1 суммируются и сравниваются некоторые свойства врожденной и адаптивной иммунных систем. Элементами врож- денной системы являются оболочки тела и его внутренние компоненты, такие как кожа и сли- зистые оболочки, кашлевый рефлекс, которые представляют эффективный барьер для чужерод- ных агентов. Эффективными химическими барь- ерами против проникновения многих микроор- ганизмов являются кислотность (pH) и выделяе- мые жирные кислоты Другим неклеточным эле- ментом врожденной иммунной системы является система комплемента. Как и в предыдущих изда- ниях этой книги, мы рассмотрели его в отдель- ной главе (см. гл. 13). Существуют и другие многочисленные компо- ненты врожденного иммунитета: лихорадка, ин- терфероны (см. гл. И), другие вещества, высво- бождаемые лейкоцитами, и молекулы, распозна- ющие структуры патогенов, которые могут свя- зываться с разными микроорганизмами (То11-по- • Таблица 1.1. Основные свойства врожденной и адаптивной иммунных систем Свойство Врожденная система Адаптивная система Характеристики Антигеннеспецифическая Быстрый ответ (минуты) Нет памяти Антигенспецифическая Медленный ответ (дни) Память Иммунные компоненты Естественные барьеры (например, кожа) Фагоциты Растворимые медиаторы (например, комплемент) Молекулы, распознающие структуры, характерные для патогенов Лимфоциты Антигенраспознающие молекулы (рецепторы В- и Т-клеток) Секретируемые молекулы (например, антитела)
ОБЩИЙ ОБЗОР 23 добные рецепторы или TLR; см. гл. 2), а также белки сыворотки, например р-лизин, фермент ли- зоцим, полиамины и кинины. Все перечислен- ные элементы либо непосредственно действуют на патогенный объект, либо усиливают реакцию организма на него. К другим компонентам врож- денного иммунитета относятся фагоцитирующие клетки, такие как гранулоциты, макрофаги и мик- роглиальные клетки центральной нервной систе- мы (ЦНС), которые участвуют в разрушении и удалении чужеродного материала, проникающего сквозь физические и химические барьеры Приобретенный иммунитет Приобретенный иммунитет более специализиро- ван, чем врожденный, и поддерживает защиту, создаваемую врожденным иммунитетом. С точки прения эволюции приобретенный иммунитет по- является относительно поздно и имеется только у позвоночных. Хотя индивидуум уже рождается со способно- стью запускать иммунный ответ на чужеродное вторжение, приобретается иммунитет только при контакте с вторгшимся объектом и специфичен именно к нему; отсюда и его название — приоб- ретенный иммунитет. Первоначальный контакт с чужеродным агентом (иммунизация) запускает цепь событий, которые ведут к активации лимфо- цитов и других клеток, а также к синтезу белков, некоторые из которых обладают специфической реактивностью против чужеродного агента. В этом процессе индивидуум приобретает иммунитет, который позволяет противостоять последующей атаке или защищает при повторной встрече с этим же агентом. Открытие приобретенного иммунитета опре- (елило появление многих концепций современ- ной медицины. В течение столетий признавалось, ч го люди, которые не умирали от таких смертель- но опасных заболеваний, как бубонная чума и оспа, были в последующем более устойчивы к за- болеванию, чем люди, которые не встречались с ними ранее. Окончательное открытие приобре- I с иного иммунитета приписывают английскому врачу Э.Дженнеру (Е. Jenner), который в конце XVIII в. экспериментально вызвал иммунитет к оспе. Если бы Э.Дженнер проводил свой экспе- римент сегодня, его медицинская лицензия была бы аннулирована, а он сам стал бы подсудимым на сенсационном судебном процессе: он ввел ма- 1снькому мальчику гной из очага поражения у молочницы, которая болела коровьей оспой — относительно доброкачественным заболеванием, родственным оспе. Затем он намеренно заразил мальчика оспой. Но контакт с возбудителем не вызвал заболевания! В связи с защитным эффек- юм введения возбудителя коровьей оспы (vaccinia 01 латинского слова «vacca», означающего «коро- ва») процесс получения приобретенного иммуни- icra был назван вакцинацией. Теорию вакцинации или иммунизации разви- ли Л. Пастер и П. Эрлих почти 100 лет спустя после эксперимента Э. Дженнера. К 1900 г. стало ясно, что иммунитет может быть вызван не только к микроорганизмам, но и к их продуктам. Сейчас мы знаем, что он может развиться против бесчи- сленного количества естественных и синтетиче- ских веществ, включая металлы, химические ве- щества с относительно низкой молекулярной мас- сой, углеводы, белки и нуклеотиды. Вещество, к которому возникает иммунная реакция, называется антигеном. Этот термин был создан для демонстрации способности вещества генерировать продукцию лн/интел. Конечно, в на- стоящее время известно, что антигены могут ге- нерировать реакции, опосредованные и антите- лами, и Т-клетками. Активная, пассивная и адоптивная иммунизация Приобретенный иммунитет индуцируется пу- тем иммунизации, которая может достигаться не- сколькими путями. • Активная иммунизация — иммунизация инди- видуума путем введения антигена. • Пассивная иммунизация — иммунизация по- средством переноса специфических антител от иммунизированного к неиммунизированному индивидууму. • Адоптивная иммунизация — перенос иммуни- тета путем переноса иммунных клеток. Характеристики приобретенного иммунного ответа Приобретенный иммунный ответ имеет несколь- ко общих черт, характеризующих его и отличаю- щих от других физиологических систем, таких как циркуляторная, респираторная и репродуктивная. Это следующие черты: • специфичность — это способность распознавать определенные молекулы среди многих других и реагировать только на них. избегая таким обра- зом случайного недифференцированного ответа; • адаптивность — способность реагировать на ранее не встречавшиеся молекулы, которые в действительности могли бы и не существовать на Земле в естественной среде; • распознавание между «своим» и «чужим» — глав- ное свойство специфичности иммунного отве- та; способность узнавать и реагировать на чу- жеродные («чужие») молекулы и избегать ре- акции на собственные. Это распознавание и узнавание антигенов передается специализи- рованными клетками (лимфоцитами), которые несут на своей поверхности антигенспецифи- ческие рецепторы;
24 ГЛАВА 1. ВСТУПЛЕНИЕ И ОБЗОР • память — способность (как и у нервной систе- мы) вспоминать предыдущий контакт с чуже- родной молекулой и реагировать на нее уже известным образом, однако с большими силой и скоростью. Для описания иммунологической памяти используют термин «анамнестический ответ». Когда вы дочитаете книгу до конца, вы будете понимать клеточную и молекулярную основы иммунного ответа. Клетки, участвующие в приобретенном иммунном ответе В течение многих лет иммунология оставалась эмпирической наукой, в которой эффекты введе- ния различных веществ в живые организмы ис- следовались главным образом с точки зрения по- лучаемых продуктов. Основной прогресс был до- стигнут с появлением количественных методов выявления этих продуктов иммунного ответа В 1950-х гг. после открытия того, что лимфоциты являются клетками, играющими основную роль в иммунном ответе, акценты в иммунологии резко сместились и в ней выделилась новая область — клеточная иммунология. В настоящее время установлено, что существу- ют три основных типа клеток, вовлеченных в при- обретенный иммунный ответ, и для индукции полноценного иммунного ответа необходимо сложное взаимодействие между ними. Из них клетки двух типов имеют общую лимфоидную клетку-предшественник, но в дальнейшем их диф- ференцировка идет по разным направлениям. Одна линия клеток созревает в тимусе, и их отно- сят к Т-клеткам. Другие созревают в костном мозге и относятся к В-клеткам. Клетки В- и Т-лимфо- цитарных линий различаются по многим функ- циональным признакам, но имеют в иммунном ответе одну важную способность, а именно: обла- дают специфичностью относительно антигена. Таким образом, в иммунном ответе основные функции — распознавание и реагирование — вы- полняют лимфоциты. Антигенпрезентирующие клетки (АПК), такие как макрофаги и дендритные клетки, относятся к третьему типу клеток, участвующих в приобре- тенном иммунном ответе. Хотя на этих клетках нет антигенспецифических рецепторов, как у лим- фоцитов, они выполняют важную функцию — процессируют (перерабатывают) и презентируют антиген специфическим рецепторам (Т-клеточ- ным рецепторам) на Т-лимфоцитах. Антигенпре- зентирующие клетки имеют на своей поверхно- сти два типа специальных молекул, участвующих в презентации антигена. Эти молекулы, называе- мые молекулами главного комплекса гистосовмес- тимости (major histocompatibility complex — МНС) I и II классов, кодируются набором генов, кото- рые отвечают также за отторжение или прижив- ление трансплантированной ткани. Процессиро- ванный антиген нековалентно связывается с мо- лекулами МНС I или И класса (или обеими) Антиген, представляемый на молекулах МНС I класса, презентируется и участвует в активации одной из субпопуляций Т-клеток (цитотоксиче- ских Т-клеток), в то время как антиген, процесси- руемый и экспрессируемый на АПК в комплексе с молекулами МНС II класса, приводит к актива- ции другой субпопуляции (Т-клетки-хелперы). Этот вопрос более детально обсуждается в гл. 9. Кроме того, в иммунных ответах участвуют и клетки других типов, такие как нейтрофилы и тучные клетки. В действительности, они прини- мают участие как в реакциях врожденного, так и приобретенного иммунитета. В основном они во- влечены в эффекторную фазу реакции. Эти клет- ки не способны специфически распознавать анти- ген. Они активируются различными субстанция- ми, называемыми цитокинами, которые высвобож- даются другими клетками, в том числе активиро- ванными антигенспепифическими лимфоцитами. Клонально-селекционная теория Поворотным пунктом в иммунологии стало рас- пространение в 1950-е гг. дарвиновской теории на клеточную основу специфичности при иммун- ном ответе. Это была повсеместно принятая в настоящее время клонально-селекционная теория. предложенная и развитая Ерне (Jerne) и Берне- том (Burnet) (оба лауреаты Нобелевской премии), а также Толмеджем (Talmage). Основные посту- латы этой теории суммируются далее. Специфичность иммунного ответа основыва- ется на способности его компонентов (а именно антигенспецифичных Т- и В-лимфоцитов) распо- знавать определенные чужеродные молекулы (ан- тигены) и реагировать на них, чтобы устранить. Неотъемлемой частью этой теории является не- обходимость клональной делеции (выбраковки, удаления) лимфоцитов, способных быть ауторе- активными. При отсутствии такого механизма постоянно возникали бы аутоиммунные реакции. К счастью, лимфоциты с рецепторами, связыва- ющимися с собственными антигенами, устраня- ются на ранних стадиях развития, повышая та- ким образом толерантность к структурам собствен- ного организма (рис. 1.1). Поскольку, как указано ранее, иммунная си- стема способна распознавать огромное множество чужеродных антигенов, остается выяснить, как осуществляется реакция на какой-либо один ан- тиген. В дополнение к уже доказанному постула- ту, что аутореактивные клоны лимфоцитов инак- тивируются, клонально-селекционная теория предполагает: • что Т- и В-лимфоциты, отличающиеся огром- ным разнообразием специфичностей, существу-
ОБЩИЙ ОБЗОР 25 4 3 7 Антиген Пул неаутореактивных зрелых лимфоцитов 4 7 3 7 4 3 Стимуляция антигеном лимфоцитарных клонов 3 7 4 Анти-3 1g Анти-41g Анти-7 1g Антисыворотка к гену • Рис. 1.1. Теория клональной селекции В-клеток, вырабатывающих антитела ют еще до того, как произошел какой-либо контакт с инородным антигеном; • лимфоциты, участвующие в иммунном ответе, имеют антигенспецифичные рецепторы на сво- их поверхностных мембранах. В результате свя- зывания антигена с лимфоцитом клетка акти- вируется и высвобождает различные вещества. В случае В-лимфоцитов рецепторами являют- ся молекулы (антитела), обладающие той же специфичностью, что и антитела, которые клет- ка в дальнейшем будет производить и секрети- ровать. Т-клетки обладают рецепторами, на- зываемыми Т-клеточными рецепторами (Т cell receptors — TCR). В отличие от В-клеток Т-лимфоциты продуцируют вещества, отлича- ющиеся от их поверхностных рецепторов и яв- ляющиеся другими белковыми молекулами, называемыми цитокинами. Они участвуют в устранении антигена путем регуляции других клеток, необходимых для организации эффек- гивной иммунной реакции; • каждый лимфоцит несет на своей поверхности рецепторные молекулы только одной специ- фичности, как показано на рис. 1.1 для В-кле- гок, что также справедливо для Т-клеток. В этих трех постулатах указывается на суше- спзование широкого спектра возможных разли- чии по специфичности, формируемых в процессе размножения и дифференцировки до того, как происходит какой-либо контакт с чужеродной субстанцией, на которую должна быть реакция В ответ на ведение чужеродного антигена из всех имеющихся разновидностей (специфично- стей) отбираются те, которые специфичны для антигена и делают возможным его связывание (см. рис. 1.1). Схема, показанная на рис. 1.1 для В-клеток, также подходит для Т-клеток, однако Т-клетки имеют рецепторы, не являющиеся ан- тителами, и секретируют молекулы, не являющи- еся антителами. Оставшиеся постулаты клонально-селекционной теории объясняют процесс селекции антигеном клеток из всего репертуара доступных клеток. • Иммунокомпетентные лимфоциты соединяют- ся с чужеродным антигеном или его частью, называемой эпитопом, посредством своих по- верхностных рецепторов. В соответствующих условиях идет стимуляция их пролиферации и дифференцировки в клоны клеток с соответ- ствующими идентичными рецепторами к опре- деленной части антигена, называемой антиген- ной детерминантой или эпитопом. У В-кле- точных клонов это приводит к синтезу анти- тел, имеющих совершенно одинаковую специ- фичность Комплекс антител, секретируемых разными клонами, составляет поликлональную антисыворотку, способную взаимодействовать с множеством эпитопов, представленных на
26 ГЛАВА 1. ВСТУПЛЕНИЕ И ОБЗОР антигене. Т-клетки будут таким же образом от- бираться соответствующими антигенами или их участками. Каждая селектированная Т-клетка будет активироваться, чтобы делиться и обра- зовать клоны той же самой специфичности. Таким образом, в клональном ответе на анти- ген количество реагирующих клеток будет ум- ножено, а образовавшиеся клетки будут вы- свобождать различные цитокины. Последующий контакт с тем же антигеном приведет к акти- вации многих клеток или клонов той же спе- цифичности. Вместо синтеза и высвобождения антител, как у В-клеток, Т-клетки синтезиру- ют и высвобождают цитокины. Эти цитокины, являющиеся растворимыми медиаторами, осу- ществляют свое воздействие на другие клетки, заставляя их расти или активироваться для даль- нейшего устранения антигена. Распознаваться могут несколько отделенных друг от друга уча- стков антигена (эпитопов), соответственно для создания антител к ним будут стимулировать- ся несколько различных клонов В-клеток, ко- торые в свою очередь все вместе будут созда- вать антигенспецифическую антисыворотку, объединяющую антитела различной специфич- ности (см. рис. 1.1). Все клоны Т-клеток, рас- познающие различные эпитопы на том же ан- тигене, будут активироваться для выполнения своей функции. Последний постулат был добавлен для объяс- нения способности к распознаванию собственных антигенов без возникновения реакции. • Циркулирующие аутоантигены, попадающие в места развития незрелых лимфоцитов до того, как начнется определенный этап их созрева- ния, обеспечивают «выключение» тех клеток, которые будут специфически распознавать эти аутоантигены и, таким образом, предотвратят начало последующего иммунного ответа. Сформулированная таким образом клонально- селекционная теория оказала поистине револю- ционное воздействие на иммунологию и измени- ла подход к ее изучению. Гуморальный и клеточный иммунитет Существуют две ветви приобретенного иммунитета с разным составом участников и различным пред- назначением, но имеющие одну общую цель — устранение антигена Как мы увидим в дальней- шем, эти две ветви взаимодействуют друг с дру- гом, чтобы достичь конечной цели — устранения антигена. Из этих двух направлений приобретен- ного иммунного ответа одно определяется учас- тием в основном В-клеток и циркулирующих ан- тител, в форме так называемого гуморального им- мунитета (термин «гуморальный» ранее исполь- зовали для определения жидких сред организма) Другое направление определяется участием Т-кле- ток, которые, как мы указывали ранее, не синте- зируют антител, но синтезируют и высвобождают различные цитокины, действующие на другие клетки. В связи с этим данный вид приобретен- ного иммунного ответа называется клеточным или клеточно-опосредованным иммунитетом. Гуморальный иммунитет Гуморальный иммунитет определяется участием сывороточных антител, которые являются белка- ми, секретируемыми В-клеточным звеном иммун- ной системы (см. гл. 7). Первоначально после свя- зывания антигенов со специфическими молекула- ми мембранного иммуноглобулина (1g) (В-кле- точные рецепторы; В cell receptors — BCR) В-клет- ки активируются для секреции антител, которые экспрессируются этими клетками. По имеющим- ся оценкам, каждая В-клетка экспрессирует при- мерно 105 BCR совершенно одинаковой специ- фичности. После связывания антигена В-клетка получает сигналы на производство секретируемой формы того иммуноглобулина, который ранее был представлен в мембранной форме Процесс ини- циации полномасштабной реакции с участием антител направлен на удаление антигена из орга- низма. Антитела представляют собой гетероген- ную смесь сывороточных глобулинов, которые обладают способностью самостоятельно связы- ваться со специфичными антигенами. Все сыво- роточные глобулины со свойствами антител от- носят к иммуноглобулинам. Все молекулы иммуноглобулинов имеют общие структурные свойства, которые позволяют им: 1) распознавать и специфически связываться с уни- кальными элементами структуры антигена (т.е. эпи- топами)} 2) выполнять общую биологическую функцию после соединения с антигеном. В ос- новном, каждая молекула иммуноглобулина со- стоит из двух идентичных легких (L) и двух тяже- лых (Н) цепей, связанных дисульфидными мос- тиками. Получающаяся в результате структура показана на рис. 1.2. Часть молекулы, которая связывается с анти- геном, является зоной, состоящей из терминаль- ных участков аминокислотных последовательно- стей как на L-, так и на Н-цепях. Таким образом, каждая молекула иммуноглобулина является сим- метричной и способна связываться с двумя иден- L-пепь _ Антиген^ связывающие участки L-цепь Н-цепь Н-цепь • Рис. 1.2. Типичная молекула антитела, состоящая из двух тяжелых (Н) и двух легких (L) цепей Выделены антиген- связывающие участки
ОБЩИЙ ОБЗОР 27 точными эпитопами, имеющимися на одной мо- лекуле антигена или на разных молекулах. Кроме различий между участками, связываю- щими антиген, у разных молекул иммуноглобу- лина имеются и другие различия, наиболее важ- ные из которых касаются Н-цепей. Существует пять основных классов Н-цепей (называемых у, ц, а, г и 8). На основании различий в Н-цепях молекулы иммуноглобулина были разделены на пять основных классов: IgG, IgM, IgA, IgE и IgD, каждый из которых характеризуется уникальны- ми биологическими свойствами. Например, IgG является единственным классом иммуноглобули- нов, пересекающим плацентарный барьер и пе- редающим материнский иммунитет плоду, в то время как IgA — основной иммуноглобулин, об- наруживаемый в таких секретах желез, как слеза или слюна. Важно отметить, что антитела всех пяти классов могут обладать совершенно одина- ковой специфичностью по отношению к антиге- ну (антигенсвязывающие участки), сохраняя в то же время различные функциональные (биологи- ческие эффекторные) свойства. Связь между антигеном и антителом некова- лентная, она зависит от множества относительно слабых сил, таких как водородные связи, ван-дер- ваальсовы силы и гидрофобные взаимодействия. Поскольку эти силы слабы, для успешного свя- зывания антигена с антителом требуется очень близкий контакт на ограниченном участке, напо- добие контакта ключа и замка. Другим важным элементом гуморального имму- нитета является система комплемента (см. гл. 13). Реакция между антигеном и антителом активиру- ет комплемент, который составляют ряд сыворо- точных ферментов, что приводит или к лизису мишени, или усиливает фагоцитоз (поглощение антигена) клетками-фагоцитами. Активация ком- племента также приводит к привлечению поли- морфно-ядерных (ПМЯ) клеток, обладающих высокой способностью к фагоцитозу и являющих- ся частью врожденной иммунной системы. Эти события обеспечивают максимально эффективный ответ гуморальной ветви иммунитета на вторже- ние чужеродных агентов. Клеточно-опосредованный иммунитет Антигенспецифичная ветвь клеточно-опосредо- ванного иммунитета задействует Т-лимфоциты (рис. 1.3). В отличие от В-клеток, вырабатываю- щих растворимые антитела, которые циркулиру- ют для связывания соответствующих специфич- ных антигенов, каждая Т-клетка, несущая множе- ство идентичных антигенных рецепторов, назы- ваемых TCR (около 105 на клетку), сама направ- 1яется непосредственно к месту, где на АПК экс- прессируется антиген, и взаимодействует с ней в б шзком (непосредственно межклеточном) контак- IC (см. гл. 10). Иммуноглобулин TCR м- • В-лимфоцит Т-лимфоцит • Рис. 1.3. Рецепторы для антигена, экспрессируемые как трасмембранные молекулы на В- и Т-лимфоцитах Существует несколько различающихся по фе- нотипу субпопуляций Т-клеток, каждая из кото- рых может обладать одинаковой специфично- стью по отношению к антигенной детерминанте (эпитопу), но при этом выполнять различные функции. В данном случае можно провести ана- логию с разными классами молекул иммуногло- булинов, которые обладают одинаковой специ- фичностью, но различными биологическими функциями. Имеются две субпопуляции Т-кле- ток: Т-клетки-хелперы (Тн-клетки), которые экс- прессируют молекулы CD4, и цитотоксические Т-клетки (Тс-клетки), которые экспрессируют молекулы CD8 на своей поверхности. Разным субпопуляциям Тн-клеток приписыва- ют различные функции. • Взаимодействие с В-клетками для увеличения продукции антител. Такие Т-клетки действуют путем высвобождения цитокинов, которые обеспечивают подачу различных активирующих сигналов В-клеткам. Как указывалось ранее, цитокины являются растворимыми вещества- ми или медиаторами, высвобождаемыми клет- ками; такие медиаторы, высвобождаемые лим- фоцитами, называются лимфокинами. Группе цитокинов с низкой молекулярной массой дали название хемокины. Они, как указывается да- лее, участвуют в воспалительной реакции. До- полнительная информация о цитокинах пред- ставлена в гл. 11. • Участие в реакциях воспаления. После актива- ции определенная субпопуляция Т-клеток вы- свобождает цитокины, индуцируя миграцию и активацию моноцитов и макрофагов, что при- водит к возникновению так называемых вос- палительных реакций гиперчувствительности замедленного типа (см. гл. 16). Эту субпопуля- цию Т-клеток, участвующих в реакции гипер- чувствительности замедленного типа (ГЗТ). иногда называют Тгзт или просто Тн. • Цитотоксические эффекты. Т-клетки особой субпопуляции становятся цитотоксическими клетками-киллерами, которые при контакте со своей мишенью способны нанести удар, веду- щий к гибели клетки-мишени. Эти Т-клетки
28 ГЛАВА 1. ВСТУПЛЕНИЕ И ОБЗОР называют цитотоксическими Т-клетками (Тс). В отличие от Тн-клеток они экспрессируют молекулы CD8 на своих мембранах и поэтому называются СВ8+-клетками. • Регуляторные эффекты. Хелперные Т-клетки могут быть разделены на две различные функ- циональные подгруппы в соответствии с цито- кинами, которые они высвобождают. Как вы узнаете из следующих глав, эти субпопуляции (Тн1 и Тн2) обладают различными регулятор- ными свойствами, которые передаются посред- ством высвобождаемых ими цитокинов (см. гл. И). Более того, Тн1-клетки могут негатив- но перекрестно влиять на Тн2-клетки, и на- оборот. У другой популяции регуляторных или Т-клеток-супрессоров отмечается коэкспрессия CD4 и CD25 (CD25 является a-цепью рецеп- тора интелейкина-2 (см. гл. 11). Регуляторная активность этих СВ4+/СВ25+-клеток и их роль в активном подавлении аутоиммунитета обсуж- дается в гл. 12. • Эффекты цитокинов. Т-клетки и другие клет- ки иммунной системы (например, макрофаги) оказывают различное воздействие на многие клетки, лимфоидные и нелимфоидные, посред- ством разных цитокинов, которые они высво- бождают. Таким образом, прямо или косвенно Т-клетки связываются и взаимодействуют с множеством типов клеток. В результате многолетних иммунологических исследований было установлено, что клетки, ак- тивированные антигеном, проявляют целый ряд эффекторных способностей. Однако только за последние несколько десятилетий иммунологи стали осознавать всю сложность событий, кото- рые происходят при активации клеток антигеном и при их взаимодействии с другими клетками. Мы теперь знаем, что простой контакт Т-клеточного рецептора с антигеном недостаточен для актива- ции клетки. В действительности для активации антигенспецифичной Т-клетки должны быть даны по крайней мере два сигнала. Первый сигнал обес- печивается связыванием Т-клеточного рецептора с антигеном, который должен быть соответству- ющим образом презентирован АПК. Второй сиг- нал определяется участием костимуляторов, сре- ди которых имеются определенные цитокины, такие как IL-1, IL-4, IL-6 (см. гл. 11), и поверх- ностные молекулы, экспрессированные на АПК, такие как CD40 и CD86 (см. гл. 10). В последнее время под термином «костимулятор» стали под- разумевать и другие стимулы, например продук- ты жизнедеятельности микроорганизмов (инфек- ционные, чужеродные) и поврежденная ткань («гипотеза опасности» П.Матзингера (Р. Matzin- ger)), которые будут усиливать первый сигнал, если он относительно слаб. Как только Т-клетки по- лучают достаточно четкий сигнал для активации, происходит ряд событий, и активированная клет- ка синтезирует и высвобождает цитокины. В свою очередь эти цитокины контактируют с опре- деленными рецепторами на различных клетках и воздействуют на эти клетки. Хотя обе, гуморальная и клеточная, ветви им- мунного ответа рассматриваются как самостоя- тельные и отличные друг от друга компоненты, важно понимать, что реакция на любой специ- фический патоген может предусматривать слож- ное взаимодействие между ними, а также участие элементов врожденного иммунитета. Все это на- целено на обеспечение достижения максимально возможного выживания организма за счет удале- ния антигена и, как мы увидим далее, защиты организма от аутоиммунного ответа на собствен- ные структуры. Проявление разнообразия в иммунном ответе Последние достижения в иммунологических ис- следованиях обусловлены союзом молекулярной биологии и иммунологии. Благодаря тому что клеточная иммунология смогла выявить на кле- точном уровне суть многочисленных и различных по спектру реакций, а также природу процессов, позволяющих достичь уникальной специфично- сти, появилось множество соображений относи- тельно реальных генетических механизмов, кото- рые позволяют всем этим специфичностям стать частью репертуара у каждого представителя дан- ного вида. Вкратце эти соображения таковы. • По различным подсчетам число специфичных антигенов, к которым может возникать иммун- ный ответ, способно достигать 106—107. • Если каждый специфичный ответ, как анти- тельный, так и Т-клеточный, определяется од- ним геном, означает ли это, что каждому ин- дивидууму потребуется более 107 генов (один на каждое специфичное антитело)? Каким об- разом этот массив ДНК передается неповреж- денным от индивида к индивиду? На этот вопрос позволили ответить новатор- ские изыскания, проведенные С.Тонегавой (S.To- negawa) (лауреат Нобелевской премии) и Ф. Леде- ром (Ph. Leder), в которых были использованы ме- тоды молекулярной биологии. Эти исследовате- ли описали уникальный генетический механизм, с помощью которого иммунологические рецеп- торы, экспрессированные на В-клетках и отлича- ющиеся огромным разнообразием, могут созда- ваться на базе относительно небольшого количе- ства ДНК, предназначенного для этой пели. Природа создала технологию генных рекомби- наций, при которой белок может кодироваться молекулой ДНК. составленной из набора реком- бинируемых (переставляемых) мини-генов, кото- рые и составляют полный ген. На основе неболь- шого набора таких мини-генов, способных сво-
ОБЩИЙ ОБЗОР 29 бодно комбинироваться для создания целого гена, можно получить огромный репертуар специфично- стей, используя ограниченное число генных фраг- ментов. (Детально вопрос обсуждается в гл. 6.) Первоначально этот механизм был призван объ- яснить существование огромного разнообразия антител, которые не только секретируются В-клет- ками, но также фактически составляют антиген- или эпитопспецифичные рецепторы В-клеток. Впоследствии было установлено, что подобные ме- ханизмы отвечают и за разнообразие антигенспе- цифичных Т-клеточных рецепторов (TCR). Ме- ханизмы, определяющие возникновение различий среди В-клеточных рецепторов и антител, описа- ны в гл. 6. Механизмы, определяющие различия между Т-клеточными рецепторами, описаны в гл. 8. Достаточно сказать, что существование различ- ных методов молекулярной биологии, позволяю- щих не только исследовать гены, но и произволь- но перемещать их из одной клетки в другую, обес- печивает быстрый дальнейший прогресс в имму- нологии. Успехи иммунологии Хотя мы до сих пор рассматривали теоретические аспекты иммунологии, ее практическое примене- ние имеет первостепенное значение для выжива- ния человека и должно изучаться в процессе под- । отовки студентов-медиков. Иммунология оказалась в центре внимания человечества после успешного применения вак- цин против полиомиелита в середине XX в. В бо- iee позднее время внимание привлекли впечатля- ющие трансплантации человеческого сердца и дру- I их крупных органов, таких, например, как печень. 11убличный интерес к иммунологии был подогрет возможностью применения иммунного ответа для щагностики и борьбы с раком; а в 1980-х гг. лю- 1ям пришлось ознакомиться с некоторыми аспек- гами иммунологии в связи с быстрым распро- странением СПИДа. Системы врожденного и приобретенного им- мунитета играют существенную роль в предот- вращении и излечении от инфекционных заво- еваний и, несомненно, являются определяющи- ми для выживания человека. В начале XIX в. И. И. Мечников впервые высказал предположение, что клетки-фагоциты составляют первую линию оСюроны против инфекции и что воспалительная реакция в действительности помогает защите орга- ни ша. В самом деле, реакции врожденного им- мунного ответа несут ответственность за распо- шавание и быстрое разрушение большинства ин- фицирующих агентов, с которыми люди встреча- йся в повседневной жизни. Теперь мы знаем, чю реакции врожденного иммунного ответа дей- к 1вуют одновременно с реакциями адаптивного иммунного ответа, в результате чего вырабатыва- йся антигенспецифичные эффекторные механиз- мы, посредством которых происходит разрушение и выведение инфицирующего патогена. В гл. 20 приведена информация о том, как иммунные си- стемы реагируют на микроорганизмы и каким образом методы, разработанные для включения этих механизмов, могут быть использованы для иммунопрофилактики Эффективной формой про- филактики явилась вакцинация против инфекци- онных болезней. Иммунопрофилактика против вируса полиомиелита привела к тому, что он пе- рестал представлять серьезную опасность во мно- гих частях света, а после вакцинации против оспы эта широко распространенная ранее болезнь во- обще исчезла с лица Земли. Последний случай естественной передачи вируса оспы был офици- ально зарегистрирован в 1972 г. К сожалению, уг- роза биологической войны заставляет задуматься о вероятности возвращения из небытия ряда ин- фекционных заболеваний, включая оспу. К сча- стью, имеются возможности проведения широкой вакцинации людей для устранения или уменьше- ния опасности применения микробиологических агентов в качестве оружия. Последние достижения в иммунологии также дали надежду на успешную иммунопрофилакти- ку малярии и некоторых других паразитарных болезней, поражающих миллионы людей в раз- ных частях света. С помощью вакцинации домаш- них животных можно увеличить производство мяса в развивающихся странах. В то же время вак- цинация против определенных веществ, участву- ющих в репродуктивных процессах у млекопита- ющих, дает возможность осуществлять длитель- ную контрацепцию как у человека, так и у живу- щих с ним животных, таких как кошки и собаки. Повреждающие эффекты иммунного ответа Огромное значение иммунного ответа для выжи- вания человека очевидно. Приобретенный имму- нитет направлен против инородного агента, его целью является устранение чужеродной субстан- ции. В процессе иммунного ответа из-за накоп- ления компонентов с неспецифическим действи- ем могут пострадать некоторые ткани организма Обычно такое повреждение носит временный ха- рактер. После устранения агрессора ситуация бы- стро возвращается к норме Однако бывают случаи, когда выраженный иммунный ответ, направленный против попавшей в организм инородной субстанции (такой как ле- карство, вдыхаемые частицы пыльцы или веще- ства, попадающие в организм при укусах насеко- мых), приводит к тяжелым патологическим по- следствиям или даже смерти. Подобные проявле- ния называют реакциями гиперчувствительности или аллергическими реакциями. Понимание ос- новных механизмов, лежащих в основе этих про- цессов, имеет фундаментальное значение для их
30 ГЛАВА 1. ВСТУПЛЕНИЕ И ОБЗОР лечения и контроля над ними и, кроме того, рас- ширяет наши знания о естественном иммунном ответе. Данное утверждение справедливо, посколь- ку в обоих случаях задействованы одинаковые механизмы, однако в случае гиперчувствительно- сти эти механизмы направлены не в ту сторону или выходят из-под контроля. Реакции гиперчувствительности различают в соответствии с эффекторами, вовлеченными в них. Один тип этих реакций характеризуется участием антител; такая реакция может быть воспроизве- дена у другого индивидуума с помощью соответ- ствующего количества и типа антител в сыворот- ке крови. Данный тип реакций в свою очередь подразделяется на три класса в зависимости от специфики определяющих их механизмов, вклю- чающих или тучные клетки, или комплемент и нейтрофилы. Подобные реакции характеризуют- ся быстротой возникновения и развиваются в пе- риод от нескольких минут до нескольких часов после контакта с антигеном, поэтому их обычно относят к реакциям гиперчувствительности немед- ленного типа (реакции гиперчувствительности описаны в гл. 14— 16). Второй большой тип реакций гиперчувстви- тельности в основном опосредуется Т-клетками с последующим вовлечением моноцитов и, соответ- ственно, называется клеточно-опосредованным иммунитетом. Такие реакции более отсрочены во времени. Обычно они достигают максимума че- рез 18 —24 ч и традиционно относятся к реакци- ям ГЗТ. В отличие от реакций гиперчувствитель- ности, опосредованных антителом, которые могут переноситься от чувствительного индивидуума не- чувствительному с помощью сыворотки, реакции ГЗТ могут быть переданы только Т-клетками. Следует еще раз подчеркнуть, что все эти ре- акции гиперчувствительности дублируют нормаль- ные реакции, поскольку те же механизмы могут быть задействованы для защиты организма от чу- жеродного агента. Только в том случае, если из- менена точка приложения реакций или отрица- тельные последствия для организма чересчур вы- ражены, их называют реакциями гиперчувстви- тельности. Регуляция иммунного ответа Учитывая сложность иммунного ответа и его спо- собность вызывать повреждения, становится оче- видным, что он должен осуществляться в услови- ях четкой регуляции, как и любая другая физио- логическая система. Механизмы подобного конт- роля многочисленны и включают ингибирование по типу обратной связи, в которой участвуют рас- творимые вещества, а также разные типы меж- клеточных взаимодействий, которые могут либо усилить, либо ослабить реакцию. Конечной це- лью является поддержание гомеостаза таким об- разом, чтобы реакция, возникающая после вне- дрения инородного агента, была достаточной для его устранения, после чего система приходила бы в равновесие, иными словами — иммунный ответ прекращался. Однако память о данном агрессоре сохраняется, что обеспечивает более быстрый и сильный ответ при повторной встрече с ним. Нарушения в этих регуляторных механизмах могут быть вызваны такими условиями, как врож- денные дефекты, гормональные нарушения или инфекция; каждое из них может привести к ката- строфическим последствиям. В качестве примера уместно привести СПИД, поскольку при нем ин- фицируются Т-лимфоциты, участвующие в регу- ляции иммунного ответа. В результате заражения вирусом иммунодефицита человека (ВИЧ), кото- рый вызывает СПИД, уменьшается количество и снижается функциональная активность одной из субпопуляций Т-клеток, что делает пациента без- защитным перед инфекциями, вызываемыми обычно непатогенными микроорганизмами. Важная форма регуляции касается предотвра- щения иммунных реакций против собственных антигенов. По разным причинам подобная регу- ляция может оказаться нарушенной, что приве- дет к развитию реакции против собственных струк- тур. Этот тип иммунного ответа называется ауто- иммунитетом. Он является причиной таких за- болеваний, как некоторые формы артрита, тирео- идита и диабета, очень трудно поддающихся ле- чению Будущее иммунологии Студенту, заглянувшему в будущее иммунологии, откроется много захватывающих перспектив. Пер- вую роль будут играть применение методов моле- кулярной биологии и компьютерные технологии. Давайте рассмотрим лишь некоторые примеры, такие как разработка вакцин и регуляция иммун- ного ответа. Так, в противовес тяжкому эмпири- ческому подбору аттенуированных вирусов или бактерий, пригодных для иммунизации, в насто- ящее время можно использовать данные о пато- генспецифичной последовательности белка и при- менять изощренные компьютерные методы для выявления иммуногенных пептидов, пригодных для тестирования в качестве вакцин. Помимо этого ДНК-вакцины, содержащие ДНК-векторы, коди- рующие иммуногенные белки, могут полностью изменить протоколы вакцинации в недалеком будущем. Идентификация различных генов и бел- ков или их частей (пептидов), кодируемых этими генами, делает возможным конструировать вак- цины, направленные к широкому спектру биоло- гически важных соединений. Другим перспективным направлением являет- ся синтез и описание характеристик цитокинов, контролирующих активацию различных клеток, связанных с иммунным ответом, а также с други- ми функциями организма. Методы выделения
ОБЩИЙ ОБЗОР 31 гена, репродукции клонов, цепная полимеразная реакция и биосинтез также способствовали быст- рому развитию иммунологии. С помощью техно- логий применения рекомбинантной ДНК были синтезированы имеющие большое значение силь- ные модуляторы, исследуемые в настоящее время на предмет терапевтической эффективности при различных заболеваниях, включая многие разно- видности опухолей. Иногда исследования цито- кинов проводятся уже не в лабораториях, а на самих больных, поскольку на основе некоторых цитокинов созданы лекарственные препараты. И, наконец, вероятно, одной из наиболее ин- тересных является технология по генетическому проектированию разных клеток и даже целых животных, например мышей, у которых отсутству- ет один или несколько специфических призна- ков («нокаут» гена) или присутствует особый при- знак (перенос гена, трансген). Эти и другие экс- периментальные системы, основанные на имму- нитете, будут описаны в гл. 5. Они позволяют им- мунологам изучать воздействия таких признаков на иммунную систему и организм в целом, для loro чтобы можно было понять сложную регуля- цию, экспрессию и функцию иммунного ответа и достичь конечной цели — контроля признака во благо индивидуума. Таким образом, наши увели- чивающиеся знания о том, как функционирует им- мунная система, вместе с недавно открытой воз- можностью изменять ее компоненты и манипу- шровать ими несут в себе огромные возможное - । и для будущего человечества. В следующих главах мы более детально опи- шем способы функционирования иммунной си- С1смы, начиная с ее клеточных компонентов. За- йм рассмотрим вещества, принимающие участие и реакциях и общую методологию оценки этих реакций. Дальнейшие главы посвящены форми- рованию и активации клеточных и молекулярных компонентов иммунной системы, необходимых 11Я начала реакции. Завершит описание основ- ной природы иммунитета обсуждение механиз- мов контроля, регулирующих направление и ин- тенсивность иммунных реакций В первой полови- не книги приведена глава о цитокинах и рас- творимых медиаторах, регулирующих иммунный ответ и играющих важную роль в гемопоэзе. За ней следуют главы, касающиеся большого числа различных болезней с вовлечением иммунологи- ческих компонентов. Описываемые болезни обу- словлены как неэффективностью или отсутстви- ем иммунитета (иммунодефицит) и дискоордини- рованными (аберрантными) иммунными реакци- ями (гиперчувствительность), так и реакциями на собственные антигены (аутоиммунитет) Следую- щие главы посвящены описанию роли иммунно- го ответа при трансплантации и противоопухоле- вым реакциям. В последней главе основное вни- мание уделяется спектру микроорганизмов, бро- сающих вызов иммунной системе, и тому, как для защиты организма от инфекционных заболеваний запускается чувствительный, хорошо скоордини- рованный иммунный ответ. Обсуждается и имму- нопрофилактика с использованием вакцин для защиты от разнообразных патогенных организмов. Несомненно, что успешное использование вак- цин способствовало коренным изменениям в об- ласти медицины в XX в. В свою очередь, в XXI в. будут нужны дальнейшие научные исследования по созданию крайне необходимых вакцин против уже существующих в природе вирусов, микроор- ганизмов, появившихся не так давно (наиболее известен ВИЧ), и против новых, созданных в ка- честве вероятного биологического оружия, или еще не идентифицированных. Изучив данный учебник, можно получить об- щее, если не сказать — широкое, понимание сущ- ности иммунного ответа. Для этого мы описали фундаментальные элементы и основные концеп- ции иммунологии, объединив в одной книге об- ширные знания в области предмета. Если чита- тель заинтересуется более узкими вопросами, чем те, которые рассмотрены в этом издании, он мо- жет обратиться к современным книгам, статьям, обзорам и обучающим сайтам, один из которых поддерживает данный учебник (см. предисловие).
Глава ЭЛЕМЕНТЫ ВРОЖДЕННОГО И ПРИОБРЕТЕННОГО ИММУНИТЕТА • ВВЕДЕНИЕ Каждый живой организм противостоит посто- янным попыткам вторжения из окружающей его внешней среды Наша иммунная система осна- щена сетью механизмов для охраны от инфек- ционных микроорганизмов, которые иначе мог- ли бы использовать наши тела для своего соб- ственного выживания. Можно сказать, что им- мунная система возникла как система надзора, готовая запускать и поддерживать защитные ре- акции практически против любого опасного чу- жеродного элемента, с которым мы можем встре- титься. Эти защитные механизмы простираются от физических барьеров, таких как кожа, до край- не сложных систем, таких как приобретенный иммунный ответ. В этой главе описаны меха- низмы защиты: элементы, составляющие ее, органы и клетки, участвующие в ней, а также действия участников в иммунной реакции на чужеродные субстанции, проникающие в орга- низм. У позвоночных иммунитет против микроор- ганизмов и их продуктов или других чужерод- ных субстанций, которые могут проникать в орга- низм, подразделяется на два основных вида: врожденный, или неспецифический, и приобретен- ный, или адаптивный. Эти два вида иммунитета, их происхождение, компоненты и взаимодействия и обсуждаются в данной главе. В данной и последующих главах наглядно показано, что врожденные иммунные реакции важны не только потому, что они представля- ют собой независимую ветвь иммунной систе- мы, но и потому, что эти реакции кардинально влияют на характер адаптивных иммунных ре- акций. В ВРОЖДЕННЫЙ ИММУНИТЕТ Врожденный иммунитет существует с рождения и состоит из многих факторов, которые относитель- но неспецифичны, т.е. действуют против почти всех веществ, угрожающих организму. Его принципи- альная роль — обеспечение ранней неспецифичес- кой первой линии защиты против патогенов. Боль- шинство микроорганизмов, с которыми повседнев- но встречается здоровый индивидуум, выявляются и уничтожаются в течение минут или часов врож- денными защитными механизмами. Врожденный иммунитет связан со многими индивидуальными свойствами, определенными на генетическом уровне. Различия во врожденном иммунитете у разных людей могут, кроме того, зависеть от возраста, расы, гормонального и ме- таболического статуса. В данном подразделе опи- сываются главные клеточные, неклеточные и ре- цепторные компоненты врожденного иммуните- та, которые могут служить важной основой для последующего обсуждения связей между врожден- ным и адаптивным иммунитетом Физические и химические барьеры Большинство организмов и чужеродных субстан- ций не в состоянии проникнуть через неповреж- денную кожу, но могут попасть внутрь тела, если она повреждена. Некоторые организмы могут про- никать через сальные железы и волосяные фол- ликулы. Однако низкий pH пота и секрета саль- ных желез, а также наличие различных жирных кислот и гидролитических ферментов (например. лизоцимов), обладающих определенным антимик- робным действием, уменьшают значимость этого пути проникновения инфекции. Кроме того, рас- творимые протеины, такие как интерфероны и
ВРОЖДЕННЫЙ ИММУНИТЕТ 33 определенные компоненты системы комплемен- та. обнаруживаемые в сыворотке (см. гл. 13), уча- ствуют в работе неспецифического иммунитета. Интерфероны — это группа протеинов, выраба- 1ываемых клетками в ответ на вирусную инфек- цию, которые, по существу, приводят окружаю- щие клетки в состояние генерализованной про- 1ивовирусной защиты (см. гл. 11). Активация ком- понентов комплемента в ответ на поступление оп- ределенных микроорганизмов приводит к конт- ролируемому энзиматическому каскаду, который направлен на разрушение мембраны патогенных м и кроорганизмов. Во врожденном иммунитете важным механиз- мом защиты многих участков организма, включая (ыхательный и желудочно-кишечный (ЖКТ) трак- ты, является слизистая оболочка, покрывающая поверхности этих участков. Она является барьером, улавливающим микроорганизмы, которые затем выносятся цилиарными эпителиальными клетками в сторону наружного отверстия. Волосы в носовых проходах и кашлевый рефлекс также способствуют предотвращению инфицирования микроорганизма- ми респираторного тракта. Алкоголь, курение и наркотики подавляют всю эту защитную систему. Альвеолярные макрофаги также удаляют мик- роорганизмы из респираторного тракта. Они, как видно далее, являются фагоцитирующими клет- ками, способными захватывать и уничтожать не- которые микроорганизмы. Другие микроорганиз- мы, которые проникают сквозь барьер слизистой оболочки, могут быть захвачены макрофагами или Потентная стволовая клетка Т-зависимые области лимфа- тических узлов и селезенки В-клеточные области лимфа- тических узлов, селезенки, пейеровых бляшек и миндалин Макрофаг Тучная клетка Дендритная клетка • Рис. 2.1. Путь развития различных типов клеток из потентной стволовой клетки костного мозга
34 ГЛАВА 2. ЭЛЕМЕНТЫ ВРОЖДЕННОГО И ПРИОБРЕТЕННОГО ИММУНИТЕТА • Рис. 2.2. Эндоцитоз и фагоцитоз, осуществляемые макрофагами иным способом перенесены в лимфатические узлы, где многие из них уничтожаются. Среда в ЖКТ враждебна для многих микроор- ганизмов благодаря таким врожденным механиз- мам, как гидролитические ферменты в слюне, низкий pH в желудке и протеолитические фер- менты и желчь в тонком кишечнике. Низкий pH во влагалище выполняет ту же функцию. Клеточная защита Если микроорганизм-агрессор преодолевает раз- личные физические и химические барьеры, он встречается со следующей линией обороны, со- стоящей из специализированных клеток, целью которых является его уничтожение. Существует несколько типов клеток, выполняющих эту функ- цию. Пути развития гемопоэтических клеток и взаимодействие между разными типами клеток, которые будут обсуждаться в данной и последую- щих главах, представлены на рис. 2.1. Фагоцитоз и внеклеточный киллинг Как часть врожденной иммунной системы орга- низм выработал защиту, осуществляемую посред- ством специализированных клеток, которые унич- тожают проникающие микроорганизмы, сначала заглатывая их, а затем разрушая (фагоцитоз), или убивая вне клетки (без заглатывания) Эндоцитоз и фагоцитоз Два врожденных иммунных механизма вызывают интернализацию чужеродных макромолекул и клеток и могут привести к их внутриклеточному разрушению и удалению. Происходящие при этом процессы называют эндоцитозом и фагоцитозом. Эндоцитоз Эндоцитоз — это процесс, посредством которого макромолекулы, находящиеся во внеклеточной тканевой жидкости, заглатываются клетками. Он может осуществляться посредством или пиноци- тоза, при котором происходит неспецифическая инвагинация мембраны, или через опосредован- ный рецептором эндоцитоз — процесс, включаю- щий селективное (избирательное) связывание макромолекул со специфичными рецепторами мембраны. В обоих случаях заглатывание чуже- родных молекул приводит к появлению эндоци- тозных пузырьков, наполненных чужеродным ма- териалом, которые затем сливаются с эндо-
ВРОЖДЕННЫЙ ИММУНИТЕТ 35 плазматическими тельцами с кислым содержи- мым, называемыми эндосомами. В свою очередь эндосомы сливаются с лизосомами, содержащи- ми ферменты (т.е. нуклеазы, липазы, протеазы), чтобы расщепить проглоченные макромолекулы до небольших продуктов распада, включающих нуклеотиды, сахара и пептиды (рис. 2.2). Фагоцитоз Фагоцитоз — это поглощение отдельными клет- ками агрессивных чужеродных агентов, таких как бактерии. Это основной защитный механизм им- мунной системы. Многие микроорганизмы вы- свобождают вещества, привлекающие клетки-фа- гоциты Фагоцитоз может быть усилен рядом фак- торов, которые делают чужеродный агент более легкой мишенью. Все эти факторы называют оп- сонинами (от греческого слова, означающего «го- товить пишу»); к ним относят антитела и раз- личные сывороточные компоненты комплемента (см. гл. 13). После захвата инородная частица за- ключается в фагоцитарную вакуоль (фагосому). которая сливается с лизосомой, формируя фаго- лизосому (см. рис. 2.2). Из лизосом высвобожда- ются активные ферменты, которые переваривают частицу. Фагоциты также могут повреждать внедрив- шиеся патогены, производя токсические вещества во время процесса, называемого респираторным взрывом. Эти токсические метаболиты начинают вырабатываться во время фагоцитоза патогенов, таких как бактерии, и катализируются рядом вза- имосвязанных ферментных процессов. Наиболее важными из токсических метаболитов являются окись азота (индуцибельная NO-синтаза), пере- кись водорода и супероксидный анион (фагоци- • Рис. 2.3. Полиморфно-ядерный лейкоцит (окруженный эритроцитами в мазке крови) с трехдольчатым ядром и цитоплазматическими гранулами (х950) (с любезного разрешения д-ра AC Enders, School of Medicine, University of California at Davis) тарная НАДФН-оксидаза), а также хлорноватис- тая кислота (миелопероксидаза). Каждый из них является токсичным для бактерий. Эти микроби- цидные продукты могут повреждать и клетки орга- низма. К счастью, ряд защитных энзимов, выра- батываемых фагоцитами, контролируют действия этих веществ, так что их микробицидная ак- тивность в основном ограничена фаголизосомой (т.е. слившимися фагосомой и лизосомой — см. рис. 2.2), и таким образом направляют токсиче- ское действие на захваченные патогены. К этим защитным ферментам относятся каталаза, кото- рая расщепляет перекись водорода, и супероксид- дисмутаза, которая преобразует супероксидный анион в перекись водорода и кислород. Отсут- ствие или поломка одного из компонентов рес- пираторного взрыва в фагоцитарных клетках про- является в форме иммунодефицита, который пред- располагает организм к рецидивирующим респи- раторным инфекциям (см. гл. 17). Клетки, участвующие в работе врожденной иммунной системы Многие типы клеток участвуют в работе механиз- мов врожденной иммунной системы организма. Как указывалось ранее, фагоцитоз является ос- новным защитным механизмом и осуществляется клетками нескольких типов, включая ПМЯ лей- коциты, фагоцитирующие моноциты (например, макрофаги) и фиксированные макрофаги ретику- лоэндотелиальной системы. При активации все эти клетки высвобождают растворимые вещества, называемые цитокинами, которые оказывают раз- ное действие на различные клегки (см. гл. 11). Многие из этих и других клеток, участвующих в работе врожденной иммунной системы, также вовлечены в основные этапы активизации адап- тивной иммунной системы, включая презентацию антигена. Полиморфно-ядерные лейкоциты Полиморфно-ядерные лейкоциты представляют собой популяцию клеток, также относящуюся к гранулоцитам. В нее входят базофилы, тучные клетки, эозинофилы и нейтрофилы. Гранулоци- ты являются короткоживущими фагоцитарными клетками, содержащими богатые ферментами ли- зосомы, которые могут способствовать разруше- нию инфицирующих микроорганизмов (рис. 2.3). Они могут также вырабатывать пероксидные и супероксидные радикалы, токсичные для боль- шинства микроорганизмов. Некоторые лизосо- мы также содержат бактерицидные протеины, такие как лактоферрин. Полиморфно-ядерные лейкоциты играют большую роль в защите от инфекции. Нарушения их функции сопровож- даются хроническими или рецидивирующими инфекциями.
36 ГЛАВА 2. ЭЛЕМЕНТЫ ВРОЖДЕННОГО И ПРИОБРЕТЕННОГО ИММУНИТЕТА Макрофаги Макрофаги — это фагоциты, развивающиеся из моноцитов крови (рис. 2.4). Моноцит сам по себе является маленькой сферической клеткой с не- большим числом выпячиваний, широким цито- плазматическим ободком, небольшим эндоплаз- матическим ретикулумом и множеством гранул. После миграции моноцитов из крови в разные ткани они претерпевают дальнейшую дифферен- цировку в разные гистологические формы, кото- рые участвуют в фагоцитозе. Эти клетки вклю- чают: • купферовские клетки — крупные клетки с мно- жеством цитоплазматических выпячиваний, находятся в печени; • альвеолярные макрофаги — в легких; • макрофаги селезенки — в белой пульпе; • перитонеальные макрофаги — свободно плава- ют в перитонеальной жидкости; • микроглиальные клетки — в ЦНС. Каждая из этих популяций макрофагов входит в ретикулоэндотелиальную систему (РЭС), кото- рая распространена по всему организму. Основ- ная функция РЭС — фагоцитоз микроорганиз- мов и инородных веществ, находящихся в крови и разных тканях. Она также участвует в разруше- нии старых и поврежденных клеток, например эритроцитов. Многие из этих клеток, по-разному названные и расположенные, имеют, однако, общие свой- ства, такие как способность связывать и захваты- вать частицы вещества и антигены. В связи с тем что они располагаются вдоль капилляров, эти клет- ки чаще всего первыми вступают в контакт с аг- рессивными патогенами и антигенами, а также, • Рис. 2.4. Изображение, полученное при сканирующей электронной микроскопии. Макрофаг со складчатыми мембранами и поверхностью, покрытой микроворсинка- ми (х5200) (с любезного разрешения д-ра KL Erikson, School of Medicine, University of California at Davis; воспро- изведено с разрешения Lippincott/Harper & Row) как мы увидим далее, определяют успешное раз- витие реакций как врожденного, так приобретен- ного иммунитета. Клетки-макрофаги имеют две главные функ- ции. Первая раскрывается их названием («боль- шой пожиратель»). Она заключается в том, что макрофаги захватывают материал и с помощью разрушающих ферментов в своих лизосомальных гранулах расщепляют его на простые аминокис- лоты, сахара и другие вещества для дальнейшего использования или выведения. Таким образом, эти клетки играют ключевую роль в удалении бакте- рий и паразитов из организма. Второй функцией макрофагов, как будет описано в следующих гла- вах, является захват антигенов, обработка (про- цессирование) их путем частичной денатурации или частичного переваривания и презентация на своих поверхностях специфичным Т-клеткам. Это означает, что макрофаги выполняют функцию антигенпрезентирующих клеток (см. гл. 9). Дендритные клетки являются долгоживущими. Они находятся в незрелом состоянии в большин- стве тканей, где распознают и фагоцитируют па- тогены и другие антигены. Дендритные клетки присутствуют в коже в виде интердигитальных клеток тимуса и клеток Лангерганса и развива- ются из тех же гемопоэтических клеток-предше- ственников, что и моноциты. Непосредственный контакт со многими патогенами ведет к созрева- нию дендритных клеток, что в свою очередь зна- чительно увеличивает их антигенпрезентирующую способность. На самом деле, такое созревание позволяет им активировать наивные антигенспе- цифичные Т-клетки. Таким образом, они имеют большое значение как для врожденного иммуни- тета, так и для инициации адаптивных иммунных реакций. По данному краткому описанию можно видеть, что каждый из этих клеточных компонентов врож- денной иммунной системы выполняет разные фун- кции в рамках неспецифической ветви иммунной системы. Они также играют ключевую роль в аф- ферентной, или индукционной, ветви приобретен- ного иммунного ответа (инициируя Т-клеточные реакции). Наконец, макрофаги участвуют в эффе- рентной, или эффекторной, ветви приобретенно- го иммунного ответа на его завершающей стадии в качестве клеток, которые активируются цитокина- ми, вырабатываемыми в основном Т-клетками, что повышает их способность убивать патогены. Клетки — натуральные киллеры Измененные свойства мембран аномальных кле- ток, таких как раковые или пораженные вирусом, распознаются цитотоксическими клетками или клетками-киллерами, которые уничтожают клет- ку-мишень не путем фагоцитоза, а высвобождая биологически активные молекулы, которые в те- чение очень короткого промежутка времени ее убивают. К таким клеткам-киллерам относят ан-
ВРОЖДЕННЫЙ ИММУНИТЕТ 37 тигенспецифичные цитотоксические Т-лимфоци- ты, являющиеся элементами адаптивной или при- обретенной иммунной системы (более детально обсуждается в гл. 10), и натуральные киллеры (natural killers — NК-клетки), которые являются элементами врожденной иммунной системы. Натуральные киллеры, вероятно, играют опре- деленную роль на ранних стадиях вирусной ин- фекции или онкогенеза до того, как количество Т-лимфоцитов, представляющих приобретенный иммунный ответ, увеличится. Натуральные кил- леры представляют собой гранулярные лимфоци- ты, способные лизировать определенные клетки, зараженные вирусом, и опухолевые клетки без предварительной стимуляции. В отличие от ци- тотоксических Т-лимфоцитов, которые распозна- ют несущие антиген клетки-мишени с помощью своих TCR, NK-клетки не имеют собственных антигенспецифичных TCR. Как же в таком слу- чае они распознают и уничтожают свои мишени? Натуральные киллеры делают это посредством механизма, включающего прямой межклеточный контакт, который позволяет им выяснить, утра- тила ли потенциальная клетка-мишень собствен- ный специфичный антиген — белок МНС I клас- са. Главные комплексы гистосовместимости I класса экспрессируются практически на всех об- ладающих ядром клетках. Натуральные киллеры экспрессируют рецепторы, не родственные TCR, называемые ингибиторными рецепторами клеток- киллеров (killer cell inhibitory receptors — KIR), которые связываются с молекулами МНС I клас- са. Если KIR связываются, то клетка-мишень за- щищается от разрушения NK-клетками. На ин- фицированных вирусом или трансформированных (опухолевых) клетках уменьшается количество мо- лекул МНС I класса. Таким образом, когда по- добные клетки встречаются с NK-клетками, они не могут эффективно задействовать такие KIR и становятся чувствительными к цитотоксичности, опосредованной NK-клетками (рис. 2.5). Ингибиторный рецептор NK-клетки Мертвая I клетка Ишибиторный рецептор NK-клетки Инфицированная вирусом Лизис • Рис. 2.5. Лизис и ингибиторные рецепторы NK-клеток икиллинг Уничтожение клеток-мишеней достигается пу- тем высвобождения различных цитотоксических молекул. Некоторые из этих молекул вызывают образование пор в мембране клетки-мишени, ве- дущее к их лизису. Другие молекулы проникают в клетки-мишени и вызывают апоптоз (програм- мируемую гибель клетки) клетки-мишени, уси- ливая фрагментацию ее ядерной ДНК. Активность NK-клеток значительно усиливается растворимы- ми медиаторами, такими как IL-2, IL-12 и интер- феронами. Как указано в гл. 11, IFNa и IFNp яв- ляются противовирусными протеинами, синтези- руемыми и высвобождаемыми лейкоцитами, фиб- робластами и клетками, инфицированными ви- русами. Интерлейкин-2 и IFNy высвобождаются активированными Т-лимфоцитами. NK-T-клетки Другой популяцией клеток с фенотипическими и функциональными свойствами, сходными со свой- ствами NK-клеток, являются NK-Т-клетки тими- ческого происхождения. Как и другие Т-клетки. они экспрессируют TCR. хотя с ограниченной вариабельностью. В отличие от других Т-клеток эти клетки экспрессируют маркер, называемый NK1.1, который распознает МНС-ассоциирован- ный CDl-рецептор, экспрессируемый на антиген- презентирующих клетках. Т-клетки с маркером NK-L1 отличаются по своим функциональным возможностям, поскольку они выполняют функ- ции и врожденной, и адаптивной иммунных си- стем. После активации они секретируют несколько цитокинов, включая IL-4 и IFNy (таким образом они выполняют иммунорегуляторную функцию) и убивают клетки-мишени посредством взаимо- действия рецептора Fas с лигандом Fas. Воспаление Важной функцией фагоцитирующих клеток яв- ляется их участие в воспалении — основном ком- поненте защитного механизма организма. Далее описаны важные аспекты воспаления. Воспаление представляет сложный процесс, инициируемый повреждением тканей, которое вызвано эндогенными (такими как некроз тканей или перелом кости) и экзогенными факторами. Эти факторы включают различные виды повреж- дений, такие как механическое (например, порез), физическое (ожог), химическое (например, кон- такт с агрессивным веществом) повреждение, био- логическое воздействие (например, инфицирова- ние микроорганизмами: см. гл. 20) и иммуноло- гическое повреждение (например, реакция гипер- чувствительности: см. гл. 14— 16). Воспалитель- ная реакция составляет важную часть как врож- денного, так и приобретенного иммунитета. Она возникла как защитная реакция против повреж- дения и инфекции. Хотя в определенных случа-
38 ГЛАВА 2. ЭЛЕМЕНТЫ ВРОЖДЕННОГО И ПРИОБРЕТЕННОГО ИММУНИТЕТА ях, таких как гиперчувствительность, когда вос- паление скорее является проблемой, чем ее ре- шением, воспалительная реакция в основном бы- вает защитной, т.е. представляет собой один из ответов на повреждение, и направлена на воз- вращение поврежденных тканей в нормальное со- стояние. Главными признаками воспаления являются боль, покраснение и повышение температуры. Каждый из них является результатом специфи- ческих изменений состояния локальных кровенос- ных сосудов. Боль вызывается увеличением диа- метра сосудов, что ведет к усилению кровотока. таким образом приводя к повышению температу- ры и появлению красноты в данном месте. По- следующее уменьшение скорости тока крови и со- путствующая экспрессия так называемых молекул адгезии, вызванная цитокинами и кининами на эндотелиальных клетках, выстилающих кровенос- ные сосуды, способствует связыванию циркулиру- ющих лейкоцитов. Эти события облегчают при- крепление лейкоцитов и проникновение их в тка- ни, а также привлечение нейтрофилов и моноци- тов к месту воспаления. Другим важным измене- нием в местных кровеносных сосудах является повышение их проницаемости. Оно происходит в связи с расхождением до этого тесно сомкнутых эндотелиальных клеток, выстилающих кровенос- ные сосуды, что ведет к выходу жидкости и про- теинов из крови и накоплению их в ткани. Все это приводит к отеку, сопутствующему воспале- нию, что также значительно усиливает боль. В течение нескольких минут после поврежде- ния начинается воспалительный процесс, при котором происходит активация и повышается кон- центрация фармакологически активных субстан- ций, таких как группа протеинов, называемых белками острой фазы воспаления. Реакции ост- рой фазы запускают местные и системные реак- ции. Локализованные воспалительные реакции частично возникают в результате активации ки- нинов и коагуляционной системы (свертывание). Кинины обладают несколькими важными функ- циями: • они действуют непосредственно на местную гладкую мускулатуру и вызывают сокращение мышц; • они действуют на аксоны, блокируя нервные импульсы, что ведет к релаксации дистальных мышц; • особенно важно то, что они действуют на клет- ки сосудистою эндотелия (например, вазоак- тивный пептид брадикинин), вызывая их сокра- щение (что ведет к повышению проницаемо- сти сосудов) и экспрессию молекул адгезии эн- дотелиальных клеток (endothelial cell adhesion molecules — ЕСАМ), ведущую к адгезии лей- коцитов и экстравазациш, • кинины представляют собой очень сильные нервные стимуляторы; они являются молеку- лами, в наибольшей степени отвечающими за боль (и зуд), связанную с воспалением. После активации кинины быстро инактивиру- ются протеазами, вырабатываемыми во время ло- кализованных реакций. Коагуляционный каскад состоит из ферментов плазмы, которые последовательно активируются вслед за повреждением кровеносных сосудов. Его роль в воспалительной реакции заключается в формировании физического барьера (сгусток), который препятствует поступлению микроорга- низмов в кровоток. Системная воспалительная реакция включает появление лихорадки (рассматривается далее), уве- личение продукции лейкоцитов, усиленный син- тез гидрокортизона и адренокортикотропного гор- мона (АКТГ) и выработку острофазовых белков (см. гл. 11). Среди острофазовых протеинов важ- ное место занимает С-реактивный белок. Он связывается с мембраной определенных микро- организмов и активирует систему комплемента (см. гл. 13). Это приводит к лизису микроорга- низма или усиленному фагоцитозу фагоцитарны- ми клетками, а также к другим важным биологи- ческим проявлениям, как мы увидим далее. Цитокины играют ключевую роль в воспали- тельной реакции. Интерлейкины-1 и -2 и фактор некроза опухоли a (tumor necrosis factor — TN Fa) входят в число наиболее важных цитокинов, вов- леченных в реакцию (см. гл. И). Эти цитокины, высвобождаемые активированными макрофагами, вовлекают в процесс молекулы адгезии на стен- ках эндотелиальных клеток сосудов, к которым прикрепляются нейтрофилы, моноциты и лимфо- циты перед тем, как выйти из сосуда (процесс, называемый экстравазацией) в поврежденную ткань. Эти цитокины также вызывают коагуля- цию и увеличение проницаемости сосудов. Про- чие цитокины, включая 1L-8 и IFNy, действуют иначе, в частности повышают хемотаксис лейко- цитов и усиливают фагоцитоз. Все эги эффекты приводят к скоплению жидкости (отек) и лейко- цитов в поврежденных участках. Это в свою оче- редь усиливает реакцию, поскольку вместе с жид- костью перемещаются, а также высвобождаются из скопившихся клеток биологически активные соединения, привлекая и активируя еще больше клеток. Большинство клеток, вовлеченных в воспали- тельную реакцию, являются клетками-фагоцита- ми, первоначально представляемыми ПМЯ-лей- коцигами, которые накапливаются в течение 30 — 60 мин, фагоцитируют внедрившегося возбудите- ля или повреждают ткань и высвобождают лизо- сомальные ферменты, пытаясь уничтожить агрес- сора. Если причина воспалительной реакции со- храняется и после этого, в течение 4 —6 ч данное место будет инфильтрировано мононуклеарными клетками, такими как макрофаги и лимфоциты Макрофаги дополняют фагоцитарную активность
ВРОЖДЕННЫЙ ИММУНИТЕТ 39 ПМЯ-клеток, таким образом усиливая защиту уча- стка. Более того, макрофаги участвуют в процес- сировании и презентации антигенов лимфоцитам, которые реагируют на чужеродные антигены аг- рессора, запуская приобретенную иммунную ре- акцию, специфичную для этих антигенов. В случае сохранения повреждения или про- должения инвазии со стороны микроорганизмов воспалительная реакция будет поддержана и уси- лена элементами приобретенного иммунитета, включая антитела и клеточно-опосредованный иммунитет. Участие антител обеспечивает запуск каскада комплемента, в котором активируются и высвобождаются фармакологически активные ве- щества. К последним относятся вещества, уве- личивающие проницаемость сосудов и расшире- ние капилляров, а также хемотаксические веще- ства, которые притягивают и активируют допол- нительные ПМЯ-клетки и антигенспецифичные лимфоциты. Сами по себе лимфоциты способны уничтожать некоторые чужеродные патогены. Однако важнее то, что они высвобождают цито- кины, которые активируют макрофаги и другие клетки для участия в разрушении и выведении агрессора. Многие вещества, активированные во время воспалительной реакции, участвуют в восстанов- лении поврежденных тканей. Во время этого процесса многие клетки, включая лейкоциты, уничтожаются. Макрофаги, находящиеся в дан- ном месте, фагоцитируют остатки, и воспале- ние уменьшается. Ткань может возвращаться в нормальное состояние или же образуется руб- цовая ткань. В некоторых случаях трудно или невозможно устранить причину воспаления. Поэтому возни- кает хроническое воспаление, наблюдаемое при хронических инфекциях (например, туберкулезе), или постоянная активация иммунной реакции (например, при ревматоидном артрите и гломе- рулонефрите). В этих случаях воспалительная ре- акция продолжается и может быть только времен- но изменена назначением противовоспалительных средств, таких как аспирин, ибупрофен и корти- зон. Эти и другие лекарства действуют на некото- рые метаболические пути, обеспечивающие про- дукцию и активацию ряда фармакологических медиаторов воспаления. Однако они не влияют на основную причину воспаления, и при их от- мене симптомы могут появиться вновь. Лихорадка Хотя лихорадка является наиболее частым прояв- лением инфекции и воспаления, информация о ее значении в протекании инфекции у млекопи- тающих еще довольно скудна. Лихорадку могут вызывать многие вещества, вырабатываемые бак- териями, особенно эндотоксины грамотрицатель- ных бактерий, но обычно она возникает в резуль- тате высвобождения эндогенных пирогенов, кото- рые вырабатываются моноцитами и макрофага- ми, в частности IL-1 и определенными интерфе- ронами. Биологически активные вещества Многие ткани синтезируют вещества, губитель- ные для микроорганизмов. Их примерами могут служить расщепляющие ферменты, токсичные сво- бодные радикалы, кислоты, ингибиторы роста, острофазовые протеины и интерфероны. Таким образом, в зависимости от способности синтези- ровать эти вещества некоторые ткани могут обла- дать повышенной резистентностью к инфекции, вызванной некоторыми микроорганизмами Рецепторы, входящие в систему врожденного иммунитета В отличие от адаптивной иммунной системы, ко- торая использует антигенспецифичные рецепто- ры, чтобы позволить эффекторным Т- и В-клет- кам определить подходящие антигены, врожден- ная иммунная система не обладает такой специ- фичностью. Эти рецепторы не распределяются клонально в отличие от антигенспецифичных ре- цепторов. Таким образом, данный набор рецеп- торов будет присутствовать на всех клетках одно- го клеточного типа. Эта особенность клеточных рецепторов врожденной иммунной системы ка- сается и тех рецепторов, которые вовлечены в фагоцитоз. Например, нейтрофилы экспрессиру- ют /-Met-Leu-Phe-рецептор, хемотаксический рецептор, который связывает N-формилирован- ные петиды, присутствующие на определенных бактериях, и направляет нейтрофилы к месту ин- фекции. На многих типах клеток, принадлежащих врож- денной иммунной системе, экспрессируются так- же семейства рецепторов, распознающих структу- ры патогенных микроорганизмов (pattern recognition receptors — PRR). Эти рецепторы распознают кон- сервативные микробные структуры, которые мо- гут служить отличительными признаками опре- деленных классов патогенов. Одним из типов PRR является маннансвязывающий (МС) лектин, по- зволяющий фагоцитам распознавать экспресси- руемые микробом полисахариды, которые имеют структуру, состоящую из остатков этого моноса- харида с определенным интервалом; такая струк- тура не обнаруживается на клетках макроорганиз- ма. Связывание присутствующего на фагоцитах МС-лектина (рецептора) с этими сахарами ини- циирует и активирует МС-лектиновый путь ком- племента. Это приводит к выработке компонен- тов комплемента, которые покрывают микроор- ганизм (опсонизация), делая их более чувствитель- ными к фагоцитозу (см. гл. 13). Следующую группу
40 ГЛАВА 2. ЭЛЕМЕНТЫ ВРОЖДЕННОГО И ПРИОБРЕТЕННОГО ИММУНИТЕТА фагоцитарных рецепторов представляют рецепто- ры-мусорщики (scavenger receptors — SR), кото- рые распознают специфические анионные поли- меры и ацетилированные липопротеины низкой плотности, экспрессируемые как определенны- ми патогенами, так и старыми поврежденными эритроцитами, что ведет к удалению этих кле- ток. Недавно было открыто семейство Toll-подоб- ныхрецепторов (Toll-like receptor — TLR), игра- ющих важную роль в распознавании патоген- специфичных компонентов, присущих микро- организмам. Toll-генное семейство было открыто в связи с его участием в формировании дорсаль- ных и вентральных структур у эмбриона Drosophila melanogaster. Позднее исследования показали, что Toll-гены кодируют белки, которые играют реша- ющую роль во врожденной иммунной реакции мух на микробную инфекцию. Дальнейшее исследо- вание подтвердило существование гомологичных белков у млекопитающих (TLR), которые могут активировать фагоциты и тканевые дендритные клетки для борьбы с патогенами. Toll-подобные рецепторы составляют большое семейство, и каж- дый распознает специфические микробные ком- поненты. Активация TLR микробными компонен- тами ведет не только к активации врожденной иммунной системы, но и к развитию адаптивного иммунитета за счет выработки провоспалитель- ных цитокинов и экспрессии костимулируюших молекул. АДАПТИВНЫЙ (ПРИОБРЕТЕННЫЙ) ИММУНИТЕТ Если инфицирующий агент не уничтожается по- средством неспецифических механизмов врожден- ного иммунитета, включается адаптивный иммун- ный ответ с выработкой антигенспецифичных лим- фоцитов (эффекторные клетки) и клеток памя- ти. которые могут предотвратить повторное ин- фицирование тем же микроорганизмом. Такие адаптивные ответы (иногда называемые приобре- тенными) развиваются долгое время (более 96 ч), поскольку редкие В- и Т-клетки, специфичные для вторгшегося микроорганизма, должны прой- ти через клональную экспансию (размножение клона) до того, как смогут дифференцироваться в эффекторные клетки, способствующие устране- нию инфекции. В отличие от врожденного имму- нитета, присущего каждому живому организму, адаптивный иммунитет является более специали- зированной формой. Он возник на позднем этапе эволюции и существует только у позвоночных. Различные элементы, участвующие в работе врож- денного иммунитета, не отличаются специфич- ностью к чужеродным агентам, с которыми они сталкиваются, в то время как приобретенный иммунитет всегда обладает такой специфичностью. Как и подразумевает его название, приобретен- ный иммунитет является следствием встречи с инородной субстанцией. Первая встреча с опре- деленной инородной субстанцией, проникшей в организм, запускает цепь событий, вызывающих иммунную реакцию, специфическую по отноше- нию к данной субстанции. КЛЕТКИ И ОРГАНЫ, ВОВЛЕЧЕННЫЕ В АДАПТИВНЫЙ ИММУННЫЙ ОТВЕТ Приобретенный иммунитет обычно проявляется только после первой встречи с каким-либо ве- ществом. Таким образом, он развивается только после контакта или иммунизации таким веще- ством. Существуют две основные популяции лим- фоцитов, являющихся элементами приобретен- ного иммунитета: В-лимфоциты (названные так, поскольку они происходят из костного мозга (от англ, bone marrow) и Т-лимфоциты (поскольку их дифференцировка происходит в тимусе). Имен- но В- и Т-лимфоциты определяют ту специфич- ность, которая присуща реакциям приобретен- ного иммунитета. В-лимфоциты синтезируют и выделяют в кровеносное русло антитела, специ- фичные по отношению к чужеродной субстан- ции. Этот процесс называется гуморальным им- мунитетом. Т-лимфоциты, которые обладают специфичностью по отношению к чужеродной субстанции, опосредованной их рецепторами (TCR), не производят антител, но осуществляют различные эффекторные функции, когда АПК доставляют антигены во вторичные лимфоидные органы. Т-лимфоциты также взаимодействуют с В-клетками, помогая последним вырабатывать антитела; они активируют макрофаги и играют главную роль в развитии и регуляции приобре- тенного иммунитета (см. гл. 10). Приобретенный иммунитет, опосредованный Т-лимфоцитами, называется клеточным или клеточно-опосредо- ванным иммунитетом. Как мы уже знаем, мак- рофаги являются фагоцитирующими клетками; они не проявляют специфичности по отноше- нию к определенной субстанции, но вовлечены в процессирование и презентацию чужеродных субстанций Т-лимфоцитам, а также активацию Т-лимфоцитов (см. гл. 9 и 10). У представителей млекопитающих циркулиру- ющие клетки крови имеют общее происхождение из небольшого кластера клеток, которые переме- шаются из примитивного желточного мешка в за- родышевую печень и, наконец, в костный мозг, где находятся постоянно. Эти клетки являются ге- мопоэтическими стволовыми клетками, называ- емыми так потому, что они являются недиффе- ренцированными клетками, из которых развива- ются все другие специализированные клетки крови (см. рис. 2.1).
КЛЕТКИ И ОРГАНЫ, ВОВЛЕЧЕННЫЕ В АДАПТИВНЫЙ ИММУННЫЙ ОТВЕТ 41 Эти недифференцированные стволовые клет- ки характеризуются способностью пролифериро- вать на протяжении жизни как самообновляющий- ся резервуар, пополняющий пул более зрелых клеток по мере их использования в период нор- мальной жизнедеятельности. Эти ранние стволо- вые клетки считаются плюрипотентными, т.е. спо- собными развиваться в любую более дифферен- цированную линию клеток под влиянием различ- ных растворимых факторов, контролирующих как интенсивность, так и направление созревания. Выделению и описанию этих самых первых гемо- поэтических и плюрипотентных стволовых кле- ток способствовало недавнее обнаружение на их поверхности молекул, отнесенных к CD34 (но- менклатура CD обсуждается в гл. 5). Экспрессия CD34 вполне специфична для ранних клеток- предшественников (так же как и для эндотели- альных клеток). Начав дифференцировку в каком- либо направлении, клетка становится коммити- рованной к продукции клеток одной линии, т.е. унипотентной, при этом экспрессия CD34 умень- шается. Один путь дифференцировки (миелоид- ная дифференцировка) начинается из стволовых клеток костного мозга и порождает различные дифференцированные клетки-предшественники, а заканчивается эритроцитами, тромбоцитами и различными гранулосодержащими клетками гра- нулоцитарно-моноцитарной линии Другой путь дифференцировки (лимфоидная дифференцировка) ведет к образованию двух различных типов кле- ток, называемых Т- и В-лимфоцитами. Лимфатические органы Лимфатическими называются органы, в которых происходят созревание, дифференцировка и про- лиферация лимфоцитов. Эти органы обычно раз- деляют на два вида. Первичными (центральными) лимфоидными органами являются те из них, в ко- торых Т- и В-лимфоциты созревают в антиген- распознающие лимфоциты. Как мы увидим из следующих глав, развивающиеся Т- и В-клетки приобретают свои антигенспецифичные рецеп- торы в первичных лимфоидных органах. Зрелые В- и Т-лимфоциты мигрируют из костного мозга и тимуса соответственно через кровоток к пери- ферическим лимфоидным тканям, к которым от- носят лимфатические узлы, селезенку и лим- фатические ткани ЖКТ, такие как миндалины. В таких вторичных (периферических) лимфоидных органах происходят антигензависимая пролифе- рация и дифференцировка (рис. 2.6). Первичные лимфоидные органы Существует два основных первичных лимфоид- ных органа, в одном из которых развиваются Т-клетки, а в другом — В-клетки. Аденоиды Миндалины Правая подключичная вена Лимфатический узел Почки Аппендикс Лимфатические сосуды Сердце Грудной проток Селезенка Костный мозг Толстый кишечник Пейеровы бляшки в тонком кишечнике Левая подключичная вена Тимус • Рис. 2.6. Распределение лимфоидных тканей в теле (воспроизведено с разрешения FS Rosen и RS Geha, Case Studies in Immunology, Garland Publishing) Тимус Клетки-предшественники из костного мозга миг- рируют в первичный лимфоидный орган — ти- мус, в котором они дифференцируются в Т-лим- фоциты Тимус является железой, состоящей из двух долек и происходящей из энтодермы треть- его и четвертого глоточных карманов (рис. 2.7). В период развития плода размер тимуса увеличи- вается. Рост продолжается до наступления пубер- татного периода. В дальнейшем тимус постепен- но атрофируется. Тимус является лимфоэпителиальным органом и состоит из эпителиальных клеток, организую- щих кортикальную (наружную) и медуллярную (центральную) зоны, инфильтрированные лимфо- идными клетками (тимоцитами). Кора плотно заполнена лимфоцитами разных размеров, боль- шинство из которых являются незрелыми, и рас- сеянными макрофагами, участвующими в удале- нии апоптозных тимоцитов. Т-лимфоциты созре- вают в корковом веществе и мигрируют в мозго- вое, в котором встречаются с макрофагами и ден- дритными клетками. Здесь они подвергаются ти- мической селекции, которая приводит к разви- тию зрелых функциональных Т-клеток, которые затем выходят из железы и попадают в перифери- ческий кровоток, посредством которого транспор- тируются во вторичные лимфоидные органы. (Раз- витие Т-клеток детально обсуждается в гл. 8.) Именно во вторичных лимфоидных органах Т-клетки контактируют с чужеродными антиге- нами и реагируют на них. Созревание Т-лимфоцитов предполагает появ- ление у данных Т-клеток способности распозна- вать и реагировать на определенную детерминан-
42 ГЛАВА 2. ЭЛЕМЕНТЫ ВРОЖДЕННОГО И ПРИОБРЕТЕННОГО ИММУНИТЕТА • Рис. 2.7. Клеточная организация тимуса (воспроизведено с разрешения FS Rosen и RS Geha, Case Studies in Immunology, Garland Publishing) ту или эпитоп чужеродного антигена. Подобное распознавание достигается с помощью специфич- ного рецептора на Т-клетке (TCR), который при- обретается в период дифференцировки в тимусе (см. гл. 8). Созревшие Т-лимфоциты в мозговом веществе способны реагировать на чужеродные антигены таким же образом, как они реагировали бы во вторичных лимфоидных органах. Однако тимус считается первичным лимфоидным орга- ном, поскольку является местом, где клетки диф- ференцируются, чтобы экспрессировать TCR. Созревание Т-лимфоцитов происходит в основ- ном в период развития плода и короткое время после рождения. У мышей удаление тимуса в нео- натальном периоде приводит к серьезному сни- жению качества и количества Т-лимфоцитов и вызывает потенциально смертельный рант-синд- ром (вейстинг-синдром). Удаление тимуса у взрос- лой особи обычно не оказывает сильного влия- ния на количество и качество Т-лимфоцитов, ко- торые к этому времени уже созрели и заселили вторичные лимфоидные органы. Однако удаление этой железы у взрослого может иногда привести к дефициту Т-клеток в случае неожиданной гибе- ли Т-клеток, обычно населяющих вторичные лим- фоидные органы (как это происходит после об- щего облучения организма). Без тимуса не будет существовать и механизм для повторного заполне- ния вторичных органов новыми Т-лимфоцитами Только 5 — 10 % созревающих лимфоцитов вы- живают и в последующем покидают тимус; 90 — 95 % всех тимоцитов погибают в тимусе. Понят- но, что погибают, а потому удаляются те лимфо- циты, которые приобрели специфичность отно- сительно собственных структур организма или не способны создать функциональные рецепто- ры. У выживших лимфоцитов развивается специ- фичность к чужеродным антигенам. Все это будет детально обсуждаться в гл. 9. Фабрициева сумка и костный мозг Первичный лимфоидный орган был впервые об- наружен у птиц. Созревание В-клеток у них про- исходит в фабрициевой сумке. Этот орган, распо- ложенный рядом с клоакой, состоит из лимфоид- ных центров, содержащих эпителиальные клетки и лимфоциты. В отличие от лимфоцитов в тимусе эти лимфоциты состоят исключительно из про- дуцирующих антитела В-клеток (см. гл. 7). Млекопитающие не имеют фабрициевой сум- ки. Поэтому чтобы выявить у них эквивалент пер- вичного лимфоидного органа, в котором В-клет- ки развиваются и созревают, понадобилось много времени и сил. В настоящее время ясно, что в эмбриональный период жизни В-клетки диффе- ренцируются из гемопоэтических стволовых кле- ток в печени плода. После рождения и в течение
КЛЕТКИ И ОРГАНЫ, ВОВЛЕЧЕННЫЕ В АДАПТИВНЫЙ ИММУННЫЙ ОТВЕТ 43 жизни индивидуума эта функция переходит к ко- стному мозгу — структуре, которая считается пер- вичным лимфоидным органом с функциями, эк- вивалентными функциям фабрициевой сумки у птиц. Каждый зрелый В-лимфоцит несет анти- генспецифичные рецепторы, которые имеют структуру и специфичность, идентичную антите- лу, синтезируемому позднее этой В-клеткой Зре- лые В-клетки переносятся циркулирующей кро- вью во вторичные лимфоидные органы, где встре- чаются с чужеродными антигенами и реагируют на них. Вторичные лимфоидные органы Вторичные лимфоидные органы состоят из опре- деленных структур, в которых зрелые, готовые к распознаванию антигена (антигенкоммитирован- ные) лимфоциты стимулируются антигеном, для того чтобы произошли их дальнейшие деление и дифференцировка. Основными вторичными лим- фоидными органами являются селезенка и лим- фатические узлы. Кроме того, вторичными лим- фоидными органами считаются миндалины, ап- пендикс и кластеры лимфоцитов, распределенные в слизистой оболочке тонкого кишечника (пейе- ровы бляшки}, а также лимфоидные скопления, разбросанные повсеместно в слизистой ткани. Вторичные лимфоидные органы обнаруживаются в разных участках тела, таких как слизистая обо- лочка пищеварительного, респираторного и мо- чеполового трактов, конъюнктива и слюнные же- лезы, где зрелые лимфоциты взаимодействуют с антигенами и подвергаются активации. Эти вто- ричные лимфоидные органы в слизистой оболоч- ке получили название лимфоидной ткани, ассо- циированной со слизистыми оболочками (mucosa- associated lymphoid tissue — MALT). Такие лим- фоидные ткани, связанные с кишечником, назы- ваются ассоциированными с кишечником (gut- associated lymphoid tissue — GALT), а связанные c бронхиальным деревом — ассоциированными с бронхами (bronchus-associated lymphoid tissue — BALT). Вторичные лимфоидные органы имеют две основные функции: они крайне эффективны при улавливании и концентрации чужеродных субстан- ций и являются основными местами продукции антител и индукции антигенспецифичных Т-лим- фоцитов. Селезенка Селезенка является крупнейшим вторичным лим- фоидным органом (рис. 2.8). Она крайне эффек- тивна в улавливании и концентрации чужерод- ных субстанций, переносимых кровью. Селезен- ка является главным органом тела, в котором син- тезируются антитела и из которого они затем вы- свобождаются в кровоток Селезенка состоит из белой пульпы, богатой лимфоидными клетками, • Рис. 2.8. Селезенка: общий вид и вид в разрезе (вос- произведено в разрешения FS Rosen и RS Geha, Case Studies in Immunology, Garland Publishing) и красной пульпы, которая содержит много сину- сов, а также большое количество эритроцитов и макрофагов, некоторое количество лимфоцитов и несколько других типов клеток. Вокруг небольших артериол расположены уча- стки белой пульпы, периферические области ко- торых богаты Т-клетками; В-клетки находятся в основном в зародышевых центрах. Примерно 50 % клеток селезенки составляют В-лимфоциты, 30 — 40 % — Т-лимфоциты. После стимулирования ан- тигенами зародышевые центры содержат большое число В-клеток и плазматических клеток. Эти клетки синтезируют и высвобождают антитела. Лимфатические узлы Лимфатические узлы являются небольшими яй- цевидными структурами (обычно до 1 см в диа- метре), находящимися в разных регионах по все- му телу (рис. 2.9). Они располагаются в местах слияний лимфатических сосудов, которые впада- ют в грудной проток. В свою очередь грудной проток переносит лимфу и лимфоциты в полую вену — сосуд, который несет кровь к правой сто- роне сердца (рис. 2.10) и из которого она затем перераспределяется по всему телу. Лимфатические узлы состоят из мозгового ве- щества со многими синусами и коры, окруженной капсулой из соединительной ткани (рис. 2.9, А). Кортикальный участок содержит первичные лим- фоидные фолликулы После антигенной стиму- ляции эти структуры увеличиваются и образуют
44 ГЛАВА 2. ЭЛЕМЕНТЫ ВРОЖДЕННОГО И ПРИОБРЕТЕННОГО ИММУНИТЕТА Вторичный лимфоидный фолликул (в основном В-клетки) Медуллярный синус Трабекула Зона мантии П аракортикальный слой (в основном Т-клетки) Антигенпрезенти- рующие клетки Мозговое вещество Зародышевый центр Капсула Кора Эфферентный лимфатический сосуд (стрелка показывает ток лимфы и лимфоцитов) Афферентный лимфатический сосуд (стрелка показывает ток лимфы и лимфоцитов) Субкапсулярный синус — Первичный лимфоидный фолликул Посткапиллярная венула (стрелка показывает ток лимфоцитов) Б • Рис. 2.9. (А) Срез лимфатическо- го узла. Стрелки показывают движе- ние лимфы и лимфоцитов. (Б) Срез через лимфатический узел с демон- страцией капсулы и субкапсулярно- го синуса, мозгового вещества (вверху слева) и коры, содержащей зародышевые центры. Также показан (вверху справа) фолликул без заро- дышевого центра (х140) (с любезно- го разрешения д-ра AC Ender, School of Medicine, University of California at Davis) вторичные лимфоидные фолликулы с зародыше- выми центрами, содержащими плотные популя- ции лимфоцитов (в основном В-клеток), подвер- гающихся митозу. В ответ на антигенную стиму- ляцию антигенспецифичные В-клетки, пролифе- рирующие внутри этих зародышевых центров, так- же вовлекаются в процесс созревания аффинно- сти, для того чтобы произвести клоны клеток с рецепторами повышенной аффинности (антите- ла) для антигенных эпитопов, запустивших пер- вичную реакцию (см. гл. 7). Оставшиеся антиген- неспецифичные В-клетки выталкиваются наружу для формирования области мантии. Глубокая кор- тикальная зона или паракортикальный регион содержит Т-клетки и дендритные клетки. Анти- гены доставляются в эти зоны дендритными клет- ками, которые презентируют фрагменты антиге- на Т-клеткам, в результате чего они активируют- ся. Медуллярная зона лимфатического узла со- держит плазматические клетки, которые секрети- руют антитела. Эти клетки перемещаются из коры в медуллярную область по лимфатическим сосу- дам. Лимфатические сосуды высоко эффективны в улавливании антигена, поступающего через аф- ферентные лимфатические сосуды. В узле ан- тиген взаимодействует с макрофагами, Т-клет- ками и В-клетками. Это взаимодействие вызы- вает иммунный ответ, проявляющийся выработ- кой антител и антигенспепифичных Т-клеток. Лимфа, антитела и клетки покидают лимфати- ческий узел через эфферентный лимфатический сосуд, расположенный как раз под медуллярной областью.
СУДЬБА АНТИГЕНА ПОСЛЕ ПЕНЕТРАЦИИ 45 Рис. 2.10. Циркуляция лим- фы и судьба антигена после поступления: 1) через кровоток; 2) кожу; 3) желудочно-кишеч- ный или респираторный тракт РЕЦИРКУЛЯЦИЯ ЛИМФОЦИТОВ Лимфоциты крови поступают в лимфатические узлы через посткапиллярные венулы, а покидают их через эфферентные лимфатические сосуды. которые последовательно сходятся в грудной про- ток. Этот проток открывается в полую вену — со- суд, который возвращает кровь сердцу, таким об- разом обеспечивая постоянную рециркуляцию лимфоцитов. Сходным образом функционирует и селезен- ка. Лимфоциты артериальной крови поступают в нее через ворота и попадают в трабекулярную ар- терию, которая в дальнейшем становится узкой и разветвленной. На самых дальних ветвях трабе- кулярной артерии находятся капилляры, ведущие к лимфоидным узелкам. В конце концов, лимфо- циты возвращаются в венозную циркуляцию че- рез трабекулярную вену. Как и лимфатические узлы, селезенка имеет эфферентные лимфатиче- ские сосуды, откуда лимфа поступает в лимфати- ческие протоки, по которым клетки продолжают свою рециркуляцию по организму и возвращают- ся обратно в афферентные сосуды. Миграция лимфоцитов между различными лимфоидными и нелимфоидными тканями и их хоминг к определенному месту четко регулирует- ся посредством различных адгезионных молекул клеточной поверхности (cell-surface adhesion mole- cules — САМ) и рецепторов к этим молекулам. Таким образом, за исключением селезенки, где маленькие артериолы заканчиваются, открывая доступ лимфоцитам крови к паренхиме, обычно лимфоциты крови должны проникать (в лимфо- идную ткань) сквозь сосудистый эндотелий, выс- тилающий посткапиллярные участки сосудистого русла, называемые венулами с высоким эндоте- лием (high endotherial venules — HEV). Этот про- цесс называется экстравазацией. Рециркулирую- щие лимфоциты избирательно связываются со спе- цифическими рецепторами на HEV в лимфоид- ной ткани или на участках воспаленной ткани и, похоже, совершенно игнорируют другие участки сосудистого эндотелия. Более того, оказывается, что некоторые различные субпопуляции лимфо- цитов преимущественно связываются с HEV за счет более высокой специфичности, что избира- тельно регулирует миграцию лимфоцитов в раз- личные лимфоидные и нелимфоидные ткани. Ре- циркулирующие моноциты и гранулоциты также экспрессируют рецепторы, являющиеся молеку- лами адгезии, и мигрируют в ткани, используя такой же механизм. Благодаря перемещению лимфоцитов между лимфоидными и нелимфоидными тканями при контакте антиген и лимфоциты, специфичные к данному антигену, секвестрируются в лимфоид- ной ткани, где лимфоциты проходят пролифера- цию и дифференцировку. Клетки, подвергшиеся дифференцировке (клетки памяти), покидают лимфоидный орган и распространяются по телу для последующей концентрации в месте, где про- должает сохраняться антиген, и там проявляют свою защитную функцию. СУДЬБА АНТИГЕНА ПОСЛЕ ПЕНЕТРАЦИИ Ретикулоэндотелиальная система предназначена для того, чтобы удерживать захватывать и разру- шать проникшие в организм чужеродные антиге-
46 ГЛАВА 2. ЭЛЕМЕНТЫ ВРОЖДЕННОГО И ПРИОБРЕТЕННОГО ИММУНИТЕТА ны с помощью системы фагоцитирующих клеток. Кроме того, постоянное движение лимфоцитов по организму позволяет депонировать их в стратеги- ческих участках вдоль лимфатических сосудов. Система не только задерживает антигены, но и направляет их в места (вторичные лимфоидные органы), где на очень маленьком участке антиген, макрофаги, Т-клетки и В-клетки могут взаимо- действовать, чтобы запустить иммунный ответ. На рис. 2.10 показаны пути, по которым анти- ген проходит через физические барьеры, а также клеточные и гуморальные компоненты последу- ющей иммунной реакции. Существуют три глав- ных пути проникновения антигена в организм. • Антиген может поступить в организм через кро- воток. В этом случае он переносится в селе- зенку, где взаимодействует с АПК, такими как дендритные клетки и макрофаги. В-клетки так- же выполняют роль АПК, хотя их основная задача — это продукция антител в ответ на ан- тигенную стимуляцию. Антигенпрезентирую- щие клетки необходимы для активации анти- генспецифичных Т-клеток. Взаимодействия между АПК и Т-клетками неизбежно ведет к активации В- и Т-клеток и, таким образом, к иммунной реакции. Затем антитела выходят из селезенки непосредственно в кровоток. Лим- фоциты также покидают селезенку; они направ- ляются в эфферентные лимфатические прото- ки, чтобы возвратиться в кровоток, пройдя че- рез грудной проток. • Антиген может задержаться в эпидермисе, дер- ме или подкожной клетчатке, где вызовет вос- палительную реакцию. Из этих тканей анти- ген или в свободном виде, или захваченный АПК перемещается по афферентным лимфа- тическим сосудам в регионарные лимфатиче- ские узлы. В лимфатическом узле антиген, мак- рофаги, дендритные клетки, Т-клетки и В-клет- ки взаимодействуют, что вызывает иммунный ответ. В последующем антигенспецифичные Т-клетки и антитела, которые были синтези- рованы в лимфатическом узле, поступают в кровоток и переносятся в разные ткани. Анти- генспецифичные Т-клетки, В-клетки и анти- тела также поступают в кровоток через груд- ной проток. • Антиген может также поступать в желудочно- кишечный или респираторный тракт, где за- держивается в MALT. Там он будет взаимодей- ствовать с макрофагами и лимфоцитами. Ан- титела, синтезируемые в этих органах, депо- нируются в местных тканях. Кроме того, лим- фоциты, поступающие в эфферентные лимфа- тические сосуды, переносятся через грудной проток в циркуляторное русло и, таким обра- зом, перераспределяются по различным тканям. Для индукции адаптивного иммунного ответа необходимо взаимодействие чужеродного антигена с лимфоцитами, распознающими этот специфич- ный антиген. Подсчитано, что у обычных (неим- мунизированных) животных только один из каж- дых 103—105 лимфоцитов способен распознавать типичный антиген. Таким образом, вероятность того, что антиген встретит подходящие клетки, очень мала. Проблема осложняется тем, что для последующего синтеза антитела должны провза- имодействовать два различных вида лимфоцитов, а именно Т- и В-клетки, специфичные именно к этому антигену. По статистике вероятность взаимодействия специфичных Т-лимфоцитов с подходящим для них антигеном, а затем и с В-лимфоцитами, спе- цифичными к данному антигену, очень мала. Однако природа выработала простой механизм для организации контакта этих двух клеток с антиге- ном: он переносится по дренирующим лимфати- ческим протокам во вторичные лимфоидные орга- Врожденный иммунитет Физические барьеры I Кожа, слизистые оболочки Клетки Химические Цитокины Рецепторы, распознающие структуры патогенных микроорганизмов, ПМЯ- клетки, моноциты, макрофаги, эозинофилы, NK-клетки Антитела Цитокины В-клетки Т-клетки Антигенспецифичные рецепторы барьеры I pH, липиды, ферменты и др Цитокины Приобретенный иммунитет • Рис. 2.11. Взаимодействие между врожден- ным и приобретенным иммунитетом
ВЗАИМОДЕЙСТВИЕ МЕЖДУ ВРОЖДЕННЫМ И ПРИОБРЕТЕННЫМ ИММУНИТЕТОМ 47 ны. В этих органах антиген представляется на по- верхности фиксирующих его специализированных клеток. Поскольку Т- и В-лимфоциты циркули- руют с относительно высокой скоростью, совер- шая кругооборот каждые несколько дней, неко- торые из них, обладающие специфичностью по отношению к конкретному антигену, имеют воз- можность пройти мимо него за относительно ко- роткое время. Когда такие лимфоциты встреча- ются с антигеном, к которому обладают специ- фичностью, они активируются, и запускается при- обретенный иммунный ответ, специфический по отношению к антигену, его вызвавшему. а ВЗАИМОДЕЙСТВИЕ МЕЖДУ ВРОЖДЕННЫМ И ПРИОБРЕТЕННЫМ ИММУНИТЕТОМ Приобретенный и врожденный иммунитет как две ветви иммунной системы обладают способностью прекрасно взаимодействовать. Система взаимодей- ствия посредством различных цитокинов и моле- кул клеточной адгезии позволяет компонентам врожденной и приобретенной иммунных систем согласованно функционировать, посылать друг дру- гу сигналы, активировать друг друга и работать со- вместно с единой целью — уничтожить и удалить инфицирующий микроорганизм и его продукты. Взаимодействие между врожденным и приобретен- ным иммунитетом показано на рис. 2.11. РЕЗЮМЕ 1 - Существуют две формы иммунитета: а) врож- денный, или неспецифический; б) приобретенный, или адаптивный. 2, Врожденный иммунитет включает многие эле- менты, такие как различные физические барьеры (на- пример, кожа), химические барьеры (например, низ- кий pH в желудке), клеточные компоненты (например, фагоциты) и рецепторы, распознающие структуры па- тогенных микроорганизмов (например, TLR). 3. Два основных типа клеток участвуют в осуществ- лении приобретенного иммунитета и клонально экс- прессируют антигенспецифичные рецепторы: а) В-лим- фоциты; б) Т-лимфоциты. 4. Макрофаги составляют существенную часть РЭС и служат для улавливания, процессирования и презентации антигена Т-лимфоцитам, таким образом осуществляя важную функцию в рамках как врожден- ного, так и приобретенного иммунитета. 5. В- и Т-лимфоциты обладают рецепторами, спе- цифичными по отношению к конкретным антигенам и, таким образом, являются компонентами приобретен- ного иммунитета, отвечающего за антигенную специ- фичность. 6. В- и Т-лимфоциты развиваются в первичных лимфоидных органах. В-клетки происходят из лимфо- идных клеток-предшественников и дифференцируют- ся в костном мозге. Т-клетки происходят из тех же лимфоидных клеток-предшественников, что и В-клет- ки, и дифференцируются в тимусе, чтобы стать функ- циональными клетками, перед тем как мигрировать в периферические лимфоидные органы. 7. Зрелые В- и Т-лимфоциты дифференцируются и пролиферируют в ответ на антигенную стимуляцию. Эти процессы обычно происходят во вторичных лим- фоидных органах. 8. В-лимфоциты синтезируют и секретируют анти- тела. Т-лимфоциты участвуют в клеточно-опосредо- ванном иммунитете. Они помогают В-клеткам выраба- тывать антитела, обеспечивая последние растворимы- ми факторами роста и дифференцировки (цитокина- ми), необходимыми для активации В-клеток. Они так- же регулируют и другие процессы в ходе иммунного ответа, продуцируя цитокины. 9. Лимфоциты постоянно циркулируют между кро- вью, лимфой, лимфоидными органами и тканями. Ре- цепторы на них взаимодействуют с молекулами кле- точной адгезии, расположенными на специализиро- ванных HEV, способствующих экстравазации в ткани, где происходит активация иммунных клеток. ТЕСТЫ Выберите ОДИН НАИБОЛЕЕ ПРАВИЛЬНЫЙ ответ на каждый тест. 1, Обычно не относится к костному мозгу (первич- ному лимфоидному органу) и вторичным лимфоидным органам: а) клеточная пролиферация; б) дифференциация лимфоцитов; в) клеточное взаимодействие; г) антигензависимый ответ. 2, К вторичным лимфоидным органам относится: а) наличие предшественника В- и Т-клеток; б) циркуляция лимфоцитов; в) окончательная дифференцировка; г) клеточная пролиферация. 3- К врожденным иммунным механизмам не отно- сится: а) отсутствие специфичности; б) стимулированная активация; в) вовлечение клеток многих типов; г) компонент памяти. 4, Основной функцией лимфоидной системы явля- ется: а) врожденный иммунитет; б) воспаление; в) фагоцитоз; г) приобретенный иммунитет. 5- Удаление фабрициевой сумки у цыпленка при- водит: а) к заметному уменьшению числа циркулирующих Т-лимфоцитов; б) анемии; в) отсроченному отторжению кожных лоскутов; г) низкому уровню антител в сыворотке; д) дефициту врожденного иммунитета 6. Зародышевые центры, находящиеся в корти- кальной зоне лимфатического узла и периферическом
48 ГЛАВА 2. ЭЛЕМЕНТЫ ВРОЖДЕННОГО И ПРИОБРЕТЕННОГО ИММУНИТЕТА регионе периартериолярной лимфатической ткани селезенки: а) поддерживают развитие незрелых В- и Т-клеток; б) участвуют в удалении поврежденных эритроци- тов из кровотока; в) действуют как основной источник стволовых клеток и таким образом помогают поддерживать ге- мопоэз; г) обеспечивают инфраструктуру, которая после антигенной стимуляции содержит большие популяции В-лимфоцитов и плазматических клеток; д) являются местами для дифференцировки NK- клеток. 7, Укажите правильную характеристику NK-клеток: а) пролиферируют в ответ на антиген; б) уничтожают клетки-мишени путем фагоцитоза и внутриклеточного переваривания; в) являются субпопуляцией ПМЯ-клеток; г) уничтожают клетки-мишени без фагоцитоза; д) особенно эффективны против определенных бактерий. 8- Зрелые дендритные клетки способны: а) активировать первичные антигенспецифичные Т-клетки; б) удалять красные кровяные клетки; в) вырабатывать брадикинин; г) уничтожать клетки-мишени без фагоцитоза. ОТВЕТЫ НА ТЕСТЫ 1 — г. Клеточная пролиферация, дифференциров- ка лимфоцитов и клеточные взаимодействия могут происходить в костном мозге (или в фабрициевой сумке). Однако антигензависимые реакции протекают во вторичных лимфоидных органах, таких как селезен- ка и лимфатические узлы. 2 — в. Окончательная дифференцировка В-клеток в плазматические клетки происходит только во вто- ричных лимфоидных органах, таких как селезенка и лимфатические узлы. Циркуляция лимфоцитов и кле- точная пролиферация (но не антигензависимые реак- ции окончательной дифференцировки) также проис- ходят в первичных лимфоидных органах, таких как фибрициевая сумка или ее эквивалент, и тимусе. Кост- ный мозг является местом, где плюрипотентные ство- ловые клетки дифференцируются в клетки-предшест- венники В- и Т-клеток. 3 — г. Врожденный иммунитет не обладает анти- генной специфичностью, характерной для приобре- тенного иммунитета. Он активируется такими стиму- лами, как проникновение чужеродных частиц в орга- низм. К врожденному иммунитету относятся клетки многих типов, такие как клетки моноцитарной серии (макрофаги) и гранулоцитарного ряда (нейтрофилы, эозинофилы и т.д.). 4 — г. Основная функция лимфоидной системы — это распознавание чужеродного антигена лимфоцита- ми, что ведет к возникновению приобретенного им- мунного ответа. Такие функции, как фагоцитоз и вос- паление, не требуют обязательного участия лимфоид- ной системы; они составляют часть врожденного им- мунитета. 5 — г. Удаление фабрициевой сумки у цыпленка приводит к значительному снижению уровней антител в сыворотке, поскольку этот орган работает как первич- ный лимфоидный орган, в котором созревают В-лим- фоциты (в последующем синтезирующие и секрети- рующие антитела). Удаление этого органа не приводит к значительному уменьшению количества циркулирую- щих Т-лимфоцитов или анемии, характеризующейся выраженным уменьшением числа эритроцитов, по- скольку эритроциты вызревают вне сумки. Удаление сумки не влияет на отторжение кожных трансплантатов 6 — г. В условиях антигенной стимуляции зароды- шевые центры содержат большие популяции В-лим- фоцитов, подвергающиеся митозу, и плазматические клетки, секретирующие антитела. Наивные (не встре- чавшиеся с антигеном) лимфоциты развиваются в первичных лимфоидных органах, а не во вторичных лимфоидных органах, таких как селезенка и лимфати- ческие узлы. Зародышевые центры не участвуют в удалении поврежденных эритроцитов, а также не яв- ляются источником стволовых клеток; последние на- ходятся в костном мозге. 7 — г. Натуральные киллеры являются большими гранулярными лимфоцитами. Их число не увеличива- ется в ответ на появление антигена. Натуральные кил- леры уничтожают антигены без фагоцитоза, а их клет- ками-мишенями являются инфицированные вирусом или опухолевые клетки. Они не являются особенно эффективными против бактериальных клеток. 8 — а. После того как незрелые дендритные клет- ки захватывают патогены (фагоцитоз), они активиру- ются и созревают, т.е. становятся более эффективны- ми в презентации антигена и действительно могут ак- тивировать антигенспецифичные наивные Т-клетки.
Глава ИММУНОГЕНЫ И АНТИГЕНЫ 9 ВВЕДЕНИЕ Иммунный ответ возникает в результате воздей- ствия чужеродного агента. Соединение, которое вызывает реакцию, относят или к антигенам, или к иммуногенам. Различие между ними заключает- ся в их функциях. Антигеном является любой агент, способный специфически связываться с компо- нентами иммунного ответа, такими как рецепто- ры В-клеток (BCR) на В-лимфоцитах, и раство- римыми антителами. Иммуноген же представля- ет собой агент, способный вызывать иммунную реакцию и таким образом являться иммуногенным. Различать эти два термина необходимо, посколь- ку имеется много соединений, не способных вы- зывать иммунную реакцию и в то же время спо- собных связываться с компонентами иммунной системы, которые были выработаны специально против них. Таким образом, все иммуногены яв- ляются антигенами, но не все антигены являются иммуногенами. Это различие становится очевид- ным в случае с соединениями низкой молекуляр- ной массы, группой веществ, включающей мно- гие лекарства и антибиотики Сами по себе эти соединения не способны вызвать иммунный от- вет, но когда они объединяются с гораздо более крупными агентами, такими как протеины, фор- мируется конъюгат, способный вызывать иммун- ный ответ, направленный против различных час- тей конъюгата, в том числе и его составляющую с низкой молекулярной массой. Действующее та- ким образом низкомолекулярное вещество отно- сится к гаптенам (от греч. hapto — схватывать), в го время как соединение с высокой молекуляр- ной массой, с которым соединяется гаптен, на- зывается носителем. Таким образом, гаптен яв- ляется соединением, не способным самостоятель- но вызывать иммунный ответ, но против которо- го иммунный ответ может быть получен путем иммунизации, если гаптен конъюгирован с но- сителем. Иммунный ответ был получен против всех из- вестных семейств биохимических соединений, таких как углеводы, липиды, протеины и нуклеи- новые кислоты. Он может быть получен и к ле- карствам, антибиотикам, пищевым добавкам, кос- метическим средствам, мелким синтетическим пептидам, но только в том случае, если они объ- единены с носителем. В этой главе будут обсуж- даться основные свойства соединений, которые делают их антигенами и иммуногенами. УСЛОВИЯ ПОЯВЛЕНИЯ ИММУНОГЕННОСТИ Для того чтобы обладать свойствами иммуноген- ности, соединение должно иметь следующие ха- рактеристики: 1) чужеродность; 2) большая моле- кулярная масса; 3) сложное химическое строение; 4) в большинстве случаев способность к разруше- нию (деградации) и взаимодействию с МНС орга- низма-хозяина. Чужеродность Обычно у животных не отмечают аутоиммунных реакций. Так, если кролику, например, вводят его собственный сывороточный альбумин, он не вызовет иммунной реакции, поскольку распоз- нается как собственный. Напротив, если сыво- роточный альбумин кролика вводят морской свинке, он будет распознаваться как чужеродный кроличий сывороточный альбумин и вызывать иммунный ответ. Чтобы доказать сохранность им- мунитета у кролика, у которого не наблюдалось
50 ГЛАВА 3. ИММУНОГЕНЫ И АНТИГЕНЫ иммунной реакции на собственный сывороточ- ный альбумин, ему можно ввести альбумин мор- ской свинки. У кролика с сохраненным имму- нитетом будет наблюдаться иммунная реакция на сывороточный альбумин морской свинки, по- скольку эта субстанция будет определяться как соон Вторичная структура е Рис. 3.1. Уровни организационной структуры протеина На первичную структуру указывает линейное расположе- ние аминокислот (для чего используют однобуквенный код); также отмечается наличие внутри цепи разных ди- сульфидных мостиков. Вторичная структура возникает при укладывании полипептидной цепи в а-спирали и р-склад- ки. Третичная структура, показанная в виде ленточной диа- граммы, формируется путем складывания участков вто- ричных структур (адаптировано с разрешения Р Sun, JC Boyington, Current Protocols in Protein Science, Wiley) чужеродная. Таким образом, первым требовани- ем к веществу, рассматриваемому как иммуно- генное, является чужеродность. Чем более чуже- родным является вещество, тем более оно имму- ногенно. Обычно соединения, синтезируемые в организ- ме хозяина, не являются для него иммуногенны- ми. Однако имеются исключения, когда у инди- видуума отмечается иммунная реакция на свои собственные ткани. Это состояние называется аутоиммунитетом (см. гл. 12). Большая молекулярная масса Вторым необходимым свойством иммуногена яв- ляется определенная минимальная молекулярная масса вещества. Обычно соединения малой мо- лекулярной массой менее 1 000 Да (например, пе- нициллин, прогестерон, аспирин) не являются иммуногенными. Соединения молекулярной мас- сой между 1000 и 6000 Да (например, инсулин, адренокортикотропный гормон) могут быть им- муногенными, а могут и не быть. Соединения молекулярной массой более 6000 Да (например, альбумин, столбнячный токсин) обычно явля- ются иммуногенными. Итак, относительно мел- кие молекулы соединений обладают низкой им- муногенностью, в то время как большие — вы- сокой. Сложная химическая структура Третьим свойством, которым должно обладать соединение, чтобы быть иммуногенным, являет- ся определенный уровень физико-химической сложности. Например, простые молекулы, такие как гомополимеры аминокислот (например, по- лимер лизина молекулярной массой 30000 Да), редко являются хорошими иммуногенами. Ана- логично, гомополимер поли-у-D-глутаминовой кислоты (материал капсулы бациллы сибирской язвы) молекулярной массой 50000 Да не явля- ется иммуногенным. Отсутствие иммуногенно- сти, несмотря на большую молекулярную массу этих веществ, обусловлено отсутствием доста- точной химической сложности. Однако при уве- личении химической сложности путем присое- динения к е-аминогруппе полилизина дополни- тельных частей, таких как динитрофенол, или других соединений с низкой молекулярной мас- сой, не являющихся иммуногенными, такая мак- ромолекула становится иммуногенной. Полу- чаемый иммунный ответ направлен не только против спаренных соединений с низкой моле- кулярной массой, но и против гомополимера с высокой молекулярной массой. Обычно увеличе- ние химической сложности соединения сопро- вождается увеличением его иммуногенности. Так, сополимеры некоторых аминокислот, таких
УСЛОВИЯ ПОЯВЛЕНИЯ ИММУНОГЕННОСТИ 51 Четвертичная структура • Рис. 3.2. Четвертичная структура белков, возникающая из связи двух или более полипептидных цепей, которые формируют полимерный белок (адаптировано с разреше- ния Р Sun and JC Boyington, Current Protocols in Protein Science, Wiley) как полиглутаминовой, аланиновой и лизино- вой (poly-GAT), обычно обладают высокой им- муногенностью. Поскольку многие иммуногены являются про- теинами, важно понять структурные свойства этих молекул. Каждый из четырех структурных уров- ней белка вносит свой вклад в появление имму- ногенности у молекулы. При инициации приоб- ретенного иммунного ответа распознаются мно- гие структурные характеристики и химические свойства соединений. Например, антитела могут распознавать такие структурные характеристики протеина, как первичная структура (последова- тельность аминокислот), вторичные (структуры каркаса полипептидной цепи, такие как ос-спи- раль или р-складка) и третичные структуры (сфор- мированные трехмерной конфигурацией белка, которая создается при складывании полипептид- ной цепи и поддерживается дисульфидными мо- стиками, водородными связями, гидрофобными взаимодействиями и т.д.) (рис. 3.1). Могут рас- познаваться и четвертичные структуры (сформи- рованные наложением отдельных частей, если молекула состоит из более чем одной субъедини- цы белка) (рис. 3.2). Способность разрушаться Для антигенов, активирующих Т-клетки, способ- ность стимулировать иммунный ответ определя- ется возможностью взаимодействия с молекула- ми МНС, экпрессированными на антигенпрезен- тирующих клетках (АПК) (см. гл. 9). Последние должны вначале расщепить антиген, подвергнуть его ферментной деградации (этот процесс назы- вается процессированием антигена), после чего антигенные эпитопы (небольшие фрагменты им- муногена) могут быть представлены на поверхно- сти АПК. После деградации и возникновения нековалентной связи с МНС эти эпитопы стиму- лируют активацию и расширение клона антиген- специфичных эффекторных Т-клеток. Чувстви- тельность протеинового антигена к ферментатив- ной деградации во многом зависит от двух свойств: 1) он должен быть достаточно стабильным для то- го, чтобы попасть к месту взаимодействия В- или Т-лимфоцитов, что необходимо для развития им- мунного ответа; 2) соединение должно относи- тельно легко поддаваться частичной фермента- тивной деградации, которая происходит во вре- мя процессирования антигена АПК. Пептиды, со- стоящие из D-аминокислот, которые устойчивы к ферментативной деградации, не являются им- муногенными, в то время как их L-изомеры, чув- ствительные к ферментам, являются иммуноген- ными. Напротив, углеводы, которые не подвер- гаются изменениям и не презентируются, не мо- гут активировать Т-клетки, хотя активируют В-клетки. В целом, чтобы быть иммуногенным, вещество должно обладать всеми этими четырьмя свойства- ми. Оно должно быть чужеродным тому, кому введено, иметь относительно большую молекуляр- ную массу, обладать определенной степенью хи- мической сложности и быть способным к дегра- дации. Гаптены Как указывалось ранее, вещества, называемые гаптенами, не вызывают иммунного ответа в своей первоначальной форме из-за низкой молекуляр- ной массы и простоты химического строения. Эти соединения не иммуногенны до тех пор, пока они не соединятся с носителями, обладающими слож- ной химической структурой и высокой молеку- лярной массой. Таким образом, иммунный ответ может быть вызван тысячами химических соеди- нений, как с высокой, так и с низкой молекуляр- ной массой при условии, что они соединены с носителями, обладающими сложной химической структурой и высокой молекулярной массой.
52 ГЛАВА 3. ИММУНОГЕНЫ И АНТИГЕНЫ Другие условия появления иммуногенности Существует также ряд других факторов, опреде- ляющих, будет ли вещество иммуногенным. Важ- ную роль в том, будет ли данное вещество вызы- вать иммунную реакцию, играет генетическая организация (генотип) иммунизируемого индиви- дуума. Генетический контроль иммунной реактив- ности осуществляется в основном генами, карти- рованными внутри МНС. Другой решающий фак- тор, определяющий иммуногенность веществ, — индивидуальный репертуар В- и Т-клеток. Реак- ции приобретенного иммунитета запускаются после связывания антигенных эпитопов с анти- генспецифичными рецепторами на В- и Т-лим- фоцитах. Если у индивидуума отсутствует опре- деленный клон лимфоцитов, состоящий из кле- ток, несущих идентичный антигенспецифичный рецептор, необходимый для ответа на данный ан- тигенный стимул, иммунного ответа на такой эпитоп не будет. И, наконец, такие важные на практике факторы, как доза и метод введения ан- тигена, также играют роль в проявлении веще- ством иммуногенности. Недостаточные дозы антигена могут не выз- вать иммунный ответ в связи с тем, что они будут не способны в должной мере активировать лим- фоциты или потому что данная доза делает реа- гирующие клетки неотвечаюшими. Последнее из перечисленных явлений вызывает состояние то- лерантности к данному антигену (будет обсуждать- ся в гл. 12). Возможность индуцировать иммун- ный ответ определяется не только необходимо- стью введения порогового количества антигена, но и числом вводимых доз. Далее будет показано, что для получения сильного иммунного ответа не- обходимо повторно ввести антиген. Наконец, на результат иммунизации может повлиять путь введения антигена, поскольку именно он определяет, какие органы и популя- ции клеток будут вовлечены в реакцию. Антиге- ны, вводимые наиболее распространенным спо- собом — подкожно, обычно вызывают наиболее сильный иммунный ответ. Это связано с тем, что их захват, процессирование и представление (пре- зентация) эффекторным клеткам осуществляют- ся клетками Лангерганса, находящимися в коже и являющимися одними из наиболее эффектив- ных АПК. Реакции на подкожное введение ан- тигенов проявляются в лимфатических узлах, куда происходит отток лимфы от места введения. Ан- тигены, введенные внутривенно, переносятся вначале в селезенку, где могут индуцировать им- мунологическую неотвечаемость, или толерант- ность, или, если они представлены АПК, выз- вать иммунный ответ. Антигены, поступающие через рот {гастроинтестинальный путь), вызы- вают локальный антительный ответ в границах собственной пластинки кишечника, но часто приводят к возникновению системной толеран- тности к антигену (подробно о толерантности см. в гл. 12). Наконец, введение антигенов через рес- пираторный тракт {интраназальный путь) неред- ко вызывает аллергические реакции (см. гл. 14). Поскольку иммунные реакции зависят от мно- жества межклеточных взаимодействий, на тип и выраженность иммунного ответа влияют клетки, заполняющие орган, в который антиген достав- ляется первоначально. Обязательные для прояв- ления иммуногенности условия, перечисленные ранее, составляют часть тонкого механизма конт- роля, описанного в следующих главах, который, с одной стороны, запускает приобретенный им- мунный ответ, а с другой, защищает индивидуум от реакции на вещества в тех случаях, когда такие реакции являются вредными. ПЕРВИЧНЫЙ И ВТОРИЧНЫЙ ОТВЕТЫ Первая встреча индивидуума с иммуногеном рас- сматривается как первичная иммунизация, кото- рая вызывает первичный ответ. Как мы увидим в следующих главах, во время этой первичной им- мунизации происходит много различных событий: клетки, процессирующие антиген, запускают про- лиферацию и дифференцировку антигенспеци- фичных лимфоцитов. Субпопуляции Т-лимфо- цитов взаимодействуют с другими субпопуляция- ми и индуцируют дифференцировку последних в Т-лимфоциты со специализированной функцией. Т-лимфоциты взаимодействуют также с В-лим- фоцитами, побуждая их к синтезу и секреции ан- тител. Повторная встреча с тем же иммуногеном при- водит к развитию вторичного ответа. Этот по- вторный контакт может произойти после того, как первичный иммунный ответ затих или полностью прошел (через недели или даже годы). Вторич- ный ответ отличается от первичного по многим показателям. Наиболее заметным и биологиче- ски обусловленным является гораздо более быст- рое начало и большая интенсивность реакции Этот вторичный (и последующие) контакт про- исходит таким образом, как будто организм «вспо- минает», что он уже встречался с данным имму- ногеном. Фактически при вторичных и последу- ющих ответах вовлекается большее число анти- генспецифичных лимфоцитов, образовавшихся в ходе первичного иммунного ответа. Таким об- разом, увеличивается арсенал реагирующих лим- фоцитов, что частично обусловливает размах на- блюдаемой реакции. Вторичный ответ называют анамнестическим или реакцией памяти, а В- и Т-лимфоциты, которые участвуют в этом ответе, называют клетками памяти. Динамика продук- ции антител после иммунизации детально описа- на в гл. 4.
ЭПИТОПЫ, РАСПОЗНАВАЕМЫЕ В- И Т-КЛЕТКАМИ 53 • Таблица 3.1. Распознавание антигенов В- и Т-клетками Характеристика В-клетка Т-клетка Антигенное взаимодействие В-клеточный рецептор (мембранный иммуноглобулин) связывает антиген Т-клеточный рецептор связывает антиген и МНС Природа антигенов Белки, полисахариды, липиды Пептиды Связывание раствори- мых антигенов Да Нет Распознаваемые эпитопы Доступные, последовательные или прерывистого типа Внутренние линейные пептиды, произво- димые при процессировании антигена (протеолитическая деградация) • АНТИГЕННОСТЬ И АНТИГЕНСВЯЗЫВАЮЩИЙ УЧАСТОК Иммунный ответ, вызванный антигеном, приво- дит к появлению антител или лимфоцитов, ко- торые специфически реагируют с этим антиге- ном. Антигенсвязывающий участок антитела или рецептора на лимфоците обладает уникальной структурой, позволяющей комплементарно соот- ветствовать некоторым частям структуры специ- фичного антигена. Часть иммуноглобулина, ко- торая специфически связывается с антигенной детерминантой, или эпитопом, концентрирует- ся в нескольких гипервариабельных участках мо- лекулы, которая формирует участок, определяю- щий комплементарность (complementary- determing region — CDR). Дополнительные струк- турные характеристики молекулы иммуноглобу- лина описаны в гл. 4. В разных исследованиях указано, что размер эпитопа, который взаимодействует с CDR на дан- ном антителе, примерно эквивалентен 5 — 7 ами- нокислотам. Эти размеры были определены жс- периментальным путем при связывании антител с полисахаридными и пептидными эпитопами. Считается, что эти величины примерно соответ- ствуют размеру комплементарного антительного связывающего участка, называемого паратопом. Действительно, эти расчеты были подтверждены методом рентгенологической кристаллографии. Малый размер эпитопа (пептида), который свя- зывается со специфичным Т-клеточным рецепто- ром (TCR) (пептиды, состоящие из 8 — 12 амино- кислотных остатков), функционально увеличива- ется, поскольку вступает в нековалентную связь с М НС-протеинами АПК. Этот бимолекулярный комплекс, состоящий из эпитопа и МНС, после • Рис. 3.3. Пример антигена (миоглобин кашалота), со- держащего пять линейных В-клеточных эпитопов (крас- ные), один из которых связан с антигенсвязывающим уча- стком антитела, специфичного для аминокислотных остат- ков 56-62 связывания с рецептором Т-клетки формирует тримолекулярный комплекс (TCR —эпитоп — МНС). В ЭПИТОПЫ, РАСПОЗНАВАЕМЫЕ В- И Т-КЛЕТКАМИ Существует большое количество данных, указы- вающих на то, что свойства многих эпитопов, рас- познаваемых В-клетками, отличаются от свойств эпитопов, распознаваемых Т-клетками (табл. 3.1). Как правило, связанные с мембраной антитела, представленные на В-клетках, распознают и свя- зывают свободный растворимый антиген. Такие эпитопы обычно находятся в наружной части мо- лекулы и доступны для взаимодействия с рецеп- тором В-клетки. Обычно, В-клеточные эпитопы составляют концевые части полисахаридных це- пей и гидрофильные участки белковых молекул. В качестве примера на рис. 3.3 представлен анти- ген с пятью линейными В-клеточными эпитопа- ми, расположенными на внешней поверхности ми- оглобулина. В-клеточные эпитопы могут также формироваться в результате конформации моле- кулы при изгибе ее фрагментов, как показано на рис. 3.4. Такие эпитопы называются конформаци- онными {прерывистыми) эпитопами, в которых аминокислотные остатки, не расположенные по-
54 ГЛАВА 3. ИММУНОГЕНЫ И АНТИГЕНЫ • Рис. 3.4. Антиген представлен аминокислотными остат- ками (круги), которые формируют прерывистый эпитоп «петля» (синяя), образованный с помощью дисульфидно- го мостика между остатками 64 и 80. Заметьте, что анти- тело, специфичное к данному эпитопу, связывается с ами- нокислотами, расположенными непоследовательно • Рис. 3.5. Структура молекулы МНС I класса (ленточная диаграмма) с антигенным пептидом (модель, составлен- ная шариками и палочками)
СВЯЗЫВАНИЕ АНТИГЕНА С АНТИГЕНСПЕЦИФИЧНЫМИ АНТИТЕЛАМИ ИЛИ Т-КЛЕТКАМИ 55 Описание Пример Один эпитоп Гапте н ы Много эпитопов одинаковой специфичности Много эпитопов разной специфичности Много полисахаридов, гомополимеров Белки • Рис. 3.6. Некоторые возможные антигенные структуры, содержащие единичные и многочисленные эпитопы следовательно вдоль полипептидной цепи, сво- дятся вместе в результате конформационных из- гибов белка, как показано на рис. 3.3. В отличие от В-клеток Т-клетки не способны связывать растворенные антигены. Для взаимодей- ствия эпитопа с рецептором Т-клетки необходи- мо, чтобы АПК процессировала антиген. При этом происходит ферментативное разрушение антиге- на с образованием мелких пептидов, которые за- тем связываются с МНС. Таким образом, Т-кле- точные эпитопы могут быть только непрерывными, или линейными, поскольку состоят из одного сег- мента полипептидной цепи. На рис. 3.5 показана структурная организация молекулы МНС I клас- са, связанной с антигенным пептидом. Обычно такие, подвергшиеся процессированию, эпитопы являются внутренними денатурированными линей- ными гидрофобными участками белков. Полиса- хариды не имеют таких участков и, как известно, не связываются с Т-клетками и не активируют их. Таким образом, полисахариды содержат исключи- тельно эпитопы, распознаваемые В-клетками, в то время как в белках находятся эпитопы, распозна- ваемые как В-, так и Т-клетками (см. табл. 3.1). Антигенные эпитопы могут иметь характеристи- ки, представленные на рис. 3.6. Они могут состо- ять из единичного эпитопа (гаптена) или иметь разное число идентичных эпитопов на одной моле- куле (например, полисахариды). Наиболее распро- страненные антигены (белки) имеют разное число разнообразных эпитопов на одной молекуле. ♦ ОСНОВНЫЕ КЛАССЫ АНТИГЕНОВ Антигенами могут быть несколько основных хи- мических семейств. • Углеводы (полисахариды). Полисахариды яв- ляются иммуногенными только тогда, когда они связаны с белками-носителями. Напри- мер, полисахариды, которые составляют часть более сложных молекул (гликопротеины), бу- дут вызывать иммунную реакцию, часть кото- рой направлена непосредственно на полиса- харидную составляющую молекулы. Иммун- ный ответ, представленный в основном анти- телами, может индуцироваться против мно- гих видов полисахаридных молекул, таких как компоненты микроорганизмов и клеток эука- риоит. Прекрасным примером антигенности полисахаридов является иммунный ответ, свя- занный с группами крови АВО. Полисахари- ды в данном случае находятся на поверхности эритроцитов. • Липиды. Липиды редко являются иммуноген- ными, но иммунная реакция на них может быть вызвана, если липиды конъюгированы с бел- ками-носителям. Таким образом, липиды мо- гут рассматриваться как гаптены. Также отме- чены иммунные реакции на гликолипиды и сфинголипиды. • Нуклеиновые кислоты. Нуклеиновые кислоты сами по себе являются слабыми иммуногена- ми, но становятся иммуногенными при связы- вании с белками-носителями. Нативная спи- ральная ДНК обычно не является иммуноген- ной у животных. Однако во многих случаях от- мечались иммунные реакции на нуклеиновые кислоты. Одним из важных примеров в кли- нической медицине является появление анти- тел против ДНК у больных системной крас- ной волчанкой (детально обсуждается в гл. 12). • Белки. Фактически все белки иммуногенны. Таким образом, чаще всего иммунный ответ развивается к белкам. Более того, чем выше уровень сложности белка, тем сильнее иммун- ный ответ на этот протеин Размер и сложность белковых молекул определяют наличие мно- жества эпитопов. * СВЯЗЫВАНИЕ АНТИГЕНА С АНТИГЕНСПЕЦИФИЧНЫМИ АНТИТЕЛАМИ ИЛИ Т-КЛЕТКАМИ Связывание антигенов с антителами подробно обсуждается в гл. 4 и 5. Взаимодействие антигена с В- и Т-клетками и последующие события рас- смотрены в гл. 10. На данном этапе важно под- черкнуть только, что в связывании антигена с антителом или рецепторами Т-клетки ковалент- ные связи не участвуют. Нековалентное связыва- ние может включать электростатические взаимо- действия, гидрофобные взаимодействия, водород- ные связи и ван-дер-ваальсовы силы. Поскольку эти взаимодействующие силы относительно сла- бы, сцепка между антигеном и его комплемен- тарным участком на рецепторе антигена должна происходить на площади, достаточно большой, чтобы произошло суммирование всех возможных взаимодействий. Это условие является основой для исключительной специфичности наблюдаемых иммунологических взаимодействий.
56 ГЛАВА 3. ИММУНОГЕНЫ И АНТИГЕНЫ ПЕРЕКРЕСТНАЯ РЕАКТИВНОСТЬ Поскольку макромолекулярные антигены содер- жат несколько отстоящих друг от друга эпитопов, некоторые из этих молекул могут быть изменены без полного изменения их иммуногенетической и антигенной структуры. Это имеет важные послед- ствия при иммунизации против высокопатоген- ных микроорганизмов или чрезвычайно токсич- ных соединений. Действительно, проводить им- мунизацию с помощью патогенного токсина не- разумно. Однако можно разрушить биологическую активность такого токсина и целого ряда других токсинов (например, бактериальных токсинов или ядов змей), сохранив их иммуногенность. Токсин, модифицированный до такой степени, что боль- ше не является токсичным, но все еще сохраняет некоторые иммунохимические характеристики, называется анатоксином. Таким образом, мы мо- жем говорить о том, что анатоксин иммунологи- чески перекрестно реагирует с токсином. Соот- ветственно имеется возможность, иммунизируя индивидуума с помощью анатоксина, вызвать иммунный ответ к некоторым эпитопам, которые на анатоксине сохранены в том же виде, как и на токсине, поскольку не были уничтожены при модификации. Хотя молекулы токсина и анаток- сина отличаются по многим физико-химическим и биологическим характеристикам, они иммуно- логически перекрестно реактивны. Достаточное количество сходных эпитопов позволяет вызвать иммунный ответ на анатоксин и способствовать эффективной защите от самого токсина. Имму- нологическую реакцию, в которой иммунные ком- поненты, будь то клетки или антитела, реагируют с двумя молекулами, имеющими одинаковые эпи- топы, но отличающиеся по другим признакам, называют перекрестной реакцией. Когда два со- единения обладают перекрестной иммунологиче- ской реактивностью, они имеют один или не- сколько общих эпитопов, и в процессе иммунно- го ответа на одно из соединений будут распозна- ваться один или более таких же эпитопов на дру- гом соединении с вовлечением его в реакцию. Другая форма перекрестной реактивности наблю- дается в случаях, когда антитела или клетки, спе- цифичные для одного эпитопа, связываются, обычно слабее, с другим эпитопом, который не является совершенно идентичным, но по струк- туре напоминает первый эпитоп. Чтобы отметить, что антиген, используемый для иммунизации, отличен от того, против которого позднее будут реагировать произведенные иммун- ные компоненты, используют термины «гомоло- гичный» и «гетерологичный». Термин «гомологич- ный» обозначает, что антиген и иммуноген оди- наковы. Термин «гетерологичный» указывает, что вещество, использованное для индуцирования иммунного ответа, отличается от вещества, кото- рое позднее используется для реакции с продук- тами индуцированного ответа. В последнем слу- чае гетерологичный антиген может реагировать, а может и не реагировать с иммунными компо- нентами. При появлении реакции можно сделать заключение, что гетерологичный и гомологичный антигены проявляют иммунологическую перекрест- ную реактивность. Несмотря на то что основным критерием в иммунологии является специфичность, иммуно- логическая перекрестная реактивность наблюда- ется на многих уровнях. Это не означает, что роль иммунологической специфичности уменьшается, а скорее указывает на то, что соединения, обла- дающие перекрестной реактивностью, имеют оди- наковые антигенные детерминанты. В случаях наличия перекрестной реактивности антигенные детерминанты веществ, обладающих перекрестной реактивностью, могут иметь идентичные химиче- ские структуры или состоять из одинаковых, но не идентичных физико-химических структур. В при- веденном ранее примере токсин и соответствую- щий ему анатоксин представляют две молекулы: токсин является первоначальной молекулой, а анатоксин — модифицированной, которая обла- дает перекрестной реактивностью по отношению к первоначальной (нативной) молекуле. Существуют и другие примеры иммунологи- ческой перекрестной реактивности, в которых два вещества, обладающие ею, не родственны друг другу за исключением того, что обладают одним или более общими эпитопами, точнее одним или более участками, имеющими одинаковые трехмер- ные характеристики. Эти вещества относят к гете- рофильным антигенам. Например, антигены груп- пы крови А человека реагируют с антисыворот- кой, полученной против полисахарида (тип XIV) капсулы пневмококка. Таким же образом, анти- гены группы крови В человека реагируют с анти- телами к определенным штаммам Escherichia coli. В этих примерах перекрестной реактивности антигены микроорганизмов относятся к гетеро- фильным антигенам (относительно антигенов групп крови). АДЪЮВАНТЫ Для усиления иммунного ответа на представлен- ный антиген часто используются различные до- бавки и наполнители. Адъювант (от лат. adjuvare — помогать) является веществом, которое при сме- шивании с иммуногеном усиливает иммунный ответ против этого иммуногена. Важно различать носитель для гаптена и адъювант. Гаптен стано- вится иммуногенным после ковалентного конъю- гирования с носителем; он не может быть имму- ногенным при смешивании с адъювантом. Таким образом, адъювант усиливает иммунный ответ на иммуногены, но не придает иммуногенность гап- тенам. Адъюванты используются для усиления иммун- ной реакции на антигены уже более 70 лет. В на-
АДЪЮВАНТЫ 57 стоящее время растет интерес к выявлению но- вых адъювантов для использования их при вак- цинации, поскольку многие кандидаты в вакци- ны не обладают достаточной иммуногенностью. Это особенно важно для пептидных вакцин. Ме- ханизм действия адъюванта включает: 1) увеличе- ние биологического и иммунологического пери- ода полураспада антигенов вакцины; 2) увеличе- ние продукции местных воспалительных цитоки- нов; 3) улучшение доставки, процессирования антигенов и их представления (презентации) АПК. особенно дендритными клетками. Эмпирически было выяснено, что адъюванты, содержащие мик- робные компоненты (например, экстракты мико- бактерий), являются лучшими. Патогенные ком- поненты вынуждают макрофаги и дендритные клетки экспрессировать костимулирующие моле- кулы и выделять цитокины. Недавно было пока- зано, что в такую индукцию, осуществляемую микробными компонентами, вовлекаются молеку- лы, распознающие структуры патогенных микро- организмов (например, TLR 2), экспрессируемые этими клетками. Таким образом, связывание мик- робных компонентов с TLR дает клеткам сигнал экспрессировать костимуляторные молекулы и секретировать цитокины. Хотя много различных адъювантов испытаны в опытах на животных (табл. 3.2) и в эксперимен- тах на человеке, только один стал использоваться для обычной вакцинации. В настоящее время единственными адъювантами, разрешенными к использованию в патентованных вакцинах для людей в США, являются гидрат окиси алюминия и фосфат алюминия. Как компонент неорганической соли ион алю- миния связывается с протеинами, вызывая их преципитацию, что усиливает воспалительную реакцию, которая неспецифически увеличивает иммуногенность антигена. После инъекции пре- ципитированный антиген высвобождается из ме- ста инъекции медленнее, чем обычный Более того, если в результате преципитации размер ан- тигена увеличится, это повысит вероятность того, что макромолекула будет подвергнута фагоцитозу. Многие адъюванты используются в экспери- ментах на животных. Одним из обычно использу- емых адъювантов является полный адъювант Фрейн- да (Freund’s complete adjuvant — FCA). состоя- щий из убитых Mycobacterium tuberculosis или М. Butyricит, суспензированных в масле. В после- дующем из них готовится эмульсия с водным рас- твором антигена. Водно-масляная эмульсия, со- держащая адъювант и антиген, позволяет антиге- ну медленно и постепенно высвобождаться, про- длевая воздействие иммуногена на реципиента. Другими микроорганизмами, используемыми в качестве адъювантов, являются бациллы Кальмет- та-Герена (БЦЖ) (аттенуированные Mycobacte- rium). Corynebacterium parvum и Bordetella pertusis. В действительности многие из этих адъювантов используют способность молекул, экспрессируе- мых микробами, активировать иммунные клетки. К таким молекулам относят липополисахариды (ЛПС), бактериальную ДНК, содержащую неме- тилированные CpG динуклеотидные повторы, и бактериальные белки теплового шока. Многие из этих микробных адъювантов связывают рецепто- ры, распознающие структуры патогенных микро- организмов, такие как TLR. Связывание этих рецепторов, экспрессируемых многими типами клеток врожденной иммунной системы, способ- ствует стимуляции адаптивного ответа В- и Т-лим- фоцитами. Например, дендритные клетки явля- ются важными АПК, через которые проявляется • Таблица 3.2. Известные адъюванты и механизм их действия Адъювант Состав Механизм действия Гидрат окиси или фосфат алюминия (квасцы) Гель гидрата окиси алюминия Увеличение поглощения антигенов АПК; замедление высвобождения антигена Алюминий с дипептидом, выделенным из мико- бактерий Гель гидрата окиси алюминия с мурамилдипептидом Увеличение поглощения антигенов АПК; замедление высвобождения антигена; индукция костимуляторных молекул на АПК Алюминий с Bordetella pertusis Гель гидрата окиси алюминия с убитой Bordetella pertusis Увеличение поглощения антигенов АПК; замедление высвобождения антигена; индукция костимуляторных молекул на АПК Полный адъювант Фрейнда Водно-масляная эмульсия с убитыми микобактериями Увеличение поглощения антигенов АПК; замедление высвобождения антигена; индукция костимуляторных молекул на АПК Неполный адъювант Фрейнда Водно-масляная эмульсия Увеличение поглощения антигенов АПК; замедление высвобождения антигена Иммуностимулирующие комплексы Открытые структуры, напомина- ющие клетку, содержащие холе- стерин и смесь сапонинов Высвобождение антигена в цитозоль; позволяют индуцировать Т-клеточные цитотоксические ответы
58 ГЛАВА 3. ИММУНОГЕНЫ И АНТИГЕНЫ действие микробных адъювантов. Они отвечают секрецией цитокинов и экспрессией костимуля- торных молекул, которые в свою очередь стиму- лируют активацию и дифференцировку антиген- специфичных Т-клеток. РЕЗЮМЕ 1. Иммуногенность — это способность соединения вызвать иммунный ответ. Условием иммуногенности являются: а) чужеродность соединения для иммуни- зируемого индивидуума; б) превышение определен- ной минимальной молекулярной массы; в) опреде- ленный уровень химической сложности; г) способ- ность к деградации или чувствительность к процесси- рованию антигена, а также представление (презента- ция) посредством взаимодействия с МНС. 2, Антигенность определяется способностью со- единения связаться с антителами или клетками им- мунной системы. Это связывание является высоко- специфичным; компоненты иммунной системы спо- собны распознавать различные физико-химические характеристики соединения. В образование связи между антигеном и иммунными компонентами вовле- чены несколько слабых сил, действующих на неболь- ших расстояниях (ван-дер-ваальсовы силы, электро- статические взаимодействия, гидрофобные взаимо- действия и водородные связи), но не задействованы ковалентные связи. 3. Наименьшая частица антигена, способная свя- зываться с антителами, называется антигенной детер- минантой, или эпитопом. Соединения могут иметь один или более эпитопов, способных реагировать с иммунными молекулами Иммунный ответ на эти со- единения подразумевает продукцию антител или об- разование клеток, специфично направленных против большинства или всех этих эпитопов. 4, Для иммуноглобулинов, представленных на мембране В-клетки, или секретируемых антител ха- рактерно распознавание доступных аминокислотных последовательностей, которые обычно гидрофобны и мобильны. Это могут быть как последовательно, так и непоследовательно расположенные аминокислот- ные остатки (конформационные детерминанты), ко- торые сближаются в результате трехмерного склады- вания белка. Мембранные формы иммуноглобулинов на В-клетках и антитела способны распознавать по- лисахариды и липиды. 5. Т-клетки распознают внутреннюю последова- тельность аминокислот в молекуле белка в комплексе с молекулами МНС I или II класса. Пептидные фраг- менты белковых антигенов образуются в результате процессирования антигена и могут связываться с мо- лекулами МНС и представляться Т-клеткам. 6- Термин «иммунологическая перекрестная реак- тивность» означает ситуацию, когда два или более вещества, которые могут в определенной степени от- личаться друг от друга, обладают одинаковыми эпито- пами и способны взаимодействовать с иммунными компонентами, вырабатываемыми против любого из них. Так, анатоксин, который является модифициро- ванной формой токсина, может обладать одним (или более) общим эпитопом с токсином. Иммунизация анатоксином ведет к выработке иммунного ответа не только на анатоксин, но и на нативный токсин. 7. Адъювантами являются вещества, способные ускорять, продлевать и повышать качество специфич- ных иммунных ответов. При введении с антигеном адъюванты способствуют иммунным реакциям, специ- фичным для данного антигена (но не для самого адъ- юванта), поскольку усиливают реакцию неспецифи- чески. Принцип действия адъювантов заключается в усилении презентации антигена АПК (особенно денд- ритными клетками), индукции костимулирующих мо- лекул, а также местного воспалительного цитокиново- го ответа. ТЕСТЫ Выберите ОДИН НАИБОЛЕЕ ПРАВИЛЬНЫЙ ответ на каждый тест. 1. Большой белок расщеплен ферментами в ла- боратории для получения смеси пептидов длиной от 4 до 10 аминокислот. После введения пептидной сме- си экспериментальному животному следует ожидать: а) что при введении только смеси пептидов будут вырабатываться специфичные к пептиду антитела; б) специфичные к пептиду антитела будут выраба- тываться, только если вместе со смесью пептидов бу- дет вводиться адъювант; в) специфичные к пептиду антитела будут выраба- тываться, только если они вначале будут объединены с носителем; г) специфичные к пептиду антитела и Т-клетки бу- дут формироваться после введения только пептидной смеси; д) специфичные к пептиду антитела и Т-клетки бу- дут образовываться, только если со смесью пептидов будет вводиться адъювант. 2, Иммунитет против вируса оспы, сформировав- шийся в результате предшествующей инфекции, выз- ванной коровьей оспой, обусловлен: а) антигенной специфичностью; б) перекрестной реактивностью антигенов; в) усиленным захватом вирусов макрофагами; г) врожденным иммунитетом; д) пассивной защитой. 3. Трансформация токсина в анатоксин: а) делает токсин более иммуногенным; б) уменьшает фармакологическую активность ток- сина; в) усиливает связывание с антитоксином; г) индуцирует только природный иммунитет; д) усиливает фагоцитоз. 4, Гаптены: а) нуждаются в молекулах-носителях, чтобы стать иммуногенными; б) реагируют со специфическими антителами, ког- да не используются гомологичные носители; в) взаимодействуют со специфичным антителом, даже если гаптены моновалентны; г) не могут стимулировать вторичный антительный ответ без носителей; д) все перечисленное
АДЪЮВАНТЫ 59 5, Адъювант является веществом: а) увеличивающим размер иммуногена; б) повышающим иммуногенность гаптенов; в) усложняющим химическую структуру иммуногена; г) усиливающим иммунный ответ на иммуноген; д) усиливающим иммунологическую перекрестную реактивность. 6, Антитела к антигену столбнячного анатоксина одного типа реагируют с ним, даже если анатоксин денатурирован с разрывом всех дисульфидных свя- зей. Антитела другого типа против столбнячного ана- токсина не могут реагировать с анатоксином после подобной денатурации. Наиболее логичным объясне- нием этого будет следующее: а) первые антитела являются специфичными для нескольких эпитопов, экспрессируемых анатоксином; б) первые антитела специфичны для первичной последовательности аминокислот анатоксина, в то время как вторые специфичны для конформационных детерминант; в) вторые антитела специфичны для дисульфидных связей; г) первые антитела имеют более высокую аффин- ность с анатоксином ОТВЕТЫ НА ТЕСТЫ 1 — в. Пептиды (длиной 4—10 аминокислот) яв- ляются молекулами с низкой молекулярной массой. С учетом небольшого размера они не способны выз- вать антительный ответ. Пептиды могут стать иммуно- генными при соединении или связывании с носителем. 2 — 6. Иммунитет против оспы, возникший после инфицирования вирусом коровьей оспы, является примером перекрестной реактивности антигенов. Им- мунизация вирусом коровьей оспы приводит к воз- никновению иммунного ответа на натуральную оспу, поскольку эти два вируса обладают несколькими идентичными или схожими по структуре детерминан- тами. 3 — б. Трансформация токсина в анатоксин про- исходит, чтобы уменьшить фармакологическую актив- ность токсина. После этого можно ввести достаточное количество анатоксина для индуцирования иммунного ответа 4 - д. Гаптены обычно являются моновалентными веществами с низкой молекулярной массой и сами по себе не могут вызывать иммунные реакции (первич- ные или вторичные). Но они могут инициировать та- кие реакции при конъюгировании с носителями, обла- дающими высокой молекулярной массой. Гаптены могут реагировать и реагируют с индуцированными антителами; при этом нет необходимости их конъюга- ции с носителем. 5 — г. Иммунологический адъювант является ве- ществом, которое в смеси с иммуногеном усиливает иммунный ответ на данный иммуноген. Механизм действия при этом зависит от используемого адъю- ванта (например, усиление презентации антигена, за- медление удаления антигена). Адъювант не увеличи- вает размер антигена и не усложняет его химическую структуру. Кроме того, адъювант не усиливает иммун- ную реакцию на гаптен; для индуцирования реакции против гаптена необходима конъюгация гаптена с им- муногенным носителем. Адъювант не имеет отноше- ния к возможной токсичности иммуногена. 6 — 6. Антитела могут распознавать единичные эпитопы, сформированные первичными, вторичными, третичными или четвертичными конформационными структурами. Денатурация белка с разрывом дисуль- фидных связей обычно разрушает конформационные детерминанты. Поэтому первые антитела реагируют с детерминантой, образованной первичной последова- тельностью аминокислот. Эта детерминанта присут- ствует как в первоначальном, так и денатурированном токсине, в то время как следующие антитела распо- знают конформационную детерминанту, присутствую- щую только на исходном токсине
Глава СТРУКТУРА АНТИТЕЛ И ИХ ФУНКЦИИ ВВЕДЕНИЕ Одной из основных функций иммунной системы является продукция растворимых белков, свобод- но циркулирующих и обладающих особыми свой- ствами, необходимыми для работы иммунной си- стемы и защиты от чужеродных субстанций. Эти растворимые белки — антитела — относятся к классу белков, называемых глобулинами в связи с их глобулярной структурой. Первоначально из-за способности к перемещению при электрофорезе их назвали у-глобулинами (в отличие от более быстро перемещающихся альбумина, а-глобули- нов и р-глобулинов). Теперь они известны под общим названием иммуноглобулины (1g). Иммуноглобулины экспрессируются в виде сек- ретируемых и мембранных форм. Секретируемые антитела вырабатываются В-клетками на терми- нальной стадии дифференцировки — плазмати- ческими клетками, которые служат фабриками по производству антител и располагаются в основ- ном в костном мозге. Мембранные антитела при- сутствуют на поверхности В-клеток, где они слу- жат антигенспецифичными рецепторами. Мемб- ранная форма антитела, ассоциированная с гете- родимером, называемым Iga/Igp, образует В-кле- точныйрецептор (BCR). Как будет описано в гл. 7, гетеродимер Iga/Igp проводит внутрь клетки сиг- налы, связанные с активацией В-лимфоцита. Структура иммуноглобулинов определяет не- которые свойства, необходимые для их участия в иммунном ответе. Двумя наиболее важными из этих свойств являются специфичность и биоло- гическая активность. Как будет показано далее, специфичность обусловлена определенной обла- стью молекулы антитела, которая содержит ги- первариабельный участок, или участок, опреде- ляющий комплементарность (CDR). Этот участок ограничивает связь антитела только с теми суб- станциями, которые содержат одну определенную антигенную структуру. Существование огромно- го разнообразия потенциальных антигенных де- терминант, или эпитопов (см. гл. 3), обусловило эволюцию системы в направлении продукции та- кого спектра молекул антител, чтобы каждая из них была способна комбинироваться со строго оп- ределенной (частной) антигенной структурой. Все вместе — репертуар антител — характеризуется большим разнообразием в отношении типов мо- лекулярных структур, с которыми они способны реагировать, однако по отдельности эти антитела проявляют высокий уровень специфичности, по- скольку одно антитело способно реагировать толь- ко с одной определенной антигенной структурой. Хотя количество антител разных специфично- стей, способных реагировать со многими струк- турными единицами, очень велико, биологиче- ские эффекты таких реакций довольно немного- численны. К ним относятся: нейтрализация ток- синов, иммобилизация микроорганизмов, нейт- рализация вирусной активности, агглютинация (скопление) микроорганизмов или антигенных частиц (см. гл. 5), связывание растворимого ан- тигена. ведущее к образованию преципитатов (ко- торые активно элиминируются фагоцитирующи- ми клетками; см. гл. 2) и активация сывороточ- ного комплемента для усиления лизиса микро- организмов (см. гл. 13) или фагоцитоза и деструк- ции, осуществляемых либо фагоцитирующими клетками, либо лимфоцитами-киллерами. Еще одним важным биологическим свойством анти- тел является их способность проникать через пла- центу от матери к плоду. Не все молекулы анти- тел способны одинаково выполнять все эти био- логические функции. Различия в биологических функциях антител определяются их изотипической структурой (клас- сом). В то время как одна часть молекулы антите-
СТРУКТУРА ЛЕГКИХ И ТЯЖЕЛЫХ ЦЕПЕЙ 61 ла должна легко подвергаться адаптации, чтобы обеспечить возможность приспосабливаться к большому числу эпитопов, другая часть должна легко адаптироваться для выполнения биологи- ческих функций, общих для многих антител. Опре- деление структуры антител, установление взаимо- связи между их структурой и функцией и выявле- ние генетической организации молекул иммуно- глобулинов в значительной степени способство- вали нашему пониманию эволюционирования иммунной системы. Весь антительный репертуар представляет собой сложную, высокоспециализи- рованную систему, в которой различные структу- ры (иммуноглобулины) распознают одно и то же — антиген, но комплекс иммуноглобулина с анти- геном определяет развитие множества различных биологических эффектов. В этой главе описыва- ются структурные и биологические свойства им- муноглобулинов. I ОБНАРУЖЕНИЕ АНТИТЕЛ И ОПРЕДЕЛЕНИЕ ИХ ХАРАКТЕРИСТИК Антитела содержатся в сыворотке крови, кото- рую получают после ее свертывания и удаления образовавшегося сгустка с находящимися в нем клетками и факторами свертывания. При электро- форезе сыворотки (разделении в электрическом поле) в условиях слабощелочной среды (pH 8,2), в ней, как правило, можно различить пять ос- новных компонентов (рис. 4.1). Было показано, что антитела содержатся в области у-глобулинов, где располагаются самые медленные с точки зрения миграции относительно анода элементы. После выявления этой закономерности провели простое сравнение элекрофоретических профилей антисы- воротки, взятой у гипериммунизированного кро- лика (получившего многоразовую иммунизацию тест-антигеном) до и после удаления тестируе- мых антигенспецифичных антител, для чего про- вели преципитацию с антигеном. Эта процедура привела к уменьшению размера только фракции у-глобулинов. Анализ показал, что когда эта фрак- ция собиралась отдельно, в ней содержались все определяемые антитела. Позднее было показано, что активность антител присутствует не только в у-глобулиновой фракции, но и в области, не- сколько более близкой к аноду. В результате все глобулярные белки, обладающие свойствами ан- тител, были в основном отнесены к иммуногло- булинам, что подтверждает у-пик (см. рис. 4.1). Ширина электрофоретических пиков свиде- тельствует, что они представляют гетерогенную смесь иммуноглобулиновых молекул с немного различающимися зарядами. Эта гетерогенность была одним из первых препятствий на пути опре- деления структуры антител, поскольку аналити- ческая химия в качестве первичного материала (+) Электрофоретическая мобильность (-) • Рис. 4.1. Электрофоретическая мобильность белков сы- вороток, полученных от нормального индивидуума (голу- бая) и больного с lgG-миеломой (красная) (с любезного разрешения д-ра С Miller, School of Medicine, University of California at Davis) требует гомогенных материалов, способных кри- сталлизоваться. Эта проблема была частично ре- шена после открытия миеломных белков, которые являются гомогенными иммуноглобулинами, про- изводимыми потомством одной плазматической клетки, подвергшейся опухолевой трансформации при злокачественном заболевании, называемом множественной миеломой. Это наглядно демон- стрирует форма у-глобулинового зубца элекрофо- реграммы сывороточных белков больного множе- ственной миеломой (см. рис. 4.1). Когда выясни- ли, что некоторые миеломные белки связывают антиген, стало очевидно, что с ними можно обра- щаться, как с типичными молекулами иммуно- глобулина. Другим подспорьем в исследованиях структу- ры антител стало открытие белков Бенс-Джонса в моче. Эти гомогенные белки, определяемые в больших количествах у некоторых больных мно- жественной миеломой, являются димерами к- или Х-легких цепей иммуноглобулинов. Они оказались очень полезными при определении структуры этой части иммуноглобулиновой молекулы. Сегодня разработана эффективная методика гибридизации двух клеток (гибридомная технология), которая позволяет получать большое количество гомоген- ных препаратов моноклональных антител прак- тически любой специфичности (см. гл. 5). СТРУКТУРА ЛЕГКИХ И ТЯЖЕЛЫХ ЦЕПЕЙ Структурные характеристики антител начали ана- лизировать в 1959 г. после двух открытий, пока- завших, что эти молекулы могут быть разделены на части, пригодные для дальнейшего исследова- ния. В Англии Р.Р. Портер (R.R. Porter) обнару- жил, что после протеолитического расщепления
62 ГЛАВА 4. СТРУКТУРА АНТИТЕЛ И ИХ ФУНКЦИИ Н-цепьх S-S-' S-S- Fc-субфрагменты Fc □ □ • Рис 4.2. Протеолитическое расщепление иммуногло- булина с использованием папаина и пепсина молекулы иммуноглобулина (молекулярная мас- са 150000 Да) ферментом папаином получаются три фрагмента примерно одинаковой величины (рис. 4.2). Два фрагмента сохраняют способность к специфическому связыванию антигена, хотя в отличие от интактной молекулы утрачивают спо- собность к преципитации антигена в растворе. Эти Связывание антигена Связывание антигена • Рис. 4.3. Молекула иммуноглобулина с наличием им- муноглобулиновых петлевых доменов, сформированных дисульфидными мостиками внутри цепей два фрагмента назвали Fab-фрагментами (fragment antigen binding — фрагмент, связывающий анти- ген), их считают моновалентными (имеющими по одному связывающему центру) и идентичными по всем параметрам. Третий фрагмент может быть выкристаллизован из раствора, что указывает на его явную гомогенность. Он называется Fc-фраг- ментом (crystallizable fragment — кристаллизуемый фрагмент). Он не может связываться с антигеном, но, как было показано в дальнейшем, отвечает за биологические функции молекулы антитела пос- ле того, как антиген связывается с Fab-фрагмен- том интактной молекулы. Примерно в то же время в США Д. Г. Эдель- ман (D. Н. Edelman) обнаружил, что при воздей- ствии меркаптоэтанола (реактива, разрушающего S — S-мостики) молекула у-глобулина значитель- но уменьшается; она разделяется на четыре цепи: две одинаковые легкие цепи молекулярной массой около 53000 Да каждая и две другие примерно по 22000 Да каждая. Более крупные молекулы были названы тяжелыми (heavy — Н) цепями, а более мелкие — легкими (light — L). На основании этих результатов была определена структура молекул иммуноглобулина, как она представлена на рис. 4.2. В последующем была доказана принципиальная правильность модели, а Р. Р. Портер и Д. Г. Эдель- ман поделили Нобелевскую премию за открытие структуры антител. Таким образом, все молекулы иммуноглобулина имеют базовую структуру, со- стоящую из четырех полипептидных цепей — двух одинаковых тяжелых и двух одинаковых легких, связанных несколькими дисульфидными мости- ками. Следует отметить, что папаин расщепляет иммуноглобулиновую молекулу в N-терминаль- ном конце шарнирной области до дисульфидного мостика, в результате чего получаются два моно- валентных Fab- и Fc-фрагмента. В отличие от папаина пепсин расщепляет шарнирную область в С-терминальном конце ниже дисульфидного мостика, что приводит к получению двухвалент- ного фрагмента, названного F(ab )2, в котором со- держатся два Fab-фрагмента, соединенных дисуль- фидным мостиком, а также несколько Fc-субфраг- ментов (см. рис. 4.2). Детально базовая структура молекулы иммуноглобулина, состоящая из двух гликозилированных тяжелых и двух легких цепей, представлена на рис. 4.3. Заметьте, что кроме ди- сульфидных мостиков между цепями, которые удерживают их вместе, внутри каждой тяжелой и легкой цепи содержатся дисульфидные мостики, создающие иммуноглобулиновые (петлевые) до- мены. которые формируют антипараллельную р-складку — структуру, характерную для молекул антител. Далее в этой главе указывается, что дру- гие молекулы, принадлежащие к так называемо- му суперсемейству иммуноглобулинов, также об- ладают этим структурным признаком. Как в случае с другими белками, иммуногло- булины одного вида иммуногенны для другого вида. Использование иммуноглобулинов опреде-
ДОМЕНЫ 63 ленного вида в качестве иммуногенов у другого вида позволяет вырабатывать различные антисы- воротки, которые способны распознавать струк- туру разных цепей иммуноглобулинов. При сов- местном использовании биохимических и серо- логических (с использованием сывороточных ан- тител) методов было показано, что почти у всех исследованных видов животных имеются два ос- новных класса легких цепей: к и X. У животных каждого вида продуцируются легкие цепи обоих типов, но соотношение к- и Х-цепей различны для каждого вида (у мыши 95 % к-цепей, у чело- века 60%). Однако в любой молекуле иммуно- глобулина обе легкие цепи всегда или к-, или Х-типа; никогда не бывает по одной цепи каждо- го типа. Хотя существует всего два типа легких цепей, было показано, что иммуноглобулины практически у всех видов состоят из пяти разных классов (изотипов), различающихся по структуре тяжелых цепей. Эти тяжелые цепи различаются по антигенным свойствам (серологически), содер- жанию углеводородов и размеру. Более важно то, что они определяют различные биологические свойства, присущие каждому изотипу. Тяжелые цепи, чьи константные области являются произ- водными генов тяжелых цепей иммуноглобули- нов (детально обсуждается в гл. 6), обозначаются греческими буквами, как показано в табл. 4.1. Гены, кодирующие константные области тя- желых цепей, обозначаются сходным образом (см. гл. 6). Поэтому гены, кодирующие константные (С) области, отвечающие за ц, 8, у, а и е тяжелые цепи, называются Ср, С8, Су, Са, Се соответ- ственно. У представителей любого вида есть тяжелые цепи в пропорциях, характерных для данного вида, но в любой молекуле антитела обе тяжелые цепи идентичны (например 2у, 2е). Таким образом, молекула антитела класса IgG может иметь струк- туру к2у2 с двумя идентичными легкими к-цепя- ми и двумя тяжелыми у-цепями. В отличие от этого антитело класса IgE может иметь структу- ру к2е2 или Х2е2. В каждом случае именно при- рода тяжелых цепей придает молекуле ее уни- кальные биологические свойства, такие как пе- риод полураспада в кровотоке, способность свя- зываться с определенными рецепторами и акти- вировать ферменты (см. гл. 13) в комбинации с антигенами. Дальнейшее определение характеристик этих изотипов с помощью специфических антисыво- • Таблица 4.1. Распределение иммуноглобулинов по изотипам в соответствии с наличием тяжелых цепей Изотип Тяжелая цепь Изотип Тяжелая цепь IgM IgD IgG Н 8 Y IgA IgE а Е роток привело к выявлению ряда подклассов, имеющих более тонкие отличия. Так, основной класс IgG человека может быть разделен на под- классы IgGj, IgG2, IgG3 и IgG4. Иммуноглобу- лин А также был разделен на два подкласса: IgAj и lgA2. Подклассы отличаются друг от друга по числу и организации дисульфидных мостиков между цепями, а также по изменениям в других структурных свойствах. Эти изменения в свою очередь вызывают изменения функциональных свойств, как описано далее. • ДОМЕНЫ На ранних этапах исследования структуры имму- ноглобулинов стало ясно, что кроме дисульфид- ных мостиков, которые удерживают вместе лег- кие и тяжелые цепи, а также две тяжелые цепи, внутри каждой цепи существуют дисульфидные мостики, формирующие петли в структуре каж- дой цепи. Глобулярная структура иммуноглобу- линов и способность ферментов расщеплять эти молекулы на крупные составляющие в строго опре- деленных местах, а не разрушать их до олигопеп- тидов и аминокислот, указывает на чрезвы- чайную компактность структуры. Более того, на- личие дисульфидных мостиков внутри цепи че- рез регулярные и примерно равные промежутки по 100—110 аминокислот означает, что каждая петля в пептидных цепях должна формировать компактно сложенный глобулярный домен. В дей- ствительности каждая легкая цепь имеет по два домена, а тяжелые цепи — по четыре или пять доменов, разделенных несложно организованны- ми отрезками (см. рис. 4.3). Наличие таких кон- фигураций было подтверждено прямыми наблю- дениями и с помощью генетического анализа (см. гл. 6). Молекулы иммуноглобулинов собраны из от- дельных доменов, каждый из которых располага- ется вокруг дисульфидного мостика и настолько гомологичен остальным, что можно предполо- жить, что они развились из одного общего гена- предшественника, который дуплицировал себя несколько раз, а затем изменил свою аминокис- лотную последовательность, чтобы получившие- ся разные домены выполняли различные функ- ции. Каждый домен обозначают буквой, означа- ющей его принадлежность к легкой или тяжелой цепи, и числом, указывающим его положение. Как мы детально рассмотрим далее, первый домен на легкой и тяжелой цепях всех антител крайне ва- риабелен по последовательности аминокислот; он обозначается как VL и VH соответственно (см. рис. 4.3). Второй и последующие домены на обе- их тяжелых цепях гораздо более постоянны по последовательности аминокислот и обозначаются CL или Сн1, Сн2 и Сн3 (см. рис. 4.3). В дополнение к дисульфидным мостикам между цепями глобу- лярные домены связываются друг с другом в гомо-
64 ГЛАВА 4 СТРУКТУРА АНТИТЕЛ И ИХ ФУНКЦИИ логичные пары в основном за счет гидрофобных взаимодействий в следующем порядке: VHVL, CH1CL, СН2СН2, СнЗСнЗ. ШАРНИРНАЯ ОБЛАСТЬ У иммуноглобулинов (возможно, за исключением IgM и IgE) шарнирная область состоит из корот- кого сегмента аминокислот и обнаруживается между участками СН1 и Сн2 тяжелых цепей (см. рис. 4.3). Этот сегмент состоит преимущественно из остатков цистеина и пролина. Цистеины во- влечены в формирование дисульфидных мости- ков между цепями, а пролиновые остатки пре- дотвращают складывание в глобулярную структу- ру. Этот участок тяжелой цепи отвечает за важ- ную структурную характеристику иммуноглобули- нов. Он обеспечивает подвижность между двумя Fab - фрагментами Y-образной молекулы антитела. Это позволяет Fab-фрагментам открываться и зак- рываться, чтобы обеспечивать связывание с двумя эпитопами, разделенными фиксированным проме- жутком, что может наблюдаться на поверхности бактерии. Кроме того, поскольку этот отрезок ами- нокислот открыт и доступен, как любой другой несвернутый пептид, он может быть расщеплен протеазами для получения Fab- и Fc-фрагментов, описанных ранее (см. рис. 4.2). ВАРИАБЕЛЬНАЯ ОБЛАСТЬ Биологические функции молекулы антитела про- истекают из свойств константной области, кото- рая идентична для антител любой специфично- сти внутри определенного класса. При этом часть молекулы, которая связывается с эпитопом, со- ставляет вариабельную область. Основной про- блемой для иммунологов было определение, ка- ким образом вариабельная область может обес- печить такое большое разнообразие индивиду- альных специфичностей, которое необходимо для соответствия огромному количеству антигенов. • Рис. 4.4. Вариабельность аминокислот, составляющих N-концевые остатки VH, в молекуле иммуноглобулина Антигенный эпитоп • Рис. 4.5. Комплементарность между эпитопом и анти- генсвязывающим центром, состоящим из гипервариа- бельных участков L- и Н-цепей. Пронумерованные буквы обозначают CDR тяжелой и легкой цепей, номера в круж- ках - номера аминокислотных остатков в CDR Как мы увидим в гл. 6, этот вопрос был в основ- ном решен. Когда была определена последовательность аминокислот у белков с высокой однородностью (например, миеломные белки и белки Бенс-Джон- са), обнаружили, что наибольшая вариабельность последовательностей существует для ПО N-тер- минальных аминокислот как легкой, так и тяжелой цепей. Е.А.Кабат (Е.А. Kabat) и Т.Т.Ву (T.T.Wu) сравнили последовательность аминокислот мно- гих Vl-h Ун-областей. Они схематически пред- ставили вариабельность аминокислот в каждой позиции цепи и показали, что наибольшая сте- пень вариабельности (определяемая соотношени- ем числа различных аминокислот в данной пози- ции к частоте наиболее характерных аминокис- лот в данной позиции) наблюдается в трех обла- стях легкой и трех областях тяжелой цепи. Эти участки называются гипервариабельными. Менее вариабельные участки, которые находятся между гипервариабельными участками, называются кар- касными. Теперь известно, что гипервариабель- ные участки принимают участие в связывании антигена и формируют регион, комплементарный по структуре эпитопу антигена. Исходя из этого, гипервариабельные участки называются участка- ми^ определяющими комплементарность легких и тяжелых цепей: CDR1, CDR2 и CDR3 (рис. 4.4). Гипервариабельные участки, хотя и разделены в линейной двухмерной модели пептидных цепей, в действительности приближены друг к другу в свернутой форме интактной молекулы антитела. Вместе они составляют антигенсвязывающий центр, комплементарный эпитопу (рис. 4.5). Ва- риабельность этих CDR обеспечивает различия в конфигурации антигенсвязываюшего центра, ко- торые необходимы для функционирования анти- тел различной специфичности. Все известные силы, вовлеченные во взаимодействие антиген — антитело, являются слабыми нековалентными вза- имодействиями (например, ионные, водородные, ван-дер-ваальсовы силы и гидрофобные взаимо-
ВАРИАНТЫ ИММУНОГЛОБУЛИНОВ 65 действия). Поэтому необходимо, чтобы между ан- тигеном и антителом был тесный контакт в доста- точно большой области, чтобы обеспечить общую связывающую силу, адекватную для устойчивого взаимодействия. В соединении между эпитопом и антителом участвуют и тяжелая, и легкая цепи. Теперь должно быть ясно, что две молекулы антитела с разной антигенной специфичностью должны иметь и различную последовательность аминокислот в своих гипервариабельных участ- ках, а те, которые обладают одинаковой последо- вательностью, обычно имеют и одинаковую спе- цифичность. Однако существует возможность, что два антитела с разной последовательностью ами- нокислот обладают специфичностью к одному и тому же эпитопу. В этом случае аффинность свя- зывания антител с эпитопом будет, вероятно, раз- личной, поскольку будут существовать различия в числе и типах связывающих сил, доступных для связывания идентичных антигенов с разными свя- зывающими участками двух антител. Дополнительный источник вариабельности может заключаться в размере антигенсвязываю- щего участка на антителе, который обычно (но не всегда) имеет форму углубления или щели. В не- которых случаях, особенно если вовлечены не- большие гидрофобные гаптены, эпитопы занима- ют не весь антигенсвязывающий участок. Однако при этом достигается достаточная аффинность связывания. Было показано, что антитела, специ- фичные для таких небольших гаптенов, могут в действительности реагировать с другими антиге- нами, не обладающими явным сходством с гапте- ном (например, динитрофенол и эритроциты ба- рана). Эти большие отличающиеся антигены свя- зываются или с большим участком, или же с дру- гим участком антигенсвязывающего центра на антителе (рис. 4.6). Таким образом, способность определенного антигенсвязывающего центра свя- зываться с двумя (или более) действительно раз- личными эпитопами называют избыточностью, Способность одной молекулы антитела перекрест- но реагировать с неопределенным числом эпито- пов может уменьшить количество антител, необ- ходимых для защиты индивида от широкого спек- тра агрессивных антигенов. • Рис. 4.6. Варианты того, как антитело (Ац) определен- ной специфичности может проявлять способность к свя- зыванию с двумя различными эпитопами (Aq и Аг2) I ВАРИАНТЫ ИММУНОГЛОБУЛИНОВ Изотипы До сих пор описывались черты, общие для всех иммуноглобулиновых молекул, такие как конст- рукция из четырех цепей и структурные домены. В своем противостоянии агрессивным чужерод- ным субстанциям организм выработал ряд меха- низмов, каждый из которых основан на каком-то отдельном свойстве или функции молекулы им- муноглобулина. Таким образом, когда специфич- ная молекула антитела соединяется со специфич- ным антигеном или патогеном, начинают действо- вать несколько разных эффекторных механизмов. Эти механизмы опосредованы различными клас- сами (изотипами) иммуноглобулинов, каждый из которых может взаимодействовать с одним и тем же эпитопом, но при этом каждый может запус- кать отличную от других реакцию. Данные отли- чия являются результатом структурных вариаций тяжелых цепей, создавших домены, определяю- щие разнообразие функций. Структурные изме- нения обсуждаются в данной главе. Общий обзор свойств классов иммуноглобулинов представлен в табл. 4.2 и 4.3 и на рис. 4.7. Аллотипы Другой формой вариаций в структуре иммуно- глобулинов являются аллотипы. Эти вариации ос- нованы на генетических различиях между инди- видуумами и зависят от существования аллель- ных форм (аллотипов) одного и того же белка в результате присутствия разных форм одного и того же гена в данном локусе. В результате алло- типы тяжелой или легкой цепи, составляющие любой иммуноглобулин, могут присутствовать у одних представителей вида и отсутствовать у дру- гих. Подобная ситуация резко отличается от си- туаций с классами или подклассами иммуногло- булинов, которые присутствуют у всех предста- вителей вида. Аллотипические различия в известных локу- сах затрагивают только одну или две аминокис- лоты в константном участке цепи. За редким ис- ключением наличие аллотипических различий у двух идентичных молекул иммуноглобулина обыч- но не влияет на связывание антигена, но служит важным маркером для анализа наследования по Менделю. Некоторые известные аллотипические марке- ры составляют группы на у-цепи человеческого IgG (называемую Gm для маркеров IgG), к-цепи (называемую Кт) и ос-цепи (называемую Ат), Аллотипические маркеры были обнаружены у иммуноглобулинов нескольких видов обычно при использовании антисыворотки, полученной путем иммунизации представителя данного вида
66 ГЛАВА 4. СТРУКТУРА АНТИТЕЛ И ИХ ФУНКЦИИ • Таблица 4.2. Наиболее важные свойства изотипов иммуноглобулина Свойство Изотип IgG IgA IgM IgD IgE Молекулярная масса 150000 160000 у мономера 900000 180000 200000 Дополнительные белковые компоненты — J и S J — — Примерная концентрация в сыворотке, мг/мл 12 1,8 1 0,00-0,04 0,00002 Доля всех 1g, % 80 13 6 0,2 0,002 Месюнахождение Примерно равное вне и внутри сосудов Внутри сосудов и в секрете В основном внутри сосудов На поверх- ности лимфоцита На тучных клет- ках, базофилах, в секрете слизи- стой оболочки носа и слюне Период полураспада, сут 23 5,5 5,0 2,8 2,0 Прохождение через плаценту + + — — — 1 _ Наличие в секрете — + + — — — Наличие в молоке + + От нуля до следов — — Активация комплемента + — + + + — — Связывание с Fc-рецеп- торами на макрофагах, NK- и ПМЯ-клетках + + — — — — Относительная агглютини- рующая способность + + + + + + — — Противовирусная активность + + + + + + + — — Антибактериальная активность + + + + + (с лизоцимом) + + + (с компле- ментом) — — Антитоксическая активность + + + — — — + + Адлер! ическая акшвность — — — — + + антителами от другого представителя того же вида. Как и в отношении других аллельных систем, ал- лотипы наследуются как доминантные менделев- ские признаки. Гены, кодирующие эти марке- ры, экспрессируются кодоминантно, и таким • Таблица 4.3. Важные различия среди подклассов IgG человека Характеристика IgGL IgGz IgG, IgG4 Наличие, % общего IgG 70 20 7 3 Период полураспада, сут 23 23 7 23 Связывание комплемента + + + + + - Прохождение через плаценту + +/- + + + + Связывание моноцитов + + + + + + + +/- образом индивидуум может быть гомозиготным или гетерозиготным относительно данного мар- кера. Идиотипы Как мы убедились, антигенсвязывающий центр молекулы специфичного антитела состоит из уни- кальной комбинации аминокислот в вариабель- ных областях легкой и тяжелой цепей. Поскольку такая комбинация отсутствует у других молекул антител, она должна быть иммуногенной и спо- собной стимулировать иммунологический ответ на самое себя у животного того же вида. Такой факт действительно обнаружили Ж.Оудин (J.Oudin) и Г. Кункель (Н. Kunkel), которые в начале 1960-х гг показали, что при экспериментальной иммуни-
СТРУКТУРНЫЕ СВОЙСТВА IgG 67 • Рис. 4.7. Разные типы вариаций иммуноглобулинов зации определенными антителами или миелом- ным белком можно получать антисыворотку, спе- цифичную только по отношению к использован- ному антителу и ни к какому иному иммуногло- булину данного вида. Такие антисыворотки со- держат популяции антител, специфичных для не- скольких эпитопов, называемых идиотопами. ко- торые присутствуют в вариабельной области (тя- желой и легкой цепи) антител, использованных для иммунизации. Совокупность всех идиотопов на введенной молекуле антитела называется иди- отипом. В некоторых случаях антиидиотипичес- кая сыворотка предотвращает связывание анти- тела с его антигеном. В этом случае считается, что идиотипическая детерминанта располагается внутри или рядом с самим антигенсвязывающим центром. Антиидиотипические сыворотки, кото- рые не блокируют связывание антител с антиге- ном, вероятно, направлены против вариабельных детерминант на каркасном участке, вне антиген- связывающего центра (рис. 4.8). Основываясь на теоретических выкладках, можно наглядно пред- ставить, что антиидиотипическое антитело, свя- зывающееся с антигенсвязывающим центром, комплементарным такому центру у идиотипа, на- поминает эпитоп, который также комплемента- • Рис. 4.8. Два антиидиотипических антитела к Атг (А) Антиидиотипическое антитело, направленное против антигенсвязывающего центра Ат1# предотвращает связы- вание А^ с антигеном. (Б) Антиидиотипическое антитело связывается с каркасными участками Ат1# не предотвра- щая его связывания с антигеном рен к антигенсвязывающему центру идиотипа. Таким образом, антиидиотип может представлять оттиск или внутренний образ условного эпитопа. Действительно, есть примеры иммунизации экс- периментальных животных с использованием ан- тиидиотипических внутренних образов в качестве иммуногенов. Такие иммуногены приводят к по- явлению антител, способных реагировать с анти- геном, несущим эпитоп, к которому направлен первоначальный идиотип. Появление таких ан- тител индуцируется без какого-либо контакта иммунизированного животного с самим первона- чальным (оригинальным) антигеном. В некоторых случаях, особенно у инбредных животных, антиидиотипические антитела реагиру- ют с несколькими различными антителами, направ- ленными против одного и того же эпитопа и обла- дающими сходными идиотипами. Эти идиотипы называются общими или перекрестно реагирующи- ми, и обычно данный термин определяет семей- ство антительных молекул. В отличие от подобной ситуации сыворотка, которая реагирует только с од- ной определенной молекулой антитела, определя- ется как имеющая уникальный идиотип. В гл. 10 показано, что наличие идиотипических детерми- нант в молекулах иммуноглобулина может играть роль в контроле и модуляции иммунного ответа, как описывается в сетевой теории Н. Ерне (N. Jerne), хотя мнения по этому поводу противоречивы. На рис. 4.9 представлены различные типы вари- аций, отмечаемых среди иммуноглобулинов. Отли- чия между константными областями в результате вовлечения различных генов константных областей тяжелых и легких цепей называют изотипами. От- личия, связанные с различными аллелями одного гена константной области, называют аллотипами Наконец, внутри конкретного изотипа (например IgG) особенности в специфической реаранжиров- ке VH- и VL-reHOB называют идиотипами. СТРУКТУРНЫЕ СВОЙСТВА IgG Иммуноглобулин G наиболее распространен в крови, лимфе, цереброспинальной и перитонеаль- ной жидкостях. Молекула IgG состоит из двух тяжелых у-цепей с молекулярной массой пример-
68 ГЛАВА 4. СТРУКТУРА АНТИТЕЛ И ИХ ФУНКЦИИ • Рис. 4.9. Структуры основных классов секретируемых антител. Легкие цепи показаны зеленым цветом, а тяжелые — голубым. Оранжевые кружки показывают участки гликозилирования. Полимерные IgM и IgA содержат полипептид, на- зываемый J-цепью. Представленная димерная молекула IgA содержит секреторный компонент (показан красным) но 50000 Да и двух легких цепей (или к, или X) молекулярной массой примерно 25000 Да каж- дая, удерживаемых вместе дисульфидными мос- тиками (см. рис. 4.9). Таким образом, молекула IgG имеет молекулярную массу примерно 150000 Да и коэффициент седиментации 7S. При электро- форезе молекулы IgG располагаются ближе к ано- ду, чем все другие сывороточные белки, и мигри- руют в у-область электрофореграммы сывороточ- ных глобулинов (отсюда и произошло их прежнее название — у-глобулин или 78-иммуноглобулин) Класс IgG у человека включает четыре под- класса’. IgGh IgG2. IgG3u IgG4. названных в соот- ветствии с частотой их обнаружения в сыворотке крови (IgG! наиболее распространен). За исклю- чением вариабельных областей все иммуноглобу- лины внутри класса обладают примерно 90 % го- мологией по последовательности аминокислот, однако между классами имеется только 60 % го- мология (например, между IgG и IgA). Эта сте- пень гомологии означает, что антисыворотка к IgG может быть направлена против детерминанты, общей и специфичной для всех представителей данного класса (например, для представителей класса IgG), в то время как другая созданная ан- тисыворотка может быть специфична для детер-
БИОЛОГИЧЕСКИЕ СВОЙСТВА IgG 69 минанты, обнаруживаемой только у одного из под- классов (например, у IgG2). Это отличие впервые было выявлено по антигенным характеристикам с использованием антител к различным у-цепям. Подклассы IgG различаются своими химически- ми, а также, что более важно, биологическими свой- ствами, которые будут рассмотрены далее. • БИОЛОГИЧЕСКИЕ СВОЙСТВА IgG Присутствующий в сыворотке взрослого челове- ка IgG составляет в ней примерно 15% общего белка (остальные белки представлены альбуми- нами, глобулинами и ферментами). Иммуногло- булин G примерно одинаково распространен во внутрисосудистом и внесосудистом пространствах. За исключением подкласса IgG3, имеющего короткий функциональный цикл с периодом по- лураспада 7 сут, период полураспада IgG состав- ляет примерно 23 сут, что представляет наиболь- ший срок для иммуноглобулинов всех изотипов. Такое продолжительное присутствие в сыворотке делает IgG наиболее пригодным для пассивной иммунизации путем переноса антител. Интересно, что как только концентрация IgG в сыворотке увеличивается (как, например, при множествен- ной миеломе или после введения очень больших концентраций IgG), повышается и уровень его катаболизма, а период полураспада IgG сокраща- ется до 15 — 20 сут и даже меньше. Недавние ис- следования дали четкое объяснение длительности выживания IgG по отношению к другим белкам сыворотки и уменьшению периода его полурас- пада при высоких концентрациях. Был обнару- жен насыщаемый рецептор, который связывается с Fc-фрагментом IgG и защищает его (так назы- ваемый FcRp, или рецептор Брамбелла). Данный рецептор выявляется в клеточных эндосомах и избирательно возвращает в кровоток IgG из эн- досом (например, после эндоцитоза иммунного комплекса антиген —антитело). На рис. 4.10 по- казано, как этот механизм позволяет очистить антитело IgG от антигена и собрать антиген для презентации без разрушения антитела. При вы- соком уровне содержания IgG FcRp-рецепторы насыщаются и делают катаболизм избыточного IgG таким же, как катаболизм альбумина или дру- гих изотипов 1g. Агглютинация и формирование преципитата Молекулы IgG могут вызывать агглютинацию, или склеивание антигенных частиц (нерастворимых), таких как микроорганизмы. Реакция IgG с раство- римыми мультивалентными антигенами может привести к появлению преципитатов (см. гл. 5). Это свойство IgG имеет, несомненно, большое значение для выживания, поскольку нераствори- • Рис. 4.10. Рециркуляция IgG при использовании защит- ного рецептора (FcRp). Циркулирующий мономерный IgG с антигеном (иммунный комплекс) поступает в антиген- презентирующую клетку посредством эндоцитоза. Внутри эндосомы комплекс связывается с FcRp; IgG и антиген раз- деляются, что позволяет IgG направиться к поверхности клетки для рециркуляции. Антиген расщепляется в лизо- соме (процессинг антигена), и фрагменты его протеолиза в конечном счете экспрессируются на поверхности клетки в составе молекул МНС II класса мые комплексы антиген—антитело легко фагоци- тируются и разрушаются фагоцитирующими клет- ками. Агрегацию молекул можно вызвать разны- ми методами. Например, для очистки IgG исполь- зуется метод спиртовой преципитации, а нагре- вание при +56 °C в течение 10 мин, используемое для инактивации комплемента (см. гл. 13), вызы- вает агрегацию IgG. Агрегированный IgG все еще сохраняет способность связываться с антигеном. Многие свойства, приписываемые комплексам антиген —антитело, проявляет и агрегированный IgG (без антигена), например прикрепление к фагоцитирующим клеткам, а также активация комплемента или других биологически активных субстанций, способных нанести вред организму. Такую активацию объясняют соприкосновением Fc-доменов в процессе агрегации аналогично тому, как это происходит при формировании иммун- ного комплекса, индуцированного антигеном. Поэтому чрезвычайно важно, чтобы в пассивно переносимом IgG не было агрегированного IgG. Прохождение через плаценту и абсорбция у новорожденных Единственным классом иммуноглобулинов, спо- собным проходить через плаценту и позволяю- щим матери передавать иммунитет плоду, явля- ется изотип IgG (за исключением подкласса IgG2). Переход через плаценту облегчается экспресси-
70 ГЛАВА 4. СТРУКТУРА АНТИТЕЛ И ИХ ФУНКЦИИ Fc-рецептор Фагоцитирующая клетка Рис. 4.11. Фагоцитоз частицы, покрытой антителами рованными на плацентарных клетках рецептора- ми, защищающими IgG (FcRn). Недавно было показано, что FcRn идентичен рецептору, защи- щающему IgG (FcRp), обнаруженному в клеточ- ных эндосомах. Анализ иммуноглобулинов у плода показал, что на 3 —4-м месяце беременности рез- ко возрастает концентрация IgG. Этот IgG, не- сомненно, должен быть материнским, поскольку в таком возрасте плод еще не способен синтези- ровать иммуноглобулины. Затем в течение 5-го месяца беременности плод начинает синтезиро- вать IgM и следовые количества IgA. Только на- чиная с 3 —4-го месяца поле рождения, когда уро- вень полученного от матери IgG падает в резуль- тате катаболизма (период полураспада IgG 23 сут), ребенок начинает самостоятельно синтезировать антитела IgG. Таким образом, защита плода и новорожденного от инфекции обеспечивается почти исключительно за счет материнского IgG, который проходит через плаценту. Было установ- лено, что прохождение через плаценту опосре- дуется Fc-фрагментом молекулы IgG; F(ab')2~ и Fab-фрагменты IgG не проходят через плаценту. Интересно, что защищающий IgG рецептор (FcRn), экспрессированный на плацентарных клетках, короткое время суперэкспрессируется в тканях кишечника новорожденного. Абсорбция материнских IgG, содержащихся в молозиве кор- мящих матерей, достигается связыванием с эти- ми рецепторами, обильно представленными в тка- ни кишечника. Рецептор FcRn перестает выяв- ляться в ткани кишечника к возрасту 2 недели. Кроме того что прохождение молекул IgG че- рез плаценту обеспечивает плоду противоинфек- ционный иммунитет, оно также может обуслов- ливать развитие гемолитической болезни новорож- денных (эритробластоз плода) (см. гл. 15). Дан- ное заболевание вызывается материнскими анти- телами к эритроцитам плода. Материнские анти- тела IgG к RJi-антигену, производимые резус- отрицательной матерью, проходят через плацен- ту и атакуют эритроциты плода, экспрессирую- щие Rh-антигены (резус-положительные). Опсонизация Иммуноглобулин G является опсонизирующим антителом (от греч opsoniazo — готовить пищу), способным за счет этого усиливать фагоцитоз. Он реагирует с эпитопами (например, экспрес- сируемыми микроорганизмами) посредством сво- их Fab-фрагментов, но именно Fc-фрагмент обу- словливает опсонизационную способность IgG. Многие фагоцитирующие клетки, такие как мак- рофаги и ПМЯ фагоциты, экспрессируют мемб- ранные рецепторы для Fc-фрагмента молекулы IgG. Эти клетки прикрепляются к покрытой ан- тителами бактерии посредством Fc-рецепторов. Эффект сети заключается в закрытии по типу молнии поверхностной мембраны фагоцитиру- ющей клетки вокруг микроорганизма по мере того, как рецепторы для Fc и Fc-фрагменты ан- тител продолжают соединяться, вызывая окон- чательное поглощение и разрушение микроор- ганизма (рис. 4.11). Антителозависимая клеточно-опосредованная цитотоксичность Молекулы IgG играют важную роль в антите- лозависимой клеточно-опосредованной цитоток- сичности (АЗКЦ). При этой форме цитотоксич- ности Fab-фрагмент связывается с клеткой-ми- шенью, будь это микроорганизм или опухоле- вая клетка, а Fc-фрагмент — со специфичными для него рецепторами, которые обнаруживают- ся на некоторых больших гранулярных лимфо- цитах, называемых натуральными киллерами (см. гл. 2). С помощью этих механизмов моле- кулы IgG направляют клетки-киллеры на их мишень, а те уничтожают ее не путем фагоци- тоза, а с помощью различных высвобождаемых ими субстанций. Активация комплемента В гл. 13 обсуждаются основные свойства систе- мы комплемента. Если упомянуть об этом вкрат- це, комплемент представляет собой набор бел- ков плазмы, способных активироваться, связы- ваясь с определенными патогенами или антите- лом (например, патогенспецифичными антите- лами). Активацию комплемента часто описыва- ют как серию каскадных ферментативных реак- ций, приводящих к появлению специфических
СТРУКТУРНЫЕ СВОЙСТВА IgM 71 компонентов комплемента, которые помимо дру- гих важных иммунологических феноменов вы- зывают опсонизацию и фагоцитоз вторгшихся микроорганизмов, а также прямой лизис организ- ма-агрессора. Структурные свойства ранних компонентов комплемента, участвующих в каскаде активации, в котором задействованы антитела, определяют классы антител, с которыми будет связываться комплемент. Молекула IgG способна активировать систему комплемента (см. гл. 13). Это приводит к высво- бождению некоторых важных биологически ак- тивных молекул и вызывает лизис, если антитело соединено с антигеном на поверхности клетки. Некоторые из компонентов комплемента также являются опсонинами; они связываются с анти- геном-мишенью и таким образом направляют фагоциты, несущие рецепторы, специфичные для этих опсонинов, фокусируя их фагоцитарную ак- тивность на антигене-мишени. Другие компонен- ты, получающиеся при активации комплемента, являются хемотаксическими; в частности, они привлекают фагоцитарные клетки. В целом, ак- тивация комплемента IgG обладает огромным био- логическим воздействием на организм и антиген- мишень, будь то живая клетка, микроорганизм или опухолевая клетка. Нейтрализация токсинов Молекулы IgG являются антителами, способны- ми нейтрализовать токсины, такие как столбняч- ный и ботулинический, и инактивировать яды, на- пример змеи или скорпиона. В связи со способ- ностью молекулы IgG нейтрализовать подобные яды (в основном за счет блокирования их актив- ных участков) и относительно большим перио- дом полураспада антитела этого изотипа лучше подходят для пассивной иммунизации (т.е. пере- носа антител) против токсинов и ядов. Иммобилизация бактерий Молекулы иммуноглобулинов эффективно обездви- живают различные подвижные бактерии. Взаимо- действие антител с ресничками и жгутиками, на- ходящимися на некоторых микроорганизмах, вы- зывает их слипание, что препятствует движению и предотвращает распространение и проникнове- ние микробов в ткани. Нейтрализация вирусов Антитела IgG эффективно нейтрализуют вирус. Одним из механизмов нейтрализации является прикрепление антител к антигенным детерминан- там, присутствующим на различных участках ви- русной оболочки, среди которых имеются участ- ки, используемые вирусом для прикрепления к клетке-мишени. Ингибирование места прикреп- ления вируса эффективно прекращает инфекцию. Считается, что другие антитела ингибируют пе- нетрацию вируса или сбрасывание вирусной обо- лочки, необходимое для высвобождения вирусной ДНК или РНК, требующейся для развития ин- фекции. Разнообразие функций молекулы IgG делает ее очень важной в иммунном ответе. Ее большая важность подтверждается теми случаями иммуно- дефицита, при которых индивидуум не способен синтезировать молекулы IgG (см. гл. 17). Такие индивидуумы подвержены инфекциям, способным привести к токсемии и смерти. V СТРУКТУРНЫЕ СВОЙСТВА IgM Как показано далее в этой главе, IgM является первым иммуноглобулином, продуцируемым после иммунизации. Его название связано с тем, что впер- вые он был описан как макроглобулин (М), облада- ющий большой молекулярной массой (900000 Да). Он обладает коэффициентом седиментации 19S и дополнительным Сн-доменом. По сравнению с молекулой IgG, состоящей из одной четырехце- почечной структуры, молекула IgM представлена в виде пентамера, состоящего из пяти таких еди- ниц, каждая из которых состоит из двух легких и двух тяжелых цепей, скрепленных вместе допол- нительными дисульфидными мостиками между их Fc-фрагментами и полипептидной цепью, назы- ваемой J-цепью (см. рис. 4.9). Эта цепь, которая подобно легким и тяжелым цепям синтезируется в В-клетках или плазматических клетках, облада- ет молекулярной массой 15000 Да. Подобная пен- тамерная организация IgM, удерживаемая дисуль- фидными мостиками, распадается после умерен- ного воздействия такого редуцирующего агента, как меркаптоэтанол. Любопытно, что каждая пентамерная молеку- ла IgM, как оказалось, пятивалентна (т.е. содер- жит пять антигенсвязывающих участков), а не де- сятивалентна, что можно предположить благода- ря наличию 10 Fab-фрагментов, содержащихся в пентамере. Это относительное уменьшение валент- ности, возможно, является результатом конфор- мационных ограничений, обусловленных полиме- ризацией. Известно, что пентамерный IgM обла- дает плоской конфигурацией, в которой каждый из его Fab-фрагментов не может раскрыться пол- ностью в момент связывания с антигеном, как это происходит у IgG, поскольку этому препятствуют прилегающие Fab-фрагменты. Таким образом, лю- бой крупный антиген, связанный с одним Fab- фрагментом, может не допустить связывания с ан- тигеном участка, находящегося рядом, что пре- вращает молекулу в пятивалентную (или даже еще меньшей валентности).
72 ГЛАВА 4. СТРУКТУРА АНТИТЕЛ И ИХ ФУНКЦИИ • БИОЛОГИЧЕСКИЕ СВОЙСТВА IgM Иммуноглобулин М, присутствующий в сыворот- ке взрослого человека, обнаруживается в основ- ном в сосудистом русле. Период полураспада мо- лекулы IgM составляет приблизительно 5 сут. В от- личие от IgG антитела IgM не отличаются мно- гофункциональностью; они плохо нейтрализуют токсины и неэффективны при нейтрализации вирусов. Молекулы IgM также обнаруживаются на поверхности зрелых В-лимфоцитов вместе с IgD (см. далее), где они служат антигенспеци- фичными рецепторами (BCR). После активации В-клетки, которая следует после связывания BCR антигеном, может произойти переключение класса (см. гл. 6) и начнут секретироваться и экспресси- роваться другие изотипы мембранных иммуногло- булинов (например, IgG). Благодаря своей пентамерной форме IgM яв- ляются антителами, связывающими и активиру- ющими комплемент. В отличие от иммуноглобу- линов других классов даже одна молекула IgM, связавшаяся с антигеном по крайней мере в двух Fab-фрагментах, может инициировать каскадную активацию комплемента, что делает этот имму- ноглобулин наиболее эффективным для запуска опосредованного комплементом лизиса микро- организмов и других клеток. Это свойство IgM при том, что антитела этого класса первыми про- дуцируются после иммунизации или инфекции, делает их очень важными для обеспечения пер- вой линии иммунологической защиты на ранних этапах бактериальных инфекций. Антитела IgM не проходят через плаценту. Однако поскольку они являются единственным классом иммуноглобулинов, синтезируемым пло- дом, начиная примерно с 5-го месяца гестации, повышенные уровни содержания IgM указывают на врожденную или перинатальную инфекцию. Антитела IgM синтезируются после иммуниза- ции или контакта с Т-независимыми антигенами в значительном количестве и у детей, и у взрослых. Первичный иммуногенный Вторичный иммуногенный стимул стимул • Рис. 4.12. Кинетика антительного ответа Иммуноглобулин М — первый изотип, который синтезируется после иммунизации (рис. 4.12). Поэтому повышенный уровень IgM обычно указы- вает или на недавно развившуюся инфекцию, или на недавний контакт с антигеном Агглютинация Молекулы IgM являются эффективными агглю- тинирующими антителами. Благодаря своей пен- тамерной форме антитела IgM могут формиро- вать макромолекулярные мостики между эпито- пами, настолько отдаленными друг от друга, что эти эпитопы не могут быть связанными более мелкими антителами IgG. Более того, благодаря своей пентамерной форме и множественной ва- лентности антитела IgM являются особенно под- ходящими для связывания с антигенами, которые содержат повторяющиеся структуры одной и той же антигенной детерминанты, как в случае с по- лисахаридными антигенами или клеточными ан- тигенами, которые во множестве экспрессируют- ся на клеточных поверхностях. Изогемагглютинация К антителам IgM относятся изогемагглютинины — встречающиеся в норме антитела против эритро- цитарных антигенов групп крови АВО. Считает- ся, что эти антитела возникают в результате им- мунизации, осуществляемой бактериями, находя- щимися в респираторном и желудочно-кишечном трактах. Эти бактерии несут детерминанты, сход- ные с олигосахаридами, определяющими группу крови по системе АВО. Таким образом, без уста- новленной предварительной иммунизации люди с группой крови 0 имеют изогемагглютинины к антигенам А и В; люди с группой крови А имеют антитела к антигенам В, а люди с антигеном В имеют антитела к антигену А. Индивидуум с груп- пой крови АВ не имеет антител ни анти-А, ни анти-В. К счастью, IgM-изогемагглютинины не могут проникать через плаценту, и несовмести- мость по группам крови АВО между матерью и плодом не представляет угрозы для плода. Одна- ко трансфузионные реакции, возникающие при АВО-несовместимости, когда изогемагглютинины реципиента реагируют с донорскими эритроци- тами, могут иметь катастрофические последствия. • СТРУКТУРНЫЕ И БИОЛОГИЧЕСКИЕ СВОЙСТВА IgA Основным иммуноглобулином, обнаруживаемом в выделяемых наружных секретах, таких как слю- на, слизь, пот, желудочный сок и слезы, является IgA Более того, он является основным иммуно-
СТРУКТУРНЫЕ И БИОЛОГИЧЕСКИЕ СВОЙСТВА IgA 73 глобулином, находящимся в молозиве кормящих матерей, и может стать основным средством за- щиты кишечника в первые несколько недель после рождения. Молекула IgA состоит из двух легких или к-, или Х-цепей, а также двух тяжелых «-це- пей. Причем ос-цепь несколько больше, чем у-цепь. Молекулярная масса мономерного IgA составля- ет примерно 165000 Да, а коэффициент седимен- тации — 7S. При электофорезе сывороточных гло- булинов IgA смещается в «медленную» р- или «быструю» у-область. Димерный IgA обладает мо- лекулярной массой 400000 Да. В классе IgA содержатся два подкласса: IgAi (93 %) и IgA2 (7 %). Интересно, что если учитывать про- дуцируемый IgA на всех слизистых поверхностях (респираторный, желудочно-кишечный и мочевы- водящий тракты), то в количественном отноше- нии он становится основным иммуноглобулином. У сывороточного IgA период полураспада со- ставляет 5,5 сут. Находящийся в сыворотке IgA является преимущественно мономерным (одна че- тырехцепочечная структура) и, вероятно, высво- бождается до димеризации, таким образом теряя способность связываться с секреторным компо- нентом. Биологическая ценность секреторного IgA очень высока, но о функции сывороточного IgA известно мало. В основном IgA присутствует не в сыворотке, а в секретах организма, таких как слезы, слюна, пот и слизь, в которых он выполняет важную биоло- гическую функцию, являясь, например, частью MALT, как указано в гл. 2. В секрете слизистых оболочек IgA существует в виде димера и состоит из двух четырехцепочечных единиц, соединенных той же объединяющей (J) цепью, которая при- сутствует и в молекулах IgM (см. рис. 4.9). Плаз- матические клетки, секретирующие IgA, синте- зируют молекулы IgA и J-цепи, формирующие димеры. Такие плазматические клетки преимуще- ственно располагаются в соединительной ткани, называемой lamina propria (собственная пластин- ка), находящейся непосредственно под базальной мембраной многих участков эпителия (например, в околоушных железах, ворсинках кишечника, слезных железах, лактирующих молочных желе- зах или под слизистой оболочкой бронхов). Ког- да эти димерные молекулы высвобождаются из плазматических клеток, они соединяются с поли- Ig-рецептором, экспрессируемым на базальной мембране тесно прилегающих друг к другу эпители- альных клеток Рецептор транспортирует IgA-ди- меры через эпителиальные клетки и высвобожда- ет их во внеклеточные жидкости (например, в про- свет кишечника или бронха). Высвобождению способствует ферментативный гидролиз поли- Ig-рецептора, причем большой фрагмент этого ре- цептора молекулярной массой 70000 Да (называ- емый секреторным компонентом) остается свя- занным с Fc-фрагментом димерной молекулы IgA (рис. 4.13). Данный секреторный компонент по- могает защитить димерный IgA от протеолити- ческого расщепления Следует заметить, что сек- Эпителиальные клетки • Рис. 4.13. Транспорт димерного IgA через эпителий. Плазматические клетки в непосредственной близости к эпители- альным базальным мембранам в кишечнике, легочном эпителии, а также слизистых оболочках слюнных, слезных и лак- тирующих молочных желез высвобождают димерный IgA. Иммуноглобулин А связывается с поли-1д-рецептором, и этот комплекс транспортируется в образовавшейся везикуле через клетку. Поли-1д-рецептор отщепляется от комплекса у апи- кальной поверхности, чтобы высвободить IgA из клетки. Покинув клетку, пентамерный фрагмент поли-lg-рецептора, называемый секреторным компонентом, остается связанным с димерным IgA и, как полагают, защищает антитело в про- светах некоторых органов, соединенных с внешней средой Просвет компонент
74 ГЛАВА 4. СТРУКТУРА АНТИТЕЛ И ИХ ФУНКЦИИ реторный компонент также связывается с пента- мерным IgM и в небольших количествах транс- портирует его к поверхности слизистых оболочек. Действие IgA при инфекциях слизистых оболочек В связи с тем что секреторный IgA находится в содержимом таких секретов, как слюна, моча и желудочный сок, он играет важную роль в каче- стве первой линии иммунологической защиты против локальных респираторных и желудочно- кишечных инфекций. Считается, что его защитный эффект обусловлен способностью предотвращать прикрепление вторгающихся микроорганизмов к эпителиальной поверхности или прохождение сквозь нее. Например, в случае холеры патоген- ный микроорганизм прикрепляется к клеткам, выстилающим ЖКТ, в котором вибрионы выде- ляют свой экзотоксин, ответственный за все сим- птомы заболевания, но никогда не проникает сквозь них. Антитела IgA, которые могут предот- вратить прикрепление микроорганизма к клеткам, таким образом обеспечивают защиту от патогена. Можно сказать, что для защиты от локальных инфекций гораздо более эффективны такие спо- собы иммунизации, которые приводят к местной продукции IgA, чем вызывающие преимуществен- ное поступление антител в кровь. Бактерицидная активность Молекула IgA не содержит рецепторов для комп- лемента, поэтому он не является комплементак- тивирующим или комплементсвязывающим им- муноглобулином. Соответственно, IgA не инду- цирует комплементзависимый лизис бактерий. Однако было показано, что IgA обладает бакте- рицидной активностью против грамотрицатель- ных микроорганизмов, но только в присутствии лизоцима, который содержится в тех же секретах, в которых находится и секреторный IgA. Противовирусная активность Секреторные IgA являются эффективными про- тивовирусными антителами, предотвращающими проникновение вирусов в клетки. Кроме того, они также являются и эффективными агглютинирую- щими антителами. СТРУКТУРНЫЕ И БИОЛОГИЧЕСКИЕ СВОЙСТВА IgD Молекула IgD состоит из двух легких к- или Х-цепей и двух тяжелых 8-цепей (см. рис. 4.9). Иммуноглобулин D является мономером молеку- лярной массой 180000 Да и коэффициентом се- диментации 7S. При электрофорезе он смещается в «быструю» у-область сывороточных глобулинов. Какие-либо аллотипы тяжелых цепей или подклас- сы молекул IgD не известны. Иммуноглобулин D присутствует в сыворотке в незначительных концентрациях, которая при этом постоянно меняется, вероятно, потому что он не секретируется плазматическими клетками, а также потому что по сравнению с другими иммуноглобу- линами чрезвычайно подвержен протеолитической деградации. Кроме того, после активации В-клет- ки транскрипция белка тяжелой 8-цепи быстро по- давляется; этот феномен позволяет объяснить низ- кий уровень содержания IgD в сыворотке. Иммуноглобулин D коэкспрессируется вместе с IgM на поверхности зрелых В-клеток и подобно IgM действует как антигенспецифичный BCR. Его присутствие служит показателем дифференциров- ки В-клеток в более зрелую форму. Поэтому во время онтогенеза В-клеток экспрессия IgD идет вслед за экспрессией IgM (см. гл. 7). Хотя функция IgD до конца не изучена, экс- прессия мембранного IgD, похоже, взаимосвяза- на с удалением В-клеток, способных производить аутоантитела. Таким образом, в период развития основная биологическая значимость IgD может заключаться в «глушении» аутореактивных В-кле- ток. У зрелых В-клеток IgD является антигенсвя- зывающим поверхностным иммуноглобулином вместе с коэкспрессируемым IgM. СТРУКТУРНЫЕ И БИОЛОГИЧЕСКИЕ СВОЙСТВА IgE Молекула IgE состоит из двух легких (к- или Х-) и двух тяжелых цепей (г). Как и молекула IgM, IgE имеет дополнительный Сн-домен (см. рис. 4.9). Иммуноглобулин Е обладает молекулярной мас- сой примерно 200000 Да и коэффициентом седи- ментации 8S. При электрофорезе он смещается в «быструю» у-область сывороточных глобулинов. До настоящего времени ни о каких аллотипах в отношении тяжелых цепей, ни о подклассах IgE не сообщалось. Важность IgE при паразитарных инфекциях и реакциях гиперчувствительности У IgE, также называемых антителами-реагина- ми. период полураспада в сыворотке составляет 2 сут. Это самый короткий срок среди иммуно- глобулинов всех классов. Его концентрация в сы- воротке является наименьшей среди всех имму- ноглобулинов. Такой уровень содержания отчас- ти обусловлен низкой скоростью синтеза и ис- ключительной способностью Fc-фрагмента IgE, содержащего дополнительный Сн-домен, связы-
КИНЕТИКА ОБРАЗОВАНИЯ АНТИТЕЛ ПОСЛЕ ИММУНИЗАЦИИ 75 ваться с высокой степенью аффинности с рецеп- торами (Fee-рецепторами), находящимися на туч- ных клетках и базофилах. Однажды связавшись с этими высокоаффинными рецепторами, IgE мо- жет удерживаться на клетках неделями и месяца- ми. При повторном появлении антиген взаимо- действует с Fab-фрагментами IgE, закрепленны- ми на этих клетках, приводя к перекрестному свя- зыванию. Клетки при этом активируются и выс- вобождают содержимое своих гранул: гиста- мин, гепарин, лейкотриены и другие фармаколо- гически активные соединения, запускающие ре- акции гиперчувствительности немедленного типа. Такие реакции могут быть умеренными, как при укусе комара, или тяжелыми, как в случае бронхи- альной астмы; они могут приводить даже к общей анафилактической реакции, способной вызвать смерть в течение нескольких минут (см. гл. 14). Иммуноглобулины Е не являются агглютини- рующими или активирующими комплемент ан- тителами, однако играют важную роль в защите от некоторых паразитов, таких как гельминты (черви). Защита достигается за счет активации той же самой острой воспалительной реакции, кото- рая наблюдается при патологических формах ре- акции гиперчувствительности немедленного типа. Повышенные уровни IgE в сыворотке наблюда- ются при инфекции, вызванной аскаридами. Дей- ствительно, иммунизация аскаридным антигеном индуцирует образование IgE. КИНЕТИКА ОБРАЗОВАНИЯ АНТИТЕЛ ПОСЛЕ ИММУНИЗАЦИИ Первичный иммунный ответ Как указывалось в гл. 3, первый контакт индиви- дуума с определенным иммуногеном называют первичной иммунизацией, а определяемый после этого ответ называют первичным иммунным отве- том. Как показано на рис. 4.12, первичный гумо- ральный иммунный ответ может быть разделен на несколько фаз. 1. Латентная, или скрытая, фаза’, после пер- воначального контакта с антигеном проходит до- статочно большой промежуток времени, прежде чем в сыворотке начинают определяться антите- ла. Продолжительность этого периода обычно составляет 1 — 2 недели в зависимости от имму- низируемого вида, антигена и других факторов (обсуждаются в следующих главах). Длительность латентного периода также во многом зависит от чувствительности метода, используемого для опре- деления продукта иммунного ответа. Латентный период (более детально этот вопрос будет об- суждаться позднее) включает время, необходимое Т- и В-клеткам для контакта с антигеном, про- лиферации и дифференцировки. В-клетки также должны секретировать антитела в количестве, до- статочном, чтобы их можно было определить в сыворотке. Чем менее чувствителен метод опре- деления антитела, тем больше антител потребует- ся для их выявления и тем длиннее будет опреде- ляемый латентный период. 2. Экспоненциальная фаза’, во время этой фазы происходит экспоненциальный рост концентра- ции антител в сыворотке. 3. Состояние равновесия’, во время этого пери- ода процесс продукции и разрушения антитела находится в состоянии равновесия. 4. Фаза снижения’, в конце концов, иммунный ответ начинает угасать, и концентрация антител в сыворотке быстро снижается. При первичном иммунном ответе первым опре- деляемым классом антител обычно является IgM, который в некоторых случаях бывает и единствен- ным классом производимых иммуноглобулинов. Если затем начинается продукция антител IgG, их появление обычно сопровождается быстрым прекращением продукции IgM (см. рис. 4.12). Вторичный иммунный ответ Хотя синтез антител после примирования может полностью прекратиться через несколько недель (см. рис. 4.12), у иммунизированного индивиду- ума остается клеточная память об этом контак- те (т.е. долгоживущие клетки памяти). Наличие вторичного иммунного ответа (также называемого анамнестическим) становится очевидным при по- вторном введении того же самого антигена. После повторной инъекции длительность латентной фазы значительно меньше, и время, необходи- мое для появления антител, может составить менее половины от срока, необходимого для пер- вичного ответа. Антитела продуцируются с го- раздо большей интенсивностью, а в сыворотке определяются более высокие концентрации ан- тител. Продукция антител может также продол- жаться более длительный период, а их устойчи- вый уровень часто сохраняется в сыворотке ме- сяцы и даже годы спустя. При вторичном иммунном ответе отмечаются выраженные изменения в типе и качестве проду- цируемых антител. В реакции со стороны изоти- пов иммуноглобулинов происходит сдвиг, извест- ный как переключение класса, при котором анти- тела IgG появляются в больших концентрациях и дольше сохраняются, чем IgM, содержание кото- рых может резко снижаться вплоть до полного ис- чезновения. Это переключение может также при- водить к появлению IgA и IgE. Кроме того, проис- ходит созревание аффинности — феномен, при ко- тором средняя аффинность (константа связывания) антител с антигеном повышается по мере разви- тия вторичного ответа Движущей силой этого уве- личения аффинности может быть процесс селек- ции, во время которого В-клетки соревнуются со свободным антителом в захвате антигена, количе-
76 ГЛАВА 4. СТРУКТУРА АНТИТЕЛ И ИХ ФУНКЦИИ И ммуноглобулин шшп ШШ11 Iga/Igp- гетеродимер (CD79a/79b) Рецептор Т-клетки р а (г) <5) vf h Поли- Ig-рецептор VI CD3 у, 5, £ ШШ шш Молекулы МНС II класс I класс р2т Ешшшшшшш! ! ппппппппппп ППШ = ШШ1 Н а С р • Рис. 4.14. Типичные представители суперсемейства иммуноглобулинов. Петлевые иммуноглобулиновые домены (по- казаны в виде круглых синих петель) являются общим структурным признаком этих молекул Во всех случаях карбокси- концевая область молекул заякорена на мембране ство которого уменьшается. Таким образом, обес- печить процесс дифференцировки В-клеток в плаз- матические клетки могут только те клоны В-кле- ток, которые будут связывать антиген поверхност- ными иммуноглобулиновыми рецепторами с до- статочно высокой аффинностью. Эти плазматиче- ские клетки, возникшие из селективно отобранных В-клеток, синтезируют определяемые антитела, обладающие высокой аффинностью к антигену. Способность к вторичному ответу может со- храняться длительное время (у людей — годы) и дает явные преимущества с точки зрения отбора для особей, переживших первый контакт с агрес- сивным патогеном. Установление такой памяти при выработке специфического ответа несомнен- но является целью программ государственного здравоохранения по иммунизации. I СУПЕРСЕМЕЙСТВО ИММУНОГЛОБУЛИНОВ Общие структурные свойства тяжелых и легких иммуноглобулиновых цепей, такие как петлевые домены иммуноглобулина (см. рис. 4.3), обнару- жены и у значительного числа белков. Большин- ство этих белков являются гликопротеинами, свя- занными с мембранами. В связи с такой схоже- стью структур они были отнесены к представите- лям суперсемейства иммуноглобулинов. Избыточ- ность структуры, наблюдаемая у этих белков, ука- зывает на то, что кодирующие их гены произош- ли от общего родоначального гена — того, кото- рый отвечает за получение базовой структуры до- мена. Дупликация и последующая дивергенция этого родоначального гена могли бы объяснить существование большого числа мембранных бел- ков, обладающих одним или более участками, го- мологичными петлевому домену иммуноглобули- на. Генетические и функциональные исследова- ния белков иммуноглобулинового суперсемейства показали, что их гены развивались независимо, поскольку они не имеют общей генетической свя- зи или общих функций. На рис. 4.14 в качестве примеров показаны несколько белков — членов иммуноглобулинового суперсемейства. Прочие многочисленные примеры обсуждаются в других главах. Как можно видеть, каждая молекула со- держит характерную структуру укладки иммуно- глобулина — петлю, формируемую за счет внут- рицепочечных дисульфидных мостиков и состоя-
ТЕСТЫ 77 щую примерно из 110 аминокислот. Считается, что эти домены способствуют взаимодействию между мембранными белками (например, моле- кулами CD4 на хелперных Т-клетках и молекула- ми МНС II класса на АПК). РЕЗЮМЕ 1. Иммуноглобулины всех классов имеют основ- ную четырехцепочечную структуру, состоящую из двух идентичных легких (L) и двух идентичных тяжелых (Н) цепей. Каждая легкая цепь соединяется с тяжелой цепью, и две тяжелые цепи соединены между собой посредством дисульфидных мостиков. 2. В естественном состоянии цепи свернуты в до- мены, стабилизируемые внутрицепочечным дисуль- фидным мостиком. Группа других белков (например, TCR, CD4 и молекулы МНС I и II классов) также со- держат такие домены, что делает их всех представи- телями суперсемейства иммуноглобулинов. 3. Иммуноглобулины присутствуют в двух формах: мембранной (антитела экспрессируются на поверхно- сти В-клеток) и секреторной (антитела продуцируются плазматическими клетками). Мембранные антитела ассоциируются с гетеродимером, называемым Iga/ IgP, для формирования В-клеточного рецептора. 4. N-концевые домены и тяжелой, и легкой цепей являются вариабельными (V) областями и содержат ги- первариабельные участки, также называемые участка- ми, определяющими комплементарность (CDR), кото- рые составляют антигенсвязывающий центр антитела и варьируются в соответствии с его специфичностью. 5. Другие домены составляют константные (С) об- ласти. Эти домены одинаковы внутри каждого класса молекул иммуноглобулинов. 6. Fc-фрагменты тяжелых цепей отвечают за раз- личные биологические функции, присущие каждому классу антител. 7. Изотипы иммуноглобулинов различаются по константным областям тяжелых цепей. Аллельное разнообразие иммуноглобулинов в области тяжелой цепи (состоящие иногда в замене одной или двух аминокислот) определяют как аллотип, по которому отличаются отдельные особи внутри вида Идиотипи- ческие маркеры, наоборот, представлены уникальны- ми комбинациями аминокислот, которые составляют антигенсвязывающий центр молекулы антитела; они уникальны для каждого определенного антитела. 8. Иммуноглобулины G представляют класс анти- тел, обладающих многочисленными биологическими функциями, начиная от нейтрализации токсина до ак- тивации комплемента и опсонизации. Они являются единственным классом иммуноглобулинов, который проходит через плаценту и передает материнский иммунитет плоду. Период полураспада IgG составляет 23 сут и является самым большим среди иммуногло- булинов всех классов. 9. Иммуноглобулины М экспрессируются на по- верхности зрелых В-клеток (как мономеры) и секре- тируются как антитела в пентамерной форме. Из всех классов иммуноглобулинов они обладают наибольшей агглютинирующей активностью и способностью к ак- тивации комплемента. 10. Иммуноглобулины А существуют в мономер- ной и димерной формах. Димерная форма считается секреторной, поскольку обнаруживается в секретах желез. Иммуноглобулины А являются важными проти- вовирусными иммуноглобулинами. 11. Иммуноглобулины D находятся на поверхности зрелых В-клеток и экспрессируются совместно с IgM, обладающими той же антигенной специфичностью. Функциональные свойства IgD до конца не изучены. 12. Иммуноглобулины Е, называемые также реаги- новыми антителами, имеют важнейшее значение при аллергических реакциях. Они играют важную роль в защите от паразитарных инфекций. Fc-фрагмент IgE связывается с высокой аффинностью с рецепторами некоторых клеток, таких как тучные клетки. При кон- такте с антигеном IgE запускает процесс дегрануля- ции таких клеток, приводящий к высвобождению фар- макологически активных субстанций, опосредующих реакции гиперчувствительности (аллергические). 13. Первичный ответ после первичной иммуниза- ции состоит в основном в продукции антител IgM Ре- зультатом вторичного контакта с тем же антигеном является вторичный ответ или так называемая анам- нестическая реакция (память). Вторичный ответ раз- вивается быстрее первичного, при этом происходит сдвиг от продукции IgM к синтезу IgG и других изоти- пов. Вторичный ответ по продолжительности значи- тельно превосходит первичный. ТЕСТЫ Выберите ОДИН НАИБОЛЕЕ ПРАВИЛЬНЫЙ ответ на каждый тест. 1. Функциональные свойства иммуноглобулинов, такие как связь с Fc-рецептором, определяются: а) легкими цепями; б) J-цепью; в) дисульфидными мостиками; г) тяжелыми цепями; д) вариабельными областями. 2. Идиотип молекулы антитела определяется по- следовательностью аминокислот: а) константной области легкой цепи; б) вариабельной области легкой цепи; в) константной области тяжелой цепи; г) константных областей тяжелых и легких цепей; д) вариабельных областей тяжелых и легких цепей. 3. К получению поликлональной кроличьей анти- сыворотки, специфичной к тяжелым у-, к- и Х-цепям и Fc-фрагменту иммуноглобулина человека, приведут: а) белки Бенс-Джонса; б) совокупность IgG; в) обработанный пепсином IgG; г) очищенный Fab-фрагмент; д) очищенный Р(аЬ')2-фрагмент. 4. Поликлональная антисыворотка, полученная против пула (совокупности) IgA человека, будет реаги- ровать: а) с IgM человека; б) легкими к-цепями; в) IgG человека;
78 ГЛАВА 4. СТРУКТУРА АНТИТЕЛ И ИХ ФУНКЦИИ г) J-цепью; д) со всем перечисленным. 5. Индивидуум оказался гетерозиготным по алло- типам 3 и 12 IgGv Различные антитела, которые толь- ко может продуцировать данный индивидуум, никогда не будут иметь: а) двух тяжелых цепей аллотипа 12; б) двух легких к- или Х-цепей; в) двух тяжелых цепей аллотипа 3; г) двух тяжелых цепей: одна — аллотипа 3, другая — аллотипа 12. 6. Обработанный папаином препарат антител IgG, специфичных для альбумина куриного яйца (антиген НЕА): а) потеряет свою антигенную специфичность; б) будет преципитировать НЕА; в) потеряет межцепочечные дисульфидные связи; г) будет расщеплен на две молекулы Fab и одну молекулу Fc; д) ничего из перечисленного не произойдет. 7. У большинства обычных индивидуумов при хро- нических инфекциях увеличивается содержание им- муноглобулинов класса: a) IgA; в) IgG; д) IgD. б) IgE; г) IgM; 8. Активировать комплемент после связи одной его молекулы с антигеном может иммуноглобулин: a) IgA; в) IgG; д) IgD. б) IgE; г) IgM; 9. Относительный уровень патогенспецифичных антител IgM может быть важен для диагностики: а) поскольку IgM легче определяется, чем другие изотипы; б) вирусная инфекция часто приводит к резко вы- раженным изменениям со стороны IgM; в) антитела IgM гораздо чаще оказывают защитное действие в отношении реинфекций, чем другие изо- типы; г) относительно высокие уровни IgM часто обу- словлены первым недавним контактом с индуцирую- щим агентом. 10. Первичный и вторичный ответы со стороны ан- тител различаются: а) преимущественно продуцируемым изотипом; б) числом лимфоцитов, реагирующих на антиген; в) быстротой появления антител в сыворотке; г) биологическими функциями, которые демонст- рируют продуцируемые изотипы иммуноглобулинов; д) всем перечисленным. ОТВЕТЫ НА ТЕСТЫ 1 — г. С-концевой участок константной области тя- желой цепи содержит домен, связанный с биологи- ческой активностью иммуноглобулинов. 2 — д. Идиотип является антигенной детерминан- той молекулы иммуноглобулина, включающей участок связывания антигена, который в свою очередь состо- ит из вариабельных областей как L-, так и Н-цепей. 3 — б. Только пулированный IgG, содержащий смесь молекул IgG, каждая из которых экспрессирует тяжелую у-цепь (следовательно, Fc-фрагмент) и лег- кие к- либо Х-цепи, будет приводить к выработке ан- тисыворотки к каждому из этих компонентов иммуно- глобулина. Никакие другие варианты индукции иммун- ного ответа не приведут к стимуляции антител ко всем этим компонентам. Белки Бенс-Джонса являют- ся димерами легких цепей и обнаруживаются в моче больных множественной миеломой. Обработка IgG пепсином приводит к расщеплению Fc-фрагмента. Очищенные Fab- и Е(аЬ')2-фрагменты не имеют тяже- лой у-цепи (следовательно, и Fc-фрагмента). 4 — д. Все ответы верны. Антисыворотка к IgA бу- дет содержать антитела, специфичные к легким к- и Х-цепям. Эти антитела, конечно, будут реагировать с IgG и IgM, имеющими такие к- и ^-цепи. Будут иметь- ся и антитела к J-цепи, если для иммунизации ис- пользовался димерный IgA. 5 — г. В любом иммуноглобулине, продуцируемом одной клеткой, две Н-цепи и две L-цепи идентичны Поэтому любая молекула антитела у этого индивидуу- ма будет иметь либо Н-цепи аллотипа 3, либо Н-цепи аллотипа 12, но не их смесь. Также и антитела будут иметь либо две к-, либо две Х-цепи. 6 — г. Папаин расщепляет молекулы IgG выше шарнирной области, образуя две молекулы Fab и Fc- фрагмент. Fab-фрагменты способны связываться с НЕА, но поскольку они не удерживаются вместе ди- сульфидными связями, то не смогут преципитировать антиген. Другой эффект дает обработка IgG пепси- ном, который расщепляет молекулу ниже шарнирной области, оставляя целой одну двухвалентную молеку- лу F(ab')2, способную преципитировать антиген. Фраг- менты НЕА-специфичных антител после обработки пепсином будут обладать той же аффинностью к ан- тигену, что и первоначальные Fab-фрагменты антител, поскольку CDR молекул будут сохранены. 7 — в. При хронических инфекциях В-клетки мно- гократно стимулируются к участию в иммунном ответе из-за присутствия патогена, вызвавшего инфекцию. Таким образом, в период инфекционного заболевания у обычных людей уровни IgG в сыворотке будут уве- личиваться. 8 — г. Только IgM может активировать и фиксиро- вать комплемент, когда только одна молекула связана с антигеном. Это обусловлено пентамерной формой иммуноглобулинов этого класса. 9 — г. Верен только последний ответ. Относитель- но высокие уровни IgM часто обусловлены первым недавним контактом с индуцирующим агентом, по- скольку IgM является первым изотипом, синтезируе- мым в ответ на иммуноген Ю-д. Все ответы верны и сами содержат объяс- нения.
Глава ВЗАИМОДЕЙСТВИЯ АНТИГЕНОВ С АНТИТЕЛАМИ. ИММУНОЛОГИЧЕСКИЕ ИССЛЕДОВАНИЯ И ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНЫЕ СИСТЕМЫ ВВЕДЕНИЕ В предыдущих главах мы по необходимости каса- лись некоторых методов и аналитических при- емов, что способствовало лучшему пониманию некоторых фундаментальных аспектов врожден- ного и приобретенного иммунитета. В этой гла- ве мы более детально обсудим лабораторные ме- тоды исследования и экспериментальные систе- мы, которые используют в научно-исследователь- ских и диагностических лабораториях. Некото- рые из них связаны только с определением ан- тител (например, серологические методы), в то время как в других применяют методы молеку- лярной биологии, генной инженерии, методы клеточных культур и модели на животных, кото- рые в значительной мере способствуют понима- нию физиологии и патофизиологии иммунной системы. В 2000 г. была открыта последователь- ность человеческого генома. Благодаря активным попыткам расшифровки последовательности ге- номов микроорганизмов появились многообеща- ющие подходы к изучению иммунной системы — исследования с использованием биоинформати- ки и вычислительной биологии (так называемые эксперименты in silica}. Эти технологии основа- ны на данных, полученных при изучении гено- мики и протеиномики, и используют мощные компьютерные программы и вычислительные алгоритмы. Для иммунологии они очень много- обещающи. Это особенно актуально при попыт- ках идентификации иммуногенных эпитопов, экспрессируемых возбудителями, которые в даль- нейшем могут быть использованы для получе- ния вакцин. Хотя эта тема находится за предела- ми предмета данной главы, важно помнить, что будущий прогресс в области иммунологии будет обеспечен комбинацией исследовательских при- емов in vitro, in vivo и in silica. Начнем эту главу с обсуждения физических механизмов взаимодействия антигена и антитела. ВЗАИМОДЕЙСТВИЯ АНТИГЕН - АНТИТЕЛО Реакция между антигеном и сывороточными ан- тителами (серология) является основой многих иммунных исследований. Вследствие строгой спе- цифичности иммунного ответа для диагностиче- ских целей, обнаружения и идентификации ан- тигенов или антител широко используется взаи- модействие между антигеном и антителом in vitro. Примером использования серологических мето- дов для идентификации и классификации анти- генов является серотипирование микроорганиз- мов с использованием специфической антисы- воротки. Взаимодействие антигена с антителами может приводить к различным последствиям, включая преципитацию (если антиген растворимый), агглю- тинацию (если антиген представляет собой твер- дую частицу) и активацию комплемента. Все эти исходы обусловлены взаимодействием между по- ливалентными антигенами и антителами, которые имеют по крайней мере два участка для связыва- ния молекулы антигена. Перечисленные реакции, развивающиеся при взаимодействии антиген- антитело, не являются характерными при первич- ном антительном ответе на соответствующие ан- тигенные эпитопы, а в большей степени отража- ют события, развивающиеся при повторном вза- имодействии поливалентных антигенов с антите- лами. Такие феномены, как образование преци- питатов, агглютинация и активация комплимен- та, развиваются, если антитело с двумя или более связывающими участками прореагировало с ran-
80 ГЛАВА 5 ВЗАИМОДЕЙСТВИЯ АНТИГЕНОВ С АНТИТЕЛАМИ. ИММУНОЛОГИЧЕСКИЕ ИССЛЕДОВАНИЯ... Антиген/гаптен Антитело/фрагмент Образуемый комплекс Взаимодействие между антителом и гаптеном Анти-А А-анти-А-комплексы без перекрестного связывания Моновалентный монодетерминантный антиген (гаптен) Взаимодействие между антителом и поливалентным антигеном с одной детерминантой Анти-А Перекрестно связанные А-анти-А-комплексы Поливалентный монодетерминантный антиген Взаимодействие между Fab и поливалентным антигеном с одной детерминантой А Анти-А Поливалентный монодетерминантный антиген А-анти-А — Fab-комплексы без перекрестного связывания Взаимодействие между димерами Fab и поливалентным антигеном с одной детерминантой Анти-А Перекрестно связанные А-анти-А-комплексы Поливалентный моно- детерминантный антиген Взаимодействие между антителами к детер- минантам А, В и С и поливалентным полидетерминантным антигеном с детерми- нантами А, В и С А С П ол и валентный полидетерминантный антиген Перекрестно связанные А-анти-А-, А-анти-В- и А-анти-С-комплексы • Рис. 5.1. Взаимодействия между антителами или фрагментами антител и антигенами или гаптенами теном (например, антигеном, имеющим одну де- терминанту, — моновалентным); однако они ини- циируются при взаимодействии моновалентных фрагментов антител (например, Fab) с антигеном, даже если антиген поливалентен. Причины этих различий показаны на рис. 5.1. Для преципитации, агглютинации или актива- ции комплимента требуется, чтобы антитела пе- рекрестно связывали разные антигенные молеку- лы, что возможно, только если антиген полива- лентен, а антитело двухвалентно (либо интактные антитела, либо Р(аЬ')2-фрагмент, состоящий из двух антигенсвязываюших участков) (см. рис. 5.1). Напротив, перекрестное связывание невозмож- но, если антиген или антитело является монова- лентным.
ПЕРВИЧНЫЕ ВЗАИМОДЕЙСТВИЯ МЕЖДУ АНТИТЕЛОМ И АНТИГЕНОМ 81 ♦ ПЕРВИЧНЫЕ ВЗАИМОДЕЙСТВИЯ МЕЖДУ АНТИТЕЛОМ И АНТИГЕНОМ Во взаимодействие между антителом и антиген- ным эпитопом ковалентные связи не вовлекают- ся. Следовательно, связующие их силы относи- тельно слабы. К ним относятся в основном ван- дер-ваальсовы, электростатические и гидрофоб- ные силы; для них необходимо очень тесное сбли- жение между взаимодействующими элементами. Таким образом, для взаимодействия эпитоп ан- тигена и антитело должны точно соответствовать, что часто сравнивают с взаимодействием типа ключ —замок. Из-за того что во взаимодействие между антигеном и антителом вовлечены слабые силы, комплекс антиген — антитело может легко диссоциировать под влиянием низкого или высо- кого pH, гиперосмолярности раствора или хао- тропических ионов (например, цианатов), кото- рые эффективно разрушают водородные связи мо- лекул воды. Константа ассоциации Взаимодействие между антителом и антигенным эпитопом удобно рассматривать на примере ре- акции между антителом и моновалентным гапте- ном. Поскольку молекула антитела симметрична и имеет два идентичных антигенсвязывающих Fab- фрагмента, при связывании одной молекулы ан- титела с двумя идентичными моновалентными гаптенами каждый Fab-фрагмент независимо со- единяется с одной молекулой гаптена. Связь мо- новалентного антигена (Ag) с каждым сайтом ан- титела может быть представлена следующим урав- нением: кх Ag + Ab Ab - Ag, k i где kx — прямая константа (ассоциации); k\ — обратная константа (диссоциации); Ab — антитело. Отношение kx/k_x — это ассоциативная кон- станта К, мера сродства (аффинности). Она мо- жет быть рассчитана по отношению концентра- ции связанных комплексов антиген—антитело к концентрации несвязанных (свободных) антиге- нов и антител. K^kx JAb-Ag] [Ab][Ag] ’ Константа ассоциации (К) действительно яв- ляется мерой аффинности (сродства) антитела и антигенного эпитопа. Когда все антитела, кото- рые связывают соответствующие гаптены или ан- тигенные эпитопы, идентичны (как в случае мо- ноклональных антител), тогда константа К пред- ставляет собой внутреннюю константу ассоциа- ции. Однако по причине того, что сывороточные антитела, даже те, которые взаимодействуют толь- ко с единственным эпитопом, гетерогенны, сред- няя константа ассоциации всех антител к эпито- пам, обозначается как Kq. Взаимодействие между антителами и каждым эпитопом поливалентного антигена подчиняется кинетике и силам, сходны- ми с теми, что участвуют во взаимодействии между антителами и гаптенами, поскольку каждый эпи- топ антигена реагирует с соответствующим анти- телом аналогичным образом, о котором рассказа- но ранее. Константа ассоциации может быть определена с использованием метода равновесного диализа. Для этого используется диализная камера с двумя от- секами, разделенными полупроницаемой мемб- раной, через которую могут свободно проникать молекулы соответствующего размера. Антитела помещают с одной стороны полупроницаемой мембраны, причем они не могут проникать сквозь нее из-за большого размера. С другой (антиген- ной) стороны мембраны добавляется известное число мелких растворимых радиоактивно мечен- ных гаптенов, олигосахаридов или олигопепти- дов, предоставляющих эпитопы сложных углево- дов или белков. В момент старта гаптен или используемый ан- тигенный эпитоп (обозначаемый здесь и далее как лиганд) начинает диффундировать через мембра- ну: при достижении равновесия концентрация свободных лигандов будет одинаковой по обе сто- роны мембраны. Однако общее количество ли- гандов будет больше с той стороны, на которой расположены антитела, поскольку некоторые ли- ганды будут связываться с молекулами антител. Разница в концентрации лигандов в двух отсеках диализной камеры отражает концентрацию лиган- дов, связанных с антителами (т.е. комплексов ан- тиген-антитело). Чем больше аффинность ан- тител, тем больше лигандов связывается Кроме того, в этом исследовании могут быть использованы разные концентрации лигандов, поскольку концентрация антител, помещенных в диализную камеру, может быть предопределена и остается постоянной. Этот подход используется в так называемом методе Скэтчарда. Он применя- ется в ситуации, когда надо определить, являют- ся ли исследуемые препараты антител гомоген- ными (например, моноклональные антитела) или гетерогенными (например, поликлональная анти- сыворотка), или измерить среднюю константу аф- финности (Ло). Аффинность и авидность Как упоминалось ранее, внутренняя константа ас- социации, характеризующая связь антитела с ан- тигенным эпитопом или гаптеном, определяется как аффинность, сродство. Если антиген состоит из множества повторяющихся идентичных эпи-
82 ГЛАВА 5. ВЗАИМОДЕЙСТВИЯ АНТИГЕНОВ С АНТИТЕЛАМИ. ИММУНОЛОГИЧЕСКИЕ ИССЛЕДОВАНИЯ... топов или поливалентен, взаимодействие между полной молекулой антигена и антителом зависит не только от аффинности каждого эпитопа и со- ответствующего антитела, но и от суммарной аф- финности всех вовлеченных эпитопов. Например, аффинность соединения анти-А-антитела с поли- валентным антигеном А может быть на четыре- пять порядков выше, чем аффинность связи того же антитела (т.е. анти-А) с моновалентным анти- геном А (см. рис. 5.1). Причина в том, что соеди- нение в пары анти-А-антител с антигеном А уси- ливается за счет увеличения числа участков анти- гена А, с которыми могут реагировать анти-А-ан- титела. Термин «аффинность» обозначает внутреннюю ассоциативную константу между антителом и мо- новалентным лигандом, таким как гаптен, а тер- мин «авидность» используется для обозначения общей связующей силы между антителами и по- ливалентным антигеном. Так, как правило, анти- тела IgM обладают большей авидностью, чем ан- титела IgG, хотя соединение каждого Fab-фраг- мента молекулы IgM с лигандом может иметь та- кую же аффинность, которой обладает Fab-фраг- мент молекулы IgG. • ВТОРИЧНЫЕ ВЗАИМОДЕЙСТВИЯ МЕЖДУ АНТИТЕЛАМИ И АНТИГЕНАМИ Реакции агглютинации Снова обратимся к рис. 5.1. Взаимодействие ан- титела с поливалентным антигеном, который яв- ляется корпускулярным (т.е. представленным не- растворимыми частицами), приводит к перекрес- тному связыванию различных частичек антигена антителами. Это перекрестное связывание в кон- це концов приводит к группировке или агглюти- нации частиц антигена антителами. Титр Агглютинация антигенов при их перекрестном связывании антителами зависит от правильного соотношения между количеством антигена и ан- тител. Одной из методик, иногда используемой для измерения уровня сывороточных антител, спе- цифичных к корпускулярным антигенам, являет- ся реакция агглютинации. Более чувствительные количественные исследования (например, имму- ноферментный метод, обсуждаемый далее) прак- тически вытеснили эту технологию измерения уровня антител в сыворотке. Действительно, аг- глютинационное титрование конкретной сыворот- ки позволяет только полуколичественно опреде- лять содержание антител, присутствующих в сы- воротке; оно не является способом количествен- ного измерения концентрации антител (масса к объему) Это исследование проводится путем сме- шивания двукратных серийных разведений сыво- ротки с антигеном, концентрация которого фик- сирована. Высокие разведения сыворотки обыч- но не вызывают агглютинации антигена, посколь- ку при таких разведениях содержание антител недостаточно для развития заметной, визуализи- руемой агглютинации. Наибольшее разведение сыворотки, которое дает агглютинацию и после которого агглютинация не развивается, называ- ется титром. Часто бывает, что агглютинация не развивается также и при высоких концентрациях антител, хотя при большем разведении сыворот- ки эта реакция происходит Пробирки с высокой концентрацией сыворотки, в которых не разви- вается агглютинация, называются прозоной. В этой прозоне антитела присутствуют в избытке. Аг- глютинация может не развиваться при высоком отношении антител к антигену, поскольку каж- дый эпитоп на частице оказывается связанным с отдельной молекулой антигена, что предотвращает перекрестное связывание между разными части- цами. Из-за феномена прозоны при определении аг- глютинирующих антител к конкретному антиге- ну непременным условием является тестирование сыворотки в нескольким разведениях. Тестирова- ние сыворотки только в родном разведении может привести к необоснованным выводам при отсут- ствии агглютинации, поскольку оно означает как прозону, так и отсутствие антител. Зета-потенциал Поверхность некоторых корпускулярных антиге- нов может обладать электрическими зарядами, как, например, сетка отрицательных зарядов на поверхности эритроцитов, созданная остатками сиаловой кислоты. Когда такие заряженные час- тицы погружаются в физиологический раствор, между ними возникает электрический потенци- ал, называемый зета-потенциалом, который пред- отвращает слишком тесное сближение частиц. Этот потенциал препятствует агглютинации за- ряженных частиц антителами, в особенности — эритроцитов антителами класса IgG. Расстояние между Fab-фрагментами в молекуле IgG даже при максимальном удалении слишком мало для эф- фективного связывания двух эритроцитов и пре- одоления зета-потенциала. Таким образом, хотя IgG могут быть направлены против антигенов на поверхности эритроцита, имеющей отрицатель- ный заряд, агглютинация не может развиться из- за отталкивания вследствие зета-потенциала. При этом некоторые Fab-фрагменты в пентамере IgM достаточно удалены друг от друга и могут связы- вать эритроциты, разделенные зета-потенциалом. Это свойство антител класса IgM, как и пентава- лентность, является основной причиной их эф- фективности в качестве антител-агглютининов.
ВТОРИЧНЫЕ ВЗАИМОДЕЙСТВИЯ МЕЖДУ АНТИТЕЛАМИ И АНТИГЕНАМИ 83 о© о о Антиген Антитело (1g) Отсутствие агглютинации • Рис. 5.2. Тест Кумбса (антииммуноглобулиновый) В течение многих лет предпринимались попыт- ки улучшить реакцию агглютинации путем сни- жения разными методами зета-потенциала, но ни один из них не стал универсальным или доста- точно эффективным. Однако в 1950-х гг. Р. Кумбс (R. Coombs) предложил метод, который устранил эту проблему. Метод, описанный далее, облег- чает агглютинацию эритроцитов антителами класса IgG, специфичными к антигенам поверх- ности эритроцитов. Он также может использо- ваться при определении неагглютинирующих ан- тител, которые присутствуют на поверхности эритроцита. Тест Кумбса В тесте Кумбса используются антитела к иммуно- глобулинам (вот почему он иногда называется антииммуноглобулиновым тестом). В его основе лежат два важных факта: 1) иммуноглобулины одного биологического вида (например, челове- ческие) являются иммуногенными при их введе- нии в организм другого биологического вида (на- пример, кролика) и приводят к продукции анти- тел против иммуноглобулинов; 2) большинство антииммуноглобулинов (например, кроличьи ан- титела к 1g человека) связываются с антигенной детерминантой на Fc-фрагменте антител, остав- ляя Fab-фрагменты свободными для реакции с антигеном. Так, например, если человеческие IgG связаны с соответствующими им эпитопами на поверхности эритроцитов, то добавление кроли- чьих антител к человеческому IgG приведет к их связыванию с Fc-фрагментами человеческих ан- тител, уже закрепленных на эритроцитах посред- ством Fab-фрагментов (рис. 5.2). Эти кроличьи антитела не только связываются с человеческими антителами, в свою очередь уже связанными с эритроцитами, но и формируют перекрестные связи (мостики) между человеческими антитела- ми, расположенными на относительно удаленных друг от друга эритроцитах, преодолевая разделе- ние, обусловленное зета-потенциалом, что при- водит к агглютинации. Добавление антииммуно- глобулинов вызывает агглютинацию, даже если антитела, направленные против эритроцитов, при- сутствуют в достаточно больших концентрациях, чтобы вызвать феномен прозоны. Существует два варианта реакции Кумбса: пря- мой и непрямой тесты Кумбса. Эти две версии несколько отличаются по методике, но обе по- строены на одном принципе: использовании ге- терологичных антииммуноглобулинов для обнару- жения взаимодействия антигена и антитела. В пря- мом тесте Кумбса антииммуноглобулины добав- ляются к частицам (например, эритроцитам) для обнаружения антител, связанных с антигенами на их поверхности. Например, этот тест использу- ют, когда у новорожденного подозревают гемо- литическую болезнь, вызванную материнскими анти-ИЬ-антителами класса IgG. связанными с эритроцитами младенца. Для того чтобы доказать правомочность таких подозрений, в прямом тесте Кумбса следует получить следующие результаты: добавление антииммуноглобулинов к суспензии эритроцитов ребенка путем связывания антиим- муноглобулинов с материнскими антителами на поверхности эритроцитов должно вызвать агглю- тинацию. Непрямой тест Кумбса используют для обнаружения в сыворотке антител, специфичных для антигенов на частичках. Добавление к час- тичкам сывороточных антител, возможно, не при- ведет к агглютинации из-за наличия зета-потен- циала. Последующее добавление антииммуногло- булинов обязательно вызовет агглютинацию. Чаще всего непрямой тест Кумбса используется для об- наружения антител класса IgG к резус-фактору в крови резус-отрицательных женщин (см. гл. 15). Эта процедура включает, во-первых, реакцию сыворотки женщины с резус-положительными эритроцитами, а во-вторых — добавление реаген- та с антииммуноглобулином (как в прямом тесте Кумбса). Таким образом, прямой тест Кумбса выявляет связанные антитела, в то время как не- прямой тест — сывороточные. Вначале название «тест Кумбса» использова- лось для реакции определения человеческих ан- тител на поверхности эритроцитов. Сегодня этот термин используется для обозначения любой ре- акции обнаружения любых иммуноглобулинов, связанных с антигенами, посредством антиимму- ноглобулина
84 ГЛАВА 5 ВЗАИМОДЕЙСТВИЯ АНТИГЕНОВ С АНТИТЕЛАМИ. ИММУНОЛОГИЧЕСКИЕ ИССЛЕДОВАНИЯ... Пассивная агглютинация Реакция агглютинации может проводиться с кор- пускулярными антигенами (например, эритроци- тами или бактериями) и растворимыми аллерге- нами в том случае, если растворимый антиген может быть надежно закреплен на нерастворимой частице. Например, растворимый антиген тиреоглобу- лин можно зафиксировать на частицах латекса, и тогда добавление антител к тиреоглобулину приведет к агглютинации частиц латекса, покры- тых тиреоглобулином. Конечно, добавление ра- створимого антигена к антителам до их взаимо- действия с покрытыми тиреоглобулином части- цами латекса ингибирует агглютинацию, посколь- ку антитела вначале свяжутся с растворимым антигеном. Если растворимый антиген присут- ствует в избытке, антитела вообще не будут спо- собны связываться с антигеном, связанным с по- верхностью частиц. Последний пример называ- ют угнетением агглютинации. Необходимо раз- личать такое угнетение и случаи, когда антитела к некоторым вирусам предотвращают агглюти- нацию эритроцитов самими вирусными частич- ками. В такой ситуации антитела направлены на участок или участки оболочки вируса, которые связываются с соответствующими рецепторами на красных клетках крови Если антиген является естественным компо- нентом частицы, реакцию называют прямой агглю- тинацией. Если же реакция происходит между антителами и растворимым антигеном, который предварительно был закреплен на нерастворимых частицах, реакцию называют пассивной агглюти- нацией. Реакцию агглютинации (прямую или непря- мую, с применением теста Кумбса или без) ши- роко используют в клинической практике. В до- бавление к уже приведенным примерам упомя- нем типирование эритроцитов в банках крови, диагностику различных иммуноопосредованных гемолитических заболеваний (таких как лекар- ственно-индуцированная аутогемолитическая ане- мия), тест на обнаружение ревматоидного факто- ра (человеческий IgM к анти-IgG человека), диа- гностические тесты при сифилисе и латекс-тест для обнаружения беременности. Последний на- правлен на обнаружение хорионического гонадо- тропина человека в моче беременной женщины. Реакции преципитации Реакции в растворах В отличие от реакций агглютинации, которые происходят между антителами и корпускулярны- ми антигенами, реакции преципитации развиваются при смешивании антител и растворимых антиге- нов. Как и в случае агглютинации, преципитация комплексов антиген — антитело развивается бла- годаря тому, что двухвалентные молекулы анти- тел способны связываться с поливалентными мо- лекулами антигенов, образуя решетку. По достижении определенного размера поли- молекулярный комплекс антиген — антитело пере- стает быть растворимым и преципитирует из раст- вора. На рис. 5.3 приведены количественные харак- теристики реакции преципитации. При добавле- нии раствора с повышающейся концентрацией антигена в несколько пробирок, содержащих раст- вор антител постоянной концентрации, количе- ство преципитата изменяется. Масса преципита- та в каждой из пробирок может быть измерена разными методами. При графическом отображении массы преци- питата относительно количества добавленного антигена получим кривую преципитации, подоб- ную представленной на рис. 5.3. Значимыми являются три зоны под кривой, показанные на рис. 5.3: 1) избытка антител; 2) эк- вивалентности; 3) избытка антигенов. В зоне эк- вивалентности соотношение антигенов и антител оптимально для максимальной преципитации; в зонах избытка антител или антигенов соотно- шение реагентов не приводит к эффективному пе- рекрестному связыванию и преципитат не фор- мируется. Необходимо подчеркнуть, что зоны на кри- вой преципитации выделены на основании ко- личества именно преципитировавших комплек- сов антиген —антитело. Однако зоны избытка антигенов или антител могут содержать раство- римые комплексы антиген —антитело; в частно- сти в зоне избытка антигенов, когда формирует- ся небольшое количество преципитата, основная масса комплексов антиген — антитело присут- ствует в надосадочной жидкости. Таким образом, количество образовавшегося преципитата зави- сит от соотношения между реагирующими анти- генами и антителами. Правильное соотношение реагентов приводит к образованию максималь- • Рис. 5.3. Реакция преципитации
ВТОРИЧНЫЕ ВЗАИМОДЕЙСТВИЯ МЕЖДУ АНТИТЕЛАМИ И АНТИГЕНАМИ 85 Aij Aij Ат, А А12 Аг2 Ат Ат Б Ai2 Ai2 / Ат2 • Рис. 5.4. (А) Диффузия в геле: антитела и один анти- ген. (Б) Диффузия в геле: антитела и антигены 1, 2, 3 • Рис. 5.5. Варианты двойной диффузии в геле: идентич- ность (А), различия (Б) и частичная идентичность (Б) ан- тигенов ного количества преципитата; избыток антиге- нов (или антител) приводит к образованию ра- створимых комплексов. Реакции преципитации в гелях Реакции преципитации между растворимыми ан- тигенами и антителами могут развиваться не только в растворах, но и на полутвердых средах, таких как агаровый гель. Когда растворимые антигены и антитела размешают в ячейки в геле (рис. 5.4, Л), реагенты начинают диффундировать в него, при- чем в непосредственной близости от ячейки кон- центрация вещества наибольшая, а по мере уда- ления снижается. На некотором расстоянии от обеих ячеек реагирующие антигены и антитела встретятся в концентрациях, оптимальных для формирования преципитата. Если в ячейке для антител содержится смесь антител 1, 2 и 3, специфичных для антигенов 1, 2 и 3 соответственно, причем диффузионная спо- собность антигенов различна (коэффициент диф- фузии 1 > 2 > 3), то линии преципитации сфор- мируются в трех различных положениях. Они формируются благодаря тому, что антитела анти-1, анти-2 и анти-3 реагируют соответственно с ан- тигенами 1, 2 и 3 в трех разных зонах эквивален- тности (рис. 5.4, Б). Различия в скорости диффу- зии антигенов и антител связаны с различиями в концентрации, размере молекул или их форме. Метод двойной диффузии, разработанный О. Оухтерлони (О. Ouchterlony) (это имя иногда используют для описания метода вместо термина «двойная диффузия»), при котором антитело и ан- тиген диффундируют навстречу друг другу, весь- ма полезен при определении антигенных взаимо- действий между различными веществами. Разли- чают три варианта реакции при диффузии в гель (рис. 5.5): идентичность, различие антигенов и частичная идентичность. В случае, когда антиген- ные свойства молекул совпадают, реакция фор- мируется по модели идентичности. Пересечение линий преципитации друг с другом соответствует модели, в которой антигены различаются между собой. Наконец, в случае, когда антигены не пол- ностью идентичны, т.е. содержат эпитопы, со- ответствующие и не соответствующие антителам, в геле формируется линия преципитации, похо- жая на шпору. Радиальная иммунодиффузия Тест радиальной иммунодиффузии является вари- ацией теста двойной диффузии (рис. 5.6). Ячейки содержат антиген в разных концентрациях, а ан- титела однородно распределены по агаровому гелю Таким образом, линия преципитации выглядит как кольцо преципитации вокруг ячейки. Расстояние, на которое сдвигается кольцо преципитации от центра ячейки, прямо пропорционально концен- трации антигена в ней. Соотношение между кон- центрацией антигена в ячейке и диаметром коль- ца преципитации может быть представлено гра- фически (см. рис. 5.6). Если ячейки, например F и G, содержат неизвестное количество какого-либо антигена, его концентрация может быть опреде- лена путем сравнения диаметров колец преципи- тации с диаметром кольца, образуемого ячейкой с известной концентрацией антигена. Метод радиальной иммунодиффузии использу- ют в клинике для определения концентраций бел- ков сыворотки крови. Для этого антитела к раз- • Рис. 5.6. Радиальная диффузия. Ячейки А, В, С, D и Е содержат известные концентрации антигена; F и G — не- известные концентрации, которые могут быть вычислены с помощью графика
86 ГЛАВА 5. ВЗАИМОДЕЙСТВИЯ АНТИГЕНОВ С АНТИТЕЛАМИ ИММУНОЛОГИЧЕСКИЕ ИССЛЕДОВАНИЯ... ным белкам сыворотки крови вводятся в гель: концентрация конкретного белка определяется путем сравнения диаметра образовавшегося кольца преципитации с диаметром кольца, полученного при использовании исследуемого белка в извест- ной концентрации. Иммуноэлектрофорез Иммуноэлектрофорез представляет собой разде- ление смеси белков посредством электрического поля (электрофорез) с последующим определени- ем этих белков с помощью антител, диффундиру- щих в геле Этот метод очень удобно применять при анализе смеси антигенов с помощью раство- ра, содержащего антитела к антигенам исследуе- мой смеси. Например, при клинической характе- ристике белков сыворотки человека небольшая капля сыворотки пациента помещается в ячейку в центре полоски, покрытой агаровым гелемт За- тем сыворотка подвергается электрофорезу, ко- торый разделяет разные компоненты в соответ- ствии с их подвижностью в электрическом поде. После электрофореза вдоль края полоски выреза- ют желобок, в который помещают антитела к бей- кам сыворотки человека. Эти антитела диффун- дируют в агаре, так же как и разделенные белки сыворотки крови. При оптимальном соотноше- нии антигена и антител для каждого антигена и соответствующих ему антител формируется линия преципитации. В результате появляется картина, образец которой представлен на рис. 5.7. При срав- нении распределения и интенсивности линий, образуемых сывороткой здорового человека и по- лученных при исследовании образцов сывороток больных, можно выявлять отсутствие, избыток или другой тип изменений одного или нескольких белков сыворотки крови. Действительно, именно с помощью метода иммуноэлектрофореза в 1952 г. был впервые идентифицирован синдром дефицита антител (агаммаглобулинемия Брутона) (см. гл. 17). Вестерн блот (иммуноблоттинг) В методике Вестерн блот (иммуноблоттинг) на первом этапе антиген (или смесь антигенов) раз- деляется в геле электрофорезом. Затем разделен- ный материал переносится (блоттинг) на листы, способные связывать белок (например, из нитро- целлюлозы). Далее на лист нитроцеллюлозы на- носятся антитела, которые связываются со спе- Альбумин Зрансферин IgM IgA IgG • Рис. 5.7. Иммуноэлектрофорез белков сыворотки крови о о ° ° ® ® ® « о о S s s 2 О С С й Выявленные белки ВИЧ: 160 кДа Белки оболочки (env) 120 кДаП ,, _ — — Обратная транскриптаза (+РНКаза) 66 кДа _ Предшественник внутреннего сог-белка Обратная транскриптаза 55 кДа •* Трансмембранный белок 51 кДа 41 кДа , ' Интеграза 31 кДа щ Главный внутренний сог-белок 24 кДа 17кДа - Внутренний сог-белок • Рис. 5.8. Результаты иммуноблотинга сывороток двух ВИЧ-инфицированных и одного здорового человека цифичными для них антигенами. Антитела метят, например, радиоактивными изотопами Если нуж- но выявить локализацию комплекса антитела с антигеном, к которому присоединилось первое антитело, используют меченые антитела к имму- ноглобулинам. Эта методика, называемая Вестерн блот, широко используется в исследовательских и клинических лабораториях для определения и характеристики антигенов. В частности, иммуно- блоттинг используется для подтверждения диаг- ноза ВИЧ-инфекции. Сыворотки пациентов по- мещаются на лист нитроцеллюлозы, на котором закреплены антигены ВИЧ. Обнаружение специ- фичных антител является строгим доказательством инфицирования вирусом (рис. 5.8). • ИММУНОЛОГИЧЕСКИЕ ИССЛЕДОВАНИЯ Иммунологические исследования с прямым связыванием Радиологическое иммунное исследование (radio- immunoassay — RIA) основано на применении мо- лекул, имеющих изотопную метку, что позволяет измерять крайне малые количества антигена, ан- тител или комплексов антиген — антитело. Кон- центрация меченых молекул определяется при из- мерении радиоактивности, что точнее, чем хими-
ИММУНОЛОГИЧЕСКИЕ ИССЛЕДОВАНИЯ 87 ческий анализ. Этот прием повышает чувствитель- ность определения на несколько порядков. За раз- работку этого высокочувствительного аналитиче- ского метода, который в настоящее время широ- ко применяется при исследовании гормонов, а так- же других вешеств, встречающихся в биологиче- ских жидкостях в очень низких концентрациях, Р. Ялоу (R.Yalow) получила Нобелевскую премию. Принцип радиоиммунного исследования по- казан на рис. 5.9. Известное количество радиоак- тивно меченного антигена реагирует с ограничен- ным количеством антител. После этого в раство- ре образуются антитела, связавшиеся с радиоак- тивно меченным антигеном, а также находится немного несвязанного меченого антигена. После разделения свободных антигенов и антигенов, связанных с антителами, определяют количество радиоактивных меток, связавшихся с антителами. Далее проводят ту же процедуру, в которой неиз- менное количество меченого антигена смешива- ется с немеченым (рис. 5.10). Смесь реагирует с тем же количеством антител, как и ранее, затем комплексы антиген — антитело отделяются от сво- бодных антигенов. Немеченый антиген конкури- рует с меченым за антитела; в результате с анти- телами связывается меньше меток, чем это было в отсутствие немеченого антигена. Чем больше немеченого антигена присутствует в реакционной смеси, тем меньше отношение связанного с ан- тителами радиоактивно меченного антигена к сво- бодному радиоактивно меченному антигену. Это отношение может быть представлено графически как функция концентрации немеченого антигена, использованного для конкуренции за антитела. Для определения неизвестной концентрации антигена в растворе образец этого раствора сме- шивается с заранее определенными количества- ми меченого антигена и антител. Соотношение уровней связанной с антителами и свободной ра- диоактивности сравнивается с уровнем радиоак- тивности, определяемым в отсутствие немечено- го антигена (последнее значение принимается равным 100%). Важным шагом при проведении RIA, как упо- миналось ранее, является отделение свободного антигена от антигена, образовавшего комплекс с Антиген Антитела Отделение Связанная (9 единиц) (недостаток) метки, не свя- метка занной с анти- (6 единиц) телами, от свя- занной Три единицы несвя- занной метки • Рис. 5.9. Количество метки, связанной антителами, пос- ле инкубации с константным количеством антител и мече- ного антигена антителом. В зависимости от конкретного антиге- на это разделение может быть достигнуто разны- ми методами, основным из которых является ис- пользование антииммуноглобулинов. Процедура основана на том, что антиген (меченый или не- меченый), связанный с антителом, будет преци- питировать после добавления антител против им- муноглобулинов, поэтому в надосадочной жидко- сти останется только несвязанный антиген. Обыч- но при проведении радиоиммунных исследований используются кроличьи антитела к изучаемым антигенам. Эти комплексы кроличьих антител с антигенами могут преципитировать при добавле- нии антител козы, направленных против кроли- чьих иммуноглобулинов. Поскольку количества антигенов и антител, необходимые для проведения радиоиммунного исследования, крайне малы, комплексы антиген- антитело, реагирующие с антииммуноглобулино- выми антителами, будут образовывать лишь едва заметные преципитаты. Обычными методами сложно, если не невозможно, выделить их коли- чественно для измерения радиоактивности. Для преодоления этой проблемы обычно добавляют- ся иммуноглобулины, неспецифичные к антиге- ну реакционной смеси; общее количество имму- ноглобулинов при этом значительно увеличива- ется до уровня, при котором антитела к иммуно- глобулинам легко образуют преципитаты без по- тери количества вещества. Эти преципитаты в основном состоят из неспецифических иммуно- глобулинов, с которыми не связан радиоактив- Меченый антиген (в той же концентра- ции, что и на рис. 5 .9) и немеченый антиген (9 единиц) Антитела (в той же концентрации, что и на рис. 5. 9) Отделение метки, не связанной с антителами, от связанной Связанная метка (3 единицы) Шесть единиц несвязанной метки (и 6 единиц несвязанного немеченого антигена) • Рис. 5.10. Радиоиммунное исследование, основанное на конкуренции за анти- тела между мечеными и немечеными антигенами
88 ГЛАВА 5. ВЗАИМОДЕЙСТВИЯ АНТИГЕНОВ С АНТИТЕЛАМИ. ИММУНОЛОГИЧЕСКИЕ ИССЛЕДОВАНИЯ... Антиген Покрытая антигеном пластиковая ячейка Блокирующий белок Блокирование незанятых участков планшета инертным белком Антитело, меченное ферментом • Рис. 5.11. Иммуноферментный анализ с использованием ячеек, покрытых антигеном ный антиген. Однако в них содержится также край- не малое количество специфичных антител из реакционной смеси и каждая связавшаяся с ан- тителами молекула радиоактивного антигена. Альтернативный подход к отделению комплек- сов антиген — антитело от свободного антигена основан на том, что иммуноглобулины становят- ся нерастворимыми и осаждаются, если раствор содержит 33 % насыщенного сульфата аммония. Поскольку антиген не преципитирует в этих усло- виях, добавление сульфата аммония приводит к преципитации комплексов антиген —антитело, оставляя свободный антиген в растворе. Еще раз отметим, что количество антител, реагирующее со специфичным антигеном, очень мало, поэтому не- обходимо добавлять достаточное количество не- специфичных антител к реакционной смеси; при достижении 33 % насыщения сульфатом аммония из раствора будут осаждены заметные преципи- таты, что позволит отделить свободный антиген от связавшегося с антителами. Твердофазные иммунологические исследования Твердофазные иммунологические исследования являются одними из наиболее широко использу- емых иммунологических методов. Сейчас они ав- томатизированы и широко используются в кли- нической медицине для определения как антиге- нов, так и антител. Хорошим примером исполь- зования твердофазного иммунологического ис- следования является определение антител к ВИЧ (см. гл. 17). В твердофазных исследованиях используются различные виды пластика (например, поливинил или полистирен), способные сорбировать моно- молекулярный слой белка на своей поверхности Хотя адсорбированные молекулы могут терять некоторые антигенные детерминанты, большин- ство эпитопов остаются неповрежденными и мо- гут по-прежнему реагировать с соответствующи- ми антителами. Наличие антител, связавшихся с антигеном, сорбированным на пластике, может быть определено с помощью антииммуноглобу- линов, меченных либо радиоактивной меткой, либо ферментом (рис. 5.11). Если в тесте исполь- зуются антииммуноглобулины, меченные фермен- том, которые могут быть определены по появле- нию окрашивания при добавлении субстрата, та- кой тест называется ферментным иммуносор - бентным анализом (Enzime-Like ImmunoSorbent Assay — ELISA). Важно отметить, что после покрытия планше- та антигеном поверхность, оставшуюся свободной, необходимо защитить, чтобы предотвратить аб- сорбцию на нее других реагентов, особенно мече- ных. Для этого после добавления антигена поверх- ность планшета покрывают инертным белком, таким как желатин, в высокой концентрации. Иммунные анализы на твердой фазе могут быть использованы для выявления антител к антиге- нам, которые покрывают планшет. Поскольку пластиковые ячейки обычно покрыты сравнитель- но большим количеством антигена, то, следова- тельно, чем больше концентрация антител, свя- завшихся с антигеном, тем большее количество меченого антииммуноглобулина потребуется для связывания антител. Таким образом, всегда важ- но использовать его избыток для обеспечения достаточного насыщения. Иммунный анализ на твердой фазе может быть использован для количественного и качественно- го определения антигенов. Для этого исследуе- мую антисыворотку смешивают с разными извест- ными количествами антигенов, после чего добав- ляют антисыворотку в ячейки, покрытые антиге-
МЕТОДЫ СОРТИРОВКИ КЛЕТОК, МЕЧЕННЫХ ФЛУОРОХРОМАМИ 89 ном. Такая предварительная процедура приводит к связыванию антител с растворимым антигеном и снижает способность свободных антител свя- зываться с антигеном, покрывающим планшет. Чем выше концентрация растворимого антигена, который реагирует с антителами до их добавле- ния в ячейки, тем меньшее количество антител свяжется с антигеном на планшете и тем мень- шее количество меченых антииммуноглобулинов сможет связаться с этими антителами. Уменьшение количества связанной метки за- висит от концентрации антигенов, используемых для этого уменьшения, что можно отобразить гра- фически Количество антигена в неизвестном растворе может быть определено по диаграмме путем сравнения уменьшения связанной метки, вызванного неизвестным раствором, с уменьше- нием, вызванным известной концентрацией чи- стого антигена. в ИММУНОФЛУОРЕСЦЕНЦИЯ Флуоресцентное вещество обладает свойством испускать свет определенной длины волны при активации под воздействием света с более корот- кой длиной волны. Иммунофлуоресценция — это метод, позволяющий выявить локализацию анти- генов с использованием меченных флуоресцином антител. В методе, первоначально описанном Р. Кумбсом, используют антитела, с которыми ковалентно связываются флуоресцентные группы, не вызывающие каких-либо существенных изме- нений активности антител. Одно из широко используемых в иммуноло- гии флуоресцентных веществ — флуоресцинизо- тиоцианат — под влиянием ультрафиолета флуо- ресцирует видимым зеленоватым цветом. Он лег- ко соединяется со свободными аминогруппами. Другое широко используемое флуоресцентное ве- щество — фикоэритрин, флуоресцирующий крас- ным, также легко связывается свободными ами- ногруппами. Флуоресцентные микроскопы, осна- щенные источниками ультрафиолетового света, позволяют визуализировать флуоресцирующие вещества в микрокопируемых образцах. Флуорес- центные антитела широко используются для ло- кализации антигенов в разных тканях и микро- организмах. Существуют два важных связанных между со- бой метода, в которых используют флуоресцент- ные антитела: прямой и непрямой иммунофлуо- ресценции. Прямая иммунофлуоресценция Прямая иммунофлуоресценция используется для прямого определения антигена. Для этого иссле- дуемая ткань (или микроорганизмы) обрабатыва- ется меченными флуоресцином антигенспецифич- ными антителами Этот метод широко использу- ется в клинике для идентификации субпопуля- ций лимфоцитов и выявления специфических бел- ковых депозитов в определенных тканях, таких как почки и кожа, например при системной крас- ной волчанке (СКВ) (см. гл. 12). Непрямая иммунофлуоресценция При непрямой иммунофлуоресценции вначале мишень реагирует со специфическими антитела- ми, не имеющими меток. После этой процедуры проводят обработку антииммуноглобулином, ме- ченным флуоресцином. Метод непрямой иммунофлуоресценции ис- пользуется шире, чем прямой, поскольку один тип меченных флуоресцином антииммуноглобулино- вых антител можно использовать для выявления антител разной специфичности. Более того, по- скольку антииммуноглобулины содержат антите- ла ко многим эпитопам специфического иммуно- глобулина, то применение флуоресцентных им- муноглобулинов значительно усиливает флуорес- центный сигнал. Прекрасным примером исполь- зования метода непрямой иммунофлуоресценции является скрининг сывороток пациентов для об- наружения антител к ДНК при СКВ. * МЕТОДЫ СОРТИРОВКИ КЛЕТОК, МЕЧЕННЫХ ФЛУОРОХРОМАМИ Недавно был разработан очень эффективный ме- тод с применением флуоресцентных антител, спе- цифичных к антигенам клеточной поверхности. Это метод сортировки клеток по активированной флуоресцентной метке (Fluorescence-Activated Cell Sorter — FACS). Суспензия клеток, меченных спе- цифическими флуоресцентными антителами, про- пускается через устройство, формирующее поток маленьких капелек, каждая из которых содержит одну клетку. Эти капельки пропускаются между лазерным лучом ультрафиолетового спектра и де- тектором, подсчитывающим эмиссию флуоресци- нов, если в капельке присутствует меченая клет- ка. Испущенный сигнал передается на электрод, который заряжает капельки, что приводит к их отклонению в электромагнитном поле (рис. 5.12). Таким образом, после прохождения лазерного луча капельки подсчитываются и могут быть разделе- ны (например, немеченые от меченых) согласно тому, испускают ли они световой сигнал. Интен- сивность флуоресцентного окрашивания, которая отражает плотность экспрессированных на каж- дой клетке антигенов, может быть определена с помощью сложной электроники. Данные приборы в настоящее время позволя- ют быстро выявлять профиль пула лимфоцитов на основании разной экспрессии ими молекул
90 ГЛАВА 5 ВЗАИМОДЕЙСТВИЯ АНТИГЕНОВ С АНТИТЕЛАМИ ИММУНОЛОГИЧЕСКИЕ ИССЛЕДОВАНИЯ... • Рис. 5.12. Анализ FACS клеточной поверхности, относительное количе- ство молекул клеточной поверхности, экспрес- сируемых на каждой клетке, а также долю и чис- ленность каждого типа клеток. Также можно ис- пользовать этот прибор для разделения (сорти- ровки) собранных клеток, окрашенных пятью или более флуоресцинами, что позволяет получить в высокой степени однородную популяцию клеток определенного типа. В одном из вариантов этого метода для разделения клеточных популяций ис- пользуются флуоресцентные антитела, соединен- ные с магнитными гранулами. Клетки, связанные с флуоресцентными антителами, могут быть от- делены от неокрашенных с помощью магнита. Оба метода (FACS и метод разделения магнитными частицами) эффективны при выделении очень редко встречающихся клеток, таких как стволо- вые гемопоэтические клетки. Наиболее распространенный метод фенотипи- рования и сортировки клеток основан на исполь- зовании антител, которые реагируют с белками клеточной поверхности, идентифицируемыми как антигены кластеров дифференцировки (ciasters of differentiation — CD). Номенклатура CD была раз- работана при исследовании моноклональных ан- тител (они обсуждаются далее) к клеткам, оха- рактеризованным фенотипически. Было обнару- жено, что поверхностные маркеры (CD-антиге- ны) связаны с разными стадиями развития клет- ки. Более того, эти белки выполняют важные био- логические функции, необходимые для нормаль- ного функционирования клетки. Стадии разви- тия В- и Т-клеток и их функциональные подти- пы сейчас могут быть фенотипированы на осно- вании экспрессии ими CD-маркеров. Однако сто- ит отметить, что поверхностная экспрессия кон- кретной молекулы не всегда специфична только для одного типа клеток или даже их семейства. Тем не менее, экспрессию на поверхности клеток можно использовать для выделения чистых попу- ляций или характеристики клеток. На практике после аббревиатуры CD всегда указывается опре- деленная арабская цифра, которой обозначается специфичный белок клеточной поверхности. Но- мера CD присваиваются Номенклатурным коми- тетом международного союза иммунологических наук (Nomenclature Commitee of the International Union of Immunologic Sciences). Список некото- рых наиболее важных CD-антигенов, экспресси- руемых В-клетками, различными субпопуляция- ми Т-клеток и другими клетками, можно найти в приложении
ИССЛЕДОВАНИЯ С ИСПОЛЬЗОВАНИЕМ КЛЕТОК 91 ♦ ИММУНОАБСОРБЦИЯ И ИММУНОАДСОРБЦИЯ Специфическое связывание антигена с антителом позволяет связать или селективно удалить из жид- кой смеси антигены тех специфичностей, к кото- рым направлены антитела. Подобным же обра- зом, используя специфичный антиген, из смеси антител можно выделить или селективно удалить антигенспецифичные антитела. Есть два основных метода, позволяющих осу- ществить такое удаление. При использовании пер- вого метода абсорбция проводится обоими реаген- тами в растворе (иммуноабсорбция), а при другом один из реагентов закреплен на нерастворимой подложке (иммуноадсорбция). Иммуноадсорбпия имеет преимущества, потому что адсорбированный материал может быть восстановлен путем тщатель- ной обработки, которая разрушает комплексы ан- тиген-антитело. Такой обработкой может быть снижение pH (добавление гидрохлорида глицина или уксусной кислоты снижает pH до 2 — 3) или добавление хаотропных ионов. Это позволяет эф- фективно очистить антигены или антитела, кото- рые представляют интерес для исследователя. • ИССЛЕДОВАНИЯ С ИСПОЛЬЗОВАНИЕМ КЛЕТОК В данной главе также описаны иммунологические исследования, используемые для обнаружения и изучения клеточных компонентов иммунной си- стемы. Среди них есть методы, позволяющие оп- ределять функциональную активность лимфоци- тов. Методики, измеряющие ответ В-клеток на антигенную или митогенную стимуляцию, иног- да используются в клинике для исследования со- стоятельности гуморального иммунитета. В усло- виях эксперимента эти исследования помогают понимать регуляторные и молекулярные механиз- мы, связанные с активацией В-клеток. Аналогич- но, методы исследования функциональной актив- ности Т-клеток используются и в клинике, и в эксперименте. Они направлены на измерение пролиферативного и эффекторного ответа и оп- ределение цитокинового профиля Т-клеток. Ис- следования Т-лимфоцитов значительно повлия- ли на понимание функциональной гетерогеннос- ти Т-клеток, а также на идентификацию многих цитокинов, производимых клетками, принадле- жащими к конкретной субпопуляции. Методы для оценки функций лимфоцитов Исследования, применяемые для оценки функ- ций лимфоцитов, в основном проводятся для того, чтобы ответить на один из следующих вопросов: 1) нормально ли отвечают Т- или В-клетки на митогенные стимулы, которые активируют клет- ки к развитию пролиферативного ответа? 2) вы- зывает ли митогенная или антигенопосредован- ная стимуляция продукцию антител (у В-клеток) или цитокинов (у Т-клеток)? Кроме того, учиты- вая функциональную неоднородность Т-клеток, тесты с Т-лимфоцитами могут быть использова- ны для оценки функциональной интеграции от- дельных субпопуляций. Это особенно важно при клиническом обследовании больных с вероятными иммунодефицитными заболеваниями (см. гл. 17). В случае определения функциональных характе- ристик Т-хелперов основным параметром явля- ется изменение состояния клеток-мишеней, по- лучающих помощь от Т-лимфоцитов. Например, при использовании в качестве мишеней В-лим- фоцитов исследование будет направлено на оценку способности Т-лимфоцитов усиливать индуциру- емый синтез антител. В тесте, указанном в этом примере, будет определяться уровень продукции антител. Подобно этому при изучении возмож- ности Т-лимфоцитов поддерживать оптимальную активацию макрофагов измеряемыми параметра- ми будут функциональные свойства фагоцитиру- ющих клеток. Важно отметить, что многие иссле- дования, используемые для оценки функции кле- ток Т-хелперов, основаны на измерении специ- фичных цитокинов, поскольку клетки, которые получают помощь, могут активироваться и само- стоятельно производить цитокины. Исследования пролиферации Т- и В-клеток Активация лимфоцитов, стимулированных мито- генами, запускает биохимические сигнальные кас- кады, которые приводят к экспрессии генов, син- тезу белков, пролиферации клеток и дифферен- цировке. Пролиферативный ответ, вызываемый действием митогена, поликлонален по своей при- роде. Есть митогены, избирательно стимулирую- щие либо В-, либо Т-клеточные популяции. Вот почему в отличие от иммуногенов, которые акти- вируют только те лимфоцитарные клоны, кото- рые несут соответствующие антигенные рецепто- ры, поликлональные активаторы стимулируют множество Т- и В-лимфоцитарных клонов неза- висимо от их антигенной специфичности. Мито- гены, которые избирательно активируют В-клет- ки, такие как липополисахаридный (Л ПС) компо- нент клеточной стенки грамотрипательных бак- терий, вызывают поликлональную стимуляцию В-клеток мышей. Интенсивность пролиферации клеток в ответ на митогенную стимуляцию может быть измерена при добавлении в культуральную среду радиоактивно меченных нуклеозидов (на- пример, тимидина, меченного тритием) и после- дующего определения количества встроенных
92 ГЛАВА 5 ВЗАИМОДЕЙСТВИЯ АНТИГЕНОВ С АНТИТЕЛАМИ. ИММУНОЛОГИЧЕСКИЕ ИССЛЕДОВАНИЯ... молекул в ДНК делящихся клеток, для чего ис- пользуется жидкостный сцинтилляционный счет- чик. Подобно этому некоторые белки, связываю- щие сахара, называемые лектинами, в том числе конконавалин А (Кон А) и фитогемагглютинин (ФГА), являются эффективными Т-клеточными митогенами. Митоген лаконоса (поквид) (МЛ) — другой пример лектина с выраженными митоген- ными свойствами. Однако в отличие от Кон А и ФГА он стимулирует поликлональную активацию как В-, так и Т-клеток. Продукция антител В-клетками Митогенная стимуляция В- и Т-клеток приводит к пролиферации и дифференцировке множества клеточных клонов. Поэтому в случае с В-клетка- ми поликлональные активаторы Л ПС или МЛ могут быть использованы для изучения способ- ности популяции В-клеток продуцировать анти- тела. Для количественного определения уровня антител чаще всего используется иммунофермент- ный анализ (ELISA). При другом методическом подходе {ELISPOT) В-клетки могут быть прости- мулированы митогенами или специфичными ан- тигенами. а затем определенное время культиви- роваться in vitro в камерах непосредственно на нитроцеллюлозных мембранах. Способность нит- роцеллюлозы связывать белок облегчает захват секретируемых антител от каждой отдельной В-клет- ки. Это приводит к образованию дискретных уча- стков (фокусов), в которых антитела связались с нитроцеллюлозой. Для обнаружения этих анти- тел используют вторичные меченные фермента- ми антитела, специфичные к связанным с план- шетом антителам, что позволяет точно вычислить количество клеток, секретирующих антитела. Исследования эффекторных Т-клеток и натуральных киллеров Как упоминалось ранее, выбор типа эффекторных клеток, которые будут использоваться в тесте, за- висит от вопросов, на которые необходимо найти ответ. Исследования Т-клеток настолько же раз- нообразны, насколько отличаются функции извест- ных субпопуляций. Так, были разработаны различ- ные методы измерения клеточной функции Т-хелперов, в том числе направленные на изуче- ние хелперной активности в отношении актива- ции В-клеток и макрофагов. Существуют также тесты, измеряющие другие типы хелперной актив- ности СВ4+-Т-клеток. Кроме того, доступны и не- сколько видов исследований цитотоксической ак- тивности СВ8+-Т-клеток. В одном из таких тестов {цитотоксический тест) измеряется способность цитотоксических Т-клеток или натуральных кил- леров (NK-клеток) разрушать радиоактивно мечен- ные клетки-мишени, экспрессирующие антиген, к которому чувствительны цититоксические Т-клет- ки. В сходном исследовании NK-клетки культи- вируются с радиоактивно меченными клетками- мишенями, с которыми связались антитела, спе- цифичные для клеток-мишеней. Обоснованием для этого подхода послужил тот факт, что NK-клетки экспрессируют на мембране Ёс-рецептор для свя- зывания с Fc-фрагментами некоторых изотипов им- муноглобулинов. Этот метод измеряет важное функ- циональное свойство NK-клеток, известное как ан- тителозависимая клеточно-опосредованная цито- токсичность (АЗКЦ). КЛЕТОЧНЫЕ КУЛЬТУРЫ Появление некоторых экспериментальных систем дало возможность найти ответы на мириады во- просов, связанных с развитием иммунной си- стемы, ее функциональными и регуляторными свойствами, а также патологическими механиз- мами, связанными с иммунодефицитами и ауто- иммунными заболеваниями. Большинство этих эк- спериментальных систем зависят от методики культивирования клеток, используемой для под- держания жизнедеятельности клеток in vitro. Бла- годаря системам культивирования клеток было со- вершено несколько серьезных научных прорывов, в том числе и разработка в 1970-х гг. Ц. Милыитей- ном (С. Milstein) и Г. Кёлером (Н. Kohler) В-кле- точной гибридомной технологии для получения мо- ноклональных антител. Определение факторов ро- ста, необходимых для поддержания лимфоцитов, сделали возможными клонирование и выращива- ние функционально компетентных клеток in vitro. Более того, методики с использованием реком- бинантной ДНК позволили переносить заданные гены в клонируемые клеточные линии, таким об- разом позволяя исследователям отвечать на мно- гие вопросы, связанные с ними. Методики с ис- пользованием рекомбинантной ДНК также сде- лали возможной разработку иммунных молекул и рецепторов, создаваемых методами генной инже- нерии, которые могут быть перенесены в клетки и использованы для выявления биологических по- следствий экспрессии рецепторов и активации ре- цепторов (например, при захвате лигандов). Эти лабораторные техники продолжают использовать- ся для углубления знаний об иммунной системе и, в некоторых случаях, для разработки новых био- логических препаратов и вакцин для клинического использования. Первичные культуры клеток и клонируемые клеточные линии лимфоцитов Как и во многих других областях биологической науки, системы культивирования клеток служат необходимым исследовательским инструментом
КЛЕТОЧНЫЕ КУЛЬТУРЫ 93 для понимания многих физиологических свойств клеток, связанных с их созреванием. Способность культивировать первичные лимфоидные клетки, состоящие из различных популяций Т- и/или В-клеток (хотя бы в течение ограниченного пе- риода времени), позволила иммунологам изучить биохимические и молекулярные механизмы, кон- тролирующие многие важные биологические функ- ции В- и Т-клеток, в том числе генные реаранжи- ровки. В течение нескольких последних десяти- летий системы культивирования клеток значитель- но улучшились, что привело к развитию техноло- гий клонирования клеток. Для образования кло- нированной иммортализованной (бессмертной) клеточной линии необходима трансформация В- или Т-клеток, происходящих из общей специфи- ческой родительской клетки, которая достигается различными методами, в том числе воздействием на клетки некоторых канцерогенов и вирусов (на- пример, вирус Эпштейна — Барр для трансформа- ции В-клеток; вирус Т-клеточного лейкоза чело- века первого типа для трансформации Т-клеток). Необходимо отметить, что многие клеточные ли- нии получены из опухолей, возникших как спон- танно, так и экспериментально (как результат назначения канцерогенов или вирусной инфек- ции). Основное преимущество использования клонированных клеточных линий состоит в том. что для исследования доступно огромное число клеток. Недостатком использования клеток, по- лученных в результате канцерогенной или вирус- ной трансформации, является то, что они по оп- ределению аномальны. Действительно, у многих трансформированных клеток отмечается аномаль- ное число хромосом и они часто имеют феноти- пические и функциональные свойства, не харак- терные для нормальных клеток. Существенный прогресс в получении клониро- ванных лимфоцитов наблюдался в конце 1970-х гг., когда выяснилось, что нетрансформированные клеточные линии и клоны антигенспецифичных Т-клеток могут расти длительное время в случае, если в культуру добавлен фактор роста Т-лимфо- цитов (IL-2), а также присутствует источник ан- тигена и АПК. У этого подхода было несколько преимуществ по сравнению с использованием трансформированных клеток, поскольку клетки из такой культуры были со всех точек зрения нор- мальными. Таким образом, стало возможным по- лучать большие количества нетрансформирован- ных антигенспецифичных Т-клеток для исследо- ваний. Действительно, многие из этих клониро- ванных Т-клеточных линий использовались для идентификации и биохимической характеристи- ки цитокинов, что в итоге привело к клонирова- нию генов, кодирующих эти белки. Совместное использование систем клонирова- ния клеток, методов переноса генов и моделей на животных помогло понять, как развивается ауто- толерантность лимфоцитов, а также то, как им удается ускользать от механизмов, индуцирующих толерантность, и становиться аутореактивными клетками, иницирующими заболевания. Системы культивирования клеток открыли для исследова- телей возможность изучать физиологические и патофизиологические свойства лимфоцитов. Как будет обсуждаться далее, системы культивирова- ния клеток также продуктивно использовались при разработке многих диагностических и лекарствен- ных средств, таких как моноклональные антитела В-клеточные гибриды и моноклональные антитела Специфичность иммунного ответа служит осно- вой серологических реакций, в которых специ- фичность антител используется для количествен- ного и качественного определения антигена Од- нако распознающая способность сывороточных антител не безгранична, поскольку иммунизация нативным антигеном (который обычно состоит из многих эпитопов) приводит к образованию анти- сыворотки, содержащей смесь антител, обладаю- щих различной специфичностью и направленных ко всем эпитопам антигена. Более того, даже ан- титела к одному эпитопу обычно представлены смесью иммуноглобулинов с разной степенью специфичности и поэтому разной аффинностью к антигенной детерминанте. Иммунизация анти- геном стимулирует различные популяции анти- телообразующих В-лимфоцитов. Эти клетки мо- гут культивироваться недолгое время (порядка нескольких дней), поэтому практически невоз- можно вырастить нормальные клетки и получить клоны, которые производят антитела только од- ной специфичности. Решающий скачок в техноло- гии получения антител, обладающих высокой рас- познающей способностью, произошел в 1970-х гг. и связан с разработкой метода производства мо- ноклональных антител. Метод разработали Г. Кё- лер и Ц. Милыитейн, которые получили за это от- крытие Нобелевскую премию. Моноклональные антитела представляют собой гомогенные попу- ляции молекул антител, полученные от одной ан- тителопродуцирующей клетки. В таких популя- циях все антитела идентичны и обладают одина- ковой специфичностью к данному эпитопу. В данной методике используются трансформи- рованные плазматические клетки (иммортализо- ванные культивируемые линии), которые не про- дуцируют иммуноглобулины. Эти клетки метода- ми генной инженерии видоизменяют таким об- разом, что они не теряют способность произво- дить фермент — гипоксантингуанинфосфорибо- зилтрансферазу (ГГФРТ) — и поэтому не могут выживать в культуре, если этот фермент не будет добавлен в среду, на которой выращиваются клет- ки. Модифицированные плазматические клетки гибридизуют с В-клетками, выделенными у мы- шей, недавно иммунизированных антигеном (на- пример, клетками из селезенки) (рис. 5.13). Про-
94 ГЛАВА 5. ВЗАИМОДЕЙСТВИЯ АНТИГЕНОВ С АНТИТЕЛАМИ. ИММУНОЛОГИЧЕСКИЕ ИССЛЕДОВАНИЯ... Мышь, иммунизированная антигеном X Миеломные клетки мыши ГГФРТ +, Ig+, в том числе анти-Х- клетки из селезенки Смерть клеток ГГФРТ ,1g Сплавление Смерть «Бессмертные» клеток гибридные клетки, ГГФРТ+, Ig+, отобранные на среде, содержащей гипоксантин Скрининг на анти-Х и клонирование клеток, производящих такие антитела Клон 1 Клон 2 Клон 3 Моноклональные антитела к антигену X • Рис. 5.13. Получение моноклональных антител цедура гибридизации часто выполняется с исполь- зованием полиэтиленгликоля (ПЭГ). После гиб- ридизации клетки выращивают в среде, не содер- жащей ГГФРТ. Поскольку антителопродуцирую- щие В-клетки синтезируют ГГФРТ, гибридные клетки (гибридомы), состоящие из иммортали- зованных плазматических клеток, сплавленных с В-лимфоцитами, выживают в среде, не обогащен- ной ГГФРТ. В отличие от гибридных клеток ГГФРТ-негативные плазматические клетки и В-лимфоциты, не образовавшие гибридому, гиб- нут течение нескольких дней. Оставшиеся гибри- домы, синтезирующие специфичные антитела, сортируют с помощью тестов на антигенную реак- тивность (например, ELISA), а затем единичные клетки клонируют и размножают в клеточной культуре. Каждый клон синтезирует антитела од- ной специфичности. Эти высокоспецифичные моноклональные антитела используют в разных процедурах, начиная от специфических диагно- стических тестов и заканчивая иммунотерапией рака (см. гл. 19). При иммунотерапии различные препараты или токсины конъюгируют с монокло- нальными антителами, обеспечивающими достав- ку этих веществ к клеткам опухоли, к которым эти антитела специфически направлены. Т-клеточные гибридомы Важно отметить, что гибридомная технология при- меняется не только для производства монокло- нальных иммуноглобулинов. В конце 1970-х гг. были разработаны также и методы гибридизации для Т-клеток, при которых сплавлялись линии злокачественных Т-клеток и незлокачественных антигенспепифичных Т-лимфоцитов, популяцию которых получали при иммунизации антигеном. Т-клеточные гибридомы оказались очень полез- ным инструментом при изучении взаимоотноше- ний Т-клеток одной специфичности с соответству- ющим им эпитопом.
ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНЫЕ МОДЕЛИ НА ЖИВОТНЫХ 95 Молекулы и рецепторы, полученные методами генной инженерии В настоящее время большинство моноклональных антител получают из мышиных клеток. Эти мо- лекулы подходят для диагностики и многих дру- гих целей. Однако их введение в организм чело- века вызывает осложнения: у больных будут вы- рабатываться антитела к мышиным иммуногло- булинам. Пока попытки разработать технологию получения человеческих моноклональных анти- тел в целом были малоэффективными. Моноклональные человеческие антитела полу- чают методами генной инженерии, используя не- сколько подходов. В одном из методов использу- ют технологию рекомбинантной ДНК для произ- водства химерных антител мышь —человек. Эти так называемые гуманизированные антитела со- стоят из константной области иммуноглобулина человека и вариабельной области иммуноглобу- лина мыши. Подобный метод используется и для создания таких гуманизированных антител, в ко- торых константная область состоит из иммуно- глобулина человека, а вариабельная область со- держит гипервариабельную область мыши и кар- касную (структурную) область человека. При дру- гом методическом подходе используют полиме- разную цепную реакцию (ПЦР), с помощью ко- торой создают генные библиотеки ДНК тяжелых и легких цепей, полученных из гибридных или плазматических клеток. Множество тяжелых и легких цепей рандомно (случайно) соединяют, после чего получившиеся Fab-клоны скринируют для определения среди них антител, обладающих способностью распознавать исследуемый антиген. В настоящее время с помощью этой технологии стало можно создавать миллионы клонов разной специфичности, быстро скринировать их на за- данную специфичность, затем разрабатывать не- обходимые Fab-конструкции, не прибегая к им- мунизации и избегая трудностей, связанных с про- изводством моноклональных антител, в особен- ности человеческих. Генная инженерия иммунных белков не огра- ничивается только созданием моноклональных антител Были клонированы многие гены, коди- рующие мембранные белки, экспрессируемые в лимфоидных и нелимфоидных клетках; в некото- рых случаях они встраивались в клетки, обычно не экспрессирующие такие рецепторы. Экспрес- сия некоторых костимулирующих молекул об- легчает межклеточное взаимодействие (напри- мер, физический контакт между цитотоксической Т-клеткой и клеткой-мишенью, который закан- чивается гибелью последней). Экспрессия в ре- зультате переноса генов таких костимулирующих молекул (например, В7.1, по-другому называемый CD80) на опухолевых клетках существенно уве- личивает способность Т-клеток распознавать и уничтожать злокачественные клетки Эксперимен- тальные стратегии получения вакцин (как разно- видность иммунотерапии) показали, что иммуни- зация животных с опухолью их собственными клетками, в которые in vitro введен ген В7.1, мо- жет усиливать распознавание и уничтожение ро- дительских опухолевых клеток Т-лимфоцитами. Следует отметить, что в моделях на животных подобная стратегия успешно использовалась в некоторых случаях при внесении в опухолевые клетки генов цитокинов. Иммунотерапевтические подходы, используемые при лечении разных за- болеваний, обсуждаются в гл. 17—19. • ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНЫЕ МОДЕЛИ НА ЖИВОТНЫХ На животных было разработано несколько важ- ных моделей (in vivo), обладающих эксперимен- тальной ценностью и клинической пользой и со- поставимых с системами in vitro, упоминавшими- ся ранее. В качестве моделей использовали инб- редные линии мышей с разными генетическими профилями; некоторые из них были получены методами генной инженерии. У животных неко- торых инбредных линий отмечается врожденная предрасположенность к развитию определенных заболеваний (например, рак молочных желез, лей- коз, аутоиммунные заболевания, тяжелый комби- нированный иммунодефицит). Кроме того, выве- дены животные с генетическими нарушениями, способные экспрессировать некоторые клониро- ванные чужеродные гены (так называемые транс- генные мыши), или животные, у которых задан- ные гены не экспрессируются (мыши с «нокаут- ными» генами). Такие линии используют для изу- чения последствий экспрессии определенных трансгенов или последствий отсутствия экспрес- сии гена у «нокаутных» мышей. Начнем обсужде- ние с животных инбредных линий. Инбредные линии Множество классических экспериментов в обла- сти иммунологии были проведены с использова- нием животных инбредных линий, таких как мыши, крысы и морские свинки. К образованию инбредной линии обычно приводит селективное близкородственное скрещивание потомства на протяжении более чем 20 поколений. Все члены инбредной линии животных генетически идентич- ны. Поэтому их называют сингенными, как и иден- тичных близнецов. Иммунный ответ инбредной линии можно изучать без учета вариабельности, связанной с генетическими различиями между животными. Как будет обсуждаться в гл. 18, транс- плантация органов между членами инбредной линии всегда успешна, поскольку их антигены главного комплекса гистосовместимости (МНС)
96 ГЛАВА 5. ВЗАИМОДЕЙСТВИЯ АНТИГЕНОВ С АНТИТЕЛАМИ. ИММУНОЛОГИЧЕСКИЕ ИССЛЕДОВАНИЯ... идентичны. Действительно, знание законов транс- плантации и того факта, что МНС является ос- новным генетическим барьером для транспланта- ции, пришло в результате экспериментов на инб- редных линиях. Эксперименты с использованием инбредных линий привели к идентификации ге- нов МНС I и II классов, основной функцией ко- торых является доставка пептидных фрагментов антигена на поверхность клетки, что позволяет эпитопам быть распознанными антигенспецифич- ными Т-лимфоцитами. В последующих главах де- тально освещена важная роль МНС в развитии нормального иммунного ответа, созревании Т-кле- ток, чувствительности к заболеваниям и транс- плантации органов и тканей. Адоптивный перенос и пассивная иммунизация Защита от многих болезней осуществляется кле- точно-опосредованным иммунитетом, обеспечи- ваемым антигенспецифичными Т-клетками, в от- личие от опосредованного антителами (гумораль- ного) иммунитета. Различие между этими двумя ветвями иммунной системы хорошо демонстри- руется адоптивным (заимствованным) переносом Т-клеток или пассивным введением антивосыво- ротки или очищенных антител. Адоптивный пе- ренос Т-клеток обычно проводится в генетиче- ски идентичных парах донор — реципиент (на- пример, внутри инбредной линии) и в результате приводит к формированию долгосрочного адоп- тивного иммунитета после первого контакта с ан- тигеном. Напротив, пассивный перенос сыворот- ки, которая содержит антитела, может быть осу- ществлен без учета барьеров МНС и остается эф- фективным лишь в течение того времени, пока перенесенные антитела сохраняют активность у реципиента. Вот почему этот тип переноса назы- вается пассивной иммунизацией. Мыши с тяжелым комбинированным иммунодефицитом Тяжелый комбинированный иммунодефицит (ТКИД) является расстройством, при котором нарушается созревание В- и Т-клеток, что приводит к форми- рованию у индивидуума недостаточности механиз- мов лимфоцитарной защиты. Причины возникно- вения ТКИД у людей обсуждаются в гл. 17. В 1980 г. была выведена инбредная линия мышей, у кото- рых спонтанно развилась аутосомно-рецессивная мутация, приволяшая к ТКИД. Вследствие отсут- ствия функционирующих Т- и В-клеток у ТКИД- мышей приживлялись клеточные и тканевые транс- плантаты от мышей других линий или видов. Таким ТКИД-мышам могут быть введены человеческие гемопоэтические стволовые клетки для создания ТКИД-человеческих химер. У таких химерных мы- шей развиваются зрелые функциональные Т- и В-клетки, которые являются потомками введенных человеческих гемопоэтических стволовых клеток- предшественников. Эта модель на животных стала ценным исследовательским инструментом, по- скольку позволяет иммунологам манипулировать человеческой иммунной системой in vivo и иссле- довать развитие разных лимфоидных клеток. Бо- лее того, ТКИД-человеческих мышей можно ис- пользовать для тестирования создаваемых вакцин, включая и те из них, которые помогут защитить людей от ВИЧ-инфекции. Тимэктомированные и бестимусные мыши Значение тимуса в развитии зрелых Т-клеток мож- но продемонстрировать на мышах, которые в пе- риод новорожденное™ перенесли тимэктомию, облучение, а затем пересадку сингенного костно- го мозга. У таких мышей не развиваются зрелые Т-лимфоциты. Также у мышей, гомозиготных по рецессивной мутации пи/пи, не развиваются зре- лые Т-клетки, потому что мутация приводит к фенотипу, характеризующемуся отсутствием тиму- са и волос (отсюда термин «nude» — голые). В обеих ситуациях развитие Т-клеток может быть восста- новлено путем пересадки этим мышам эпители- альной ткани тимуса. Как и модели с ТКИД-мы- шами, эти животные модели полезны при изуче- нии развития Т-лимфоцитов. Также они исполь- зовались для размножения in vivo линий опухоле- вых клеток и свежих опухолевых эксплантатов от животных других линий или вида, для чего необ- ходимо отсутствие Т-клеток. призванных оттор- гать подобные чужеродные клетки. • ТРАНСГЕННЫЕ МЫШИ И МАНИПУЛЯЦИИ С ГЕНАМИ Трансгенные мыши Еще одной важной моделью на животных, актив- но используемой в иммунологических исследова- ниях, являются трансгенные мыши. Их получают путем введения клонированного гена (трансгена) в оплодотворенную мышиную яйцеклетку. Затем яйцеклетки вводятся псевдобеременной мыши (рис. 5.14). Уровень успешности этой методики относительно невысок, трансген экспрессируют 10 — 30% потомства. Поскольку трансген внедря- ется как в соматические, так и в половые клетки, он передается потомству как менделевский при- знак. Конструируя трансген с заданным промо- тором, можно контролировать экспрессию генов Например, некоторые промоторы работают толь- ко в определенных тканях (в частности, инсули- новый промотор работает только в поджелудоч-
АНАЛИЗ ЭКСПРЕССИИ ГЕНОВ 97 • Рис. 5.14. Общая методика получения трансгенных мышей Усилитель \ Промотор Завершающая последова- тельность I Клонированный «трансген», вводимый в пронуклеус Ген I Имплантирование псевдобеременной у мыши обработанных яйцеклеток Скрининг потомства по экспрессии трансгена Разводят мышей, экспрессирующих трансген, для получения трансгенной линии ной железе). Другие промоторы начинают рабо- тать в ответ на биохимические сигналы, которые в некоторых случаях могут быть введены в каче- стве пищевой добавки (например, металлотиони- новый промотор начинает работать в ответ на цинк, который можно добавлять в питьевую воду). Трансгенные мыши использовались для изучения генов, которые обычно не экспрессируются in vivo (например, онкогены). Также с помощью транс- генов изучалось действие отдельных молекул им- муноглобулинов, Т-клеточных рецепторов, моле- кул МНС I и II классов и цитокинов. Были выве- дены трансгенные мыши, у которых весь мыши- ный иммуноглобулиновый локус был замещен генами иммуноглобулинов человека. Такая модель используется для выработки «человеческих» ан- тител у мышей. Необходимо отметить, что недо- статком трансгенного метода является то, что трансген встраивается в геном случайным обра- зом. Это ограничение вместе с тем фактом, что экспрессия трансгена в большом количестве в разных тканях нефизиологична, обязывает иссле- дователей очень тщательно интерпретировать ре- зультаты, полученные на трансгенных мышах. Мыши с «нокаутными» генами Иногда интересно определить, как удаление про- дукта конкретного гена повлияет на иммунную систему. Используя метод генных манипуляций, можно заместить нормальный ген мутировавшим или поврежденным, создав мышь с «нокаутным» («выбитым») геном. Таким образом, в отличие от метода, использующегося для создания трансген- ных мышей, при данном методе «нокаутные» мыши экспрессируют трансгены, встраиваемые в собственные специфические гены, с помощью процесса, названного гомологичной рекомбинацией. Гипотетически любой ген, для которого существу- ет мутировавший или поврежденный трансген, может быть замещен таким путем. Были выведе- ны «нокаутные» мыши, у которых отсутствует экспрессия различных важных генов, в том числе и тех, что кодируют некоторые цитокины и моле- кулы МНС. «Нокаутные» мыши использовались для идентификации участков гена, необходимых для его нормального функционирования. Для это- го путем трансгенеза обратно в геном внедряли различные мутантные генные копии, что приво- дило (или не приводило) к восстановлению функ- ционирования гена. * АНАЛИЗ ЭКСПРЕССИИ ГЕНОВ Микромассивы в исследовании экспрессии генов Микромассивы, или генные чипы, являются мощ- ными инструментами исследования уровня экс- прессии тысяч генов одновременно. Микромас- сив состоит из тысяч фрагментов ДНК (у каждо-
98 ГЛАВА 5. ВЗАИМОДЕЙСТВИЯ АНТИГЕНОВ С АНТИТЕЛАМИ. ИММУНОЛОГИЧЕСКИЕ ИССЛЕДОВАНИЯ... го из которых уникальная последовательность), прикрепленных в определенном порядке к стеклу или другой поверхности. Эти фрагменты ДНК в форме комплементарной ДНК (кДНК; прибли- зительно 500 — 5000 пар оснований) или олиго- нуклеотидов (20 — 80 пар оснований) могут пред- ставлять гены из всех частей генома. При этом можно приготовить специализированные микро- массивы, которые будут использовать только ДНК исследуемых генов. В исследовании используется образец общей информационной РНК (и PH К) — продукт, получаемый в результате транскрипции всех активных генов. Для проведения исследования с микромасси- вом образец общей и PH К от клетки или ткани обычно тестируется параллельно с контрольным образцом, необходимым для сравнения экспрес- сии генов. Например, могут сравниваться разные типы клеток или тканей, клетки на разных стади- ях дифференцировки или опухолевые клетки со своими нормальными аналогами. Образцы, кото- рые добавляются к микромассиву, обычно не яв- ляются иРНК; на матрице общей (тотальной) иРНК проводят обратную транскрипцию, а обра- зовавшуюся кДНК затем помечают флуоресцент- ным материалом (флуорохромом). Флуорохромы разной окраски используют для маркировки кДНК из различных источников. На рис. 5.15 показано, как микромассивы ис- пользуются для сравнения экспрессии генов в популяции опухолевых лимфоидных клеток и нормальных лимфоцитов. Красный флуорохром был использован в качестве метки эксперимен- тальных кДНК из опухолевых клеток, а зеленый — для кДНК, приготовленных из контрольных нор- мальных аналогов. Меченые кДНК наносили на чип и оставляли для гибридизации пар основа- ний с соответствующими фрагментами. К микро- массиву добавляли кДНК как контрольного об- разца, так и экспериментального, поэтому они конкурировали за связывание на поверхности микромассива. Материал, не образовавший гиб- ридов, смывали, оставляя участки флуоресценции там, где произошло совпадение. По окончании гибридизации микромассив сканировали лазером для обнаружения красных, зеленых или желтых пятен. Наибольшие уровни каждого типа кДНК отражал свой цвет: красный — кДНК экспери- ментальных опухолевых клеток; зеленый — конт- рольные кДНК; желтый — одинаковые уровни ДНК обоих образцов. Для интерпретации резуль- татов флуоресцентный сканер определял точный уровень флуоресценции каждого пятна на стекле Полученные данные затем анализировала компь- ютерная программа, которая сравнивала инфор- мацию о флуоресценции с генетической базой данных для определения того, какие гены избы- точно или недостаточно экспрессируются в тес- тированных образцах. Характеристика распреде- ления и количества связывания ДНК с микро- массивом потенциально может быть полезной в области иммунологии. В частности, для клини- ческой диагностики лимфоидных опухолей, раз- работки препаратов (например, тестирование раз-
ТЕСТЫ 99 рабатываемых иммуносупрессивных препаратов по их действию на экспрессию цитокиновых генов) и открытия новых генов. РЕЗЮМЕ 1. При взаимодействии антитела и антигена кова- лентные связи не используются; задействованы сла- бые силы, такие как электростатические, гидрофоб- ные и ван-дер-ваальсовы. Следовательно, для доста- точного взаимодействия связывающий участок анти- тела и антиген должны строго пространственно соот- ветствовать друг другу, как ключ с замком. 2. Только реакция между поливалентным антиге- ном и по меньшей мере двухвалентным антителом может привести к взаимодействию, выраженному пе- рекрестным связыванием молекул антигена антитела- ми. Эти реакции невозможны при участии гаптенов или моновалентных Fab-фрагментов. 3. Взаимодействие между растворимым антите- лом и нерастворимым корпускулярным антигеном приводит к агглютинации. Степень агглютинации за- висит от соотношения взаимодействующих антител и антигена. При большой концентрации антител агглю- тинация может не развиться. Это явление называется прозоной. Под термином «титр» понимают наиболь- шее разведение сыворотки, при котором еще проис- ходит агглютинация, после чего при более высоком разведении она не начинается. 4. Реакция преципитации происходит при смеши- вании в правильном соотношении растворимого поли- валентного антигена и (по меньшей мере) двухвалент- ных антител. Она может протекать в водной среде или геле. 5. Реакции в геле между растворимыми антигенами и антителами могут быть использованы для качествен- ного и количественного анализа антител или антиге- нов. Примерами таких реакций могут стать диффузия в геле, радиальная диффузия и иммуноэлектрофорез 6. Радиоиммунное исследование является высоко- чувствительным тестом для количественного определе- ния антигенов или антител. В нем используются радио- активно меченные антигены или антитела, а основой метода является конкурентное связывание немеченого и меченого антигенов. Необходимо отделить антиген, связанный с антителами, от несвязанного меченого ан- тигена. Обычно разделение достигается использовани- ем преципитации с антииммуноглобулинами 7. Иммунное исследование на твердой фазе явля- ется методикой, которая основана на способности многих белков прикрепляться к пластику с образовани- ем мономолекулярного слоя. Антиген наносится на ячейки планшета, добавляются антитела, затем ячейки отмываются и измеряется наличие и количество свя- занных антител, для чего используют антииммуногло- булины с радиоактивной или ферментной меткой. 8. Ферментный иммуносорбентный анализ являет- ся разновидностью твердофазного иммунного иссле- дования, в котором ферменты прикреплены к антиим- муноглобулинам. Количество определяется путем ко- лориметрической оценки после добавления субстра- та, который меняет цвет под действием фермента. 9. Иммунофлуоресценция — это метод, при кото- ром антиген обнаруживают, используя иммуноглобули- ны, меченные флуоресцином. При прямой иммунофлуо- ресценции антитела к искомому антигену несут флуо- ресцентную метку. При непрямой иммунофлуоресцен- ции антигенспецифичные антитела не маркированы, их определяют после добавления флуоресцентно мечен- ных антииммуноглобулинов. Проточные флуоресцент- ные клеточные сортеры являются приборами, которые можно использовать для подсчета и сортировки флуо- ресцентно меченных клеток. 10. В исследованиях, используемых для оценки функции лимфоцитов, обычно измеряют клеточный пролиферативный ответ или эффекторные функции. Например, можно исследовать функциональное со- стояние В-клеток путем измерения их способности к пролиферации и продукции антител в ответ на В-кле- точные митогены, такие как ЛПС или митоген лаконо- са. Т-клетки обычно исследуют по их способности усиливать функции других клеток (в случае CD4*-кле- ток) или по способности уничтожать мишени, имею- щие специфичные антигены (в случае СЭ8+-клеток). Кроме того, Т-клетки можно исследовать, измеряя их способность к пролиферации или продукции некото- рых цитокинов в ответ на действие Т-клеточных мито- генов, таких как ФГА и Кон А. 11. Моноклональные антитела являются высоко- специфичными реагентами, состоящими из гомоген- ной популяции антител, идентичных по специфично- сти к определенному эпитопу. ТЕСТЫ Выберите ОДИН НАИБОЛЕЕ ПРАВИЛЬНЫЙ ответ на каждый тест 1. Первичное взаимодействие антигенов с антите- лами включают все перечисленное, кроме: а) ковалентных связей; б) ван-дер-ваальсовых сил; в) гидрофобных связей; г) электростатических сил; д) точного соответствия между эпитопом и антите- лом. 2. Препарат антител IgG, специфичных к лизоциму куриного яйца, обработан папаином для образования Fab-фрагментов. Укажите, какое из следующих поло- жений, касающихся авидности этих фрагментов, спра- ведливо: а) они будут иметь более низкую авидность к ли- зоциму куриного яйца, чем интактный IgG; б) они будут иметь более высокую авидность к ли- зоциму, чем интактный IgG; в) они будут иметь такую же авидность к лизоци- му, как интактный IgG; г) они потеряют авидность для связи с лизоцимом; д) они будут иметь такую же авидность, но более низкую аффинность к лизоциму. 3. Исследование методом Вестерн блот образцов сывороток для определения присутствия антител к инфекционным агентам, таким как ВИЧ, особенно ши- роко используется в диагностике: а) потому что оно более чувствительно, чем ELISA; б) в нем могут быть обнаружены антитела ко мно- гим антигенным эпитопам;
100 ГЛАВА 5. ВЗАИМОДЕЙСТВИЯ АНТИГЕНОВ С АНТИТЕЛАМИ. ИММУНОЛОГИЧЕСКИЕ ИССЛЕДОВАНИЯ... в) оно обеспечивает количественный результат анализа образцов; г) оно позволяет тестировать несколько образцов одновременно; д) оно дешевле и отнимает меньше времени, чем ELISA. 4. Самое главное отличие трансгенных мышей и мышей с «нокаутными» генами в том: а) что у трансгенных мышей всегда используются клонированные гены, полученные от других видов; б) у трансгенных мышей чужеродные гены встраи- ваются в заданный локус путем гомологичной реком- бинации; в) у трансгенных мышей чужеродный ген, встроен- ный в их геном, функционирует; г) у мышей с «нокаутными» генами всегда уникаль- ный фенотип. 5. У ТКИД-мышей есть генетический дефект, кото- рый предотвращает развитие функционально зрелых: а) гемопоэтических клеток; б) В- и Т-клеток; в) Т- и NK-клеток; г) плюрипотентных стволовых клеток; д) миелоидных клеток. 6. Из приведенных утверждений, касающихся В-клеточных гибридом, ложным является следующее: а) они являются иммортализованными клеточными линиями, которые продуцируют антитела одной спе- цифичности; б) они происходят из В-клеток, которые сначала клонировали, а затем выращивали в краткосрочной клеточной культуре; в) они содержат большое ядро, образованное сли- янием двух ядер; г) они могут использоваться для производства диа- гностических или терапевтических моноклональных антител; д) они получаются при сплавлении В-клеток с трансформированными плазматическими клетками, которые неспособны секретировать иммуноглобулины. 7. Разрабатывается тест ELISA, направленный на обнаружение сывороточных антител к новому штамму патогенных бактерий. В начале моноклональные анти- тела, специфичные к одному из эпитопов этого орга- низма, были использованы как для придания специ- фичности (сенсибилизации) ячейкам пластикового планшета, так и в качестве меченных ферментами ан- тител при последующем двухслойном иммунофер- ментном анализе. Однако обнаружить антиген не уда- лось, несмотря на использование широкого спектра концентраций антител. Наиболее вероятная причина проблемы заключается в следующем: а) антиген, использованный в этом исследовании, слишком большой; б) у антител низкая аффинность к антигену; в) моноклональные антитела, использованные для сенсибилизации ячеек, блокируют доступ к эпитопу, поскольку те же антитела, меченные ферментами, не могут присоединиться к антигену; г) необходимо использовать вторые антитела, ме- ченные ферментами, не того изотипа, что использо- вались для сенсибилизации ячеек; д) вероятно, использованные моноклональные ан- титела нестабильны. ОТВЕТЫ НА ТЕСТЫ 1 — а. Ковалентные связи не используются при взаимодействии антитела и антигена. Связывающие силы относительно слабы. Это ван-дер-ваальсовы, гидрофобные и электростатические силы. Эпитоп и антитело должны точно соответствовать друг другу. 2 — а. Авидность — это общая энергия связи между антителом и поливалентным антигеном. По- скольку Fab-фрагменты моновалентны по сравнению со специфичной двухвалентной молекулой IgG (благо- даря присутствию двух Fab-фрагментов), авидность Fab-фрагмента будет меньше. Вариант «д» неверен, так как аффинность Fab-фрагментов будет такой же, как и Fab-фрагментов интактной молекулы IgG 3 — б. Исследование Вестерн блот использует методику электрофоретического разделения для опре- деления молекулярной массы данного антигена или выделения его из смеси антигенов. Поскольку гумо- ральный ответ на инфекционные агенты приводит к поликлональному ответу в силу сложности антигенных детерминант, экспрессируемых этим агентом, Вестерн блот может подтвердить наличие таких антител, кото- рые реагируют с электрофоретически разделенными антигенами известной молекулярной массы. 4 — в. Клонированные чужеродные гены того же или другого вида внедряют в мышей для получения трансгенной линии. Внедрение происходит рандомно и наблюдается как в соматических, так и в половых клетках. Вариант «г» неверен, поскольку иногда «нокаут- ные» мыши не имеют уникального фенотипа, связан- ного с заменой функционального гена на неработаю- щий, возможно, в связи с активностью компенсатор- ных механизмов. 5 — б. У ТКИД-мышей есть аутосомно-рецессив- ная мутация, вызывающая расстройство, при котором не созревают Т- и В-клетки. Как и у людей с таким заболеванием, у ТКИД-мышей нарушены лимфоци- тарные механизмы защиты. Плюрипотентные стволо- вые клетки, которые присутствуют у ТКИД-мышей, могут давать начало другим гемопоэтическим линиям, включая клетки миелоидного ряда и NK-клетки. 6 — 6. Метод, используемый для образования В-кле- точных гибридом, состоит в сплавлении В-клеток (на- пример, из селезенки или лимфатических узлов), по- лученных от иммунизированной мыши, с отобранной популяцией трансформированных плазматических клеток, не способных секретировать иммуноглобули- ны. Перед сплавлением с плазматическими клетками антигенспецифичные В-клетки не клонируют. 7 — в. При проведении двухслойного ферментного иммуносорбентного анализа (ELISA) антитела (часто моноклональные), использованные для покрытия яче- ек (первые), связываются с эпитопом, к которому они специфичны. В приведенном примере те же антитела, специфичные к тому же эпитопу, использованы также как меченные ферментом обнаруживающие (вторые) антитела. Первые моноклональные антитела блокиру- ют доступ к эпитопу тех же самых моноклональных антител, использованных второй раз, поэтому они не связываются.
Глава ГЕНЕТИЧЕСКАЯ ОСНОВА СТРУКТУРЫ АНТИТЕЛ ВВЕДЕНИЕ В предыдущих главах было описано огромное ко- личество вариантов иммунного ответа; при этом особое внимание уделялось разнообразию анти- тел — молекул иммуноглобулинов, которые явля- ются секретируемыми формами антигенспецифич- ных рецепторов, обнаруживаемых на отдельных В-лимфоцитах. Подсчитано, что количество Т- и В-клеток, обладающих разной антигенной специ- фичностью, которое может продуцировать отдель- ный организм, составляет от 1015 до 1018, т.е. каж- дый индивидуум способен вырабатывать от 1015 до 1018 различных молекул 1g или Т-клеточных ре- цепторов. Поскольку для геномов (наследуемые ДНК) многих видов организмов была определена последовательность генов, число которых соста- вило всего 30000 — 40000 единиц, возник вопрос: каким образом столь малое число генов обеспе- чивает существование такого большого числа раз- личных молекул антигенных рецепторов? В работах ряда ученых, выполненных за по- следние 30 лет, было доказано, что гены 1g и TCR для достижения уровня разнообразия, необходи- мого для иммунного ответа, используют уникаль- ную стратегию генных комбинаций. Первым клю- чевым открытием стало то, что вариабельные и константные области молекулы 1g кодируются разными генами. Оказалось, что многие разные гены вариабельной (V) области могут присоеди- няться к одному гену константной (С) области. Следующее решающее открытие сделал лауреат Нобелевской премии С.Тонегава (5. Tonegawa). Он показал, что гены антител способны перемещать- ся и реаранжировываться (перегруппировывать- ся) внутри генома дифференцирующейся клетки: ген V-области может находиться в одном поло- жении в ДНК на наследуемой хромосоме (состо- яние зародышевой линии), но затем во время диф- ференцировки лимфоцита перемещается в дру- гое место на хромосоме. Этот процесс реаранжи- ровки во время дифференцировки сводит вместе набор генов, кодирующих V- и С-области. Набор реаранжированных генов затем транскрибирует- ся и транслируется в законченную тяжелую (Н) или легкую (L) цепь. Дальнейшие исследования (детально обсужда- емые в гл. 8) показали, что гены TCR и механиз- мы, обеспечивающие разнообразие TCR, имеют много общих черт с генами 1g и механизмами, отвечающими за разнообразие молекул 1g. В на- стоящее время стратегии реаранжировки, исполь- зуемые для выработки антигенспецифичных ре- цепторов на Т- и В-клетках, считаются уникаль- ными для организма: не найдено других генов, проходящих реаранжировку. Далее в этой главе описано, как организованы гены 1g, как протека- ет процесс реаранжировки и как с использовани- ем небольшого числа генов может быть произве- дено огромное число полипептидных иммуногло- булинов. КРАТКОЕ ОПИСАНИЕ СТРУКТУРЫ И ЭКСПРЕССИИ НЕИММУНОГЛОБУЛИНОВЫХ ГЕНОВ Перед обсуждением молекулярной организации и реаранжировки генов, связанных с синтезом 1g, рассмотрим организацию и экспрессию неимму- ноглобулиновых генов. Обратим внимание на ком- поненты генов, кодирующих обычный белок, эк- спрессируемый на поверхности клетки, как пока- зано на рис. 6.1. • Геном (вся наследуемая ДНК) индивидуума состоит из линейных последовательностей — генов — в нитях ДНК различных хромосом.
102 ГЛАВА 6. ГЕНЕТИЧЕСКАЯ ОСНОВА СТРУКТУРЫ АНТИТЕЛ Интроны Лидер / Ъ/ | j [Экзон 1] [Экзон з[ [Экзон з] [Экзюн4] Геномная ДНК I Транскрипция Лидер ________ " ________ _________ 5 LJ Экзон! Экзон 2 Экзон 3 Экзон 4 [ з' Первичный транскрипт РНК Сплайсинг Лидер '' Экзон 11 Экзон 2[ Экзон з| Экзон 4 Зрелая иРНК Трансляция в белок Клеточная мембрана 'СООН Цитоплазматический «хвост» - экзон 4 Трансмембранный сегмент (экзон 3) Домен 2 (экзон 2) Домен 1 (экзон 1) NH2 Рис. 6.1. Прототипный ген, кодирующий трансмембранный белок Ген транскрибируется в РНК, а РНК транс- лируется в белок. • Все диплоидные клетки в человеческом орга- низме содержат одинаковый набор генов. Един- ственное исключение — лимфоциты, которые, если говорить вкратце, отличаются от других клеток и друг от друга по состоянию генов, кодирующих их антигенспецифичного рецеп- тора. Клетки в пределах одного организма от- личаются друг от друга, потому что они транс- крибируют и транслируют разные гены. Гово- рят, что эти клетки экспрессируют разные структуры генов. • Экспрессия специфических структур генов определяет функцию клетки. Например, хотя каждая клетка содержит ген инсулина, экс- прессируют его только панкреатические р-клет- ки, что позволяет им производить инсулин Точно так же все клетки содержат гены 1g, од- нако только В-лимфоциты (и их дифференци- рованная форма — плазматические клетки) эк- спрессируют гены 1g и соответственно синте- зируют молекулы 1g. Подобно всем другим клеткам, кроме В-клеток, Т-клетки содержат гены [g, но не экспрессируют их. Контроль экспрессии гена осуществляется на многих уровнях, включая действие транскрип- ционных факторов (белков, которые иницииру- ют или модулируют транскрипцию, обычно свя- зываясь с регуляторными последовательностями ДНК вблизи 5'-концевого участка генов), а так- же скорость транскрипции и период полураспа- да информационной (матричной) РНК. Пони- мание механизмов, которые регулируют экспрес- сию гена, в частности то, каким образом гены «включаются» и «выключаются» в клетках, — исключительно важно для современных научных исследований. • Большинство генов, кодирующих белок, име- ет характерные структуры — экзоны и интро- ны. Экзоны представляют собой последователь- ности пар оснований, которые затем траскри- бируются в зрелую иРНК. Они отделены друг от друга интронами — некодирующими участ- ками пар оснований. • Когда ген транскрибируется в РНК, весь учас- ток ДНК (экзоны плюс интроны) транскриби- руется в первичный траскрипт РНК. Фермен- ты изменяют этот первичный транскрипт РНК путем сплайсинга, при котором удаляются не- кодирующие интроны и соединяются вместе все кодирующие экзоны. Таким образом, пос- ле процессирования получается сегмент зре- лой иРНК, который намного короче, чем пер- воначальный транскрипт. Эта иРНК трансли- руется с образованием белка на рибосомах. Экзон обычно кодирует дискретную область белка (см. рис. 6.1), такую как внеклеточный домен, трансмембранный участок, или цито- плазматический сегмент. Таким образом, бел- ки составляются путем группирования вместе многочисленных функциональных участков, причем каждый участок кодируется отдельным генным сегментом.
ГЕНЕТИЧЕСКИЕ ИЗМЕНЕНИЯ ПРИ СИНТЕЗЕ ЦЕПЕЙ 1g 103 • Гены, кодирующие белки, экспрессированные на клеточной поверхности, имеют лидерную последовательность (L-экзон) на 5'-конце. Она кодирует последовательность — сигнальный пеп- тид — состоящую примерно из 10 аминокислот (в основном гидрофобных) на амино(ЪШ2— )- концевом отрезке белка. Когда иРНК для бел- ка, ассоциированного с мембраной, трансли- руется на рибосомы, этот сигнальный пептид направляет синтез полипептидной цепи в эн- доплазматический ретикулум. Образующаяся полипептидная цепь подается от рибосом внутрь эндоплазматического ретикулума, где сигнальный пептид отщепляется. Вновь син- тезированный белок движется от эндоплаз- матического ретикулума в комплекс Гольджи, а затем к клеточной мембране. На рис. 6.1 изображена поверхностная моле- кула с аминоконцевым отрезком и двумя внекле- точными доменами, одной трансмембранной об- ластью и большой карбокситерминальной об- ластью внутри клетки. Структура молекулы мембранного 1g, экспрес- сированной на поверхности В-клетки, имеет не- которое сходство со структурой молекулы, пред- ставленной на рис. 6.1, в частности это касается внеклеточных N-терминальных доменов и транс- мембранной области. Мембранный иммуноглобулин также суще- ственно отличается от структуры изображенной молекулы. Во-первых, 1g представляет собой че- тырехцепочечный гликопротеин. Чтобы получить полную молекулу 1g, вновь синтезированные от- дельные Н- и L-цепи должны быть собраны и гли- колизированы внутри клетки прежде, чем четы- рехцепочечная молекула достигнет клеточной по- верхности. Во-вторых, каждая цепь 1g имеет очень короткий цитоплазматический концевой сегмент (хвост). Другие молекулы, участвующие в иммунном ответе и экспрессирующиеся на клеточной поверх- ности, имеют различную конфигурацию, напри- мер С-конец расположен внеклеточно, a N-ko- нец — внутриклеточно. Еще одни мембранные мо- лекулы, как, например, CD81, экспрессируемый на В-клетках, образуют многочисленные петли, про- ходящие через мембрану (см. гл. 7 и 10). Третьи, например антиген, ассоциированный с функцией лейкоцитов (LFA-1, CD58), и регуляторный бе- лок системы комплемента (ФУД; CD55), полно- стью внеклеточны, но сцеплены с поверхностью клетки посредством ковалентной связи с олиго- сахаридом, который в свою очередь связан с од- ним из мембранных фосфолипидов — фосфати- дилинозитолом. Таким образом, подобные молекулы считаются мембранными молекулами, сцепленными с гли- козилфосфатидилинозитолом (ГФИ). (Функции CD58 и CD55 рассматриваются соответственно в гл. 10 и 13.) • ГЕНЕТИЧЕСКИЕ ИЗМЕНЕНИЯ ПРИ СИНТЕЗЕ ЦЕПЕЙ 1д Организация и реаранжировка генов легкой цепи Как было показано в гл. 4, каждый к- и ^-поли- пептид L-цепи состоит из двух главных доменов, вариабельной и константной областей (VL и CL). При этом VL является аминоконцевой частью лег- кой цепи, состоящей из примерно 108 аминокис- лотных остатков. Она кодируется двумя отдель- ными сегментами гена', вариабельным (V) сегмен- том, кодирующим 95 аминокислотных остатков, и небольшим соединительным (J) сегментом, ко- дирующим приблизительно 13 остатков (96— 108) на карбокситерминальном конце вариабельной области. Один V-генный и один J-генный сегмен- ты собираются вместе в геноме, чтобы образо- вать генную структуру, которая вместе с геном С-области кодирует всю L-цепь иммуноглобули- на. Этот уникальный механизм реаранжировки генов, называемый У(В^-рекомбинацией (D-сег- менты рассматриваются далее в подразделе, ка- сающемся генов Н-цепей), используется только генами, кодирующими L- и Н-цепи иммуногло- булина и TCR. В настоящее время только начинают понимать сложную, строго регулируемую последователь- ность молекулярных событий, происходящих при реаранжировке. Однако известно, что дефект в этом механизме или регуляции У(ОД-рекомби- наций может привести к заболеванию (см. гл. 17). Многие этапы реаранжировки для В- и Т-клеток оказались одинаковыми. Ферментный комплекс, называемый V(D)J-peKOM6una3o6, опосредует ре- аранжировку рецепторных генов в В- и Т-клетках. Продукты двух генов, RAG-1 и RAG-2 (recombi- nation-activating genes — гены, активирующие ре- комбинацию), важны, как свидетельствует их на- звание, для инициирования рекомбинаций в лим- фоидных клетках-предшественниках. Белки RAG-1 и RAG-2 необходимы на начальных стадиях вы- резания ДНК в локусах 1g и TCR: у мышей, не имеющих одного из этих генов («RAG-нокаутные» мыши), обычно не развиваются В- и Т-клетки. Хотя У(ОД-рекомбиназа имеется во всех клетках и вовлечена в восстановление цепей ДНК, про- дукты генов RAG-1 и RAG-2 экспрессируются исключительно в лимфоцитах. Синтез к-цепи Сначала рассмотрим синтез легких цепей. На рис. 6.2 представлен ряд генов человека, кодирующих те из цепей, которые отнесены к к-локусу, распо- ложенному на хромосоме 2. Генетический анализ показывает, что существует следующая компонов- ка (аранжировка) к-генов в зародышевой линии, т.е. в любой клетке организма: приблизительно
104 ГЛАВА 6. ГЕНЕТИЧЕСКАЯ ОСНОВА СТРУКТУРЫ АНТИТЕЛ ДНК зародышевой линии (переаранжированная) ДНК В-клетки (реаранжированная) Первичный транскрипт РНК Зрелая иРНК Полипептид к-цепи 40 разных Ук-генов, каждый из которых может ко- дировать 95 N-концевых аминокислот вариабель- ной к-области, расположены линейно, каждый со своей собственной лидерной (L) последователь- ностью, и разделяются интронами, как это пока- зано на рис. 6.2 (для упрощения лидерные после- довательности на рисунке не показаны). Группа из пяти 1к-генных сегментов располагается ниже (т.е. 3'). Каждый Зк-генный сегмент может коди- ровать оставшиеся 13 аминокислотных остатков (96—108) вариабельной к-области. Длинный ин- трон отделяет Ск-генный сегмент (ген, кодирую- щий один константный участок к-цепи) от JK-reH- ных сегментов. Для получения к-цепи недифференцированная клетка В-лимфоцитарной линии выбирает один из Ук-генов из своей ДНК и соединяет его (физи- чески) с одним из Зк-сегментов (на рис. 6.2 V2 реаранжируется к J4). Как происходит этот выбор V- и J-генов, неизвестно, но, возможно, это слу- чайный процесс. Объединение предполагает сцеп- ление последовательностей распознавания, нахо- дящихся на концах всех генов (как 1g, так и TCR), которые используют реаранжируемые генные сегменты при образовании полипептидов. На рис. 6.3 эта реаранжировка V2 к J4 представлена более детально. Заметим, что ДНК в этой клетке все еще содержит переаранжированные генные сегменты V! и J5. Во время реаранжировки в боль- шинстве случаев ДНК, расположенная между со- единяемыми сегментами, собирается в петлю, вырезается и в конце концов разрушается. На рис. 6.2 также показано, что после того как клетка В-клеточной линии реаранжирует свою ДНК, она создает первичный транскрипт РНК. Затем происходит сплайсинг этого транс- крипта с целью удаления всех промежуточных некодирующих последовательностей, в результате чего экзоны VK, JK и Ск собираются вместе в зре- лой иРНК. В шероховатом эндоплазматическом ретикулуме лидерная последовательность отщеп- ляется, и иРНК транслируется в к-полипептид- ную цепь. Эта к-цепь движется в просвет эндо- плазматического ретикулума, где может объеди- няться с вновь синтезированной Н-цепью и об- разовывать молекулу 1g. Синтез к-цепи У человека Х-гены расположены на хромосоме 22, т.е. на хромосоме, далекой от генов к- и Н-не- пей. Синтез Х-цепей аналогичен в основном син- тезу к-цепей в том отношении, что он включает реаранжировку ДНК, которая объединяет Ух-ген У(Б)3-рекомбиназа 3' ДНК зародышевой линии 3' Реаранжированная ДНК • Рис. 6.3. Реаранжировка ДНК, кодирующей легкую к-цепь
ГЕНЕТИЧЕСКИЕ ИЗМЕНЕНИЯ ПРИ СИНТЕЗЕ ЦЕПЕЙ 1g 105 (кодирующий N-концевую область X-вариабель- ной области) с Jx-сегментом (кодирующим осталь- ные 13 аминокислот Х-вариабельной области). У лю- дей Х-локус включает примерно 40 Vx- и четыре Jx-гена, которые, как известно, являются функ- циональными. Зх-сегмент также содержит после- довательности, называемые псевдогенами, — длин- ные отрезки ДНК с некоторым дефектом, кото- рый предотвращает их транскрипцию или транс- ляцию. Организация локуса Х-гена несколько от- личается от организации локуса к-гена, содержа- щего только один Ск-ген. В противоположность ему каждый J^-сегмент ассоциируется со своим Сх-геном. Таким образом, у человека есть четыре разных вида Сх-полипептидов. Организация и реаранжировка генов тяжелой цепи Гены Н-цепи находятся на хромосоме, располо- женной далеко от любой L-цепи (у человека на хромосоме 14). На рис. 6.4 представлена органи- зация генов, кодирующих Н-цепь. Можно видеть сходство и отличия этого локуса от локусов L-цепи. В противоположность вариабельной области лег- кой цепи, состоящей из двух генных сегментов, вариабельная область тяжелой цепи состоит из трех генных сегментов (Кя, DH и /я). Таким обра- зом, помимо V- и J-сегментов гены, кодирующие вариабельный участок Н-цепи, используют также сегмент разнообразия (diversity), или D-сегмент. D- и J-сегменты кодируют аминокислотные после- довательности в третьей гипервариабелъной облас- ти. или области, определяющей комплементар- ность (CDR3) тяжелой цепи (см. гл. 4). На рис. 6.4 показано, что локус Н-цепи человека включает приблизительно 50 Ун-генов, примерно 20 DH- генных и шесть Зн-генных сегментов. Второй важной особенностью генов Н-цепи является наличие в зародышевой линии большо- го количества генов, кодирующих С-область 1g. Как описано в гл. 4, С-область определяет класс и, следовательно, биологическую функцию каж- дого антитела. С-гены, каждый из которых флан- кирован с двух сторон интронами, отделяются от Ун-генов крупным интроном. На рис. 6.4 показан порядок расположения С-генов у человека. Ближе всего к генам V-области находятся такие С-гены, как ц и 8, которые в процессе развития В-клетки считываются первыми. При синтезе тяжелой цепи используются те же механизмы реаранжировки, что и у легких цепей, а именно: для проведения процесса соединения разных генных сегментов используется V(D)J-pe- комбиназа. На ранних стадиях существования оп- ределенной В-клетки должны происходить две ре- аранжировки ДНК зародышевой линии. В ходе первой один D-сегмент устанавливается рядом с одним J-сегментом. В ходе второй один V-cer- мент устанавливается рядом с DJ-структурой (V2D2J5 на рис. 6.4), что создает антигенную спе- цифичность Н-цепи. Затем реаранжированная ДНК считывается вместе с ближайшими генами С-участка: ц и 8. Этот первичный транскрипт может подвергаться сплайсингу в двух направле- ниях (альтернативный сплайсинг) и формировать соответственно или VDJ-p-, или VDJ-8-иРНК Затем эти две иРНК могут транслироваться в ше- роховатый эндоплазматический ретикулум и оп- ределять синтез или ц-, или 8-полипептидов. Та- ким образом, одна покоящаяся В-клетка может экспрессировать одновременно как ц-, так и 8- тяжелые цепи, имеющие идентичную антигенную специфичность. Альтернативный сплайсинг первичного транс- крипта тяжелой цепи также позволяет получать мембранные и секреторные формы полипептидов ।—VH(n~50)—। ।—Бн(п~20)—। ।—JH(1 6)—। Гены С-области Ыл vn d2i [pn| щ EK1И И И И E Ы | Реаранжировка 5' |у2|Рг|j5|Ы И±300Е10НВЕ1 1 Транскрипция у ДНК зародышевой линии (неаранжи- рованная) , ДНК В-клеток 3 (реаранжированная) Первичный транскрипт РНК • Рис. 6.4. Генетические изме- нения, приводящие к синтезу тяжелой цепи у человека Зрелая иРНК Полипептид тяжелой цепи
106 ГЛАВА 6. ГЕНЕТИЧЕСКАЯ ОСНОВА СТРУКТУРЫ АНТИТЕЛ тяжелой цепи. Два дополнительных экзона (не представленные на рис. 6.4) находятся на З'-кон- це каждого Сн-гена, например, один из этих эк- зонов кодирует трансмембранный и цитоплазма- тический концевой участок мембранной формы молекулы, в то время как другой — С-терминаль- ный конец секреторной формы молекулы. Оба экзона транскрибируются и входят в состав пер- вичного транскрипта, но один из них вырезается из него. Это приводит к образованию ряда иРНК, которые транслируют или в мембранную, или сек- реторную форму полипептида тяжелой цепи Регуляция экспресии генов lg Теоретически у любой В-клетки есть много генов, из которых можно выбрать гены для синтеза моле- кулы 1g: множество V-, D- и J-генов для образова- ния вариабельных областей и разных генов для лег- ких к- и Х-цепей. Фактически же каждая В-клетка использует только один набор VDJ-генов и один тип легкой цепи. В результате одна В-клетка продуци- рует Ig только одной антигенной специфичности. Более того, В-клетка имеет два набора хромо- сом, по одному от каждого родителя, так что тео- ретически гены Ig, находящиеся на обеих хромо- сомах, могли бы синтезировать молекулы Ig. Но этого не происходит. В отличие от почти всех других генных продуктов, которые производятся на основе генов обеих родительских хромосом, Ig-цепи кодирует только один комплект генов или с материнской, или с отцовской хромосомы. На- пример, Н-цепь может кодироваться генами от- цовской хромосомы, а L-цепь (к- или Х-) — мате- ринской. Этот феномен использования генов толь- ко одной родительской хромосомы называется аллельным исключением. Все этапы реаранжировки, аллельное исклю- чение и, следовательно, синтез полной молекулы Ig жестко контролируются, хотя все контролиру- ющие механизмы еще не полностью изучены. Если происходит успешная или продуктивная реаран- жировка V-, D- и J-генов на одной родительской хромосоме и образуется полипептид тяжелой цепи, то на другой родительской хромосоме реаранжи- ровка тяжелой цепи прекращается под влиянием некоего супрессивного механизма. Если попытка реаранжировки V-, D- и J-генов на первой роди- тельской хромосоме оказывается неудачной (т.е. не приводит к образованию полипептидной цепи), то реаранжировка Н-цепи продолжается на вто- рой родительской хромосоме. Такой же процесс затем происходит и с L-пепью: сначала с генами к-цепи, а затем Х-цепи. Продуктивная реаранжи- ровка, вызванная присоединением V-сегмента к J-сегменту одного из этих генов, заставляет дру- гие генные сегменты оставаться в форме зароды- шевой линии. Так клетка проходит через некото- рые или все этапы, на которых происходит копи- рование хромосомного материала до тех пор, пока успешно не завершится продуктивная реаранжи- ровка генов для одной Н- или L-цепи. Эти цепи определяют специфичности антител, представля- емых данной клеткой. Можно сделать вывод, что в В-клетке функцио- нально экспрессируются только одна Н- и одна L-цепи, несмотря на то что каждая В-клетка со- держит две хромосомы (от отца и матери), кото- рые могли бы кодировать тяжелую цепь, и две хромосомы, которые могли бы кодировать лег- кую цепь. Этот механизм генного исключения гарантирует моноспецифичность, т.е. специфич- ность каждой В-клетки и синтезируемых ею ан- тител только к одному эпитопу. Таким образом В-клетка защищается от образования и экспрес- сии на ее клеточной поверхности молекул Ig с разной антигенной специфичностью. • ПЕРЕКЛЮЧЕНИЕ КЛАССА ИЛИ ИЗОТИПА Как было описано ранее, одна В-клетка создает антитела только одной специфичности, которая определяется природой произошедших VJ- (L-цепь) и VDJ-реаранжировок (Н-цепь). Эти реаранжиров- ки происходят в отсутствие антигена на ранних стадиях В-клеточной дифференцировки. Уже было описано, как одна и та же В-клетка может синте- зировать IgM и IgD с одинаковой антигенной спе- цифичностью. Далее будет продемонстрировано, как В-лимфоцит может переключаться на созда- ние антител другого класса, таких как IgG, IgE и IgA. Это явление носит название переключение клас- са или изотипа. Переключение класса приводит к изменению эффекторной функции В-клетки, но не меняет ее антигенную специфичность. Переключение класса происходит в стимули- рованных антигеном зрелых В-клетках, синтези- рующих IgM и IgD (обсуждается в гл. 7). Этот процесс связан с дальнейшей реаранжировкой ДНК, в результате которой VDJ-гены присоеди- няются к другому гену С-области тяжелой цепи (рис. 6.5). Помимо антигенного действия пере- ключение класса зависит от присутствия таких известных факторов, как цитокины, высвобожда- емые Т-клетками (см. далее и гл. 10 и 11). В-клет- ки при отсутствии Т-клеточных цитокинов почти или вообще не переключают изотипы. Цитокины, влияющие на переключение клас- са, вызывают дальнейшую реаранжировку ДНК В-клеток и переключение на другие классы Ig, С-генные сегменты которых расположены далее (например, к IgG4 или IgE). Таким образом, каж- дая В-клетка, имеющая уникальную специфич- ность, способна продуцировать антитела всех воз- можных классов в зависимости от переключений, возникающих в ДНК, кодирующей ее Н-цепь. Механизм, посредством которого В-клетки подвергаются переключению класса, представлен
ОБЕСПЕЧЕНИЕ РАЗНООБРАЗИЯ АНТИТЕЛ 107 ------------- Гены С-области---------------► Переключение класса под влиянием Т-клеток 3' ДНК В-клетки ДНК В-клетки после переключения класса | Транскрипция ПГП з' Первичный транскрипт РНК Сплайсинг |V2|P2| J5| У1| иРНК для тяжелой У!-цепи • Рис. 6.5. Механизм переключения класса при синтезе 1g Область переключения, располо- женная перед константной областью тяжелой цепи, обозначена буквой S на рис. 6.5. К 5'-концу каждой С-области (Сн-гена) кроме С§ прилежит один из участков, состоящий из повторяющихся последовательностей основа- ний, называемый областью переключения (switch region — S-область). Эта область переключения позволяет Сн-генам (за исключением С6) присо- единяться к VDJ-структуре. На рисунке представ- лены только Сн-гены уь у3 и а2, но могут ис- пользоваться и другие. Под влиянием стимули- рующего воздействия антигенов и Т-клеточных цитокинов В-клетка с VDJ-структурой, связан- ной с Сц и С8, реаранжирует далее свою ДНК, чтобы произошло сцепление VDJ с областью пе- реключения перед Сн-областью другого гена (на рис. 6.5 это у]). После образования первичного РНК-транскрипта с реаранжированной ДНК про- исходит сплайсинг интронов с появлением иРНК, кодирующей Н-цепь IgG]. При этом удаляется РНК, разделяющая С-области. Таким образом, на данной стадии клетка теряет способность про- дуцировать антитела того класса, гены С-облас- ти которых утрачены (в данном примере IgM, IgD или IgG3). Переключение класса представляет собой ме- ханизм, уникальный для Н-цепей 1g в В-клетках. Он позволяет антителу с определенной антиген- ной специфичностью ассоциироваться с разны- ми цепями, имеющими другую константную об- ласть, и тем самым приобретать другие эффек- торные функции. Например, VDJ-структура ан- тител, специфичная в отношении какого-либо бактериального антигена, может присоединиться к Су-гену и образовывать молекулу IgG. Эти ан- титела IgG взаимодействуют с такими клетками как макрофаги, которые экспрессируют рецепто- ры для Fcy. Или та же VDJ-структура может при- соединиться к Се и образовывать молекулу IgE Антитела IgE взаимодействуют с тучными клет- ки, экспрессирующими рецепторы для Fce. Цитокины, присутствующие при активации В-клеток антигеном, играют ключевую роль в вы- боре Сн-гена во время переключения изотипа Например, в присутствии цитокина IFNy В-клет- ка может реаранжировать VDJ-структуру к СУ2-тя- желой цепи, и клетка переключается на синтез IgG2. И наоборот, в присутствии цитокина IL-4 В-клетка может реаранжировать VDJ к СУ4 или СЕ, и тогда клетка переключается соответствен- но на синтез IgG4 или IgE. Полагают, что каж- дый цитокин ослабляет структуру двойной спи- рали ДНК только в определенных точках вдоль локуса 1g, позволяя тем самым ферменту, назы- ваемому переключающей (switch) рекомбиназой. распознавать ДНК, кодирующую специфические С-области. ОБЕСПЕЧЕНИЕ РАЗНООБРАЗИЯ АНТИТЕЛ До сих пор описывались уникальные генетиче- ские механизмы, участвующие в формировании совокупности чрезвычайно разнообразных анти- тел, способных противостоять множеству антиге- нов без того, чтобы задействовать слишком боль- шой участок ДНК. Однако разнообразие антител достигается и с помощью других механизмов. Не- которые из них рассмотрены далее. Наличие множества V-генов в зародышевой линии На основе количества разных генов для V-обла- сти в зародышевой линии определяется минималь- ное количество разных антител, которые могут быть продуцированы.
108 ГЛАВА 6. ГЕНЕТИЧЕСКАЯ ОСНОВА СТРУКТУРЫ АНТИТЕЛ VJ- и VDJ-комбинаторная ассоциация Как уже было указано, может произойти ассо- циация любого V-сегмента с любым J-сегментом гена, в результате чего образуется вариабельная область L-цепи. Аналогичным образом при ген- ной реаранжировке Н-цепи любой V-сегмент гена может ассоциироваться с любым D- или J-сег- ментом гена. Все эти отдельные сегменты уча- ствуют в создании структуры вариабельной об- ласти. Так как имеются примерно 40 VK- и пять 1к-генов, кодирующих вариабельную область к-цепи (предполагается случайная ассоциация), то могут образовываться 40-5, т.е. 200 к-цепей. При 40 Vx- и четырех J^-генах может появиться 160 Х-цепей. Аналогичным образом при наличии примерно 50 V-генов, 20 D-генов и шести J-генов, которые могут кодировать вариабельную область Н-цепи и также ассоциироваться в любую ком- бинацию, возникает 50-20-6, т.е. 6000 разных тя- желых цепей. Случайный выбор тяжелых и легких цепей Помимо разнообразия, достигаемого VJ- и VDJ- комбинаторными ассоциациями, любая Н-цепь может ассоциироваться с любой L-цепью. Таким образом, если любая Н-цепь ассоциируется с лю- бой к- или Х-цепью, то могут возникать 1,2х хЮ6 (200 -6000) разных к-содержащих молекул 1g и 0,96 -106 (160 -6000) Х-содержащих молекул из всего 165 различных генов (сумма всех Н-, к- и Х-сегментов)! Из этого видно, как с помощью ог- раниченного числа генов можно получить огром- ное количество разных антител. Разнообразие межсегментных соединений и вставки нуклеотидов Точные позиции, в которых происходит слияние V- и J-сегментов генов (или V-, D-, и J-), не яв- ляются постоянными, и неточная рекомбинация ДНК может привести к изменениям состава ами- нокислот в местах этих соединений. Из-за неточ- ности при соединении реаранжированной ДНК происходят делении или изменения в аминокис- лотных остатках (так называемое разнообразие меж- сегментных соединений), которые влияют на анти- генсвязывающий участок, поскольку составляют ту часть гипервариабельной области, которая опре- деляет комплементарность к антигену. Кроме того, небольшое количество нуклеотидов могут встав- ляться в месте соединения V—D и D—J (вста- вочное разнообразие). Основной механизм, при- водящий к вставке нуклеотидов в последователь- ность ДНК, определяется участием фермента тер- минальной дезоксинуклеотидилтрансферазы (TdT). Появляющееся дополнительное разнообразие на- зывается вариабельностью N-области Соматический гипермутагенез Разнообразие антител, продуцируемых популяци- ей В-клеток, также увеличивают мутации, проис- ходящие в V-генах тяжелых и/или легких цепей в период существования В-клетки. Обычно антите- ла низкой аффинности образуются при первич- ном ответе на антиген. Секвенирование (опреде- ление последовательности) ДНК и полипептидов антител, образующихся при первичном ответе, показывает, что эти последовательности сопоста- вимы с последовательностями, которые закоди- рованы в ДНК зародышевой линии. Однако по мере «созревания» ответа, особенно после вторич- ного антигенного стимула, аффинность синтези- рованных антител в отношении антигена возра- стает, а аминокислотные последовательности этих антител отличаются от тех, которые кодированы в ДНК зародышевой линии. Эта дивергенция является в основном резуль- татом точечных мутаций в рекомбинированной VDJ-структуре V-генов антител, которые приво- дят к изменению отдельных аминокислот. Это явление называют соматическим гипермутагене- зом. поскольку мутации здесь происходят с час- тотой по крайней мере в 10000 раз большей, чем обычная частота мутации. Соматический гипер- мутагенез приводит к повышению аффинности антител к антигену при вторичном ответе. Как следствие этой тонкой настройки иммунного от- вета соматический гипермутагенез увеличивает разнообразие антител, продуцируемых В-клетка- ми. Согласно имеющимся данным соматический гипермутагенез происходит в течение короткого промежутка времени, а именно периода после антигенной стимуляции, который протекает в за- родышевых центрах селезенки и лимфатических узлов (см. гл. 7). Конверсия соматических генов Из исследований, проводимых на мышиных и человеческих В-клетках, известно, что разнооб- разие 1g обусловлено VDJ-рекомбинацией и то- чечными соматическими мутациями. Однако в последующих исследованиях на других видах (чаще на птицах и кроликах) было обнаружено, что у этих животных для получения разной В- клеточной специфичности задействован механизм, называемый конверсией соматических генов. Эта конверсия включает неэквивалентный обмен по- следовательностями между генами: часть донор- ского гена или генов «копируется» в акцептор- ном гене, но изменяется только этот акцептор- ный ген. Точный механизм, посредством которо- го это происходит, в настоящее время неизвестен
ОБЕСПЕЧЕНИЕ РАЗНООБРАЗИЯ АНТИТЕЛ 109 Около 20 Функциональные псевдогенов генные сегменты У(Б)1-реаранжировка V D J ДНК зародышевой линии • Рис. 6.6. Конверсия соматических генов приводит к появлению разнообразия генов Ig у некоторых видов. На рисунке представ- лен феномен, наблюдаемый в локусе тяже- лой цепи иммуноглобулина цыпленка: ко- роткие последовательности ДНК из одного или нескольких псевдогенов (на рисунке - 3 и 8) копируются в реаранжированную В-клеточную VDJ-структуру В-клеточная ДНК Конверсия соматических генов В-клеточная ДНК На рис. 6.6 представлен локус Н-цепи цыпленка, включающий один функциональный Ун-ген, ко- торый реаранжируется во всех В-клетках, и при- мерно 20 дефектных Ун-генов (псевдогенов), ко- торые не способны к реаранжировке. На нижней части рисунка показано, что в данной определен- ной клетке для придания разнообразия структуре вариабельного гена в реаранжированный VDJ-ген включаются две короткие последовательности из псевдогена 3 и одна — из псевдогена 8. Конвер- сия соматических генов может также придавать разнообразие легким цепям У многих видов, исключая человека и мышь, получение разнообразия в рамках первичного ре- пертуара Ig основывается на конверсии сома- тических генов и соматическом гипермутагенезе, т.е. оно происходит до антигенной стимуляции. Например, у цыплят конверсия соматических ге- нов — основной механизм формирования пер- вичного репертуара, в то время как у овец для этого используется соматический гипермутаге- нез. У других видов животных, например кроли- ков, крупного рогатого скота и свиней, для дос- тижения первичного разнообразия Ig использует- ся очень ограниченное число VDJ-рекомбинаций, а также конверсия соматических генов и сомати- ческий гипермутагенез. Редактирование рецепторов При некоторых обстоятельствах в клетке В-кле- точной линии может происходить повторная реа- ранжировка вариабельных генных сегментов лег- кой цепи после того, как уже была сформирована рекомбинированная VJ-структура. Этот процесс называется редактированием рецепторов (описан в гл. 7). Механизм редактирования можно понять, рассмотрев рис. 6.3. Реаранжированная ДНК от- дельной В-клетки содержит неаранжированные элементы V] и J5, которые могут использоваться при повторной реаранжировке Редактирование рецептора может происходить, когда В-клетка с рецептором, специфичным в отношении аутоан- тигена, взаимодействует с ним. Одним из резуль- татов этого взаимодействия является повторная реаранжировка V- и J-генов В-клетки, которая мо- жет приводить к образованию VJ-распознающей структуры, специфичной скорее для чужеродно- го, чем для собственного антигена. Следователь- но, редактирование рецептора может повысить разнообразие общего ответа на чужеродные анти- гены. Все указанные механизмы способствуют фор- мированию огромной библиотеки или репертуа- ра В-лимфопитов, содержащего все «специфич- ности», необходимые для того, чтобы иметь дело с огромным количеством разнообразных эпито- пов. Достигаемое разнообразие в специфичности Ig у индивидуума составляет порядка 1015, при- чем оно может возрастать за счет соматического гипермутагенеза. РЕЗЮМЕ 1. Каждый индивидуум синтезирует огромное ко- личество различных молекул Ig, каждая из которых может действовать в качестве рецептора на поверх- ности В-клетки, специфичной для определенного эпитопа. 2. Вариабельная область Н-цепи в молекуле Ig ко- дируется тремя отдельными генами, называемыми VH-, DH- и Зн-генными сегментами. Отдельный генный сегмент кодирует константную область тяжелой цепи Сн- Вариабельная область L-цепи кодируется двумя генными сегментами VL и JL, отличными от сегментов, используемых для синтеза тяжелой цепи. В каждой клетке организма ДНК (зародышевая линия) содержит множество V-, D- и J-генных сегментов для синтеза Н- и L-цепей Ig. 3. В ходе дифференцировки В-клетки происходит реаранжировка ДНК тяжелой цепи, при которой один \/н-сегмент соединяется с одним DH- и одним JH-cer- ментом. Объединенная VDJ-структура кодирует всю вариабельную область тяжелой цепи. Такие реаран- жировки гена передвигают VDJ-структуру ближе к ге- нам константной области Н-цепи, т.е. См и Cs. 4. Тот же вид реаранжировок приводит к образо- ванию генной структуры, кодирующую всю V-область легкой цепи Ig. Один VL-cerMeHT гена соединяется с од-
110 ГЛАВА 6. ГЕНЕТИЧЕСКАЯ ОСНОВА СТРУКТУРЫ АНТИТЕЛ ним Зь-сегментом, в результате чего VJ-структура располагается рядом с геном константной области легкой цепи. В В-клетке, коммитированной к созда- нию к-цепи, VKJK-структура перемещается ближе к Ск- гену, а в В-клетке, коммитированной к образованию Х-цепи, V^J^-структура располагается ближе к Сх-гену. 5. Первичные транскрипты РНК образуются на ре- аранжированной ДНК. Из первичного транскрипта удаляется некодирующая РНК (сплайсинг). В резуль- тате возникает иРНК для L- и Н-цепей, которая затем транслируется в L- и Н-цепи IgM и IgD. 6. В В-клетке Н-цепь кодируется собственными генными сегментами, находящимися на материнской или отцовской хромосоме. Легкая цепь также кодиру- ется своими сегментами гена, находящимися на той или иной хромосоме. Благодаря этому феномену (ал- лельному исключению) одна В-клетка продуцирует lg только одной антигенной специфичности. 7. После антигенной стимуляции В-клетка может далее реаранжировать свою ДНК Н-цепи. VDJ-струк- тура, которая соединяется с Сц- и С§-генами, может реаранжироваться для соединения с другим геном С-области, таким как Су, Са или Се. Этот феномен на- зывается переключением класса. В результате В- клетка, синтезирующая IgM и IgD, теперь может син- тезировать антитела иного изотипа (IgG, IgA или IgE), но с той же антигенной специфичностью. 8. Разнообразие специфичностей антител достига- ется: • множеством наследуемых генов для V-областей L- и Н-цепей; • реаранжировкой V-, D- и J-сегментов в разных комбинациях и случайным набором Н- и L-цепей; • разнообразием соединений и вставок, формиру- ющихся при соединении V-, D- и J-генных сегментов; • соматическим гипермутагенезом, который впер- вые встречается после антигенной стимуляции и при- водит к отбору мутаций, придающих антителам более высокую аффинность к антигену; • конверсией соматических генов у разных видов, исключая человека и мышь. Короткие последователь- ности ДНК из неаранжированных генов копируются в реаранжированную VDJ-генную структуру. Эти механизмы позволяют с помощью неболь- шого числа генов сформировать огромное количе- ство молекул антител разной антигенной специфич- ности. ТЕСТЫ Выберите ОДИН НАИБОЛЕЕ ПРАВИЛЬНЫЙ ответ на каждый тест. 1. В В-клетке, продуцирующей 1дС2-антитела к дифтерийному анатоксину, ДНК для Н-цепи имеет следующую структуру: 5'-V17 D5J2 СУ2-СУ4-Се-Са2-3'. Для перехода от эмбриональной ДНК к ДНК этой В-клетки требуется следующее число отдельных реаранжи- ровок: а) 1; б) 2; в) 3; г) 4; д) ни одной. 2. Если бы было 50 V-, 20 D- и шесть J-сегментов, способных кодировать тяжелую цепь, и 40 V- и пять J-генов, способных кодировать легкую цепь, можно было бы иметь максимальный набор: а) из 76 + 45 = 121 специфичностей антител; б) 76-45 = 3420 специфичностей; в) (40-5) + (50-20-6) = 6200 специфичностей; г) (40-5)(50-20-6) = 1200000 специфичностей; д) более 1 200000 специфичностей. 3. Антигенная специфичность определенной В-клетки: а) индуцируется взаимодействием с антигеном; б) определяется только последовательностью лег- кой цепи; в) определяется последовательностями вариабель- ной области Н + L-цепи; г) изменяется после переключения изотипа; д) определяется константной областью Н-цепи. 4. Если бы вы могли провести анализ плазмати- ческой клетки, образующей антитело IgA, на молеку- лярном уровне, вы бы не обнаружили: а) последовательности ДНК для V-, D-, J-генов, транслоцированных рядом с ДНК Са-экзона; б) иРНК, специфичную или для к-, или для Х-лег- ких цепей; в) иРНК, специфичную для J-цепей; г) иРНК, специфичную для ц-цепей; д) последовательность ДНК, кодирующую Т-кле- точный рецептор для антигена 5. Способность одной В-клетки одновременно экс- прессировать молекулы как IgM, так и IgD на своей поверхности обусловлена: а) аллельным исключением; б) переключением изотипа; в) одновременным распознаванием двух разных антигенов; г) избирательным сплайсингом РНК; д) использованием генов из обеих родительских хромосом. 6. Укажите верное утверждение, касающееся орга- низации lg-генов: а) V- и J-гены эмбриональной ДНК уже подверг- лись реаранжировке; б) гены легкой цепи подвергаются дальнейшей ре- аранжировке после экспрессии поверхностного IgM; в) Ун-генные сегменты могут реаранжироваться с JK- или J^-генными сегментами; г) VDJ-сегменты, кодирующие lg \/н-области, ассо- циируются с разными генами константной области тя- желой цепи; д) после того как произошло VDJ-соединение, тре- буется дальнейшая реаранжировка, чтобы поместить VDJ-структуру рядом с См-геном. 7. Достижению разнообразия В-клеточных рецеп- торов антигена не способствует: а) множество V-генов в зародышевой линии; б) случайный набор легких и тяжелых цепей; в) неточная рекомбинация V- и J- или V-, D- и J- сегментов; г) наследование множества генов С-области; д) соматическая гипермутация.
ТЕСТЫ 111 8. Укажите неверное утверждение, касающееся экспрессии lg на В-клетке: а) легкие цепи IgM и IgD имеют идентичные ами- нокислотные последовательности; б) константные области тяжелых цепей IgM и IgD имеют разные аминокислотные последовательности; в) IgM и IgD имеют разную антигенную специфич- ность; г) если пролиферация и дифференцировка В-клет- ки в антителосекретирующую плазматическую клетку запускается антигеном и сигналами, исходящими от Т-клетки, то эта клетка может потенциально секрети- ровать антитела IgG, IgE или IgA. 9. В изменении антигенсвязывающего центра В- клетки после антигенной стимуляции играет роль: а) множественность J-сегментов; б) комбинаторное разнообразие; в) разнообразие зародышевой линии; г) соматический гипермутагенез; д) дифференциальный сплайсинг первичных транс- криптов РНК. СИТУАЦИОННАЯ ЗАДАЧА Вы являетесь членом исследовательской группы, изучающей племя, обнаруженное в отдаленном райо- не Новой Гвинеи. Вам удалось сделать удивительное открытие — у представителей этого племени имеются только два V-гена для легкой цепи и три V-гена для тяжелой цепи иммуноглобулинов. Тем не менее люди чувствуют себя здоровыми и могут противостоять многим патогенам, эндемичным для данного района. Предположите, чем это можно объяснить. ОТВЕТЫ НА ТЕСТЫ 1 — в. Необходимы три реаранжировки ДНК. Сна- чала появляется реаранжировка D5->J2 с последу- ющей V17-»D5J2. Это запускает синтез молекул IgM и IgD за счет использования V17D5J2. Третья реаранжи- ровка — это переключение класса V17D5J2CgC6 в V17D5J2CY2, что приводит к синтезу молекул lgG2. 2 — д. Если число 1 200000 является произведе- нием всех возможных комбинаций генов, то вполне возможно получить еще большее число специфично- стей антител в результате неточных рекомбинаций VJ- или VDJ-сегментов, вставки разных нуклеотидов и соматического гипермутагенеза. 3 — в. Антигенная специфичность определяется последовательностями и, соответственно, структурой, образованной комбинацией вариабельных областей тяжелой и легкой цепей. 4 — г. Как следствие реаранжировки VDJ к Са в клетке, продуцирующей IgA, произойдет делеция См-ге- на. В клетке можно будет наблюдать другие последо- вательности ДНК и виды иРНК. 5 — г. Одновременный синтез IgM и IgD возможен за счет альтернативного сплайсинга первичного транс- крипта РНК 5'-VDJ-CM-Cs-3', что приводит к образова- нию VDJCM- или VDJC5-PHK. 6 — г. Это является основой для переключения изотипа или класса. 7 — г. Наличие множества генов Сн-области хотя и является основой функционального разнообразия, тем не менее не способствует разнообразию антиген- специфичных рецепторов. 8 — в. Иммуноглобулины М и D, экспрессируемые на одной В-клетке, используют одни и те же V(D)J-reH- ные структуры тяжелой и легкой цепей и поэтому имеют одинаковую антигенную специфичность. 9 — г. Из описанных механизмов достижения раз- нообразия молекул lg только соматическая гиперму- тация влияет на антигенсвязывающий центр после антигенной стимуляции. ОТВЕТ НА СИТУАЦИОННУЮ ЗАДАЧУ Несмотря на небольшое количество генов V-обла- сти, у представителей этого племени сохраняются другие механизмы генерирования разновидностей ге- нов их антител. К этим механизмам относятся: нали- чие нескольких J- и D-сегментов в зародышевой ли- нии, разнообразие межсегментных участков из-за де- леции (удаления) или инсерции (вставки) оснований, случайный набор Н- и L-цепей и соматический гипер- мутагенез. Таким образом, несмотря на ограниченный набор V-генов, эти люди обладают достаточным раз- нообразием специфичностей антител для того, чтобы выжить.
Глава БИОЛОГИЯ В-ЛИМФОЦИТА * ВВЕДЕНИЕ В гл. 6 мы достаточно подробно обсудили, каким образом у В-лимфоцитов создается огромное ко- личество вариантов антигенной специфичности Именно этой вариабельностью объясняется одна из основных характеристик адаптивного иммун- ного ответа, которая рассматривалась в гл. 1 (опи- сание см. в подразделе «Клонально-селекционная теория»), — разнообразие, т.е. способность реаги- ровать на разные антигенные детерминанты — эпитопы, даже если индивидуум никогда прежде не встречался с ними. Среди других важных характеристик адап- тивного иммунного ответа можно назвать следу- ющие: • специфичность — способность различать эпи- топы; • память — способность вспоминать предыдущий контакт с определенным антигеном таким об- разом, что повторный контакт ведет к разви- тию более быстрого и эффективного иммун- ного ответа, чем первичный; • различение «своего» и «чужого» — способность реагировать на антигены, которые являются «чужими» или «не своими», чтобы избежать реакций на собственные, принадлежащие орга- низму, антигены. Эта глава посвящена биологии В-лимфоцитов — клеток, синтезирующих антитела в ответ на дей- ствие антигенов. Рассматриваются основные этапы развития В-клетки и то, каким образом она приобретает свои характерные черты, связанные с адаптивным иммунным ответом: разнообразие, специфичность, память и способность к распознаванию «своего» и «чужого». * МЕСТА РАННЕЙ ДИФФЕРЕНЦИРОВКИ В-КЛЕТОК Пониманию процесса дифференцировки В-клеток способствовали исследования на животных, в ко- торых была возможность манипулировать их эмб- риональным развитием. По этой причине особен- но хорошо изучена дифференцировка В-клеток у цыплят и млекопитающих. Многие этапы процесса дифференцировки В-клеток являются общими для людей, цыплят и мышей. Название «В-лимфоциты» появилось во вре- мя первых опытов с птицами: было показано, что для синтеза антитела необходим орган, называе- мый фабрициевой сумкой (карман из эпителия клоаки). Хирургическое удаление фабрициевой сумки предотвращало синтез антител. Поэтому клетки, превращающиеся в зрелые антителопродуциру- ющие клетки, стали называться бурсазависимы- ми или В-клетками. В отличие от птиц у млекопитающих такой фабрициевой сумки нет, а дифференцировка В- клеток происходит в некоторых определенных участках. Предшественники В-клеточной линии об- наруживаются на ранних стадиях развития пло- да в ряде мест, в том числе печени. Позднее по мере развития плода и в течение всей дальней- шей жизни основным лимфоидным органом, в котором происходит дифференцировка В-кле- ток, является костный мозг. В связи с этим ко- стный мозг рассматривается как первичный лим- фоидный орган, в котором дифференцируются В-лимфоциты у человека и других млекопитаю- щих (см. гл. 2).
ОНТОГЕНЕЗ В-ЛИМФОЦИТОВ 113 • ОНТОГЕНЕЗ В-ЛИМФОЦИТОВ Начальные фазы дифференцировки В-клеток: про- и пре-В-клетки На рис. 7.1 показаны основные стадии процесса дифференцировки В-клеток. Многие из них опре- деляются специфическими реаранжировками ге- нов 1g, что было описано в гл. 6. В-лимфоциты возникают из гемопоэтических стволовых клеток. Адгезивные взаимодействия со стромой костного мозга, нелимфоидными клет- ками, формирующими каркас, или матрицу, для костного мозга, а также действие цитокина IL-7 обеспечивают поступление сигналов, способству- ющих выживанию и усиливающих пролиферацию клеток В-линии на ранних стадиях. Самой пер- вой из определяемых клеток В-линии является так называемая про-В-клетка. у которой сегмент Он-гена тяжелой цепи реаранжируется к сегмен- ту JH-rena. На следующей стадии пре-В-клетки сегменты Ун-гена тяжелой цепи реаранжируют- ся, чтобы соединиться с реаранжированными ОнЛн-сегментами, сформировав VDJ-структуру. После реаранжировки VDJ размещается рядом с См (см. рис. 6.4), и пре-В-клетка синтезирует ц-пепь. Реаранжировки гена Ig во время этих ранних фаз дифференцировки В-клеток происходят в за- данном порядке, как было описано в гл. 6. Пер- воначальные реаранжировки D —J в про-В-клет- ках происходили на обеих хромосомах в локусах Н-цепи одновременно. Хромосома, на которой происходит продуктивная DJ-реаранжировка, да- лее реаранжирует V-генный сегмент к DJ-струк- туре. Если эти реаранжировки продуктивны, хро- мосома производит ц-цепь, а на другой хромосо- ме прекращается реаранжировка в локусе Н-цепи Если V—DJ-реаранжировка не продуктивна на первой хромосоме, она тем не менее происходит на другой хромосоме. Если реаранжировка про- дуктивна на второй хромосоме, тогда данная хро- мосома продуцирует p-цепь. Если ни одна из этих реаранжировок не продуктивна, клетка умирает посредством апоптоза, также называемого про- граммируемой смертью клетки. Основной чертой пре-В-клетки является то, что она экспрессирует ц-цепь в качестве трансмемб- ранной молекулы на своей поверхности вместе с продуктами двух нереаранжируемых генов, назы- ваемых Х5 и V-npe-B; оба функционируют вместе как суррогатные легкие цепи. На рис. 7.2, А пока- зано, что ц-цепь и суррогатные легкие цепи экс- прессируются на поверхности пре-В-клетки вме- сте с двумя трансмембранными молекулами: Iga (CD79a) и /gP (CD79b), которые тесно связаны друг с другом дисульфидной связью. Комплекс из ц-цепей и суррогатных легких цепей в соедине- нии с Iga и Igp называют пре-В-клеточным ре- цептором (npe-BCR). Иммуноглобулины аир ассоциируются с мемб- ранными молекулами [g на всех клетках В-кле- точной линии: от пре-В-клетки до В-клетки па- мяти (см. рис. 7.1). Комплекс Iga и Igp, ассоции- рованный с мембранными молекулами Ig более зрелых клеток В-лимфоцитарной линии, называ- ется В-клеточным рецептором (BCR); он пока- зан на рис. 7.2, Б. Иммуноглобулины а и р не Стволовая Про-В Пре-В клетка Незрелая В Зрелая В В-клетка памяти VL (к или X) V(D)L-реаранжировка гена Dh-Jh Vh-DhJh Мембранная экспрессия Ig ц + Суррогатные IgM легкие цепи IgM + IgD Переключение изотипа на IgG, IgA или IgE Мембранная экспрессия отсутствует — секретируется IgM или после переключения изотипа IgG, IgA или IgE • Рис. 7.1. Путь дифференцировки В-лимфоцитов Пунктирными линиями на пре-В-клетке показаны суррогатные легкие цепи Две сплошные линии, ассоциированные с тяжелой цепью поверхности клетки, представляют сигнальные молекулы Iga и Igp
114 ГЛАВА 7. БИОЛОГИЯ В-ЛИМФОЦИТА • Рис. 7.2. (А) Пре-В-клеточный рецептор (пре- BCR). (Б) В-клеточный рецептор (BCR). Тяжелой це- пью пре-BCR является ц-цепь; тяжелой цепью BCR может быть ц-, 8-, у-, а- или е-цепь Иммунорецеп- торная тирозинсодержащая активационная после- довательность (мотив) (ITAM), описываемая далее в этой главе, изображена как прямоугольник в по- липептидах Igoe и IgP связываются с антигеном. Их функция — переда- вать сигналы ядру клетки, что ведет к изменению структуры экспрессируемых генов, в связи с чем Iga и IgP относят к молекулам, передающим сиг- нал, ассоциированным с пре-BCR и BCR. Как показано в гл. 8 и 10, молекулы, передающие сиг- нал, также ассоциированы с антигенспецифичным рецептором, экспрессируемым на разных стадиях развития Т-лимфопита. На зрелых В-клетках роль Iga и IgP в BCR за- ключается в передаче сигналов после того, как ан- тиген свяжется с вариабельным доменом поверх- ностного 1g (более детально обсуждается в гл. 10). Однако свидетельства того, что пре-BCR связы- вается с антигеном, отсутствуют. Данные скорее указывают на то, что Iga и IgP, ассоциированные с пре-BCR, сообщают клетке, что она успешно реаранжировала гены Н-цепи 1g и создала функ- Связанный с клеткой аутоантиген Растворимый Редактирование рецептора = = реактивация У(ОЦ-рекомбинации I В-клетка с рецептором для неаутологичного антигена • Рис. 7.3. Взаимодействие незрелой В-клетки с ауто- антигенами циональную ц-цепь. В результате этого сигнала клетка, экспрессирующая пре-BCR, дифференци- руется дальше: пролиферирует, прекращает син- тез суррогатных легких цепей, начинает реаран- жировку гена L-цепи и прекращает дальнейшую реаранжировку гена Н-цепи. Реаранжировка легкой цепи в более поздних фазах развития пре-В-клетки также последователь- на: гены к-пепи реаранжируются первыми, но если ни одна из хромосом, кодирующих к-пепи. ус- пешно не реаранжируется. происходит реаранжи- ровка Х-гена. (Если не происходит продуктивной реаранжировки L-цепи, клетка погибает.) Как указано в гл. 6, биологическим следствием исполь- зования генов только одной хромосомы для про- изводства Н- и L-цепи (аллельного исключения) является то, что отдельная В-клетка экспрессиру- ет на своей поверхности молекулу 1g, специфич- ную только к одному определенному антигену. Незрелые В-клетки На следующей стадии дифференцировки В-кле- ток L-цепи составляют пары с ц-цепями, форми- руя мономерный IgM, который вставляется в мемб- рану. Клетка, несущая только мономерный IgM в качестве антигенспецифичного рецептора, отно- сится к незрелым В-клеткам. Первые эксперимен- ты показали, что незрелая В-клетка может рас- познавать и отвечать на чужеродный антиген, но это взаимодействие приводит скорее к длитель- ной инактивации, чем к клональной пролифера- ции и дифференцировке. Более поздние исследо- вания показали, что незрелая В-клетка может вза- имодействовать с аутологичными молекулами в костном мозге, что также может привести к ее инактивации. Такое взаимодействие аутологичных молекул и В-клеток играет важную роль в уста- новлении аутотолерантности у клеток В-линии. поскольку предотвращает развитие потенциаль- но аутореактивных клеток. На рис. 7.3 показаны два варианта развития аутотолерантности. Если незрелая В-клетка ветре-
ОНТОГЕНЕЗ В-ЛИМФОЦИТОВ 115 чается с собственной молекулой, экспрессируе- мой на поверхности клеток костного мозга, она погибает посредством апоптоза (делеция). Напро- тив, если незрелая В-клетка встречается с моле- кулой, не находящейся на поверхности клетки (растворимый антиген) в костном мозге, она инак- тивируется, но не устраняется, а, как говорится, становится анергичной (Делеция и анергия опи- саны в гл. 12.) Инактивацию незрелых В-клеток, обладающих потенциальной аутореактивностью при взаимодействии с аутологичными молекула- ми, называют негативной селекцией. Как указано в гл. 8, развивающиеся Т-лимфоциты также про- ходят через негативную селекцию в процессе диф- ференцировки в тимусе. На рис. 7.3 также изображен и третий возмож- ный исход взаимодействия незрелой В-клетки с аутологичной молекулой, а именно реактивация клеточной V(D)J-рекомбиназы — феномен, извест- ный как редактирование рецептора (см. гл. 6). Вследствие этого гены L-цепи 1g проходят вто- ричную реаранжировку, используя переаранжи- рованные V- и J-элементы. Например, в показан- ной на рис. 6.3 клетке, реаранжируюшей свой к-локус, Vi и J5 являются переаранжированными генами, которые могут быть использованы для по- вторной реаранжировки Редактирование рецеп- тора может привести к появлению специфично- сти к «чужому» антигену, и незрелая клетка та- ким образом «спасется» от инактивации. Зрелые В-клетки Следующая фаза в процессе дифференцировки В-клеток — развитие зрелых IgM4gD- В-клеток. Считается, что в основном развитие происходит в костном мозге и, возможно, вторичных лимфо- идных органах. Сигналы, которые направляют дифференцировку IgM+-B-KneTOK к IgM+IgD+-CTa- дии, неизвестны. Иммуноглобулины М и D, экс- прессируемые на одной В-клетке, обладают оди- наковой антигенной специфичностью, что явля- ется результатом альтернативного сплайсинга од- ного вида РНК, транскрибируемой с VDJ, плюс ц- и 8-генов (обсуждается в гл. 6). Функция IgD не вполне ясна. Как указано в гл. 4, В-клетки, экспрессирующие IgD, не производят антител, реагирующих с компонентами собственного орга- низма. Таким образом, экспрессирование IgD может служить сигналом для «глушения» таких аутореактивных клонов. Синтез антител и переключение класса Взаимодействие антигена со зрелой IgM+IgD+-B- клеткой обычно приводит к активации в отличие от описанной ранее инактивации при взаимодей- ствии антигена с незрелой ^М+-В-клеткой. В ос- новном они взаимодействуют во вторичных лим- фоидных органах, лимфатических узлах и селе- зенке. Большинство антигенов, особенно белки, называют тимусзависимыми, поскольку для того чтобы В-клетки синтезировали антитела, необ- ходимы хелперные Т-клетки (см. гл. 10). Перво- начальное взаимодействие антигена, хелперных Т-клеток и зрелых В-лимфоцитов осуществляет- ся на границе В- и Т-зависимых областей вто- ричного лимфоидного органа. В-клетки увели- чиваются (и называются теперь В-клеточными бластами) и пролиферируют. Некоторые из ак- тивированных В-клеток могут дифференциро- ваться далее в специализированную конечную стадию — плазматические клетки, которые спо- собны синтезировать и секретировать антитела (показано справа на рис. 7.1). Антитела, секре- тируемые отдельной плазматической клеткой, обладают той же антигенной специфичностью, что и 1g на поверхности В-клетки, которая изна- чально была активирована антигеном. Плазма- тические клетки не экспрессируют мембранные формы 1g. Антитела класса IgM синтезируются на ранних стадиях иммунного ответа. Позднее потомство IgM+IgD+-B-KJieTOK, которые первоначально реа- гировали на антиген, может продуцировать анти- тела разных изотипов. Это переключение класса (изотипа), механизм которого описан в гл. 6, про- исходит в результате синтеза цитокинов, выраба- тываемых хелперными Т-клетками, и контактно- го взаимодействия В- и Т-клеток (более полно описано в гл. 10). Соответственно, IgM+IgD+-B- клетки переключаются на синтез молекул IgA, IgG или IgE. Какой бы изотип 1g ни продуцировался, все дочерние клетки обладают одинаковой анти- генной специфичностью. Созревание аффинности и формирование клеток памяти Еще позднее в процессе иммунного ответа на ти- мусзависимые антигены некоторые из активиро- ванных В-клеток формируют во вторичном лим- фоидном органе специализированный участок — так называемый зародышевый центр (см. рис. 2.9 и 7.4). На рис. 7.4 показано, что зародышевый центр преимущественно состоит из активирован- ных В-клеток, меньшего количества Т-клеток и небольшого числа специализированных клеток, называемых фолликулярными дендритными клет- ками, которые удерживают антиген на своей по- верхности и презентируют его В-клеткам. На рис. 7.4 показано также, что зародышевый центр является местом интенсивной пролифера- ции В-клеток. Во время этого значительного уве- личения их первоначальной популяции В-клетки с мутациями в вариабельной области генов 1g по- являются с гораздо большей частотой, чем обыч- но. Этот соматический гипермутагенез (упоми- нается в гл. 6) приводит к появлению В-клеток. чьи гены вариабельных областей 1g могут синте- зировать антитела с более высокой аффинностью
116 ГЛАВА 7. БИОЛОГИЯ В-ЛИМФОЦИТА Соматический гипермутагенез V-генов Ig — селекция В-клеток с высокой аффинностью к антигену Плазматическая клетка В-клетка памяти • Рис. 7.4. Развитие В-клеток в зародышевом центре: соматический гипермутагенез, созревание аффинно- сти и формирование В-клеток памяти к активирующему антигену, чем был у первона- чальной В-клетки, активированной антигеном. Недавние наблюдения дают основания полагать, что гипермутагенез возникает в результате дей- ствия фермента, индуцируемого при активации В-клеток. В гене V-области Ig фермент превра- щает цитозин в урацил; попытки исправить это «неправильное основание» с помощью «механиз- мов восстановления» в клетке часто приводят к ошибкам и появлению мутаций. В-клетки, у которых повышена аффинность генов V-области, селектируются для создания кло- на и размножаются в зародышевом центре, в то время как В-клетки без мутаций в V-областях не проходят селекцию и погибают. Таким образом, соматический гипермутагенез приводит к увели- чению продукции антител, обладающих высокой аффинностью к определенному антигену, — фе- номен, известный как созревание аффинности. В этих клетках также может происходить пере- ключение изотипа. В-клетки, прошедшие этап се- лекции в зародышевом центре, покидают лимфо- идный орган и продуцируют антитела того клас- са, который необходим. В-клетки, активированные в зародышевом цент- ре, в процессе дифференцировки также могут ста- новиться В-клетками памяти (см. также рис. 7.1), которые покидают лимфоидный орган и переме- щаются в ткани. Как именно В-клетки развива- ются в зародышевом центре, в настоящее время не ясно, но считается, что плазматические клет- ки не становятся клетками памяти. В-клетки па- мяти являются непролиферирующими, обычно долгоживущими клетками, которые могут быть активированы в процессе последующего (повтор- ного) более быстрого ответа на антиген. Эти клет- ки экспрессируют на своей поверхности изоти- пы, отличные от IgM и IgD, а именно IgG, IgA и IgE. В-клетки памяти, похоже, не экспрессируют на своей поверхности особых молекул, отлича- ющих их от наивных или активированных зрелых В-клеток, зато экспрессируют более высокие уров- ни CD44, чем другие В-клетки; CD44 участвует в адгезии лимфоцитов к клеткам вне лимфатиче- ского узла. Общим результатом описанных этапов диф- ференцировки является то, что организм созда- ет постоянно пополняемую библиотеку В-кле- ток разной специфичности (репертуар), направ- ленных против огромного множества антигенов. Таким образом, ответ на действие антигена за- висит от взаимодействия антигена с существу- ющим клоном В-клеток, содержащихся в дан- ной библиотеке. Однако большинство В-клеток из этого огромного репертуара за время своего существования никогда не взаимодействуют с антигеном. Неактивированные зрелые IgM+IgD+- В-клетки находятся в течение примерно 4 — 5 мес в селезенке, где хранятся как покоящиеся лим- фоциты.
МЕМБРАННЫЕ БЕЛКИ В-КЛЕТОК 117 Анатомическое распределение В-клеток Как говорилось ранее, дифференцировка В-кле- ток на ранних этапах происходит в костном моз- ге. Зрелые В-клетки током крови перемещаются во вторичные лимфоидные органы, преимуще- ственно лимфатические узлы, селезенку и пей- еровы бляшки кишечника. Если В-клетка не вза- имодействует с антигеном, она или покидает лим- фоидный орган через лимфатические сосуды и продолжает циркулировать, или погибает в нем. Если В-клетка взаимодействует с антигеном и хелперными Т-клетками, формируется зародыше- вый центр, как указано ранее. Те В-клетки, кото- рые превратились в плазматические клетки, сек- ретирующие IgG, через лимфатическую систему мигрируют в костный мозг и продолжают синте- зировать 1g. Плазматические клетки, секретиру- ющие IgA, находятся в ткани слизистой оболоч- ки. Миграция наивных В-клеток во вторичные лимфоидные органы, а В-клеток, активированных антигеном, и В-клеток памяти в другие ткани управляется посредством разных типов хоминг- взаимодействия, описанными в гл. 8 и 9, посвя- щенных Т-клеткам. В-1-клетки Описанные ранее этапы дифференцировки фор- мируют популяцию В-клеток, доминирующую в крови, лимфе и вторичных лимфоидных органах. Эти В-клетки являются В-2-клетками. Вторая популяция В-клеток, называемая В-1-клетками, описана у людей, мышей и других животных. У взрослых особей в селезенке и лимфатических узлах В-1-клетки представляют минорную (мень- шую в количественном отношении) популяцию, но преобладают в перитонеальной и плевральной полостях. Как в действительности взаимосвязаны В-1- и В-2-клетки, до конца не выяснено. Похо- же, В-1-клетки используют ограниченный набор V-генных сегментов для формирования своего репертуара. Для большинства, но не всех В-1-кле- ток характерна поверхностная экспрессия моле- кул CD5, которые не экспрессируются на В-2-клет- ках. CD5+-B-1-клетки преобладают при хрониче- ском лимфоцитарном лейкозе (см. гл. 17). При попадании в организм разных типов бак- терий на ранней стадии первичного ответа В-1- клетки синтезируют преимущественно низкоаф- финные полиспецифичные (т.е. обладающие ре- активностью относительно многих разных анти- генов) антитела IgM. Они осуществляют так на- зываемый тимуснезависимый ответ на бактери- альные полисахариды (см. гл. 10), т.е. не нуждают- ся в Т-хелперах, чтобы синтезировать антитела. В-1-клетки синтезируют IgM и малые количества (если вообще синтезируют) 1g других изотипов. По этим причинам считается, что В-1-клетки важ- ны в качестве первой линии обороны против мно- гих патогенов, особенно в иммунной системе слизи- стых оболочек. Кроме того, полагают, что В-1-клет- ки отвечают за синтез большинства «естествен- ных» антител, которыми являются в основном антитела IgM, обнаруживаемые у индивидуума в отсутствие примирования антигеном. * МЕМБРАННЫЕ БЕЛКИ В-КЛЕТОК Главной особенностью В-клеток является способ- ность синтезировать антитела после стимуляции антигеном. Продукция антител В-клетками, как будет более детально описано в следующих гла- вах, является многоступенчатым процессом, тре- бующим тесного взаимодействия В- и Т-клеток. В следующих подразделах и на рис. 7.5 кратко Поверхность В-клетки IgH + L (CD79a/CD79b) В-клеточный рецептор для антигена (BCR) lg H + L: антигенсвязывающие компоненты Iga + Ig₽: молекулы, передающие сигнал, которые ассоциированы с 1g Н-цепью CD19 CD81 В-клеточныи корецептор Молекулы, передающие добавочные сигналы, ассоциированные с BCR • Рис. 7.5. Важные молекулы, экспрес- сируемые на поверхностной мембране зрелой В-клетки МНС II класса CD40 В7 (CD80 и CD86) CD32 Презентация процессированного пептида CD4+- T-клеткам; связывание с TCR и CD4 Взаимодействие с CD 154 (CD40L) на Т-клетке, вызвающее переключение класса антител Костимуляторные молекулы: взаимодействуют с CD28 и CD 152 (CTLA-4) на Т-клетке Низкоаффинный Fc-рецептор для IgG (FcyRIIb)
118 ГЛАВА 7. БИОЛОГИЯ В-ЛИМФОЦИТА описаны некоторые мембранные белки В-клеток, необходимые для синтеза антител, и другие бел- ки, обладающие важными функциями. Антигенсвязывающие молекулы: мембранный иммуноглобулиновый рецептор Наиболее важным свойством В-лимфоцитарной линии является экспрессия цепей 1g на поверх- ности клетки. (Заметьте, что при этом ни про-В- клетка — самая незрелая клетка этой линии, ни плазматическая клетка — клетка на терминаль- ной стадии В-клеточной дифференцировки, сек- ретирующая 1g, — не экспрессируют 1g на своей поверхности.) Таким образом, поскольку ассоци- ированный с мембраной 1g связывает антиген, он может использоваться как для идентификации В- клеток, так и для их отделения (сепарации) от других лимфоцитов и одноядерных клеток. Передача сигналов молекулами, ассоциированными с мембранным иммуноглобулиновым рецептором Функция передающих сигналы молекул, ассоци- ированных с BCR, более детально описана в гл. 10 в подразделе, посвященном внутриклеточным со- бытиям, происходящим при активации В-клеток. Здесь же кратко описаны функции некоторых отдельно взятых молекул. Тяжелые и легкие цепи 1g обладают очень ко- роткими внутриклеточными доменами и непо- средственно не передают сигнал в В-клеткучпосле связывания с антигеном. Более вероятно, что ра- нее описанные молекулы Igoe (CD79a) и Igp (CD79b), нековалентно ассоциированные с Н- и L-цепями 1g на мембране В-клеток (см. рис. 7.2), передают сигнал активации внутрь В-клетки. Од- ним из самых первых событий, происходящих при активации В-клетки после связывания антигена с BCR, является фосфорилирование (добавление фосфатной группы) к остаткам тирозина в цито- плазматических участках Igoc/lgp ферментами про- теинтирозинкиназами. В Iga/IgP тирозиновые остатки содержатся в аминокислотных последо- вательностях, относящихся к иммунорецепторной тирозинсодержащей активационной последователь- ности (мотиву) (immunoreceptor tyrosine-based activation motif — ITAM). Аминокислотная пос- ледовательность рассматривается как мотив, по- скольку она обнаруживается в ряде других пере- дающих сигнал молекул на клетках иммунной системы (например, связанных с Т-клеточными рецепторами, описываемыми в гл. 8). Другие молекулы на мембране В-клетки влия- ют на сигнал, передаваемый через BCR, и таким образом играют важную роль в его передаче внутрь В-клетки. Гены CD19. CD81 (известный также как ТАРА-1) и CD21 ассоциированы в комплекс, на- зываемый В-клеточным корецептором. Связыва- ние антигена с корецептором усиливает актива- ционный сигнал, передаваемый через BCR. По- этому если антиген связывается к корецептором, требуется гораздо меньшее количество антигена, чем при активации В-клетки только через BCR. Корецептор со сходной функцией ассоциируется и с Т-клеточным рецептором (описывается в гл. 8). В В-клеточном корецепторном комплексе CD21 является рецептором для компонента комплемента C3d, который связывается с микробными патоге- нами (см. гл. 13). Поэтому считается, что CD21 играет большую роль в усилении В-клеточных ответов на патогены, которые активируют каскад комплемента. Также CD21 действует как рецеп- тор для вируса Эпштейна — Барр, что определяет возможность инфицирования В-клеток и их про- лиферацию в ответ на действие вируса. Этот вирус является возбудителем мононуклеоза и лимфомы Беркитта в Африке (африканская лимфома). Некоторые молекулы, экспрессированные на поверхности В-клеток, оказывают негативное дей- ствие при активации В-клетки. К ним относится рецептор CD22. который отрицательно регулиру- ет корецепторы CD 19, CD81 и CD21, а также CD32. являющийся низкоаффинным рецептором к Fc-фрагменту IgG (FcyRII) и экспрессирующий- ся практически на всех зрелых В-клетках. Рецеп- тор CD32 связывает IgG, когда его агрегация про- исходит в отсутствие антигена (см. гл. 4) и когда IgG находится в комплексе антиген —антитело. Рецептор CD32 играет важную роль в осуществ- лении антителами обратной связи — инактива- ции В-клетки путем подачи ей отрицательного сигнала. Молекулы, участвующие во взаимодействиях Т- и В-клеток Для активации Т-клеток антиген должны пред- ставлять антигенпрезентирующие клетки (АПК) (подробнее см. гл. 8— 10). В-клетки, особенно ак- тивированные, могут выступать в качестве АПК для Т-клеток. Они обладают важными чертами, присущими АПК. Во-первых, В-клетки экспрессируют на своей по- верхности белки, являющиеся молекулами главного комплекса гистосовместимости (МНС) IIкласса (см. гл. 9). Эти белки играют важнейшую роль в презентировании антигена большой субпопуляции Т-клеток, называемых СО4+-Т-клетками. В отли- чие от образцов экспрессии на многих других клет- ках экспрессия молекул МНС II класса на В-клет- ках является конститутивной, т. е. эти молекулы всегда экспрессируются Экспрессия молекул МНС II класса на В-клетках может быть в даль- нейшем увеличена при воздействии определен-
ТЕСТЫ 119 ных цитокинов, таких как IL-4. Молекулы МНС II класса экспрессируются на всех клетках В-клеточ- ной линии за исключением про-В-клеток. Во-вторых, В-клетки экспрессируют высокие уровни семейства молекул, известных как В7 (CD80/CD86). которые относятся к костимули- рующим молекулам, поскольку их присутствие, как и присутствие антигена, необходимо для актива- ции наивных (непримированных) Т-клеток. По- коящиеся зрелые В-клетки экспрессируют низ- кие уровни В7 и являются слабыми АПК, тогда как активированные В-клетки — очень эффек- тивными. В-третьих, В-клетки экспрессируют CD40. ко- торый взаимодействует с CD 154 (СЭ40-лиганд — CD40L), экспрессируемым на активированных Т-клетках. Это взаимодействие активирует В-клет- ки и играет основную роль в переключении изо- типа, описанном ранее. Важность взаимодействия CD40 — CD154 подчеркивается таким состоянием, как Х-сцепленный гипер-IgM-синдром. У маль- чиков с мутацией гена CD 154, у которых Т-клет- ки либо вообще не экспрессируют, либо имеют нефункциональные гены CD 154, вырабатывают- ся только антитела IgM, а в их В-клетках не про- исходит переключения на другие изотипы. РЕЗЮМЕ 1. У млекопитающих на протяжении всей жизни ранние стадии дифференцировки В-клеток проходят в костном мозге Самой первой из идентифицируе- мых клеток В-линии является про-В-клетка; на этой стадии происходит первая реаранжировка гена Н-цепи Ig: Он-генный сегмент реаранжируется к JH- генному сегменту. 2. Следующая стадия представлена пре-В-клеткой, у которой \/н-генный сегмент реаранжируется к объ- единенным DJ-сегментам, формируя VDJ-структуру, которая приближена Сц-гену. В пре-В-клетке блок ге- нов VDJCM транскрибируется и транслируется, что ве- дет к синтезу ц-цепи. Эта цепь экспрессируется на поверхности пре-В-клетки в ассоциации с суррогат- ными легкими цепями. 3. На поверхности пре-В-клетки ц-цепь и сурро- гатные легкие цепи экспрессируются с двумя тесно связанными трансмембранными молекулами: Iga (CD79a) и IgP (CD79b). Комплекс из р- и суррогатных легких цепей в соединении с Iga и lg(3 составляет пре-В-клеточный рецептор. 4, На следующей стадии дифференцировки начи- нают реаранжировать гены L-цепи; синтез суррогат- ных легких цепей прекращается; формируется к- или Z-цепь, которая ассоциируется с ц-цепью. Это приво- дит к формированию молекулы IgM, которая экспрес- сируется на поверхности клетки Такая клетка отно- сится к незрелым В-клеткам. 5. Если незрелая В-клетка встречается с антиге- ном, она обычно инактивируется. Взаимодействие не- зрелых клеток с собственными молекулами организ- ма, приводящее к инактивации или устранению кле- ток с потенциальной аутореактивностью, — один из важнейших путей поддержания состояния аутотоле- рантности (негативная селекция). 6. На следующей стадии дифференцировки зре- лые В-клетки экспрессируют IgM и IgD (с одинаковой антигенной специфичностью) на поверхности клетки. 7. Дальнейшее развитие зрелых В-клеток проис- ходит преимущественно вне костного мозга и опреде- ляется контактом с антигеном. Активация В-клеток ведет к пролиферации и дифференцировке в плазма- тические клетки, которые синтезируют и секретируют антитела. Во время первичного ответа после контакта с антигеном синтезируются преимущественно IgM. 8- В-клетки, взаимодействующие с Т-клетками и их продуктами — цитокинами, осуществляют пере- ключение изотипа (класса), т.е. продуцируют антитела различных изотипов: IgG, IgA, или IgE. Переключение изотипа включает механизм реаранжировки, харак- терный только для В-клеток: VDJ-структура тяжелой цепи, присоединенная к Сц- и С8-генам, реаранжиру- ется, чтобы присоединить другой ген С-области, та- кой как CY, Са или Се. В-клетка, которая синтезирова- ла IgM и IgD, теперь может синтезировать антитела различных изотипов (IgG, IgA или IgE), но той же ан- тигенной специфичности. 9- Соматический гипермутагенез генов, кодирую- щих V-области антител, происходит в зародышевых центрах вторичных лимфоидных органов. Это ведет к тому, что селектируются В-клетки с мутациями в об- ласти иммуноглобулиновых V-генов, кодирующие ан- титела с более высокой аффинностью к антигену, чем исходные В-клетки (созревание аффинности). Эти отобранные В-клетки могут развиваться в В-клетки памяти или плазматические клетки. 10. У отдельной В-клетки Н-цепь кодируется сег- ментами гена Н-цепи, находящимися либо на мате- ринской, либо на отцовской хромосоме; L-цепь также кодируется сегментами гена L-цепи, находящимися на одной или другой хромосоме. Этот феномен ис- пользования генов только на одной хромосоме для синтеза Н-цепи Ig называют аллельным исключением; он обеспечивает продукцию отдельной В-клеткой Ig только одной антигенной специфичности. 11. Экспрессия мембранной формы Ig присуща только В-клеткам. Молекулы Iga и Igp, а также другие молекулы, ассоциированные с мембранным иммуно- глобулиновым рецептором, после связывания антиге- на с Ig передают сигнал в В-клетку. Та также экспрес- сирует на своей клеточной поверхности ряд молекул, играющих решающую роль во взаимодействии с дру- гими клетками, особенно Т-клетками. Такими молеку- лами являются и молекулы МНС II класса, В7 и CD40. ТЕСТЫ Выберите один НАИБОЛЕЕ ПРАВИЛЬНЫЙ ответ на каждый тест. 1. Самые ранние стадии дифференцировки В-кле- ток: а) наблюдаются в тимусе эмбриона; б) требуют присутствия антигена; в) включают реаранжировку сегментов гена к-цепи; г) включает реаранжировку сегментов гена сурро- гатной легкой цепи;
120 ГЛАВА 7. БИОЛОГИЯ В-ЛИМФОЦИТА д) включают реаранжировку сегментов гена тяже- лой цепи. 2, На поверхности В-лимфоцита экспрессируется: a) CD40; б) молекулы МНС II класса; в) CD32; г) IgM и IgD; д) все перечисленное. 3. Из перечисленных утверждений ложным являет- ся следующее: а) антитела во время вторичного иммунного ответа обычно имеют более высокую аффинность к антигену, чем антитела, образованные во время первичного от- вета; б) соматический гипермутагенез генов V-области может внести свой вклад в изменение аффинности антител, наблюдаемое во время вторичного ответа; в) синтез антител при вторичном ответе происхо- дит преимущественно в крови; г) переключение изотипа происходит в присут- ствии антигена; д) во время первичного ответа вырабатываются преимущественно антитела IgM. 4, Незрелые В-лимфоциты: а) имеют реаранжированные сегменты только D- и J-генов; б) являются предшественниками как Т-, так и В-лим- фоцитов; в) экспрессируют на своей поверхности и IgM, и IgD; г) находятся на той стадии развития, когда контакт с антигеном может привести к отсутствию ответа; д) должны пройти через тимус, чтобы созреть. 5. Антиген, связывающийся с В-клеточным рецеп- тором: а) передает сигнал через антигенсвязывающие цепи; б) неизменно ведет к активации В-клетки; в) передает сигнал через молекулы Iga и IgP; г) приводит к активации макрофагов; д) ведет к синтезу цитокинов, активирующих Т-клет- ки 6. На В-клетках памяти не будет обнаруживаться: a) Iga и lg₽; б) тяжелые у-цепи; в) тяжелые е-цепи; г) суррогатные легкие цепи; д) легкие к-цепи. 7, Зародышевые центры, находящиеся в лимфати- ческих узлах и селезенке: а) поддерживают развитие незрелых В- и Т-кле- ток; б) участвуют в удалении поврежденных эритроци- тов из кровотока; в) служат основным источником стволовых клеток, способствуя этим поддержанию гемопоэза; г) являются местами антигенной стимуляции зре- лых В-клеток; д) являются местами дифференцировки Т-клеток. ОТВЕТЫ НА ТЕСТЫ 1 — д. Самые ранние стадии дифференцировки В- клеток отмечаются в печени плода и костном мозге взрослого человека и включают реаранжировку V-, D- и J-генных сегментов тяжелой цепи. 2 — д. Все указанные молекулы экспрессируются на поверхности В-клетки. 3 — в. Синтез антител при вторичном ответе про- исходит преимущественно в лимфатических узлах, а не в крови. 4 — г. У незрелых В-клеток, экспрессирующих только IgM, контакт с антигеном ведет скорее к отсут- ствию ответа, чем к активации. 5 — в. Молекулы Iga и IgP, ассоциированные с по- верхностной молекулой lg, передают сигнал после связывания поверхностного lg с антигеном. 6 — г. Суррогатные легкие цепи экспрессируются только на пре-В-клеточной стадии дифференцировки. 7 — г. Зародышевые центры — это места в лимфа- тических узлах и селезенке, где активированные антиге- ном зрелые В-клетки пролиферируют, претерпевают соматическую гипермутацию и окончательно дифферен- цируются в плазматические клетки и клетки памяти.
Глава БИОЛОГИЯ Т-ЛИМФОЦИТОВ ВВЕДЕНИЕ В предыдущих главах мы сосредоточили внимание на характеристиках В-лимфоцитов и их рецепто- ре к антигену, иммуноглобулину (1g). Молекулы Ig, секретируемые В-клетками, и антитела игра- ют основную роль во взаимодействии с антиге- нами, когда они находятся вне клеток, например когда встречаются с вирусами в крови или на поверхности слизистой оболочки. Однако когда антиген попадает в клетку, антитела обычно не имеют к нему доступа и поэтому не эффективны по отношению к антигенам внутри клеток. Обычно считается, что Т-клетки возникают для участия в основной фазе ответа на такие патоге- ны, как вирусы, бактерии и паразиты, которые проникают внутрь клеток организма. Т-клетки реагируют в основном на белковые антигены (не- которые исключения будут описаны в гл. 9 и 10), поскольку белки являются либо основными ком- понентами патогенов, либо синтезируются пато- генами. Т-клетки играют решающую роль в отве- те почти на все потенциально опасные агенты, с которыми встречается индивидуум, в фазе внут- риклеточной инфекции. Как и В-клетки, Т-клетки экспрессируют ан- тигенспецифичные рецепторы, которые распре- деляются по клонам, т.е. каждый клон Т-клеток экспрессирует Т-клеточные рецепторы (TCR) для антигена, имеющие уникальную последователь- ность. Огромный репертуар молекул TCR, состав- ляющий по оценкам 1015— 1018 возможных струк- тур, определяется той же стратегией реаранжи- ровки V(D)J-reHOB, описанной для молекул Ig в гл. 6. Специфические аспекты, присущие ре- аранжировке генов TCR, более детально описаны далее в этой главе. Структуры TCR и В-клеточ- ного антигенного рецептора Ig, а также органи- зация генов, кодирующих TCR и Ig, чрезвычай- но схожи. Это сходство, или гомология, предпо- лагает, что TCR и Ig (а в действительности и многие другие молекулы, экспрессируемые на поверхности клеток) возникли из общего пред- шествующего гена. Такие гены принадлежат су- персемейству иммуноглобулиновых генов, а моле- кулы называются членами суперсемейства имму- ноглобулинов. В этой главе описаны характеристики TCR, проведено их сравнение с характеристиками Ig и рассказано о других важных молекулах, находя- щихся на поверхности Т-лимфоцитов. Также опи- саны основные этапы развития Т-клеток в тиму- се, органе, в котором развивающиеся Т-клетки приобретают свои антигенспецифичные рецеп- торы. ПРИРОДА АНТИГЕНСПЕЦИФИЧНОГО Т-КЛЕТОЧНОГО РЕЦЕПТОРА Молекулы, взаимодействующие с антигеном Каждая Т-клетка экспрессирует на своей поверх- ности двухцепочечную молекулу TCR, взаимодей- ствующую с антигеном. На левой стороне рис. 8.1 показаны форма TCR, полипептидные а- и Р-це- пи, которые экспрессируются на большинстве зрелых Т-клеток человека и многих других видов. Эти а- и p-цепи связаны дисульфидными мости- ками и представляют трансмембранные глико- протеины с короткими цитоплазматическими уча- стками. Цепи содержат разное количество угле- водов, поэтому молекулярная масса а- и Р-цепей варьирует от 40 до 60 кДа.
122 ГЛАВА 8. БИОЛОГИЯ Т-ЛИМФОЦИТОВ •— СНО (углевод) • Рис. 8.1. Преобладающая форма антигенсвязывающих цепей TCR, а- и p-цепи и связанный с мембраной lg с ука- занным Fab-фрагментом На рис. 8.1 сравнивается структура TCR со структурой мембранного 1g. Каждая цепь TCR состоит из вариабельной (V) и константной (С) областей, аналогичных V- и С-областям молекул lg. Каждая V- и С-область складывается в Ig-no- добные домены. Более того, как и 1g, V-области TCR содержат гипервариабельные участки или участки, определяющие комлементарность (CDR1, 2, 3), которые формируют антигенсвязывающий центр. Структуры TCR и 1g обладают, однако, несколь- кими важными различиями. • Валентность и конформация. Т-клеточный ре- цептор является двухцепочечной структурой, формирующей один антигенсвязывающий центр. Таким образом, TCR является монова- лентным и напоминает моновалентный Fab- фрагмент антитела. Обширные взаимодействия между доменами каждой цепи TCR придают его структуре устойчивую конформацию Им- муноглобулин. напротив, является четырехце- • Рис. 8.2. Взаимодействие TCR с молекулярным комп- лексом МНС-пептид почечной молекулой с шарнирной областью и двумя антигенсвязывающими центрами. Эти особенности придают молекуле 1g гибкость, что позволяет ей бивалентно связываться с анти- генами разных форм и размеров. • Распознавание антигена. В гл. 3 и 4 описано, каким образом 1g связывается с разными типа- ми антигенов (углеводами, ДНК, липидами и белками), которые встречаются в жидкостях, например сыворотке. Мы также указали, что lg может реагировать на линейные и конфор- мационные эпитопы в антигене. Таким обра- зом, для того чтобы вызвать антительный от- вет, необходимы определенная трехмерная структура и аминокислотная последователь- ность антигена. Поскольку Т-клетки взаимодействуют с бел- ковыми антигенами, поступающими изнутри клет- ки, эти клетки используют антигенраспознающую систему, отличающуюся от той, которую исполь- зуют В-клетки. Т-клеточный рецептор взаимодей- ствует с небольшими фрагментами белков (пеп- тидами), которые экспрессируются на поверхно- сти клетки организма. Эти пептиды, появляющи- еся вследствие ферментативного расщепления белка внутри клетки, ассоциируются с молекула- ми главного комплекса гистосовместимости (МНС). Таким образом, как показано на рис. 8.2, TCR взаимодействует с пептидом, связанным с молекулой МНС на поверхности клетки. (Роль молекул МНС в создании эпитопов для Т-кле- точных ответов кратко отмечалась в гл. 3 и на рис. 3.4, а более детально будет обсуждаться в гл. 9.) Соответственно в отличие от разнообразия струк- тур и форм, распознаваемых молекулами 1g, ан- тиген, распознаваемый TCR, является комбина- цией из молекулы МНС и небольшого линейного пептида. По результатам кристаллографического иссле- дования было высказано предположение, что раз- ные участки TCR вступают в контакт с разными частями структуры пептид — МНС. Обшей чертой всех структур пептид — МНС — TCR, которые под- вергались изучению, являлось то, что CDR3 Vo- и Vp-цепей TCR взаимодействуют с двумя или тре- мя аминокислотами в центре пептидной после- довательности; таким образом, это взаимодей- ствие, похоже, является решающим в обеспече- нии специфичности связывания пептида с TCR. В некоторых кристаллических структурах TCR CDR1 и CDR2 Va- и Vp-цепей взаимодействует с МНС-компонентом молекулярного комплекса МНС —пептид, в то время как в других случаях все три CDR взаимодействуют с МНС» • Секреция рецептора. В отличие от lg TCR не существует в специфической секретируемой форме и не секретируется при активации Т- клеток. Как описывается в гл. 10, активация Т-клеток приводит к секреции цитокинов и/ или киллингу инфицированных клеток орга-
ПРИРОДА АНТИГЕНСПЕЦИФИЧНОГО Т-КЛЕТОЧНОГО РЕЦЕПТОРА 123 низма. Напротив, как сказано в гл. 7, после того как антиген связывается с мембранным Ig и активирует В-клетку, В-клетка дифференци- руется в плазматическую клетку и секретирует Ig с той же антигенной специфичностью, что была характерна для В-клетки, которая перво- начально связала антиген. • Отсутствие изменений в TCR во время ответа на антиген. Как указывалось в гл. 6 и 7, в пери- од ответа на антиген молекулы Ig подвергают- ся соматическому гипермутагенезу (что связа- но с созреванием аффинности) и переключе- нию класса, связывающему один из генных наборов, кодирующих определенную V-область, с разными генами С-области. Эти механизмы являются уникальными для В-клеток: TCR не изменяются в период ответа на антиген. Корецепторные молекулы Т-клеточные рецепторы экспрессируются на по- верхности Т-клетки в ассоциации с другой транс- мембранной молекулой, назвываемой корецепто- ром. На рис. 8.3 показано, что этот корецептор может быть одной из двух молекул на зрелой Т- клетке: или CD4. или двухцепочечной CD8 (обе являются членами суперсемейства Ig). Таким об- разом, экспрессия корецептора разделяет попу- ляцию Т-клеток на две подгруппы: CD4+ или CD8+. (Клетка, экспрессирующая интересующий нас ген, обозначается как «+», а неэкспрессирующая — как «-».) Как будет описано далее в этой главе, толь- ко незрелые Т-клетки, дифференцирующиеся в тимусе, экспрессируют и CD4, и CD8. Молекулы CD4 и CD8 выполняют несколько важных функций. • Внеклеточные части CD4 и CD8 связываются с молекулами МНС на поверхности клетки, представляющей антиген для Т-лимфоцита — АПК (более полно описаны в гл. 9). Молекула CD4 избирательно связывается с МНСIIклас- са. a CD8 — с МНС I класса. На рис. 8.3 по- казано, что СО4+-Т-клетки взаимодействуют с клетками организма, экспрессирующими пептид, ассоциированный с МНС II класса, а СЭ8+-Т-клетки — с клетками, экспрессиру- ющими пептид, ассоциированный с МНС I клас- са. Это формирует основу для рестрикции (ограничения) Т-клеточного ответа по МНС (см. в гл. 9). • Связывание CD4 или CD8 с молекулами МНС, экспрессируемыми на АПК, способствует уси- лению связи Т-клеток с АПК. Таким образом, CD4 и CD8 действуют как молекулы адгезии при взаимодействии Т-клеток с АПК. • Молекулы CD4 и CD8 вовлекаются в передачу сигнала после связывания антигена с TCR. Их внутриклеточные части специфически связа- ны с ферментами, известными как белковые рецептор • Рис. 8.3. Рецепторы TCR и их взаимодействие с молеку- лами МНС. (A) CD4 и (Б) CD8. Обозначены все молекулы тирозинкиназы, которые являются важными компонентами в процессе ранней активации Т-клеток. Более детально это обсуждается в гл. 10. • Уникальным свойством молекулы CD4 явля- ется то, что с ней связывается ВИЧ. Это поз- воляет вирусу инфицировать клетки, экспрес- сирующие CD4, что в последующем приводит к развитию СПИДа (см. гл. 17). Комплекс Т-клеточного рецептора На рис. 8.4 показано, что антигенраспознающие а- и p-цепи также экспрессируются на поверхно- сти Т-клеток в тесной нековалентной ассоциации с молекулой CD3 и двумя идентичными £- (дзета)- цепями (CD247; молекулярная масса 16 кДа). Сочетание а- и P-цепей TCR и CD3 и £ называет- ся Т-клеточным рецепторным комплексом анало- гично В-клеточному рецепторному комплексу, описанному в гл. 7. Молекула CD3 состоит из трех разных поли- пептидов у, 8 и 8 (молекулярной массой 25, 20 и 20 кДа соответственно). В настоящее время счи- тается, что 8 ассоциируется как с у-, так и 8-цепя- ми в составе комплекса (см. рис. 8.4). Поскольку CD3 играет роль «спутника» при транспортиров- ке вновь синтезированной молекулы TCR через клетку к ее поверхности, она всегда находится в ассоциации с TCR. Молекула CD3 является ин- вариантной (т.е. она одинакова на всех Т-клет- ках) и поскольку экспрессируется исключитель- но на Т-клетках. может быть использована как маркер, отличающий Т-клетки от всех остальных. Молекула CD3 и ^-полипептиды не связыва- ют антиген. Они являются молекулами, переда- ющими сигнал, и активируются после того, как антиген связывается с TCR, подобно молекулам Iga и Igp, ассоциированным с BCR и описанным в гл. 7. Каждая цепь комплекса CD3 имеет одну содержащую тирозин последовательность, назы- ваемую иммунорецепторной тирозинсодержащей активационной последовательностью (мотивом) (ITAM), которая также имеется в Iga и Igp; £-цепь
124 ГЛАВА 8. БИОЛОГИЯ Т-ЛИМФОЦИТОВ Связывание антигена • Рис. 8.4. Комплекс TCR. Т-клеточный рецептор и ассо- циированный комплекс CD3 (у-, 6- и Е-цепи), передающий сигнал , плюс £. Незакрашенные квадратики — ITAM Передача сигнала £ £ содержит три таких последовательности. Если ан- тиген связывается с ос- и p-цепями TCR (более детально это будет рассматриваться в гл. 10), ITAM, расположенные в структуре CD3 и ^-це- пей, обеспечивают процессы ранней фазы акти- вации Т-клеток Другие важные молекулы, экспрессируемые на поверхности Т-клетки В следующих подразделах и на рис. 8.5 кроме молекул, ассоциированных с комплексом TCR и Т-клеточными корецепторами, рассмотрены моле- кулы, необходимые для функционирования Т-кле- ток. Костимулирующие лиганды В гл. 7 рассказывалось об экспрессии молекул семейства В7 (из которых больше всего известно о молекулах В7-1 и В7-2, CD80 и CD86) на В- клетках и других АПК. Взаимодействие В7 с CD28, экспрессируемой зрелой Т-клеткой, обеспечива- ет костимулирующий или второй сигнал для акти- вации Т-лимфоцита. Костимулирующее взаимо- действие необходимо в дополнение к взаимодей- ствию пептид —МНС с TCR для активации наив- ных Т-клеток (т.е. Т-клеток, которые еше не встре- чались с антигеном). Активированные Т-клетки также экспрессируют молекулу, близкородствен- ную CD28, известную как CD152 (CTLA-4Y кото- рая взаимодействует с молекулами В7, передавая отрицательный сигнал активированной Т-клетке. В гл. 10 взаимодействие молекул В7 с CD28 и CD152 разобрано более детально. Молекулы адгезии Ранее было указано, что CD4 и CD8, экспресси- рованные на Т-клетке, действуют и как молекулы адгезии (молекулы, которые усиливают контакт Т-клеток с АПК), и как молекулы, передающие сигнал. Почти все зрелые Т-клетки экспрессиру- ют CD2, который тоже обладает адгезивными свойствами и способностью передавать сигналы. У людей CD2 взаимодействуют с CD58 (LFA-3), экспрессированными на различных клетках. Молекулы CD2, CD4 и CD8 экспрессируются почти исключительно на Т-клетках. Другие мо- лекулы, называемые интегринами — семейство двухцепочечных молекул, — экспрессируются Т- клетками и клетками других типов. Интегрины играют важную роль в адгезии Т-клеток к АПК и эндотелиальным клеткам кровеносных сосудов. Опосредованная интегринами адгезия усилива- ется хемокинами — небольшими цитокинами, вырабатываемыми во время воспалительных ре- акций (см. гл. 11). Основной интегрин, экспрес- сируемый зрелыми Т-клетками, — это LFA-1 (CDllaCD18Y который взаимодействует с некото- рыми лигандами, включая ICAM-1 (CD54), экспрес- сируемыми на АПК, таких как макрофаги и ден- дритные клетки, а также на эндотелиальных клет- ках. Активированные Т-клетки экспрессируют и другие интегрины, такие как VLA-4 (CD49dCD29), которые взаимодействуют с VCAM-1, экспресси- руемыми на активированных эндотелиальных клетках. Не ясно, участвуют ли интегрины во внут- риклеточной передаче сигнала. Хоминг Т-клетки также экспрессируют на своей поверх- ности молекулы, связанные с хомингом — изби-
ПРИРОДА АНТИГЕНСПЕЦИФИЧНОГО Т-КЛЕТОЧНОГО РЕЦЕПТОРА 125 рательным проникновением лимфоцитов разных типов в различные ткани. Наивные Т-лимфоциты поступают в периферические лимфатические узлы и лимфатические скопления в слизистых оболоч- ках. Хоминг опосредуется связыванием молекул CD62L (L-селектин или MEL-14), экспрессируе- мых на поверхности наивных Т-клеток, с гликоп- ротеиновыми молекулами адресатами, которые экспрессируются на клетках в определенном уча- стке сосудистого эндотелия на границе лимфатиче- ских узлов. Это взаимодействие запускает даль- нейшие парные взаимодействия, которые приво- дят к тому, что наивные лимфоциты покидают кровоток и поступают в лимфатический узел, про- тискиваясь через тесно прилегающие друг к другу эндотелиальные клетки. Как будет более деталь- но описано в гл. 10, активированные антигеном лимфоциты и Т-клетки памяти выходят из лим- фатических узлов и поступают в участки кожи и другие ткани. Этот процесс опосредуется путем снижения на поверхности клетки экспрессии CD62L и повышения экспрессии других молекул, таких как CD44 и интегрин CD49dCD29 (VLA-4), описанный ранее. Недавние наблюдения указывают, что наивные лимфоциты и Т-клетки памяти отличаются по экспрессии не только молекул хоминга, но и хе- мокиновых рецепторов. Таким образом, различия в экспрессии как молекул хоминга, так и хемо- киновых рецепторов приводят к появлению раз- личных субпопуляций Т-клеток, избирательно мигрирующих в разные участки тела. у§- Т-клетки Некоторые Т-клетки экспрессируют TCR, отлич- ный от оср. Этот альтернативный TCR известен как у8, а клетки, экспрессирующие этот рецеп- тор, называют у8-Т-лимфоцитами. Вместе с у8- цепями TCR экспрессируются CD3 и (Заметь- те, что у8-цепи TCR отличаются от у- и 8-цепей CD3.) Обычно у у8-клеток отсутствует корецеп- торная молекула CD4, имеющаяся на Т-клетках, экспрессирующих ocf}, но некоторые у8-клетки эк- спрессируют CD8. У взрослых людей в норме у8-Т-клетки наблю- даются в значительно меньшем количестве, чем «р-клетки, но их число возрастает при встрече с инфекционными агентами. у8-Т-клетки присут- ствуют