Author: Квасников Е.И.
Tags: биология клетки и субклеточных частиц цитология биология микробиология
Year: 1975
Text
АКАДЕМИЯ НАУК СССР
Всесоюзное микробиологическое общество
Институт микробиологии и вирусологии
им. Д. К. Заболотного АН УССР
Е. И. КВАСНИКОВ, О. А. НЕСТЕРЕНКО
МОЛОЧНОКИСЛЫЕ
БАКТЕРИИ
И ПУТИ ИХ ИСПОЛЬЗОВАНИЯ
ИЗДАТЕЛЬСТВО «НАУКА» МОСКВА 1975
УДК 576.852.22; 576.852.24
Молочнокислые бактерии и пути их использования. Квасников Е. И., Несте-
ренко О. А. М., «Наука», 1975, стр. 1—384.
Книга посвящена молочнокислым бактериям — группе микроорганизмов, иг-
рающей большую и разностороннюю роль в жизни человека. Описаны методы
исследования молочнокислых бактерий, особенности их морфологии, цитологии,
физиологии и биохимизма. Большое внимание уделено систематике. Приведены
ключи для определения культур. Изложены вопросы, связанные с использова-
нием молочнокислых бактерий в различных отраслях народного хозяйства, осо-
бенно в хлебопечении, силосовании кормов, биологическом консервировании
овощей и фруктов, изготовлении мясных и рыбных продуктов, получении молоч-
ной кислоты и декстрана.
Предназначена для широкого круга исследователей, практических работников-
специалистов в области биологии, здравоохранения, пищевой, бродильной, ми-
кробиологической промышленности и сельского хозяйства, а также преподава-
телей и студентов вузов.
Табл. 53, илл. 23, библ. 26 стр.
„ 21007-149
К 055(02)—75 578-75
(g) Издательство «Наука», 1975 г.
}
Ш teal
ВВЕДЕНИЕ
Истоки многих направлений практического использования мо-
лочнокислых бактерий возникли в глубокой древности, когда чело-
век начал стихийно применять их в своей повседневной жизни.
Классические работы Луи Пастера открыли первые страницы в
изучении этой важной группы микроорганизмов. В небольшом ис-
следовании, опубликованном в 1857 г., Пастер на этом объекте с за-
мечательной экспериментальной достоверностью и прозорливостью
показал роль микроорганизмов в превращении веществ в природе.
Дата опубликования этих исследований по существу является да-
той рождения новой науки — микробиологии.
Молочнокислые бактерии уже свыше ста лет привлекают к себе
возрастающее внимание исследователей. Развитие микробиологии
резко расширило и усовершенствовало области применения этих
микроорганизмов. На основе использования их возникли крупные
отрасли народного хозяйства.
Молочнокислые бактерии играют важную роль в хлебопечении,
особенно при приготовлении ржаного хлеба. Консервирующее
действие их используют для предохранения многих продуктов
от порчи — квашение овощей (капуста, огурцы, помидоры, арбузы
и др.) и фруктов.
Велика роль молочнокислых бактерий в биологическом консер-
вировании кормов — силосовании, в приготовлении некоторых кис-
лых напитков (квас и др.), при засоле рыбы (сельдь, килька), в
изготовлении ряда мясных продуктов. С помощью молочнокислых
бактерий в промышленности получают молочную кислоту. Неко-
торые из них используют и для синтеза декстрана, применяемого
в медицине в качестве частичного заменителя крови. Огромна
роль молочнокислых бактерий в молочной промышленности.
Издавна было отмечено и оздоравливающее значение ряда
продуктов, изготовленных с использованием молочнокислых бак-
терий, для лечения ряда заболеваний. Широко применяли их вра-
чи древности. Указания на это мы встречаем у врача XII века
Абу Али Ибн Сина в его «Каноне врачебной науки». Наш вели-
кий соотечественник И. И. Мечников в поисках путей борьбы с
преждевременной старостью указал на молочнокислые бактерии
как антагонисты вредных микробов, обитающих в кишечном тра-
кте человека. Эти исследования явились стимулом к изучению их
антибиотических свойств. Выявлен ряд антибиотиков, продуци-
3
руемых молочнокислыми бактериями. Некоторые из них с успе-
хом испытываются в пищевой промышленности, а возможно
найдут применение как дополнительное лечебное средство и в ме-
дицине.
Среди молочнокислых бактерий выявлены индикаторные штам-
мы. Эти «живые реактивы» находят применение при исследова-
нии витаминов и аминокислот не только в работе научных лабо-
раторий, но и в практике пищевой и витаминной промышленно-
сти.
Неуклонный интерес к изучению молочнокислых бактерий
обусловлен не только тем, что они играют большую и разносто-
роннюю роль в хозяйстве человека. Эти микроорганизмы оказа-
лись чрезвычайно удобным объектом и для исследования ряда
вопросов, связанных с процессами метаболизма живых клеток.
Литература, посвященная молочнокислым бактериям, огром-
на. Вопросы ее биологии были освещены нами в монографии
(Е. И. Квасников. Биология молочнокислых бактерий, 1960 г.).
Но, несмотря на то что с момента ее издания прошло 15 лет, с
тех пор ни в отечественной, ни в зарубежной литературе не поя-
вилось ни одной книги, посвященной этой теоретически интерес-
ной и практически важной группе микроорганизмов. Лишь молоч-
нокислым бактериям молока посвящен ряд капитальных работ.
В настоящей работе обобщены результаты наших почти соро-
калетних исследований и важнейшие достижения мировой науки,
посвященные изучению морфологии, цитологии, физиологии и
биохимизма группы. Освещаются современные методы исследо-
вания этих микроорганизмов. Большое внимание уделяется воп-
росам систематики, приведены практические ключи для опреде-
ления культур. Даются: новая трактовка экологии этой группы,
закономерности распространения в природе и характер взаимоот-
ношений с органическим миром (другими микроорганизмами, ра-
стениями и животными), освещаются вопросы использования
молочнокислых бактерий в пищевой и бродильной промышленно-
сти, сельском хозяйстве и здравоохранении.
В проведении экспериментальных работ цо отдельным разде-
лам исследований и во внедрении разработанных рекомендаций
в практику деятельное участие принимали сотрудники и аспиран-
ты авторов. Имена их будут указаны в соответствующих разделах
книги. Авторы считают приятным долгом принести им свою глубо-
кую благодарность.
СВОЙСТВА
МОЛОЧНОКИСЛЫХ
БАКТЕРИЙ
ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА МОЛОЧНОКИСЛЫХ БАКТЕРИЙ
Основным свойством молочнокислых бактерий, по которому их объ-
единяют в отдельную обширную группу микроорганизмов, является
способность образовывать в качестве главного продукта брожения
молочную кислоту. Сбраживание углеводов по типу молочнокисло-
го брожения, как правило, коррелирует с рядом других признаков.
Молочнокислые бактерии неподвижны, не образуют спор, каталазо-
негативны, положительно окрашиваются по Граму, не образуют
пигмент, не восстанавливают нитраты в нитриты.
В последние годы были описаны штаммы, которые по некоторым
свойствам отличаются от типичных. Они подвижны, восстанавлива-
ют нитраты в нитриты, образуют споры, каталазоположительны.
Остановимся на характеристике отдельных свойств группы мо-
лочнокислых бактерий.
Морфология клеток
По форме клеток молочнокислые бактерии — палочки и кокки. Раз-
меры их варьируют у отдельных видов.
Бактерии рода Streptococcus — круглые или слегка овальные
клетки диаметром от 0,5—0,6 до 1 мк, расположенные единично,
парами или различной длины цепочками. Однако, как указывает
Орла-Иенсен (Orla-Jensen, 1942), типичный представитель этого
рода Str. lactis1 некоторые считают палочковидной формой, по-
скольку клетки больше в длину, чем в ширину.
Бактерии рода Leuconostoc — удлиненные и яйцевидные, диа-
метром от 0,5 до 0,8 мк и длиной до 1,6 мк, иногда они имеют
палочковидную форму длиной до 1—3 мк, располагаются цепоч-
ками, не образуя кучкообразных скоплений клеток.
Еще более разнообразны по форме палочковидные молочнокис-
лые бактерии рода Lactobacillus (лактобациллы) — от коротких
коккообразных до длинных, нитевидных (рис. 1, а-е). Так, бакте-
рии вида L. plantarum прямые, с закругленными концами палоч-
ки различной длины — от 0,7—1,1 до 3,0—8,0 мк, расположенные
единично или цепочками (Pederson, 1936). Широко распространен-
ный в молоке вид L. casei имеет короткие или сравнительно длин-
ные, тонкие палочковидные клетки, иногда слегка извитые, распо-
ложенные парами или цепочками, причем длина отдельных палочек
и цепочек клеток определяется средой выращивания (Orla-Jen-
1 При цитировании чужих исследований мы по всей работе сохраняем ори-
гинальную транскрипцию видов, употребляемую авторами.
6
Рис. 1. Клетки Lactobacillus на агаризованной среде МРС в возрасте
36 час, X 1680
а — L plantarum, выделенный из эпифитной микрофлоры; б — L. casei var. case! —
из рубца коровы; в — L. easel var. rhamnosus - из молока; г — L. brevis NCTC 1817;
б—L. buchneri NCTC 8518; е — L. acidophilus NCTC 1723
7
sen, 1942; Hansen, Lessel, 1971). Среди лактобацилл встреча-
ются и изогнутые палочки характерной грушевидной формы —
L. coryniformis; изогнутая форма клеток присуща и виду L. спг-
vatus (рис. 2, а, б). Изучая молочнокислые бактерии, выделенные
из различных источников (силос, эпифитная микрофлора, вино),
мы неоднократно отмечали, что представители L. brevis на агари-
зованных средах образуют характерные «обрубленные», почти
квадратные клетки; иногда они достигают 2—3 мк и очень ред-
ко — 9 мк. Бактерии располагаются одиночно, парами или корот-
кими цепочками. Очень короткие палочки видов L. brevis и L. cel-
lobiosus выделяли также Або-Элнага и Канцлер (Abo-Elnaga,
Kandler, 1965b, 1966b) (рис. 2, в, г).
Очень типична форма клеток видов термофильных молочно-
кислых бактерий подрода Thermobacterium. Они растут в виде
Рис. 2. Электронно-микроскопические снимки клеток, выращенных на
жидкой среде, в возрасте 24 час. (Abo-Elnaga, Kandler, 1965а; Kandler,
Abo-Elnaga, 1966b)
“—Lactobacillus coryniformis ssp. coryniformis, X 7500; 6—L. curvatus, X 24 000;
— L. brevis; a — L. cellobiosus; Э, e — L. coprophilus; a — ex 7800
8
Рис. 3. Ультратонкая структура клеток Lactobacillus casei, X 88 000
(Brown et al., 1968)
n — полифосфатные включения; р — рибосомы; кс — клеточная стенка:
им — цитоплазматическая мембрана
Е. И. Квасников, О. А. Нестеренко
Рис. 4. Ультратонкая структура Lactobacillus casei, X 132 000 (Brown et al.,
1968)
тцм — трехслойная цитоплазматическая мембрана; кс — клеточная стенка; ям— нити
ядерного материала; в — везикулярные остатки старой увеличенной мезосомы
Рис. 5. Ультратонкая структура лактобацилл
а, б, е — часть среза клетки Lactobacillus с asei, X 200 000 (Brown etal., 1968); г —
L. corynoides (Schotz et al., 1965) ян—плотные тонкие ядерные нити; м— ла-
меллярные (у L. casei) и трубчатые (у L. corynoides) мезосомы; ц — цитоплазма;
мм — слои цитоплазматической мембраны
Рис. 6. Подвижные формы лактобацилл,
выделенных из силоса (Gemmell, Hod-
gkiss,/1964)
длинных, нередко толстых палочек, часто нитевидных или в длин-
ных цепочках (рис. 1, е).
Длина клеток у различных культур одних и тех же видов мо-
лочнокислых бактерий зависит в определенной степени от состава
среды, присутствия кислорода, способа инкубации. Так, стрепто-
кокки (Str. cremoris, Str. bovis) могут вытягиваться и напоминать
палочковидные формы, а палочковидные бактерии — образовывать
стрептококкоподобные цепочки (например, Streptobacterium casei,
Sbm. plantarum, Betabacterium breve) (Orla-Jensen, 1942).
Как указывает Мак Дональд (McDonald, 1971), в культурах
Str. cremoris и Str. lactis, выращенных в хемостате на среде с 2%
молочного порошка (а также иных средах), обнаруживаются длин-
ные нитевидные клетки. Это, очевидно, связано со снижением ак-
тивности бактериальных аутолитических ферментов, участвующих
в процессе расхождения образующихся при делении клеток.
Существенное влияние на форму клеток оказывает присутствие
в среде некоторых витаминов. Так, L. leichmannii при развитии в
полноценной синтетической среде, содержащей витамин Bi2, обра-
зует типичные для этого вида формы клеток. При недостатке же,
витамина В12 или замене его одной из дезоксирибозидаз эта бакте-
рия образует нитевидные формы клеток. По-видимому, витамин
В12 играет существенную роль в процессе нормального клеточного
деления.
Удлинение формы клеток, их истончение и грануляцию наблюл
дали Педерсон и Албери (Pederson, Albury, 1955) при культивиро-
вании отдельных молочнокислых бактерий на средах с высокой
активной кислотностью (pH 3,7), при значительном содержании
поваренной соли (до 6%), при температурах, намного превышаю-
щих оптимальные (45° вместо 18°). Такие же длинные, тонкие,
гранулированные палочки нередко выделяются и из бродящих ово-
щей, рассолов, вин, сусел, томатных продуктов.
Образование удлиненных палочковидных клеток у некоторых
молочнокислых бактерий происходит и при развитии их в средах с
высоким содержанием этилового спирта (Квасников, 1949, 1951а,
1952а).
На форму клеток значительное влияние могут оказывать ио-
низирующие излучения. Высокие и средние дозы облучения гам-
ма-лучами (порядка 100—300 тыс. рентген) двухсуточных куль-
тур L. plantarum и L. brevis сильнее тормозят деление клеток, чем
их рост. Поэтому в культурах непосредственно после воздействия
облучения, как правило, образуются длинные палочковидные и
нитевидные, а также дегенеративные раздутые формы клеток
(Квасников и др., 1961; Гриневич, 1967).
Значительное увеличение длины клеток L. casei наблюдается
при воздействии на бактерии лизоцима (Rogosa, 1970). Изменен-
ные клетки молочнокислых бактерий появляются и при добавле-
нии в среду веществ, снижающих поверхностное натяжение, а так-
же антибиотиков.
9
Условия роста нередко настолько изменяют первоначальные
морфологические и физиологические свойства молочнокислых бак-
терий, что отдельные авторы им даже давали новые видовые наз-
вания. В связи с этим Педерсон и Албери (Pederson, Albury, 1955)
рекомендуют после выделения лактобацилл из таких источников,
как кислые, соленые или спиртосодержащие продукты, выращи-
вать их в стандартных лабораторных условиях в течение некото-
рого времени, чтобы решить, отличаются ли они от ранее описан-
ных видов.
При микроскопировании, особенно в недостаточно сильных
оптических системах, исследователь нередко затрудняется, куда
отнести тот или иной штамм молочнокислых бактерий — к коккам
или палочкам, так" как длина некоторых видов лишь немного пре-
вышает ширину. При изучении таких форм мы рекомендуем про-
изводить высев в среды, содержащие 8—14 об.%' этилового спирта.
Спирт, как мы показали (Квасников, 1960), тормозит деление кле-
ток сильнее, чем их рост. Поэтому кокки в спиртсодержащих'сре-
дЗх~сохраняют”своюформу, палочки же обычно вытягиваются в
длину. < . *• Л ~ :л f*
Улътраструктура клеток молочнокислых бактерий и ряда дру-
гих грамположительных бактерий во многом схожа (Suganuma,
1966^ВпсЕтТгё,Т970).Так, клеточная стенка лактобацилл пред-
ставляет собой относительно электронно-плотный гомогенный слой
толщиной 15—6Д .ммк (Brown et al., 1968) (рис. 3—5). Цитоплаз-
матическая мембрана может быть двухслойной (Кац, Харатьян,
1969) или трехслойной, шириной до 75—85 A (Brown et al., 1968)
(рис. 4).
На срезах клеток различных видов лактобацилл обнаружены
развитые мезосомальные структуры нескольких типов. Так, благо-
даря впячиванию цитоплазматической мембраны в цитоплазму у
L. easel образуются ламеллярные мезосомы (Brown et al., 1968)
(рис. 5), у Lactobacterium pentoaceticum (Lactobacillus brevis) —
трубчатые мембранные органоиды (Кац, Харатьян, 1969). Интен-
сивно развитые трубчатые мезосомы обнаружены и у L. corynoides,
причем плотно упакованные ряды трубок лежат вдоль и поперек
плоскости среза бактерии (Schotz et al., 1965) (рис. 5).
В последние годы значительное внимание исследователей уделя-
ется не только расшифровке структуры цитоплазматических мем-
бран и мезосом, но и их функций, в частности локализации в них
отделыиых~^рментных "СйС'темГПе исключено, что мембранные
структуры, возникая непосредственно в местах образующейся кле-
точной перегородки, принимают участие в образовании материала'
, клеточной оболочки. Есть предположение о выполнении мезосома-
ми и выделительной функции (Харатьян и др., 1967; SchoTFet al.,
'Т9Т>5). Исследование локализации продукта восстановления тетра-
золид тетранитроголубого на ультратонких срезах клеток L. casei,
выращенных"на"среде с маннитом я способных окислять его, пока-*"
зало, что диформазан локализуется как в районе цитоплазмати-
10
ческой мембраны, так и мезосом. Эти результаты могут свидетель-
ствовать о том, что, возможно, такие ферменты, как флавин-свя-
аанная терминальная оксидаза и (или) диафодаза, локЯКЗуЙсь'на’
мемораше”’и~мёз0йягах(®iff внутри их), ответственны за восста-
новление краски (Brown et al., 1968).
В цитоплазме клеток лактобацилл обнаружены дискретные ри-
босомы диаметром до 150 А (рис. 3); находят область ядерного ма-
териала(нуклеоид), состоящего из тонких плотных нитей шири-
ной 20—2аА7“ОТ'б'Ждествляемых с дезоксирибонуклеиновой кисло-
той (ДНК) (Brown et al., 1968) (рис. 5).
"р У низинпродуцирующих Str. lactis клеточная стенку (200 А) и
4 . цитоплазматическая мембрана (70 А) соединены между собой тя-
жами (Hurst, Stubbs, 1969). Клеточная стенка имеет внешнюю
’^гладкую поверхность, а внутренняя состоит из элементов с пери-
одичностью 100 А. В клеточной стенке находятся «поры» (200—
600 А), которым на поверхности цитоплазматической мембраны
соответствуют «пробки» (до 200А).
Сложное строение клеточной стенки обнаружено и у других
стрептококков, например, Str. faecalis (Shockman, Martin, 1968).
Воздействуя на клеточные стенки этих бактерий автолитически-
ми ферментами и лизоцимом, удалось показать, что указанные со-
единения, снимая поверхностные слои стенки, обнажают Фибрил-
лярные структуры pasMgjMiM^ffiuip—30 ммк. Интересно отметить,
что на клеточных“Ттенках Str. faecalis выявлены экваториальные
пояса, которые можно было разрушить только после длительного
воздействия ферментами и лизоцимом. При этом показано, что
ферменты латентного автолиза находятся в районе экваториаль-
ных поясов. Возможно, эти зоны (состоящие из тейхоевой кисло-
ты) принимают участие в росте и делении клеточной стенки.
Условия культивирования влияют на ультраструктуру клеток
молочнокислых бактерий. Так, Мота с сотрудниками (Mota et al.,
1972) установили, что клеткй Str. faecalis, выращенные на среде
> с глюкозой при pH 4,2,(имеют отчетливо сформированную трех-
слойную цитоплазматическую мембрану, а при действии лизоци-
ма образуют стабильные сферические протопласты. Если же Str.
faecalis культивировать на среде без глюкозы, то синтез цитоплаз-
матической мембраны нарушается, а протопласты приобретают не-
правильную форму. Выращивание Lactobacterium pentoaceticum
при сильной (аэрации4 приводит к тому, что клеточная мембрана из
асимметричной становится симметричной;, а мембраноидные труб-
чатые органоиды распадаются, обнаруживаясь в пространства
между клеточной стенкой и мембраной (Кац, Харатьян, 1969). (
Внутренняя структура клеток может быть различной у отдель-
ных видов. Иногда палочковидные формы содержат зерна метахро-
матина, который может образовывать в них крупные включения.
Нахождение таких включений в клетках характерно, например, для
определенных видов подрода Thermobacterium. По данным Шарп
(Sharpe, 1962), Lactobacillus helveticus и L. jugurti можно отличит»
11
от L. bulgaricus и L. lactis по присутствию у последних метахрома-
тиновых гранул. Они обнаруживаются при выращивании бактерий
в молоке с глюкозой и дрожжевым автолизатом и окрашиваются
метиленовой синью. Однако, как указывает Гансен (Hansen,
1965), Орла-Иенсен наблюдал образование гранул не только L. bul-
garicus, но и L. jugurti.
Молочнокислые бактерии размножаются делением перегород-
кой. Если клетки делятся в одной плоскости, это приводит к обра-
зованию цепочек; когда же деление идет в двух плоскостях, обра-
зуются так называемые тетрады, характерные для молочнокислых
бактерий рода Pediococcus. Следует отметить интересные наблюде-
ния Германа (Herrmann, 1966), который методом травления по
замороженному срезу показал, что у педиококков группы, состоя-
щие из двух, трех, или четырех клеток, имеют' общую клеточную
стенку. Тетрады образуются из единичной клетки путем деления
ее в разных плоскостях, но не образуются вторично путем перерас-
пределения клеток в цепочке.
Некоторые авторы (Скалой, 1939; Канунникова, 1954, и др.)
описывали образование у молочнокислых бактерий фильтрующихся
форм.
Молочнокислые бактерии неподвижны. Следует, однако, отме-
тить, что имеется ряд сообщений о нахождении подвижных форм.
Так, Гаррисон и Гансен (Harrison, Hansen, 1950а) из фекалиев
индюков выделили микроорганизмы, у которых при электронном
микроскопировании были выявлены перитрихиальные жгутики,
и отнесли их к роду Lactobacillus, назвав Lactobacillus plantarum
var. mobilis. Принадлежность к данному виду исследователи уста-
навливали на основании сбраживания организмами раффинозы и
мелибиозы. Они наблюдали, что выделенный штамм образует не
только DL-молочную кислоту, но и избыток L(+)-молочной кисло-
ты. Температурный оптимум роста штамма — 44°; при 20° роста не
наблюдается. Отдельные клетки изогнуты, часто длинные, располо-
женные по 2—3 вместе, но цепочек не образуют.
Однако Або-Элнага и Кандлер (Abo-Elnaga, Kandler, 1965а)
считают, что по этим признакам выделенные штаммы вряд ли
можно причислить к L. plantarum. Скорее их следует идентифици-
ровать как L. salivarius.
О подвижных гомоферментативных молочнокислых бактериях
из силоса сообщали Каннингхэм и Смит (Cunningham, Smith,
1940), Мэн и Оксфорд (Mann, Oxford, 1954) выделили подвижные
штаммы из рубца телят. Возможно, эти организмы, ввиду их спо-
собности расти при 45° и отсутствия роста при 16°, являются видом
L. salivarius (Gemmell, Hodgkiss, 1964). Подвижные анаэробные
лактобациллы с перитрихиальными жгутиками, выделенные из
рубца коровы, описали и Шарп с сотрудниками (Sharpe, Latham et
al., 1973). Авторы назвали их Lactobacillus ruminis n. sp.
Хейсу и Рейстеру (Hays, Reister, 1952) из апельсинового сока
удалось выделить подвижные молочнокислые бактерии, позднее
12
идентифицированные Педерсоном (Pederson, 1952, цит по Tittsler,
1952) как L. plantarum. Дейбл и Нивен (Deibel, Niven, 1958) сооб-
щили о подвижных бактериях, изолированных из ветчинных рас-
солов и с поверхности ветчины; по свойствам они занимали проме-
жуточное положение между L. casei и L. plantarum.
Ванкова (Vankova, 1957) также обнаружила подвижные молоч-
нокислые бактерии. В Чехословакии их применяют для получения
молочной кислоты. Под электронным микроскопом у семи-девяти-
часовых культур бактерий были выявлены жгутики. Автор иденти-
фицировала эти бактерии как L. delbruckii. Однако нахождение
цитохромов а и Ь, а также каталазы у этих штаммов дает возмож-
ность предположить, что в действительности эти микроорганизмы
принадлежат к роду Bacillus (Davis, 1964).
Позднее Кедди (Keddie, 1969) выделил гомоферментативные,
палочковидные, подвижные, растущие при пониженных темпера-
турах, молочнокислые бактерии из силоса. Ленгстон и Боума
(Lanston, Вошла, 1960а) из этого же субстрата изолировали под-
вижные штаммы и назвали их L. casei (variable) на том основании,
что они соответствовали в большей степени описанию L. casei, чем
L. plantarum.
Торнли и Шарп (Thornley, Sharpe, 1959) описали подвижные
гомоферментативные молочнокислые бактерии, выделенные из ку-
риного мяса. Эти неспорообразующие микроорганизмы по своим
свойствам занимают промежуточное положение между молочно-
кислыми палочками и аэробными спорообразующими бактериями.
Геммель и Ходгкис (Gemmell, Hodgkiss, 1964) отмечают, что ввиду
того, что указанные штаммы были выделены из облученного мяса,
трудно что-либо сказать об их свойствах, так как мы мало знаем о
влиянии облучения на молочнокислые бактерии.
О подвижном штамме вида L. curvatus сообщают также Або-Эл-
нага и Канцлер (Abo-Elnaga, Kandler, 1965а). Они отмечают,
однако, что при последующих пересевах подвижность у этого мик-
роорганизма не наблюдалась. Китахара и Сузуки (Kitahara, Suzuki,
1963) из корма для птиц выделили молочнокислые бактерии, рас-
тущие в виде палочек (0,7—0,8X3,0—5,0 мк), соединенных попар-
но, редко в коротких цепочках. В молодом возрасте у бактерий
наблюдали перитрихиальные жгутики, а подвижность сохранялась
в течение более, чем 72 час. в среде, забуференной уксуснокислым
натрием или углекислым кальцием.
Геммель и Ходгкис (Gemmell, Hodgkiss, 1964) из силоса выде-
лили 28 подвижных, гомоферментативных, мезофильных палочко-
видных молочнокислых бактерий (рис. 6) и подробно изучили их
свойства. Изолированные штаммы не сбраживали мелибиозу и
поэтому не могли быть отнесены к L. plantarum. Следует отметить,
что четыре штамма обладали необычным свойством — образовыва-
ли декстран на среде с сахарозой. Авторы считают, что наличие
жгутиков вряд ли может иметь таксономическое значение, ибо из
силоса выделяются и неподвижные формы, в остальном аналогия-
<г ! Л'/
ные подвижным. Это наблюдали и другие исследователи (Deibel,
Niven, 1958; Keddie, 1959; Langston, Вошла, 1960a).
По мнению Каннингхэма, Смита (Cunningham, Smith, 1940) и
Кедди (Keddie, 1959), движение молочнокислых бактерий происхо-
дит с помощью одного жгутика. Однако, как мы указывали, Гарри-
сон и Гансен (Ймг!^пГНап§еп, 1950а) установили перитрихиаль-
ное расположение жгутиков у изученных ими организмов. Нахож-
дение перитрихиальных жгутиков у подвижных лактобацилл
согласуется с данными других авторов (Langston, Вошла, 1960а;
Gemmell, Hodgkiss, 1964, и др.).
Подвижные стрептококки, принадлежащие к группе энтерокок-
ков, описаны рядом авторов (Langston, Gutierrez, Bouma, 1960b,
Lund, 1967).
Выше мы указывали, что характерным для молочнокислых бак-
терий является отсутствие спорообразования.* Однако в последние
годы были описаны сподооЗдйз ию wue молочнокислые бактерии.
Китахара и СузукиДКтЫтагп, Suzuki, Г9ВЗУ”обн'аружили,~что
выделенные ими подвижные лактобациллы, о которых мы говорили
выше, обладают способностью образовывать споры. Они распола-
гаются паддщцах клеток в разбухших спорангиях, имеющих форму
эллиптического цилиндра размером до 1 мк. При выращивании
данных микроорганизмов в среде с пептоном (0,5 %), дрожжевым
экстрактом Дифко (0,5 %), глюкозой (2 %) количество .спорообра-
зующих клеток незначительно.ШдщГко число их сильно возрастал^
'в среде с небольшим содержанием глюкозы, в присутствии СаСО3 и)
ионов мГафг'анца в концентрации 10“* М. (количество спорообразую-;
^щих“кле.тщ£ определяли при высеве культуры, прогретой до 8(гв
’течений 10 mhhj'> • - . . --------- — -----
Подвижные спорообразующие бактерии Китахара и Сузуки
предложили выделить в новый подрод Sporolactobacillus семейства
Lactobacillaceae и назвать его Sporolactobacillus inulinus nov. sp.
Авторы полагают, что они занимают промежуточное положение
между родами Lactobacillus и Clostridium.
Впоследствии были подобраны оптимальные условия культиви-
рования и среда для максимального образования спор. Состав ее
(в %): дрожжевой экстракт — 0,1; мясной экстракт — 0,5;
(NH4) 2SO4 — 1,0; а-метилглюкозид — 0,5; томатный сок — 20;
СаСО3 (в избытке). Культивирование штаммов при 37° позволяло
получать культуры, состоящие на 98% из спор (Kitahara, Lai,
1967). Споры S. inulinus выдерживают нагревание до 80° в течение
10 мин., имеют строение, подобное строению спор других бактерий.
Китахара и Лаи (Kitahara, Lai, 1967) показали, что количество
дипиколиновой кислоты, находящейся в спорах, достигает макси-
мума (5,16 %l от сухого веса спор) к шестым или седьмым суткам
роста. Интересно отметить, что исключение из вышеприведенной
среды (NH4)2SO4 и СаСОз влечет за собой превращение до 20%
клеток в «головастикоподобные». Последние были лишены термо-
устойчивости и рефрактильности, присущей спорам.
Штаммы, близкие к S. inulinus, были выделены из ризосферы
дикорастущих растений (Nakayama, Yanoshi, 1967). Эти перитри-
хиальные (реже с полярным жгутиком) бактерии образовывали
терминально или субтерминально расположенные споры (0,9—
— 1,4X1,2—2,1 мк) в отчетливых спорангиях. При сбраживании
глюкозы, фруктозы, сахарозы, трегалозы и инулина гомофермента-
тивные спорообразующие бактерии продуцировали DL-молочную
кислоту, снижая pH среды до 3,8—3,2.
Вейксл-Гофман (Weixl-Hofmann, 1958) выяснила, что спорооб-
разование наступает в том случае, если на блок нанести непосред-
ственно культуру из холодильника, длительно хранящуюся там в
скисшемся молоке при температуре несколько выше нуля.
Автор сообщает, что использовав разработанную ^методику, ей
удалось выявить спорообразование у ряда видов молочнокислых
бактерий (в том числе у L. bulgaricus). Данные Вейксл-Гофман
нуждаются в проверке на различных видах молочнокислых бак-
терий.
Форма колоний
Отдельные исследователи нередко весьма противоречиво описы-
вали форму колоний различных видов молочнокислых бактерий.
Еще Орла-Иенсен (Orla-Jensen, 1919) утверждал, что истинные
молочнокислые бактерии на желатиновых и агаризованных сре-
дах образуют мелкие колонии без выраженного поверхностного
роста. С. А. Королев (1932) показал, что это утверждение неточ-
но, так как все виды рода Streptococcus образуют поверхностные
колонии, хотя и мелкие. Однако он указывал, что большая часть
палочек их не образует. По данным О. К. Палладиной (1941),
прибавление в среду веществ, обладающих восстановительными
свойствами, например, 0,2% цистеина, содействует образованию
у молочнокислых палочковидных бактерий типичных поверхно-
стных шероховатых форм колоний..
Ряд исследователей приводит описание поверхностных коло-
ний почти всех видов коккообразных и палочковидных молочно-
кислых бактерий. Термофильные молочнокислые палочки (под-
род Thermobacterium) образуют шероховатые колонии; мезофиль-
ные (подроды Streptobacterium и Betabacterium), как правило,
гладкие, причем эти формы колоний коррелируют с иными
признаками бактерий указанных подродов — способностью расти
при определенной температуре и образовывать длинные, часто
нитевидные или же короткие клетки. Нередко можно наблюдать,
что в культуре наряду с шероховатыми колониями имеются и
гладкие, хотя последние со временем превращаются в шерохова-
тые. Такое явление наблюдается, например, у Lactobacillus
acidophilus, причем гладкие колонии данного вида нередко оши-
бочно отождествляли с гладкими колониями L. casei (Rogosa et al.,
1953). Рогоза с сотрудниками указывают, что в кхмгЯЛвн^Ь. casei,
15
характеризующихся гладкими колониями, с возрастом могут по-
являться колонии с короткими нитевидными ответвлениями, име-
ющие, однако, тенденцию возвращаться к гладким, относительно
большим, имеющим дискообразную или линзоподобную форму при
росте в толще агара.
У бактерий рода Leuconostoc найдены S-, О- и R-типы коло-
ний, причем среди R-типов можно установить еще несколько раз-
новидностей (Непомняща, 1934).
Изучению формы колоний молочнокислых бактерий уделялось
большое внимание в период расцвета исследований по вопросам
диссоциации микроорганизмов. Исследователями было сделано
много попыток в направлении изыскания связи между способ-
ностью бактерий к образованию определенных типов колоний, их
морфологическими признаками и физиологической активностью.
Мы не станем подробно останавливаться на этих исследованиях.
Укажем лишь, что результаты, полученные отдельными автора-
ми, были в значительной степени противоречивы. Обзор этих
работ сделан нами ранее (Квасников, 1960).
Л. П. Старыгина (1935) утверждала, что L. casei, образующие
колонии круглой формы, состоящие из отдельных небольших па-
лочек, накапливают больше кислот, чем те же бактерии с паучко-
образными колониями, которые состоят из сильнозернистых кле-
ток. То же наблюдала она и при изучении Str. lactis. Расы с
круглыми колониями (S) сбраживали большее количество угле-
водов, чем образующие паучкообразные колонии (R). По
данным Треси (Tracey, 1938), S-вариант L. plantarum более ак-
тивен, чем R-вариант. Бактерии, относящиеся к S-варианту,
образуют кислоту из глюкозы, арабинозы и раффинозы. Предста-
вители R-варианта кислоту из глюкозы не образуют, однако
лучше растут на безутлеводных белковых средах.
Вопрос о природе образования различных форм колоний в
культуре бактерий и перехода одних форм в другие неоднократно
был предметом оживленной дискуссии. Большинство цитируемых
выше исследователей рассматривало его как диссоциацию у мик-
роорганизмов, в основе которой лежат мутации. Существует, од-
нако, иная точка зрения, связывающая превращения одного типа
колоний в другие с условиями существования культуры, особен-
но с ее питанием.
Мобли (Mobley, 1937) установил, что тип колоний L. acido-
philus, вырастающих на агаризованных средах, в значительной
степени зависит от компонентов сред. Автор испытал 18 различ-
ных сред и выявил отдельные, которые содействовали образова-
нию шероховатых или гладких колоний. Шероховатые (волокни-
стые) колонии он наблюдал при высоком содержании белков в
среде (особенно при наличии пептона).
Рогоза и Митчел (Rogosa, Mitchell, 1950) исследовали взаим-
ное превращение S- и R-форм бактерий у L. acidophilus, L. helve-
ticus и L. brevis. Использовались культуры, образующие на среде
16
с томатным соком шероховатые колонии. При введении в среду
сорбитанмоноолеата (твин 80) культура, образующая шерохова-
тые колонии, стала давать только гладкие. На основании своих
опытов, позволяющих произвольно изменять форму колоний в
любом направлении, авторы утверждают, что эта способность свя-
зана с изменением состава среды, но не с мутациями.
Как отмечают Рогоза с сотрудниками (Rogosa et al., 1953),
генотипические изменения формы колоний безусловно имеют мес-
то, однако, как показано в ряде работ, они встречаются так редко
на среде, не содержащей веществ, способствующих изменению
фенотипа, что почти во всех случаях тип колоний на стандартных
средах является отличительным для вида.
Девис с соавторами (Davis et al., 1955) изучили 221 штамм
гомо- и гетероферментативных молочнокислых палочковидных
бактерий и пришли к выводу, что большой процент гомофермен-
тативных штаммов обладает колониями в виде «головы Медузы»,
а гетероферментативные имеют гладкие, бесструктурные коло-
нии. В связи с этим авторы рекомендуют широко применять куль-
туральные признаки при классификации молочнокислых бакте-
рий. В противоположность изложенным данным было показано,
что у молочнокислых бактерий, выделенных из сыра, гладкие ко-
лонии преобладают как у гомо-, так и у гетероферментативных
видов (Smith, Cunningham, 1962), что свидетельствует о том, что
в ряде случаев не удается установить коррелятивную зависимость
между формой колоний и рядом иных свойств у этих микроорга-
низмов.
Форму колоний, как один из ключевых признаков, использует
Девис (Davis, 1959а) в схеме дифференциации видов pp^a^f»a^to-
bacillus.
Протеолитическая, липолитическая
и нуклеазная активность
Молочнокислые бактерии обладают определенной
ской активностью, обусловливаемой действием протеиназ и пепти-
даз.
Протеолитическую активность проявляют как кокковые фор-
мы, так и термофильные палочки и стрептобактерии. В процессе
протеолиза белков молока, особенно в начале культивирования
штаммов в молоке, происходит накопление главным образом ами-
нокислот (аспарагиновой кислоты, глицина, серина, глутаминовой
кислоты, треонина, тирозина, валина, фенилаланина, изолейцина),
а также пептидов (Королева, 1968; Щедушнов, Дьяченко, 1972, и
др.). Молочнокислые палочковидные бактерии обладают большей
протеолитической активностью, чем кокковые формы. Так, L. bul-
garicus, L. casei могут переводить до 25—30% казеина в раствори-
мую форму, тогда как Str. cremoris и Str. lactis — 15—17% (Джес-
персон, 1971).
17
Протеолитическую активность молочнокислых бактерий оцени-
вают по накоплению в среде аминного, общего растворимого и не-
белкового растворимого азота (Щедушнов, Дьяченко, 1972); поль-
зуются и иными показателями. Например, разработаны методы
оценки ее путем колориметрического определения количества об-
разующихся в результате белкового протеолиза аминокислот, в
частности, тирозина и триптофана (Залашко, Мочалова, 1969; За-
лашко и др., 1970; Начев, Добрева, 1967, и др.). Как отмечает
В. И. Звягинцев (1973), различные мнения исследователей о про-
теолитической активности тех или иных молочнокислых бактерий
можно объяснить различными критериями, используемыми авто-
рами для характеристики протеолитической активности культур.
В связи с этим В. И. Звягинцев считает, что суммарную протеоли-
тическую активность молочнокислых бактерий следует оценивать
по убыли как казеина вообще, так и его отдельных фракций (as,
Р и у).
Гидролиз белков молока молочнокислыми бактериями осущест-
вляется с помощью внеклеточных и внутриклеточных протеаз.
Так, активные протеазы найдены в бесклеточных фильтратах сред,
на которых в течение 24 час. выращивали L. bulgaricus, а также
Str. lactis (van der Zant, Nelson, 1954).
Из клеток Str. lactis, обладавших способностью расщеплять ка-
зеин, путем обработки их ультразвуком и последующего центри-
фугирования выделено два фермента, обладавших протеиназной
активностью. Один из них связан с клеточной мембраной, а дру-
гой — с цитоплазмой. Мембранная протеиназа разрушается при
температуре от 3 до — 20°; цитоплазматическая стабильна при 3°,
но инактивируется при —20° (Cowman, Speck, 1967; Speck, Cow-
man, 1968). Авторы установили, что протеиназную активность
клеток Str. lactis, утерянную во время хранения их при 3°, можно
восстановить действием на клетки глутатиона. Активность интакт-
ных клеток и фермента, связанного с клеточной мембраной, ак-
тивирует и цистеин.
Существенную роль в процессе гидролиза казеина играют
внутриклеточные протеазы и других молочнокислых бактерий, на-
пример, Str. cremoris и L. helveticus (Ohmiya, Sato,1972).
У молочнокислых бактерий обнаружены протеазы, разрушаю-
щие пептиды. Так, из Str. lactis изолирована внутриклеточная про-
теаза, гомогенная электрофоретически, хроматографически и по
результатам ультрацентрифугирования. Интересно отметить, что
этот фермент специфически гидролизовал пептиды с аланиновым
остатком на N-конце и был активен по отношению к природным
пептидам, которые включали аспарагиновую кислоту или аспара-
гин (Cowman et al., 1968).
Ионы некоторых металлов (Mg++, Мп++) активизируют дей-
ствие пептидаз (Dudani, 1950; van der Zant, Nelson, 1954, и др.).
Брандсаэтер и Нелсон (Brandsaeter, Nelson, 1956) установили,
что гидролиз молочнокислыми бактериями большинства пептидов
18
(например, DL-аланилглицина и глицил-БЬ-аланина) сильно
стимулируется ионами кобальта при pH 5,5—6,0. Авторы считают,
что вариабельность в оптимуме pH, активирование ионами метал-
лов и устойчивость к нагреванию свидетельствуют о том, что у
L. casei существует несколько пептидазных систем.
До настоящего времени нет единого мнения о существовании
зависимости между протеолитическими свойствами культур и энер-
гией кислотообразования. Одни авторы утверждают, что такая за-
висимость существует (Тевелевич, 1961; Залашко, Мочалова,
1969), другие — отрицают. Так, А. К. Максимова (1968) не у всех
изученных ею культур наблюдала зависимость между энергией
кислотообразования и интенсивностью протеолиза. Эта зависимость
отмечалась у штаммов Str. lactis, Str. acetoinicus и отсутствовала у
Str. cremoris и ряда палочковидных форм — Lactobacterium acidop-
hilum, L. bulgaricum, L. casei, L. helveticum.
Под воздействием мутагенных факторов (ультрафиолетовых и
рентгеновских лучей, этиленимина и др.) можно получать мутан-
ты лактобацилл и кокков, отличающиеся от исходных штаммов
повышенной протеолитической активностью (Максимова, 1968;
Пятницына, 1968).
Протеолитическая активность молочнокислых бактерий особен-
но детально исследовалась в связи с задачами, стоящими перед
молочной промышленностью (Orla-Jensen, 1919; Богданов, 1957;
Тевелевич, 1961; Максимова, 1968; Банникова, Максимова, 1969;
Залашко, Мочалова, 1969; и др.). Высказывается мнение в пользу
необходимости подбора штаммов молочнокислых бактерий с вы-
сокой протеолитической активностью для введения их в состав
заквасок, используемых для приготовления ряда молочных про-
дуктов (сыры, кислосливочное масло и др.) (Дьяченко, Шидлов-
ская, 1970; Максимова, 1970; и др.).
В настоящее время бесспорно установлена ведущая роль мо-
лочнокислых бактерий в протеолитическом расщеплении белков
в процессе созревания сыров. Как показали Омийя и Сато (Ohmi-
уа, Sato, 1972), в 1 г сырной массы находится до 10э клеток мо-
лочнокислых бактерий, при автолизе которых в процессе созрева-
ния сыра выделяются внутриклеточные протеазы с активностью
0,022 оптических единиц нм) (активность реннина при этом
равна 0,018 опт. ед.). Если учесть, что в процессе созревания сыра
количество молочнокислых бактерий увеличивается, станет очевид-
ной их роль при получении этого продукта (особенно в сочетании
с действием реннина). Установлено, что введение лактобацилл
(подрод Streptobacterium) в состав закваски при выработке неко-
торых сортов сыров (эдамский, тильзит) значительно улучшает
качество продукта за счет более интенсивного разложения белков
молока (Барр, 1969).
Рядом авторов показана прямая зависимость между степенью
созревания сыра, его вкусом, ароматом и содержанием в нем сво-
бодных аминокислот, накапливаемых протеолитически активными
«а
молочнокислыми бактериями. В настоящее время, однако, считают,
что ведущая роль в образовании характерного вкуса и запаха
сыра все же принадлежит продуктам превращения аминокислот.
Так, лейцин и валин могут служить предшественниками 3-метил-
бутанала и 2-метилпропаната, являющихся соединениями, придаю-
щими специфический вкус сыру чеддер (Звягинцев, 1973).
Учитывая важную роль аминокислот в создании букета сыра,
исследователи (Диланян и др., 1970) рекомендуют подбирать для
сырных заквасок молочнокислые бактерии, накапливающие при
культивировании их на лабораторных средах такие свободные
аминокислоты и в таких количествах, в которых они встречаются
в сырах высшего качества.
При подборе штаммов молочнокислых бактерий, расщепляю-
щих белки молока, с целью введения их в закваски для сыра, важ-
но иметь в виду, что использование для заквасок штаммов, обра-
зующих фракции пептидов с горьким вкусом, недопустимо (Кли-
мовский и др., 1969).
Молочнокислые бактерии либо вовсе не обладают липолити-
ческой активностью, либо проявляют ее в определенной степени
при воздействии на некоторые субстраты. Не исключено, что они
играют роль в процессах созревания сыра, расщепляя жир молц-
ка (Davis, 1960; Reiter, Sharpe, 1971J7^~“” Q g f
Штаммы многих видов молочнокислых кокковых (StiZ lactis,
Str. cremoris, Str. diacetilactis, Str. thermophilus, Leuconostoc me-
senteroides, Pediococcus cerevisiae) и палочковидных (L. helveticus,
L. delbrueckii, L. casei, L. pentosus и L. brevis) бактерий в качестве
субстрата используют некоторые триглицериды. Так, с помощью
диффузионного метода, при котором суспензия бактерий помеща-
ется в лунки, сделанные в агаре, эмульгированном с исследуемым
субстратом, удалось показать, что указанные микроорганизмы об-
разуют значительные зоны просветления вокруг лунок после их
инкубации в течение 24 час. в присутствии трибутирпна. Несколь-
ко слабее эти бактерии гидролизуют триолин и совсе"м"н'е затраги-
вают соевое масло (Gaddi, Marth, 1971). Препарат липазы, полу-
ченный из бесклеточных экстрактов L. brevis, наиболее легко гид-
ролизовал простые триглицериды и с большим трудом трибутирин,
трикапроцн и i^HKanpogra(GKSder et al., 1973). ——______
”* Следует отметить, что молочнокислые бактерии явились объек-
том, с помощью которого были открыты некоторые новые жирные
кислоты. Так, Гофман с сотрудниками (Hofmann et al., 1952; Hof-
mann, Sax, 1953), изучив природу жирных кислот у отдельных
лактобацилл, нашли, что «свободные»' й «Связанные» липиды,
извлеченные из L. arabinosus, содержат пальмитиновую, стеарино-
вую, а также ранее неизвестную жирную кислоту — лактобацил-
.«Ю,(С19Н36О2). С-с ~С
Отдельные виды лактобацилл (L. fermenti, L. casei, L. salivarius,
L. viridescens) способны продуцировать внеклеточные нуклеазы
при выращивании на агаре, содержащем ДНК или РНК. Судя по
' 2Q
величине диаметра светлых зон вокруг колоний на агаре с ДНК,
значительной ДНК-азной активностью характеризуются некото-
рые штаммы L. fermenti (зоны до 3—4 мм). Иногда лактобациллы
синтезируют одновременно и внеклеточную ДНК-азу, и РНК-азу
(A. Miller et al., 1971). . . • '< ,
i
Образование каталазы
Известно, что отсутствие способности образовывать каталазу яв-
ляется характерным признаком молочнокислых бактерий. Однако,
особенно за последние годы, ряд авторов сообщили об обнаружении
каталазной активности у различных видов молочнокислых бак-
терий. Z"!
Установлено, что некоторые молочнокислые бактерии способны
разлагать образующуюся при использовании определенных суб-
стратов перекись водорода благодаря наличию у них каталазной
активпостй,"бсущббтвляел1ой так называемой псевдокаталазой и
собственно каталазой (Whittenbury, 1964). Псевддаатале^а^обна^-”
ружена у штаммов Pediococcus pentosaceus, Leuconostoc mesente-
roides и Lactobacillus plantarum при выращивании их на питатель-
ном агаре с 0,05 %, но не с 1 % глюкозы. При этом у лейконостоков
псевдокаталаза не обнаруживается в анаэробных условиях.
Активность псевдокаталазы значительно снижается при под-
кислении среды от 7,0 до 4,5; на нее не оказывает влияния добав-
ление гематина, 0,01 М азид или 0,01 М цианид. Делвич (Delwiche,
1961) из педиококков изолировал перекисеразлагающий фермент
и показал, что-он не является ни (ГёйЬ-J ни флавощротёином По-
добный фермент найден и у ряда ЛЖТббацилл,''йейКбностоков, пе-
диококков и стрептококков (Johnston, Delwiche, 1962). Очевидно,
именно 'псевдбкаталаза^была обнаружена и рядом других авторов
у педиококков (Felton et al., 1953; Jensen, Seeley, 1954), L. plan-
tarum (Dacre, Sharpe, 1956), Leuc. mesenteroides (Langston, Bou-
ma, 1960a) и представителей рода Streptococcus (Langston, Gutier-
rez, Bouma, 1960a).
Второй фермент, разрушающий перекись,— каталаза — найден
у ряда молочнокислых бактерий (Whittenbury, 1964) только при
выра вании их на среде, содержащей прогретую кровь или гема
тин -_____________________На этой среде у ряда гетерофер-
ПентаТивных "лактобацилл не наблюдается образования перекиси
водорода. На активность каталазы не влияет присуГствиёв^срёдё
^К^ЭДйЯКозы, а также изменчив pH средыот 7,0 до 4,5. Однако
фермёнт'чувствителен к 0,01(М/азиду и О.ОуУрцианиду. Очевидно,
среди молочнокислых бактщГйиТптбются организмы, способные
минрвую группу). Активности каталазы молочнокислых бактерии
й бактерии, обычно образующих ее, например, Е§сЬ...соИ,,близки
(Whittenbury, 1964). Способность к образованию перекиси и актив-
ность разложения ее некоторыми молочнокислыми бактериями не
'.........' я$г.' '
зависят от потребности их в аэробных или анаэробных условиях
роста.
Азид- и цианидчувствительная каталаза обнаружена также
Джонстоном и Делвичем у ряда педиококков и лактобацилл при
выращивании их в присутствии ^гематинa) (Johnston, Delwiche,
1965). Образование чувствительпмДГ^ТГйпгибиторам энзима (ка-
талазы) сопровождается синтезом и инг^битор-нечувствитёльного
фермента (псевдокаталазы); железо иМарганец в среде для роста
стимулируют образование последпего.СХйрйЦия?) по данным авто-
ров, значительно усиливает синтез каталазы. Проведено разделе-
ние двух указанных энзимов, выделенных из бесклеточных эк-
страктов штамма Р. homari, растущего на среде с^кровью.
Сбраживание углеводов
Источником энергии для молочнокислых бактерий служит мо-
лочнокислое брожение. Молочнокислые бактерии по характеру
продуктов сбраживания гексоз (глюкоза, фруктоза,, манноза, га-__
дактоза), дисахаридов, (лактоза,"мОЕтоза, сахароза) ~и полисаха-
ридов (декстрин, крахмал), согласно терминологии, предложенной
Плюйвербм й'Дбнкером (Kluyyer, Donker, 1925), относят к гомо(-
ферментативным или гетерофермент’ативным. Гомоферментатив-
ные в результате брожения образуют главным образом молочную
кислоту и лишь ничтожные количества фумаровой и янтарной? ~
летучих кислот, этилового спирта и углекислоты. Гетё^рофермент’а-
тивпыеТй'ё’ббразуют значительно большие количества уксусной
кислоты, этилового спирта, углекислого газа и иных побочных
продуктов и используют на это до 50% сбраживаемых гексоз.
К настоящему времени механизм сораживанйяГмолбчйокис-
лыми бактериями гексоз и пентоз достаточно хорошо изучен.
Установлено, что гомбфёрмепТативное молочнокислое брожение
осуществляется по ^икблитичёсйощ^схеме Эмбдена — Мейергофа
(ввиду того, что эта схема широко известна и представлена в раз-
личных руководствах, мы ее не приводим).
Гибе с соавторами (Gibbs et al., 1950, 1955) в опытах, проведен-
ных с меченой глюкозой, показали, что Lactobacillus casei, L. pen-
tosus, Streptococcus faecalis образуют молочную кислоту, меченную
по метильной группе, при использовапии1-С14-глюкозы и меченную
по карбоксильной группе при применении 3,4-С14-глюкозы. Такое
распределение меченых атомов углерода глюкозы характерно i
именно для брожения, идущего по схеме Эмбдена—Мейергофа.
Во время сбраживания одного моля глюкозы гомоферментатив-
ные молочнокислые бактерии накапливают до ккал~энёргии,
что*гораздб меньше, чем при других (аэробных) процессах энерге-
тического обмена (Вуд, 1963). . _
Гетероферментативные бактерии характеризуются принци-
пиально другим, чем гомоферментативные, путем разложения
глюкозы — пентозофосфатным (DeMoss, 1953; Hurwitz, 1958).
|Ш1irIM '111 , A ' ’ ’ ’
22
Ниже приводится схема процесса гетероферментативного молочно-
кислого брожения, осуществляемого Leuconostoc mesenteroides
(а — по Вуду, 1963; б — по De Ley, 1962).
Глюкоза >
АТФ'5|
Глюкозо— 6—фосфат
|-----------------2Н
Фосфоглюконовая кислота
а г—--------------—------1—-----------------2Н-----
Пентозофосфат
Фи
3 —Фосфоглицериновый ^Ацетил—Ф
альдегид --------2Н--
у Фн н I
Путь Эмбдена-Мейергофа Ацетальдегид
г0 2АТФ-4 -------2Н—
- Молочная кислота Этиловый спирт
Глюкоза
Глюкозо —6— фосфат
t
6—Фосфоглюконовая кислота
Рибулозо—5 —фосфат + СО,
t
Рибозо—5— фосфат
+4Н
Глицерин ,
Ксилулозо—5— фосфат
f фосфокетолааа +4ц
+ Ацетилфосфат —»
3— Фосфоглицериновый
' альдегид |
Молочная кислота
Уксусная кислота
б
Сначала происходит окисление глюкозо-6-фосфата до 6-фосфо-
глюконовой кислоты с помощью дегидрогеназы, связанной с нико-
тинамидадениннуклеотидом (НАДУУЕли^ никотинамидаденин-
нуклеотидфосфатом (НАДФ). Затем 6-фосфоглюконовая кислота
окисляется связанной с НАДФ дегидрогеназой до пентозофосфата
(Крампитц, 1963).
Более детальное исследование ферментов окислительного
фосфорилирования 6-фосфоглюконата у ряда штаммов Leuconostoc
mesenteroides и L. brevis в бесклеточных экстрактах их показало,
что окислительное декарбоксилирование 6-фосфоглюконата может
идти путем прямого декарбоксилирования субстрата с образовани-
ем рибулозо-5-фосфата, а у некоторых штаммов — путем дегидри-
23
рования 6-фосфоглюконата в 2-кето-6-фосфоглюконат с последую-
щим декарбоксилированием последнего (Yashima, Kitahara, 1969).
Образованный пентозофосфат с помощью фермента фосфокето-
лазы расщепляется на ацетилфосфат и 3-фрсфрглицериновый аль-*"
из которых образуются этиловый спирт, молочная и уксус-
наяГкислоты. Восстановление ацетилфосфата и ацетальдегида до
этилового спирта сопряжено с окислением глюкозо-6-фосфата и
6-фосфоглюконовой кислоты, которое осуществляется дегидроге-
назами (Вуд, 1963).
Де Лей (de Ley, 1962) указывает, что результаты исследований,
проведенные с Leuc. mesenteroides, показали, что путь превраще-
ния глюкозы с помощью фосфокетолазы (так называемый «фосфо-
кетолазный») наиболее эффективен у гетероферментативных мо-
лочнокислых бактерий, у которых отсутствует альдолаза, а также
тр анскетрд дзд. TJ
*^™Др*Йоссс сотрудниками (DeMoss et al., 1951, a, b; 1953) уста-
новили, что среди ферментов Leuc. mesenteroides, участвующих в
брожении по пентозофосфатной схеме, не удается обнаружить ни
альдолазу, ни триозофосфатизомеразу, которые присущи гликоли-
тическому путибродшпия Эмбдена—Мейергофа. Буиз с сотрудпй-
йами~(Виуге“et al., 1957У"утверждают, что альдолдза- -отсутствует
и у L. brevis, _ _ ----—— ---------- _____ -
.'"'Что касается энергетической эффективности гетероферментаХ
тивного превращения гексоз молочнокислыми бактериями, то наД\
(^Йюль^ сброженной глюкозы образуется^-моль дденозинтрифосфо'р^
нбикислотьГХМ’ФТТ^'- ё- в два раза меЙЕйТё, чем при сбражива-
нии глюкозы по гликолитическому пути (Вуд.1963) . ------
^_-->Буиз с сотрудниками" (Buyze et al., 1957)пХосповании изуче-
ния ферментов у ряда видов гомо- и гетероферментативных мо-
лочнокислых бактерий пришли к заключению, что истинные бак-
терии могут быть разделены на три группы: 1) облигатные
гомоферментативные, обладающие альдолазой, но не имеющие
дегидрогеназ гапокозр^б-фосфата и 6-фосфоглюконовой кислоты;
они не способны сбраживать глюконовую кислоту или пентозы;
2) облигатные гетероферментативные, у которых нет альдолазы,
но есть указанные выше дегидрогеназы; они сбраживают глюко-
новую кислоту с образованием СО 2 и пентозы с образованием мо-
’лочпой й уксусной кислот; 3) факультативные гомоферментатив-
ные бактерии, имеющие С6-дегидрогеназы, но вызывающие броже-
ние по схеме Эмбдена — Мейергофа; они могут сбраживать глюко-
новую кислоту и пентозы подобно упомянутым выше гетеро-
ферментативным бактериям.
Необходимо отметить, что по численности группы облигатных
гомо- и гетероферментативных бактерий сравнительно малы,
а группа факультативных гомоферментативных бактерий более
значительна.
В табл. 1 для наглядности приводим биохимичрркде признаки,
характеризующие три подрода молочнокислых бактерии, учиты-
вая данные Буиза и сотрудников (Buyze et al„ 1957).
У некоторых молочнокислых бактерий сбраживание углерод-
содержащих субстратов (например, глюконовой кислоты Str. fae-
calis) частично протекает и по схеме Энтнера—Дудорова (Sokatch,
Gunsalus, 1957). Этот путь начинается с отнятия воды от 6-фосфо-
глюконовой кислоты и последующего альдольного расщепления
продукта на пировиноградную кислоту и триозофосфат-З-Д-фос-
фоглицериновый альдегид.
Путь Энтнера—Дудорова и пентозофосфатный, будучи равно-
ценными по выходу энергии, отличаются распределением мече-
ных атомов углерода в процессах брожения. Ниже приводится схе-
ма распределения меченых атомов углерода при различных путях
сбраживания гексоз молочнокислыми бактериями (Abo-Elnaga,
Kandler, 1965b).
1СН3
2 СО
р-5 СО
зСООН
4 СООН
6СН,
Пировиноградная
кислота
1.6 СНз
Уксусная кислота
3,4 СООН
3,4 СО2 или Н3,4СООН Муравьиная
+ кислота
2,5СН2ОН
2,5 СООН
1,6 СН3
Спирт
Гликолиз
Грмоферментативное
брожение
2 * Молочная кислота ,
2.5СНОН
1,6 СН3
1С
1СО2
2С
ЗС
4С
5С
6С
Гексоза
2СН.
или
2СН3
3 СН2ОН
-Спирт
4 СООН
5СНОН
вен;
Молочная
СООН
Уксусная кислота
6 Фосфоглюконатный
Г етерофермептативное
брожение
кислота
путь
/
1 СООН 1,4 С02 или Н1,4СООН Муравьиная
| + + кислота
*2 СО s—------------*-2,5 СООН 2,5СН2ОН
ЗСН3 ч. > 3,6 СН3 3,6 СН3
Пировиноград— 'ч. Уксусная кислота Спирт
ная кислота
Путь Энтнера-
Дудорова
4СНО 1,4 СООН
5СНОН Z---------------*2,5 CHOH
6 СН2ОН 3,6 сн3
Триоза Молочная
кислота
25
Хорошо известно, что многие молочнокислые бактерии (L. plan-
tarum, L. brevis) интенсивно сбраживают пентозы, иногда даже
более активно, чем глюкозу. Брожение пентозТюызываемое рядом
молочабкислых бактерий, характеризуется тем, что кроме молоч-
ной кислоты образуется такое же количество уксусной (Gibbs et
al., 1955; Gunsalus, 1959). В настоящее время механизм брожения
пентоз довольно хорошо изучен. Установлено, что с помощью ряда
ферментов — щюмераз, киназ, эпимераз — гомо- и гетерофермента-
тивные бактерии превращает пентозы в В-ксилулозо-5-фосфат,
затем расщепляющийся фосфокетолазой на ацетилфосфат и 3-фос-
фогщщериповый альдегид, дающие в итоге уксусную и молочную
абслоты. -
D- и L-Пентозы
Ксилулозо-5-Ф
!фн
Ацетилфосфат -f- 3-фосфоглицериновый
I >адф альдегид
I L.AT® I
Уксусная кислота Молочная кислота
Некоторые гомоферментативные молочнокислые бактерии спо-
собны сбраживать пентозы с образованием молочной кислоты.
При этом из трех молей пентоз образуется пять молей молочной
кислоты; процесс идет по пути Эмбдена—Мейергофа и гексозомо-
нофосфатному, и пентозы (ксилулозо-5-фосфат) превращаются в
гексозы (фруктозо-6-фосфат) (De Ley, 1962).
Ряд авторов (Gest, Lampen, 1952; Wilken, 1959, и др.), изу-
чавших сбраживание меченных по углероду пентоз L. pentosus,
L. pentoaceticus и Leuc. mesenteroides, обнаружили, что метильный
и карбоксильный углероды уксусной кислоты и карбоксильный,
карбинольный и метильный углероды молочной кислоты происхо-
дят соответственно из 1-, 2-, 3-, 4-, и 5-углеродных атомов пентоз.
При сбраживании пентоз молочнокислыми бактериями выход
энергии таков же, как при сбраживании равного количества гек-
созы по схеме Эмбдена—Мейергофа.
Следует отметить, что в литературе имеется значительное чис-
ло исследований, указывающих на изменение характера конечных
продуктов брожения молочнокислых бактерий в зависимости от
ряда конкретных факторов (pH, наличия СО2 и кислорода, Физио-
логического состояния клеток), '#го свидетельствует о невозмож-
ности резкого разграничения групп гетеро- и гомоферментативных
молочнокислых бактерий.
Плат и Фостер (Platt, Foster, 1958), изучавшие конечные
продукты сбраживания глюкозы в анаэробных условиях у Str.
faecalis, Str. liquefaciens, Str. durans, Str. lactis, Str. cremoris и дру-
гих гомоферментативных стрептококков, показали, что для иссле-
дованных штаммов характерно образование побочных продуктов
26
(С02, глицерина, диацетила, ацетона, 2,3-бутиленгликоля), состав-
лявших в среднем до 8% углерода сброженной глюкозы. Подоб-
ное явление отмечали еще ранее С. А. Королев (1932), Джибсон и
Абд-эль-Малек (Gibson, Abd-el-Malek, 1945).
Гунзалус и Нивен (Gunsalus, Niven, 1942) показали, что у Str.
liquefaciens при щелочных pH среды из 25—40% сброженного са-
хара вместо молочной кислоты накапливаются муравьиная, уксус-
ная кислоты и этиловый спирт (2:1:1).
Стил с соавторами (Steel et al., 1954) обнаружили, что Str. pyo-
genes сбраживает глюкозу в анаэробных и аэробных условиях
с образованием главным образом молочной кислоты. В то же вре-
мя при ферментации галактозы только до 50% сахара превраща-
ется в молочную кислоту, остальное используется на образование
муравьиной, уксусной кислот и этилового спирта. Подобное явле-
ние Стил и другие наблюдали также при сбраживании галактозы
Str. faecalis и L. casei. . _ .
Подобно коккам, молочнокислые гомоферментативные\ палочки)
также образуют небольшие количества побочных продуктов (Wil-
ken, 1959). Имеются данные о штаммах L. plantarum и L. casei,
которые, не образуя газа из глюкозы на специальной среде, нака-
пливают в аэробных условиях летучие кислоты, а также диацетил
и ацетоин (Laxminarayana et al., 1952; Manderson, Doelie, 1972).
Шервуд (Sherwood, 1939) считал, что подобные указанным штам-
мы Streptobacterium plantarum имеются в сыре чеддер и полагал,
что они, возможно, занимают промежуточное положение между
Sbm. casei и Betabacterium breve.
В литературе приводится пемЭло примеров зависимости харак-
тера сбраживания глюкозы молочнокислыми палочками от ряда
факторов. Орла-Иенсен (Orla-Jensen, 1942) отмечал, что свеже-
выделенные Betabacterium breve, Bbm. caucasicum и Bbm. longum
продуцируют незначительное количество газа и янтарной кислоты
из глюкозы, но это свойство скоро утрачивается при культивиро-
вании бактерий на искусственных лабораторных средах. По Орла-
Иенсену, аэрация ведет к увеличению выхода уксусной кислоты.
В. Н. Шапошников и В. А. Семенова (1949) сообщали, что повы-
шение pH среды приводит к этому же результату (для Bbm. breve).
Н. Н. Гречушкина (1962) установила, что при повышении
температуры выращивания до 48—50° Lactobacterium pentoaceti-
cum проводит сбраживание глюкозы, как гомоферментативный
организм. По данным Е. Н. Красильниковой (1965), при сбражи-
вании сусла Lactobact. delbruckii в присутствии метиленовой сини,
как искусственного акцептора водорода, происходит образование
значительных количеств малоновой кислоты за счет уменьшения
выхода молочной до 40—70% от сброженного сахара (вместо 90—
97 %). Было установлено также, что в среде с дрожжевым автоли-
затом и 2% глюкозы Lactobact. delbruckii в присутствии 0,1—0,3%
пировиноградной кислоты, наряду с молочной кислотой, образует
диацетил, а в присутствии фумаровой — яблочную, т. е. гомофер-
27
Таблица 1
Биохимические признаки трех подродов рода Lactobacillus (по Gasser, 1970)
Подроды Орла-Иенсена Группы no Буизу и др. Конечные продукты • ана- эробного сбраживания, моль/моль Сбраживание
ГЛЮКОЗЫ пентоз пентоз глюко- ната
Thermoba- Облигатные гомо- 2 лактата — — —
cterium ферментативные
Streptoba- Факультативные 2 лактата 1 лактат
cterium гомоферментатив- 1 ацетат + или — +
пые
Betabacte- Облигатные гете- 1 СОг 1 лактат
rium роферме нтативные 1 лактат 1 этанол 1 ацетат + или — +
ментативные бактерии в зависимости от состава среды могут об-
разовывать различные (побочные) продукты брожения, кроме мо-
лочной кислоты.
При исследовании молочнокислых бактерий — возбудителей
заболеваний вин — Lactobacillus buchneri, L. brevis и L. fermenti мы
(Квасников, Кондо, 1958) наблюдали у исходных штаммов по-
терю способности к образованию летучих кислот, углекислоты и
спирта. Переход гетероферментативных бактерий в гомофермента-
тивные происходил при многолетнем культивировании штаммов
из больных вин на автолизатглюкозных и люцерновых средах.
Большой интерес, на наш взгляд, представляют данные Неика
и Надкарни (Naik, Nadkarni, 1968). Они установили, что при вы-
ращивании L. casei на 1-С14-глюкозе меченый углерод обнаружи-
вается почти полностью в лактате, являвшемся главным продук-
том брожения. Однако при росте L. casei на рибозе, а затем на
меченой глюкозе, образуются эквимолярные количества лактата,
этанола и СОг, что типично для гетероферментативного брожения.
При этом 14С меченой глюкозы выявляется главным образом в
14СО2. Неик и Надкарни установили, что в клетках, выращенных
на рибозе, содержалось в 5—6 раз больше фосфокетолазы и глю-
козо-6-фосфатдегидрогеназы и в 2—3 раза меньше фосфофрукто-
киназы и альдолазы, чем в экстрактах клеток, инкубированных на
глюкозе. Таким образом, L. casei может вести себя, как гетерофер-
ментативный организм при росте на рибозе и последующей инку-
бации его на глюкозе.
По представлениям Де Лея (de Ley, 1962), истинные молочно-
кислые бактерии берут начало от общих предков, подобных гомо-
ферментативным молочнокислым бактериям. От этих предков одна
линия вела к гомоферментативным, не содержащим цитохромов,
палочкам и коккам; вторая линия — к аэробным Microbacterium
28
Присутствие **
FDPA G6PD 6PGD РРК
+ ± ± —
+ ± + +
+ + +
* По Buyze et al., 1957.
* * По Вуду, 1963;
± очень слабая активность;
— отсутствие активности;
FDPA — фруктозо-дифосфатальдолаза;
G6PD — глюкозо-6-фосфатдегидрогеназа;
6PGD — 6-фосфоглюконатдегидрогеназа;
РРК — пентозо-фосфокетолаза.
(вероятно, содержащим цитохромы). На определенной стадии эво-
люции утеря альдолазы и транскетолазы привела к образованию
гетероферментативных молочнокислых бактерий (третья линия).
Участие кислорода в процессе молочнокислого брожения
Молочнокислые бактерии в отличие от аэробных, цитохромсодер-
жащих бактерий, не имеют цитохромов (гемопротеидов), участву-
ющих в переносе электронов от субстрата к кислороду. Однако, не-
смотря на это, они обладают способностью активно окислять ряд
веществ с помощью молекулярного кислорода. Это осуществляется
благодаря наличию флавопротеидных систем так же, как и у анаэ-
робных клостридий (Gunsalus, 1959).
Используя полужидкую агаровую среду для создания условий,
способствующих усвоению субстратов молочнокислыми бактерия-
ми, Виттенбари (Whittenbury, 1963) установил, что имеются куль-
туры, требующие присутствия кислорода для использования ряда
субстратов. Так, Str. faecium, Pediococcus spp. и L. plantarum усва-
ивают в аэробных условиях глицерин; Aerococcus viridans, Р. uri-
nae-equi — глицерин, маннит, сорбит и в течение первых 24-х час.—
глюкозу; Str. faecalis — m-инозит (в отсутствие фумарата как ак-
цептора водорода); Str. salivarius — маннит и сорбит; некоторые
лейконостоки в начальных стадиях — гексозы; L. brevis и L. buchne-
ri — гексозы, глюконат или маннит. При этом было отмечено, что
подкисление среды способствовало аэробному росту; последний
зависел и от температуры инкубации культур. Так, некоторые
штаммы L. brevis и L. buchneri при 30° росли хорошо по всей тол-
ще среды, тогда как при 37° — только в аэробной ее части; обрат-
ное явление наблюдалось у L. hilgardii, у некоторых стрептококков
и гетероферментативных молочнокислых палочек.
29
Указанные факты, по мнению Виттенбари, свидетельствуют о
том, что флавопротеиновые оксидазы (или пероксидазы) могут
функционировать вместо утерянных анаэробных дегидрогеназ;
кислород при этом используется в качестве акцептора водорода.
Как показали Браун и Ван Демарк (Brown, VanDemark, 1968),
некоторые штаммы L. casei поглощают кислород в присутствии
глюкозы, маннита, сорбита, глицерина, лактата и пирувата. Фрак-
ционирование бесклеточного экстракта выявило, что окислительная
способность лактобацилл связана с пиридиннуклеотидоксидазами,
содержащими флавины, и пероксидазами и не включает бензо- и
нафтохиноны. Так, L. casei штамм 103 способен окислять маннит-
1-фосфат до фруктозо-6-фосфата, при этом перенос электронов к
молекулярному кислороду происходит при посредстве таких фер-
ментов, как флавинсодержащая NAD • Н-оксидаза (или пероксида-
за). Указанный штамм на среде с маннитом в отсутствие экзоген-
ного органического акцептора электронов является облигатным
аэробом (Brown et al., 1968).
Многочисленные исследования были проведены по механизму
окисления глицерина отдельными штаммами энтерококков (глице-
рин+О2->-молочная кислота+Н2О) (Долин, 1963). У этих орга-
низмов обнаружено до пяти флавопротеидов, которые катализи-
ровали окисление восстановленного дифосфопиридиннуклеотида
(ДПН-Н) (ДПН-Н-оксидаза; ДПН-Н-пероксидаза; цитохром-с-ре-
дуктаза; диафораза; менадионредуктаза).
Окисление ряда субстратов молочнокислыми бактериями «фи-
зиологически полезно» для них, так как сопряжено с образовани-
ем макроэргических фосфатных связей (на уровне субстрата).
С другой стороны, благодаря наличию различных путей переноса
электронов к кислороду эти организмы способны усваивать такие
субстраты, которые иначе не могли бы быть использованными вви-
ду отсутствия акцепторов водорода (Долин, 1963; Brown, VanDe-
mark, 1968).
Процесс окисления у молочнокислых бактерий часто связан с
образованием перекиси водорода, подавляющей окисление. В то
же время некоторые из них (Str. mastitidis, Str. faecalis, L. bre-
vis, Leuc. mesenteroides) способны катализировать восстановление
перекиси до воды в присутствии окисляемых субстратов (Долин,
1963; Johnson, McCleskey, 1958). Фермент, осуществляющий эту
реакцию у Str. faecalis (и, возможно, у других молочнокислых бак-
терий), был назван ДПН-Н-пероксидазой (Dolin, 1957), а перокси-
дазная активность рассматривалась как атипичная, так как не
была связана с наличием тяжелых металлов.
Виттенбари (Whittenbury, 1964,1965) предложил методы выяв-
ления образования перекиси водорода (агар, содержащий MgO2;
о-дианизидиновый агар с гретой кровью) и показал, что некоторые
молочнокислые бактерии образуют значительное количество ее,
а другие не образуют, независимо от потребностей их в аэробных
или анаэробных условиях роста. Образование перекиси водорода
30
может зависеть от вещества, которое используется в качестве
источника энергии. Например, сбраживающие маннит или сорбит
штаммы Str. faecium продуцируют перекись в присутствии этих
веществ на о-дианизидиновом агаре с гретой кровью. Виттенбари
(Whittenbury, 1964) показал, что у молочнокислых бактерий не
наблюдается четкой зависимости между НгОг-расщепляющей ак-
тивностью и предпочтением или потребностью организмов в аэроб-
ных или анаэробных условиях или между НгОг-разрушающей ак-
тивностью и образованием этого соединения.
М. Л. Горбунова (1970), изучавшая распространение в организ-
ме человека бактерий — продуцентов перекиси водорода, показала,
что значительный процент их составляют молочнокислые бактерии.
Продуценты Н2О2 из рода Streptococcus принадлежат к энтерокок-
кам видов Str. faecalis, Str. faecalis var. zymogenes и Str. faecalis
var. liquefaciens и высеваются, в основном, из кала и мекония
новорожденных. Молочнокислые палочки, образующие Н2О2, изо-
лируются, как правило, из грудного молока. Продукция перекиси
водорода обнаружена и у многих музейных штаммов — Str. lactis,
Str. faecalis, L. arabinosus, L. acidophilus.
Исследованные автором свежевыделенные и музейные молочно-
кислые бактерии образуют перекись водорода не только в микроб-
ных телах, но и выделяют ее в питательный агар.
Максимальная продукция перекиси водорода отмечается в ло-
гарифмической фазе роста культуры.
Рассматривая вышеизложенные данные в свете эволюции
молочнокислых бактерий, можно отметить, что они занимают
промежуточное положение между облигатными анаэробами и цито-
хромсодержащими факультативными и облигатными аэробами.
Стрептококки могут быть связаны с аэробными формами через
педиококки, а палочковидные молочнокислые бактерии — через
цитохромсодержащие бактерии родов Propionibacterium и Согупе-
bacterium (Долин, 1963).
Доказательством связи молочнокислых бактерий с аэробными
формами может быть наличие у Str. faecalis пируватоксидазной
системы, напоминающей таковую у Esch, coli, а также присутствие
у Str. faecalis цитохром-с-редуктазы (Долин, 1963). В пользу ука-
занной связи свидетельствуют, очевидно, и данные Сипестейна
(Sijpesteijn, 1970). Автор установил, что при выращивании Str.
lactis и Leuc. mesenteroides в присутствии гемина их дыхательная
активность возрастает; соотношение продуктов распада глюкозы
сдвигается в более окисленную сторону. Методом дифференци-
альной спектрофотометрии показано, что гемин вызывает синтез
цитохромов типа а2 и Ъ. Способность к образованию каталазы
на средах с кровью также служит доказательством эволюционных
связей молочнокислых бактерий с аэробными микроорганизмами.
Костридии и молочнокислые бактерии находятся на различных
стадиях эволюции; используя сходные дыхательные механизмы,
молочнокислые бактерии лучше приспособлены к аэробным усло-
виям роста (Долин, 1963).
31
Виттенбари (Whittenbury, 1964) установил, что ряд молочно-
кислых бактерий, имеющих каталазу, способен был образовывать
цитохромы при росте в среде с гретой кровью, а один штамм обна-
ружил следы цитохрома в среде с гретой кровью и без нее. Эти
факты, по мнению автора, свидетельствуют скорее не о приспособле-
нии молочнокислых бактерий к аэробным условиям, как считал
Долин (1963), а о ретрогрессивном происхождении молочнокислых
бактерий от факультативно-аэробных гемопротеинобразующих ор-
ганизмов. Как указывает автор, изучение железопорфирин-недо-
статочных мутантов гемопротеинобразующих факультативных аэ-
робов свидетельствует об определенном тесном родстве их с
молочнокислыми бактериями.
Питательные потребности
Среди различных групп микроорганизмов молочнокислые бакте-
рии с точки зрения потребности в разнообразных питательных ве-
ществах относятся к наиболее сложным организмам.
Для проявления своей жизнедеятельности они требуют наличия
субстратов, являющихся источником энергии и веществ, необходи-
мых им для построения бактериальной клетки (нуклеиновых
кислот, полисахаридов, аминосахаров и т. п.).
Углеродное питание
Молочнокислые бактерии могут удовлетворять свои потребности
в углеродном питании за счет незначительных количеств тех соеди-
нений, которые служат им источником энергии. Например, в опы-
тах с меченой глюкозой (Веселов и др., 1955) было установлено,
что до 17% радиоактивного углерода глюкозы включается в бел-
ковую фракцию азотистых веществ бактериальной массы, и это
включение происходит, в основном, в момент интенсивного бро-
жения. Опыты с немеченой глюкозой и меченными по углероду
азотистыми веществами показали, что активность бактериальной
массы во время брожения уменьшается, что, по мнению авторов,
свидетельствует о накоплении в бактериальных телах в процессе
их старения безазотистых веществ и жиров, образующихся из про
межуточных продуктов сбраживания углеводов.
Наиболее важным источником энергии для молочнокислых бак-
терий являются моно- и дисахариды — глюкоза, лактоза, сахароза,
мальтоза. Используются в качестве источника энергии и в кон-
структивном обмене и органические кислоты — лимонная, яблоч-
ная, пировиноградная, фумаровая и др. (Красильникова, 1965;
Whittenbury, 1965; Flesch, 1968; Bottazzi et ah, 1971a).
Некоторые готероферментативные молочнокислые бактерии
(L. brevis), выделенные из пищевых продуктов, используют (оче-
видно, с помощью адаптивных ферментных систем) в качестве
источника углерода уроновые кислоты — глюкуроновую и галак-
32
туроновую — с образованием СОг, уксусной и молочной кислот
(Stamer, Stoyla, 1968). У варианта L. casei описана необычная
потребность в Д-молочной кислоте, на основании чего был разра-
ботан чувствительный метод определения этого соединения (Carm-
en, Dunn, 1954).
Имеются данные о том, что в отсутствие сбраживаемых угле-
родсодержащих субстратов молочнокислые оактерии могут исполь-
зовать аминокислоты (глутаминовую кислоту, аргинин, тирозин)
в качестве источника энергии; при этом происходит их декарбо-
ксилирование с выделением СО2 (Lerche, 1960; Thomas, Batt ,1969).
Различные виды (иногда и штаммы вида) молочнокислых бакте-
рий требуют неодинаковых источников углерода; иногда сбражи-
вание того или иного углеродсодержащего вещества можно связать
с местообитанием микроорганизма. Например, L. delbrueckii, разви-
вающийся на растительных субстратах, сбраживает мальтозу,
глюкозу, галактозу, сахарозу, часто декстрин и не сбраживает лак-
тозу и раффинозу; в то же время L. bulgaricus, обитающий в мо-
лочных продуктах, сбраживает лактозу и, как правило, не сбражи-
вает мальтозу и сахарозу.
Наиболее часто используемым и более доступным углеводом
является глюкоза, хотя описаны виды, предпочитающие другие
сахара, а также утратившие способность сбраживать глюкозу. Так,
описан штамм L. bulgaricus, который использовал лактозу, галак-
тозу или смесь этих сахаров лучше, чем глюкозу (Snell, Lewie,
1953). Снелл и Левик, изучая действие сока спаржи на рост L. f ег-
menti, установили, что последний лучше растет в присутствии
мальтозы, а глюкоза угнетает его, что, по мнению авторов, объясня-
ется тем, что фосфоролитическое расщепление дисахаридов имеет
энергетическое преимущество по сравнению с гидролизом моноса-
харидов, имеющим место перед усвоением их.
Молочнокислые бактерии, как правило, не сбраживают полиса-
хариды, хотя имеются и исключения, а для некоторых молочно-
кислых бактерий использование полисахаридов служит характер-
ным видовым свойством. Например, Str. bovis сбраживает крахмал
(Abd-el-Malek, Gibson, 1948), Sporolactobacillus (Lactobacillus)
inulinus — инулин (Kitahara, Suzuki, 1963).
Следует остановиться и на потребности некоторых молочнокис-
лых бактерий в СО2, которая, как известно, участвует в синтезе
жирных кислот, аспарагиновой кислоты пуринов и пиримидинов
(Reiter, Oram, 1961). Плат и Фостер (Platt, Foster, 1958) в опытах
с углекислотой, меченной по 14С, показали фиксацию ее гомофер-
ментативными видами Str. cremoris, Str. lactis и Str. liquefaciens.
Изотопы были обнаружены как в клеточном содержимом, так и эк-
страцеллюлярных уксусной и молочной кислотах.
У некоторых молочнокислых стрептококков удлиняется лаг-фа-
за при выращивании их в молоке, если образующаяся СО2 посто-
янно удаляется током азота без примеси СО2. Найдено, что 64-ча-
совая инкубация штамма Str. lactis ML3 с
2 И. Квасников, О. А. Нестеренко 33
непрерыри^т^^далепием
fь - 'Ч
со
С02 приводит к приостановке роста. Этот организм требует присут-
ствия СО2 как в синтетической среде, так и в молоке, а необходи-
мое для начала роста количество СО2 продуцируется самими Str.
lactis (Reiter, Oram, 1961).
Гофф и Гартман (Goff, Hartman, 1970) изучали фиксацию
NaH14GO3 клеточными суспензиями Str. faecalis var. liquefaciens
и нашли, что эти бактерии используют большую часть фиксирован-
ной СО2 для синтеза белков. При этом только аспарагиновая кис-
лота в белковой фракции клеток была радиоактивной. Часть 14СО2
накапливается экстрацеллюлярно.
СО2 выполняет и функцию стимулятора биосинтеза протеина-
зы не размножающимися суспензиями клеток Str. faecalis var.
liquefaciens (Swiencicki, Hartman, 1967). Фиксация 14GO2 экстрак-
тами клеток этих бактерий имеет место благодаря карбоксилазе
пировиноградной кислоты (Hartman, 1970).
Углекислота при определенных условиях играет важную роль
в питании некоторых видов молочнокислых бактерий (Tittsler et
al., 1952). Так, L. arabinosus и Str. faecalis вполне удовлетворитель-
но растут при замене фенилаланина, гистидина и аспарагиновой
кислоты 6 % СОг, а 1 % СОг заменяет полнормы биотина.
Источники азотного питания
Значительное число молочнокислых бактерий не способно син-
тезировать сложные органические формы азота и поэтому нужда-
ется для своего роста в присутствии их в среде; только некоторые
из молочнокислых бактерий используют минеральные соединения
азота для синтеза ряда органических соединений. Так, когда в сре-
де присутствуют минимальные количества необходимых аминокис-
лот, эти бактерии для синтеза отдельных аминокислот и иных азот-
содержащих веществ — существенных компонентов клетки — по-
требляют аммиак (Снелл, 1954). Рост некоторых молочнокислых
бактерий (L. helveticus, например) стимулируется аммонийными
солями даже в сложных по своему составу питательных средах
(Tittsler et al., 1952).
Еще Орла-Иенсен (Orla-Jensen, 1919; Orla-Jensen et al., 1936)
показал, что молочнокислые бактерии по потребности в источни-
ках азота можно разделить на три основные группы:
1) бактерии, нуждающиеся в сложном комплексе аминокислот
(род Thermobacterium);
2) бактерии, хорошо развивающиеся на цистеине и аммонийных
солях (род Streptobacterium);
3) бактерии, которые могут развиваться на аммонийных солях в
качестве единственного источника азота (род Streptococcus).
Для нормального роста и развития молочнокислых бактерий,
как правило, необходимы субстраты со сложными органическими
формами азота — подобранными смесями аминокислот, фермента-
тивными или кислотными гидролизатами белков — мяса, лакталь-
бумина, казеина, различных' сортов муки (фасолевой, соевой, ви-
U f / 34
/ Л/
ковой и т. д.), являющимися источниками пёпТоПбв, пептидов, смё-
сей различных аминокислот.
Значительное место в исследованиях по питанию молочнокис-
лых бактерий занимал вопрос о потребностях их в отдельных
аминокислотах. Было показано, что эти потребности велики й сло-
жны. Так, для удовлетворительного роста молочнокислых бакте-
рий необходим ряд аминокислот (табл. 2).
Таблица 2
Аминокислоты, необходимые молочнокислым бактериям (по Tittsler et al.,
1952; Снелл, 1954)
Аминокислота Типичный организм, нуждаю- щийся в данном соединении для роста Концентрация, при которой рост явля- ется функцией кон- центрации амино- кислоты, мкг/мл
Аланин Leuconostoc citrovorum 0—10—.Z1 ,
Аргинин Lactobacillus casei 0—10 ’ >
Аспарагиновая Leuconostoc mesenteroides 0—40
Цистеин (или цистин) Тот же 0—10
Глутаминовая Lactobacillus arabinosus 0—50
Глицин Leuconostoc mesenteroides 0—10
Гистидин Streptococcus faecalis 0—6
Изолейцин Lactobacillus arabinosus 0—10
Лейцин Тот же 0—10
Лизин Leuconostoc mesentesoides 0—20
Метионин Streptococcus faecalis 0—10
Фенилаланин Leuconostoc mesenteroides 0—15
Пролин Тот же 0—6
Серин Lactobacillus delbrueckii 0—20
Треонин Streptococcus faecalis 0—10
Триптофан Lactobacillus pentosus 0—3
Тирозин * Lactobacillus delbrueckii 0—6
Валин Lactobacillus arabinosus 0—10
Козер и Томас (Koser, Thomas, 1955) изучали потребности в
аминокислотах у ряда молочнокислых бактерий, выделенных из
ротовой полости, исключая из среды отдельные аминокислоты, вхо-
дящие в смесь 18—19 аминокислот. Независимо от вида и штам-
ма молочнокислых бактерий, большинству необходимы аргинин,
цистеин, глутаминовая кислота, лейцин, фенилаланин, триптофан,
тирозин, валин. Однако не все требуют”для роста набора амино-
кислот (18—19). L. arabinosus, например, растет в присутствии 8—
10 аминокислот, a Leuc. mesenteroides — 17—19.
Кроме вышеуказанных «существенных» аминокислот, имеются
аминокислоты, которые, будучи опущенными, не вызывают умень-
шения интенсивности роста молочнокислых бактерий в среде пол-
35
2*
його Состава (например, с 17-ю аминокислотами). Такие амино-
кислоты обычно определяются как «несущественные». Однако в
менее полной питательной среде, когда опущено несколько таких
аминокислот одновременно, часто наблюдается медленный и сла-
бый рост бактерий. Так, отсутствие серина или глицина не оказы-
вает существенного влияния на рост Str. faecalis, тогда как одног
врёменнбе^удайенйе обейх аминокислот приводит к цолцйй_еш.
останС^ёТЮчАвиднЯ, при" наличии одной кислоты организм сипте-
зйрует'ТфугуюГАналбгйчные наблюдения были сделаны и с L. fcr-
menti (Koser, Thomas, 1955). « —--
Необходимо иметь ввиду, что из-за явления антагонизма амино-
кислот одна аминокислота может существенно тормозить усвое-
ние другой. Так, для определенных молочнокислых бактерий трео-
нин мешает усвоению., .серцна, лейцин и валин — изолёицина,
а высокие концентрации аспарагиновой кислоты сильно тормозят
усвоение глутаминовой кислоты и метионипа.
Молочнокислые бактерии потребляют различные количества
аминокислот (табл. 2). Так, для максимального роста этих бдкде-
рий, выделенных из ротовой полости, необходимо (па"1 мл среды)-:
40—100 мкг валина (200 мкг уже’тормозят рост), 5 мкг триптофан
йа,^до 100 мкг или более глутаминовой кислоты 'ТКовёгТ^Йот'аС
1955). Если у Str. faecalis в среде будет недостаток, например, ва-
лина (6,0 вместо~100 мкг/мл), в их клетках немедленно прекра-
щается синтез РНК (Ziegler, Daneo-Moore, 1971); дефицит трео-
нину и валина ведет к уменьшению числа /мёЭДТОм^г их деграда- '
дни. Отмечаются и существенные изменения в процессе роста кле-
точной стенки при делении этих энтерококков (Higgins, Shockman,
1970; Higgins et al., 1971).
Следует указать, что количество аминокислот, требуемое раз-
личными молочнокислыми бактериями, непостоянно. У некоторых
из них (например, L. arabinosus) избыток аспарагиновой кислоты
приводит к увеличению потребности организма в глутаминовой ки-
слоте, что говорит о количественной’ изменчивости потребностей'
организма в этих ростовых веществах при культивировании на
средах различного состава.
Большое число ссылок на работы, касающиеся значения отдель-
ных аминокислот для молочнокислых бактерий (глутаминовой, ас-
парагиновой, аланина, метионина, цистеина) приведено в обзорной
статье Девиса (Davis, 1960).
Как считают Моришита и Юра (Morishita, Yura, 1969), потреб-
ность «диких» штаммов молочнокислых палочек (в частности,
L. -casei) во многих аминокислотах и витамтаахнаводит на мысль о
том, что в течение эволюции эти бактерии могли постепенно утра-
тить способность к синтезу ряда веществ. Подтверждением этого
является получение мутантов L. casei, которые (в результате одно-
ступенчатых мутаций) приобрели способность к синтезу семи из
20 аминокислот и одного из четырех, ранее не синтезировавшихся,
витаминов.
/л
N / Л' О У / ’' •
Витамины
Большинство видов молочнокислых бактерий (особенно палоч-
ковидных) остро нуждается для своего развития в витаминах, чем
и объясняется в значительной мере влияние на их рост добавок к
средам различных растительных экстрактов (картофеля, моркови,
кукурузы и т. д.), дрожжевого автолизата и других соединений.
Данные, полученные отдельными исследователями, о потребности
молочнокислых бактерий в витаминах, приведены в табл. 3.
Было установлено, что рост Leuc. citrovorum очень сильно
стимулируется веществом, находящимся в естественных субстра-
тах (так называемый «цитроворус фактор» — ЦФ). Впоследствии
оказалось, что свойствами ЦФ обладает синтезированная
из. фолиевой кислоты фолиновая кислота (лейковорин). Лейко-
ворин может заменить потребность в фолиевой кислоте у Str. fae-
calis и L. casei, цыплят, человека, но фолиевая кислота не может
заменить потребность в лейковорине у Pediococcus cerevisiae
(Eigen, Shockman, 1963). В связи с тем, что Р. cerevisiae требу-
ет наличия в среде фолиновой кислоты, эта потребность считалась
характерным свойством рода Pediococcus. Гюнтер и Уайт
(Gunther, White, 1961а) показали, однако, что только некоторые
представители Р. cerevisiae нуждаются в этом витамине.
Потребность в витамине В6, встречающемся в свободной и
связанной формах (пиридоксин, пиридоксаль, пиридоксамин,
пиридоксальфосфат, пиридоксаминфосфат), проявляют многие
виды лактобацилл и стрептококков. На рост одних влияет пиридо-
ксаль, иные стимулируются как пиридоксалем, так и пиридокса-
мином. L. acidophilus, L. delbrueckii, L. lactis требуют фосфорили-
рованных производных витамина В6, тогда как свободные формы
его нужно вносить в среду в концентрации в 1000—10000 раз
выше (см. табл. 3).
Отдельные виды молочнокислых бактерий и, более того, иногда
даже отдельные штаммы одного вида отличаются по потреб-
ностям в различных витаминах. Так, 21 штамм Str. lactis нуждал-
ся в биотине, некоторые — в пантотеновой кислоте, но ни один
не проявлял потребности в фолиевой кислоте или витамине Вб.
В то же время 3 Фггамма из 21 не требовали тиамин, а осталь-
ным 18 он был необходим; только 10 штаммов из 21 изученных
нуждались в рибофлавине (Niven, 1944). Таким же образом
неоднородны по своим потребностям в витаминах и представители
вида Str. faecalis. Из 5 изученных штаммов ни один не нуждался
в тиамине, но всем были необходимы биотин, никотиновая и
пантотеновая кислоты, а также витамин В6, но только четырем
из пяти был необходим рибофлавин и трем — фолиевая кислота
(Niven, Sherman, 1944).
Цикл работ по изучению потребностей в витаминах молочно-
кислых палочковидных бактерий был проделан рядом авторов,
особенно за последнее время. Рогоза с сотрудниками (Rogosa
37
Таблица 3
Витамины и соответствующие факторы роста, необходимые молочнокислым
бактериям (по Tittsler et al., 1952; Снелл, 1954)
Витамин и фактор роста Организм, требующий фактор роста Концентрация, при которой рост является функ- цией концентра- ции витамина, мкг/мл
n-Аминобензойная кислота Биотин Lactobacillus plantarum L. arabinosus L. plantarum Leuconostoc mesenteroides Streptococcus faecalis 0—0,20
Фолиевая кислота (птероил- глутаминовая кислота) Фолиновая кислота (лейко- ворин, 5-формил-5,6,7,8-тет- рагидроптероилглутамино- вая кислота) Липоевая кислота, (тиоктие- вая кислота, ацетат заме- щающий фактор, протоген) Lactobacillus casei Streptococcus faecalis Leuconostoc citrovorum * Lactobacillus casei ** Streptococcus lactis ** 0—0,15
Никотиновая кислота Lactobacillus arabinosus Leuconostoc mesenteroides Streptococcus faecalis 0—40
Пантотеновая кислота Пантетеин или пантетин Lactobacillus casei Leuconostoc mesenteroides Streptococcus faecalis Lactobacillus acidophilus *** L. bulgaricus 0—20
Рибофлавин L. casei Streptococcus lactis 0—40 0—1
Тиамин Витамин Be **** Lactobacillus fermenti Streptococcus lactis 0—5
Пиридоксаль Lactobacillus casei 0—0,7
Пиридоксамин Пиридоксамин фосфат Streptococcus faecalis Lactobacillus acidophilus ***** L. delbrueckii ***** L. lactis ***** 0-0,4
Витамин В12 L. lactis L. leichmannii 0—0,05 0—0,05
* Очень большие количества фолиевой кислоты (соответствующие потребности
в фолиновой кислоте) позволяют расти в отсутствие фолиновой кислоты.
** Потребность в этом витамине проявляется только тогда, когда эти организмы
выращены в отсутствие ацетата. При этих условиях замечается стимуляция роста;
однако рост также наблюдается и в отсутствие добавочного фактора роста.
*** Очень большие количества пантотеновой кислоты (соответствующие потребно-
сти в пантетине) позволяют расти в отсутствие пантетина.
**** Пиридоксин в очень больших количествах способствует росту при замене
пиридоксаля или пиридоксамина, вероятно, потому, что он взаимодействует с компо-
нентами среды, образуя эти последние соединения в очень малых количествах.
***** Очень большие количества пиридоксаля или пиридоксамина (соответственно
требуемому количеству пиридоксамин фосфата) позволяют расти при отсутствии пири-
доксамин фосфата.
38
et al., 1947) нашли, что из 250 изученных штаммов все нуждались
в пантотеновой кислоте и биотине и, как правило, ни один не нуж-
дался в инозите, холине и и-аминобензойной кислоте. Эта работа
явилась началом тщательного изучения коррелятивной зависимо-
сти между потребностями в тех или иных витаминах и морфолого-
культуральными и физиолого-биохимическими свойствами отдель-
ных видов. Позднее Рогоза с сотрудниками (Rogosa et al., 1953),
изучив большую коллекцию штаммов молочнокислых бактерий,
выделенных из ротовой полости, установили в ряде случаев четкую
зависимость между потребностями в витаминах и видовой при-
надлежностью штаммов. Вместе с тем, потребности в витаминах
некоторых видов молочнокислых палочек оставались неизучен-
ными, так как они не росли ни на одной из предложенных в то
время сред.
Рогоза и другие (Rogosa et al., 1961) опубликовали состав
среды, обеспечивающей оптимальный рост наиболее требователь-
ных видов (L. bulgaricus, L. lactis, L. helveticus, L. jugurti, L. aci-
dophilus, L. delbrueckii, L. leichmannii), и получили ряд новых
данных по потребностям различных видов в некоторых витаминах.
Состав полной основной среды (по Rogosa et al., 1961)* мы приво-
дим ниже (окончательные концентрации в литре среды).
Кислотный гидролизат казеина, освобожден- 100 мл —5 г Раствор минеральных со- лей ** 10 мл
ный от витаминов ** Аденин, гуанин, ксантин, по 5 мг
Панкреатический гид- 100 мл Г урацил
ролизат казеина, осво- Пиридоксаль-этил-ацеталь 2 мг
божденный от витами- гидрохлорид
НОВ Ниацин, тиамин соляно- по 1 мг
Глюкоза 10 г кислый, Са-пантотенат, рибофлавин
К2НРО4; КН2РО1 по 3 г
(NH*)2HCeH5O7 0,6 г n-Аминобензойная кислота, по 10 мкг
Аскорбиновая кислота 0,5 г биотин
Цистеин солянокислый Твин 80 0,05 1 г г Фолиевая кислота, вита- мин В12 по 1 мкг
* В работе даны указания в отношении использования и приготовления гидроли-
затов казеина, добавления всех ингредиентов среды, автоклавирования и засева ее.
** Циклические аминокислоты (DL-триптофан, L-тирозин, DL-фенилаланин, L-npo-
лин, L-гистидин), раствор минеральных солей добавляют по Форду (Ford et al., 1958).
pH среды доводится до 6,0—6,1 перед прибавлением указанных
витаминов. Все испытанные виды молочнокислых бактерий хоро-
шо растут в указанной среде с полным набором витаминов. Дан-
ные по изучению потребностей в некоторых витаминах молочно-
кислых палочковидных бактерий различных подродов мы приво-
дим в табл. 4.
Рогоза с сотрудниками (Rogosa et al., 1961) установили, что
никотиновая и пантотеновая кислоты необходимы для роста всех
видов, а тиамин — только гетероферментативных. В то же время
39
фолиновая и п-аминобензойная кислоты не были существенными
и не стимулировали рост молочнокислых палочек.
Авторы нашли, что L. casei и L. plantarum целесообразно диф-
ференцировать по потребностям в фолиевой кислоте и пиридок-
сале (табл. 4). При этом интересно отметить, что штаммы, близ-
кие к L. plantarum, характеризующиеся, однако, отсутствием
способности сбраживать мальтозу и маннит (Keddie, 1959),
требует фолиевую кислоту, что свидетельствует, возможно, о при-
надлежности их к новому виду. L. bulgaricus и L. jugurti отлича-
ются потребностями в пиридоксале.
Таблица 4
Потребность в некоторых витаминах бактерий рода Lactobacillus
(по Rogosa et al., 1961)
Вид Рибофла- вин Пиридок- саль Фолиевая кислота Bia Тимидин
Подрод Thermobacterium Orla-Jensen
L. helveticus + + — — —
L. jugurti + + — — —•
L. bulgaricus + — — —• —
L. lactis + — — — —'
L. acidophilus + — + — —.
L. leichmannii — — + или стимули- рует —
L. delbrueckii + — — — +
L. salivarius Подрод + Streptobac ;erium Or + la-Jensen — —*
L. plantarum + —. — — —.
L. casei var. rhamnosus + 4- или стимули- рует + — —•
L. casei var. casei + To же + — —
L. casei var. alactosus Подрод + Bet abaci! To же srium Orh + i-Jensen — -
L. fermenti
L. buchneri +
L. brevis __ +
L. cellobios us —
L. viridescens + Стимули- рует Стимули- рует — —
Примечание. Некоторые штаммы L. lactis и L. acidophilus нуждаются в витамине
Ви в условиях строгого аэробиоза, особенно в отсутствие определенных дезоксирибо-
зидов; L. leichmannii нуждается в витамине В« в отсутствие дезоксирибозидов.
Рогоза с соавторами (Rogosa et al., 1953) описали две разновидности L. plantarum,
одна из которых нуждалась в рибофлавине. Эта потребность коррелировала с рядом
других признаков.
75% штаммов L. buchneri нуждается во внесении рибофлавина; для всех гетерофер-
ментативных видов подрода Betabacterium Orla-Jensen, в отличие от гомоферментатив-
ных, необходим тиамин.
40
О механизме аккумуляции отдельных витаминов в клетках
молочнокислых бактерий известно очень мало. Показано, напри-
мер, что клетки штаммов L. leichmannii и L. delbrueckii, нуждаю-
щихся в витамине Bi2, поглощают его из среды в количестве
до 0,5 мкг/г сухого веса. При этом почти весь витамин обнаружи-
вался во фракции клеточных стенок, очевидно, связываясь
находящимся там полипептидом (Sasaki, 1972).
Приведенные нами результаты показывают, что потребности
молочнокислых бактерий в витаминах при соблюдении строго
определенных условий культивирования микроорганизмов отчет-
ливо выявляются и постоянны, что важно с точки зрения возмож-
ности использования их с целью идентификации штаммов.
Вместе с тем следует отметить, что условия выращивания и
состав среды влияют на потребности бактерий в витаминах. Так,
Str. faecalis требует тиоктиевую кислоту или ацетат + тиамин,
когда растет в аэробных условиях, но не требует их, когда клетки
находятся в отсутствие кислорода (Shockman, 1956). Str. bovis
нуждается в ряде витаминов в аэробных условиях, тогда как при
культивировании в анаэробных он растет без них.
На потребность молочнокислых бактерий в витаминах влияют
температура инкубации, pH, наличие СОг и окислительно-восста-
новительный потенциал среды. Так, при изменении температуры
выращивания в пределах 3—4° реакция L. helveticus на внесен-
ный рибофлавин меняется в пределах 25% (Tittsler et al., 1952).
Такие восстановители, как аскорбиновая, тиогликолевая кислоты,
глутатион заменяют витамин В12 для L. lactis, если добавляются
в количествах, необходимых для достижения критического уровня
окислительно-восстановительного потенциала (Tittsler et al., 1952).
Некоторые молочнокислые бактерии, требующие неизвестные
факторы роста, обходятся без них, если pH отнтетической среды
снижается до 5,5, а концентрация Са-пантотената в, среде увели-
чивается от 0,5 мкг/мл до 4 мкг/мл (Puranen, Nurmikko, 1962).
Среди молочнокислых палочек, выделенных из молока и
сыров, наряду с типичными (т. е. подобными найденным Рогозой
и соавторами в 1961 г.; см. табл. 4) содержатся штаммы, потреб-
ность которых в витаминах варьирует. Так, было найдено незна-
чительное число штаммов L. casei, не нуждающихся в рибофла-
вине, пиридоксале, фолиевой кислоте. В то же время из 27 штам-
мов L. brevis только три имели типичные потребности в витаминах.
Рибофлавин был необходим (или оказывал стимулирующее дей-
ствие) для роста большинства, а пиридоксаль — некоторых штам-
мов L. brevis. Большинство L. buchneri требовало для роста
фолиевую кислоту. Эти данные, противоречащие найденным
Рогозой с сотрудниками, значительно снижают ценность признака
потребностей видов в витаминах как таксономического.
Молочнокислые бактерии для обеспечения своего роста
нуждаются в различных количествах отдельных витаминов
(см. табл. 3), которые нередко определяются составом среды.
41
Рост некоторых молочнокислых бактерий усиливается только
в присутствии небольших количеств веществ в среде; при значи-
тельном же содержании их они могут действовать бактерицидно.
Например, при внесении 10 мкг фолиевой кислоты на литр среды
полностью задерживается рост L. bulgaricus, тогда как концент-
рация 1 мкг/л благоприятно сказывается на его росте (Rogo-
sa et al., 1961). В ряде случаев показано, что концентрация опре-
деленного витамина, обеспечивающая максимальный рост, не
совпадает с той, которая необходима для проявления иных свойств
данных микроорганизмов, например, способности декарбоксилиро-
вать тирозин.
Молочнокислые бактерии могут аккумулировать в клетках
определенные количества витаминов, например, витаминов груп-
пы В6, тиамина при выращивании на средах с большим содержа-
нием витаминов, чем это необходимо для образования максималь-
ного числа клеток (так называемое «избыточное потребление»
витамина) (Holden et al., 1949).
Потребность молочнокислых бактерий в отдельных витаминах,
как мы уже говорили, обусловливается составом среды и может
изменяться в зависимости от присутствия тех или иных амино-
кислот, жирных кислот и дезоксирибозидов. В то же время потреб-
ность в аминокислотах или пуриновых основаниях, в свою оче-
редь, также определяется наличием в среде тех или иных
витаминов. Например, молочнокислые бактерии не нуждаются
в витамине Вы, если в среде имеются дезоксирибозиды; иногда
такое же действие оказывает и негидролизованная дезоксирибо-
нуклеиновая кислота. Пуриновые основания влияют на потреб-
ность молочнокислых бактерий (L. arabinosus) в п-аминобензой-
ной кислоте.
Потребность L. casei и Str. faecalis в фолиевой кислоте можно
устранить, выращивая бактерии в среде, содержащей все извест-
ные аминокислоты, тимин (или тимидин) и пуриновые основания,
которые синтезируются в клетке с помощью фолиевой кислоты.
Последняя участвует и в синтезе некоторых аминокислот. Так,
при исключении из среды серина Str. faecalis требует фолиевую
кислоту. Это свидетельствует о том, что катализ синтеза серина
осуществляется этим витамином.
Аспарагиновая и олеиновая кислоты при одновременном при-
сутствии в среде полностью заменяют биотин для L. arabinosus.
У L. fermenti потребность в биотине удовлетворяется полностью
при наличии в среде одной олеиновой кислоты. Вероятно, биотин
у этих организмов необходим для синтеза ненасыщенных жирных
кислот или жирных кислот и аспарагиновой кислоты (Снелл, 1954).
То, что изомеры жирных кислот обладают биотиноподобной
активностью, было показано Ченгом с соавторами (Cheng et al.,
1951).
Имеются данные и о том, что Str. faecalis при недостаточном
содержании в среде биотина нуждается для роста в L-аспараги-
42
новой кислоте. При субоптимальной концентрации этой амино-
кислоты и низком содержании биотина клетки лизируются
в результате нехватки аминокислоты, использующейся для синте-
за материала клеточной стенки (Rahmanian et al., 1971).
Количество витамина В6, необходимое для роста ряда молочно-
кислых бактерий, в значительной степени зависит от количест-
венного и качественного аминокислотного состава среды. Так,
Str. faecalis растет в среде, где очень мало или отсутствует В6 толь-
ко в том случае, если в среду добавлены все аминокислоты (табл.
2). Когда витамин В6 добавлен в избытке, многие из этих амино-
кислот перестают быть необходимыми для роста и синтезируются
тест-объектами (Tittsler et aL, 1952). Холден и Снелл (Holden,
Snell, 1949) обнаружили, что Str. faecalis не нуждается в витамине
В6 и в том случае, если в среде имеется полный набор аминокис-
лот, входящих в состав гидролизата казеина. Потребность в вита-
мине В6 может быть снята внесением в среду необходимого им для
роста D-аланина. Подобным образом L. casei и L. plantarum нуж-
даются в D-аланине при росте на среде без витамина В6 (Koser,
Thomas, 1955). Указанные примеры свидетельствуют о том, что
одной из основных функций витамина В6 является катализ реак-
ций синтеза микроорганизмами необходимых им аминокислот.
Другие органические факторы роста
Кроме аминокислот и витаминов существует ряд других орга-
нических соединений, необходимых для роста молочнокислых
бактерий, или стимулирующих его. Ниже приведены данные
о различных органических факторах, стимулирующих рост молоч-
нокислых бактерий (по Tittsler et al., 1952). Эти соединения
(к ним следует добавить пептиды) вызывают отчетливую стимуля-
цию роста молочнокислых бактерий при наличии в среде различ-
ных концентраций веществ (мкг/мл): олеиновой кислоты —0—4,
уксусной — 0—40, тимидина —0—2 (Снелл, 1954).
Приводим данные об органических факторах роста молочно-
кислых бактерий (по Tittsler et al., 1952).
Производные нуклеиновой _
кислоты Жирные кислоты Производные аминокислот
Аденин
Гипоксантин
Гуанин (гуаниловая кис-
лота)
Урацил (оротовая кис-
лота, уридин)
Тимин
Тимидин
Другие дезоксирибозиды
Уксусная Z-асиарагин
Олеиновая (или другие Z-глутамин
высшие ненасыщенные
жирные кислоты)
43
Различным молочнокислым бактериям требуются неодинако-
вые органические факторы роста. Одни из них стимулирует ура-
цил или уридин, другие, например, L. bulgaricus, требуют для ро-
ста оротовую кислоту и не используют вместо нее урацил (Tittsler
et al., 1952). Потребности в пуриновых основаниях и тимине свя-
заны с потребностями в n-аминобензойной или фолиевой кисло-
тах, о чем мы уже упоминали.
Китей и другие (Kitay et al., 1950) изучили потребность 18 ви-
дов молочнокислых бактерий в дезоксирибозидах и витамине Bi2
и установили, что ни один не рос в среде, состоящей из аминоки-
слот, томатного сока и ферментной вытяжки из казеина. Однако
все они росли, когда в среде находился тимидин. В большинстве
случаев тимидин мог быть заменен дезоксирибозидами гипоксанти-
на, аденина, гуанина, цитозина или большим количеством ДНК.
Для роста некоторых бактерий (L. lactis, L. acidophilus) эффекти-
вны восстановители — глутатион, аскорбиновая кислота; ими воз-
можно заменить тимидин и витамин В12 (Kitay et al., 1950).
В среде, содержащей свободные аминокислоты, витамины и
другие необходимые компоненты, частичные гидролизаты белков
часто ускоряют рост определенных молочнокислых бактерий (Rai-
nes, Haskell, 1968). Возможно, пептиды выполняют роль постав-
щиков необходимых аминокислот в усвояемой и при том защищен-
ной от разрушения форме. Они стимулируют рост клеток более эф-
фективно, чем свободные аминокислоты (например, гистидиновый
пептид по сравнению с гистидином). По мнению Шокмана (Shock-
man, 1963), в состав некоторых синтетических сред есть смысл
включать ряд высокоочищенных синтетических пептидов, которые,
наряду с обеспечением оптимального роста бактерий, исключают
явление антагонизма аминокислот, нередко наблюдаемое при ис-
пользовании высоких концентраций свободных аминокислот. В ис-
следованиях по использованию нескольких синтетических пепти-
дов валина и лейцина отдельными молочнокислыми бактериями
были отмечены заметные отличия в их усвоении (Shankman,
Schvo, 1958; Shankman et al., 1960). Например, Leuconostoc citro-
vorum 8081 использовал L-L-L-валин так же эффективно, как и
L-валин. Однако D-L-L-пептид он не усваивал, а L-L-D-трипептид
валина угнетал рост этой бактерии.
К органическим факторам роста молочнокислых бактерий отно-
сятся также лимонная и уксусная кислоты. Благоприятное влия-
ние цитрата на рост молочнокислых бактерий было замечено давно
(Rogosa et al., 1953), в связи с чем в настоящее время цитрат ши-
роко используется как компонент сред для культивирования этих
микроорганизмов. £J
Молочнокислые бактерии явились?объектом, на котором впер-
вые было показано положительноеДлияние уксусной кислоты на
рост микроорганизмов. Сейчасуйцетат натрияЛиспользуется в ка-
честв<Сбуфера^при культивировании” мШЛ'ИхмЬлочнокислых бак-
терий. Применяется уксусная кислота и как составной компонент
•Д/ X 7 $ * С
сред (в значительно меньших дозах, чем длэд буферизации средх)
участвующий в биосинтезе ряда соединений, необходимых для их
жизнедеятельности (Collins, Bruhn, 1970). Для некоторых молоч-
нокислых бактерий (L. arabinosus) высшие жирные кислоты и сте-
^ролы замещают ацетаты, (Tittsler et al., 1952).
Фактором роста для отдельных молочнокислых бактерий (на- ,
пример, L. bulgaricus) может брггь муравьиная кислота/^
,0 (30—50 мкг/мл). Это было установлено в опытах при выращивании
Str. thermophilus, являющейся продуцентом муравьиной кислоты,
в молоке, используемом в дальнейшем для приготовления йогурта
с помощью L. bulgaricus (Verigna etal., 1968; Bottazzi et al., 1971b).
Из жирных кислот — стимуляторов роста молочнокислых бак-
терий — нужно назвать олеиновую кислоту, а также линолевую и
линоленовою. которые могут заменять олеиновую кислоту. Пос-
ледняя, в свою очередь, может заменить потребность ряда молоч-
нокислых бактерий в^твине 8(р Некоторые молочнокислые бакте-
рии (L. acidophilus, L. bulgaricus) нуждаются в ненасыщенных
жирных кислотах даже в присутствии биотина.
Неорганические соли
Для обеспечения роста и развития молочнокислые бактерии ну-
ждаются в ряде неорганических соединений — меди, железе, нат-
рии, калии, фосфоре, йоде, сере, магнии и, особенно, марганце.
Стэмер с сотрудниками (Stamer et al., 1964) изучили природу тер-
моустойчивого компонента томатного сока, давно и широко исполь-
зуемого в питательных средах наиболее требовательных в отноше-
нии питания молочнокислых бактерий, и показали, что веществом,
обусловливающим стимулирующее действие сока, является мар-
ганец; для большинства молочнокислых бактерий им можно заме-
нить томатный сок. Марганец, по мнению авторов, очевидно, от-
ветствен за стимулирующее действие и капустного сока. Марганец
препятствует автолизу клеток и необходим для нормальных про-
цессов жирового обмена.
Отдельные штаммы молочнокислых бактерий (Str. lactis, Str.
cremoris) обнаруживают потребности в железе и ванадии. При
этом замена указанных ионов молибденом, кобальтом, цинком,
медью и марганцем не приводит к росту культур в среде (Reiter,
Oram, 1968).
Исследуя потребление Mn++ L. arabinosus, Мак Леон и Снелл
(MacLeod, Snell, 1950) отметили, что увеличенные концентрации
этого микроэлемента снимают токсическое действие Zn++ при на-
личии его в среде. Кроме Мп++, токсичность Zn++ уменьшали
ионы Mg++, Са++, Sr++; хотя они и не могли заменить Мн++, но
содействовали его более экономному потреблению клеткой. По мне-
нию авторов, токсичность ионов цинка объясняется, по-видимому
тем, что Zn++ может участвовать в формировании одного или более
существенных протеинов клетки, содержащих металлы, и при этом
45
инактивирует их каталитическую деятельность. Ионы Mn++, Mg++,
Са++ и Sr++ заменяют Zn++ в протеинах и формируют с ними ка-
талитически активные соединения.
Потребности молочнокислых бактерий в определенных ионах не
всегда специфичны. Так, Rb++ замещает К+ для Str. faecalis (но не
для Leuc. mesenteroides) и способствует меньшему потреблению
К+ Leuc. mesenteroides, a Cs+ аналогично ведет себя по отноше-
нию к L. arabinosus. '----4-— --------'
/ ИмёютсТГтолько немногочисленные исследования по потребно-
стям молочнокислых бактерий в соединениях серы. Так, Шиота и
Кларк (Shiota, Clark, 1955) показали, что DL-метионин, а-гидро-
ксианалог его, L-цистеин, L-цистатионин и DL-гомоцистеин могут
служить единственными источниками серы для L. arabinosus 17-5.
Этот микроорганизм не может расти в среде, где присутствуют
только сернокислые магний, марганец и железо, а также аденин,
и очень слабо растет при наличии сульфида натрия и натрия тио-
гликолевокислого как единственных источников серы. Независимо
от используемых соединений серы L. arabinosus нуждается в био-
тине, никотиновой кислоте, пантотенате кальция и пиридоксале.
В присутствии метионина или его tz-гидроксианалога, но не цис-
теина, гомоцистеина или цистатионина, организм не нуждается в
n-аминобензойной кислоте. Изучаемые молочнокислые бактерии
нуждаются в серине при наличии в среде в качестве единственного
источника серы метионина, его аналога или гомоцистеина (при на-
личии же цистеина или цистатионина серин не требуется, очевид-
но потому, что цистеин превращается в серин).
Спиртоустойчивость
В литературе имеется значительное количество работ о влия-
нии спиртов на различные группы микроорганизмов. Наиболее
полно изучено действие одноатомных спиртов, особенно, этилового,
и их водных растворов как антисептиков (Reddish, 1954; Schinzel,
Lingnau, 1955, и др.).
Установлено, что эти спирты обладают бактерицидным и бакте-
риостатическим действием на вегетативные клетки микроорганиз-
мов. Антибактериальное действие спирта обусловливается денату-
рацией протеинов клетки. В отсутствие воды белки денатуриру-
ются слабее, поэтому абсолютный этиловый спирт менее бактери-
циден, чем его водные растворы. Наибольшее бактерицидное дейст-
вие он оказывает в концентрации от 60 до 75 об.%.
Наиболее чувствительны к воздействию спиртов вегетативные
формы микроорганизмов; споры бактерий значительно более рези-
стентны. Они выдерживают пребывание в 25—10 об. % этиловом
спирте в течение 48 час. Особенно устойчивы споры к безводному
алкоголю. Значительную устойчивость к спиртам проявляют и вы-
сушенные микроорганизмы. Грамположительные микроорганизмы
обладают большей устойчивостью, чем грамотрицательные.
46
При действий высоких концентраций спиртов у ряда микроорга-
низмов наблюдается лизис. Лизис обусловливается тем, что спирты
в определенных дозах вызывают прекращение роста микроорганиз-
мов, но не приостанавливают действия протеолитических фермен-
тов.
Бактерицидные дозы спиртов находятся в большой зависимости
от состава среды, в которой они действуют. Эффект снижается в
присутствии аминокислот: лейцина, триптофана, глутаминовой
кислоты и повышается при наличии пролина, серина, аланина.
В присутствии трехатомного спирта (глицерина) молочнокислые
бактерии развиваются относительно хорошо.
Вопрос о влиянии содержания невысоких доз одноатомных
спиртов в средах на развитие микроорганизмов изучен слабо. Ис-
следования в данном направлении проводились преимущественно
с этиловым спиртом и только с теми группами микроорганизмов,
у которых он является основным продуктом брожения или кото-
рые используют его в качестве продукта питания.
Особенно детально исследовалось отношение к этиловому спир-
ту дрожжей. Установлены дозы спирта, тормозящие размножение
и брожение различных видов дрожжей, преимущественно имею-
щих производственное значение. Показано, что размножение дрож-
жей подавляется более низкими дозами спирта, чем брожение.
Предельные концентрации спирта, которые полностью приостанав-
ливают жизнедеятельность дрожжей, различны для отдельных ви-
дов и даже рас. Наибольшую устойчивость к нему проявляют вин-
ные дрожжи (особенно хересные, которые бродят при 16—18 об. %
спирта). Предельные концентрации спирта, при которых возмож-
но развитие других микроорганизмов, лежат значительно ниже,
чем для дрожжей. Только немногие виды уксуснокислых бактерий
развиваются в средах с 11—13 об.°/о спирта. Условия культивиро-
вания дрожжей влияют на их устойчивость к спирту. Так, дрожжи
из аэрированных культур менее устойчивы к действию спирта, чем
из неаэрированных.
Рядом исследователей показано, что многие микроорганизмы
при длительном культивировании их при возрастающих концент-
рациях спирта повышают устойчивость к нему. Это установлено
для хересных рас дрожжей (Саенко,.1950, и др.). Никодемус с сот-
рудниками (Nikodemusz et al., 1955) нашли, что штаммы Pseudo-
monas, пассированные на средах с 5 об. % спирта, через год приоб-
ретают способность расти при 8—9 об. % и лишь 10 об. % действу-
ет на них бактерицидно.
Развитие в средах с высоким содержанием этилового спирта
В литературе нам не удалось найти сколько-нибудь полных и
систематических исследований по вопросу об отношении группы
молочнокислых бактерий к спирту. Имеются только данные по от-
ношению к спирту молочнокислых бактерий, вызывающих заболе-
вания вин.
47
Исследователи (Miiller-Thurgau, Osterwalder, 1913a, и др.), изу-
чавшие молочнокислое скисание вин, указывали, что штаммы, вы-
деленные ими из сухих вин, развивались при предельных содержа-
ниях спирта в средах — 12 об.% и лишь единичные при 14 об.%.
Позднее исследователи (Ribereau-Gayon, 1956 и др.), описывая за-
болевания вин, преимущественно крепких и десертных, априорно
полагали, что высокая спиртоустойчивость присуща только немно-
гим представителям группы молочнокислых бактерий. Авторы, ус-
танавливающие границы спиртоустойчивости бактерий, не уделяли
обычно внимания физиологическому состоянию культуры и соста-
ву среды, что, как удалось показать в наших экспериментах, имеет
существенное значение.
Нами с сотрудниками (Квасников, 1951а, 1952а, 1958; Квасни-
ков, Сумневич, 1954; Квасников, Андрусенко, 1958а, б и др.) в
процессе многолетних исследований было изучено отношение к
спирту нескольких тысяч штаммов молочнокислых бактерий как
музейных, так и преимущественно свежевыделенных из различных
природных и производственных субстратов (эпифитной и ризо-
сферной микрофлоры растений, почвы, силоса, вин, солода, ква-
шеных овощей и фруктов, заторов бродильных заводов, молочных
продуктов, фекалий и т. д.). Испытывались штаммы многих видов
молочнокислых бактерий: Str. lactis, Str. cremoris, L. buchneri,
L. plantarum, L. brevis, L. fermenti, L. acidophilus, L. bulgaricus
и др.
Опыты проводились по следующей методике. Питательные сре-
ды подбирались наиболее благоприятные для развития того или
иного из исследуемых видов (автолизат дрожжей с 1% глюкозы,
капустный отвар с 1 % пептона и 2 % глюкозы, люцерновый отвар с
добавлением тех же компонентов, солодовое сусло с дробиной, мо-
локо и др. с оптимальным значением pH). В них вводился спирт в
различных концентрациях (от 6 до 26 об.%) и после тщательного
перемешивания высевалась активная двухсуточная культура (в
количестве около 1 млн. микробных тел на 1 мл среды). Среды за-
крывались пробками, которые дополнительно парафинировались
для уменьшения испарения спирта и выдерживались при 20—22°.
Ежедневно производится осмотр пробирок и микроскопирование.
Все штаммы L. buchneri, выделенные из больных вин, как су-
хих, так и десертных, развивались независимо от типа вина при
концентрации спирта до 16—22 об.%. Высокую спиртоустойчи-
вость (до 23%) при этом проявляли штаммы, выделенные из шам
панского в резервуарах, заболевание которого было описано нами
впервые в 1951 г. (Квасников, 19516). Жесткие для молочнокислых
бактерий условия резервуарной шампанизации направленно со-
действовали повышению их спиртоустойчивости. В процессе много-
летних исследований нам даже удавалось выделить из шампанско-
го и десертных вин несколько штаммов, выдерживающих до
25 об. % спирта. Аналогичную стойкость к спирту проявили и
штаммы L. brevis и L. fermenti, также изолированные из вин.
48
Однако значительной спиртоустойчивостью обладают не только
винные штаммы. Штаммы молочнокислых бактерий, выделенные
из эпифитной микрофлоры среднеазиатских растений и принадле-
жащие к видам L. plantarum, L. brevis, L. fermenti, росли в средах,
содержащих 16—20 об.% спирта, а единичные — 22 об.%. Такую
же спиртоустойчивость проявили штаммы этих бактерий, изолиро-
ванные из силоса, квашеных овощей и фруктов (капусты, помидо-
ров, огурцов, яблок и т. п.).
Испытание большого количества палочковидных гетерофермен-
тативных бактерий, выделенных из почвы и ризосферы растений,
показало их способность развиваться в средах, содержащих 14—
18 об. % спирта, а иногда и больше.
Менее детально нами исследовались штаммы молочнокислых
бактерий, применяемые в молочной промышленности. Штаммы аци-
дофильной палочки (L. acidophilus), музейные и свежевыделенные
из фекалий, которые мы испытывали, росли при 12—18 об. % спир-
та, а болгарская палочка (L. bulgaricus) при 12—16 об.%. Молоч-
нокислые кокки (Str. lactis и Str. cremoris), выделенные из различ-
ных проб узбекского кислого молока, росли в средах, содержащих
спирт в пределах 12—16 об. % и лишь единичные штаммы выдер-
живали 18 об. % спирта.
При высеве естественного комплекса микроорганизмов молока
в среды с различным содержанием спирта развитие молочнокис-
лых бактерий наблюдалось при 12—16 об.%, посторонние микро-
организмы подавлялись. Из некоторых проб молока удавалось вы-
делять и более устойчивые к спирту штаммы бактерий. Только
очень немногие штаммы ароматообразующих бактерий оказались
менее спиртоустойчивыми. Они выдерживали только 6—8 об. %
спирта.
Взятые для контроля из музея живых культур Института вак-
цин и сывороток Министерства здравоохранения УзССР стандарт-
ные штаммы золотистого стафилококка (Staphylococcus aureus
№ 292 и 222) и кишечной палочки (Bact. coli commune № 240)
развивались лишь при максимальной концентрации спирта
5—7 об.%, а антракоид (Вас. antracoides) не рос уже при 6 об.%.
Была испытана также устойчивость к спирту 60 свежевыделенных
и производственных штаммов Saccharomyces ellipsoideus. На сусле
при тех же условиях опыта ни один из штаммов уже не дал роста
при концентрации спирта выше 16 об.%, a Torula kefir не развива-
лась даже при 14 %-ном спирте.
Подавляющее большинство штаммов молочнокислых палочко-
видных бактерий развивалось при 15—18%-ной концентрации
спирта, некоторые при 20 и даже 22, а единичные при 23- и даже
24 %-ной. Лишь немногие (преимущественно кокки, выделенные
из молочных продуктов) росли при более низких концентрациях —
не выше 12—16 об.%.
Приспособленность молочнокислых бактерий к развитию при
высоких концентрациях спирта является характерным свойством,
49
Присущим группе молочнокислых бактерий как гетерофермента-
тивных, так и гомоферментативных.
Существенно подчеркнуть, что специально проведенные опы-
ты по сравнительному изучению спиртоустойчивости штаммов мо-
лочнокислых бактерий, обладающих различной кислотообразую-
щей способностью, отчетливо показали, что эти свойства положи-
тельно коррелируют. Штаммы молочнокислых бактерий,
обладающие высокой энергией кислотообразования, характеризу-
ются и максимальной устойчивостью к спирту. Наоборот, малоак-
тивные штаммы к нему менее устойчивы.
Наиболее быстро в средах с высоким содержанием спирта раз-
множаются молодые культуры всех испытанных видов молочно-
кислых бактерий. С возрастом скорость размножения в этих средах
закономерно падает.
Всегда чем больше спирта содержала среда, тем медленнее в
ней размножались молочнокислые бактерии. При предельных кон-
центрациях спирта видимые признаки роста культуры наблюда-
лись только через 20—30 и более суток. Важно подчеркнуть, что
если высев старых культур производился в обычные среды, а спирт
в них в количестве 15% вводился не сразу, а через 1—1,5—2 су-
ток, то культуры успевали «омолодиться» и в дальнейшем прояв-
ляли ту же устойчивость к спирту, что и молодые культуры.
Все приведенные данные о максимальных концентрациях спир-
та, которые выдерживают молочнокислые бактерии, получены в
опытах со средами, полностью обеспечивающими их потребности в
питательных компонентах и витаминах. На неполноценных средах,
на которых развитие молочнокислых бактерий происходит затор-
моженно, устойчивость к спирту значительно снижается. Так, они
развиваются при содержании спирта 1—3% ниже в сусле, приго-
товленном из винограда без добавления автолизата дрожжей, чем
в том же сусле, но с автолизатом. Обогащение сусел автолизатом
дрожжей делает их пригодными для развития бактерий при опи-
санных выше нормах спирта.
Длительное культивирование молочнокислых бактерий (L. bu-
chneri) с дрожжами (Sacch. ellipsoideus) в виноградном сусле в
наших опытах повысило устойчивость бактерий к спирту на 2%
по сравнению с исходным штаммом. Так, штамм L. buchneri, обла-
дающий непосредственно после выделения из винограда способ-
ностью развиваться при предельных концентрациях спирта в
22 об. %, после четырех лет выращивания совместно с дрожжами
Sacch. ellipsoideus (раса Ркацители 6) в виноградном сусле приоб-
рел способность к развитию при 24 об. % спирта.
Угнетающее действие высоких концентраций спирта на молоч-
нокислые бактерии более остро сказывается при высоких темпера-
турах. Так, при 16 об. % спирта подавляющее большинство штам-
мов L. buchneri не развивается уже при 36°, а при 38° прекраща-
ется развитие всех штаммов (температурный максимум для
данного вида в средах без спирта около 45°).
50
Наличие спирта в среде оказывает существенное влияние
на длительность выживания бактерий. Отмечено, что продолжи-
тельность жизни молочнокислых бактерий без пересевов в спирт-
содержащих средах в два-четыре раза больше, чем в тех же средах
без спирта. Это явление обусловливается тем, что в первых бакте-
рии медленно размножаются и накапливают продукты брожения.
Этим же объясняется и высокая продолжительность жизни молочу
нокислых бактерий в винах. В осветленных винах, по нашим наб-
людениям, в лабораторных условиях при комнатной температуре
молочнокислые бактерии выживали в течение 7 мес. и более. Мак-
симальную же продолжительность жизни популяций молочнокис-
лых бактерий нам приходилось отмечать в дрожжевых осадках
сухих вин (свыше 4 лет).
Таким образом, при работах с молочнокислыми бактериями в
спиртсодержащих средах пересевы возможно производить значи-
тельно реже, чем при культивировании на обычных средах.
Морфологические изменения культур молочнокислых бактерий,
при развитии их в средах с высоким содержанием спирта законо-
мерны. Спирт у многих видов, особенно при развитии на средах,
слабо обеспечивающих их питание, вызывает увеличение размеров
клеток в длину, иногда при этом они принимают вид длинных изо-
гнутых нитей. В основном спирт подавляет функцию размножения
клеток; функция же роста подавляется слабее.
Особенности действия водных растворов этилового спирта
В литературе нет данных о действии водных растворов этилового
спирта на группу молочнокислых бактерий. С целью изучения их
влияния была поставлена серия опытов по следующей методике.
Для исследования было взято значительно меньшее количест-
во штаммов молочнокислых бактерий, чем в предыдущих опытах.
Сопоставлением устанавливалось отношение к спирту и ряда дру-
гих микроорганизмов, отобранных из музея чистых культур нашей
лаборатории: золотистого стафилококка (Staph, aureus), кишечной
палочки (Bact. coli commune), уксусной бактерии (Bact. aceti),
сенной палочки (Вас. subtilis), картофельной бациллы (Вас. те-
sentericus), плесневого грибка (Penicillium notatum) и винных
дрожжей (Sacch. ellipsoideus, раса Ркацители 6).
Заблаговременно для опытов приготавливался абсолютный эти-
ловый спирт путем перегонки 96%-ного спирта с негашеной из-
вестью. Из абсолютного спирта готовили затем водные растворы
нужной концентрации.
В спиртовые растворы вводилось постоянное количество микро-
организмов в определенном физиологическом состоянии и выдер-
живалось в них заданное время. Затем 0,1 мл спиртового раство-
ра с находящимися в нем микроорганизмами высевали в капуст-
ную или люцерновую среду, которая по прошествии семи суток
51
инкубации в термостате при 30° просматривалась и микроскопиро-
валась.
Бактерицидные дозы спирта были установлены для молодых
односуточных культур микроорганизмов. В 1 мл спирта и его вод-
ных растворов вносилось около 1 млн. микробных тел. В условиях
опыта все штаммы молочнокислых бактерий проявили значительно
большую устойчивость к спирту и его водным растворам, чем ве-
гетативные формы других микроорганизмов. Наибольшей стой-
костью обладали штаммы L. buchneri и L. brevis. Они выдерживали
воздействие 90%-ного спирта до 2, 70%-ного до 3—5 и 50%-ного
Мин.
180 г
Рис. 7. Длительность выживания Lactobacillus buchneri штамм 114г в вод-
ных растворах этилового спирта в зависимости от возраста культуры. На оси
абсцисс концентрация этилового спирта в %
Возраст культуры, суток: а. — 5/б — 15; в — 30; г — 60
до 10 мин. L. plantarum, штамм К-10, выделенный из ризосферы
винограда, оказался несколько менее устойчивым, однако и он вы-
держивал 90%-ный спирт до 2, 70%-ный до 3 и 50%-ный до 7 мин.
Взятые для контроля золотистый стафилококк и кишечная па-
лочка в спиртовых растворах погибли при более низких концентра-
циях и значительно быстрее. Несколько более устойчивыми к спир-
ту оказались уксуснокислые бактерии и винные дрожжи, для
которых субстраты со спиртом являются естественной средой оби-
тания. Однако и они были в несколько раз менее спиртоустойчи-
выми, чем молочнокислые бактерии. Слабой устойчивостью к воз-
действию спирта обладали и вегетативные формы сенной палочки,
картофельной бациллы и плесневого грибка Penicillium notatum.
Лишь споры этих микроорганизмов, как это было установлено в
особых опытах, проявили высокую спиртоустойчивость, что пол-
ностью согласуется с данными других исследователей.
Спиртоустойчивость культур молочнокислых бактерий, так же
как в предыдущих опытах, изменялась в зависимости от их воз-
раста. Наивысшей устойчивостью к спирту обладали молодые куль-
туры. Со старением их стойкость к спирту постепенно падала
52
(рис, 7). Эта закономерность наблюдалась при испытании всех
штаммов молочнокислых бактерий.
Наибольшую устойчивость к спирту проявили бактерии, разви-
вавшиеся в средах, полностью обеспеченных полноценными пита-
тельными компонентами и витаминами (автолизат-глюкозная,
капустно-люцерновая). Значительную устойчивость проявили и
штаммы бактерий, выращиваемые в винах, особенно десертных.
Пребывание бактерий на «голодных средах» (вода) и средах,
односторонне обеспечивающих их питанием (автолизатная или
глюкозная), делает их менее устойчивыми к последующему воздей-
ствию спирта.
Определенное влияние на развитие культур оказывает и состав
среды, в которую высеваются молочнокислые бактерии после обра-
ботки спиртом. При высеве в среды, полноценно обеспечивающие
питание молочнокислых бактерий, они растут при крайних дози-
ровках, которые оказываются уже летальными, если высев был
произведен в неполноценные питательные среды (даже такие, как
мясо-пептонный бульон).
Спиртоустойчивость молочнокислых бактерий и в данных опы-
тах повышалась после длительного совместного культивирования
их с дрожжами. В наших опытах штамм L. buchneri 114г после
трехлетнего развития в сусле с дрожжами Sacch. ellipsoideus (раса
Ркацители 6), будучи выделен в чистую культуру, выдерживал
90%-ный спирт до 4, 70%-ный до 6 и 50%-ный до 12 мин. Исход-
ный же штамм (контроль) в том же опыте был устойчив как мак-
симум к воздействию 90%-ного спирта до 2, 70%-ного — до 3 и
50%-ного до 10 мин.
Известно, что бактерицидные дозы антисептиков изменяются
в определенных пределах в зависимости от количества микробных
тел, на которые они воздействуют. С увеличением содержания в
среде молочнокислых бактерий бактерицидное действие спирта
также ослабляется и поэтому для достижения обеспложивающего
эффекта дозы его соответственно должны быть увеличены. Так,
при увеличении количества клеток молочнокислых бактерий втрое
устойчивость их к спирту возрастала уже на 5—10%.
Следует отметить, что в наших опытах R- и S-варианты
L. buchneri проявляли одинаковую спиртоустойчивость.
При изучении влияния сублетальных дозировок спирта на ак-
тивность кислотообразования молочнокислых бактерий они после
обработки спиртом высевались в стерильную капустно-люцерно-
вую среду с глюкозой. В качестве контроля бралась та же культу-
ра, но подвергавшаяся спиртовому воздействию. Среды инкубиро-
вались в термостате при 25° и в них периодически определялась
титруемая кислотность. Было установлено, что сублетальные дозы
спирта в первое время, как правило, угнетают кислотообразующую
способность молочнокислых бактерий, однако к концу брожения
они накапливают то же количество кислот, что и контрольный
штамм.
53
Сублетальные дозировки спирта и его водных растворов оказы-
вают определенное влияние на морфологию клеток молочнокислых
бактерий в первые сутки их развития в питательных средах. У не-
которых изученных видов наблюдается при этом образование уд-
линенных палочек и нитей длиною до 20 мк и более. При этом
культуры, подвергавшиеся спиртовому воздействию, несколько
напоминают по форме клетки, развивающиеся в средах с постоян-
ным присутствием спирта, описанные выше. При дальнейшем раз-
витии в средах без спирта, молочнокислые бактерии приобретают
нормальную для них форму.
Закономерности влияния гомологического ряда
одноатомных спиртов
В литературе прочно установилось мнение, что бактерицидное дей-
ствие отдельных представителей гомологического ряда одноатом-
ных спиртов возрастает с увеличением их молекулярного веса. Ре-
диш (Reddish, 1954), Шинцель, Лингнау (Schinzel, Lingnau, 1955)
и другие утверждают, что все микроорганизмы проявляют наиболь-
шую устойчивость к низшему представителю этого ряда — метило-
вому спирту; этиловый спирт оказывает на них уже большее губи-
тельное действие. Бактерицидность пропилового, бутилового и ами-
лового спиртов возрастает с увеличением числа углеродных атомов
в углеродной цепочке.
По-видимому, эта закономерность носит общебиологический ха-
рактер, и антисептическое действие любого ряда соединений, в ко-
тором изменение структуры связано лишь с изменением длины
углеродной цепочки, проявляется аналогично. Низшие члены дан-
ного ряда обладают слабым действием, активность влияния ве-
ществ повышается до определенного предела с увеличением их
молекулярного веса (Дюбо, 1948, и др.).
Во всех наших опытах молочнокислые бактерии проявили зна-
чительно большую устойчивость к этиловому спирту, чем к мети-
ловому. Это в одинаковой степени наблюдалось при исследовании
как бактериостатического, так и бактерицидного действия спиртов.
Этой закономерности подчинялись все испытанные штаммы мо-
лочнокислых бактерий.
Наибольшую устойчивость к спиртам и их водным растворам
(рис. 8) проявили молочнокислые бактерии — активные кислото-
образователи, особенно гетероферментативные — L. buchneri
(штамм 114г, выделенный из больных вин). Весьма устойчивы к
ним были и гомоферментативные бактерии — L. plantarum
(штамм 16, изолированный из эпифитной микрофлоры растений).
Значительно меньшую стойкость к спиртам проявили молочнокис-
лые кокки — Str. lactis (штамм, выделенный из молока). Золоти-
стый стафилококк, испытанный в качестве контроля, проявил, как
и следовало ожидать, меньшую спиртоустойчивость, причем этило-
вый спирт оказывал на него более сильное бактерицидное и бак-
54
териостатическое действие, чем метиловый. Аналогичные резуль-
таты были получены во всех опытах, где испытывалось влияние
спиртов на развитие молочнокислых бактерий в различных средах
(люцерновой, автолизат-глюкозной, капустной, мясо-пептонном
бульоне и др.).
При исследовании бактерицидного действия водных растворов
спиртов все молочнокислые бактерии также проявили большую
устойчивость к этиловому спирту, чем к метиловому. Так, напри-
мер, L. buchneri штамм 1142 выдерживал воздействие 90%-ного
спирта до 2, 50%-ного до 10, а метилового спирта, соответственно,
Рие. 8. Дозы этилового
(А) и метилового (Б)
спиртов при 10-суточном
воздействии их на мо-
лочнокислые бактерии в
люцерновой среде
а — бактериостатические,
б — бактерицидные,
1 — Lactobacillus bucheri
штамм 1142,
2 — L. plantarum штамм 16.
з — Streptococcus lactis,
4 — Staphylococcus aureus
до 1 и 3 мин. Близкие данные были получены и в опытах с други-
ми штаммами гомо- и гетероферментативных представителей рода.
Наибольшее бактерицидное действие на молочнокислые бакте-
рии, в отличие от других микроорганизмов, по-видимому, оказыва-
ют несколько более высокие водные концентрации этилового спир-
та (близкие 90 %-ной).
Бутиловый спирт в агаризованной люцерновой среде все
штаммы молочнокислых бактерий (L. plantarum, L. buchneri,
L. fermenti и L. brevis) выдерживали в концентрации 2,5—3%-ной
(табл. 5).
Интересно отметить, что штамм L. brevis, выделенный из про-
кисшей бражки Докшукинского ацетоно-бутилового завода, обла-
дал способностью развиваться даже при 5% бутилового спирта в
среде. По-видимому, при развитии в производственных условиях
устойчивость к бутиловому спирту еще более повышается. Спирто-
устойчивость штаммов на среде с мелом была такой же или немно-
гим выше, чем на средах без мела.
Другие испытанные виды микроорганизмов проявили к бутило-
вому спирту значительно меньшую устойчивость (Bact. coll com-
mune выдерживал максимум 1% его, а дрожжи Sacch. ellipsoide-
us—1,5%).
Таким образом, молочнокислые бактерии оказались менее ус-
тойчивыми к бутиловому спирту, чем к этиловому. Однако бутило-
55
Таблица 5
Влияние бутилового спирта на рост молочнокислых бактерий рода
Lactobacillus в агаризованной люцерновой среде *
Место выделения Содержание бутилового спирта (об. %) в среде
Вид, штамм без мела с мелом
1 1,5 2 2,5 3 5 10 1 1,5| 2 2,5 3 5 10
L. plantarum 66 Ризосфера винограда + + + + + — — + + + +
72 » )> + + 4" — — — + + + + + — —
11 Силос + — — — — + + + — — — —
L. fermenti 16 » » 4- — — — + + + + + — —
L. buchneri 114г Больное вино + + + — — + + + — —
L. brevis 14 Силос + + — — — + + + — —
A.6. Бражка ацетоно-бути- лового завода + — + + + + + —
Esch, coli 13 Музейный штами +
Saccharomyces ce- revisiae, раса XII + — — — — — + — — — — —
• Плюс — наличие роста; минус — отсутствие роста.
вый спирт на них действует слабее, чем на другие микроорга-
низмы.
Высокая устойчивость молочнокислых бактерий к бутиловому
спирту позволяет им развиваться при нарушении правил чистоты
брожения в субстратах ацетоно-бутиловых заводов, где они могут
приносить значительный ущерб производству.
Бактерицидность действия на молочнокислые бактерии осталь-
ных спиртов (пропилового, амилового и их изомеров) возрастает
с увеличением их молекулярного веса.
Изменения клеток молочнокислых бактерий, подвергавшихся
воздействию сублетальных концентраций бутилового спирта, на-
поминают описанные нами для культур, развивающихся в средах с
этиловым спиртом. По-видимому, бутиловый спирт, так же как и
этиловый, наиболее активно подавляет функцию деления клеток и
слабее действует на рост.
Таким образом, высокая спиртоустойчивость является одним
из характерных свойств группы молочнокислых бактерий, которые
более резистентны к одноатомным спиртам, чем вегетативные фор-
мы всех других микроорганизмов. Это выявляется как при изуче-
нии развития микроорганизмов в питательных средах со спиртом,
так и при воздействии на них его водными растворами. Отдельные
виды молочнокислых бактерий различаются между собой по устой-
56
чивости к этиловому спирту. Она достигает наибольшего значения
у видов, обладающих высокой биохимической активностью. Кок-
ковые формы молочнокислых бактерий менее спиртоустойчивы.
Как правило, возрастные изменения культур оказывают су-
щественное влияние на их устойчивость к этиловому спирту.
Наибольшей спиртоустойчивостью обладают Молодые культуры:
со старением это свойство закономерно уменьшается. Спирто-
устойчивость молочнокислых бактерий в наибольшей степени про-
является в средах, полноценно обеспечивающих их потребности в
питательных компонентах и витаминах.
Длительное развитие молочнокислых бактерий в субстратах с
этиловым спиртом (в производственных и лабораторных условиях)
повышает их спиртоустойчивость. Резистентность бактерий к
спирту также повышается при длительном совместном культиви-
ровании их с дрожжами.
Влияние сублетальных доз этилового спирта сказывается в по-
давлении функции деления клеток. Функция их роста подавляется
слабее. Это вызывает появление у некоторых видов бактерий удли-
ненных форм клеток. Биохимическая активность культур, подвер-
гнутых воздействию водными растворами этилового спирта, на
определенный отрезок времени снижается.
Продолжительность выживания молочнокислых бактерий в сре-
дах с высокими концентрациями этилового спирта в несколько раз
длительнее, чем в средах без спирта, что, в первую очередь, обус-
ловливается тормозящим действием его на процессы размножения
клеток.
Молочнокислые бактерии проявляют наибольшую устойчивость
не к метиловому, а к этиловому спирту. По-видимому, это свойство
возникло у них в процессе длительной эволюции совместно с дрож-
жами в одних и тех же природных и производственных субстра-
тах. Приведенный материал показывает, что возникающая в про-
цессе эволюции приспособленность организмов к токсическому
действию одного из компонентов гомологического ряда определен-
ных веществ повышает их устойчивость и к другим представите-
лям того же ряда.
Действительно элективными для группы молочнокислых бак-
терий являются среды, содержащие все необходимые для них пи-
тательные компоненты и этиловый спирт в концентрации, не пре-
пятствующей их развитию, но подавляющей развитие посторонних
микроорганизмов.
57
ВЫДЕЛЕНИЕ,
КОЛИЧЕСТВЕННЫЙ УЧЕТ, КУЛЬТИВИРОВАНИЕ
И ХРАНЕНИЕ МОЛОЧНОКИСЛЫХ БАКТЕРИЙ
ОТДЕЛЬНЫХ РОДОВ
Выделение и, особенно, количественный учет молочнокислых бак-
терий в различных природных и производственных субстратах свя-
заны с рядом трудностей. Это обусловлено тем, что представители
данной группы очень требовательны к источникам питания и не
растут на простых средах. Для их выращивания необходимы слож-
ные среды, содержащие растительные отвары, мясные и дрожже-
вые экстракты, белковые гидролизаты и прочее. К тому же многие
формы этих бактерий растут очень медленно и «заглушаются» со-
путствующей микрофлорой.
Сложно и хранение чистых культур молочнокислых бактерий,
так как они легко теряют свою активность и производственно цен-
ные свойства. При идентификации штаммов выбор основной среды
и соответствующих методов для выявления отношения бактерий
к испытуемому компоненту играют решающую роль. Следует от-
метить, что исследования осложняются тем, что группа молочно-
кислых бактерий представлена значительным количеством видов
как палочковидных, так и кокковых форм, весьма различных по
многим признакам и широко распространенных в разнообразных
природных и производственных субстратах.
В связи с изложенным становится понятным, почему для изо-
лирования и изучения данной группы, как правило, требуется ис-
пользование большого разнообразия сред и методов. Упрощенный
подход к подбору их нередко ведет к большим погрешностям.
Ниже мы приводим данные по основным методам, использую-
щимся для выделения и количественного учета лактобацилл и кок-
ковых форм, а также останавливаемся на способах их культивиро-
вания и хранения. Эти сведения, как нам представляется, смогут
оказаться полезными широкому кругу работников науки и практи-
ки, сталкивающихся с изучением молочнокислых бактерий.
Род Lactobacillus Beijermck, 1901
Выделение чистых культур и количественный учет. Молочнокис-
лые палочки, обитающие в различных природных и производствен-
ных субстратах, часто не занимают доминирующего положения —
над ними превалируют другие микроорганизмы (обычно грамотри-
цательные палочковидные бактерии, кокковые формы, плесневые
грибы, дрожжи и др.). Поэтому для выделения лактобацилл нужно
использовать среды, во-первых, обеспечивающие в должной мере
их питательные потребности, во-вторых, угнетающие рост посто-
ронней микрофлоры. Последнее достигается применением различ-
ных веществ, например, азида натрия, ацетата таллия, сорбиновой
и уксусной кислот, этилового спирта, а такжё^ОАй^йъным сниже-
нием pH среды (до 5 и ниже),
В настоящее время для изолирования лактобацилл рекомендо-
ван ряд эффективных сред.
В состав сред, предложенных различными исследователями,
входят ингредиенты, богатые аминокислотами и витаминами — то^-
матный сок, дрожжевой экстракт и автолизат/Томатиый сок обыч-
но готовят по методу Бригс (Briggs^,1953a). Для этого 400 г мелко
нарезанных томатов^<ипятятвД^л_шстиллированнби~воды околю
1^5 цас,л фильтруют чёрез^мажпыи^йлцтрщ автокдавируютпри
121° истечение 20 мин. Перед употреблением рН'сокцдоводятдо~770Г~
Применяют^~и~7продажньщ консервирбванныщ профильтрован-
ный сокГ ~ -----
' Дрожжевой экстракт можно приготовить таким способом. 400 г
дрожжей нагревают в 700 мл воды при 100° на водяной бане в те-
чение часа, отстаивают и сливают верхний слой; экстракт стери-
лизуют текучим паром трижды. Приготовление дрожжевых авто-
лизатов и экстрактов, а также белковых гидролизатов описано во
многих работах (Козлов, 1950; Одинцова, 1959; Виноградова,
1962, и др.). Стерилизация сред обычно проводится при
121° 15 мин. или при 115° 30 мин.
Высев из отдельных колоний, выросших на поверхности агари-
зованных сред, производят на питательные среды, применяемые
для культивирования молочнокислых бактерий.
Лерхе и Ройтер (Lerche, Reuter, 1960) успешно применили мо-
дификацию среды Бригс (Briggs, 1953а) для выделения молочно-
кислых бактерий из пищевых продуктов и фекалиев (табл. 6). Сор-
биновая кислота (0,4%) прибавляется перед разливкой среды в
чашки Петри (pH среды 5). Одновременно испытуемый материал
сеют сначала в бульон того же состава с сорбиновой кислотой,
а затем на агаризованную среду. Чашки инкубируют 2—3 суток
при 37° для выделения термофильных палочек и одни сутки при 30°
для выделения мезофилов.
Шарп (Sharpe, 1955с) рекомендует 10 г испытуемого материа-
ла взбалтывать с 20 мл физиологического раствора КаСП(образпы
сыра — со 100 мл) и одёу петлю полученной болтушки или мате-
риала из 10-1 разведения, приготовленного на растворе Рингера
(разведен в 4 раза), высевать на поверхность агаризованной среды
ТДА с ацетатом таллия, внесенным непосредственно перед стери-
лизацией среды, и без него (табл. 6). Инкубацию проводят в анаэроб-
ных условиях в течение 48 час. Кроме того, 1 мл неразведенной
болтушки исходного материала отсевается на бульонную накопи-
тельную среду того же состава, что и ТДА, но без тиогликолата
натрия и агара, т. е. в среду ТДБ с ацетатом таллия и без него.
Посев инкубируют, как указано выше, после чего делается высев
па ТДА. Шарп отмечает, что при высеве образцов на агар с ацета-
том таллия удается выделить большее разнообразие видов, чем при
использовании предварительного высева на бульон; в последнем
Таблица 6
Среды для выделения лактобацилл
Кем описана среда и откуда можно выделять на ней
бактерии
Состав среды, % Lerche, Reuter, 1960. Пищевые продукты, фекалии Sharpe, 1955 с. Фе- калии, навоз, силос- ные травы, рубец жвачных животных Keddie, 1951. Силос, травы Rogosa et al., 1951. Ротовая полость, фекалии, навоз, си- I лос, кислая капус- та, сыр, тесто i Davis et al., 1955 *. Ротовая полость Квасников, 1960. Почва, растения, со- держимое кишечного тракта, силос, суб- страты бродильных и пищевых произ- водств Леонович, Прпере- кова, 1963 **. Рубец жвачных животных
Томатный сок Растительные отвары (ка- пуста, люцерна, вино- град) Дрожжевой автолизат Дрожжевой экстракт (Difco) Мясной экстракт Триптический гидроли- зат казеина (Trypticase BBL) Пептический гидролизат казеина То же, мяса Гидролизат молока Обрат Растворимый крахмал П.ептон (Evans, Oxoid) Твин 80 Глюкоза NaCl Тиогликолевокислый натрий Ацетат таллия Цистеин Уксуснокислый натрий Лимоннокислый аммоний Ледяная уксусная кис- лота Этиловый спирт 40 10 10 о,з 20 5 1 0,5 1 40 0,5 10 1 10 2
0,8 0,8 0,05 0,1 2 0,5 2 0,01 2 1 0,1 1 0,05 1 0,1 2 2,5 0,2 0,132 0,05 1 0,1 0,5 1 1 2 8-16 10 Среда гото- вится на обрате 0,1 0,5 0,05
60
Таблица 6 (окончание)
Кем описана среда и откуда можно выделять на ней
бактерии
Состав среды, %
Соль А ***
Соль Б****
КН2РО4
pH
Агар
Сокращенное название
среды
6,8
1,5
6,6
1,5
ТДА
5,4
1,5
0,5
0,6
5,4
1,5
СЛ
0,5
0,5
6,8
ТДж
5,5—6,0
* Среда автоклавируется при 115° 20 мин.; употребляется профильтрованный
консервированный томатный сок.
* * При приготовлении агаризованной среды обрат заменялся гидролизатом мо-
лока и отсутствовал твин 80.
* ** Соль А — К2НР04 — 10 г; КП2Р04 — 10 г; дистиллированная вода до 100 мл.
* •** Соль Б - MgSO4-7H2O - 11,5 г; MnSO4-4H2O - 2,86 г (MnSO4-2H2O - 2,4 г);
FeSO4-7H2O — 0,68 г; дистиллированная вода — до 100 мл.
случае удавалось выделять только один вид молочнокислых пало-
чек. Хил и Торнтон (Hill, Thornton, 1958) успешно изолировали
и подсчитывали молочнокислые палочки в молочных продуктах,
используя указанную выше накопительную жидкую среду с ацета-
том таллия с последующим высевом на эту же, но агаризованную
среду, разлитую в чашки Петри двойным слоем.
По данным Кедди (Keddie, 1951), из трав и силосов молочно-
кислые бактерии успешно выделяются на рекомендуемой им среде
(табл. 6), в которую перед разливкой ее (двойной слой) в чашки
Петри добавляется отдельно простерилизованный апетатный бу-
'"фбр'прй pH 5,4 (О,2/М7уксусная кислота и апётат натрия).
- 'ВшдгПих”и зарубежных лабораториях широко применяется'аг'а-
ризованная среда Рогозы с соавторами (Rogosa et al., 1951), пред-
ложенная взамен агаризованных сред с томатным соком, которые
недостаточно селективны (табл. 6). Среда не требует автоклавиро-
вания и может сохраняться в холодильнике в течение шести меся-
цев. А. Ленцнер и М. Тоом (1963) получали хорошие результаты
на указанной среде, которая была авторами несколько изменена.
Например, использовался отечественный'дьЕЦтон) а вместо 0,5 г су-
хого дрожжевого экстракта Дифко брали дрожжевой автолизат
собственного приготовления.
61
Среда Рогозы применяется для количественного учета гомофер-
ментативных стрептобактерий в сырах и сырных заквасках, а так-
же других субстратах (Гудков, Хандак, 1972; Gonzalez et al., 1971).
Причем, анализы сыров и заквасок показали, что на среде Рогозы
при 37° растут только палочки, а при 30° — палочки и стреп-
тококки.
Успешное выделение молочнокислых палочек осуществляется
на среде Рогозы и других (Rogosa et al., 1951) в модификации Мэб-
бит и Зелинска (Mabbit, Zielinska, 1956). Среда готовится на
триптически переваренном молоке (5 г трипсина и 10 мл хлоро-
форма на 1 л обрата, который выдерживается в течение 24 час.
при pH' 8,5 и 37°); концентрация всех ингредиентов среды Рогозы
увеличена на 10%. А. Ленцнер и М. Тоом (1963) считают эту сре-
ду наиболее подходящей для выделения лактобацилл из образ-
цов, обсемененных и другими формами молочнокислых бактерий.
На ней можно обнаруживать молочнокислые палочки даже при
концентрации их в среде до 500 микробных тел в 1 мл.
А. Ленцнер и М. Тоом (1963) готовят среду на гидролизованном
молоке по В. М. Богданову (1950, 1957) и прибавляют 1% цис-
теина. Авторы считают целесообразным инкубировать посевы в
атмосфере СО2, где рост лактобацилл намного эффективнее, чем в
обычных условиях выращивания. Атмосферу углекислого газа
можно создать путем откачки воздуха из эксикатора или анаэро-
стата и введения туда СО2 из аппарата Киппа.
Агаризованная среда, приготовленная на гидролизованном мо-
локе с 5% дрожжевого автолизата по В. М. Богданову (1957), яв-
ляется эффективной для выделения лактобацилл (особенно в ат-
мосфере СО 2) из материала, обсемененного только этими формами
(Ленцнер, Тоом, 1963).
В 1964 г. Костилов с соавторами показали, что обезвоженная
селективная среда по Рогозе (Rogosa et al., 1951) вызывает пол-
ное угнетение роста Leuconostoc mesenteroides, Pediococcus cere-
visiae и Lactobacillus plantarum. Когда же содержание
ледяной уксусной кислоты снижают от 1,32 мл на 1 л среды до ми-
нимальных количеств, достаточных для обеспечения pH 5,6±0,05,
селективная среда становится благоприятной для роста молочно-
кислых бактерий.
В присутствии 0,0075% бромкрезолового зеленого эта среда
(жидкая и агаризованная) была с успехом использована для выде-
ления молочнокислых бактерий из засоленных огурцов, чрезвычай-
но обильно обсемененных другими группами микроорганизмов. Ав-
торы предлагают модифицированную ими среду (ЛБС-бульон,
pH 5,8) использовать для накопления клеток молочнокислых бакте-
рий, например, Pediococcus cerevisiae, Lactobacillus plantarum,
некоторых L. delbrueckii. Бульон легко готовится — его нужно
только довести до температуры кипения.
Нейлор и Шарп (Naylor, Sharpe, 1958а) испытали три среды
для выделения молочнокислых палочек из сыра и установили, что
62
ацетатный агар (АЦА) по Мэббит и Зелинска дает наилучшие ре-
зультаты. Посевы инкубируют в течение пяти суток при 30° в ат-
мосфере 90% Н2 и 10% СО2. На этой среде, в отличие от других,
удается выделять молочнокислые палочки на ранних стадиях соз-
ревания сыра, когда присутствует много молочнокислых кокков.
Гассер (Gasser, 1962) для непосредственного выделения мо-
лочнокислых бактерий из фекалиев использовал модифицирован-
ную им среду Де Мана с сотрудниками (МРС, табл. 7) с сорбино-
вой кислотой, которая добавлялась перед употреблением среды так,
чтобы концентрация кислоты составляла 0,01 М. С помощью сте-
рильной лимонной кислоты pH доводили до 5,1±0,1. Образцы
высевали непосредственно на агаризованную среду или их пред-
варительно взбалтывали в небольшом количестве стерильной дис-
тиллированной воды. В некоторых случаях не удавалось выделять
штаммы путем непосредственного высева на твердые среды; тогда
применяли жидкую накопительную среду того же состава, что и
твердая, с сорбиновой кислотой. Инкубация — двое суток при 35°
в эксикаторе в атмосфере 90% N2 и 10% СОг.
Для изолирования и подсчета лактобацилл удобно использо-
вать модифицированную среду МРС-1, предложенную А. А. Ленц-
нером (1966). На 1 л ее (в отличие от среды МРС) добавляют 0,2 г
цистеина, 50 мл дрожжевого автолизата и 100 мл печеночного эк-
стракта. Готовят МРС-1 на гидролизованном молоке по В. М. Бог-
данову, разведенном в два раза дистиллированной водой. Стерили-
зуют среду трижды текучим паром.
Печеночный экстракт готовят путем кипячения в течение
30 мин. 1 кг мелко нарезанной говяжьей печени в 1 л воды. Экст-
ракт фильтруют и стерилизуют при 0,5 атм. в течение 20 мин.
Среды МРС и МРС-1 успешно применялись в нашей лаборато-
рии для изолирования молочнокислых бактерий из различных суб-
стратов. В табл. 6 мы приводим прописи и других сред, на которых
выделяют лактобациллы.
Культивирование чистых культур лактобацилл удобно прово-
дить на среде Де Мана с сотрудниками (de Man et al., 1960) —
бульоне МРС (табл. 7) или полужидкой (0,15% агара) среде
МРС-1. На ней растут даже весьма требовательные к источ-
никам питания штаммы. Среда МРС не включает изменчивый
по своему составу томатный сок, но имеет те вещества, в присутст-
вии которых активно развиваются молочнокислые палочки. Вме-
сто пептона (Oxoid) употребляют триптон (Difco) (казеин пептон).
Термобактерии (а также лактобациллы иных подродов), кото-
рые весьма трудно изолировать и поддерживать даже при исполь-
зовании среды МРС или ее модификаций мы с успехом выделяли
(по ходу технологического процесса при производстве овощных
консервов, с оборудования сахарных заводов и т. д.) и культивиро-
вали на модифицированной А. Ф. Качаном в нашей лаборатории
среде МРС (МРС-К). Состав ее (г/л или мл/л): пептон — 10,0 г;
мясная вода — 75,0 мл; печеночный экстракт — 25 мл; томатный
63
Т'а блица 7
Состав сред (в %) для культивирования лактобацилл,
рекомендованных отдельными исследователями
Состав среды Среда МРС 1 (De Man et al., 1960) Rogosa (цит. no BfHiyml- ou, Hansen, 1962) Среда ДПТ (Deibel et al., 1957) Keddie, 1959 * Langston, Bouma, 1960a Briggs, 1953a •* Rogosa et al., 1953
1 2
Дрожжевой экстракт (Oxoid, Difco) 0,5 0,5 0,5 0,5 0,6 0,5
Дрожжевой автолизат Растворимый в воде эк- стракт печени (Wilson Laboratory) Триптический гидроли- 1,0 5 5 1,0 0,1
зат казеина
Мясной экстракт (Lab Lemco, Oxoid) 1,0 1,0 1,0
Томатный сок Пептон (Oxoid) Неопептон 1,0 20,0 1,0 10,0 1,0 20,0 40,0 1,5 20,0
Триптон 1,0 2,0
Триптоза Фитон 0,3 0,5 0,5 ;
Растворимый крахмал Лактоза 0,05 0,2
Глюкоза 2,0 2,0 1,0 1,0 0,25 0,5 2,0 0,3
Лимоннокислый натрий 0,5
Лимоннокислый аммоний 0,2 0,2
Уксуснокислый натрий 0,5 0,1
Цистеин 0,02
Твин 80 0,1 0,1 0,1 0,05 0,05 0,05 0,1 0,003
К2НРО4 КН2РО4 MgSO4-7H2O MnSO4-4H2O Солевой раствор *** 0,2 0,02 0,005 0,3 0,3 0,5 0,5
0,15
0,5
Соль С**** 2,0
NaCl 0,5 0,5 0,5
Бромкрезоловый пурпурный Агар 0,1 0,0016
pH 6,2—6,6 6,8 6,7-7,0 6,0 6,0 7,0 6,8 6,5
* Эти среды готовят на водопроводной воде.
** Бригс (Briggs, 1953b) предложила среду того же состава, но с'10 об.% томат-
ного сока. Его готовят перетиранием 4,8 кг томатов в 1 л дистиллированной воды;
сок фильтруют (pH 7,0) и автоклавируют при 120° 15 мин.
Состав сопи см. в табл. 6 (соль Б).
**•* в юр мл растВ0ра содержится MgSO4-7H2O — 4 г; FeSO4-7H2O — мг; NaCl — 200 мг;
МпС12-4Н2О — 720 мг.
64
сок — 100.0 мл; капустный отвар — 100,0 мл; дрожжевой автоли-
зат — 50,0 мл; глюкоза — 20,0 г; твин 80—1,0 мл; К2НРО4 — 2,0 г;
натрий уксуснокислый — 5,0 г; аммоний лимоннокислый 2,0 г;
MgSO4-7H2O— 0,2 г; MnSO4-4H2O— 0,05 г; дистиллированная во-
да до 1 л. При приготовлении агаризованной среды из нее исклю-
чается CH3COONa-3H2O.
Широко используется наша среда (Квасников, 1960), которая
пригодна для культивирования менее требовательных лактоба-
цилл. Применяется среда В. В. Леонович и Т. М. Поперековой
(1963), Девиса с соавторами (Davis et air, 1955) (см. табл. 6).
В наших и зарубежных лабораториях часто используют и другие
среды, указанные в табл. 7.
Трудности, связанные с составлением питательных сред, де-
лают проблему использования синтетических сред для выращива-
ния молочнокислых бактерий очень сложной. Имеется ряд пропи-
сей синтетических сред для культивирования отдельных видов мо-
лочнокислых бактерий. В нашей лаборатории при изучении
потребностей в витаминах и культивировании ряда видов молочно-
кислых бактерий пользуются синтетической средой, описанной
Фордом с сотрудниками (Ford et al., 1958).
Длительное хранение лактобацилл производят различными спо-
собами. Наиболее удобным и надежным является лиофилизация
(Барбашова, Шушунова, 1969; Шершнева, Лагода, 1970; Sharpe,
Wheater, 1955). Если нет возможности лиофилизировать культу-
ры, их следует сохранять в следующих средах (Sharpe, Fryer,
1965): 1) молоко с мелом; 2) молоко с дрожжевым автолизатом,
глюкозой, лакмусом, 0,25% печеночного экстракта и СаСО3. На
этих средах при 4° культуры сохраняются в течение трех месяцев.
Нужно помнить, однако, что при использовании мела необходима
предварительная горячая воздушная стерилизация его, что вызва-
но большой устойчивостью бактериальных спор в этой среде.
Можно хранить культуры путем посева их уколом в столбик
какого-либо питательного агара (табл. 7), например, МРС или по-
лужидкой среды МРС-1; в этом случае содержание глюкозы сни-
жают до 0,25%. На указанных средах культуры пересевают через
1—2 мес. Перед помещением в холодильник культуры следует
предварительно 2—3 раза посеять в бульонную среду.
Имеются данные о том, что молочнокислые бактерии при хра-
нении в средах с дрожжами (родов Saccharomyces, Torulopsis, Can-
dida и др.) длительное время (в течение 1—1,5 лет и более) оста-
ются жизнеспособными и сохраняют свою активность (Квасников,
1960; Корнильцева, 1969; Кулатунга, 1973).
Весьма эффективным является хранение молочнокис.дых бак-
терий путем замораживания ихТГри температуре жидкогоаЗота-
(—ТШГТГЛучнго ^ёВГЩргшнмораживаВД^бактерий в качеству
защитных сред использовать 6%-ный солодовый экстракт_ячменя,
'Ш>тг^(Т%Гшый~солодовые экстрактьт сорго (Johannsen, 1972) г
3 Е. И. Квасников, О. А. Нестеренко 65
Род Streptococcus Rosenbach, 1884
Серологическая группа D
За последние 20 лет были опубликованы различные методы под-
счета и выделения фекальных стрептококков группы D. Серьезная
порча фекальными стрептококками некоторых мясных продуктов
(Barnes, 1956а), а также указания авторов на обнаружение этих
бактерий при ряде пищевых отравлений (Калина, 1964; Barnes,
1959) остро поставили перед исследователями задачу изыскания
элективных сред для выделения фекальных стрептококков.
В настоящее время мы не располагаем какой-либо единой сре-
дой, которая была бы удовлетворительной для выделения стрепто-
кокков группы D, встречающихся в различных субстратах. Боль-
П »1
шинство методов изолирования основано на внесении в электив-
ную среду ^зида натрия }или/^щётата таллй^К. Каждое из этц>
веществ может употребляться в сочетании с красками — кристалл-
виолетом или этилвиолетом. Такие среды угнетают рост грамотри-
цательных бактерий, а также стафилококков, микрококков, спо-
ровых микроорганизмов, в то время как стрептококки оказываются
более устойчивыми. Ряд прописей сред с азидом натрия для выде-
ления фекальных стрептококков из воды приводит Барнес (Bar-
nes, 1959).
Ацетат таллия уже давно был предложен в качестве компонен-
та сред для выделения стрептококков. Среды с ацетатом таллия
(0,05%) применялись для изолирования организмов группы D из
сыров, a Str. thermophilus — из сыров и пастеризованного молока
(Sharpe, 1955с).
Шарп (Sharpe, 1952) для выделения стрептококков группы D
из фекалиев младенцев успешно использовала агаризованную
среду с 0,05% ацетата таллия. Он вносился в среду следующего
состава (в %): пептон — 1,0; мясной экстракт (Lab Lemco) —1,0;
дрожжевой автолизат — 0,3; агда— 1,2; глюкоза — 1.0. Среда с
дрожжевым автолизатом, глюкозой и 0,05% апетата_ таллия была
применена для выделения фекальных стрептококков из фекалиев
свиней (Barnes, Ingram, 4955) при обследовании беконных фаб-
рик (Barnes et al., 1956).
В 1956 г. Барнес (Barnes 1956 а, Ь) опубликовала результаты
использования двух методов выделения и подсчета стрептококков
группы D, находящихся в мясных продуктах, материалах и обору-
довании беконных заводов. Методы состояли в следующем. Первый
метод. 0,025 мл определенного разведения испытуемого материала
(готовили на растворе Рингера, разведенном в четыре раза) до-
бавляли к трем пробиркам с 10 мл бульона (назван ТИ) состава
(в %): пептон—1,0; мясной экстракт (Lab Lemco) —1,0; глюко-
за—1,0; ацетат таллия—0,1; дистиллированная вода; pH 6,0. Для
приготовления бульона пептон, глюкозу, мясной экстракт и NaCl
(если добавляется 0,5%) растворяют в дистиллированной воде,
66
доводят pH до 6,0 и прибавляют нужное количество ацетата тал-
лия, после чего среду разливают по 10 мл в пробирки и автокла-
вируют при 121° 20 мин. Засеянную среду инкубируют в течение
18 час. при 37°. Количественный подсчет стрептококков произво-
дится по одной из специальных таблиц.
Для подтверждения присутствия отдельных групп стрептокок-
ков в бульоне ТИ из мутных пробирок делают высев на агаризо-
ванную среду с тетразолием и глюкозой (ТДж) (в %): пептон —
1,0; мясной экстракт —1,0; NaGl — 0,5; глюкоза —1,0; 2,3,5-три-
фенилтетразолий хлорид—0,01; агар—1,4. Раствор, содержащий
пептон, мясной экстракт, соль и агар доводят до pH 6,0 и автокла-
вируют при 121° 20 мин. К среде добавляются необходимые коли-
чества отдельно простерилизованных глюкозы (из 20%-ного рас-
твора) и соли тетразолия (из 1%-ного раствора, простерилизован-
ного паром в течение 30 мин.).
Второй метод. 0,025 мл разведений испытуемого субстрата
сеют на чашки с агаризованной средой (ТИТДж), предварительно
подсушенной при 45° в течение 1,5 часов. Среда подобна ТДж, но
из нее опущен NaCl и добавлен ацетат таллия (0,1%). Готовится
она, как указано выше. Культуры инкубируют в течение ночи при
37°. На этой среде Str. faecium, Str. durans и Str. bovis образуют
белые или очень слабоокрашенные колонии, a Str. faecalis и его
варианты — колонии с красным центром, что объясняется способ-
ностью Str. faecalis восстанавливать соли тетразолия до формазана,
окрашенного в красный цвет.
Рекомендуемый бульон очень удобен для выявления в материа-
ле даже самых незначительных количеств стрептококков, хотя
Барнес (Barnes, 1956а) указывает, что использование для выделе-
ния фекальных стрептококков жидкой среды ТИ не дает возмож-
ности обнаружить все виды этой группы. В то же время на агари-
зованной среде ТИТДж удается обнаружить большее разнообразие
видов. Низкое начальное pH, относительно простой состав указан-
ных сред и селективное действие ацетата таллия являются благо-
приятными факторами для выделения фекальных стрептококков.
Среда ТИТДж успешно применялась Барнес (Barnes, 1959)
для исследования фекальных стрептококков в кишечнике человека,
цыплят, свиней, крупного рогатого скота. Автор обнаружила сме-
ну флоры (Str. faecalis и Str. faecium) у цыплят. Она установила,
что Str. faecalis преобладает в кишечнике человека, часто у домаш-
них птиц, но гораздо реже обнаруживается у свиней и крупного
рогатого скота, где шире распространен Str. faecium.
Барнес (Barnes, 1959) отмечает, что среды с ацетатом таллия
и азидом натрия отбирают только те формы, которые наиболее
устойчивы к неблагоприятным внешним условиям (низкое pH, вы-
сушивание, высокая температура и др.), например, Str. faecalis,
Str. faecium, Str. durans, но не Str. bovis. Изолирование Str. bovis
и Str. faecalis E. Л. Моисеева (1967) предлагает осуществлять на
модифицированной ею среде Барнес.
67 3*
Следует отметить, что на средах с 0,1% ацетата таллия выде-
ляются и стрептококки группы N (молочные). Для того чтобы от
них избавиться, можно инкубировать посевы при 45°, хотя это от-
рицательно сказывается на росте, например, Str. durans. В то же
время, если применить предварительную тепловую обработку ис-
следуемого материала при 60° в течение 30 мин., это может при-
вести к отмиранию таких бактерий, как Str. bovis, (Barnes, 1956а).
Предлагаемую Чесбро и Эвансом (Chesbro, Evans, 1959), буль-
онную среду можно использовать в качестве накопительной для
выделения энтерококков (главным образом, Str. faecium) из образ-
цов фекалиев с последующим высевом на среду АПТ (см. табл. 7).
По этой методике из образцов фекалиев удается более эффективно
выделять Str. faecium, чем на агаризованной среде с глюкозой и
азидом натрия, на которой энтерококки изолируются в меньшем
количестве и представлены главным образом Str. faecalis.
Ряд сред для выделения и количественного учета энтерококков
(с цитратом, пируватом, аргинином) предлагает Дейбл (Deibel,
1964). По его мнению, методы выделения Str. faecium должны учи-
тывать устойчивость этого вида к более высокому значению pH
среды и способность расти при 50 °.
По данным Сарасвата и других (Saraswat et al., 1963), наибо-
лее эффективной средой для подсчета и выделения энтерококков
из молочных продуктов является среда с азидом натрия и цитра-
том, хотя Дейбл (Deibel, 1964) считает, что на ней вряд ли удастся
изолировать Str. faecium, не усваивающий цитрат.
Моустардиер с соавторами (Moustardier et al., 1960) использо-
вали среду, содержашущмукостатин и каномицин: мясной экст-
ракт (Liebig) — 3,0 г;(бактЬпетгТО^ (Difco) — 5,0 г; триптоза (Difco)
— 6,0 г; NaCl — 5,0 г’;~агар (Difco) — 15 г; дистиллированная во-
да — 1л; pH 7,4. Среда разливается по 23 мл и стерилизуется при
120° 20 мин. Перед употреблением в расплавленную и охлажден-
ную до 50° среду добавляют 20 капель лошадиной крови (при
37 °), 1 мл раствора^ай концентрация 25 мкг/мл среды)
и 1 мл(мукостатипЦ^~(2 мкг/мл среды). Посев можно производить
на шшерхлЩ^ь яащциПетри_или использовать двойной слой ага-
ра. Авторы предлагают^употрёблять эту среду для выделения стреп-
тококков разных серологических групп и использовать ее в кли-
никах и на эпидемиологических станциях.
Из речной воды и сточных вод фекальные стрептококки мож-
но изолировать и подсчитывать, применяя две среды — азидный
и М-энтерококковый агар (Ramadan et al., 1972).
Гартлеб (Hartleb, 1969) рекомендует для выделения Str. faeca-
lis и его разновидностей, а также Str. faecium среду с канамици-
ном и азидом натрия (в %): полипептон или триптоза — 1,5; мяс-
ной экстракт — 0,45;(эскулин>- 0,5; NaCl — 4,0; агар — 1,0; pH 7,8.
Стерилизация в течение^Пгйин. при 120 °. Перед разливкой в чаш-
ки к 100 мл среды добавляют 4 мг канамицина, 0,5 мл. 1Гн7\ЕеС13,
ОД г азида натрия. —
Л/ 68; /
Грауде (Graude, 1957) выделял стрептококки из испражнений
младенцев на агаризованной среде с лошадиной кровью и 0,03% '
азида натрия.
На преимущество сред с азидом натрия для выделения и под-
счета стрептококков группы D указывают и другие авторы (Jenis-
tea, Pleceas, 1967а). Деварай и Циннеман (Devaraj, Zinnemann,
1969) предлагают простой и надежный метод выделения фекаль-
ных стрептококков из смешанной флоры, содержащей большое
количество грамотрицательных бактерий (моча, раны и т. д.). Он
заключается в использовании налидиксовой кислоты (неграм).
30 мкг кислоты наносят на бумажные диски, которые помещают на
поверхность чашки, засеянной испытуемым образцом. Фекальные
стрептококки, в отличие от иных микроорганизмов, устойчивы к
такой концентрации налидиксовой кислоты.
Для выделения энтерококков предложена и щелочная энтеро-
кокковая среда с полимиксином М (Калина, 1964). В нее входят:
1) мясо-пептонный бульон — 23,3 мл; дрожжевой автолизат —
2 мл; глюкоза — 1г; NaCl — 0,5; 2) NazCOs — 0,53 г; дистиллиро-
ванная вода — 25 мл; 3) КгНРОТ^ 0,25 г; дистиллированная во-“*^
да — 25 мл. Указанные составные части отдельно стерилизуют при
0,5 атм. 12 мин., затем смешивают, устанавливают pH 10,0 —
10,2 и доводят объем среды до 100 мл. К ней прибавляют 0,2 мл
1,6%-ного спиртового раствора бромтимолового синего и полимик-
син М (200 ед/мл среды). После инкубации засеянного в данный
бульон испытуемого материала при 37° в течение 24 — 48 час. из
него делают высев на агаризованную среду (см. ингредиент 1)
с кристаллическим фиолетовым 1: 800 000.
Прописи сред для изолирования стрептококков группы D из
различных субстратов предложены и другими авторами (Hahn et
al., 1970; Facklam, Moody, 1970; Lee Wie-Shing, 1972).
Серологическая группа N
Для выделения стрептококков группы N предложено много
сред (Sharpe, Fryer, 1965). Элликер с сотрудниками (Elliker et al.,
1956) опубликовали пропись среды («молочный агар»), по их мне-
нию, дающей возможность выделять кокковые и палочковидные
молочнокислые бактерии, находящиеся в различных субстратах
(молочные продукты, силос). Состав среды (в %): триптон — 2,0;
дрожжевой экстрат — 0,5; желатин (источник глицина) — 0,25;
глюкоза — 0,5; лактоза — 0,5; сахароза — 0,5; NaCl — 0,4; уксус-
нокислый натрий — 0,15; аскорбиновая кислота — 0,05; агар — 1,5;
pH 6,8 (устанавливается перед стерилизацией). Триптон можно
заменить, например, 0,5% Na-казеината; этот субстрат одновре-
менно дает возможность установить и гидролиз белка микроорга-
низмами. Предлагаемая среда без агара может употребляться для
постановки ряда тестов.
Исследованиями В. М. Богданова (1950) показана высокая пи-
69
тательная ценность сред из гидролизованного молока, пригодных
для учета и выделения молочнокислых бактерий. Для их приго-
товления к литру пастеризованного при 85° и охлажденного до 45°
обезжиренного молока (pH 7,4—7,6) добавляют 1 г порошка пан-
креатина и 5 мл хлороформа. Молоко помещают на 72 часа при 40°.
Гидролизат затем фильтруют, устанавливают pH 7,0 — 7,2 и стери-
лизуют в течение 10 мин. при 1 атм. При приготовлении агаризо-
ванной среды гидролизат разводят в два раза водопроводной
водой. Для выделения ароматобразующих стрептококков (Str. dia-
cetilactis) В. М. Богданов рекомендует использовать посев продукта
в гидролизованное молоко с 1 % лимоннокислого натрия (обо-
гатительная среда). После культивирования засеянной среды в тече-
ние 18 — 24 час. при 30 ° из нее производят высев на агаризован-
ную среду того же состава, но с 1% сахарозы (для распознавания
Leuconostoc mesentoroides). Колонии ароматобразующих бакте-
рий находят по пузырькам газа, выделяющимся за счет использо-
вания бактериями лимонной кислоты.
Ароматобразующие гомоферментативные стрептококки выде-
ляют также на среде Суотлинг (Swartling, 1951), имеющей сле-
дующий состав (в %): пептон — 0,5; мясной экстракт — 0,3; лак-
тоза — 0,2; К2НРО4 — 0,5; MgSO4-2H2O — 0,4; лимоннокислый
натрий — 0,2; дрожжевой автолизат — 1,0; агар — 1,0. Для иссле-
дований отбирают колонии, сквашивающие молоко, восстанавли-
вающие лакмус в молоке с лакмусом и дающие положительную
реакцию Вогес-Проскауэра в молоке.
Ройтер и Меллер-Мадсен (Reiter, Moller-Madsen, 1963) предла-
гают использовать для выделения Str. diacetilactis среду ВАК
1/2%, куда входят агар, сыворотка молока, 0,5% лактата кальция
и 0,5% цитрата кальция. В тех случаях, когда в заквасках имеются
гомо-и гетероферментативные ароматобразующие кокки и необхо-
димо подсчитать те и другие, применяют среду ВАККА 1/2% и
среду ТДжАС 1/2% (Skean, Overcast, 1965), которую легче при-
готовить. Последняя среда содержит ТДжА (агар с томатным со-
ком) (Difco), лактат и цитрат кальция. Лактат кальция угнетает
неароматобразующие стрептококки, а по зонам растворения цит-
рата кальция удается отбирать нужные колонии. Ройтер и Мел-
лер-Мадсен приводят ссылки на ряд исследований, где имеются
прописи сред для выделения и дифференциации Str. lactis и Str.
cremoris (с аргинином, цитратом, 2,3,5-трифенилтетразолий хло-
ридом) .
Тернер с соавторами (Turner et al., 1962, 1963) для отличия
Str. lactis от Str. cremoris предложили среду, в состав которой вхо-
дили соль 2,3,5-трифенилтетразолий хлорид (ТТХ) и аргинин.
Str. lactis в отличие от Str. cremoris образует на этой среде красные
колонии в силу своей способности продуцировать аммиак из арги-
нина и таким образом снимать действие кислоты, препятствующей
восстановлению ТТХ (восстановленный ТТХ имеет красный цвет).
Среду, содержащую 0,5% триптона, 0,5% дрожжевого экстракта,
70
0,3% L-аргинина солянокислого, 0,05% глюкозы, 0,2% К2НРО4 и
1,5%' агара доводят до pH 6,0 с помощью НС1 и автоклавируют при
121° в течение 15 мин. К 100 мл расплавленного и охлажденного до
50° агара добавляют 1 мл 0,5%ьного водного раствора ТТХ (можно
брать тетразолий синий или тетразолий красный), профильтрован-
ного через фильтр Зейтца. Чашки Петри со средой подсушивают в
термостате при 30° в течение 24 час. и засевают 0,1 мл испытуемой
культуры, выращенной на той же среде, но без ТТХ (культура раз-
водится до 10~3 в дистиллированной воде). Инкубируют посев при
30° в течение 24—48 час. При постановке опыта очень важно точно
установить pH, употреблять свежие краски и среду. Аналогичный
принцип разделения Str. lactis и Str. cremoris используется и дру-
гими авторами (Mikolajcik, 1964).
Редди с сотрудниками (Reddy et al., 1969) описали среду с ар-
гинином для разделения смешанных культур Str. lactis, Str. diace-
tilaetis и Str. cremoris. На этой среде Str. cremoris образует жел-
тые, а остальные два вида — белые колонии; отчетливая окраска
достигается введением в среду буферной системы (К2НРО4 и
СаСОз), препятствующей диффузии кислых или основных продук-
тов жизнедеятельности культур сквозь агар, которая приводит к
общему изменению окраски среды с индикатором. Предлагаемая
среда имеет следующий состав (в %): триптон — 0,5; дрожжевой
экстракт — 0,5; L-аргинин солянокислый — 0,4; К2НРО4— 0,1;
СаСОз — 0,3; ССМ — 0,6 (карбоксиметилцеллюлоза для суспендиро-
вания СаСОз); агар — 1,5.
Для приготовления литра среды в 500 мл дистиллированной во-
ды растворяют агар. В другой посуде в 500 мл воды на кипящей во-
дяной бане нагревают 6 г ССМ (до исчезновения мути). После это-
го оба раствора смешивают, к ним добавляют необходимое количе-
ство триптона, дрожжевого экстракта, аргинина, К2НРО4,СаСОз и,
накрыв алюминиевой фольгой, нагревают на водяной бане 10 мин.;
pH среды 6,8+0,1. Среду разливают по 100 мл и стерилизуют при
121° 15 мин. Перед разливкой в чашки Петри к 100 мл расплавлен-
ной среды добавляют 5 мл 11%ьного необезжиренного молока, при-
готовленного из порошка, и 0,1% индикатора бромкрезолпурпур-
ного. Среду (при 55°) разливают слоем в 4—5 мм в предварительно
охлажденные чашки Петри, после чего их подсушивают при 37° в
точение 18—24 час. и засевают 0,1 мл испытуемой суспензии.
Разделение видов Str. cremoris, Str. lactis и Str. diacetilactis мож-
но осуществлять и на среде с аргинином и цитратом, учитывая, что
два последних дезаминируют аргинин, a Str. diacetilactis усваивает
цитрат с образованием СО2 (Reddy et al., 1971). Бульон, применяе-
мый для дифференциации, содержит (в %): триптон — 0,5; дрож-
жевой экстракт — 0,5; К2НРО4 — 0,1; аргинин — 0,5; цитрат — 2,0;
бромкрезоловый пурпурный — 0,002. К 100 мл бульона добавляют
3,5 мл 11 %-ного молока; [
желтую окраску при росте
интенсивно-красную — Str.
иобретает
lactis и
Н среды 6,2+0,05. Сре
str. cremoris, фиолет
diacetilactis.
71
Для выделения и учета Str. thermophilus в молочных продук-
тах наиболее пригоден сывороточный агар с лактозой, 0,5% трип-
синового гидролизата белка и 0,5% дрожжевого автолизата. Из об-
щего числа колоний, выросших на этой среде через 24 часа в атмо-
сфере азота при 45°, вычитается число колоний, образовавшихся
на сывороточной среде с мальтозой, на которой Str. thermophilus
не растут (Ottogalli, Galli, 1967).
Количественный учет и выделение чистых культур термофиль-
ных и мезофильных стрептококков можно осуществлять и на мо-
лочном агаре с глюкозой и налидиксовой кислотой (Catteau et al.,
1971). Состав среды (в г): пептон, получаемый под действием трип-
сина — 10,0; дрожжевой экстракт — 5,0; хлоргидрат цистеина — 0,3;
глюкоза — 2,0; агар — 15,0; вода дистиллированная — 1л; налидик-
совая кислота — 0,04; pH 7,4—7,5. После стерилизации к среде,
охлажденной до 50°, добавляют 10%' стерильного обезжиренного
молока.
Учитывая то, что большинство штаммов стрептококков групп D
и N хорошо растет в питательных средах, состоящих из (в %):
пептона — 1,0; мясного экстракта — 1,0; глюкозы — 1,0; NaCl —
0,5, эти среды используются для длительного культивирования
стрептококков. Добавление 0,3% дрожжевого автолизата стимули-
рует рост некоторых штаммов. В состав указанных сред вводят
также твин 80 и MnSCh ( Sharpe, Fryer, 1965).
Молочные стрептококки рекомендуют выращивать также на
средах, приготовленных на гидролизате мицелия Penicillium chry-
sogenum (отход пенициллинового производства). Состав среды: ги-
дролизат — 100 мл; пептон — 0,3 г; NaCl — 0,5 г; DL-метионин —
8,0 мг; L-лизин — 4,0 мг; агар — 1,5 г; pH 6—6,5. Гидролиз мице-
лия (сухого или влажного) приводят в 6н. НС1 в автоклаве при 100°
в течение 3—4 час. (Кирсанов, 1969).
Стрептококки сохраняют различными способами. Для этиз
целей можно пользоваться методами, описанными для молочнокис-
лых палочковидных бактерий. В частности, лиофилизированные
культуры низинобразующих штаммов Str. lactis целесообразно хра-
нить в условиях низких температур (+5, —20°) (Силева, Литви-
нова, 1972). Хранят стрептококки также в молоке с лакмусом и ме.-
лом (Sharpe, Fryer, 1965).
Род Leuconostoc van Tieghem emend.
Hucker and Pederson, 1930
Для выделения лейконостоков применяют различные среды. Аро-
матобразующие гетероферментативные бактерии вида L. citrovorus
(L. cremoris по Garvie, 1960; Reiter, Moller-Madsen, 1963) из за-
квасок выделяют на нескольких средах. Так, для подсчета предста-
вителей этого вида в заквасках, состоящих только из L. citrovorus,
используют агаризованную среду ВАККА 1% (Reiter, Moller-Mad-
sen, 1963). В состав ее входит молочная сыворотка, лактат кальция
72
(1%), цитрат кальция (1%), смесь аминокислот (Casamino acid)
(1,4%); по зонам растворения цитрата кальция можно обнаружить
колонии гетероферментативных стрептококков. Если же закваска
содержит наряду с L. citrovorus также Str. diacetilactis, то последние
подсчитывают отдельно на среде ВАК 1/2%, где лейконостоки не
растут без дополнительного внесения смеси аминокислот и Мп
(0,1 мг/л); лейконостоки затем подсчитывают на среде ВАККА
1/2% с 0,5% цитрата кальция по светлым зонам растворения этого
соединения.
В том случае, когда лейконостоки в заквасках содержатся в не-
значительном количестве по сравнению со Str. diacetilactis, реко-
мендуется добавлять пенициллин (0,3 межд. ед. к 1 мл среды) для
угнетения Str. diacetilactis и иных стрептококков (Reiter, Moller-
Madsen, 1963).
Вместо среды ВАККА 1/2% для выделения и подсчета лейко-
ностоков можно использовать агар с томатным соком, цитратом и
лактатом; употребляют среды с триптоном, томатным соком, ази-
дом натрия или тетрациклином, угнетающими стрептококки. Так,
для выделения лейконостоков из смешанных заквасок или продук-
тов, где имеются и стрептококки (часто в больших количествах),
Мак Донат и другие (McDonough et al., 1963) рекомендуют среду с
солянокислым тетрациклином. 100 мг этого порошка растворяют в
100 мл 0,1н. НС1 и хранят в холодильнике не более двух недель.
Томатный сок (200 мл) доводят до pH 6,8—6,9, добавляют туда по
5 г триптона, триптозы, дрожжевого экстракта, 15 г агара; общий
объем среды доводят дистиллированной водой до 800 мл. Среду
нагревают до растворения ингредиентов, затем автоклавируют при
121° в течение 15 мин. Перед употреблением к среде добавляют
антибиотик из расчета 0,15 мкг/мл среды.
Засеянную агаризованную или жидкую среду следует инку-
бировать при 30° в течение 48 час., так как после этого срока вы-
растают не только лейконостоки, но и Str. lactis, и Str. cremoris.
Методы выделения ароматобразующих гетероферментатив-
ных стрептококков разработаны В. М. Богдановым (1957). Из
почв, соков (где имеется значительное число посторонних микро-
организмов, многие из которых образуют слизь па среде с сахаро-
зой) рекомендуется выделять лейконостоки на среде, в состав ко-
торой входит азид натрия (Mayeux, Golmer 1961): триптон.—
10,0 г; дрожжевой экстракт — 5,0; сахароза — 100,0 г; агар — 20,0 г;
дистиллированная вода — до 1 л. Среду разливают по 100 мл и сте-
рилизуют при 121° в течение 15 мин. Перед употреблением к ней
добавляют 0,5 мл 1%-ного стерильного раствора азида натрия,
чтобы окончательная концентрация его была 0,005%. Выросшие
колонии учитывают через двое суток. В том случае, когда для бо-
лее полного подавления посторонней микрофлоры используют
0,03% азида натрия, рост бактерий учитывают через пять суток
культивирования посевов. Для получения отчетливой структуры
колоний культуры следует инкубировать при 22°.
73
Приведенная выше среда для лейконостоков впоследствии бы-
ла модифицирована путем добавления 0,1% лимоннокислого нат-
рия, 0,5% глюкозы и 0,25% желатина для обеспечения более ин-
тенсивного роста видов рода Leuconostoc, выделяемых из смешан-
ных заквасок (Mayeux et al., 1962). При этом к расплавленному
и охлажденному агару добавляют стерильный водный раствор
азида натрия (концентрация 75 р.р.ш.), чашки со средой засевают
испытуемым материалом и инкубируют при 21° в течение четырех
суток. На этой среде рост гомоферментативных молочнокислых
стрептококков угнетается.
По данным Виттенбари (Whittenbury, 1966), для выделения
лейконостоков из эпифитной микрофлоры, трав и силоса можно
использовать модифицированную среду Кедди (Keddie, 1951)
(в г): мясной экстракт (Lab Lemco) — 0,5; пептон (Evans) — 0,5;
дрожжевой экстракт (Difco) —0,5; твин 80—0,05 мл; агар (Da-
vis)—1,5; водопроводная вода — до 85 мл; pH 5,4. Среду автокла-
вируют при 121° 15 мин. и перед разливкой в чашки Петри к ней
добавляют 10 мл растворов сахаров, профильтрованных через
Таблица 8
Среды для культивирования бактерий рода Leuconostoc по данным
отдельных авторов
г fi 0 м
Состав среды, г/л to и» Сб
rt 02 cojoC4
Триптический гидролизат казеина 10
Фитон Пептон (Evans) 5 5 20 10 10
Мясной экстракт 5 10 10
Дрожжевой экстракт 5 5 6 5 5
Твин 80 0,5 мл 0,5 мл 1 мл
Томатный сок 200 мл 250 мл
NaCl 5 5
К2НРО4 Натрий уксуснокислый 1,5 2
Аммоний лимоннокислый 5 5
MnSOt-lHaO 0,1 0,05 0,05
MgSO4-7H2O 0,2 0,2
Глюкоза 5 5 10 10 10
Вромкрезоловый пурпурный 0,016
₽н 6,5 7 6,5 6,7 4,8
* Агаризованная среда готовится путем добавления 1,5% агара и исключения
глюкозы.
Все среды автоклавируют при 121° 15 мин.
74
фильтр Зейтца (15%-ные растворы глюкозы, фруктозы, арабино-
зы или 30%-ный раствор сахарозы), 10 мл 2 М уксусной кисло-
ты и Na-ацетатный буфер при pH 5,4.
Прописи ряда иных сред, использующихся для выделения и
подсчета лейконостоков, можно почерпнуть из работ, список кото-
рых приведен Шарп и Фрайером (Sharpe, Fryer, 1965).
Для культивирования лейконостоков используют ряд сред, в
состав которых входит томатный сок, твин 80 и другие ингреди-
енты. По данным Гарви (Garvie, 1967а), рост лейконостоков за-
метно улучшается при добавлении в среды солянокислого цистеи-
на, а также при выращивании штаммов в анаэробных условиях в
присутствии смеси Н2 и СО2.
Широко применяется описанная выше среда МРС, а также
среды, прописи которых мы приводим в табл. 8. Штаммы, выделен-
ные из вин, могут иметь более низкий оптимальный pH роста,
поэтому для их культивирования необходимо использовать среды
с низким начальным pH. Гарви (Garvie, 1967а) для этих целей ре-
комендует среду АТБ, приведенную в табл. 8 (среда V).
Перед засевом L. oenos и L. cremoris к 10 мл сред IV и V до-
бавляют 0,5 мл 1%-ного стерильного раствора солянокислого ци-
стеина. Культуры инкубируют при 22° в течение 2—4 суток.
Для хранения лейконостоков, выделенных из вин, использу-
ют среду АТБ (табл. 8), но с 1,5% агара. Культуры, посеянные
уколом, инкубируют в анаэробных условиях в атмосфере Н2 и СО2
(9:1), а затем хранят в течение нескольких месяцев в холодиль-
нике.
Лейконостоки можно хранить и в молоке с дрожжевым авто-
лизатом, глюкозой, лакмусом, печеночным экстрактом (0,25%) и
СаСОз (Sharpe, Fryer, 1965).
Род Pediococcus Balcke, 1884,
emend. Mees, 1934
Выделение педиококков можно осуществлять на обычных вы-
сокопитательных естественных средах (pH 5,0—7,0) при 25—30°
или выше. Для подавления посторонней микрофлоры добавляют
тиогликолевокислый натрий, уксуснокислый натрий (2%), анти-
биотики (актидион, формицидин, эуротщдин —5, 10, 30 р. р. ш.
соответственно), угнетающие рост других бактерий, дрожжей,
плесневых грибов. При этом устанавливают pH сред, температуру
инкубации, способ культивирования бактерий (аэробное или анаэ-
робное) ; добавляют различные вещества (NaHCO3, Na2CO3 NaCl,
СаСО3), благоприятные для развития исследуемых бактерий. Это
позволяет, как указывают Накагава и Китахара (Nakagawa, Ki-
tahara, 1959), выделять предпочтительно тот или иной вид. Авто-
рам всегда удавалось получать чистые культуры кокков путем
инокуляции материала в среду, состоящую из доброженного пива,
уксуснокислого натрия и D-маннозы (pH 5, 6).
VS
Для изолирования педиококков из мясных продуктов исполь-
зуют бульон АПТ (см. табл. 7) (Deibel et al., 1961), а также среду
(ЛБС), предложенную Рогозой с соавторами (табл. 7) (Rogosa
et al., 1953). Из сыров, кислой капусты, консервированных тома-
тов, пива, силоса, фекалиев и других субстратов педиококки выде-
ляют на агаризованной среде с томатным соком — ТДж (Oxoid),
СЛ-агаре (Difco), предложенном Рогозой и другими (Rogosa et al.,
1951) (см. табл. 6). Выделяют педиококки и на агаре с пивом (Co-
ster, White, 1964).
Педиококки культивируют на разных средах — МРС, АПТ,
среде Бригс в модификации Шарп. Состав этой среды (в %): пеп-
тон (Oxoid)—1,5; глюкоза—2; дрожжевой экстракт—0,5; уксус-
нокислый натрий — 0,5; КН2РО4 — 0,5; аммоний лимоннокислый —
0,2; томатный сок—10 об. %; твин 80—0,1 об. %; соль Б (см.
табл. 6) — 0,5 об. %; pH 6,5 (Garvie et al., 1961). Среду автоклави-
руют в течение 15 мин. при 115°.
Широко используются жидкие или агаризованные среды с то-
матным соком — ТДж (Oxoid) без твина 80 (Gunther, White,
1961а) или с 0,1% его (Coster, White, 1964).
Следует отметить, что существуют штаммы педиококков, остро
нуждающиеся в сильно восстановленных условиях. В таких слу-
чаях следует добавлять к средам 5 об. % 1 % -ного раствора соляно-
кислого цистеина или аскорбиновой кислоты (Garvie et al., 1961).
Для галофильных штаммов (Р. halophilus) в среды вносят 5—7%
NaCl. Штаммы, выделенные из пива, культивируют на бульоне, со-
держащем неохмеленное пиво (Nakagawa, Kitahara, 1959), или
модифицированной «пивной» среде, к которой добавляют экстракт
печени (Coster, White, 1964).
Агаризованную или жидкую среду АПТ используют для куль-
тивирования Р. homari и Р. cerevisiae, выделенных из мясных про-
дуктов.
Сохранять педиококки можно в молоке с дрожжевым автоли-
затом, глюкозой лакмусом, 0,25% печеночного экстракта и СаСОз
(Sharpe, Fryer, 1965).
Спиртсодержащие среды
в исследованиях молочнокислых бактерии
Нами (Квасников, 1960) был разработан метод выделения и
количественного учета молочнокислых бактерий на средах со спир-
том. Выше мы показали, что одним из специфических свойств груп-
пы молочнокислых бактерий является их высокая спиртоустойчи-
вость, поэтому элективными для данной группы микроорганизмов
являются среды, полноценно обеспечивающие их питательными
компонентами и витаминами и содержащие спирт в концентрации,
которая не препятствует развитию этих бактерий, но подавляет по-
стороннюю микрофлору.
При выделении молочнокислых бактерий в чистые культуры с
высевом их на жидкие элективные среды, последние изготовляются
76
по той или иной благоприятной для роста этих микроорганизмов
прописи (например, капустный отвар из 100 г измельченной капу-
сты на 1 л воды, 1% пептона, 2% глюкозы, 0,1% дрожжевого авто-
лизата и др.)- Концентрация спирта в средах устанавливается в
зависимости от объекта исследований.
При выделении молочнокислых палочек — активных кислото-
образователей — мы применяем относительно высокие концентра-
ции спирта (14—16 об. %).
Для изолирования культур из объектов, в которых содержатся
кокковые формы молочнокислых бактерий , а также малоактивные
палочки, следует пользоваться средами с более низкими концент-
рациями спирта (10—12 и иногда 8 об.%). Такие концентрации
применяются при изолировании молочнокислых бактерий из поч-
вы, эпифитной и ризосферной микрофлоры растений. Они удобны
и при исследовании молочных продуктов. Низкие концентрации
спирта здесь являются достаточными, так как устойчивость к не-
му посторонней микрофлоры, обитающей в данных субстратах,
обычно невелика.
Из накопительной культуры на жидких средах со спиртом мо-
лочнокислые бактерии очень легко изолируются по общепринятой
методике в чистые. Для этого производят посев на агаризованные
среды с мелом. Среды удобно подготовить в колбочках, внести в
них 4% стерильного мела и снова их простерилизовать. Непосред-
ственно перед посевом агаризованные среды расплавляются, взбал-
тываются равномерным движением и разливаются в чашки Петри.
Молочнокислые бактерии при росте на данной среде образуют ти-
пичные «зоны просветления», обусловленные превращением нера-
створимого углекислого кальция в растворимый лактат кальция.
Молочнокислые бактерии можно выделять в чистые культуры
при непосредственном высеве из субстрата на агаризованные сре-
ды со спиртом. Для этого стерильную агаризованную среду с ме-
лом следует расплавить в колбочках, охладить до 45° и затем вне-
сти в нее 10—12 об. % спирта. После тщательного перемешивания
среда разливается в чашки Петри, куда и производится посев бак-
терий по обычной методике.
Этиловый спирт подавляет постороннюю микрофлору и поэтому
в первые несколько суток на поверхности вырастают преимущест-
венно молочнокислые бактерии. Если чашки Петри оставить на воз-
духе, то по мере испарения спирта будет вырастать все большее и
большее количество посторонней микрофлоры. Это спорообразую-
щие микроорганизмы (споры которых обладают высокой устойчи-
востью к спирту) и виды, на которые указанные дозы спирта влия-
ют лишь бактериостатически. Чтобы предотвратить рост посторон-
ней микрофлоры, чашки Петри рекомендуется поместить в
эксикатор.
Нами рекомендуется еще один простой прием для выделения в
чистые культуры молочнокислых бактерий с предварительным вы-
севом их в водные растворы этилового спирта. Микрофлора субст-
77
ратов (лучше предварительно освеженная пересевом) переносит-
ся в количестве 1—2 капель в 90%-ный этиловый спирт обычно на
0,5—1 мин. Затем из спирта производится высев на твердые пи-
тательные среды по обычной методике. При коротком воздействии
водных растворов этилового спирта подавляющее большинство
посторонних микроорганизмов отмирает и в чашках Петри выра-
стают преимущественно молочнокислые бактерии, которые затем
легко изолируются в чистые культуры.
Спиртсодержащие среды удобны также для количественного
определения содержания молочнокислых бактерий.
Степень устойчивости молочнокислых бактерий к спирту, а
также скорость размножения их в средах, содержащих его, как
показано в приведенных выше исследованиях, достигает макси-
мального значения у молодых культур и постепенно уменьшается
с их старением. Поэтому при проведении работ по количествен-
ному учету молочнокислых бактерий непосредственный высев в
среды со спиртом мы рекомендуем производить лишь тогда, когда
работа проводится с заведомо активными молодыми культурами.
Практически это бывает редко.
При исследовании природных и производственных субстратов
количественный высев их следует делать сначала в среды, не со-
держащие спирта, а затем вносить его через определенный проме-
жуток времени (обычно 18—24 часа). За это время молочнокис-
лые бактерии успеют «омолодиться» и приобрести описанную
выше степень спиртоустойчивости. Посторонняя же микрофлора,
как обычно, будет подавлена спиртом.
Нами была проведена сравнительная оценка различных мето-
дов количественного учета молочнокислых бактерий на чистых
культурах Lactobacillus plantarum различного возраста — от ше-
сти часов до шести месяцев. Количество спирта, вводимого в сре-
ду, варьировало от 12 до 15 об. %. В среде одновременно произво-
дился подсчет количества микробных тел в камере Тома-Цейса.
Результаты, полученные с помощью различных методов, зна-
чительно расходились между собой, что особенно сказывалось при
учете количества клеток в культурах различного возраста. При
определении содержания бактериальных клеток в молодой куль-
туре в возрасте до суток совпадающие результаты получаются при
учете количества микроорганизмов по способу разведений с по-
следующим титрованием и по нашему методу при высеве в среду
с 12—14 об. % спирта; несколько пониженные цифры были полу-
чены в опытах, в которых 15 об. % спирта вносились в среду. При
анализе более старых культур в возрасте до 20 суток совпадаю-
щие результаты давало определение содержания микроорганиз-
мов с применением титрования и высева в среды с 12—14% спир-
та, а в возрасте до пяти месяцев — титрование и высев в среду с
10—12% спирта. Указанные методы дают показатели, наиболее
близкие к полученным при прямом подсчете количества микроб-
ных тел в камере Тома-Цейса.
78
Аналогичные результаты были получены в опытах со штам-
мами L. buchneri, L. brevis и др.
Таким образом, при определении содержания молочнокислых
бактерий в субстратах с заведомо активными формами их наибо-
лее точные результаты получаются при количественном высеве в
среды с 15 об. % спирта; в старых же культурах хорошие пока-
затели дает посев в среды с 10—12 об. % спирта. Однако при этом
можно наблюдать рост других (правда, очень немногих) микро-
организмов.
При определении содержания в субстратах видов молочнокис-
лых палочек — активных кислотообразователей, заведомо нахо-
дящихся в ослабленном состоянии, достаточно точные данные по-
лучаются при высевах в среды без спирта и последующем вне-
сении 15 об. % его через 1 —1,5 суток. При исследовании объектов,
содержащих менее активные виды молочнокислых бактерий, до-
за спирта должна быть снижена до 10—12, а иногда и 8 об. %.
В процессе многолетних работ по выявлению содержания мо-
лочнокислых бактерий в различных субстратах было установле-
но, что концентрации спирта следует варьировать в зависимости
от объекта исследований. При исследовании почвы, эпифитной и
ризосферной микрофлоры растений, содержимого кишечного трак-
та животных, молочных продуктов и т. д. наилучшие результаты
были получены в тех случаях, когда в засеянные среды через
сутки вносилось в среднем 10 об. % (от 8 до 12) спирта. Анализи-
руя субстраты бродильных заводов, где нас интересуют более ак-
тивные формы молочнокислых бактерий, спирт в засеянные среды
следует также вносить через сутки, но в большей концентрации —
в среднем 14 об. % (от 12 до 16). Высокие дозы спирта особенно
необходимы при исследовании объектов, содержащих дрожжи.
Иногда эти же концентрации следует применять при анализе си-
лосов.
Следует отметить, что количественное определение содержания
молочнокислых бактерий высевом на агаризованные среды из
сильно обсемененных посторонней микрофлорой субстратов зача-
стую не дает положительных результатов, на этих средах неко-
торые виды и штаммы молочнокислых бактерий, особенно находя-
щиеся в депрессированном состоянии, растут слабо. В то же время
развитие посторонней микрофлоры и особенно плесневых грибов
затрудняет подсчет колоний и иногда делает совершенно не-
возможным выделение чистых культур. При высеве же на молоко
выделяются только те виды, которые хорошо развиваются на
нем.
Предложенный метод количественного высева на спиртсодер-
жащие среды для учета содержания молочнокислых бактерий в
различных субстратах — один из наиболее удобных и простых:
он исключает необходимость определения титруемой кислотно-
сти в каждой из пробирок, что значительно экономит время;
применение этого метода позволяет одновременно получать в
79
крайних разведениях накопительную (практически чистую) куль-
туру молочнокислых бактерий;
упрощается работа по пересевам культур, так как продолжитель-
ность жизни молочнокислых бактерий на спиртсодержащих сре-
дах возрастает в несколько раз по сравнению с обычными средами.
На основе рекомендуемых методов количественного учета жиз-
недеятельных молочнокислых бактерий были разработаны и мето-
ды производственного микробиологического контроля предприя-
тий бродильной промышленности, в частности винодельческой
(Квасников, 1960; Квасников, Кондо, 1964). Таким образом, ха-
рактерное свойство группы молочнокислых бактерий — высокая
спиртоустойчивость — позволило нам разработать новые методы
выделения в чистые культуры этих микроорганизмов в субстра-
тах, обильно обсемененных посторонней микрофлорой, и количест-
венного учета их.
Длительность жизни молочнокислых бактерий значительно
увеличивается, если в среду вносить этиловый спирт в концентра-
циях, тормозящих размножение молочнокислых бактерий, но не
убивающих их (Квасников, 1960).
МЕТОДЫ ИЗУЧЕНИЯ
СВОЙСТВ МОЛОЧНОКИСЛЫХ БАКТЕРИЙ
ОТДЕЛЬНЫХ РОДОВ
Род Lactobacillus
В настоящее время при идентификации молочнокислых палочко-
видных бактерий изучаются многие признаки (морфолого-куль-
туральные и физиолого-биохимические, потребности в источниках
питания, антигенные свойства, химический состав клеточных сте-
нок и др.). Не все они используются в повседневной работе. Сле-
дует отметить, что как набор признаков, так и способы изучения их
варьируют в различных лабораториях, что значительно осложняет
работу по диагностированию этих микроорганизмов, существенным
условием совершенствования которого является стандартизация
методов исследования свойств бактерий.
Ниже мы подробно приводим методы изучения только тех
свойств лактобацилл, которые широко используются в последних
схемах определения видов рода, не затрагивая детально исследо-
вания некоторых других признаков (состав клеточных стенок,
ферментных систем и др.).
Общий подход к изучению свойств лактобацилл. При исследова-
нии признаков молочнокислых палочковидных бактерий следует
учитывать чувствительность их к кислороду, pH, поверхностному
натяжению среды, требовательность к источникам питания.
Все опыты необходимо проводить с 18 — 24-часовыми культу-
рами, предварительно пересеянными 2 — 3 раза на одну из благо-
80
приятных для их роста жидких сред. Для посева нужно пользо-
ваться обильным инокулятом. Лактобациллы обычно являются мик-
роаэрофилами или анаэробами. Практически небольшие количест-
ва кислорода в среде интенсивно потребляются ими, а у некоторых
видов более быстрый рост наблюдается в том случае, если в среде
первоначально присутствуют следы кислорода.
Ввиду того, что кислород может быть токсичным, особенно для
штаммов, образующих перекись водорода, хорошо их культивиро-
вать в атмосфере 95% азота и 5% СО2. Благоприятным для роста
является засев обильного инокулята в быстро охлажденную после
нагревания или стерилизации среду (Davis, 1960). Термофильные
культуры инкубируют при 37 °, мезофильные — при 30 ° (об осо-
бенностях постановки ряда тестов будет сказано отдельно).
Используемые для изучения признаков бактерий основные сре-
ды должны быть адэкватны в отношении необходимых источников
питания — аминокислот, витаминов, неорганических солей и т. д.
Часто в работах по диагностике видов молочнокислых бактерий
имеются разногласия, которые обусловливаются тем, что отдель-
ные исследователи применяют среды, неполноценные по своему
составу. Работа по идентификации молочнокислых бактерий в зна-
чительной степени упростилась, если бы в различных лаборатори-
ях пользовались стандартными веществами, состав которых не был
подвержен таким колебаниям, какие наблюдаются, например, при
приготовлении томатного, капустного сока и других ингредиентов.
Желательно пользоваться источниками углерода, профильтро-
ванными через обеспложивающие фильтры; избегать присутствия
таких ингибиторов, как медь и другие; иметь ввиду, что свет мо-
жет оказаться токсичным для некоторых видов (Davis, 1960).
Следует помнить, что кислотоустойчивость молочнокислых па-
лочек (имеется ввиду способность расти при низких значениях pH)
является их характерной чертой. Они обычно не могут расти при
pH 7,0 (за исключением представителей кишечной флоры), но спо-
собны расти при pH 3,8 и ниже, что дает им возможность преобла-
дать в кислых субстратах. В связи с указанным, pH сред для лак-
тобацилл должно быть, как правило, в пределах 5,5 — 6,5.
После выделения и очистки бактерий, обнаруженных на селек-
тивных для лактобацилл средах, у них изучают: форму и размер
клеток, подвижность, окраску по Граму, наличие каталазы, спо-
собность восстанавливать нитраты в нитриты, устанавливают отсут-
ствие содержащих цитохром дыхательных систем. Если выделен-
ные бактерии окажутся молочнокислыми, то по форме клеток их
делят на кокковые и палочковидные. В пределах последней группы
рост при 15 и 45 °, форма колоний и клеток, образование газа из
глюкозы, глюконата, сбраживание рибозы дадут основание разде-
лить палочковидные молочнокислые бактерии на три подрода —
Thermobacterium, Streptobacterium и Betabacterium.
Морфология. Морфологические признаки изучают после вы-
ращивания культур (18 — 24 часа) на какой-либо из сред, напри-
81
мер, МРС-бульоне, капустном бульоне (см. табл. 7, 8). Важно ис-
пользовать для этих целей стерильный обрат, ибо на этой среде
можно получить наиболее четкие представления о морфологиче-
ских отличиях между организмами (Hansen, 1968).
Молочнокислые бактерии окрашивают по Граму, метиленовой
синью, применяют и окраску индийскими чернилами. Перед окра-
шиванием клеток метиленовой синью углеводсодержащая среда с
выросшей культурой должна быть нейтрализована.
Молочнокислые бактерии, как правило, неподвижны. Подвиж-
ность определяют в «висячей» капле или полужидких средах.
Геммель и Ходгкис (Gemmell, Hodgkiss, 1964) разработали
макроскопический метод для изучения подвижности у лактоба-
цилл, состоящий в следующем. Капля исследуемой культуры по-
мещается в центре чашки Петри, содержащей 20—25 мл полу-
жидкой агаризованной среды с 0,5% глюкозы. В состав 1 л среды
входят: мясной экстракт (Lab Lemco)—5,0 г; пептон (Evans) —
5,0 г; дрожжевой автолизат—5 об.%; твин 80—0,5 мл; MnSO4-
•4Н2О—0,1 г; лимоннокислый калий — 1,0 г; агар (Davis) —
0,15%; pH среды 6,5. На 1 л среды добавляется 2,8 мл 1,6%-ного
спиртового раствора бромкрезолового пурпурного. Засеянные чаш-
ки не передвигают. Со временем становится очевидным, что у не-
подвижных штаммов рост ограничивается местом инокуляции,
а образованная кислота медленно диффундирует в разные сторо-
ны. Подвижные же штаммы растут и изменяют индикатор на по-
Рис. 9. Колонии молочнокислых бактерий на полужидкой агаризованной
среде при определении их подвижности (Gemmell, Hodgkiss, 1964)
а — бактерии неподвижны, б — подвижны
82
верхности всей чашки (рис. 9). Авторы всегда наблюдали зависи-
мость между наличием жгутиков и макроскопическим видом куль-
туры на агаризованной среде.
Наиболее достоверные результаты о наличии или отсутствии
жгутиков у исследуемых форм дает электронно-микроскопическое
исследование.
Форма колоний. Учитывая зависимость формы колоний от ря-
да компонентов среды, ее следует изучать на агаризованных сре-
дах, не содержащих твин или другие поверхностно-активные ве-
щества. Форму колоний исследуют в глубине агара после засева
его уколом или внесения в него небольшой петлей культуры, вы-
росшей на жидкой среде. Посевы инкубируют при 30° в течение
48 час.
Выявление дыхательных систем, содержащих цитохром. Оп-
ределение проводят по Дейблу и Эвансу (Deibel, Evans, 1960). 1 г
бензидина основного, или, лучше, бензидина солянокислого реко-
мендуется растворить в 20 мл ледяной уксусной кислоты, доба-
вить 30 мп дистиллированной воды и медленно нагревать; после
охлаждения в него внести 50 мл 95°-ного этилового спирта и хра-
нить в холодильнике в течение месяца. Выросшие на чашке коло-
нии бактерий 24 — 48-часового возраста залить раствором соляно-
кислого бензидина, а затем, когда раствор пропитает колонии, при-
бавить в чашку приблизительно такой же объем 5 %-ной Н2О2.
В испытуемой бактериальной культуре, содержащей железо-
порфириновые соединения, немедленно появляется голубовато-зе-
леная или ярко-голубая окраска. Молочнокислые бактерии такой
окраски не образуют.
Образование каталазы. Молочнокислые бактерии, как мы ука-
зывали выше, способны разлагать перекись за счет двух фермен-
тов — псевдокаталазы и каталазы. Каталаза проявляет свою ак-
тивность на средах с гретой кровью или гематином, тогда как
псевдокаталаза — на средах с низкой концентрацией глюкозы (до
0,05 %). Эти ферменты не образуются при выращивании микроор-
ганизмов на агаре с 1 % глюкозы без добавления гематина или
гретой крови. Поэтому изучение продуцирования псевдокаталазы
и каталазы осуществляется на ряде сред (Whittenbury, 1964) :
1. Основная среда.
Мясной экстракт (Lab 0,5 г MnSO4-4H2O 0,01 г
Lemco) Глюкоза 1 %
Пептон (Evans) 0,5 г Агар (Davis) 1,5 г
Дрожжевой экстракт 0,5 г Водопроводная вода до 100 мл;
(Difco) pH среды
Твин 80 0,05 мл 6,8—7,0
Стерилизацию проводят при 121° в течение 15 мин. К 95 мл
расплавленной основной среды добавляют 5 мл смеси (1:1) дефиб-
&
ринированной бычьей крови и воды, после чего ее прогревают при
100° в течение 15 мин. для разрушения каталазы крови. Эта среда
получила название ГБ.
2. Гематиновый агар. Подобен приведенной прописи основной
среды, но вместо крови добавляется гематин в количестве 50 мкг/мл
из основного раствора. Его готовят внесением 50 мг гематина в
10 мл воды, после чего добавляют столько 0,1 н. NaOH, сколько
требуется для растворения гематина. После этого раствор прогре-
вают при 100й в течение 15 мин.
3. Основная среда с 0,05% глюкозы.
4. Основная среда с 1 % глюкозы.
Первые две среды разливают в чашки Петри, две другие упот-
ребляют в виде агаровых косяков. Посев производят пипеткой. На
выросшие колонии наносят капли 3%-ной перекиси водорода,
и активность каталазы определяют по выделению пузырьков газа.
Джонстон и Делвич (Johnston, Delwiche, 1965) рекомендуют
определять каталазу на среде следующего состава (в %): пептон
(Difco) — 0,5; дрожжевой экстракт (Difco) — 0,5; дрожжевой авто-
лизат (Difco) —1,0; MnSO4-4H2O— 0,05; твин 80—0,05; лимонно-
кислый натрий — 0,5; глюкоза — 0,5; pH 6,8. К стерильной распла-
вленной среде добавляют 5% бычьей крови, предварительно
смешанной (1:1) со стерильной дистиллированной водой и прокипя-
ченной в течение 15 мин. Кровь можно заменить гемином из расчета
5 мкг на 1 мл среды. Гемин добавляют из основного раствора,
приготовленного на 0,06Т^У1^а2НР04.
Широко используется для выявления псевдокаталазы довольно
простая по составу среда Фелтона и других (Felton et al., 1953)
(в %) : триптон — 1,0; глюкоза — 0,05; КН2РО4 — 0,2; NaCl — 0,5;
дрожжевой экстракт — 0,5; агар — 1,5; дистиллированная вода;
pH 6,8—7,0. На этой среде изучается способность бактерий разла-
гать перекись в присутствии незначительных концентраций глю-
козы.
Восстановление нитратов в нитриты. Исследованиями Рогозы
(Rogosa, 1961) было установлено, что у молочнокислых бактерий
можно наблюдать способность восстанавливать нитраты в нит-
риты в средах с низким содержанием углевода и довольно высо-
ким pH. Автор рекомендует модифицированную среду ББЛ соста-
ва (в %) : пептон—2,0; Na2HPO4 —0,2; глюкоза—0,1; KNO3—0,1;
дрожжевой экстракт (Difco) —0,3; pH 7,2. Среда засевается одной
каплей культуры, выросшей на бульоне МРС, и инкубируется
при 37° или 30° (в зависимости от вида бактерий) в течение 6—
7 суток. После инкубации капля культуральной жидкости поме-
щается на стекло и к ней добавляется по капле реактивов 1 и 2.
Розовый или красный цвет свидетельствует о наличии редуктазы.
В качестве контроля используется незасеянная среда.
Реактивы:
1) содержит 2 г сульфаниловой кислоты в 250 мл 5 н. уксус-
ной кислоты;
84
2) содержит 1,5 мл диметил-а-нафтиламина (или а-нафтила-
мина) в 250 мл 5 и. уксусной кислоты.
Можно употреблять и другие среды (Thornley, Sharpe, 1959),
но при этом соблюдать требования в отношении pH и низкой кон-
центрации глюкозы.
Молочнокислые палочки положительно красятся по Граму, не
имеют содержащих цитохром дыхательных систем, и, как прави-
ло, неподвижны, не образуют каталазу или псевдокаталазу, не
восстанавливают нитраты в нитриты, не разжижают желатин и
не образуют спор. После предварительного изучения этих свойств
у выделенных на селективных средах бактерий приступают к
изучению ряда других признаков, которые дадут возможность
отнести молочнокислые бактерии к определенному виду одного
из трех подродов рода Lactobacillus.
Рост при различных температурах. Лактобациллы относят к
трем подродам на основании их способности расти при различных
температурах. Эта способность часто является одним из наиболее
надежных признаков для предварительной классификации выде-
ленных штаммов.
Во избежание неверных результатов опыты следует прово-
дить в тщательно закрытых резиновыми пробками или колпачка-
ми пробирках в водяной бане, чтобы предотвратить испарение
среды и ее поверхностное охлаждение. Используют жидкие среды
по прописям Бригс (Briggs, 1953а, Ъ), МРС-бульон, среду № 1 по
Кедди, капустный бульон (см. табл. 7). Их разливают по 10 мл
в пробирки, засевают, используя обильный инокулят, и инкубиру-
ют при 15° в течение 2—3 недель, а при 45—48°—4—7 дней.
Для установления температурного оптимума роста штаммы куль-
тивируют в течение 15 час. (Abo-Elnaga, Kandler, 1965b). Как
справедливо указывает Гансен (Hansen, 1968), устанавливая
наличие роста бактерий при различных температурах, следует
уточнить такие понятия, как «развитие» или «рост». Продуциро-
вание кислоты, образование мути — это не синонимичные значе-
ния. Помутнение среды после инкубации культуры в подходящей
среде в течение, скажем, двух недель, может быть обозначено
как рост. В то же время значительное образование кислоты и сни-
жение pH среды, например, до 5,3 и ниже в адэкватной среде с
глюкозой может являться практическим тестом развития, хотя
отсутствие кислотонакопления еще не показатель отсутствия ро-
ста. Как отмечает Гансен, Орла-Иенсен использовал образование
кислоты, учитываемое титрованием, как показатель развития
культуры.
Расщепление эскулина. В ряде лабораторий действие молочно-
кислых бактерий на эскулин устанавливается с помощью несколь-
ких качественных тестов, которые к тому же варьируют по своей
чувствительности на различных по составу средах, например,
в присутствии неодинаковых количеств эскулина. Это, безусловно,
сказывается на результатах опытов (Rogosa et al., 1951; Naylor,
85
Sharpe, 1958a; Keddie, 1959; Langston, Bouma, 1960a; Bisset, Da-
vis, 1960).
Расщепление бактериями эскулина устанавливают по утере
средой, на которой выращивают штамм, флуоресценции и по по-
чернению ее; последнее имеет место в результате образования
комплексного соединения железа, входящего в состав среды, с эс-
кулитином — одним из продуктов гидролиза эскулина. Почерне-
ния не наблюдается в случае низкого значения pH среды, в связи
с чем рекомендуется доводить pH до 6—7 (Hansen, 1968). Ис-
пытуемые культуры можно сеять на бульон МРС без глюкозы,
с 0,2% эскулина и 0,5% аммонийного лимоннокислого железа.
Для установления способности расщеплять эскулин использу-
ют несколько методов. Геммель и Ходгкис (Gemmell, Hodgkiss,
1964) выращивали культуру на основной среде (пропись ее при-
ведена нами при описании установления подвижности молочно-
кислых бактерий) без цитрата, с 1% эскулина, 0,25% глюкозы,
0,05% лимоннокислого железа и 0,15% агара. Среда перед засе-
вом расплавляется и охлаждается до 45°. Гидролиз эскулина оп-
ределяют по появлению в среде кристаллов (рис. 10) и потере
ею флуоресценции в ультрафиолетовом свете. Кристаллы выделя-
Рис. 10. Образование кристал
лов в среде при определенш
отношения бактерий к эскули
ну (Gemmell, Hodgkiss, 1964)
а — вксулин не гидролизуют,
б — гидролизуют («бразуются кри
сталлы)
86
ют путем расплавления среды и фильтрования ее через фильтро-
вальную бумагу. После этого их растворяют в щелочи, в результате
чего образуется оранжевый не флуоресцирующий раствор. Утеря
флуоресценции всегда коррелирует с образованием кристаллов.
Гансен (Hansen, 1968) расщепление эскулина наблюдала по
почернению среды и по утере ею флуоресценции. Употребляют
две концентрации эскулина: меньшая — способствует увеличе-
нию чувствительности определения потери флуоресценции,
а большая — благоприятствует увеличению чувствительности теста
с лимоннокислым железом. Автор использует среду следующего
состава:
Триптиказа 10,0 г Твин 80 0,5 г
Дрожжевой экстракт 5,0 г Раствор соли1 5 мл
КН2РО4 6,0 г Глюкоза 10,0 г
Лимоннокислый аммоний 2,0 г Сахароза 10,0 г
Уксуснокислый натрий 5,0 г Арабиноза 5,0 г
Вода до 1 л
Арабинозу стерилизуют отдельно через фильтр Зейтца. Ис-
пользуют две концентрации эскулина —0,2 г или 1,0 г на 1 л
среды.
Пробирки с 2,5 мл среды с эскулином засевают стандартным
инокулятом и инкубируют при оптимальной для данного вида
температуре. Потерю флуоресценции изучают через 3, 5, 7 и
14 дней инкубации, используя длинноволновой ультрафиолетовый
свет (3660 А). На 14-ый день инкубации содержимое пробирок
доводят до pH 6—7 с помощью 1 н. NaOH, после чего добавляют
0,1 мл 1%-ного раствора лимоннокислого железа. Черная окраска
указывает на расщепление эскулина.
Гидролиз гиппуровокислого натрия. Для выявления этого при-
знака применяют различные среды с 1°/о гиппуровокислого нат-
рия. Например, жидкую среду Рогозы с соавторами (Rogosa et al.,
1951) (см. табл. 6) с 1,5% уксуснокислого натрия и без уксусной
кислоты, среду Байсета и Девиса (Bisset, Davis, 1960). Ее состав
(в %): пептон — 1,0; дрожжевой экстракт — 0,5; твин 80—0,1;
соль А2 — 0,5; соль Б2 — 0,5; глюкоза — 0,5; NaCl — 0,5. После
7—14 суток культивирования штаммов при оптимальной темпе-
ратуре к 1 мл надосадочной жидкости, помещенной в чистую про-
бирку, прибавляют 1—1,5 мл 50 %-ной H2SO4. Образование осадка
тонких кристаллов бензойной кислоты указывает на положитель-
ную реакцию. Однако Рогоза с сотрудниками (Rogosa et al., 1953)
считают подобную постановку опыта недостаточно надежной.
Геммель и Ходгкис (Gemmell, Hodgkiss, 1964) установили
1 Состав соли Б (см. табл. 6).
2 См. табл. 6.
87
гидролиз гиппурата натрия на указанной нами выше (см. о по-
движности лактобацилл) среде без цитрата, 1% гиппуровокислого
натрия и 0,5% глюкозы. После нескольких дней инкубации куль-
туры центрифугируют и к надосадочной жидкости добавляют
50%-ную серную кислоту, после чего пробирки оставляют на ночь.
Появление пластинкообразных плоских кристаллов бензойной
кислоты (точка плавления при 121°) указывает на положитель-
ную реакцию; иглоподобные кристаллы (точка плавления при
187°) отождествляют с гиппуровой кислотой.
Образование аммиака из аргинина. Этот тест, успешно при-
мененный для дифференциации видов рода Streptococcus, имеет
значение и для определения видов рода Lactobacillus.
Для установления способности молочнокислых бактерий об-
разовывать аммиак из аргинина часто используется довольно
простая среда Нивена (Niven et al., 1942) (в %): дрожжевой эк-
стракт — 0,5; триптон — 0,5; К2НРО4 — 0,2; глюкоза — 0,05; D-ар-
гинин моно-гидрохлорид — 0,3; pH 7,0. Эта же среда без аргинина
служит контролем. 5—7 мл среды засевается 1 каплей культуры
и инкубируется 3—14 суток. Затем к 1—3 каплям культуральной
жидкости прибавляют 1 каплю раствора Несслера и немедленно
отмечают появление оранжевой окраски (положительная реак-
ция). Кедди (Keddie, 1959) к указанной выше среде добавляет
0,05% твина 80 и 0,1% агара (pH среды 6,0). Опыт учитывают
через 3, 5, 8 суток инкубации при 30° и через 2 и 5 суток, если
культивирование идет при 37°.
Можно использовать томатный бульон Бригс (Briggs, 1953а, Ь)
с 0,3% L-аргинина солянокислого (учет опыта через 14 суток),
МРС-бульон без аммония лимоннокислого, но с 0,3% L-аргинина,
капустный бульон, среду по Байсету и Девису (Bisset, Davis,
1960) (в %): пептон — 0,5; дрожжевой экстракт — 0,3; глюко-
за — 0,3; уксуснокислый натрий — 1,0; твин 80 — 0,1; соль А —
0,5; соль Б — 0,5; L-аргинин солянокислый — 0,3; pH 7,4. Среда
с аргинином трижды стерилизуется текучим паром. Засеянную
среду инкубируют в течение 10 дней при 37°.
Катсарас (Catsaras, 1967) предлагает изучать образование
аммиака из аргинина на среде следующего состава: аргинин —
10 г; пептон — 5 г; мясной экстракт — 5 г; пиридоксаль —
0,005 г; водный раствор бромкрезолового пурпурного (1:500) —
5 мл; водный раствор крезолового красного (1:500) — 2,5 мл; глю-
коза — 0,5 г; дистиллированная вода — 1 л; pH 6,4. Среду разли-
вают по 1 мл, стерилизуют при 120° 15 мин., и после посева одной
капли 18-часовой культуры на поверхность среды наносят сте-
рильное вазелиновое масло. В случае положительной реакции она
окрашивается в сине-фиолетовый цвет.
Следует иметь ввиду, что при наличии в средах 2% глюкозы
аммиак из аргинина образуют только гетероферментативные па-
лочки; если же глюкозы меньше, то это свойство проявляют и
гомоферментативные бактерии (Sharpe, 1962).
88
Количество кислоты, образуемой в снятом молоке или среде с
5% глюкозы определяют после 14 суток культивирования молоч-
нокислых бактерий в 5 мл среды. Содержимое пробирки вылива-
ют в Эрленмейеровскую колбу (сгусток хорошо разбить) и титру-
ют 0,1 н. раствором NaOH в присутствии фенолфталеина (конт-
роль — незасеянная среда). Полученное число умножают на 20,
что выражает кислотность в градусах Тернера (один градус Тер-
нера соответствует 0,0075% молочной кислоты).
Образование газа из глюкозы. Молочнокислые палочковидные
бактерии рода Lactobacillus делятся на подроды Streptobacterium
и Betabacterium на основании тех продуктов, которые образуются
ими при сбраживании углеводов.
На практике характер брожения (гомо- или гетерофермента-
тивное) устанавливается по образованию микроорганизмами угле-
кислого газа из сахаров. У гетероферментативных молочнокис-
лых бактерий не удается практически обнаружить газ при исполь-
зовании широко распространенных стеклянных поплавков или
трубок Дургама (Davis, 1960). В связи с этим для установления
образования газа при сбраживании сахаров был разработан ряд
приемов с использованием различных высокопитательных сред.
Широко используется, например, среда Джибсона и Абд-эль-
Малека (Gibson, Abd-el-Malek, 1945): глюкоза — 5,0 г; капуст-
ный (или томатный) сок — 10 мл; дрожжевой автолизат —
0,25 мл; мясо-пептонный желатин (10—12%-ный)—до 100 мл.
Для получения капустного сока порезанные листья нагревают на
водяной бане в течение 15 мин. для размягчения тканей, растира-
ют, выжимают сок, фильтруют и устанавливают pH 6,5. Можно
употреблять продажный консервированный томатный сок, кото-
рый фильтруют через марлю, затем бумажный фильтр (pH сока
6,5). Вместо мясо-пептонного желатина употребляют молоко;
в этом случае глюкозу, дрожжевой атолизат и сок добавляют к сме-
си четырех частей сепарированного молока и 1 части МПА. Глюко-
за в среды добавляется из концентрированного стерильного ра-
створа.
Среды разливают по 5—6 мл и стерилизуют текучим паром.
Перед засевом их расплавляют, охлаждают до 40—45% и засева-
ют 2—3 каплями активной культуры. Затем на поверхность полу-
жидкой среды осторожно, по стенкам пробирки, наносят 2—3 см
охлажденного до 45° голодного агара. Опыт учитывают через
14 суток инкубации при оптимальной для роста штамма температу-
ре. Иногда газообразование бывает настолько сильным, что ага-
ровая пробка выталкивается почти до горлышка пробирки.
Употребляют для изучения газообразования и среду Гаррисо-
на и Гансена (Harrison, Hansen, 1950b): томатный сок, осветлен-
ный центрифугированием,— 20 мл; сухой дрожжевой эстракт —
1,0 г; триптиказа — 1,0 г; глюкоза — 5,0 г; вода — до 100 мл;
pH 6,9. Засеянная среда покрывается стерильным вазелином и
инкубируется при 37° в течение двух недель.
89
Для отличия гомо- от гетероферментативных лактобацилл
Симс (Sims, 1968) предлагает использовать фузидовую кислоту.
Простерилизованная фильтрованием кислота в количестве
10 мкг/мл добавляется к агару МРС.
Для постановки теста по образованию газа из глюкозы может
быть использована агаризованная среда МРС (см. табл. 8) с
2—5% глюкозы.
По данным Хэйуорда (Hayward, 1957), ряд гетерофермента-
тивных бактерий охотнее образует газ на среде с мальтозой, чем
глюкозой. Автор рекомендует пользоваться средой (%): пептон
(Oxoid) — 0,5; дрожжевой экстракт (Difco) —0,3; соль А — 0,5 об.
%; соль Б — 0,5 об. %; твин 80 — 0,1 об. %; уксуснокислый нат-
рий — 0,5; мальтоза — 2,5. Составные части среды растворяют в
дистиллированной воде, pH доводят до 6,8—7,0 и среду разливают
по 3 мл в пробирки (1,25 X 12,5 см), куда помещают трубки Дурга-
ма (3 X 0,625 см). Стерилизация — 15 мин. при 120°. Засев произ-
водят одной каплей 24-часовой культуры, выросшей на бульоне;
и среду сверху закрывают 2 мл жидкого парафина или агаровой
пробкой.
Гансен (Hansen, 1968) сообщает о том, что некоторые авторы
через две недели инкубации бактерий при 37° наблюдали образо-
вание газа в среде с 2% глюкозы, куда были помещены перевер-
нутые поплавки.
Следует в заключение подчеркнуть, что образование газа из глю-
козы — тест, который дает однозначные результаты лишь при усло-
вии достаточного содержания в среде глюкозы и наличия буфера.
Образование газа из глюконата устанавливают путем трехкрат-
ного пересева культур в бульон МРС, где вместо глюкозы содер-
жится 4% глюконовокислого натрия. Этот показатель применяет-
ся при дифференцировании подродов Betabacterium, Streptobacte-
rium и Thermobacterium. Гетероферментативные бактерии, как
правило, образуют газ из глюконата и сбраживают рибозу (Rogo-
sa, 1970; Sharpe et al., 1972).
Сбраживание углеводов. По данным Девиса (J. G. Davis, 1960),
в лабораториях при изучении отношения штаммов к углеводам
иногда получают неверные результаты из-за того, что в основной
среде для сбраживания имеется неподходящий для бактерий источ-
ник азота. Кроме того, ряд сахаров (фруктоза, арабиноза), кото-
рые очищаются с трудом, может содержать посторонние примеси,
например, ростовые вещества, которые будут влиять на ход бро-
жения.
Международный подкомитет по таксономии лактобацилл и
близкородственных организмов (Hansen,1968) рекомендует для
изучения сбраживания углеводов использовать среду, предложен-
ную Рогозой (Efthymiou, Hansen, 1962), (см. табл. 7). Растворы
ксилозы, арабинозы, фруктозы, сорбозы, галактозы, трегалозы,
мальтозы, целлобиозы и мелибиозы стерилизуются отдельно филь-
трацией. Учет результатов проводят через две недели инкубации
90
культур при 37°. Было решено (Hansen, 1968), что соли марганца
должны быть исключены из среды при изучении сбраживания уг-
леводов термобактериями, но не стрепто- или бетабактериями.
Для изучения сбраживания углеродсодержащих веществ широ-
ко используется бульонная среда МРС без мясного экстракта, со-
держащего заметные количества углеводов. Испытуемый углевод
или спирт (2%) добавляется к среде перед стерилизацией или по-
сле нее (из 10%-ных стерильных растворов) (de Man et al., 1960).
Индикаторами служат хлорфеноловый красный (0,004%),
бромкрезоловый пурпурный (если начальное pH' среды 6,2—6,8),
бромкрезоловый зеленый (при pH среды 5,4) (Sharpe, Fryer,
1965). Очень важны pH основной среды и подбор индикатора для
молочнокислых бактерий, выделенных из вин. Так, некоторые
штаммы, выделенные из этих субстратов (Carr, 1959), при pH сре-
ды 6,8—7,0 сбраживают только ксилозу и фруктозу, а при pH 4,4—
5,5 — глюкозу, галактозу, мальтозу, лактозу, сахарозу, раффинозу.
Сбраживание углеводов можно изучать на полужидкой среде
МРС-3 (Ленцнер, 1966), которая, в отличие от среды МРС-1, гото-
вится на воде и не содержит печеночный экстракт и глюкозу.
В нашей лаборатории с успехом используется полужидкая сре-
да, предложенная Виттенбари (Whittenbury, 1963), на которой
можно получить представление о влиянии кислорода на сбражива-
ние различных субстратов. Среда имеет следующий состав: мясной
экстракт (Lab Lemco) — 0,5 г; пептон (Evans) — 0,5 г; дрожжевой
автолизат — 5,0 мл или дрожжевой экстракт (Difco) — 0,5 г; твин
80 — 0,05 мл; агар — (Davis) — 0,15 г; крановая вода — до 100 мл.
В качестве индикатора используют бромкрезоловый пурпурный 1
(1,4 мл 1,6%-ного спиртового раствора па 1 л среды, pH 6,8—7,0)
или бромкрезоловый зеленый1 (2,8 мл 0,4%-ного водного раство-
ра на 1 л среды, pH 5,4). Среды, а также исследуемые углеводы
и спирты в виде растворов в дистиллированной воде стерилизуют-
ся автоклавированием при 1 атм. в течение 15 мин. (сахароза, ара-
биноза, ксилоза, манноза, рамноза, мальтоза, фруктоза, галактоза,
сорбоза стерилизуются через фильтр Зейтца). Расплавленную сре-
ду охлаждают до 50°, прибавляют раствор исследуемого субстрата
в таком объеме, чтобы окончательная концентрация его составляла
0,5%, перемешивают и разливают по 5—6 мл в пробирки. Перед
посевом среду охлаждают до 37—40° и вносят небольшую каплю
культуры, выросшей на вышеприведенной среде (pH 6,5), но без
агара и индикатора, с 0,5 %1 глюкозы, которая стерилизовалась
вместе со средой. Засеянную среду хорошо перемешивают. Наблю-
дения за изменением индикатора проводят в течение 10 суток ин-
кубации при 30°.
Сложные составы сред для изучения сбраживания углеводов
приводят Рогоза с сотрудниками (Rogosa et al., 1953). В качестве
1 Геммель и Ходгкис (Gemmell, Hodgkiss, 1964) употребляют соответственно
2,8 и 5,6 мл этих индикаторов на 1 л среды.
91
индикаторов (pH сред 6,6—6,8) они применяют бромкрезоловый
синий (0,0016%), ализариновый красный (0,004%). Ряд прописей
сред можно найти в других работах (Gemmell, Hodgkiss, 1964;
Hansen, 1968).
Ферментативную активность молочнокислых палочек устанав-
ливают и на более простых средах, например, на среде, предло-
женной Витер (Wheater, 1955а) (в %): неопептон —1,5; твин
80—0,1 об. %; дрожжевой автолизат — 0,6; агар — 0,15; суб-
страт — 0,2; pH — 7—7,2. Индикатор — хлорфеноловый красный
(0,004%), который перед разливкой сред в пробирки и стерилиза-
цией растворяют в 1 мл этилового спирта и прибавляют к среде.
Используют также другую пропись среды (Langston, Вошла,
1960а): триптиказа — 10 г; дрожжевой экстракт — 5 г; дистилли-
рованная вода — до 1 л; исследуемый субстрат — 1%!. 5—10 % -
ные растворы спиртов и сахаров желательно фильтровать через
фильтр Зейтца и прибавлять к основной среде перед постановкой
опыта. 4—5 мл среды следует инокулировать маленькой каплей
активной культуры. Опыты учитывают через 7—10 суток.
Рост в присутствии 0,4% типола (анионный детергент, состоя-
щий из алкильных сульфитов). Нейлор и Шарп (Naylor, Sharpe,
1958а) установили, что отношение ряда видов молочнокислых па-
лочек к типолу (0,1%' типола соответствует 40% желчи) является
характерным видовым признаком. Например, на агаре MPG с
0,4% типола Lactobacillus casei растут плохо или не растут,
a L. plantarum растут хорошо. Гомоферментативные штаммы инку-
бируют в течение двух суток, гетероферментативные — семи.
Как указывает Гансен (Hansen, 1968), этот признак можно
изучать на среде МРС с разными концентрациями типола (0,1—
0,7 г на 100 мл). Инокулированная среда инкубируется две недели,
после чего изучается изменение ее pH и образование мути. Иссле-
дуя ряд штаммов молочнокислых бактерий, хранящихся в коллек-
ции ATGC, различные лаборатории установили, что ни один из
штаммов термобактерий не рос в присутствии 0,2% типола, тогда
как все бетабактерии росли и с 0,3%, a L. plantarum — с 0,7%.
Два варианта L. salivarius росли при наличии 0,2%', но не 0,3%
типола (Hansen, 1968).
Одним из диагностических признаков молочнокислых бактерий
считают отношение их к 4%-н ой натриевой соли т аурохо-
левой кислоты (Abo-Elnaga, Kandler, 1965а), которая добав-
ляется к одной из питательных сред, например, бульону МРС.
Образование газа в присутствии яблочной и лимонной кислот.
Гомоферментативные молочнокислые палочковидные бактерии не
образуют газ из глюкозы. Вместе с тем они могут продуцировать
его в присутствии лимонной кислоты в среде без углеводов (Gib-
son, Abd-el-Malek, 1945). Гетероферментативные виды выделяют
газ только в присутствии сбраживаемых сахаров.
Для изучения образования газа в присутствии указанных кис-
лот можно применить метод, описанный Кедди (Keddie, 1959).
92
Использование лимонной кислоты лактобациллами автор исследо-
вал на среде состава: пептон—1,0 г; мясной экстракт — 1,0 г;
дрожжевой автолизат — 5,0 мл; томатный экстракт —10 мл; твин
80—0,05 мл; NaH2PO4 — 0,1 г; смесь солей А и Б (табл. 6) — 5 мл;
агар —0,2 г; «цитратный» буфер —10 мл; дистиллированная вода —
до 100 мл; pH —5,4. Буфер готовят так. Растворяют 2,5 г лимонной
кислоты в небольшом количестве дистиллированной воды, уста-
навливают pH 5,4 с помощью 10 н. КОН и весь объем доводят до
10 мл. Затем среду разливают по 4—5 мл в пробирки, засевают
3 каплями культуры, закрывают агаровой пробкой и инкубируют в
течение 14 суток, следя за выделением пузырьков газа. Для гете-
роферментативных бактерий в среду прибавляют 0,2% глюкозы1.
Контролем служит среда без лимонной кислоты.
Использование яблочной кислоты Кедди предлагает изучать
на среде: пептон —1,0 г; мясной экстракт —1,0 г; дрожжевой авто-
лизат —5 мл; томатный экстракт —10 мл; твин 80—0,05 мл; глю-
коза 1,0 г (для гетероферментативных —0,2 г; контроль —среда
без яблочной кислоты); MnSO4-4H2O—0,05 г; агар—0,2 г; «яблоч-
ный» буфер—10 мл; дистиллированная вода — до 100 мл; pH —
5,4. Буфер готовят, растворяя 4 г DL-яблочной кислоты в неболь-
шом количестве дистиллированной воды, pH доводят до 5,4 с
помощью 10 н. КОН и весь объем — до 10 мл. Окончательная кон-
центрация яблочной кислоты — около 0,3 М. Для гомофермента-
тивных термобактерий рекомендуется давать 0,1 М левовращаю-
щей яблочной кислоты. Постановка опыта такая же, как и с ли-
монной кислотой.
Для установления образования СО2 из яблочной и лимонной
кислот можно пользоваться средой МРС с 0,5% глюкозы. К ней
добавляют раствор яблочной кислоты, нейтрализованной КОН до
pH 5,5. Окончательная концентрация яблочной кислоты— 2 г на
100 мл среды; ее разливают по 10 мл и стерилизуют при 115° в те-
чение 30 мин. После засева среды сверху наносят сантиметровый
слой стерильного расплавленного вазелина. Подобным образом в
среду добавляют и лимонную кислоту.
Установление оптического вращения. Конфигурация молочной
кислоты, образуемой молочнокислыми бактериями, всегда рассмат-
ривалась как важный таксономический признак ввиду его посто-
янства и независимости от внешних условий.
Выявить в среде молочную кислоту и установить ее конфигу-
рацию можно, пользуясь рядом руководств (Асатиани, 1957;
Curran et al., 1933; Rogosa et al., 1953; Camien, Dunn, 1954; Ked-
die, 1959; Langston, Bouma, 1960a; Abo-Elnaga, Kandler, 1965a; Ca-
to, Moore, 1965; Garvie, 1967c; Hansen, 1968, и др.).
Спорообразование. Для выявления способности лактобацилл
образовывать споры можно использовать среду, рекомендуемую
1 По Джибсону и Абд-ель-Малеку (Gibson, Abd-el-Malek, 1945) содержание
глюкозы в среде должно быть не менее 0,5%.
93
Торнли и Шарп (Thornley, Sharpe, 1959): ^бактотриптон —3,0 г;
пептон (Oxoid) — 6,0 г; дрожжевой экстракт — 3,0 г; мясной экст-
ракт (Lab Lemco) — 1,5 г; агар — 25 г; раствор, содержащий
0,001% Мп++ — 1 мл; дистиллированная вода=г4'л;рЙ 7,0. ~
-Китахара и Сузуки (Kitahara, Suzuki, 1963) изучали спорообра-»
зование на среде с дрожжевым автолизатом, мелом, ионами мар-
ганца (10-4М), незначительном содержанием глюкозы.
Серологические свойства. Группировку молочнокислых палоч-
ковидных бактерий посредством реакции преципитации между
специфической антисывороткой и солянокислыми экстрактами, по-
лученными из клеток, можно осуществить по методу Шарп (Shar-
pe, 1955а). Подробно мы останавливаемся на этом в разделе об
использовании серологических методов при идентификации лакто-
бацилл (Квасников и др., 1967). Важно помнить, что выращивание
штаммов для иммунизации кроликов и приготовления солянокислых
экстрактов проводится на различных средах, например (соответст-
венно), МРС без мясного экстракта и МРС без дрожжевого экс-
тракта (Sharpe, Fryer, 1965).
ПотребщрвГь в витаминах. Описано в разделе о питании молоч-
нокислых бактерий и разделе о србдаЭ, использующихся для куль-
тивирования лактобацилл. Подробны© сведения о постановке опы-
тов можно найти в ряде работ (Rogosa et al., 1953; Rogosa et al.,
1961; Franklin, Sharpe, 1964; Abo-Elnaga, Kandler, 1965c, и др.).
Методы исследования остальных; свойств, за последние годы
применяющихся как дополнительные для идентификации видов и
подвидов лактобацилл (ферменты гликолитического и гексозомо-
нофосфатного путей, например, альдолаза, различные дегидроге-
назы; тип муреина и тейхоевых кислот; процентное содержание
ГЦ в ДНК и изучение нуклеотидной последовательности и др.),
приведены нами в соответствующцх разделах главы «Системати-
ка молочнокислых бактерий».
Род Streptococcus
Молочнокислые кокки (стрептококки, лейконостоки, педиококки)
имеют с лактобациллами ряд общих свойств (отсутствие у них
подвижности, способности восстанавливать нитраты в нитриты,
грамположительная окраска, отсутствие цитохромов, каталазы,
спорообразования, сбраживание углеводов с образованием молоч-
ной кислоты). Поэтому постановка многих тестов для кокков и
лактобацилл подобна. Здесь мы отметим только иные методы, ис-
пользуемые для изучения ряда свойств, применяющихся при диаг-
ностике видов кокковых форм.
Образование газа из глюкозы можно устанавливать методом
Джибсона и Абд-эль-Малека (Gibson, Abd-el-Malek, 1945), описан-
ным нами ранее. Продуцирование газа определяют и на среде по
Ленгстону и Боуме (Langston, Bouma, 1960а) (см. табл. 7), со-
94
держащей 2% глюкозы, 2% агара и закрытой слоем агара или ва-
зелинового масла.
Образование газа из цитрата обнаруживают по методу Джиб-
сона и Абд-эль-Малека, рекомендующих для изучения этого свой-
ства у гомоферментативных стрептококков пользоваться средой,
состоящей из питательной желатины (10 — 12%-ной) и смеси ли-
моннокислого калия (трехосновного) и лимонной кислоты (9:1),
обладающей буферной способностью (pH среды 5,5 — 6,0). Смесь
добавляют к среде перед стерилизацией (или после, из 50%-ного
раствора смеси) так, чтобы концентрация ее была 3%. Позднее эти
же авторы (Abd-el-Malek, Gibson, 1948) отметили, что сбражива-
ние цитрата является важным отличительным свойством энтерокок-
ков. Сендайн с сотрудниками (Sandine et al., 1962) для установле-
ния способности ароматобразующих стрептококков использовать
лимонную кислоту с образованием газа предлагают цитратный бу-
льон следующего состава (в г): триптон — 10,0; глюкоза — 10,0;
лимоннокислый натрий— 20,0; дрожжевой экстракт — 5,0; фосфор-
нокислый калий двухосновной — 1,0; MgSO4 — 1,0; вода — до 1 л;
pH 7,0 устанавливается с помощью НС1. Среду разливают по
4—5 мл, автоклавируют при 121° 15 мин. и засевают петлей
(0,01 мл) 24-часовой культуры в молоке. Посев инкубируют при 30°
в течение 24 час., наблюдая за выделением газа.
Образование ацетилметилкарбинола (ацетоина). Способность
образовывать ацетоин в присутствии лимонной кислоты рекомен-
дуют исследовать как важный диагностический признак аромати-
ческих гомоферментативных стрептококков и энтерококков. У по-
следних изучают также образование ацетоина из глюкозы, что яв-
ляется распространенным, хотя и не универсальным их свойством
(Abd-el-Malek, Gibson, 1948).
Абд-эль-Малек и Джибсон (Abd-el-Malek, Gibson, 1948) пред-
ложили для энтерококков (Str. faecalis) среду следующего состава:
пептон — 1 %'; дрожжевой автолизат — 1 %; смесь девяти частей ли-
моннокислого калия и одной части лимонной кислоты — 1 %; pH
среды 5—6.
Образование ацетоина ароматообразующими гомоферментатив-
ными стрептококками Суотлинг (Swartling, 1951) изучает на среде
(%): триптон (Difco) — 1,0; мясной экстракт (Lemco)—1,0;
дрожжевой экстракт (Lemco)—0,5; NaCl — 0,2; К2НРО4— 0,5;
MgSO4 — 0,05. Среда стерилизуется паром в течение 30 мин. и де-
лится на две части: к одной из них добавляют 1% лактозы, а к дру-
гой — 1% лактозы и 0,5% лимоннокислого натрия. Среды разлива-
ют по 4 мл и стерилизуют. После инокулирования петлей 18-часо-
вой культуры посевы выращивают в течение 24—28 час. при 30°.
Ленгстон и Боума (Langston, Bouma, 1960а) образование аце-
тоина регистрируют на среде относительно простого состава (в г) :
полипептон — 7,0; глюкоза — 5,0; фосфорнокислый калий — 5,0;
дистиллированная вода — до 1 л; pH 7.
Для испытания наличия ацетилметилкарбинола к 1 мл куль-
95
туральной жидкости прибавляют 0,6 мл 5%-ного спиртового рас-
твора а-нафтола (на 96°-ном этиловом спирте) и 0,2 мл 40%-ного
КОН. Красно-малиновый цвет, появляющийся моментально или
спустя некоторое время (до четырех часов) свидетельствует о на-
личии ацетоина (Barritt, 1936).
Использование лимонной кислоты молока определяют по возрас-
танию летучих кислот в молоке (Чужова, Шубина, 1960) и обра-
зованию ароматических веществ (Sandine et al., 1962). Методы оп-
ределения в средах диацетила, ацетоина, 3-метилбутанола (обус-
ловливает запах и привкус солода в продуктах при развитии Str.
lactis var. maltigenes и Str. diacetilactis var. maltigenes) можно най-
ти в ряде работ (Скородумова, 1949; Чужова, Шубина, 1960; Пи-
сарницкий и др., 1969; Тер-Казарьян и др., 1972; Reiter, Moller-
Madsen, 1963).
Выживаемость культур после прогревания их при 63° в течение
30 мин. исследуют в обезжиренном стерильном молоке или какой-ли-
бо иной среде, например ДЛБ (Swartling, 1951), состоящей из (%):
пептон (Evans) — 1,0; мясной экстракт (Lemco) —1,0; глюкоза —
1,0; NaCl — 0,5; крановая вода; pH 7,0. Инокулят, выросший на этих
средах, прибавляют в количестве 0,2 мл в пробирки с 10 мл той же
среды и прогревают, замечая время с момента, когда температура
в контрольном сосуде достигнет 60°. Затем пробирки быстро охлаж-
дают и инкубируют при 30° в течение 24 час.
Ряд авторов для изучения указанной способности использует об-
рат (Sandine et al., 1962)., Абд-эль-Малек и Джибсон (Abd-el-Malek,
Gibson, 1948) рекомендуют при этом в стерильную пробирку поме-
щать 0,2 мл свежей, умеренно выросшей на лактозном бульоне
культуры, к которой прибавляют 5 мл обезжиренного стерильного
молока, стараясь не замочить стенок пробирки. Пробирку помеща-
ют в водяную баню при 63 ° так, чтобы уровень молока был гораздо
ниже уровня воды. После того, как температура молока достигнет
63 °, его нагревают в течение 30 мин., затем пробирку охлаждают и
0,2 мл молока высевают на чашку с агаром (триптон — 1 %, глюко-
за— 0,25%, агар — 1,5%). Посевы выращивают при 30° в течение
3—4 суток.,
Рост при различных температурах исследуют на тех же средах,
что указаны выше. Посев культур и учет опыта следует проводить,
как это описано в разделе о молочнокислых палочковидных бакте-
риях. Абд-эль-Малек и Джибсон (Abd-el-Malek, Gibson, 1948) ука-
зывают, что если испытуемые культуры медленно растут в снятом
молоке, следует использовать молоко с лакмусом, содержащее глю-
козу (0,25%) и дрожжевой автолизат (0,25%).
Гидролиз аргинина устанавливают на среде, предложенной Ни-
веном и другими (Niven et al., 1942); некоторые авторы добавляют
в среду твин 80. 1
Гемолиз изучают на питательном агаре (МПА) с 0,5% NaCl и
3% дефибринированной лошадиной крови (Whittenbury, 1965).
Чашки выдерживают в течение 48 час. при 30 или 37°, затем их
96
помещают на ночь в холодильник. Виттенбари (Whittenbury,
1965) изучал наличие гемолиза и в присутствии бычьей крови на
среде, содержащей 1% NaCl (среда 1 без глюкозы в табл. 8).Упот-
ребляют и другие среды и концентрации лошадиной крови — 0,5,
5, 10—20% (Чужова, Шубина, 1960; Abd-el-Malek, Gibson,1948;
Barnes et al., 1956). Микроорганизмы сеют штрихом на поверх-
ность сред или же вносят в слой агара (Deibel, 1964). Для опреде-
ления гемолитической активности бактерий существенно употреб-
лять лошадиную кровь во избежание получения нечетких данных
(Sharpe et al., 1966).
Рост при pH 9,2 и 9,6 определяют по методу Чесбро и Эванса
(Chesbro, Evans, 1959) . Для этого готовят жидкую среду следую-
щего состава (%) : триптон — 1,0; дрожжевой экстракт — 0,5; глю-
коза —1,0; NaCl —0,25; твин 80—0,05; Na2CO3 —0,05 М; KJHPCh —
0,05. Среду удвоенной концентрации без К2НРО4 и Na2CO3 стерили-
зуют при 1 атм. 10—12 мин. Кроме того, эти же соли в четырех-i
кратной концентрации стерилизуют отдельно в хорошо закрытой
посуде. После смешивания основной среды с солями устанавлива-
ют нужное pH с помощью стерильных 2 н. NaOH и 2 н. Н3РО4. Не-
обходимая исходная концентрация среды достигается добавлением
соответствующего объема стерильной дистиллированной воды. Сре-
ду разливают по 10 мл и используют для засева. Инокулят следует,
по крайней мере за час до посева, выдержать при температуре 30°.
Гидролиз эскулина и гиппуровокислого натрия. Эти реакции
следует изучать, как указано в разделе о лактобациллах. Эскулин
(0,1%) и гиппуровокислый натрий (1%) можно добавлять в сре-
ду с пептоном, триптоном, мясным и дрожжевым экстрактами (по
0,5% каждого) и, если необходимо для роста штамма, глюкозой
(0,25%). Гидролиз испытуемых веществ устанавливают после вне-
сения FeCl3 в засеянную и инкубированную в течение 5—7 суток
среду (Abd-el-Malek, Gibson, 1948).
Рост бактерий в присутствии различных концентраций NaCl
определяют на жидкой среде с 0,5% лактозы или другого сахара,
0,5% триптона, 0,5% мясного экстракта, pH 7,2 (Abd-el-Malek,
Gibson, 1948; Swartling, 1951). Можно пользоваться средой (pH
7,2), указанной нами в разделе о культивировании стрептококков.
При приготовлении сред соль просушивают в сушильном шкафу и
навеску вносят отдельно для каждой пробы в градуированные про-
бирки, после чего заливают бульоном до метки. После стерилиза-
ции доливают стерильный бульон до первоначального уровня (Чу-
жова, Шубина, 1960). Засеянные свежим инокулятом среды инку-
бируют в течение 72 час. при 37°.
Рост в среде с 4О°/о желчи. Этот признак исследуют на среде,
состоящей из четырех частей бычьей желчи и шести частей буль-
она, в состав которого входят (по 0,5%) лактоза, пептон, триптон
и мясной экстракт (Abd-el-Malek, Gibson, 1948)., Можно рекомен-
довать и агаризованную среду по Барнес с сотрудниками (Barnes
et al., 1956) (%): пептон (Evans) — 1,0; мясной экстракт (LabLem-
4 Е. И. Квасников, О. А. Нестеренко 97
co) — 1,0; дрожжевой экстракт — 0,3; глюкоза — 1,0; агар — 1,2;
pH 7,2. Из нее исключается глюкоза, но добавляется 10% лошади-
ной крови и 40% желчи. Результаты опыта учитывают через 1 и
3 суток.
Сбраживание углеводов можно изучать на пептонной воде (1%
пептона, 0,5% NaCl, 0,5% углевода) (Swartling, 1951), а также
«молочном» бульоне по Сендайну и другим (Sandine et al., 1962)
с 0,02% бромкрезолового пурпурного.
Разжижение желатина Ленгстон и Боума (Langston, Вошпа,
1960а) предлагают наблюдать на следующей среде: мясной экст-
ракт — 3,0 г; пептон — 5,0 г; желатин — 120 г; дистиллированная
вода — до 1 л; pH 7,0, После инкубации засеянных культур в те-
чение 48 час. пробирки со средой охлаждали для определения раз-
жижения желатина.
Гидролиз крахмала определяют на питательном агаре (МПА) с
0,3% растворимого крахмала. Засеянные штрихом чашки выдер-
живают в течение трех суток при 37°. Затем их заливают раство-
ром Люголя, Str. bovis гидролизуют крахмал до восстанавливаю-
щих сахаров, тогда как Str. equinus не настолько глубоко расщеп-
ляет крахмал (Sharpe et al., 1966).
Рост в присутствии теллуровокислого калия можно исследо-
вать на среде 1 (табл. 8), в которую добавлено 0,04% теллурита
и вдвое увеличена концентрация мясного экстракта (Whittenbury,
1965). Употребляют и среду, приготовленную по Барнес с соавто-
рами (Barnes et al., 1956), с глюкозой, 10% лошадиной крови и
1/2500 теллуровокислого калия (см. выше). Среду перед заливкой
чашек выдерживают при 70° в течение 10 мин. Рост учитывают че-
рез сутки культивирования при 37°.
Восстановление 2, 3, 5-трифенилтетразолий хлорида (ТТХ)
изучают на вышеуказанной среде 1 (табл. 8) с 0,01% ТТХ, кото-
рый добавляют стерильно из основного раствора, простерилизо-
ванного в течение 15 мин. при 100°; pH среды 6,0. Ее разливают
по 4 мл и добавляют три капли инокулята. Посевы инкубируют
при 30° в течение 8 час. и отмечают восстановление ТТХ по появ-
лению розовой окраски.
Барнес (Barnes, 1956b) предлагает использовать среду, подоб-
ную приведенной нами выше, для культивирования стрептококков
(готовится на дистиллированной воде). ТТХ прибавляют в количе-
ве 375 мкг на 5 мл среды. Следует обязательно доводить pH среды
до 6,0, так как эти условия являются самыми благоприятными для
выявления реакции, характерной для Str. faecalis, но не Str. fae-
cium.
Изменения в молоке с 0,1% метиленовой сини отмеча-
ют ежедневно в течение недели. Характер роста в молоке с 1,5%
1%-ного раствора лакмуса регистрируют через 1, 2, 3, 10 суток
и месяц культивирования бактерий.
Декарбоксилирование тирозина изучают по Шарп (Sharpe,
1948). Оно определяется по pH, устанавливаемому в стандартной
98
среде, содержащей тирозин; разница в pH на 1,2 единицы или бо-
лее указывает на разложение испытуемым организмом тирозина.
Часто для стрептококков серологической группы N устанавли-
вают активность кислотообразования. Титруемую кис-
лотность определяют в стерильном молоке после заражения его
5% культуры и выращивания при 30° в течение 6 час. (Чужова,
Шубина, 1960).
Состав сред, употребляемых в процессе изучения свойств для
идентификации стрептококков серологических групп D и N, осве-
щен также в обзорах ряда исследователей (Калина, 1964, 1972;
Квасников, Нестеренко, 1968; Shattock, 1962; Reiter, Moller-Mad-
sen, 1963; Deibel, 1964, и др.).
Методы исследования серологических свойств стрептококков
групп D и N приведены во многих исследованиях (Билетова, 1965;
Shattock, 1949; Swartling, 1951; Briggs, 1952; Briggs, Newland, 1952,
и др.). HCl-экстракты (Lancefield, 1933) или формамидные экстрак-
ты (Fuller, 1938) клеток испытываются в реакции кольцепреципи-
тации с готовыми антисыворотками или применяется метод диф-
фузии в геле.
Фекальные стрептококки могут быть распределены в сероло-
логические типы с помощью реакции преципитации (Sharpe et al.,
1966). По данным Медрека и Барнес (Medrek, Barnes, 1962), нега-
тивные результаты по серологической группировке стрептококков
группы D (Str. durans, Str. bovis, Str. faecium) могут получаться
в результате выращивания бактерий для приготовления вакцин и
экстрактов антигенов на средах с недостаточной концентрацией
глюкозы. Авторы рекомендуют культивирование на глюкозном буль-
оне Лемко (г/л): пептон (Evans)—10,0; мясной экстракт (Lab
Lemco) — 10,0; глюкоза — 10,0; NaCl — 5,0; pH 7,2. Среда без глю-
козы разливается по 47,5 мл и автоклавируется при 120° 15 мип.
После охлаждения прибавляется 2,5 мл 20 %-ного отдельно про-
стерилизованного раствора глюкозы.
Пиогенные стрептококки типируются методом преципитации
и агглютинации. Как указывают Шарп с сотрудниками (Sharpe et
al., 1966), использование серологических реакций является един-
ственным более или менее надежным способом идентификации
этих видов.
Род Leuconostoc
Сбраживание лейконостоками источников углерода можно уста-
навливать на среде Ленгстона и Боума с 1% углевода, но без
фитона, твина 80 и томатного сока (см. табл. 8); на среде, предло-
женной Гарви (Garvie, 1960) (%): пептон — 1,5; дрожжевой экст-
ракт — 0,6; NaCl — 0,5; сахар — 0,2; индикатор бромкрезоловый
пурпурный — 0,002. Используют для этих целей и среду, предло-
женную Виттенбари (Whittenbury, 1963), описанную нами в раз-
деле о лактобациллах.
Рост при различных температурах изучают на среде АТБ, ага-
99
4*
ровой среде I по Виттенбари (см. табл. 8). Добавив 5% сахарозы,
на этой же среде I исследуют образование декстрана.
Слизеобразование из сахарозы обнаруживают и на средах ино-
го состава (в %): 1) триптон — 1,0; дрожжевой экстракт — 0,5;
К2НРО4 — 0,5; лимоннокислый аммоний — 0,5; сахароза — 5,0
(Garvie, 1960); 2) триптон — 0,5; дрожжевой экстракт — 0,5; саха-
роза — 10,0; СаСОз — 2,0; агар — 2,0 (Sandine et al., 1962); 3) пеп-
тон— 1,0; мясной экстракт — 1,0; дрожжевой автолизат — 5,0; то-
матный экстракт — 20; сахароза — 5,0; желатин — 12; твин 80—
0,05; pH 6,5 (Keddie, 1959). Посевы культивируют в течение 14 су-
ток при 23,5°.
Для изучения усвоения цитрата к 10 мл среды АТБ
(см. табл. 8) добавляют 1 мл 10%-ного раствора лимоннокислого
аммония, солянокислый цистеин и засевают испытуемой культу-
рой. После трехдневного выращивания при 22° определяют оста-
точный цитрат с помощью Str. lactis var. diacetilactis NCDO 1007
(Garvie, 1967a).
Рост лейконостоков при pH 3,7, 4,7 и 6,7 изучают в бульоне с
лимонной и яблочной кислотами (СМБ) (Garvie, 1967а) (%): пеп-
тон— 1,0; дрожжевой экстракт — 0,5; глюкоза — 1,0; лимонная
кислота — 0,25; DL-яблочная кислота — 0,25; КН2РО4 — 0,25;
MgSO4-7H2O— 0,02; MnSO4-4H2O— 0,005; твин 80—0,1; томат-
ный сок — 5. Среду разливают по 5 мл и стерилизуют автоклавиро-
ванием при 121° в течение 15 мин. Солянокислый цистеин добав-
ляют для штаммов видов L. oenos и L. cremoris. Среда засевается
одной каплей культуры, выращенной на среде АТБ.
Для исследования роста лейконостоков в присутствии 10 об. %
этилового спирта готовят среду СМБ удвоенной концентрации, уста-
навливают pH 4,7 для выращивания L. oenos и pH 6,7 — для
иных видов. Среду разливают по 2,5 мл, доводят объем водой до
4,5 мл, после чего автоклавируют при 121° 15 мин. После охлажде-
ния к среде добавляют 0,5 мл абсолютного этилового спирта, тща-
тельно размешивают, засевают петлей культуры и закрывают
резиновыми пробками. Посевы инкубируют в течение четырех
(для L. oenos) или одних — двух суток (для других видов).
Род Pediococcus
Морфологию клеток (через 24 и 48 час.) и форму колоний (через
1, 2, 7 суток инкубации) изучают на одной из используемых для
выделения и культивирования педиококков сред, например, агари-
зованной или жидкой среде с томатным соком. Обычная темпера-
тура инкубации посевов — 30°; для Р. damnosus — 22°.
Рост при различных температурах, солеустойчивость, устойчи-
вость к типолу, способность расти при различных pH можно ис-
следовать на среде МРС или АПТ (Sharpe, Fryer, 1965) (см. табл.
7). Для установления pH 9,0 к среде добавляют глициновый буфер
(0,1 М) (Shattock, Hirsch, 1947), а для поддержания pH 4,2 — бу-
100
фер, состоящий из натрия уксуснокислого и уксусной кислоты
0,04 М (Gunther, White, 1961а).
Потребность в кислороде определяют по интенсивности роста
культур в бульоне с томатным соком в аэробных или анаэробных
условиях в атмосфере 95% Нг и 5% СОг. Визуально отмечают
рост после инкубации в течение 24 или 72 час. (для медленно рас-
тущих штаммов)^
Псевдокаталазу выявляют на модифицированной среде
(УТДж) Фелтона и других (Felton et al., 1953) (%): триптон —
1,0; глюкоза — 0,05; КН2РО4 — 0,2; NaCl — 0,5; дрожжевой экс-
тракт — 0,5; агар — 1,5; дистиллированная вода. К среде прибав-
ляют твин 80 (0,1 об.%); FeSO4 — 0,04; MgSO4— 0,08; MnCl2 —
0,014 (Coster, White, 1964).
Сбраживание углеводов изучают на среде (%): пептон — 1,0;
дрожжевой экстракт — 0,5; NaCl — 0,5; MgSQj — 0,05; MnSCh —
0,05; углевод — 1,0. Индикатор (0,04%-ный раствор бромкрезоло-
вого пурпурного) добавляют в среду после инкубации штаммов
(Gunther, White, 1961а).
Гидролиз эскулина устанавливают на модифицированной сре-
де Девиса (Davis, 1955) (%): пептон — 1,0; дрожжевой экст-
ракт — 0,5; натрий уксуснокислый — 1,0; эскулин — 0,5; аммо-
нийное лимоннокислое железо — 0,05; NaCl — 0,2; MnSO^ —
0,05; MgSO4 — 0,05; pH 6,8. 4 мл среды засевают 1—2 каплями
испытуемой культуры. Посевы инкубируют в течение 14 суток,
отмечая через каждые 48 час. потерю флуоресценции и почерне-
ния среды (Cunther, White, 1961а).
Максимальную кислотность определяют в жидкой среде с глю-
козой и дрожжевым экстрактом через 18 суток инкубации штаммов.
Оптическое вращение молочной кислоты, продуцируемой пе-
диококками, изучают по методу Кемиена и Дана (Camien, Dunn,
1954). К среде добавляют по 0,05% MgSO4 и MnSO4 и твин 80
(0,1 об. %). Инкубируют штаммы в течение месяца (Coster, Whi-
te, 1964).
Потребность в фолиновой кислоте выявляют так, как указано
в приведенных выше руководствах. При этом отмечается отсутст-
вие роста бактерий в среде, дефицитной по этой кислоте, после
трех серийных пересевов.
Накагава и Китахара (Nakagawa, Kitahara, 1959) приводят де-
тальные указания, касающиеся методов исследования педиококков.
Среды, содержащие различные концентрации неохмеленного пива,
дрожжевой экстракт, пептон, NaCl, сахара, уксуснокислый
натрий, КН2РО4 (иногда) или NaH2PO4, имеющие различные pH,
использовались для изучения потребностей педиококков в кисло-
роде и СО2, продуктов сбраживания глюкозы, способности роста,
при различных pH среды, температурных точек роста, солеустой-
чивости, сбраживания углеводов.
Серологическое родство между видами этого рода изучал ряд
авторов (Gunther, White, 19616; Coster, White, 1964). Культуры
101
для иммунизации животных выращивают на бульоне (Shattock,
Hirsch, 1947): глюкоза — 10,0 г; Lab Lemco — 10,0 г; пептон
(Evans) — 10,0 г; NaCl — 5,0 г; вода — до 1 л; pH' 7,0. Среду стери-
лизуют при 115° 20 мин. Для приготовления НС1 — экстрактов бак-
терии выращивают на бульоне, содержащем томатный сок. Мето-
дика постановки реакции преципитации описана нами ранее.
Гемолиз, разжижение желатина (учет опыта через 7, 14 и 28
суток роста), восстановление нитратов в нитриты, образование
аммиака из аргинина, продуцирование ацетилметилкарбинола,
СО2 из глюкозы, рост в молоке с лакмусом (в течение 28 суток)
можно устанавливать, как указано нами выше в разделах о кок-
ковых и палочковидных молочнокислых бактериях.
СИСТЕМАТИКА МОЛОЧНОКИСЛЫХ БАКТЕРИЙ
Общие принципы
и схемы классификации палочковидных
и кокковых форм
Классификация молочнокислых бактерий очень трудна и еще
недостаточно разработана. В последние годы она привлекает к себе
возрастающее внимание исследователей. Это определяется,
прежде всего, той большой и важной ролью, которую молочнокис-
лые бактерии играют в ряде отраслей народного хозяйства и ме-
дицины.
Выше мы указали, что молочнокислые бактерии весьма различ-
ны по своим свойствам. Они широко распространены в природе
во многих местах обитания; условия существования определяют и
специфические приспособления к ним микроорганизмов. Как мы
отмечали, нередко в разнообразных субстратах обнаруживают мо-
лочнокислые бактерии, отдельные признаки которых не характер-
ны для всей группы — подвижные, спорообразующие и т. д. Та-
кая разношерстность свойств молочнокислых бактерий создает
значительные трудности при их классификации.
Классификацию молочнокислых бактерий затрудняет также
частое обнаружение штаммов, которые не могут быть отнесены к
тому или иному подроду или виду, а занимают как бы промежу-
точное положение. Так, считают, что для гетероферментативных
бактерий характерно образование при сбраживании углеводов
до 40—50% уксусной кислоты, спирта, СО2, тогда как для томо-
ферментативных— только 1—2%. Вместе с тем имеется немало
примеров, когда выделенные штаммы образуют от 10 до 30% по-
бочных продуктов и, таким образом, находятся по этому свойству
в промежуточном положении между гомо- и гетероферментатив-
ными бактериями (J. G. Davis, 1960).
Можно привести немало подобных примеров, касающихся го-
моферментативных стрептобактерий. Так, имеются указания на
102
то, что многие штаммы не могут быть отнесены ни к одному из
видов подрода Streptobacterium (Lactobacillus plantarum и L. casei)
из-за наличия у этих штаммов «промежуточных» свойств. Напри-
мер, Шервуд (Sherwood, 1939), Нейлор, Шарп (Naylor, Shar-
pe, 1958а, b), Перри и Шарп (Perry, Sharpe, 1960) обнаружили та-
кие формы в молоке и сыре. Йенсен и Эдмондсон (Jensen, Edmon-
dson, 1957) не смогли идентифицировать 2°/о штаммов стрептобак-
терий, выделенных из молока и сметаны, а Хил и Торнтон (Hill,
Thornton, 1958) обнаружили до 20% таких штаммов. Кедди (Ked-
die, 1959) в силосе также выявил ряд штаммов, которые он не мог
причислить к двум видам стрептобактерий. Нами (Квасников и
др., 1971а, б) в кишечнике различных насекомых были найдены
энтерококки, занимающие промежуточное положение между уже
установленными видами — Streptococcus faecalis и Str. faecium.
Как справедливо отмечает Девис (Davis, 1960), «классифика-
ция, таким образом, не является распределением черного и белого,
а решением того, куда поместить различные оттенки серого».
Трудность классификации молочнокислых бактерий заключа-
ется также в изменчивости многих свойств этих микроорганиз-
мов, особенно при культивировании их на разных средах и в раз-
ных условиях.
У молочнокислых бактерий может изменяться способность по-
ложительно краситься по Граму, расти в определенных средах.
Они могут изменять морфологические и культуральные свойства,
температурные границы роста, приобретать или, наоборот, терять
способность образовывать декстраны и т. д. Многие исследовате-
ли признают, что свежевыделенные штаммы ведут себя иначе,
чем те, что долго культивировались в лаборатории. Так, лабора-
торные культуры Str. lactis иногда слабо растут или вообще не
растут в молоке, L. casei теряет способность расщеплять казеин
и т. д.
Рогоза с соавторами (Rogosa et al., 1953) указали, что L. fermen-
ti в не адэкватной в отношении питательных компонентов среде
сбраживает одну сахарозу, a L. brevis — только арабинозу и ксило-
зу. L. leichmannii в обычных условиях культивирования не сбра-
живает лактозу и галактозу, однако может ферментировать их в
строго анаэробных условиях (Gasser, 1970). Культуры Lactobacte-
rium bulgaricum, выделенные из одной клетки и не ферментиро-
вавшие мальтозу и сахарозу, под воздействием факторов, встре-
чающихся в пищеварительном тракте (желчь, кислое и щелочное
pH) могут начать сбраживать эти углеводы, а после пассирования
через молоко вернуть свои прежние свойства (Начев, 1966).
Вместе с тем, Орла-Иенсен (Orla-Jensen, 1942) считал, что ха-
рактер изменчивости молочнокислых бактерий часто является од-
ним из наиболее специфических их признаков. Поэтому, как спра-
ведливо заметил Браун (Braun, 1947), совершенные системы
классификации должны включать описание общего возможного
масштаба изменчивости каждого бактериального вида.
103
Классификация молочнокислых бактерий строится на основе
изучения многих их свойств. При этом таксономисты придают раз-
ное значение изученным признакам.
Ряд исследователей широко использует морфологические при-
знаки. Так, Орла-Иенсеп (Orla-Jensen, 1942) морфологию клеток
брал в основу разграничения видов кокковых молочнокислых бак-
терий, а Девис — (J. G. Davis, 1955) кокковых (Str. lactis и Str.
cremoris) и палочковидных (L. bulgaricus и L. delbrueckii). Автор
указывал, что эти организмы хорошо различаются по морфологии
при условии, что культуры изучаются в определенном возрасте
и среде. Форму колоний, как один из диагностических признаков,
применял Рогоза (Rogosa et al., 1953) для дифференциации
L. acidophilus и L. casei. Важное таксономическое значение морфо-
лого-культуральным свойствам придают и Девис с сотрудниками
(G. Н. G. Davis et al., 1955), а также Або-Элнага и Канцлер
(Abo-Elnaga, Kandler, 1965а).
В основу деления на виды кладут также признаки сбражива-
ния определенных углеводов, потребности в источниках питания,
учитывается оптическое вращение молочной кислоты и т. д. При
определении того или иного организма часто нет общих правил и
критериев, нет общих положений о мере сходства организмов,
а единая точка зрения является, как заметил Девис (J. G. Davis,
1960), скорее исключением, чем правилом.
Ввиду широкого распространения молочнокислых бактерий в
природе и участия их при получении или в порче многих пищевых
продуктов, исследователи часто, не подходя к классификации мо-
лочнокислых палочек или кокков в целом, пытались создать част-
ные классификации, например, молочнокислых бактерий молока,
пива, вина, кишечного тракта насекомых и т. д. При создании этих
классификаций авторы пользовались определенными методами
изучения свойств бактерий, создавали свою номенклатуру и не пы-
тались установить тождественность найденных ими видов организ-
мам, обитающим в иных источниках. Так, в течение многих лет
молочнокислые бактерии молока и сыра, исследовавшиеся работ-
никами молочной промышленности, считались совершенно отлич-
ными от тех, что обитали в кишечнике и ротовой полости и изу-
чались медицинскими бактериологами. Имелась тенденция связы-
вать вид с источником его обитания; например, все молочнокислые
палочковидные бактерии ротовой полости считались вариантами
L. acidophilus, а отличия в признаках найденных штаммов рас-
сматривались как присущие вариантам вида (Sharpe, 1962).
Со временем стало выясняться, что один и тот же вид молоч-
нокислых бактерий (например, L. casei или L. plantarum) широко
распространен в различных молочных продуктах, силосе, ротовой
полости и т. д. Стали проводиться сравнительные исследования
большого числа штаммов, выделенных из самых разнообразных ис-
точников, с привлечением большого набора признаков. При этом
особое внимание стало уделяться поискам признаков устойчивых,
104
отчетливо выраженных и коррелирующих друг с другом (напри-
мер, форма клеток и колоний, оптическое вращение молочной кис-
лоты, наличие в клеточных стенках бактерий диаминопимелиновой
кислоты, рост в присутствии различных соединений — 0,4% тауро-
холата и т. д.) (Abo-Elnaga, Kandler, 1965а).
У молочнокислых бактерий стали изучаться серологические
свойства, потребности в витаминах и аминокислотах, состав кле-
точных стенок, особенности инфракрасных спектров поглощения,
присутствие в клетке специфических свободных аминокислот, по-
липептидов и иных химических компонентов. Привлечение для ха-
рактеристики штаммов большого числа признаков дало возмож-
ность выбрать среди них наиболее устойчивые, установить корре-
ляцию одних свойств с другими и на основании этого в значитель-
ной степени усовершенствовать классификацию и идентификацию
как кокковых, так и палочковидных молочнокислых бактерий.
Опубликовано ряд работ, характеризующих различных пред-
ставителей группы молочнокислых бактерий, а также схем для
дифференциации отдельных видов.
В 1900 г. Бейеринк (Beijerinck, цит. Breed et al., 1957) предло-
жил название Lactobacter для обозначения рода, включающего
молочнокислые палочки и кокки, а затем первые отнес к роду
Lactobacillus, а вторые — к Lactococcus. Орла-Иенсен (Orla-Jensen,
1921) объединил эти микроорганизмы в одно семейство Lacto-
bacteriaceae. Лёнис (Loehnis, 1910) создал схему классификации
молочнокислых бактерий, где он распределил все известные к тому
времени виды (среди них Streptococcus pyogenes, Str. mastiti-
dis и др.) в четыре группы. В центре каждой группы стоял типич-
ный вид, название которого принималось за название всей группы.
В настоящее время схема Лёниса представляет лишь исторический
интерес.
Первым крупным и выдающимся трудом, посвященным молоч-
нокислым бактериям, на котором основывается большинство со-
временных классификаций этой группы микроорганизмов, явилась
монография Орла-Иенсена (Orla-Jensen, 1919, 1942). Автор делит
бактерии на две основные группы: А — истинные (не образуют
каталазы, не восстанавливают нитраты в нитриты и не растут на
поверхности питательных сред) и Б — ложные (обладают ука-
занными свойствами).
Группа А включает кокковые и палочковидные формы. Кок-
ковые объединяются в роды Streptococcus и Betacoccus, различаю-
щиеся по вращению молочной кислоты (право- и левовращаю-
щая соответственно). Род Steptococcus разделяется Орла-Иенсе-
ном на группы по количеству клеток в цепочке. Внутри группы
виды различаются по отношению к сахарам, температурным точ-
кам роста, расщеплению казеина. Род Betacoccus включает два
вида, различия между которыми основаны на сбраживании пен-
гоз.
Молочнокислые палочки (группа А) автор делит на три ро-
105
да — Thermobacterium, Streptobacterim и Betabacterium. Два пер-
вых рода включают гомоферментативные бактерии, различающие-
ся по температурным точкам роста, третий — гетероферментатив-
ные. В последних схемах классификации молочнокислых бактерий
эти родовые названия приняты (как названия подродов). Отнесе-
ние микроорганизмов к указанным таксонам, основанное на легко
устанавливаемых в лаборатории и устойчивых признаках, об-
легчает задачу определения выделяемых штаммов молочнокислых
палочек.
Анализируя схему определения видов по Орла-Иенсену, убеж-
даемся, что в основу ее положен признак сбраживания источни-
ков углерода. Сам автор понимал ненадежность этого теста и ука-
зывал, что сбраживание тех или иных субстратов зависит, в част-
ности, от количества и качества доступных форм азота. Вот
почему Орла-Иенсен так настоятельно рекомендовал изучать
сбраживание субстратов на средах с лучшим и неудовлетворитель-
ным источником азота, ибо только в таком случае можно получить
отчетливую картину ферментативной активности бактерий.
Орла-Иенсен считал, что количество образованной молочной
кислоты в молоке и ее оптическое вращение имеют важное систе-
матическое значение, хотя и подвержены изменениям. Система-
тическими признаками Орла-Иенсен называл минимальную, оп-
тимальную и максимальную температуры роста, а также способ-
ность к выживанию бактерий после нагревания их в течение, на-
пример, 30 мин. при 65°. Однако нужно иметь ввиду, что в то вре-
мя как оптимум роста почти не зависит от того, на какой среде
культивируется организм, максимальные и минимальные темпе-
ратуры роста молочнокислых бактерий определяются, в известной
мере, присутствующим в среде источником азота.
Поскольку свойства, положенные Орла-Иенсеном в основу оп-
ределения видов, широко используются в настоящее время, мы
позволим себе более подробно остановиться на их таксономической
значимости, учитывая новые данные, полученные после его работ.
В отношении стойкости сбраживания отдельных углеводов
мнения исследователей расходятся. Рогоза с сотрудниками (Ro-
gosa et al., 1953) отметили стойкое сохранение способности фер-
ментировать источники углерода молочнокислыми бактериями
ротовой полости при испытании их на протяжении многих лет.
Причем, культуры сохранялись на разных средах в холодильнике
на протяжении различного времени. Изменения наблюдались
только при сбраживании тех субстратов, которые вообще фермен-
тировались медленно и слабо. Рогоза и другие считают, что боль-
шая изменчивость способности сбраживать пентозы объясняется
изменением самого индикатора в незасеянной среде, что особенно
наблюдается в случае автоклавирования сред, содержащих пен-
тозы. В связи с этим сбраживание углеводов и спиртов лучше учи-
тывать, определяя кислотность среды после выращивания на ней
молочнокислых бактерий.
106
По мнению Або-Элнага и Канцлера (Abo-Elnaga, Kandler,
1965а), для превращения молочнокислыми бактериями олигосаха-
ридов, например, дисахаридов или глюкозидов (салицин, эскулин)
в моносахариды необходимы определенные ферменты, которые у
молочнокислых бактерий подвержены частым мутациям. В то же
время способность сбраживать пентозы является более стабиль-
ным свойством, хотя часто и адаптивным. По мнению авторов,
только способность сбраживать пептозы может быть положена в
основу дифференциации организмов (установление разновидно-
стей) .
Подобно Орла-Иенсену, Або-Элнага и Канцлер отмечают из-
менчивость таких признаков как температурные точки роста,
а также способность роста и накопления кислоты в молоке (рост в
нем может обусловливаться как отсутствием способности сбра-
живать лактозу, так и потребностью штаммов в определенных фак-
торах роста, что устанавливается добавлением в молоко глюкозы
или дрожжевого автолизата). Авторы указывают, что для клас-
сификации молочнокислых бактерий очень важен признак кон-
фигурации молочной кислоты, мутационное изменение которого,
теоретически хотя и возможное, не было установлено. Або-Элнага
и Канцлер обнаружили, что оптическое вращение молочной кис-
лоты определяется только штаммом, но не средой выращивания
организма (например, молоко, бульон МРС и т. д.); поэтому фор-
мы, отличающиеся по оптическому вращению молочной кислоты,
рассматриваются как подвиды.
После работ Орла-Иенсена появился ряд новых классификаций
молрчнокислых бактерий, среди которых мы отметим только не-
которые.
С. А. Королев (1932) высказал ряд положений о принципах
классификации бактерий вообще. Так, он считал, что 1) реальное
разграничение видов и родов (дробление их) должно базировать-
ся не на каких-либо логических, хотя бы и весьма стройных схе-
мах, а прежде всего, на реальной возможности определенно и точ-
но находить установленные границы в природе; 2) выбор призна-
ков для составления характеристик должен основываться не на
логических построениях, а на реальной выпуклости, постоянстве
и определенности признаков; 3) критерием важности признаков
при их отборе следует признать их фактическую связанность меж-
ду собой.
В отношении последнего пункта следует отметить, что в настоя-
щее время ряд видов молочнокислых бактерий идентифицируется
именно по взаимосвязанным, коррелирующим друг с другом,
признакам. Так, у некоторых молочнокислых палочек зернистость
протоплазмы клетки, как правило, сопровождается высоким
температурным оптимумом роста, значительным кислотонакоп-
лением, шероховатой формой колоний. У гетерофермента-
тивных палочек сбраживание определенных углеводов коррелиру-
ет с оптимальной температурой роста (L. fermenti, L. brevis); у
107
разновидности L. casei var. rhamnosus способность расти при 45°
согласуется со сбраживанием рамнозы, характерной изогнутой
формой клеток, особенностями антигенного состава. Таких приме-
ров можно было бы привести очень много.
Предлагаемая С. А. Королевым «Практическая схема класси-
фикации» молочнокислых бактерий является, по существу, схе-
мой Лениса с внесением ряда поправок и изменений.
Девис (J. G. Davis, 1955, I960), изучая способность к дыханию
и брожению покоящихся клеток молочнокислых палочковидных и
кокковых форм, разделил их по этим признакам на три группы.
В первую группу автор включил сапрофитные организмы (Str.
lactis, Str. cremoris, Str. bovis, Str. thermophilus); во вторую груп-
пу объединил подгруппы Str. pyogenes, Str. salivarius-viridans, Str.
faecalis и Str. 1 iquefaciens; третья группа представлена гетеро-
ферментативными стрептококками (Str. mesenteroides, Str. dextra-
nicus, Str. citrovorus). Установленные три группы молочнокислых
палочек идентичны трем родам, предложенным Орла-Иенсеном.
Поскольку практически все классификационные схемы осно-
ваны на данных изучения биохимических особенностей растущих
культур в сложной среде, схема Девиса, в основу которой кладут-
ся особенности дыхания и брожения покоящихся клеток, пред-
ставляет интерес, тем более, что группы, установленные им, соот-
ветствуют группировкам Орла-Иенсена (Orla-Jensen, 1919), Шер-
мена (Sherman, 1937, 1938).
В «Определителе бактерий и актиномицетов» Н. А. Красиль-
никова (1949) нет семейства молочнокислых бактерий. Молочно-
кислые палочки отнесены к семейству Mycobacteriaceae Chester,
роду Lactobacterium Beijerinck, кокковые — к семейству Сосса-
ceae Zopf, роду Streptococcus Billroth. С практической точки зре-
ния идентификации видов молочнокислых бактерий определитель
устарел и в настоящее время пользоваться им невозможно.
Одним из крупных исследований, где имеется разработка
классификации как палочковидных, так и кокковых форм, являет-
ся седьмое издание определителя Берджи (Breed et al., 1957). Мо-
лочнокислые бактерии объединены в семейство Lactobacillaceae
Winslow et al., 1917, которое делится на трибы Lactobacilleae Wins-
low et al., 1920 (род Lactobacillus) и Streptococceae Trevisan, 1889
(роды Streptococcus, Pediococcus и Leuconostoc).
Характеристика этих родов будет дана нами в специальных
разделах.
В заключение заметим, что в настоящее время еще не раз-
работана общепринятая систематика молочнокислых бактерий,
которая отражала бы родственные, филогенетические взаимо-
отношения между отдельными группами молочнокислых бактерий.
Следует подчеркнуть, однако, что за последние годы были
сделаны значительные успехи не только в области разработки
методов, используемых для выявления свойств бактерий, но пред-
приняты шаги и в направлении поисков доказательств существо-
108
вания родства между видами отдельных родов молочнокислых
бактерий, а также между этими микроорганизмами и представи-
телями иных семейств. Последнее основывается на использовании
таких подходов, как изучение тонкой структуры клетки (в част-
ности, цитоплазматических мембранных систем), химического
состава клеточных стенок, метаболических путей и продуктов
метаболизма, содержания нуклеотидных оснований ДНК, гомоло-
гии ДНК, сравнительной химии ферментов, обладающих идентич-
ными функциями и др.
Особенно широкое применение указанные методы нашли при
разработке родовой и видовой диагностики лактобацилл. На этих
вопросах мы подробно остановимся в последующих разделах.
Там же приведем ряд практических систем, которые рекомендуем
использовать в повседневной работе, связанной с определением
лактобацилл и кокковых форм (стрептококков, лейконостоков
и педиококков).
Род Lactobacillus
Род Lactobacillus объединяет палочковидные, неветвящиеся
бактерии, которые, помимо свойств, общих для семейства молочно-
кислых бактерий Lactobacillaceae, характеризуются сложными по-
требностями в источниках питания, слабой дыхательной активно-
стью, незначительным воздействием на белки и жиры. Для них
благоприятны анаэробные или микроаэрофильные условия культи-
вирования, они относительно кислотоустойчивы, лучше всего ра-
стут при pH 5,5. Физиологически они близки к роду Streptococcus,
отличаясь от него главным образом формой клеток, активностью ро-
ста, способностью расти в средах с более низким pH (3,8 и ниже),
чувствительностью к неблагоприятным условиям, особенно к из-
бытку кислорода (J. G. Davis, 1960)
В определителе Берджи (Breed et al., 1957) лактобациллы не
разделяются на роды, включающие гомо- или гетероферментатив-
ные организмы, как это сделано для кокков. Гомоферментативные
палочки отнесены к подроду Lactobacillus Beijerinck, 1901, а гете-
роферментативные —к подроду Saccharobacillus van Laer, 1892.
Виды определяются по признакам: оптическое вращение молочной
кислоты, оптимальная температура роста, сбраживание углеводов.
При этом идентификация ряда видов крайне затруднительна. Так,
для L. acidophilus и L. helveticus не дано никаких отличительных
признаков, кроме того, что они микроаэрофилы и образуют неактив-
ную или правовращающую молочную кислоту. Неудовлетво-
рительно разграничение видов L. casei и L. plantarum; неоправдан-
но отнесение L. leichmannii к гомоферментативным палочкам с
низким температурным оптимумом роста. Ряд положений опреде-
лителя Берджи сейчас рассматривается иначе (например, вычле-
нение Lactobacillus bifidus из рода Lactobacillus и т. д.)
В настоящее время Юридическая комиссия Международного
комитета по систематике бактерий приняла решение сохранить для
109
молочнокислых палочковидных бактерий родовое название Lacto-
bacillus Beijerinck, 1901 вместо Saccharobacillus van Laer, 1892 и
синонимов. Типовым видом этого рода признан Lactobacillus del-
brueckii Beijerinck, 1901. Неотипом его следует считать ATGC 1 9649
(NCDO 2 213). Видовое название Lactobacillus caucasicus Beijerinck,
1901 помещается в список отклоненных названий (Hansen, 1971а).
Определение видов гетероферментативных палочковидных мо-
лочнокислых бактерий в определителе Берджи основано на иссле-
довании Педерсона (Pederson, 1938), явившемся продолжением
работ Орла-Иенсена по изучению бетабактерий. Педерсон исследо-
вал свыше 300 штаммов и предложил схему идентификации гете-
роферментативных лактобацилл. Автор отметил, что она не долж-
на строиться на признаках: морфология, рост в присутствии опре-
деленных концентраций NaCl, pH, характер роста в молоке. Боль-
шое внимание следует уделять признаку оптимальных ростовых
температур. Группируя гетероферментативные палочки по этому
признаку, автор наблюдал, что температурные точки роста бакте-
рий коррелировали с другими их признаками, в частности, со сбра-
живанием сахаров (арабинозы, лактозы, сахарозы, раффинозы).
Арабинозо-сбраживающая группа с оптимумом роста 30—35°
включала L. brevis (для него приводится много синонимов, напри-
мер, L. pentoaceticus, L. lycopersici, Bacillus panis fermentati, В. bras-
sicae fermentati и т. д.). Вид L. fermentum (синонимы Betabacterium
longum, Bacterium gayonii, Bact. intermedium) находился в араби-
нозо-не сбраживающей группе с оптимумом роста 35—40°. Штам-
мы с более широкими температурными границами роста и большой
ферментативной активностью были обозначены как L. buchneri.
Классификацией Педерсона широко пользуются, хотя и с не-
которыми изменениями. Так, по данным ряда авторов, сбражива-
ние L. brevis и L. fermenti сахаров (лактозы, раффинозы, сахарозы,
маннозы), а также способность расти при 15 и 45° не являются
постоянными признаками (Briggs, 1953b; Rogosa et al., 1953;
G. H. G. Davis, 1955, 1959a; Rogosa, Sharpe, 1959; Keddie, 1959;
Smith, Cunningham, 1962).
Касаясь идентификации бактерий рода Lactobacillus в целом,
укажем и на ряд некоторых других исследований.
Попыткой идентификации бактерий рода была работа Титслера
с сотрудниками (Tittsler et al., 1947). У 250 штаммов они изучили
морфологические и культуральные особенности, количество кисло-
ты, накапливаемой при росте бактерий в молоке, оптическое вра-
щение молочной кислоты, температурные точки роста, устойчи-
вость к NaCl, сбраживание 24 источников углерода, разжижение
желатина, образование газа из глюкозы, аммиака из аргинина. Ав-
торы сделали вывод о том, что признак сбраживания отдельных
углеводов может быть успешно применен для идентификации ви-
дов рода.
1 АТСС — Американская коллекция типовых культур, США;
2 NCDO — Национальная коллекция молочных организмов, Англия.
ПО
Рогоза с соавторами (Rogosa et al., 1953) применили указан-
ные выше признаки для диагностирования штаммов лактобацилл,
выделенных из ротовой полости. Кроме свойств, упитываемых Тит-
слером с сотрудниками, исследователи изучали гидролиз гиппуро-
вокислого натрия и эскулина. Было описано два новых вида —
Lactobacillus salivarius nov. sp. и L. cellobiosus nov. sp. Авторы отме-1
тили, что молочнокислые бактерии ротовой полости принадлежали
к видам, широко распространенным в природе (L. acidophilus,
L. casei, L. plantarum, L. brevis, L. fermenti, L. buchneri).
Бригс (Briggs, 1953b) поставила задачей найти простые и вме-
сте с тем устойчивые признаки, по которым можно было бы клас-
сифицировать лактобациллы. Она предложила специальную среду,
обеспечивающую хороший рост молочнокислых бактерий (Briggs,
1953а),— бульон с томатным соком, глюкозой и твином 80. Иссле-
дованные штаммы она сгруппировала в 8 групп на основе физио-
логических признаков: образование газа из глюкозы и лимонной
кислоты; аммиака из аргинина; рост при 15, 45 и 48°; рост после
прогрева при 60 и 65° в течение 30 мин.; рост в среде с 4, 6 и
8% NaCl.
Бригс указывает, что культуральные и морфологические приз-
наки, а также особенности сбраживания углеводов не коррелиру-
ют с физиологическими свойствами, положенными ею в основу раз-
деления молочнокислых палочек на группы. Однако автор считает,
что для подразделения организмов внутри группы названные
признаки могут быть полезны.
Кундрат (Kundrat, 1958) в предложенной им схеме вычленяет
сравнительно небольшое число видов подродов Thermobacterium,
Streptobacterium и Betabacterium, причем эти подроды различаются
по бродильной способности. Thermobacterium не сбраживают ме-
либиозу, целлобиозу, салицин и эскулин. Газа из глюкозы не обра-
зуют. Streptobacterium всегда сбраживают целлобиозу, салицин и
эскулин. Так же, как и предыдущий подрод, не образуют газа из
глюкозы. Betabacterium не сбраживают трегалозу, целлобиозу, са-
лицин и эскулин, газ из глюкозы образуют. Для определения видов
автор предлагает использовать отношение бактерий к углеводам,
температурные точки роста, летальную температуру, способность
развиваться при 2, 4, 6, и 8 % NaCl, образование газа из глюкозы
и отношение бактерий к таурохолату (натриевая соль таурохоле-
вой кислоты).
Следует заметить, однако, что мы не разделяем точки зрения
Кундрата, придающего, как и ряд иных исследователей (Briggs,
1953b; Wheater, 1955а, b), большое диагностическое значение тако-
му признаку, как стойкость к хлористому натрию.
Проведенное нами сравнительное экологическое изучение
штаммов, выделенных в различных эколого-географических зонах
из пресных и засоленных почв, показало, что этот признак подвер-
жен изменчивости. Наблюдается определенная адаптация молоч-
нокислых бактерий к развитию при высокой концентрации соли.
111
Таблица 9
Отличительные признаки подродов рода Lactobacillus
Так, мы нередко выделяли штаммы (в частности, из окультурен-
ных и засоленных почв Голодной степи), очень близкие по всем
признакам и явно принадлежащие к одному виду, но значительно
различающиеся по солеустойчивости. Как нами было показано,
L. plantarum, изолированный с поверхности листьев тростника, рос
при 6,5 % NaCl, а представители этого же вида, выделенные из
мясных рассолов — при 20 %. С другой стороны, различные виды в
одних и тех же условиях (L. casei и L. plantarum, выделенные из
Т а’б л и ц а 10
Отличительные признаки видов подрода Streptobacterium Orla-Jensen*
Виды Lactobacillus Рост при Кислота в моло- ке, % Конфигурация молочной кис- лоты Рост в среде с 0,4% типола
о ю чм
L. casei var. casei + ± 1.2—1,5 М+) —
L. casei var. rhamnosus + + 1,2—1,5 L(+) —
L. casei var. alactosus + — 0 L (+) —
L. plantarum + ± 0,3—1,2 DL +
* Все гидролизуют эскулин, сбраживают амигдалин, целлобиозу, галактозу, фрук-
тозу, мальтозу, (L. casei медленно), маннит, маннозу, мелецитозу (большинство L. plan-
tar um), салицин, трегалозу. Некоторые сбраживают декстрин, дульцит, а-метил-
D-глюкозид, адонит (вариабельные и слабые реакции у L. casei), инулин, инозит, а ряд
штаммов L. plantarum ферментирует а-метил-О-маннозид. Ни один не сбраживает
112
сыра) одинаково хорошо растут, например, при наличии 12% NaCl
(Smith, Cunningham, 1962).
Девис (G. Н. G. Davis, 1959a) предлагает упрощенную схему
идентификации некоторых видов молочнокислых палочек, в кото-
рой морфологические и культуральные признаки являются ключе-
выми. Мы не приводим эту схему, так как ряд положений ее тре-
бует пересмотра. Разработанные автором ключи можно использо-
вать лишь для предварительного определения видов лактобацилл.
Одним из недавних руководств, предложенных для идентифи-
кации видов молочнокислых палочковидных бактерий, явилась
схема Рогозы и Шарп (Rogosa, Sharpe, 1959). Авторы учитывали
ряд коррелирующих между собой признаков, в частности, данные,
полученные с помощью серологических методов, а также потреб-
ность бактерий в витаминах. Рогоза и Шарп делят род Lactobacil-
lus на три подрода, соответствующие родам Орла-Иенсена — Ther-
mobacterium, Streptobacterium и Betabacterium, и полагают, что
существующие различия между ними дают основания для такого
подразделения. Впоследствии эти же авторы (Sharpe et al., 1966;
Rogosa, 1970) несколько дополнили их схему идентификации лак-
тобацилл и рекомендовали набор тестов для дифференциации
подродов лактобацилл (табл. 9) (Rogosa, 1970).
По мнению Девиса (J. G. Davis, 1960), указанный определи-
тель молочнокислых палочек является наиболее удовлетворитель-
ным из всех предложенных. В табл. 10—12 мы приводим схему
идентификации видов молочнокислых палочковидных бактерий
по Рогозе и Шарп (Rogosa, Sharpe, 1959; Sharpe et al., 1966; Rogo-
sa, 1970), дополненную данными о процентном содержании гуани-
на-рцитозина в ДНК молочнокислых бактерий (Gasser, 1970).
(по Rogosa, Sharpe, 1959; Sharpe et al., 1966; Gasser, 1970; Rogosa, 1970)
Сбраживание Серологическая группа Потребность в** Содержание Г+П в ДНК, мол.%
арабинозы 1 инулина । лактозы мелибиозы раффинозы рамнозы сорбозы сахарозы ксилозы сорбита 1 пиридоксале рибофлавине фолиевой кислоте
— + — — — ± — ± в, с + + +
— — + — — + ± *** — + с + + + рб,4±0,8
— т — — — — ± + — ± В,G + +
± т + + + **♦ — + ± ± D — — — 45,0±1,0
эритит, гликоген, крахмал; ± большинство сбраживает (или растет); Ч- подавляющее
большинство не сбраживает.
** Плюс — требуют, минус — не требуют;
»•* По Рогозе (Rogosa, 1970), все разновидности L. easel сбраживают сахарозу мед-
ленно и большинство L. plantarum не ферментирует рамнозу.
**** Большинство попадает в группу В.
ИЗ
Таблица 11
Отличительные признаки видов подрода Betabacterium Orla-Jensen* * (по Rogosa, Sharpe, 1959; Sharpe et al., 1966;
Gasser, 1970; Rogosa, 1970)
Виды Lactobacillus Форма колоний Рост при 15° Рост при 45° Гидролиз эскулина Рост в среде с 4% типола Образование NH3 из аргинина Сбраживание Серологическая группа Потребность Содержание Г - Ц в ДНК, мол.%
амигдалина 1 галактозы арабинозы лактозы целлобиозы I мелецитозы а-метил- D-глюкозида мелибиозы раффинозы сахарозы трегалозы маннозы *** ксилозы 1 ' рибофлавине пиридоксале фолиевой кислоте
L. fermenti R — + + + + — +(96 %) С (4%) — ± — — 4- ± + ± ± ± — F — — — 53,4 + 0,5
L. buchneri R + ± ± + + — + + ± — + + + + + — — ± Е ± — — 44,8±1,1
L. brevis R + — + + — +(40%) С (60%) + — — ± + — ± — — + Е — — + 42,7 + 1,5 46,4+1,0
L. cellobiosus RDC + + + + + + — ± + — — + + + + ± ± X — — — 53,1+0,8
L. viridescens R + — — + — — — — — — — — ± ± + — X + — — 42,3; 35,7
* Ни один штамм не сбраживает адонит, амигдалин, декстрин,
дульцит, эритрит, глицерин, гликоген, инозит, инулин, рамнозу,
сорбит, сорбозу, крахмал, а-метил-П-маннозид. Маннит не сбра-
живают L. ferment!, иногда слабо ферментируют другие виды.
Салицин редко и слабо сбраживают L. brevis и L. cellobiosus.
Все ферментируют глюкозу, фруктозу, мальтозу, образуют DL-mo-
лочную кислоту и до 45—50% летучих кислот из глюкозы; не
требуют тиамин.
** ± вариабельный результат.
**» По данным Рогозы (Rogosa, 1970), сбраживается 67% L. fer-
ment!, иногда слабо L. cellobiosus, но не другими видами; X —
нет групповых антисывороток; С —слабо; R — шероховатая;
RDC — шероховатая, пышкоподобная или в виде цветной капусты.
Определителем Рогозы и Шарп широко пользуются в настоящее
время, хотя появляются новые данные, которые обязательно сле-
дует учитывать в работе по идентификации молочнокислых пало-
чек. Это касается, в частности, критериев дифференциации видов
L. bulgaricus, L. helveticus и L. jugurti, свойства которых изучали
некоторые авторы (de Маи, 1956; Hansen, 1965, и др.). Так, Гансен
(Hansen, 1965) исследовала штаммы, выделенные из йогурта во-
сточных европейских стран (СССР, Греция), и установила, что
там обнаруживаются не сбраживающие мальтозу лактобациллы, об-
разующие как левовращающую D (—), так и неактивную (DL)
молочную кислоту (соответственно вид L. bulgaricus и L. jugurti).
Гансен полагает, что отличия между L. helveticus и L. jugurti
(отношение к мальтозе) недостаточны для отнесения их к различ-
ным видам. Следует также иметь ввиду, что под влиянием ультра-
фиолетового облучения можно получить мутанты L. helveticus, не
сбраживающие мальтозу, и, таким образом, не отличимые от L. ju-
gurti (Hansen, 1971b). Гансен (Hansen,1965) предлагает считать
их одним видом — L. helveticus. К такому же выводу пришел и Де
Ман (de Маи, 1956), считавший необходимым виды Thermobacte-
rium jugurt (синонимом Thermobacterium jugurt Orla-Jensen, 1919
является Lactobacillus jugurti Rogosa and Sharpe, 1959) и Tbm. hel-
veticum объединить в один вид — Tbm. helveticum (Orla-Jensen,
emend.). Данные Рогозы с сотрудниками (Rogosa et al., 1961) так-
же показали, что эти организмы идентичны по потребностям в ви-
таминах и что их имеет смысл объединить под названием Lactoba-
cillus helveticus.
В отношении стрептобактерий (подрод Streptobacterium) су-
щественный и несомненный интерес представляют данные Або-
Элнага и Канцлера (Abo-Elnaga, Kandler, 1965а), на которых мы
считаем необходимым остановиться более подробно.
Авторы утверждают, что при определении молочнокислых бак-
терий, в частности, стрептобактерий, должны использоваться мор-
фологические признаки. Особо следует учитывать извитые, груше-
видные, кольцеподобные формы, привлекая для изучения морфо-
логии электронную микроскопию. Або-Элнага и Канцлер свое
мнение относительно таксономической значимости морфологиче-
ских свойств основывают на утверждении, что мутационные пре-
вращения одних форм в другие случаются крайне редко, но посто-
янное применение питательной среды (повышенное содержание
соли, антибиотики) может привести к генетически закрепленным
морфологическим изменениям формы клеток.
Або-Элнага и Кандлер (Abo-Elnaga, Kandler, 1965а), кладя в
основу видовой дифференциации гомоферментативных мезофиль-
ных палочковидных бактерий морфологию клеток, коррелирую-
щую с рядом иных свойств (наличием в клеточной стенке диами-
нопимелиновой кислоты — ДПК, оптическим вращением молоч-
ной кислоты, сбраживанием ряда субстратов и др.), предложили
два новых вида — Lactobacillus coryniformis и L. curvatus, а так-
115
Таблица 12
Отличительные признаки видов подрода Th'ermobacterium Orla-Jensen*
Виды Наличие гранул Рост при 15° Рост при 45° Кислоты в моло- ке, % Конфигурация молочной кис- лоты Образование NH3 из аргинина Гидролиз эскулина
L. helveticus — — + 2,75 — —
L. jugurti — — ± 2,75 DL — —
L. bulgaricus + — + 1,7 D(-) —
L. lactis 4- — + 1,75 D(-) — —
L. acidophilus — — ± 0,3-1,9 DL — +
L. leichmannii — + 0-0,1 D(-) ± +
L. delbrueckii — — + 0-0,05 D(-) ± —
L. salivarius var. salivarius — 1 ** 0,9 L(+)hDL — —
L. salivarius var. salicinicus — — + 0,9 L(+)nDL — +
* С — значительно стимулирует. Аммиак из аргинина могут образовывать только
L. leichmannii и L. delbrueckii. Ни один не сбраживает адонит, арабинозу, дульцит,
эритрит, глицерин, инозит, инулин, мелецитозу, сорбозу, крахмал, ксилозу, а-метил-
D-глюкозид, а-метип-Е-маннозид. L. helveticus и L. jugurti варьируют или слабо сбра-
живают фруктозу, эти виды и L. bulgaricus также относятся к маннозе. L. leichmannll
сбраживает декстрин, слабо сбраживают его L. acidophilus, L. delbrueckii. Некоторые
же обратили внимание на то, что изогнутость клеток и кольцеоб-
разование встречаются у представителей L. casei, но не у L. plan-
tarum. В табл. 13 мы приводим свойства видов стрептобактерий
по Або-Элнага и Кандлеру.
Из 534 штаммов, выделенных авторами из сырого, пастеризо-
ванного и кислого молока, сыра, доильных машин, воздуха доиль-
ных помещений, силоса, навоза, кислого теста, 204 штамма имели
в клеточных стенках ДПК, образовывали оптически неактивную
молочную кислот^, росли в среде с 4% таурохолата, расщепляли
эскулин, почти все сбраживали раффинозу и мелибиозу и по
этим свойствам относились к L. plantarum (Orla-Jensen, 1919,
1942; Fred et al., 1921; Pederson, 1963; Tittsler et al., 1947; Rogosa
et al., 1953; Wheater, 1955b; Kundrat, 1958; Rogosa, Sharpe, 1959;
Lerche, Reuter, 1962). В свою очередь, вид был разбит на две раз-
новидности на основании способности организмов сбраживать ара-
бинозу— Lactobacillus plantarum var. plantarum и L. plantarum
var. arabinosus. Ряд штаммов первой разновидности обнаруживал
отклонение от типичных признаков L. plantarum — одни не сбра-
живали сорбит; другие (редко) и декстрин, сахарозу, раффинозу,
мелибиозу. Иногда выделялись штаммы, сбраживающие только
116
(no Rogosa, Sharpe, 1959; Sharpe et al., 1966; Gasser, 1970; Rogosa, 1970)
Потребность в
««
и
®я
Йя
etiss
&+«
л 1 о
А
А
Е
Е
X
X
X
G
G
+ 4- — — — 39,3
+ + — — — 39,0±0,9
+ — — — — 50,3±1,0
+ — — ± — 50,3±1,4
+ — + ± — 36,7±0,7
— — + 4-или G — 50,8±0,5
+ — — — 4- 50,0
+ — 4- — — 34,7±1,4
+ — 4- — — 34,7±1,4
L. acidophilus сбраживают гликоген. L. delbrueckii варьирует или слабо сбраживает
маннозу.
** По Рогозе (Rogosa, 1970), только большинство штаммов разновидностей L. sali-
varius растет при 45° и все не сбраживают амигдалин; L. delbrueckii не сбраживает
галактозу; L. lactis иногда гидролизует эскулин.
лактозу. Представители второй разновидности также имели не-
характерные свойства — не сбраживали сорбит или сахарозу и
декстрин. Таким образом, характерными чертами L. plantarum, но
не L. casei являются наличие в клеточных стенках ДПК, образо-
вание DL-молочной кислоты и рост в присутствии 4% таурохола-
та. Сбраживание раффинозы и мелибиозы — менее надежные приз-
наки для разграничения этих видов.
Остальные 337 штаммов, не содержащие ДПК, Або-Элнага и
Кандлер причислили к L. casei с разновидностями и двум новым
видам, характеризовавшимся необычной морфологией клеток.
Штаммы, образующие клетки, напоминающие коринеподобные
бактерии (грушевидные, изогнутые), были отнесены к Lactobacillus
coryniformis nov. sp. с двумя разновидностями. Штаммы с кольце-
подобными клетками назвали Lactobacillus curvatus (Troili-Peters-
son) nov. comb.
Представители разновидности L. coryniformis nov. sp. ssp. co-
ryniformis (см. табл. 13) иногда сбраживали раффинозу, мелиби-
озу, декстрин; большинство не росло в молоке и не сбраживало
лактозу; отдельные штаммы росли при 45°. Молочнокислые бакте-
рии с характерной грушевидной формой обнаруживали и другие
117
Таблица 13 Свойства видов подрода Streptobacterium (по Abo-Elnaga, Kandler, 1965а)*
со
Виды Lactobacillus 1 Наличие ДПК Конфигурация молочной кисло- ты Устойчивость к нагреванию при 72° Температурный оптимум, °C Рост в присут- ствии 4% тауро- холата Рост в молоке с лакмусом Сбраживание Морфология
рамнозы арабинозы сорбита маннита | раффинозы | мелибиозы 1 1 сахарозы! 3 ео О Е- § лактозы декстрина салицина эскулина |
L. plantarum
ssp. plantarum + DL 30—37 + + (±) + + + + + + + + + Палочки от коротких до сред- них, одиночные, парами, иног- да в коротких цепочках
ssp. arabinosus L. coryniformis + DL — 30-37 + + — + (±) + + + + + + + + + То же
ssp. coryniformis DL 30-37 (±) (±) <±) + (Т) (+) + Палочки от коротких до сред- них, грушеподобной формы, одиночные или парами
ssp. torquens D(-) 30-37 + — + + + Груше- или кокковидные па- лочки, одиночные, парами, иногда в коротких цепочках
L. curvatus L. casei DL 30-37 (+) — (Т) + (Т) + Средних размеров палочки, бобовидные, часто расположен- ных по две и четыре
ssp. casei — L(+) — 30-37 — + — — (±) + — — + + + (Т) + + Средней длины палочки в длин- ных цепочках
ssp. pseudoplan- tarum — DL — 30—37 — + — — (±) + — — (±) (±) + — + + То же
ssp. rhamnosus — L (+) — 45 — + + + + + — — + (+) + (+) + + Средней длины палочки в очень длинных цепочках
ssp. tolerans — L(+) + 30—37 — + — — — — — — — 1 + — — — То же в клубкообразных це- почках
* (Ч-) — иногда сбраживают или растут; (±) — иногда не сбраживают; (-|-) — сбраживают медленно.
исследователи (Naylor, Sharpe, 1958a; Langston, Bouma, 1960a),
относившие их ранее к группе L. plantarum — L. casei.
По мнению Або-Элнага и Кандлера, вид L. curvatus отвечает
характеристике Bact. curvatum, приведенной впервые Троили-Пе-
терсон (Troili-Petersson, 1903). Представители его — короткие па-
лочки (0,7—0,9X1,0—1,2 мк), всегда изогнутые, образующие
кольца-цепочки, состоящие из четырех клеток (рис. 2,6). Форма
клеток постоянна даже после Многих пассажей бактерий на раз-
личных средах. Иногда обнаруживаются и подвижные формы,
причем авторы обращают особое внимание на это свойство в свя-
зи с тем, что такие бактерии находили и другие исследователи.
Так, Ленгстон и Боума (Langston, Bouma, 1960а) выделили из си-
лоса изогнутые и подвижные молочнокислые бактерии и отнесли
их к L. casei. Каннингхем и Смит (Cunningham, Smith, 1940)
из силоса также изолировали подвижные стрептобактерии, близ-
кие к L. curvatus. Кедди (Keddie, 1959) обнаружил подобные фор-
мы, но, объединив их в один вид, не дал, однако, им названия.
Вид L. curvatus обнаруживается в тех же субстратах, что и
L. plantarum. Обнаружение L. curvatus в навозе является причи-
ной нахождения его в воздухе конюшен и в молоке.
В пределах вида L. casei Або-Элнага и Кандлер различают че-
тыре разновидности. L. casei (Orla-Jensen) Holland ssp. casei обра-
зуют как короткие, так и длинные цепочки. У молодых культур
иногда наблюдаются изогнутые клетки, что приводит (с возра-
стом) к формированию колец, наподобие таковых у L. curvatus.
При росте этой разновидности в бульоне среда остается прозрач-
ной, образуется осадок. Некоторые штаммы растут при 45°; име-
ются штаммы, не растущие в молоке, а для роста некоторых в
этой среде необходим дрожжевой экстракт. Хотя для вида L. casei
не характерен рост в среде с 4% таурохолата, некоторые штаммы
все же в ней растут. Отмечено также несвойственное L. casei сбра-
живание (рядом культур) раффинозы и мелибиозы или только
раффинозы. Большая часть штаммов, аналогично L. plantarum, не
сбраживает сорбит, некоторые не ферментируют и маннит; сбра-
живание арабинозы отмечается очень редко. Таким образом, если
не считать отсутствия в клеточных стенках ДПК и образования
L(+) -кислоты, признаки L. casei, особенно сбраживание углево-
дов, нередко совпадают с таковыми у L. plantarum. L. casei ssp.
casei, иногда выдерживает пастеризацию молока.
L. casei (Orla-Jensen) Holland ssp. pseudoplantarum nov. ssp.
выделяется в разновидность из-за образования оптически неактив-
ной (DL)-молочной кислоты.
L. casei (Orla-Jensen) Holland ssp. rhamnosus Rogosa et al.
морфологически близки к L. casei var. casei, хотя извитые клетки
встречаются несколько чаще. Разновидность характеризуется
сбраживанием арабинозы, рамнозы; оптимум роста при 45°.
L. casei (Orla-Jensen) Holland ssp. tolerans nov. ssp. выделены
119
Таблица 14
Свойства видов гетероферментативных лактобацилл * (по Abo-Elnaga,
Виды Lactobacillus Рост при
So о ю
L. fermenti -J- или ±**
L. brevis + —
L. buchneri + —
L. cellobiosus + —
L. viridescens ssp. viridescens + —
L. viridescens ssp. minor + —
L. coprophilus ssp. coprophilus + —
L. coprophilus ssp. confusus (ATCC 10881) + —
С б р а
। арабинозы 1 сахарозы | мальтозы I лактозы мелибиозы целлобиозы । трегалозы
+ + + 4- или —** (±) —
+ ± + Т ± или 4-** —
+ + + + или ±** + —
+ + + ± + + +
— ± + ± — —
— ± + + — +
+ + + — — +
— + + — +
* (±) как правило, сбраживают; ± — сбраживают или не сбраживают; — как
правило не сбраживают; Р — редукция; G — сквашивание.
из пастеризованного молока. Образуют длинные и узловатые це-
почки. Отдельные палочковидные клетки намного больше, чем у
других разновидностей L. casei (0,9—1,1 XI,0—3,0 мк). Штаммы
этой разновидности характеризуются тем, что сбраживают только
лактозу, они термостойки и обнаруживаются в пастеризованном
молоке.
Поскольку не сбраживающие лактозу штаммы обнаружены у
всех видов стрептобактерий, этот признак Або-Элнага и Канцлер
не берут в основу разграничения разновидностей, рассматривая
ферментирование лактозы наряду со сбраживанием иных сахаров.
Мы уже указывали, что для идентификации стрептобактерий
немецкие исследователи изучали ряд различных свойств, среди
которых были и такие, как устойчивость к 4% таурохолата. Сле-
дует отметить, что и другие авторы использовали для идентифика-
ции устойчивость молочнокислых бактерий к ряду веществ, на-
пример, к желчи (Wheater, 1955а, Ь), типолу (Naylor, Sharpe,
1958а). В последнем случае было показано, что 0,4% типола в
среде МРС угнетает рост L. fermenti, L. casei, но не L. planta-
rum. Очевидно, этот признак может быть использован для иденти-
фикации молочнокислых бактерий наряду с другими свойствами.
Имеются данные о том, что на основании свойства образования
120
Kandler, 1965b; Kandler, Abo-Elnaga, 1966b; Holzapfel, Kandler, 1969)
ж и в а н и е
Гидро-
лиз
(±)
+ или ± **
s
к
я
св
Состав муреина
—или ± **
Слабо
Слабо
4-
Р—
С—
±(6%)
Ала-Глу-Лиз-Асп
(2:1:1:1)
То же
»
Ала-Глу-Орн-Асп
(2 :1:1:1)
Ала-Глу-Лиз-Сер
(4 :1 :1: 1)
То же
Ала-Глу-Лиз
(4:1:1)
Ала-Глу-Лиз
(2,5: 1:1)
+
±
±
±
±
** Эти данные приведены Kandler, Abo-Elnaga, (1966b)
газа из лимонной кислоты (Gibson, Abd-el-Malek, 1945) не пред-
ставляется возможным дифференцировать палочковидные стреп-
тобактерии (Нестеренко, 1966; Keddie, 1959; Abo-Elnaga, Kandler,
1965а).
Дальнейшим развитием исследований Рогозы и Шарп (Rogo-
sa, Sharpe, 1959) явились работы Або-Элнага и Канцлера (Abo-
Elnaga, Kandler, 1965b) по бетабактериям (подрод Betabacterium).
Авторы указывают, что наиболее четко различаются L. brevis и
L. fermenti; остальные же виды дифференцируются один от дру-
гого с трудом.
Або-Элнага и Кандлер выделили до 100 штаммов гетерофер-
ментативных бактерий, среди них — L. fermenti, L. brevis, L. buch-
neri и новый вид — L. corynoides (с подвидом L. corynoides ssp. mi-
nor). Этот подвид был впоследствии отождествлен с разновидно-
стью Lactobacillus viridescens ssp. minor, характеризующейся ак-
тивным сбраживанием олигосахаридов и малыми размерами кле-
ток (Kandler, Abo-Elnaga, 1966а). Позднее авторы описали еще
один новый вид дубинкообразных молочнокислых бактерий —
Lactobacillus coprophilus n. sp. (Kandler, Abo-Elnaga, 1966b) c
разновидностью L. coprophilus ssp. confusus nov. ssp. (Holzapfel,
Kandler, 1969), характеризующейся способностью синтезировать
121
декстран из сахарозы (табл. 14), образовывать перекись и отсут-
ствием способности ферментировать арабинозу. Представитель
этой новой разновидности ранее рассматривался как Leuconostoc
mesenteroides АТСС 10881 (NGDO 1586).
Впоследствии слизеобразующие гетероферментативные бакте-
рии, подобные L. coprophilus ssp. confusus, были более детально
изучены Шарп с сотрудниками (Sharpe et al., 1972). Необходи-
мость такого исследования обусловливалась тем, что исследовате-
ли нередко впадали в ошибку, отождествляя некоторые слизеобра-
зующие короткие палочки, продуцирующие DL-молочную кисло-
ту, газ из глюкозы и аммиак из аргинина, с лейконостоками. Такие
организмы часто изолируются из испорченного сахарного тростни-
ка, овощных соков и т. л.
Шарп с соавторами исследовали коллекцию указанных слизе-
образующих штаммов и сравнили ее с другими, уже известными
слизеобразующими (L. vermiforme, L. viridescens, L. coprophilus
ssp. confusus) и не слизеобразующими (L. cellobiosus) лактоба-
циллами (табл. 15).
Оказалось, что слизеобразующие штаммы, часто отождествляе-
мые с лейконостоками, наряду с музейными штаммами L. copro-
philus ssp. confusus, попадают в одну группу (группа 1), отличаю-
щуюся от всех остальных тем, что ее представители ферментируют
целлобиозу и амигдалин. Образование слизи, неспособность (как
правило) сбраживать трегалозу и раффинозу и стойкое сбражива-
ние салицина и ксилозы помогают дифференцировать их от L. cel-
lobiosus. Следует отметить, что три штамма их группы 1 не гидро-
лизовали аргинин и ферментировали трегалозу, подобно Leuc.
mesenteroides (табл. 15).
Другие слизеобразующие виды — L. vermiforme и L. virides-
cens можно было отличить от группы 1 на основании того, что эти
два вида не образовывали аммиак из аргинина, не гидролизовали
эскулин и не сбраживали мелибиозу, маннозу и салицин (табл. 15).
Интересно отметить, что представители L. vermiforme могли обра-
зовывать слизь и более активно ферментировать углеводы в атмо-
сфере, состоящей из 90% Н2 и 10% СО2.
Изучение химического состава слизи, образуемой гетерофер-
ментативными бактериями группы 1, показало, что это декстран.
Такую же слизь вырабатывают лейконостоки, некоторые L. brevis
(L. pastorianus); другие лактобациллы, изолированные главным об-
разом из пива и сидра, могут продуцировать слизистый гетеропо-
лисахарид иной природы (Dunican, Seeley, 1965). Причем, если у
представителей группы 1 слизеобразование — постоянный приз-
нак, то у других видов (L. pastorianus, L. vermiforme) — это свой-
ство изменчиво.
Исследование NADH-зависимых D(—)-и Ь(-|-)-пируватредук-
таз и NAD-не зависимых D(—)-или Ь(-|-)-лактатдегидрогеназ ме-
тодом электрофореза в геле показало идентичность электрофоре-
тической подвижности этих ферментов у организмов группы 1,
122
Таблица 15
Физиологические признаки слизеобразующих и некоторых других
гетероферментативных видов лактобацилл (по Sharpe et al., 1972)
Признак Группа 1: L. coprophi- lus ssp. con- fusus и Lac- | tobacillus sp. L. vermifor- me L. cellobio- sus NCDO 928 L. brevis NCDO 1749 L. virides- cens L. pastorianus NCIB 8664 L. mesente- roldes
Число штаммов 19 3 1 1 2 1 31
Сбраживание:
КСИЛОЗЫ + + — + — + +(П,5)
арабинозы -(58) * + + + — + +
маннозы + — + •— — — +(97)
галактозы -L 1 ** + + — + +(92)
сахарозы + 1 ** + — + — +
трегалозы —(89,5) — + — + — +
мальтозы + 1 ** + + + + +(92)
целлобиозы + — + — — — +(61,5)
мелибиозы -(74) — + + — + +(81,5)
лактозы —(68,5) — + + — — +(51,5)
раффинозы -(84) — + — .— — +(51,5)
салицина + — + — — -4- +(77,5)
амигдалина 4- — + — — — +(48,5)
Гидролиз аргинина +(84) — + + — + —
Слизь из сахарозы + +(66) ** — — + (50) — +
Гидролиз эскулина + — + + — “b +(92)
Рост при 45° + — + + — — —
Конфигурация молочной DL DL DL DL DL DL D(-)
кислоты
* Цифры в скобках указывают процент позитивных или негативных по данному
признаку штаммов.
** Два штамма позитивны только в анаэробных условиях.
Lactobacillus viridescens и Leuconostoc mesenteroides и существен-
ное отличие их от ферментов L, vermiforme, L. fermenti и L. cello-
biosus.
По мнению Шарп с соавторами (Sharp et al., 1972), штаммы
NCDO 1586, NCIB 1 9311, ATCG 10881 и другие, близкие им пред-
ставители группы 1, следует объединить в один вид и дать ему
название Lactobacillus confusus (Holzapfel and Kandler) comb. nov.
(L. coprophilus ssp. confusus (Holzapfel and Kandler). He исключе-
но, что подобные этому виду организмы описывались и ранее, но
под названием Leuconsostoc mesenteroides, хотя и отмечалось, что
1 NCIB — Национальная коллекция промышленных бактерий, Англия.
123
они, так же как и бетабактерии образуют DL-молочную кислоту.
Нахождение среди штаммов нового вида таких, которые не гидро-
лизуют аргинин и сбраживают трегалозу, хотя и продуцируют DL-
молочную кислоту и по форме клеток являются палочками, свиде-
тельствует о близости L. confusus и Leuc. mesenteroides. Не ме-
нее сложным является отличие и L. viridescens от Leuc. dextrani-
cum.
В связи с приведенными примерами, Гарви (Sharpe et al., 1972)
считает, что нет достаточных оснований для отнесения лейконо-
стоков и бетабактерий к отдельным родам. Логичнее было бы
объединить их в один род.
Номенклатура лактобацилл и новые методы,
используемые при их идентификации
В 1962 г. при Международном комитете по номенклатуре бакте-
рий (на X Международном конгрессе по микробиологии переиме-
нован в Международный комитет по систематике бактерий —
IGSB) был создан Таксономический подкомитет по лактобациллам
и родственным организмам.
В задачу Подкомитета входило установление общепринятых
типовых и неотиповых штаммов видов и типового вида рода; под-
готовка списка рекомендованных видовых названий; разработка
вопросов четкого определения рода Lactobacillus и отграничения
его от других родов и т. д.
Учитывая то, что номенклатура видовых названий лактоба-
цилл очень хаотична (один и тот же организм часто описывается
под различными наименованиями), и эти названия давались часто
без соблюдения правил номенклатуры (например, в названии ря-
да видов лактобацилл необоснованно стоит фамилия Holland), ра-
бота Подкомитета представляется делом первостепенной важности.
Отсутствие общепринятых типовых и неотиповых штаммов суще-
ственно тормозит работы по классификации лактобацилл, нередко
не дает возможности сопоставить данные отдельных авторов.
В настоящее время для большинства видов лактобацилл подоб-
раны типовые или неотиповые штаммы, проведено изучение их
свойств в различных лабораториях мира и обобщены результаты
этих работ (Hansen, 1968). В соответствии с Международным
кодом номенклатуры бактерий рассмотрены многие видовые наи-
менования лактобацилл и для многих видов даны синонимы (Ro-
gosa, Hansen, 1971).
Ниже мы приводим рекомендуемые Подкомитетом видовые
названия лактобацилл и описываем ряд свойств типовых и нео-
типовых штаммов каждого вида (табл. 16). Указанные признаки
бактерий изучались исследователями неоднократно на протяже-
нии многих лет. Эти данные могут быть использованы в работе
по идентификации лактобацилл. Подкомитет по лактобациллам и
родственным организмам (International Committee..., 1971, min.
124
9, 10) считает, что неотиповой штамм L. leichmannii 4797 может
быть разновидностью L. delbrueckii, L. lactis или представлять со-
бой новый вид. Штамм ATGG 521 предлагается в качестве неотипо-
вого для L. jugurt. Если же этот вид будет объединен с L. helveticus,
то типовым штаммом вида следует считать L. helveticus 15 009.
Потребность в витаминах
Рогоза с сотрудниками (Rogosa et al., 1947, 1953, 1961)
утверждают, что существует высокая степень зависимости между
потребностями в источниках питания и культурально-биохимиче-
скими и физиологическими свойствами молочнокислых бактерий
и что потребность штаммов различных видов в витаминах имеет
таксономическое значение (см. табл. 4). Однако Лакшминарайа-
на с соавторами (Laxminarayana et al., 1952) отмечают, что хотя
знания потребностей молочнокислых бактерий в определенных
витаминах и аминокислотах могут помочь при дифференциации
близкородственных видов, все же возможны ошибки при примене-
нии этого метода. Доказательство этого можно найти и в других
работах. Так, Франклин и Шарп (Franklin, Sharpe, 1964), изучив
потребности в витаминах большого числа лактобацилл, не под-
твердили в ряде случаев данных, полученных Рогозой и другими
(Rogosa et al., 1961). Або-Элнага и Канцлер (Abo-Elnaga, Kandler,
1965с) изучали потребности в пиридоксине, никотиновой кислоте,
тиамине, пантотеновой кислоте, рибофлавине, п-аминобензойной
кислоте и витамине Bi2 у 207 штаммов всех известных сейчас ви-
дов рода Lactobacillus. Они также нашли, что штаммы одних ви-
дов одинаковы по своим потребностям, а штаммы других, напри-
мер, L. lactis, L. acidophilus, L. plantarum, L. brevis, различны.
По-видимому, в тщательно соблюдаемых стандартных условиях
опыта, при применении оптимальных сред, определение потреб-
ностей штаммов в витаминах может быть использовано лишь для
характеристики лактобацилл в качестве дополнительного признака.
Серологические свойства
Попытки использовать серологические методы для идентифи-
кации молочнокислых бактерий предпринимались рядом исследо-
вателей. Гаррисон с сотрудниками (Harrison et al., 1939; Harrison,
Opal, 1944) для серологической группировки лактобацилл, выде-
ленных из ротовой полости и кишечного тракта, применили
реакцию преципитации. Полученные из бактериальных клеток
солянокислые экстракты обрабатывали этиловым спиртом с целью
получения антигенов, которые затем использовали для группирова-
ния изолированных микроорганизмов.
В дальнейшем, для идентификации лактобацилл, выделенных
из испорченного мяса, серологическая реакция преципитации бы-
ла использована и Нивеном с соавторами (Niven et ah, 1949).
125
Таблица 16
Некоторые признаки типовых и неотиповых штаммов лактобацилл *
Вид, штамм Статус штамма ГЦ, средний % Молочная кислота Кислота в молоке, % | NH3 из аргинина | Рост при Потребность в
Г5 о 10 | тиамине 1 1 рибофлавине | пиридоксале| фолиевой кислоте тимидине |
L. delbrueckii (Leich- mann) Beijerinck, 1901 нт 50,0 D (-) 0 + — + 4- — 4-
АТСС 9649) L. fermentum Beijerinck, 1901 (ATCC 14931) » 53,4 39,3 DL 0,03-0,28 + — + + — — — —
L. helveticus (Orla-Jen- sen) Bergey et al., 1925 » DL 2,7 — — + — + 4- —
(ATCC 15009) L. lactis (Orla-Jensen) » 50,2 D (-) 1,4-1,7 — — 4- — 4- — —
Bergey et al., 1934 (ATCC 12315) 50,8
L. leichmanni (Henne- berg) Bergey et al., 1923 » D (-) 0 + 4- 4- —
(ATCC 4797) L. bulgaricus (Orla-Jen- sen) comb. nov. (ATCC » 50,3 D (-) 1,7 — — 4- - + — —
11842) L. plantarum (Orla-Jen- sen) Bergey te al., 1923 т 45,0 DL 0,1—0,28 — + — - + - — —
(ATCC 14917) L. buchneri (Henneberg) Bergey et al., 1923 (ATCC 4005) нт 44,8 42,7 DL 0,04-0,24 + 4- - + - — — —
L. brevis (Orla-Jensen) » DL 0,09—0,31 + 4- — + — — + —
Bergey et al., 1934 (ATCC 14869) L. casei (Orla-Jensen, 1919) comb. nov. (ATCC нт L (+) - 4- 4-
393) L. acidophilus (Moro) comb. nov. (ATCC 4356) » 37,5 DL — — ± 4- 4- +
L. viridescens Niven and т — + — 4- + С с
Evans (ATCC 12706) L. cellobiosus Rogosa » + 4-
et al. (ATCC 11739) L. jugurt Rogosa et Shar- нт L (+);
pe (ATCC 521) DL
L. salivarius ssp. sali- varius Rogosa et al.(ATCC 11741) т DL — + + +
L. salivarius ssp. salici- nicus Rogosa et al. (ATCC 11742) » DL 4- + +
* Ни один штамм не сбраживал адонит, дульцит, эритрит, глицерин, гликоген,
инозит, инулин (АТСС 4356 по некоторым данным сбраживает его), сорбозу, крахмал.
АТСС 14 917 сбраживает а-метил-В-глюкозид, а-метил-В-маннозид, сорбит (его сбра-
живают и АТСС 11741 и 11742), а также иногда рамнозу. Плюс — всегда
12&
(no Hansen, 1968; 1971; Hansen, Mocquot, 1970; Hansen, Lessel, 1971; Lessel,
Rogosa, 1971; Rogosa, Hansen, 1971)
Сбраживание
эскулина амигдалина арабинозы целлобиозы фруктозы галактозы лактозы мальтозы маннита маннозы мелецитозы мелибиозы раффинозы салицина сахарозы трегалозы ксилозы
+ + ± ± ± + + поло ные T — + + + + житес )тдел1 сипов + + + тьные 1НЫХ эй; С + + + + + + реа исс — сти + + + + + + + + + + + + + кции ледов мули + + ± + + + + + + + + + ми ателе рует. + + + + + + + + + ± + + + нус - й; Т ± + + + + + + + + + + + + - всег часто 1 II 1 1 1 ++I-H + IIII+ + ° ° св Н + 1+ + + +1 + 1 и- + + + +I + + + ай + + + тельв ельнь + + + + + + + ые; се ре SI+ я I + +I + 1I+ 1 1 + + 1 1 Н- 1+ 1 и _ + + + + + ± + аесов и; Н + + + + + + + + + + + падак Т - н + + + + + + + + щие етип + + дан- эвой;
127
Авторам удалось установить, что солянокислые экстракты, полу-
ченные из 20 штаммов, преципитировались антисыворотками,
приготовленными только против двух из этих штаммов.
К этому же времени относятся и некоторые исследования
других авторов, целью которых являлось использование другой
серологической реакции — агглютинации для группировки штам-
мов лактобацилл, выделяемых из различных источников обитания.
Так, Вильямс (Williams, 1948), применив реакцию агглютинации
при исследовании бактерий, изолированных из ротовой полости,
обнаружил, что у них содержится четыре антигенных компонен-
та — А, В, С, D. Автор разработал способ приготовления моноспе-
цифических сывороток, основанный на насыщении отдельных сы-
вороток определенным штаммом.
Позднее Вильямс с сотрудниками (Williams et al., 1953) пока-
зали, что антигенная структура молочнокислых палочек сложна
и предложили схему классификации этих бактерий, которая строи-
лась на признаках гомо- и гетероферментативности, характере
продуктов брожения и антигенном составе.
Работы этих авторов были продолжены и значительно расши-
рены Орлендом (Orland, 1950), который проводил свои исследова-
ния на большом числе видов молочнокислых палочек, как музей-
ных, так и выделенных из разнообразных источников. Автор
получил моноспецифические сыворотки путем применения метода
«зеркальной адсорбции», при которой антисыворотка для одного
штамма истощалась клетками другого штамма и наоборот.
Эти сыворотки были применены для определения специфиче-
ских антигенных компонентов у различных штаммов в реакции
агглютинации. Орленд нашел, что из 252 штаммов 30 имели общий
антиген, обозначенный буквой F. Наличием этого антигена харак-
теризовались штаммы вида L. casei, изолированные из различных
источников и сохранявшиеся в разных условиях. Аналогичный
антиген был также найден и у некоторых штаммов видов L. hel-
veticus, L. bulgaricus и L. acidophilus. Два штамма L. plantarum
имели новый антиген G, а у одного штамма L. casei был обнару-
жен антиген Н. Кроме того, было установлено, что у штамма
L-641, кроме антигена F, есть антиген I.
В работе Орленда, как нам кажется, ценным является то, что
он сделал попытку сопоставить антигенные свойства бактерий со
способностью их сбраживать различные сахара. Было обнаружено,
например, что штаммы L. casei (содержащие антиген F) в основ-
ном не отличались по ферментативным свойствам, накоплению тит-
руемых кислот и росту на агаре с 10% крови. Интересно отметить,
что молочнокислые бактерии, обладающие разными антигенами
(которые автор называет «главными»), не имеют и общих физио-
логических признаков.
Наиболее значительным трудом, посвященным группировке
молочнокислых палочковидных бактерий с помощью серологиче-
ского метода, явилось исследование Шарп (Sharpe. 1955а, Ь). Раз-
128
работка классификации основывалась на данных, полученных при
применении реакции преципитации, с помощью которой, как ут-
верждает автор, можно устанавливать широкие группировки род-
ственных микроорганизмов. Шарп показала, что лактобациллы об-
ладают комплексом антигенов. Кроме типовых и групповых, ею был
обнаружен и так называемый R-антиген, присутствующий у ряда
микроорганизмов разных серологических групп.
Автором была разработана методика получения антисывороток,
а также групповых специфических антигенов. Для этого получен-
ные из клеток солянокислые экстракты (по Ленсфилд) обрабаты-
вались четырьмя объемами этилового спирта, а образовавшийся оса-
док растворяли в физиологическом растворе NaCl (фракция A)j
Группоспецифический антиген содержался во фракции А, которая
преципитировалась специфической групповой сывороткой. Шарп
удалось сгруппировать 312 из 442 штаммов молочнокислых бакте-
рий в шесть серологических групп и одну подгруппу. Их обозначи-
ли по названию вида, из штамма которого готовили групповую
антисыворотку (bulgaricus, casei-helveticus, casei, fermenti, planta-
rum, lactis-brevis, подгруппа brevis).
Несколько ранее Бригс (M. Briggs, 1953b), исследуя по ряду
физиологических признаков ту же коллекцию штаммов, что и
Шарп, разделила большинство из них на восемь групп. Шарп со-
поставила установленные ею серологические группы с группами
Бригс и показала полное их совпадение, за исключением серологи-
ческих групп L. bulgaricus, L. casei-helveticus.
В цитируемой работе Шарп, нам кажется, важно отметить не-
сколько моментов. Так, автор высказала предположение о том, что
существует самостоятельная серологическая группа, объединяю-
щая штаммы вида L. fermenti, выделенные из кишечника, в про-
тивоположность группе штаммов этого вида, изолированных из ро-
товой полости, молока и растений. Было показано тесное серологи-
ческое родство между видом гетероферментативных бактерий L.
brevis и видом термобактерий — L. lactis. Шарп считает, что это,
возможно, является доказательством общности происхождения этих
двух видов, впоследствии приспособившихся к разным условиям
существования. Полученные данные, по мнению исследователя, го-
ворят в пользу того, что не следует относить гомо- и гетерофермен-
тативные виды к отдельным родам.
Несмотря на успех, достигнутый Шарп при группировке лак-
тобацилл с помощью серологического метода, все же ей не удалось
приготовить групповые сыворотки для ряда видов (L. leichmannii,
L. delbrueckii и др.); не удалось также сгруппировать ряд предста-
вителей молочнокислых палочек, выделенных из кишечника.
Шарп и Витер (Sharpe, Wheater, 1957) уточнили номенклату-
ру серологических групп и предложили виды молочнокислых бак-i
терий относить к шести группам А—F. В настоящее время работы
в этом направлении продолжаются. Сравнительно недавно (Shar-
pe, 1962) в дополнение к серологическим группам, предложенным
5 Е. И. Квасников, О. А. Нестеренко 129
ранее, была установлена и новая группа G, включающая предста-
вителей вида L. salivarius.
Определенные данные получены и в отношении изучения груп-
пового антигена L. acidophilus. Так, используя в реакции преци-
питации HCl-экстракты клеток 35 штаммов L. acidophilus, Шарп
(Sharpe, 1970) показала, что этот вид можно разделить на две се-
рологические группы — I и II, имеющие собственный специфиче-
ский антиген, находящийся в клеточной стенке и являющийся
глицеринтейхоевой кислотой. Была установлена и третья группа
L. acidophilus, хотя ее антигены не охарактеризованы. Интересно
отметить, что на основании изучения лактатдегидрогеназ у той же
коллекции штаммов L. acidophilus они были распределены также
в три группы, соответствующие найденным серологическим груп-
пам (Sharpe, 1970).
Серологический метод, на основании которого Шарп (Sharpe,
1955а) установила среди лактобацилл ряд групп, в дальнейшем был
успешно использован ею в практической работе по идентификации
значительного числа молочнокислых палочек, изолированных с по-
верхности сыров. Выделенные лактобациллы, в основном, были
отнесены к серологическим группам, включающим L. plantarum и
L. brevis. Эти же штаммы, идентифицированные автором с помо-
щью физиологических признаков, были отнесены к тем же видам,
т. е. оба метода привели к совпадающим результатам.
Бурное развитие химических методов изучения структур бакте-
риальной клетки обусловило появление ряда глубоких и важных
исследований, показавших какими химическими компонентами
определяются антигенные свойства молочнокислых палочковид-
ных бактерий (Baddiley, Davison, 1961; Sharpe et al., 1964; Sharpe.;
1970; Knox, Wicken, 1970, 1972).
Было установлено, что принадлежность лактобацилл к опреде-
ленной серологической группе (из групп А—F) обусловливается
наличием в их клеточных стенках или цитоплазматических мембра-
нах одного из двух типов тейхоевых кислот — рибиттейхоевой (ос-
новная цепь кислоты состоит из рибитфосфата) или глицеринтей-
хоевой (основная цепь кислоты состоит из остатков глицерофосфа-
та). Так, в клеточных стенках бактерий группы Е (L. bulgaricus,
L. lactis, L. brevis, L. buchneri) содержатся глицеринтейхоевые ки-
слоты, которые, как оказалось, являются ответственными за груп-
повую специфичность у этих бактерий. В клеточной стенке бакте-
рий группы D (L. plantarum) выявлена рибиттейхоевая кислота,
определяющая их групповую специфичность.
В противоположность указанным данным было найдено, что
группоспецифическим преципитиногеном группы A (L. helveticus,
L. jugurti) является глицеринтейхоевая кислота, которая локали-
зуется не в стенке, а между стенкой и наружной поверхностью ци-
топлазматической мембраны (табл. 17).
Изучая далее этот вопрос, Нокс с сотрудниками (Knox et al.,
1970) показали, что у лактобацилл серологической группы F (L.
130
Таблица 17
Локализация и химическая природа групповых антигенов у лактобацилл
(по Sharpe, 1970) *
Серологи- ческая группа Виды, включен- ные в группу Локализация антигена в клетке Химическая природа анти- гена Сахар Продукт щелоч- ного гидролиза
А L. helveticus L. jugurti Мембрана ГТК Глюкоза (ел) Рибоза Глюкозилгли-
(ел) церин
В L. casci Стенка Полисаха- Рамноза
РИД
С L. casei » » Глюкоза
D L. plant arum » РТК » Глюкозилрибит
Е L. lactis L. bulgaricus L. brevis » ГТК » Глюкозилгли- церин
L. buchneri
F L. fermenti Мембрана »
G L. salivarius
* ГТК — глицеринтейхоевая кислота; РТК — рибиттейхоевая кислота; сл — следы.
fermenti) групповым антигеном являются глицрринтейхоевые ки-
слоты, находящиеся в цитоплазматических мембранах. Путем фе-
нольной экстракции Викен и Нокс (Wicken, Knox, 1970) выде-
лили комплекс высокополимерной тейхоевой кислоты с глико- и
фосфолипидными тейхоевыми кислотами. Химический анализ со-
става мембранных тейхоевых кислот обнаружил, что последние
являются полимерами глицерофосфата, соединенными с алани-
ном, глюкозой и дисахаридом, состоящим из галактозы и глюкозы.
Было также установлено, что специфичность группового антигена
зависит главным образом от галактозы, а глюкоза играет незначи-
тельную роль.
L. casei в настоящее время разделяют на две серологические
группы — В и С. У лактобацилл этих групп ответственными за се-
рологическую специфичность являются не тейхоевые кислоты, а
иные компоненты клеточных стенок — полисахариды. Причем,
оказалось, что рамноза является ответственной за серологическую
специфичность группового антигена лактобацилл группы В, а глю-
коза — группы С (табл. 17) (Baddiley, Davison, 1961; Glastonbury,
Knox, 1963; Sharpe, 1970).
В пределах некоторых видов лактобацилл, обладающих общим
групповым антигеном, имеются штаммы, которые дополнительно
131
5*
содержат и специфический типовой антиген. Так, типовой полиса-
харидный антиген содержат штаммы подвида L. casei var. rhamno-
sus, а рамноза ответственна за его серологическую специфичность.
Обнаружен штамм L. plantarum (не содержащий групповой рибит-
тейхоевой кислоты), типовым антигеном которого является тейхое-
вая кислота необычного строения (отличалась местом присоедине-
ния гликозильных единиц к глицериновым остаткам) (Sharpe,
1970).
Были получены предварительные данные и о нахождении ан-
тигенов, общих для многих видов родов молочнокислых бактерий
и иных микроорганизмов (Sharpe, 1970). Против штамма L. acidop-
hilus приготовлена очень активная антисыворотка, которая преци-
питировала HCl-экстракты, полученные из клеток бактерий всех ви-
дов родов Lactobacillus, Sporolactobacillus, некоторых видов родов
Pediococcus и Leuconostoc, а также Staphylococcus aureus.
Оказалось, что этим общим антигеном является, скорее всего,
глицеринтейхоевая кислота, локализованная в клеточной мембра-
не, в состав которой входили глюкоза, аланин, глицерин и органи-
ческий фосфат. Впоследствии было установлено, что указанные вы-
ше серологические реакции преципитации обусловливались при-
сутствием в антисыворотке против L. acidophilus антител, специ-
фически реагирующих с полиглицерофосфатной основой мембран-
ных тейхоевых кислот, находящихся в HCl-экстрактах клеток
(Sharpe, Brock, et al., 1973).
Нахождение таких общих антигенов важно для понимания род-
ственных взаимоотношений между различными родами молочно-
кислых бактерий и других групп микроорганизмов.
В заключение отметим, что все сказанное нами выше свидете-
льствует о том, что в практической работе по идентификации лак-
тобацилл с успехом может быть использован метод качественной
реакции преципитации. В классификационные современные схемы
в качестве одного из признаков вводится и принадлежность бакте-
рий к определенной серологической группе (см. табл. 10—12).
Серологическая идентификация лактобацилл подрода Strepto-
bacterium Orla-Jensen.
При помощи серологической реакции преципитации в нашей
лаборатории (Квасников, Нестеренко и др., 1967) удалось иденти-
фицировать значительное число штаммов подрода Streptobacterium.
Для получения антисывороток использовали музейные и свеже-
выделенные штаммы (табл. 18). Культуры для иммунизации выра-
щивали в течение 18 час. в 40 мл среды следующего состава (%) :
дрожжевой автолизат — 0,3 об.; глюкоза — 2; NaCl — 0,5; твин
80—0,01 об.; пептон — 1,5; pH — 6,4—6,6 (среда 1). Для приготов-
ления солянокислых экстрактов молочнокислые бактерии культи-
вировали в течение 48 час. на среде, подобной 1, но с 10 об. % то-
матного сока вместо дрожжевого автолизата (среда 2), ибо томат-
ный сок и дрожжевой автолизат, адсорбируясь на клетках лактоба-
цилл, при иммунизации ведут к образованию антител против этих
132
Таблица 18
Штаммы молочнокислых бактерий, использованные для получения
антисывороток
Вид, штамм
Откуда получен
L. casei var. rhamnosus ATGC 7469 Болгарская Академия наук, Институт микробио- логии, София
L. casei var. casei 42 Институт микробиологии и вирусологии АН УССР; выделен из рубца крупного рогатого скота
L. casei G-37 ВНИИМС, Углич
L. plantarum 116 Институт микробиологии и вирусологии АН УССР; выделен из эпифитной микрофлоры трост- ника
L. arabinosus ATCC 8014 Болгарская Академия наук, Институт микробио- логии, София
L. fermenti ATCG 9338 То же
L. fermenti CGM 1831 Чехословацкая коллекция микроорганизмов, Брно
L. fermenti 20—OK Институт микробиологии и вирусологии АН УССР; выделен из прокисших бражек ацетоно- бутилового производства
L. brevis CCM 1871 Чехословацкая коллекция микроорганизмов, Брно
L. brevis 134-H Институт микробиологии и вирусологии АН УССР; выделен из кукурузного силоса
L. brevis 82 Институт микробиологии и вирусологии АН УССР; выделен из рубца крупного рогатого скота
компонентов, что вызывает нежелательные неспецифические реак-
ции. Штаммы культивировали при 30°, L. fermenti — при 37°.
Культуры для иммунизации, выросшие на среде 1, центрифу-
гировали, дважды промывали физиологическим раствором, прог-
ревали при 60° в течение часа и использовали для иммунизации
кроликов по методу Шарп (Sharpe, 1955а). Преципитиногенами
при постановке реакции преципитации служили солянокислые эк-
стракты. Для их получения штаммы выращивали 48 час. в 40 мл
среды 2, центрифугировали, дважды промывали физиологическим
раствором и экстрагировали 1—2 мл 0,05 н. НС1 (на физиологиче-
ском растворе) в кипящей водяной бане. Экстракты охлаждали,
нейтрализовали, снова центрифугировали и хранили в холодиль-
нике при 4°. Реакции кольцепреципитации проводили в пробирках
диаметром до 3 мм при комнатной температуре. Интенсивность
реакции учитывали в плюсах.
После неоднократных попыток нам не удалось получить сыво-
роток к гетероферментативным молочнокислым палочковидным
133
бактериям (L. fermenti и L. brevis). Из штаммов, указанных в
табл. 18, мы получили сыворотки против L. casei var. rhamnosus
АТСС 7469, L. casei var. rhamnosus С-37 и L. plantarum 116.
L. casei
Из 52 штаммов, включавших виды L. plantarum, выделенные
нами из эпифитной микрофлоры, силоса и мяса, а также неиденти-
фицированные штаммы стрептобактерий, изолированные из насе-
комых и вин, ни один не дал реакции преципитации с сывороткой
к АТСС 7469 и С-37. Не наблюдали реакции и с экстрактами 21
штамма, идентифицированного как L. acidophilus, L. bulgaricus и
L. helveticus. Специфические реакции преципитации дали экстрак-
ты ряда музейных и свежевыделенных нами штаммов, идентифи-
цированных по морфолого-культуральным и физиологическим приз
накам как L. casei и его разновидности (табл. 19). Пять штаммов
L. casei var. casei не дали специфических реакций преципитации
с полученными сыворотками к L. casei var. rhamnosus (табл. 19).
Эти бактерии, по всей видимости, относятся к другой серологиче-
ской группе — В. Как указывали мы выше, вид L. casei серологи-
чески неоднороден. Одни штаммы L. casei var. casei и L. casei var.
alactosus принадлежат к группе В, другие — к С; все штаммы L. ca-
sei var. rhamnosus относятся к группе С (Rogosa, Sharpe, 1959).
Таким образом, результаты, приведенные в табл. 19, свидетель-
ствуют о том, что идентификация штаммов молочнокислых бакте-
рий по морфолого-культуральным и физиологическим признакам
соответствует серологической идентификации, хотя для вида L.
casei это и осложняется тем, что он серологически неоднороден
(группы В и С).
L. plantarum
Была получена сыворотка к штамму L. plantarum 116, выделен-
ному в нашей лаборатории из эпифитной микрофлоры тростника.
Реакцию преципитации с этой сывороткой дали 40 штаммов лакто-
бацилл, выделенных из эпифитной микрофлоры (13), рубца круп-
ного рогатого скота (21), мяса и мясных рассолов (6). В то же
время HCl-экстракты ряда штаммов, выделенных нами из тех же
источников и идентифицированных как L. plantarum, не преципи-
тировались сывороткой против L. plantarum 116.
Сопоставление некоторых свойств штаммов, давших (I группа)
и не давших (II) специфическую реакцию преципитации с сыво-
роткой к L. plantarum 116, показывает, что между ними не имеет-
ся заметных отличий.
Некоторые авторы (Tittsler et al., 1947; Rogosa et al., 1953) счи-
тают, что вид L. plantarum следует разделить на два вида или раз-
новидности — L. plantarum и L. arabinosus. Характерным свойст-
вом последнего (помимо иных признаков) является способность
134
Таблица 19
Результаты реакции преципитации HCl-экстрактов штаммов молочно-
кислых бактерий с сыворотками L. casei var. rhamnosus ATCC 7469
и L. casei C-37 *
Вид, штамм Откуда получен Сыворотки к
АТСС 7469 С-37 L. fer- menti ССМ 1831 •»
L. casei var. rham- Болгарская Академия паук, Инсти- ++++ ++++ +4 ++
nosus ATCC 7469 тут микробиологии, София
L. casei польский * * Молочная лаборатория ВНИИПК, Минск ++++ ++++ ++++
L. fermenti COM Чехословацкая коллекция микроор- ++++ ++++ ++++
1831 ** ганизмов, Брно
L. casei C-37 ** ВНИИМС, Углич ++Ч-+ ++++ ++++
L. casei var. rham- nosus 104/3 Институт микробиологии и вирусо- логии АН УССР; выделен из эпифит- ++++ ++++
ной микрофлоры тростника
L. casei CCM1824** Чехословацкая коллекция микроор- ++++
-Г-Г"г4“
ганизмов, Брно
L. helveticus CCM То же
Т'-ГТ—Г + + -Г-Г-Г"Г
1836
L. casei var. rham- Институт микробиологии и вирусо-
nosus 144 логии АН УССР; выделен из мясно-
го рассола Киевского мясокомбината
L. casei var. rham- nosus 13, 14, 27 L. casei var. alac- Институт микробиологии и вирусо- логии АН УССР; выделен из рубца крупного рогатого скота Институт микробиологии и вирусо- ++++ ++++ +++4- ++++
tosus 49 логии АН УССР; выделен из рубца крупного рогатого скота
To же, 55 То же ++++ +
» 64 » -]—|- ++++
» 67 » ++++ ++++
» 154 » +++ ++
L. casei var. ca- Институт микробиологии и вирусо- +++ +++
sei 128 логии АН УССР; выделен из куку- рузного силоса
To же, 16 Институт микробиологии и вирусо- ++++ +Ч"+4-
» 88 логии АН УССР; выделены из рубца
» 90 крупного рогатого скота +++ —
» 42, 44, 53, 81, 85 — —
* ++-H— кольцо появляется мгновенно, -H—I— появляется через 5 мин., +4—
через 15 мин., -}— через 30 мин.
** Эти штаммы в нашей лаборатории были идентифицированы как L. casei var.
rhamnosus.
135
сбраживать арабинозу. Поскольку нами было установлено, что
HCl-экстракт музейного штамма L. arabinosus АТСС 8014 не дает
реакцию преципитации с сывороткой к L. plantarum 116 (штамм
116 не сбраживает арабинозу), можно было предположить, что
серологические свойства L. plantarum связаны со способностью
сбраживать арабинозу. Однако это не так: из 40 штаммов L. plan-
tarum, давших реакцию преципитации с сывороткой к штамму
L. plantarum 116, 22 штамма сбраживают арабинозу. В то же вре-
мя из 38 штаммов, не реагировавших с сывороткой, 8 штаммов не
сбраживают арабинозу. Можно думать, что не реагирующие с сы-
вороткой к L. plantarum 116 штаммы этого же вида имеют иной
антиген, отличающийся от того, который обусловливает специфи-
ческую реакцию преципитации с антисывороткой к L. plantarum
116, т. е. что вид L. plantarum серологически неоднороден.
Подрод Thermobacterium. Orla-Jensen
Нами изучалась также возможность использования серологиче-
ского метода и для идентификации термофильных бактерий (Квас-
ников и др., 1970а).
В этом случае культуры для иммунизации и приготовления
экстрактов выращивали на среде МРС-1.
Таблица 20
Штаммы молочнокислых бактерий, использованные для получения
антисывороток
Вид, штамм Откуда получен
L. acidophilus Laktoflora 101 Лактофлора, Чехословакия
L. lactis Laktoflora 136 То же
L. helveticus Laktoflora 132 »
L. acidophilus NIRD 3 Национальный институт молочной промышленности, Англия
L. helveticus NIRD 30 То же
L. lactis NIRD 970 »
L. bulgaricus NIRD 87 »
L. helveticus NIRD 261 »
L. acidophilus NCIB 1723 Национальная коллекция промыш- ленных микроорганизмов, Англия
Lactobacterium bulgaricum m— Болгарская Академия наук, Инсти- тут микробиологии, София
Lactobact. bulgaricum м-f- То же
Сыворотки удовлетворительных титров были получены только
к некоторым из указанных в табл. 20 культурам. Реакции пре-
ципитации этих сывороток с HCl-экстрактами имевшихся у нас
136
Таблица 21
Результаты реакции преципитации HCl-экстрактов музейных штаммов
термофильных молочнокислых бактерий с сыворотками*
Вид и штамм Сыворотки к
Lactobact. bulgaricum M— L. acidophi- lus Laktoflo- ra 101 L. helveticus NIRD 30 L. lactis NIRD 970 L. bulgaricus NIRD 87 L. helveticus NIRD 261 L. helveticus Laktoflora | 132
Lactobacillus acidophilus Laktoflora 101 — ++++ ± — — +++ —
L. helveticus Laktoflora 132 — — — — — —
L. lactis Laktoflor.a 136 — — — ++++ — —
L. acidophilus NCIB 1723 — — — — — — —
L. lactis Laktoflora 970 —• — — — — —
L. acidophilus NIRD 3 — — — — — — —
L. bulgaricus NIRD 87 — — — — +++ — —
L. helveticus NIRD 30 ++++ + ++++ — — + —
L. helveticus NIRD 261 — + + — ++ —
Lactobacterium bulgaricum M— ++++ — ++++ — — — —
Lact. bulgaricum м-f- ++++ — — — — —
L. salivarius NIRD 929 — — — — — — —
’ ± В ряде случаев слабое кольцо через 30 мин.; ++++ мгновенная реакция.
+++ реакция через 5—10 мин.;4-4-через 15 мин.;-|- через 30 мин.;—отсутствие реакции.
музейных штаммов термофильных молочнокислых палочковидных
бактерий приведены в табл. 21.
При изготовлении сывороток к присланным штаммам одновре-
менно изучали некоторые физиологические свойства последних для
уточнения видовых названий молочнокислых бактерий. Руковод-
ствуясь определителем Рогозы и Шарп (Rogosa, Sharpe, 1959), ис-
пользовали наиболее быстро устанавливаемые признаки — накоп-
ление кислоты в молоке, сбраживание углеводов и спиртов, обра-
зование аммиака из аргинина. Отказалось, что ряд штаммов по сво-
им свойствам не соответствует тем названиям, которые им были да-
ны в музее; часть музейных штаммов мы не смогли отнести к ка-
кому-либо виду (табл. 22). В связи с этим анализ полученных
результатов группировки музейных и свежевыделенных штаммов в
дальнейшем осуществляли, учитывая новые видовые названия.
Таким образом, были получены сыворотки к штаммам: L. jugur^
ti NIRD 87, L. jugurti Laktoflora 101, L. helveticus NIRD 30, L. hel-
veticus NIRD 261, Lactobacillus sp. Laktoflora 132, Lactobacillus sp.
137
Таблица 22
Физиологические свойства музейных штаммов молочнокислых бактерий
подрода Thermobacterium *
Штамм и его видовое
название, данное музеем
Видовое название
штамма, данное нами
Lactobacterium bulgaric um
м—
То же, м+
Lactobacillus helveticus
NIRD 261
L. helveticus NIRD 30
L. bulgaricus NIRD 87
L. acidophilus Laktoflora 101
To же NCIB 1723
To же NIRD 3
L. salivarius NIRD 929
L. lactis NIRD 970
L. helveticus Laktoflora 132
L. lactis Laktoflora 136
---1,80 He идентифициро-
ван
— — 1,35 »
---2,10 L. helveticus
--2,55 »
---2,40 L. jugurti
--2,81 »
+ — 1,01 L. acidophilus
+ -0,91 »
--- L. salivarius
---0,3 He идентифициро-
ван
* + интенсивное сбраживание; — отсутствие реакции.
м—, Lactobacillus sp. NIRD 970. В процессе иммунизации мы по-
лучили сыворотки также против штаммов L. acidophilius NCIB 1723
и L. acidophilus NIRD 3, которые очень быстро потеряли актив-
ность.
Доктор Л. Начев (Институт микробиологии, София) любезно
предоставил нам культуры молочнокислых палочковидных бакте-
рий, выделенные из одной клетки с помощью микроманипулятора
и идентифицированные им как Lactobact. bulgaricum м+ (сбражи-
вающая мальтозу) и Lactobact. bulgaricum м— (не сбраживаю-
щая мальтозу). Экстракты этих штаммов очень интенсивно реаги-
ровали с сывороткой против м — и 30, что может свидетельствовать
о том, что присланные штаммы (м+ и м—) являются соответст-
венно видами L. helveticus и L. jugurti. С другой стороны, если при-
сланные культуры (как считает доктор Начев) относятся к виду
Lactobact. bulgaricum, то следует признать серологическое родство
этого вида с L. helveticus.
138
По литературным данным, виды L. jugurti и L. helveticus имеют
общий групповой антиген и относятся к серологической группе А
(Rogosa, Sharpe, 1959). Этим и объясняются перекрестные реакции
штаммов 101 и 261; 30, м—, 101 и 261; 261, 30 и 101; м+ и 30;
м— и 30. При этом перекрестные реакцци штаммов 30 и м— с сы-
воротками против них были всегда очень интенсивными, тогда как
эти реакции с сыворотками против 101 и 261 (L. jugurti и L. helve-
ticus) были слабы или вовсе отсутствовали (см. табл. 21).
С полученными сыворотками в реакции преципитации были ис-
следованы НС1-экстракты 42 штаммов бактерий подрода Thermo-
bacterium, полученных нами из микробиологических лабораторий
СССР, где они были выделены из различных источников.
Изученные штаммы по-разному реагируют с сыворотками:
1) имеется группа штаммов, HCl-экстракты которых очень ин-
тенсивно преципитируют сыворотки к штаммам 87, м—, 30, не реа-
гируя (или очень слабо реагируя) с сыворотками против штаммов
101 и 261; 2) штаммы, HCl-экстракты которых реагируют как
с сыворотками против штаммов 87, м— и 30 (интенсивно), так й
101 и 261 (слабее); 3) штаммы, HCl-экстракты которых дают силь-
ные реакции преципитации с сывороткой против штаммов 101 и
261, но слабые реакции (или они отсутствуют) с сыворотками про-
тив штаммов 87, м— и 30. В этой группе у некоторых штаммов мы
получили HCl-экстракты, преципитирующие только сыворотки
261 и (или) 101. Следует отметить, что именно к этой группе отно-
сится большинство штаммов, выделенных из желудочно-кишечного
тракта животных; 4) HCl-экстракты некоторых штаммов (Lacto-
bact. acidophilum 336, Lactobact. bulgaricum 37п) с одинаковой ин-
тенсивностью реагируют с сыворотками против 87, м—, 101, 30,
261; у других штаммов отмечаются только слабые реакции с дву-
мя-тремя сыворотками (Lactobact. helveticum Bg299, Bg259). Пред-
ставители первых трех групп изолированы из желудочно-кишечно-
го тракта человека и животных; четвертой — из молока.
Ни один HCl-экстракт не реагировал с сывороткой против Lac-
tobacillus sp. 132; только три штамма давали довольно сильную ре-
акцию с сывороткой против Lactobacillus sp. 970.
Исследование у штаммов физиологических свойств показало,
что у большинства они тождественны. По определителю Рогозы и
Шарп мы идентифицировали штаммы как L. helveticus и L. jugur-
ti, хотя некоторые штаммы (ЗЕ, 4Е, 9Е, 37п, 1п/3) образуют в мо-
локе меньше кислоты, чем это приведено в определителе. Ряд куль-
тур не удалось идентифицировать (20Т, 19/126).
Становится понятным, почему удалось сгруппировать подавляю-
щее большинство штаммов с помощью сывороток, полученных про-
тив представителей серологической группы А. При этом следует
отметить, что почти все исследованные штаммы различного проис-
хождения мы могли идентифицировать только с помощью сыворот-
ки против штамма L. jugurti NIRD 87. Хотя штаммы 30, 101, 261
и, вероятно, м — относятся к одной серологической группе А, одна-
d39
ко с помощью одной из сывороток, например против штамма 30
или 101, не удается сгруппировать все микроорганизмы видов
L. helveticus и L. jugurti.
Были получены также сыворотки против трех штаммов неиден-
тифицированных бактерий подрода Thermobacterium, выделенных
нами с оборудования сахарного завода (Р-101 и 1341) и из диффу-
зионного сока (№ 10). В реакции преципитации с этими сыворотка-
ми испытали 35 штаммов термофильных молочнокислых палочек,
выделенных из комбикормов (пять штаммов), по ходу технологи-
ческого процесса приготовления консервов „Зеленый горошек11
(семь штаммов) и с оборудования сахарного производства (23
штамма). Только два штамма из 23 реагировали с сывороткой про-
тив штамма 1341, и один штамм из комбикормов— с сывороткой
против штамма № 10. Ни один HCl-экстракт не преципитировал
сыворотки, указанные в табл. 21. Подобным образом вели себя и
20 штаммов гетероферментативных молочнокислых палочковидных
бактерий вида L. brevis, выделенных из силоса и прокисших бра-
жек ацетоно-бутилового производства.
Приведенные результаты свидетельствуют о том, что серологи-
ческий метод может быть использован для идентификации термо-
фильных палочковидных молочнокислых бактерий, причем это сов-
падает с идентификацией, основанной на физиологических призна-
ках, а именно: сыворотки против штаммов 87, 101, 30 (L. helveticus
и L. jugurti) преципитируют HCl-экстракты штаммов, физиологи-
ческие свойства которых также говорят об их принадлежности к ви-
дам L. helveticus и L. jugurti.
Таким образом, имеющиеся в литературе сведения, а также ре-
зультаты собственных исследований показывают, что серологичес-
кие методы могут достаточно эффективно использоваться для иден-
тификации молочнокислых палочковидных бактерий. Ряд данных,
полученных с помощью серологического метода, важен и для уста-
новления родства между видами лактобацилл. Ценность серологи-
ческих методов, положенных в основу идентификации молочнокис-
лых бактерий, определяется тем, что антигенные свойства этих
микроорганизмов стабильны. Мы видели это из данных, получен-
ных при изучении антигенных свойств лиофилизированных, а так-
же свежевыделенных и старых лабораторных штаммов лактоба-
цилл.
Найденные в настоящее время серологические группировки мо-
лочнокислых бактерий соответствуют группам, обособление кото-
рых основано на ряде морфологических, культуральных, физиоло-
гических и биохимических признаков.
На возможность быстрой идентификации гомо- и гетерофермен-
тативных молочнокислых бактерий методом иммунофлуоресценции ।
указывают О. В. Афанасьева и Ю. Н. Зубжицкий (1969). Группи-
ровки штаммов, проведенные указанным способом, совпадают с по-
лученными на основании изучения реакции преципитации и фи-
зиолого-биохимических свойств культур.
140
Химический состав клеточных стенок
Данные о химическом составе основных компонентов клеточных
стенок молочнокислых бактерий — полисахаридов, тейхоевых кис-
лот и, особенно, муреинов (мукопептидов, пептидогликанов, гли-
козаминопептидов, гликопептидов, мукополимеров) можно исполь-
зовать для родовой и видовой диагностики молочнокислых бакте-
рий. Как указывали в своей классической работе Камминс и Гар-
рис (Cummins, Harris, 1956), химический состав клеточной стен-
ки довольно постоянен и на него не оказывают влияния изменения
в составе сред или условия выращивания культур. «Состав клеточ-
ных стенок,— пишут авторы,— тесно связан с антигенными свой-
ствами бактерий, поскольку, вероятно, важнейшие клеточные анти-
гены сосредоточены именно в стенке».
Методом хроматографии на бумаге Камминс и Гаррис изучили
гидролизаты клеточных стенок ряда молочнокислых палочковид-
ных бактерий (наряду со стафилококками, стрептококками, кори-
небактериями) и показали, что аминокислотный состав их, очевид-
но характеризует род, а качественный состав и количество сахаров
и гексозаминов отражают различия между видами внутри рода.
Было установлено, что все представители видов рода Lactoba-
cillus (за исключением L. plantarum) содержат в стенках аспара-
гиновую кислоту, аланин, глутаминовую кислоту и лизин, но не со-
держат каких-либо одинаковых гексоз или пентоз? В клеточных
стенках всех исследуемых бактерий 'рода были обнаружены глю-
козамин и второй гексозамин — мурамовая кислота (Cummins,
Glendenning, 1957). Камминс и Гаррис (Cummins, Harris, 1956)
показали, что L. casei и L. delbrueckii имеют более сложный, чем
другие виды рода, химический состав клеточных стенок. Интерес-
но отметить, что в стенках исследованных штаммов L. plantarum.
отсутствовали .лизин и аспапагивовая кислота, но имеласьДиами-^
'нотйлеЯиновал- кислота) (ДПК). Подобные указания мы находим
'иТГработах других авторов (Camien, 1952; Work, Dewey, 1953;
Ikawa, Snell, 1960).
Икава и Снелл (Ikawa, Snell, 1960) нашли, что потребность не-
которых молочнокислых бактерий в D-аланине подтверждается на-
хождением в их клеточных стенках большого количества D-алани-
на наряду с D-глутаминовой кислотой. Авторы подтвердили дан-
ные Камминса и Гарриса (Cummins, Harris, 1956) в отношении на-
хождения восстанавливающих сахаров у ряда видов молочнокис-
лых бактерий, хотя и отметили некоторые расхождения. Например,
в стенках L. casei выявлено большое количество рамнозы, следы
галактозы, а различные штаммы L. plantarum отличались по соста-
ву сахаров.
Своеобразный химический состав клеточных стенок L. planta-
rum, о котором мы упоминали, в настоящее время служит основой
дифференциации L. plantarum и L. casei. Або-Элнага и Канцлер
(Abo-Elnaga, Kandler, 1965а) в своих работах уделяют особое вни-
141
мание нахождению в клеточной стенке L. plantarum диаминопиме-
линовой кислоты. Это свойство, по мнению авторов, с успехом мож-
но использовать при идентификации молочнокислых бактерий, так
как оно является постоянным. ДПК находится только в стенках,
поэтому для выявления ее употребляют кислотные гидролизаты це-
лых клеток (Becker et al., 1964).
Исследования, о которых мы указывали выше, касались каче-
ственного изучения аминосахаров и аминокислот, входящих в сос-
тав муреина клеточной стенки. Как известно, муреин грамположи-
тельных бактерий — это полимер, сост^дящий из цепочек, в которых
чередуются N-ацетилглюкозамин и у^ацетилмурамовая" кислота)
(эфир.молочной кислоты и Ъ1-ацетилглюкозамина или_3—О-карбок^
сиэтильное производноё^циь) • Эти компоненть^соединены мезкду
собогГХ^^-гликозидными связями. Остатки (Т^щётилмурамовощ)
кислоты связаны с пептидными цепочками, которые в свою оче-
редь соединены между собой поперечными пептидными мостиками.
При кислотном гидролизе муреины дают глюкозамин и ряд амино-
кислот — D- и L-аланин, D-глутаминовую и D-аспарагиновую кис-
лоты, диаминокислоту и т. д. в зависимости от природы исследуемо-
го микроорганизма.
После работ Камминса и Гарриса, а также других авторов ряд
исследователей осуществил не только качественный, но и количе-
ственный анализ компонентов муреина. Вейс с сотрудниками
(Weiss et al., 1967) показали, что клеточные стенки L. plantarum и
L. inulinus, очищенные обработкой трипсином, после экстракции
^формамидом)с -CCLGOOH. состоят на 85% (по сухому весу) из му-
реина. Авторы у L. plantarum количественно определили компонен-
ты муреина и показали, что аминосахара и аминокислоты представ-
лены: мурамовая кислота : глутамин : глутаминовая кислота : ДПК :
: L-аланин : D-аланин — 1:1: 1: 1:1: 0,5.
Со временем стало выясняться, что определение качественного
состава и количественного содержания аминокислот, входящих в
состав пептида муреина молочнокислых бактерий, недостаточно для
характеристики типа муреина. Оказалось, что при одинаковом ами-
нокислотном составе микроорганизмы могут различаться последо-
вательностью аминокислот в пептидной цепочке. Выяснилось так-
же, что для идентификации штаммов лактобацилл существенную
роль играет установление того, какие аминокислоты участвуют в
осуществлении поперечной связи между пептидными цепочками в
муреине.
Оказалось, что большинство лактобацилл (см. табл. 14) имеет
аминокислотный состав пептидных компонентов муреина: Ала-
Глу-Лиз-Асп (2:1:1:1). Муреин бактерий вида L. coprophilus име-
ет другой аминокислотный состав: Ала-Глу-Лиз 4:1:1 (Plapp,
Kandler, 1967b); L. viridescens — Ала-Глу-Лиз-Сер (4: 1:1:1) (Ka-
ndler, Abo-Elnaga, 1966a), a L. cellobiosus — Ала-Глу-Орн-Асп
(2:1:1:1) (Kandler, Abo-Elnaga, 1966b).
Важные результаты по изучению последовательности амино-
142
кислот в пептидах муреина лактобацилл (а также бифидобактерий
и молочнокислых стрептококков) были получены немецкими авто-
рами (Kandler et al., 1967; Schleifer, Kandler, 1967a, b; Plapp, Kand-
ler, 1967a, b; Kandler et al., 1968a).
К настоящему времени установлено, что лактобациллы различ-
ных видов в пределах подродов Streptobacterium и Betabacterium
характеризуются несколькими типами муреина, тогда как пред-
ставители подрода Thermobacterium однотипны по этому признаку
(Kandler, 1970).
Так, все термобактерии содержат L-Лиз-В-Асп-тип муреина. .
Это свойство сочетается с нахождением в их клеточных стенках,
как правило, глицеринтейхоевой кислоты.
Подрод Streptobacterium можно распределить на две группы
(табл. 23) — одна имеет L-Лиз-В-Асп-тип муреина, другая — ме-
зо-ДПК-тип. Тейхоевые кислоты у штаммов видов этого подрода
обнаруживаются редко. Они представлены рибиттейхоевой кисло-
той у подвидов L. plantarum ssp. plantarum и L. plantarum ssp. ara-
binosus, а также глицеринтейхоевой кислотой у L. casei ssp. tole-
rans (табл. 23). Причем, последняя характеризуется тем, что в ее
составе не был обнаружен В-аланин, который присоединяется к
гидроксильной группе глицерина эфирной связью (Kandler, 1970).
Таблица 23
Распределение типов муреина среди видов подродов Streptobacterium
и Sporolactobacillus * (по Kandler, 1970)
Вид Число штаммов Тип муреина Тейхоевая кислота
L. casei
ssp. casei 10 Ь-Лиз-D-Acn Нет
ssp. pseudoplantarum 5 »
ssp. rhamnosus 2 » »
ssp. tolerans 2 » Глицеринтейхоевая
ssp. fusiformis 3 » Нет
L. sake 1 » ?
L. coryniformis Нет
ssp. coryniformis 4 » »
ssp. torquens 2 )>
L. curvatus 4 » »
L. plantarum
ssp. plantarum 80 .мезо-ДПК-тип Рибиттейхоевая
ssp. arabinosus 40 » »
var. mobilis 3 » Нет
L. inulinus 4 » »
* Согласно терминологии Канцлера, при характеристике типов муреина везде ука-
зывается только диаминокислота и аминокислоты межпептидного мостика.
143
Полученные данные, по мнению Канцлера, могут свидетельст-
вовать в пользу объединения видов L. plantarum и L. inulinus в
отдельный подрод (Sporolactobacillus), имеющий ряд признаков,
общих с родом Bacillus, а именно: ДПК-тип муреина, нахожде-
ние в стенках клеток рибиттейхоевой кислоты, иногда подвиж-
ность лактобацилл, способность восстановливать нитраты в нитри-
ты и т. д.
Виды подрода Betabacterium также характеризуются различны-
ми типами муреина (табл. 24). При этом интересно заметить, что
аминокислотная последовательность межпептидного мостика в
муреине бактерий L. viridescens ssp. minor является обратной по
сравнению с последовательностью межпептидных аминокислот му-
реина организмов другого подвида — L. viridescens ssp. viridescens.
Это говорит в пользу разделения вида на два подвида и подтвер-
ждает данные морфолого-физиологических исследований (Kandler,
1970).
Муреины двух подвидов L. coprophilus, установленных ранее
(Holzapfel, Kandler,1969), отличаются между собой числом моле-
кул аланина внутри пептидного мостика (табл. 24).
Глицеринтейхоевые кислоты, содержащие D-аланин, связан-
ный эфирной связью с глицерином, обнаружены только у отдель-
ных видов бетабактерий (табл. 24).
Исследование типов муреина клеточных стенок лактобацилл
оказалось полезным и при установлении родового положения ряда
Таблица 24
Распределение типов муреина среди видов подрода Betabacterium
(по Kandler, 1970)
Вид Число штаммов Тип муреина Тейхоевая кислота
L. fermenti 6 Ь-Лиз-D-Acn Нет
L. brevis 10 » Глицеринтейхоевая
L. buchneri 1 » »
L. fructovorans 1 » Нет
L. malefermentans 1 » ?
L. pastorianus 1 » .?
L. parvus 1 » ?
L. frigidus 1 » ?
L. hilgardii 1 ?
L. cellobiosus 4 L-OpH-D-Аоп Нет
L. viridescens ssp. viri- 6 Ь-Лиз-Ь-Ала-Ь-Сер ?
descens
ssp. minor 4 Ь-Лиз-Ь-Сер-( L-Ала), Глицеринтейхоевая
L. coprophilus ssp. сорго- philns 3 L-Лиз-Ь (Ала)? Нет
ssp. confusus 14 L-Лиз-Ь-Ала »
144
«сомнительных» членов рода Lactobacillus. Так, тип муреина в
клетках L. bifermentans (Ь-Лиз-D-Acn), образующих при сбражи-
вании глюкозы молочную кислоту, которая затем ферментируется
до уксусной кислоты, спирта, СО2 и Н2 (Pette, van Beynum, 1943),
свидетельствует о том, что эти организмы родственны лактобацил-
лам. К ним должны быть отнесены, очевидно, и микроорганизмы,
вызывающие порчу сыра в результате образования газа из амино-
кислот (Stadthouders et al., 1966). Эти бактерии не сбраживают са-
хара и, по-видимому, их целесообразно объединить в новый подрод
(Kandler, 1970).
В заключение необходимо отметить, что химический состав
клеточных стенок молочнокислых бактерий может быть с успехом
использован в классификационной работе только в том случае, ес-
ли при выращивании молочнокислых бактерий учтен ряд факто-
ров. Так, недостаток в питательной среде такого компонента, как
лизин, присутствие бактериофага, действие антибиотиков (пени-
циллин, ванкомицин, циклосерин) может существенно сказаться
на структуре и химическом составе компонентов клеточных стенок
(Kandler, 1970). Исследования компонентов клеточных стенок мо-
лочных бактерий, особенно муреина и тейхоевых кислот, продол-
жаются.
Таким образом, данные, полученные на основании изучения
химического состава компонентов клеточных стенок лактобацилл,
в частности, муреина, с успехом используются не только при иден-
тификации видов, но и могут указывать на определенные взаимо-
отношения молочнокислых палочек с иными группами бактерий
как в пределах семейства Lactobacillaceae, так и вне его.
Так, муреин типа Ь-Лиз-В-Асп, помимо большинства лактоба-
цилл, обнаружен также у Bacillus sphaericus (вегетативные клет-
ки) и ряда видов актиномицетов. Мезо-ДПК-тип муреина найден
у разновидностей L. plantarum, L. inulinus и в спорах Вас. sphae-
ricus. _ ------------------------------------------------———
/ Нахождение у бетабактерий таких типов муреина как Ь-Лиз-
Ь-Ала, L-Лиз- (Ъ-Ала) 2, Ь-Лиз-Ь-Ала-Ь-Сер и Ь-Лиз-Ь-Сер (L-Ала) 2
подтверждает факты родства между некоторыми бетабактериями {
и лейконостоками, которые были установлены на основе общности
ряда их морфологических и физиологических свойств (Sharpe et
al., 1972). Тип муреина у большинства представителей рода Strep-
tococcus (Schleifer, Kandler, 1967а, Ь, и др.) также говорит о тес-
ном родстве стрептококков и лактобацилл^--------------------------
Свободные аминокислоты и пептиды клеток
Клетки различных видов микроорганизмов характеризуются опре-
деленным составом свободных аминокислот (Work, Dewey, 1953).
В связи с этим метод хроматографии на бумаге экстрагируемых
аминокислот и пептидов был предложен для идентификации молоч-
нокислых бактерий (Mattick et al., 195б).
145
Беридж с сотрудниками (Berridge et al., 1957) отметили,
что состав свободных аминокислот меняется с возрастом микроор-
ганизмов. Наиболее воспроизводимые данные получаются при
исследовании бактерий в конце логарифмической фазы их роста,
когда набор аминокислот в клетках наиболее полный. Достовер-
ные и отчетливые данные получены для L. casei, L. bulgaricus и
L. brevis в возрасте 26—30 час.
Свободные аминокислоты клеток штаммов группы L. casei — L.
plantarum незначительно отличаются при выращивании бакте-
рий в бульоне с глюкозой и томатным соком или глюкозой и
дрожжевым автолизатом. Гетероферментативные лактобациллы,
выращенные при 30 и 37°, отличаются между собой по количе-
ству тирозина, лизина, серина и глицина (Cheeseman, 1959).
Чисмен с соавторами (Cheeseman et al., 1957) показали, что
разделение вида L. casei на серологические группы В и С под-
тверждается данными хроматографических исследований: у боль-
шинства культур группы С обнаружен валин и интенсивное пят-
но аланина, тогда как только единичные культуры группы В со-
держат эти аминокислоты. Мэттик с сотрудниками (Mattick et
al., 1957) отмечают надежность и четкость результатов, получен-
ных при применении метода хроматографии на бумаге свободных
аминокислот клеток для дифференциации L. casei и L. plantarum.
Хроматограммы свободных аминокислот клеток термофильных
молочнокислых палочек L. bulgaricus и L. helveticus не отлича-
ются друг от друга (Mattick et al., 1956; Bottazzi, 1958). А штам-
мы, отнесенные к L. acidophilus на основании физиологических!
признаков, сходны и по составу свободных аминокислот.
Сильва и Чисмен (Silva, Cheeseman, 1959) обнаружили, что
L. plantarum отличается от представителей других видов (L. lac-
tis, L. leichmannii, L. delbrueckii, L. salivarius) по наличию в эк-
страктах клеток пролина и аминомасляной кислоты. Авторы уста-
новили, что! L. salivarius, по данным хроматограмм, ближе к L. ca-
sei, чем к L. lactis, a L. leichmannii — к L. lactis. Последнее под-
тверждают данные Рогозы и Шарп (Rogosa, Sharpe, 1959), которые
отнесли L. leichmannii и L. lactis к подроду Thermobacterium.
В серии работ, посвященных дифференциации видов и штам-
мов внутри видов молочнокислых бактерий с помощью /метода^
хроматографии/ на бумаге свободных Д аминокислот^ и пептидов ,
клетки, экстрагированных разведенной уксусной кислотой, сле-
дует отметить и сообщение Чисмена и сотрудников (Cheeseman,
Silva, 1959; Cheeseman, Berridge, 1959.) Они, использовав элект-
ронно-вычислительную машину, оценили данные, полученные
для 91 штамма гетероферментативных молочнокислых бактерий,
и разделили их на две группы, соответствующие группам бакте-
рий с низкими (L. brevis) и высокими (L. fermenti) температур-
ными точками роста. Интересно отметить, что в последней груп-
пе все штаммы кишечного происхождения отличались от штам-
мов, выделенных из других источников (по наличию глицина).
146
Впоследствии Чисмен (Cheeseman, 1960), изучив состав сво-
бодных аминокислот молочнокислых палочек, выделенных из
сыров чеддер, смог распределить их в группы, сходные с груп-
пой L. casei — L. plantarum и группой гетероферментативных
палочек с низкой оптимальной температурой роста. По биохими-
ческим и морфологическим признакам исследованные бактерии
были разбиты на те же группы.
Итак, ценность приведенного выше метода диагностики мо-
лочнокислых палочек заключается в том, что во многих случаях
идентификация, основанная на данных хроматографического
определения свободных аминокислот и пептидов, соответствует
идентификации их на основании использования других призна-
ков (физиологических, серологических). Однако показано так-
же, что состав свободных аминокислот клеток зависит от многих
факторов (температуры выращивания организма, возраста куль-
туры) и у отдельных штаммов в пределах вида может разли-
чаться. Поэтому деление молочнокислых бактерий на виды на
основе изучения свободных аминокислот клеток может служить
только дополнительным средством при диагностировании этих
организмов.
По мнению Ридла с сотрудниками (Riddle et al., 1956), дан-
ные об особенностях инфракрасных спектров поглощения кле-
ток могут быть использованы при идентификации микроорга-
низмов. Гоулден и Шарп (Goulden, Sharpe, 1958) применили
этот метод при изучении 11 видов лактобацилл и установили,
что спектры поглощения бактерий, за .немногими исключениями,
могут быть сгруппированы в пять отчетливо различающихся спект-
ральных типов, каждый из которых соответствует одному виду
или группе родственных видов подродов Streptobacterium, Beta-
bacterium и Thermobacterium. Следует отметить, что вид L. casei
по спектрам поглощения можно разделить на две подгруппы,
соответствующие двум серологическим группам В и С.
Изучение инфракрасных спектров поглощения представляет
большой интерес, так как они свидетельствуют о химическом со-
ставе организмов. Например, термобактерии содержат относитель-
но большее количество нуклеиновых кислот, чем стрепто- и бета-
бактерии.
Содержание гуанина и цитозина в ДНК бактерии
Проведены значительные исследования с целью использования
показателей процентного содержания гуанина+цитозина (Г+Ц)
в ДНК для идентификации гомо- и гетероферментативных мо-
лочнокислых бактерий (Suzuki, Kitahara, 1964; Cantoni et al.,
1965a, b; Gasser, Sebald, 1966; Cantoni, 1966a, b, c; Gasser, Mandel,
1968; Miller et al., 1970).
Как известно, для установления процентного содержания
Г+Ц в изолированной из клеток ДНК существует ряд методов.
ДНК можно гидролизовать до свободных оснований, а затем хи-
мическим методом хроматографии на бумаге разделить эти осно-
вания и установить их относительное количество.
Существует пропорциональная зависимость между количе-
ством Г+Ц (в мол.%) в ДНК и ее плавучей плотностью в гради-
енте хлористого цезия (который устанавливается после ультра-
центрифугирования раствора CsCl). На этой основе разработан
метод определения содержания г+ц ™I_______изучению плавучей
плотности ДНК в градиенте плотностиZLCsClj (Schildkraut et al.,
1962). Широко используют также метод измерения тепловой де-
натурации ДНК (Marmur, Doty, 1962).
К сожалению, отдельные авторы при проведении работ с мо-
лочнокислыми бактериями использовали различные методы, что
нередко являлось причиной значительного расхождения в полу-
ченных результатах (Gasser, Mandel, 1968).
Гассер и Себальд (Gasser, Sebald, 1966) на основании про-
веденных химическим методом исследований нуклеотидного со-
става ДНК лактобацилл разделили их на три группы: 1) виды с
ДНК, содержащей 33—37,9 мол. % Г+Ц: L. jugurti, L. helveticus,
L. salivarius, L. acidophilus; 2) виды с ДНК, содержащей 42—
47 мол. % Г+Ц: L. buchneri, L. brevis, L. casei, L. plantarum;
3) виды с ДНК, содержащей 47—53 мол. % Г+Ц: L. bulgaricus,
L. lactis, L. leichmannii, L. delbrueckii, L. fermenti, L. cellobiosus.
Позднее Гассер и Мендель (Gasser, Mandel, 1968) исследовали
нуклеотидный состав ДНК тех же штаммов методом измерения
ультрацентрифугированием плавучей плотности двухспиральной
ДНК в градиенте плотности CsCl (содержание Г+Ц рассчитывали
из средней плавучей плотности по формуле Шилдкраута, Мар-
мура и Доти) (Schildkraut et al., 1962). ДНК получали путем
обработки клеток молочнокислых бактерий лизоцимом, додецил-
сульфатом натрия и ферментами, продуцируемыми Streptomyces
albidoflavus, который выращивали на дрожжевых клеточных стен-
ках. Авторы показали, что указанный метод определения нуклео-
тидного состава ДНК, в отличие от иных (хроматографического
и изучения температуры плавления ДНК), дает возможность
получать более воспроизводимые результаты и устанавливать
четкие различия между видами с близкими показателями содер-
жания Г+Ц в ДНК. Исследователи показали, что L. acidophilus
и L. salivarius имеют достаточно различное содержание Г+Ц в
ДНК, чтобы считать их разными видами; виды L. viridescens и
L. brevis гетерогенны; нуклеотидный состав ДНК бактерий видов
L. casei и L. plantarum различается лишь незначительно; L. bulga-
ricus, L. lactis, L. leichmannii, L. delbrueckii очень близки между
собой по составу ДНК, что справедливо также для видов L. fer-
menti и L. cellobiosus.
В таблице, обобщающей большое число исследований отдельных
авторов, мы приводим среднее содержание (в мол.%) Г+Ц в ДНК
различных видов молочнокислых палочковидных бактерий. Нолу-
148
ченные данные отчетливо показывают, что в ряде случаев внутри
видов наблюдаются существенные колебания в содержании Г+Ц;
в то же время некоторые виды лактобацилл трудно дифференци-
ровать ио содержанию ГЦ-пар (табл. 25).
Известно, что идентичность процентного содержания Г+Ц
у двух организмов еще не является доказательством их принадлеж-
ности к одному виду. В связи с этим более полная информация
о родстве двух штаммов может быть получена при изучении
генетической гомологии ДНК или РНК двух организмов, дающей
представление о последовательности оснований в их ДНК или РНК.
Именно поэтому за последние годы систематика лактобацилл при-
влекает данные по гибридизации ДНК различных видов. Эти ис-
ледования по генетической гомологии, однако, серьезно осложня-
ются трудностями в получении ДНК из клеток лактобацилл (Jones,
Walker, 1968; Bogosa,. 1970). >
Используя(Р33-ДНК)Ь. bulgaricus щнемеченную ДШу L. bulga-
ricus, L. lactis, L. jugurti, L. helveticus, удалось показать, что ДНК
L. bulgaricus гибридизируется на 98% с ДНК L. bulgaricus, на 86 %
с ДНК L. lactis, на 3—5% с ДНК L. helveticus и не гибридизирует-
ся с ДНК L. jugurti (Simonds et al., 1971; Hansen, 1971 b). Эти дан-
ные, подтверждая результаты исследований по изучению содер-
жания Г+Ц в ДНК лактобацилл (табл. 25), убедительно свиде-
тельствуют о тесном родстве между видами L. bulgaricus и
L. lactis и об отсутствии такового между L. bulgaricus и L. jugurti,
хотя спектры сбраживаемых двумя последними видами углеводов
совпадают (Hansen, 1971b). Приведенные сведения еще раз под-
тверждают необходимость использования целого набора коррели-
рующих между собой признаков, прежде чем причислить микро-
организм к тому или иному виду.
Электрофоретическая характеристика дегидрогеназ
В последнее время для дифференциации видов молочнокислых
бактерий используются и такие признаки, как электрофорети-
ческая подвижность ряда клеточных ферментов — лактатдегидро-
геназ, глюкозо-6-фосфатдегидрогеназы (Gasser, 1970; Williams,
Sadler, 1971; Sharpe et al., 1972). Известно, что лактобациллы со-
держат ферменты, осуществляющие превращение пирувата в D
(—)- или L (+)-молочную кислоту. Это NADH-зависимые пиру-
ватредуктазы, обнаруженные, например, у L. plantarum. Имеются
и флавин, но не NAD-зависимые ферменты, катализирующие реак-
цию превращения лактата в пируват и выявленные у L. casei.
Это NAD-независимые лактатдегидрогеназы (Gasser, 1970; Sharpe
et al., 1972). Исследуя с помощью электрофореза ферменты, мож-
но получить данные, коррелирующие с результатами изучения
морфолого-физиологических признаков и нуклеотидного состава
ДНК у представителей определенных видов лактобацилл.
149
Таблица 25
Сравнительное содержание Г + Ц (мол. %) в ДНК бактерий различных
видов рода Lactobacillus (по Gasser/ Mandel, 1968) *
Вид Метода определения Г + Ц
хроматографи- ' ческий по температуре плавления по плавучей плот- ности ДНК (1)
L. jugurti 37,2±1,0 [10] 33,5 [4] 39+0,9
L. helveticus 36,7±0,6 [10] 31,8 [4] 39,3
L. salivarius -'^34,8±1,8 [10] 28,2 [3] 34,7+1,4
L. acidophilus 36,5±1,2 [10] 31,9 + 1,5 [2] 36,7+0,7
L. viridespens 47,2 [27] 37,9 [10] 41,0 [27] 39,0 [13]' 42,0 [22] . 42,3 35,7
L. buchneri 42,3±0,4 [10] 44,0 [5] 44,5+0,7 [6] 43,9 [4]
L. brevis 43,2 [10] 43,9 [10] 53,1 [27] 45,5 [5] 43,7+1,4 [6] 45,5 [4] 41,3+3,2] [2] 42,7±1,5 46,4 + 1,0
L. casei 46,2±2,0 [10] 47,2 [27] 47,3+0,6 [6] 47,1+0,8 [2 47,1+0,7 [3] 46,8+0,8 [5 ' 46,4+0,8
L. plantarum. 43,1±0,9 [10] 42,9 [27] 43,0 [5] 42,6 + 1,8 [6] 41,9+1,8 [2] 43 [3] 42,7+0,9 [4] 45,0±1,0
L. bulgaricus 48,9±0,8 [10] 45,5 [27] 41,1 [4] 50,3±1,0
L. lactis 48,3±0,1 [10] 36,8 [2] 35,7 [2] 50,3 + 1,4 .
L. leichmannii 49,3±0,4 [10] 38,1 [27] 31,7 [4] 30,4±1,4 [2[ 50,8±0,5
L. delbrueckii 47,8±1,2 [10] 51,2 [27] 28,9 [6] 50,0
L. fermenti 49,8±0,4 [10] 51,5 [5] 51,8 [4] 53,4+0,5
L. cellobiosus 51,3±2,4 [10] 45,5 [5] 45,7 [4] 53,1+0,8
следующие исследования:
12, 3, 4] — Canton!, 1966а, Ь, с;
[5] — Canton! et al., 1965а;
[6] — Canton! et al., 1965b;
[16] — Gasser, Sebald, 1966;
* Цифры в скобках означают ссылки на
[1] данные по Gasser, Mandel, 1968;
" " " ' ’ [13] — Marmur, Doty, 1962;
[22] — Schildkraut et al., 1962;
[27] — Suzuki, Kitahara, 1964.
150
Так, Гассер (Gasser, 1970) методом электрофореза в крахмале
у различных видов молочнокислых бактерий изучил указанные
ферменты и показал, что различия в электрофоретической подвиж-
ности их могут быть с успехом использованы для разграничения
видов, особенно тех, которые трудно дифференцируются с помо-
щью физиологических свойств — L. acidophilus и L. leichmannii,
L. jugurti и L. bulgaricus, L. casei и L. plantarum. По мнению ис-
следователя, электрофоретическая подвижность, число и природа
(NAD-зависимые, NAD-независимые, стереоспецифичные в отно-
шении D (—) или L (+)-молочной кислоты) лактатдегидрогеназ
постоянны в пределах одного вида.
По электрофоретической подвижности NAD-зависимых или
NAD-независимых, D- или (и) L-лактатдегидрогеназ (терминоло-
гия Гассера) ряд видов лактобацилл можно объединить в группы,
соответствующие группам, которые формируются по содержанию
в ДНК ГЦ-пар. Так, в компактные группы объединяются виды
L. bulgaricus, L. delbrueckii, L. lactis, L. leichmannii; L. jugurti и
L. helveticus. Особняком стоят виды L. jensenii и L. acidophilus, a
L.casei по электрофоретической подвижности NAD-зависимой
L-лактатдегидрогеназы приближается к виду L. salivarius (Hansen,
1971b).
На основании электрофоретической подвижности глюкозо-6
фосфатдегидрогеназы гетероферментативные лактобациллы разде-
ляются на две группы: L. fermenti и L. cellobiosus; L. brevis,
L. buchneri и L. viridescens (Williams, Sadler, 1971). Определенные
таксономические выводы в отношении видов бетабактерий сделаны
также Шарп с сотрудниками (Sharpe et al., 1972), изучавшими
электрофореграммы пируват — и лактатдегидрогеназ, о чем мы
упоминали выше при обсуждении свойств слизеобразующих бета-
бактерий.
Интересно отметить, что Гассер с сотрудниками (Gasser et al.,
1970) описали вид подрода Thermobacterium — Lactobacillus jense-
nii sp. nov., близкий к L. leichmannii. Новый вид отличался от
последнего процентным содержанием Г+Ц и ДНК (36,1 ±
1,2 мол.%) и электрофоретической подвижностью лактатдегидро-
геназ, а от L. acidophilus и L. jugurti — оптическим вращением *
образуемой молочной кислоты, гидролизом аргинина и по сбра-
живанию лактозы.
Виды молочнокислых палочковидных бактерий пытаются диф-
ференцировать и на основании показаний электрофореграмм водо-
растворимых белков. Найдено, что L. casei имеет постоянный на-
бор эстераз, тогда как у L. plantarum он значительно разнится у
отдельных штаммов. Термо- и бетабактерии обладают очень слабо
выраженной эстеразной активностью (Morichi et al., 1968).
Не исключено, что данные о различиях в составе внутрикле-
точных жирных кислот могут также оказаться перспективным для
диагностики видов родов Sporolactobacillus, Lactobacillus, а также
для установления систематического положения микроорганизмов,
151
характеризующихся свойствами, присущими как бактериям рода
Bacillus, так и Lactobacillus (Вас. coagulans и др.) (Uchida, Mogi,
1973, и др.).
Нумерическая систематика
Последние годы характеризуются привлечением к исследованию
молочнокислых бактерий методов нумерической таксономии. Была
сделана попытка классифицировать значительное количество мо-
лочнокислых бактерий (стрептококков, лактобацилл) и пропионо-
вокислых бактерий с помощью нумерического анализа 70 таксо-
номических признаков с применением электронно-вычислительной
машины (Seyfried, 1968). Коэффициенты подобия штаммов опре-
делялись методом Сокала и Миченера.
Нумерический анализ показал, что палочковидные молочнокис-
лые бактерии разделяются на три подгруппы, объединяющие со-
ответственно термобактерии, стрептобактерии и бетабактерии. Сре-
ди термобактерий коэффициент подобия между видами L. bulgari-
cus и L. helveticus относительно низок, что говорит в пользу отне-
сения их к разным видам. Это же можно сказать и о видах L. del-
brueckii и L. leichmannii.
Гетероферментативные молочнокислые бактерии второй под-
группы имеют коэффициент подобия 75%. Стрептобактерии, имею-
щие коэффициент подобия 79%, составляют третью подгруппу
рода. Причем, L. pentosus и L. arabinosus обнаруживают высокую
степень подобия L. plantarum, что говорит о принадлежности ука-
занных организмов к одному виду.
Зейфрид (Seyfried, 1968) на основании данных работы считает
необоснованным включение лактобацилл в семейство Propionibac-
teriaceae.
Таким образом, в настоящее время при идентификации молоч-
нокислых палочковидных бактерий используются различные ме-
тоды.
Ряд простых физиолого-биохимических тестов, легко выявляе-
мых на практике и предложенных сейчас для установления родо-
вого и видового положения лактобацилл, приобретает важное так-
сономическое значение. С их помощью удается идентифицировать
молочнокислые бактерии таким образом, что результаты этой диаг-
ностики совпадают с теми, что достигаются при использовании дру-
гих, часто сложных и длительных методов (электрофоретическая
подвижность ряда дегидрогеназ, инфракрасные спектры поглоще-
ния, серологические, химический состав клеточных стенок, свобод-
ные внутриклеточные аминокислоты и пептиды, содержание ГЦ в
ДНК, наличие ряда ферментов, осуществляющих сбраживание уг-
леводов и др.).
Например, обособление подродов Streptobacterium, Betabacteri-
um и Thermobacterium строится на морфолого-культуральных и
152
физиологических признаках, а также наличии у лактобацилл спе-
цифических инфракрасных спектров поглощения, определенном
типе муреина, потребности в ряде витаминов, ферментах, прини-
мающих участие в брожении субстратов. Наличие серологических
разновидностей В и С у вида L. casei подтверждается специфи-
ческим составом компонентов их клеточных стенок (в частности,
полисахаридов), спектральными анализами и составом свободных
аминокислот клеток. Специфический аминокислотный состав кле-
точных стенок у L. plantarum коррелирует с рядом физиологи-
ческих признаков этого вида. Число подобных примеров совпаде-
ния результатов определения видовой и родовой принадлежности
молочнокислых бактерий различными методами можно значитель-
но продолжить.
На основании анализа литературных сведений и личных иссле-
дований для идентификации молочнокислых бактерий рекоменду-
ем пользоваться схемами, приведенными в табл. 10—15. Эти схе-
мы, дополняющие друг друга, отражают современное состояние
проблемы видовой диагностики лактобацилл и могут быть исполь-
зованы работниками науки и практики. Признаки, положенные в
основу этих схем, взяты и для идентификации лактобацилл в по-
следнем издании определителя Берджи, опубликованном в 1974 г.
В нем также описаны и еще слабо изученные виды (L. xylosus,
L. homochionii, L. hilgardii, L. trichodes, L. fructivorans, L. desidio-
sus, L. heterochionii), изолированные из вин, фруктовых соков,
саке и т. д.
Род Streptococcus
К роду Streptococcus относят молочнокислые кокки сферической
или овальной формы, редко вытянутые, делящиеся в одной плос-
кости и располагающиеся парами, короткими или длинными цепоч-
ками в зависимости от условий роста и вида микроорганизма.
Стрептококки являются факультативными анаэробами; требова-
тельны к источникам питания, в частности, ряду витаминов груп-
пы В и аминокислот.
В настоящее время классификация стрептококков не может счи-
таться окончательно разработанной. Она основывается главным
образом на изучении морфолого-культуральных и физиологических
признаков бактерий, а также определении их серологической груп-
повой принадлежности (групповой антиген по Ленсфилд). Следу-
ет отметить, однако, что таксономические единицы, устанавливае-
мые по указанным выше признакам, не всегда совпадают (Colman,
Williams, 1965).
Проведены исследования с целью диагностирования стрептокок-
ков на основе изучения определенных химических компонентов их
клеточных стенок. В ряде случаев получены удовлетворительные
результаты. Так, показано, что представители, вида Streptococcus
(Diplococcus) pneumoniae содержат в клеточных стенках холин,
153
глицерин и галактозамин — компоненты, не обнаруживаемые у дру-
гих видов рода Streptococcus (Gooder, 1970). По данным Колмена
иУильямса (Colman, Williams, 1965), качественный моносахарид-
ный состав клеточных стенок стрептококков может служить осно-
вой для четкой дифференциации отдельных видов рода Streptococ-
cus, например, Str. pyogenes и Str. agalactiae. Авторам удалось так-
же показать, что серологическую группу К и Str. salivarius можно
разделить на два типа. При этом только те штаммы группы К не
содержат в составе бактериальных клеточных стенок рамнозу (но
имеют ангидрорибит), которые не образуют леван.
Вместе с тем, Колмен и Уильямс установили, что по составу са-
харов, находящихся в клеточной стенке стрептококков, не удается:
дифференцировать виды в пределах некоторых серологических
групп (например, N, Д). К таким же выводам в отношении сероло-
гических групп А, К, О пришли и другие авторы (Gooder, 1970).
Безуспешным, как правило, является использование для диф-
ференциации видов стрептококков данных о качественном соста-
Таблица 26
Пептидогликаны стрептококков (по Gooder, 1970) *
Вид Межпептидный мостик
S. pneumoniae S. pyogenes (группа А) Энтерококки S. faecalis S. faecium (и варианты) Зеленящие (S. thermophilus) Молочная группа S. lactis, S. cremoris S. cremoris 316a, 331a №-(???)-Ь-Лиз N e-(L-Ana-L-Ana)-L-Л из №-(Е-Ала-Е-Ала-Ь-Ала)-Ь-Лиз NC-(D-H3O AcnN)—L-Лиз МЕ-(Е-Ала-Ь-Ала-Ь-Ала)-Ь-Лиз Ne-(D-iso-AcnN)-L-flH3 №-(Ь-Ала-Ь-Тре)-Ь-Лиз
* Пептидная субъединица-Ка(Ь-Ала-Н-изо Глю)-Ь-Лиз-В-Ала
ве и количественном содержании аминокислот и аминосахаров, на-
ходящихся в их клеточных стенках (Gooder, 1970).
Более удачными можно считать попытки классифицировать
стрептококки на основе изучения типа муреина их клеточных сте-
нок. У стрептококков обнаружено несколько типов муреина (табл.
26). По-видимому, большинство стрептококков, входящих в состав
серологических групп по Ленсфилд (за исключением групп N и D),
имеют межпептидный мостик Б-Лиз-(Б-Ала)2. Str. faecium и мо-
лочные стрептококки имеют L-Лиз-Б-Асп-тип муреина, чаще все-
го обнаруживаемый и у видов подродов лактобацилл. Установлено,
что по типу муреина штаммы вида Str. cremoris неоднородны
(табл. 26) (Schleifer, Kandler, 1967 а, Ь). Интересно отметить,
что в клеточной стенке бактерий одного из штаммов этого вида был
найден сахар 6-деокситаллоза, обнаруженный ранее у Actinomyces
bovis (Colman, Williams, 1965).
Остановимся на характеристике отдельных видов стрептокок-
ков, объединяемых в ряд групп. В соответствии с предложением
Шермена (Sherman, 1937), род Streptococcus в определителе Берд-
жи (Breed et al., 1957) разделен на четыре группы: пиогенные,
зеленящие, энтерококки и молочные (табл. 27).
Таблица 27
Группы рода Streptococcus * (по Abd-el-Malek, Gibson, 1948; Breed etal., 1957
Признак Группа и ее представители
Pyogenic (Str. pyo- genes) Viridans (Str. bovis, Str. ther- mophilus) Enterococ- cus (Str. faecalis) Lactic (Str. lactis, Str. cre- moris)
Рост при 10° — — + +
» 45° — + + —
в среде с 6,5% NaCl — — + —
» pH 9,6 — — + —
в молоке с 0,1 % метиленовой сини — — + +
Интенсивное восстановление лакмуса перед сквашиванием молока — — +
Декарбоксилирование тирозина — — + —
Выживаемость после нагревания при 63° 30 мин. — + + —
Гидролиз аргинина + — + ±
* Плюс — признак имеется; минус — признак отсутствует; + большинство штам-
мов положительно по этому признаку.
Пиогенная группа объединяет а- и ^-гемолитические стрепто-
кокки, приспособившиеся к паразитическому образу жизни в орга-
низме млекопитающих. Сюда относятся такие виды, как Strepto-
coccus agalactiae Lehmann and Neumann, 1896 и Streptococcus equi
Sand and Jensen, 1932, патогенные для коров и лошадей; Strepto-
coccus pyogenes Rosenbach, 1884 и Streptococcus equisimilis Frost
and Engelbrecht, 1936, патогенные для человека, и др. (Sharpe et
al., 1966).
Представители этой группы стрептококков слабо устойчивы к
действию поверхностно-активных веществ, высокого осмотического
давления и низких температур, низкого pH среды. Их лучше всего
культивировать в бульоне с сывороткой крови или кровью, с 0,1%
глюкозы и в атмосфере с 5—10% СО2 при 37° (Фробишер, 1965).
155
Серологическая группировка и типирование являются наибо-
лее широко используемым и довольно эффективным способом диф-
ференциации представителей пиогенных стрептококков. В на-
стоящее время их разделяют на ряд серологических групп — А,
В, С, Е, F, G, Н, М) (Sharpe et al., 1966).
Группа зеленящих стрептококков включает в себя такие виды,
как Streptococcus thermophilus Orla-Jensen, 1919, играющий важ-
ную роль при изготовлении сыров при высокой температуре, а так-
же Streptococcus salivarius Andrewes and Horder, 1906 и Streptococ-
cus mitis Andrewes and Horder, 1906, являющиеся обитателями ро-
товой полости и глотки человека. Поскольку у них не обнаружен
групповой антиген, эти микроорганизмы до настоящего времени
остаются не разделенными на серологические группы. Сюда же,
согласно определителю Берджи, отнесены виды Streptococcus bo-
vis Orla-Jensen, 1919, emend. Sherman, 1937 и Streptococcus equinus
Andrewes and Horder, 1906, выделяемые из коровьего навоза и ки-
шечного тракта крупного рогатого скота. Последние два организма,
принадлежащие к серологической группе D по Ленсфилд, рассмат-
риваются как близкие друг другу (Seeley, Dain, 1960; Smith, Shat-
tock, 1962). Однако в настоящее время нет единого мнения по по-
воду того, считать ли их отдельными видами или только биотипа-
ми одного вида; дискутируется также вопрос и о том, причислять
ли их к группе энтерококков (Raj, Colwell, 1966; Jones et al., 1972).
По данным Эллиот (Elliott, 1966), к виду Str. bovis близки и орга-
низмы Str. suis, хотя статус последнего вида остается предметом
дискуссии (Jones et al., 1972).
Еще Орла-Иенсен (Orla-Jensen, 1942) уделял значительное вни-
мание разработке приемов дифференциации видов группы зеленя-
щих стрептококков Str. bovis и Str. thermophilus. Автор устано-
вил, что Str. bovis растет в молоке и разлагает казеин; типичные
штаммы сбраживают арабинозу. Некоторые представители этого
вида, выделенные из кишечного тракта, не сбраживают раффино-
зу. Среди свойств Str. thermoplilus Орла-Иенсен отметил такое,
как способность быстро расти при 50°. Температура 80° не явля-
ется для них летальной; иногда бактерии растут и при 5°. Этот вид
слабо сбраживает маннозу.
Абд-эль-Малек и Джибсон (Abd-el-Malek, Gibson, 1948) предло-
жили ряд диагностических признаков для отличия Str. bovis от
Str. thermophilus. Они показали, что Str. thermophilus требователь-
ны к источникам питания, медленно растут на твердой среде и не
растут при температуре ниже 18°, некоторые штаммы растут
при 50°. Описываемый вид очень чувствителен к кислоте, которую
накапливает при росте в средах, поэтому при хранении культур
после сворачивания молока их необходимо удалить из термостата
и держать при температуре ниже 15°.
По данным авторов, некоторые штаммы Str. bovis гидролизуют
эскулин; иные растут в среде с 4% NaCl и в присутствии 0,1% ме-
тиленовой сини, подобно энтерококкам. О близости Str. bovis к
156
Таблица 28
Отличительные признаки видов Str. bovis и Str. thermophilus *
(по Orla-Jensen, 1942; Abd-el-Malek, Gibson, 1948)
Признак ** Str.- bovis Str. thermophilus
Выживаемость после нагревания — +
при 65°30 мин.
Рост при
50° —, иногда слабо т
16° — или медленно —
10—13° — или медленно —
в среде с 2% NaCl + ±
3% NaCl + —
4% NaCl —, иногда медленно —
0,1% метиленовой сини —, иногда медленно —
Гидролиз эскулина Т —
Диастаза ± —
Сбраживание
мальтозы + — или медленно
раффинозы + +
инулина ± —
маннита —, редко + —
сорбита —, редко + или медленно —
салицина ± —
Предпочтительное использование — +
сахарозы и лактозы перед глю-
козой
Агар с кровью — +
Устойчивость к 40% желчи + —
* + — Большинство штаммов отрицательно по этому признаку; остальные обозна-
чения см. табл. 27.
♦* Для обоих видов характерен рост при 45°, выживаемость после прогрева при
63° в течение 30 мин. Они сбраживают сахарозу и лактозу, не действуют на глицерин,
аргинин, гиппурат, желатин и казеин* Молоко с лакмусом подкисляют и в большин-
стве случаев сквашивают; слабо восстанавливают или не восстанавливают его; не обра-
зуют ацетоин и СО2 из глюкозы или цитрата; не растут в присутствии 6,5% NaCl.
фекальным стрептококкам сообщают и Ленгстон и Боума (Lang-
ston, Bouma, 1960а). Авторы из силоса выделили штаммы, близ-
кие к Str. faecalis, которые гидролизовали крахмал и этим прибли-
жались к виду Str. bovis. И все же, несмотря на наличие некото-
рых общих физиологических свойств у энтерококков и Str. bovis,
методы, предложенные Шерменом (Sherman, 1937), дают возмож-
ность дифференцировать Str. bovis от энтерококков (табл. 28).
Отличительными признаками Str. bovis следует считать способ-
ность их (как правило) энергично гидролизовать крахмал, сбра-
живать раффинозу и инулин.
157
Некоторые авторы предполагают, что вид Str. bovis следует,
возможно, разделить на два биотипа (Mann et al., 1954а; Dain et
al., 1956; Medrek, Bernes, 1962). Биотипы различаются по проду-
цированию кислоты из маннозы, реакции, вызываемой их предста-
вителями на агаре с кровью и способности культур образовывать
слизь на сахарозо-желатиновой среде. Барнес с сотрудниками (Bar-
nes et al., 1961), однако, не подтвердили наличия корреляции меж-
ду способностью Str. bovis ферментировать маннит и неспособно-
стью их образовывать слизь из сахарозы.
В табл. 28 мы приводим характерные свойства видов Str. bovis
и Str. thermophilus, которые могут быть использованы в практиче-
ской работе при идентификации штаммов.
Таблица 29
Отличительные признаки видов отдельных групп стрептококков *
(по Sharpe et., 1966)
Зеленящие, серологическая группа не установлена
Str. thermophilus
Str. salivarius
Str. mitis
Слабо
* Обозначения см. табл. 28
Необходимо указать, что Шарп с сотрудниками (Sharpe et al.,
1966) виды Str. bovis и Str. equinus отнесли к энтерококкам, хотя
физиологические свойства этих видов и не соответствуют тем, кото-
рые в качестве отличительных предложил для энтерококков Шер-
мен. К группе энтерококков причисляют указанные виды и другие
авторы (Deibel, 1964; Ray, Colwell, 1966). В табл. 29 можно найти
дополнительные сведения, необходимые для индентификации от-
дельных видов зеленящих стрептококков и представителей сероло-
гической группы D — Str. bovis и Str. equinus.
158
Энтерококки JS7
К энтерококкам (серологическая группа D по Ленс'филд) отно-
сят стрептококки пяти видов: Streptococcus faecalis Andrewes and
Horder, 1906 с разновидностями Streptococcus faecalis var. liquefa-
ciens (Sternberg, 1893, emend. Orla-Jensen, 1919) Mattick, 1947 и
Streptococcus faecalis var. zymogenes MacGallum and Hastings,
1890), Mattick, 1947; Streptococcus faecium Orla-Jensen, 1919; Stre-
ptococcus durans Sherman and Wing, 1937; Str. bovis и Str. equinus
(о двух последних видах мы говорили выше). По мнению Наулена
и Дейбла (Nowlan, Deibel, 1967), к энтерококкам следует от-
носить и вид Str. avium, включающий, однако, штаммы, содержа-
щие антиген Q.
Энтерококки, или фекальные стрептококки объединяются в
серологическую группу D на основании наличия у них общего
группоспецифического антигена. Этот антиген является глюкозо-
содержащим биополимером — глицеринтейхоевой кислотой, на-
ходящейся в цитоплазме клеток. За типовую специфичность стреп-
тококков группы D ответствен полисахарид, в состав которого
входят глюкоза, галактоза, рамноза, гексозамин. Он локализуется
в клеточной стенке стрептококков (Jones, Shattock, 1960; Wicken,
Baddiley, 1963; Wicken et al., 1963; Barber et al., 1964; Hahn, 1972) .
Фекальные стрептококки чрезвычайно широко распростране-
ны в природе. Они постоянно обнаруживаются в кишечнике и фе-
калиях человека и животных, в почве, воде, эпифитной микрофло-
ре. Их находят в замороженных мясных и растительных продук-
тах (бобах, горохе и т. д.), соках.
Ввиду свойства этих микроорганизмов сохранять свою жизне-
способность во внешней среде в течение долгого времени (не-
сколько недель) и сравнительно несложного их культивирования
фекальные стрептококки, наряду с бактериями группы coli —
aerogenes, являются показателями санитарного состояния воды и
пищевых продуктов (Калина и др., 1973). Их предложено исполь-
зовать при оценке фекального загрязнения среды (Ахмеджанов,
1957; Калина, 1964; Праве, 1972; Morris, Weaver, 1954; Barnes,
1956а; Hess, 1972; Giammanco et al., 1972, и др.).
Отдельные виды энтерококков могут явиться показателями
характера фекального загрязнения (т. е. человеческого оно или
животного происхождения). Так, Барнес (Barnes, 1959), а затем
Виттенбари (Whittenbury, 1965) установили, что Str. faecalis,
как правило, является обитателем кишечного тракта человека
(иногда птиц), a Str. faecium чаще всего обнаруживается в ки-
шечнике и испражнениях животных — свиней, крупного рогатого
скота. Аналогичные данные получил и Папавасилио (Papavassi-
liou, 1962). Из исследованных автором энтерококков группа
штаммов, принадлежащих к Str. faecium, была самой многочис-
ленной, гетерогенной и трудно идентифицируемой. Она была раз-
бита на шесть типов. Папавасилио объясняем вариабельность
159
свойств Str. faecium влиянием различных условий обитания в
кишечном тракте животных (овца, корова, свиньи, кролики, мы-
ши и др.) и человека.
По мнению В. В. Ильина и В. С. Касторского (1968а), хотя
энтерококки и могут считаться показателями фекального загря-
знения, все же путем определения видового состава энтерококков
невозможно установить природу загрязнения, так как StT. faeca-
lis, Str. faecium и Str. durans обнаруживаются как у человека, так
и у разнообразных животных (крупный и мелкий рогатый скот,
птицы, рыбы и т. д.). В то же время авторы подчеркивают, что
нахождение Str. bovis и Str. equinus во внешней среде свидетель-
ствует о свежем фекальном загрязнении объекта травоядными
животными.
В связи с большим интересом, который проявляется к устано-
влению природы фекального загрязнения воды, пищи, земли
(т. е. человеческого или животного происхождения), а также учи-
тывая наличие сведений (хотя и противоречивых) о том, что
энтерококки могут вызвать пищевые отравления при потреблении
различных продуктов (молоко, сыр, ветчина и др.) (Калина,
1964; Hartman et al., 1965), особенно остро ставится вопрос о не-
обходимости разработки надежных методов дифференцирования
видов группы энтерококков.
Тирцелин (Thiercelin, 1899, цит. Sherman, 1937) был первым
кто, изучив морфологические свойства грамположительных ди-
плококков кишечного происхождения, дал им название «энтеро-
кокки», а Эндрюс и Хордер (Andrewes, Horder, 1906) отнесли
выделенные ими из фекалиев человека стрептококки к новому
виду — Streptococcus faecalis. К нему были причислены штаммы,
которые не проявляли гемолитической активности, сбраживали
дисахариды и маннит, но не сбраживали инулин и раффинозу
(обычно), росли при 20° и обладали сильно выраженной восста-
новительной способностью.
Впоследствии Орла-Иенсен (Orla-Jensen, 1919) предложил
разделить стрептококки фекального происхождения, ферменти-
рующие маннит, на три вида — Str. faecium, Str. glycerinaceus и
Str. liquefaciens. Последние отличались от Str. glycerinaceus толь-
ко способностью разжижать желатин. По данным Орла-Иенсена,
характерными признаками Str. faecium являются способность
расти при 50°, слабо обесцвечивать молоко с лакмусом и сбражи-
вать арабинозу (часто рамнозу и раффинозу). В противополож-
ность Str. faecium, Str. glycerinaceus ферментирует сорбит и
глицерин.
Продолжением работ Орла-Иенсена явились дальнейшие ис-
следования Шермена (Sherman, 1937). Этот автор объединил в
группу энтерококков те кокки фекального происхождения, кото-
рые росли при 10 и 45°, в среде с 6,5% NaCl, при pH 9,6 и 0,1%
метиленовой сини, образовывали аммиак из аргинина, росли в
присутствии 40% желчи и выдерживали нагревание при 60° в
160
течение 30 мин. Эта монолитная группа включала четыре ви-
да — Str. faecalis, Str. liquefaciens, Str. zymogenes и Str. durans.
Первые три вида различались между собой лишь по способности
разжижать желатин и вызывать различный тип гемолиза на ага-
ре с кровью. Поэтому Шермен предложил считать их вариантами
одного вида.
Представители вида Str. durans не сбраживают маннит, обы-
чно не ферментируют сахарозу, обладают слабой редуцирующей
активностью и вызывают [1-гемолиз. Следует отметить, что автор
не считал Str. faecium (одним из характерных признаков его яв-
ляется отсутствие способности сбраживать глицерин) членом
группы энтерококков, ибо, по его мнению, почти все энтерококки
ферментируют этот спирт. Кроме того, Шермен указал, что спо-
собность восстанавливать краски — признак непостоянный, и
некоторые штаммы могут терять эту способность при длительном
культивировании их в лаборатории. Вариабельна и способность
сбраживать различные углеводы. В табл. 30 мы приводим пред-
ложенные Шерменом диагностические признаки, по которым мож-
но различать виды группы энтерококков. Эти сведения исполь-
Таблица 30
Свойства видов энтерококков (по Sherman, 1937)
* Означает существование случайных отклонений от типичной реакции.
** Не сбраживает мелибиозу, а гемолитическая активность — признак неустойчивый
(Whittenbury, 1965). Остальные обозначения см. табл. 27.
6 Е. И. Квасников, О. А. Нестеренко 161
зованы для отличия видов и в определителе Берджи (Breed,
1957).
Критерии, установленные Шерменом, на основании которых
фекальные стрептококки объединяются в группу энтерококков,
впоследствии стали широко использоваться в различных лабора-
ториях.
Со временем начали накапливаться данные о том, что энтеро-
кокки варьируют по некоторым признакам, например, неодинако-
во растут в среде с 6,5% NaCl, pH 9,6 и др. (Shattock, Hirsch,
1947). Было установлено, что способность бактерий выживать по-
сле нагревания их при 60° в течение 30 мин. зависит от pH ис-
пользуемой среды: при pH 6,8 наблюдается наибольшая устой-
чивость клеток к нагреванию, за пределами же этого значе-
ния способность выдерживать нагревание уменьшалась (Deibel,
1964).
Чесбро и Эванс (Chesbro, Evans, 1959) показали существен-
ное влияние состава среды на способность энтерококков расти
при pH 9,6. Наличие^ например, в среде олеата и включение в нее
вместо глицина карбоната способствовало росту штаммов в среде
с pH 9,6—10,5. Следует учитывать и физиологическое состояние
штаммов: свежевыделенные микроорганизмы нередко не обнару-
живают тех свойств, которые проявляются у них затем в процес-
се лабораторного культивирования.
Изложенные факты свидетельствуют о необходимости учета
возможной вариабельности отдельных характерных свойств груп-
пы энтерококков. Эти факты заставляют использовать при иденти-
фикации штаммов комплекс коррелирующих признаков, а также
применять стандартные, общепринятые методы и прописи сред
для выявления того или иного свойства микроорганизма.
Касаясь далее вопроса о разделении энтерококков на отдель-
ные виды, отметим, что после исследований Шермена Орла-Иен-
сен (Orla-Jensen, 1942) указал, что штаммы Str. faecium в отли-
чие от Str. glycerinaceus (синоним Str. faecalis) сбраживают
мелибиозу и растут при 50° (иногда растут при 5°). Последние
подобно Str. faecium выдерживают нагревание до 70—75°; при
посеве уколом Str. glycerinaceus обнаруживают более поверхно-
стный рост, чем иные молочнокислые бактерии.
С течением времени исследования, касающиеся обособления
среди энтерококков двух видов — Str. faecalis н Str. faecium —
углублялись и расширялись. В ряде работ, проведенных в
50—60-ые годы, было показано, что энтерококки, по-видимому,
все же следует разделить на две группы, характеризующиеся
определенными физиологическими свойствами. Одна группа —
Str. faecalis с разновидностями Str. faecalis var. liquefaciens и Str.
faecalis var. zymogenes и вторая — Str. faecium, разновидностью
которого, очевидно, следует считать Str. durans (Калина, 1964;
Ильин, Касторский, 19686; Barnes, 1956а, Lake et al., 1957; Deibel
et al., 1963; Whittenbury, 1965, и др.).
162
Г. П. Калина (1964, 1972) в группу энтерококков в качестве
разновидностей вводит Str. faecalis var. proprium (обладает свой-
ствами собственно Str. faecalis) и Str. faecalis var. haemolyticus.
Последняя разновидность, в отличие от Str. faecalis var. zymogenes,
не разжижает желатин. Для быстрой идентификации Str. faecalis
var. liquefaciens предложено использовать способность этих орга-
низмов вызывать пептонизацию молока на питательном агаре с
20% молока (Калина, 1964), а также редукцию и специфическое
свертывание молока с 0,02% метиленового синего с образованием
сплошного сгустка без отделения сыворотки (Ключевич, 1972).
Использовав ряд новых тестов, исследователи установили, что
Str. faecium, в отличие от Str. faecalis, менее активно восстанавли-
вает лакмус в молоке, не растет на агаризованных средах с тел-
луровокислым калием (1: 2500), не восстанавливает соли тетразо-
лия; отличаются эти виды и по способности сбраживать различные
углеводы и спирты (табл 31).
Основываясь на приведенных выше признаках, были предложе-
ны комбинированные питательные среды, с помощью которых
удается отделить энтерококки от грамотрицательных (по устойчи-
вости к полимиксину) и грамположительных (по устойчивости к
кристаллическому фиолетовому, тесты Шермена) бактерий,
а также идентифицировать виды и разновидности внутри группы
энтерококков (по редукции теллурита калия, сбраживанию ман-
нита и сорбита, пептонизации молока, росту на агаре с кровью)
(Калина, 1972). Необходимо при этом, однако, учитывать измен-
чивость ряда использованных свойств энтерококков, а также
существование организмов, обладающих одновременно свойствами
нескольких видов (или разновидностей).
Особенно большое число тестов для разграничения Str. faecalis
и Str. faecium было изучено Виттенбари (Whittenbury, 1965).
Автор для дифференциации Str. faecalis от Str. faecium применил
как уже известные тесты (приведены нами в табл. 31), так и ряд
новых. Виттенбари показал, что из указанных выше признаков
только восстановление лакмуса, сини, тетразолия и устойчивость
к теллуровокислому калию давали возможность отличить Str.
faecalis от Str. faecium. При этом результаты опытов по восстанов-
лению указанных веществ следует учитывать через 8 час. роста
культуры. Автор ввел и ряд новых тестов — образование перекиси
водорода из некоторых спиртов и способность их сбраживать, сбра-
живание лимонной кислоты, диссимиляции малата в присутствии
глюкозы и др. (табл. 32).
Основываясь на работе Гунзалуса (Gunsalus, 1947), Виттен-
бари показал, что изучение сбраживания глицерина в полужид-
кой среде следует проводить в присутствии натриевой соли фу-
маровой кислоты (0,5%), играющей роль акцептора водорода.
В этом случае только Str. faecalis сбраживает глицерин. Если же
проводить опыты без введения фумарата, некоторые штаммы Str.
faecalis, подобно Str. faecium, сбраживают глицерин только при
163
б*
Таблица 31
Отличительные признаки Str. faecalis и Str. faecium*
Признак Str. faecalis Str. faecium
Ферментация (с образованием кис- лоты)
арабинозы - [1], Т [4, 6] + [1,2, 4, 5], ±[6]
сорбита + [1, 5, 6], ± [2, 4] -[1, 6], + [2, 4]
мелибиозы -[1,6] + [И, ±[6]
мелецитозы + [И, + [6] -[1,6], В [2]
маннита + [1,3], ± [2] + [И, В [2], + [5 **]
глицерина (анаэробно) + [1, 4, 5], ±[6] -[1,5, 6], В [2], т [4]
а-метил-П-глюкозида + [3] В [2], -[3]
инулина -[3]
раффинозы -[3], Т[4] + [4]
КСИЛОЗЫ ± [5] Т[5]
сахарозы + [5 **]
дульцита + [5]
инозита Т [5]
рамнозы + [5]
декстрина ± [5]
Усвоение в качестве источника энер-
ГИИ
пирувата + [И -[1]
аргинина + [И -[1]
цитрата + Н,3] -[1, 3]
серина + [11 -[1]
агматина + [И -[1]
глюконата + П1 -[1]
малата + [1] -[И
крахмала -[1] -[1]
Рост при pH 9,6 + [1] + [1]
6,5 % NaCl + [1]. ± [4] + [1, 4]
45° + [1, 5] + [1, 5]
50° -[1], Т [5] + [11, ± [5]
10° + Н, 5] + [1,5]
40% желчи + [1] + [1]
0,05% теллуровокислого калия*** + [1, 6] - [1, 6]
К — теллурит 1:2500 ± [4] + [4]
Потребность в фолиевой кислоте -[1, 3] + [1]
Декарбоксилирование тирозина + [1] + [1]
Восстановление 2,3,5-трифенилтетра- + [1], ±[4], + [6] - [1], В [2], Т [4],
золий хлорида*** -[6]
лакмуса (8 час.) + [1,6] -[1,6]
(24 час.) ±[4] + [4]
метиленовой сини *♦* Быстро [3], + [6] Медленно [3], — [6]
164
Таблица 31 (окончание)
Признак Str. faecalis Str. faecium
Гемолиз на агаре с кровью 3, т [1, 6] 3, a [1, 3, 6]
Образование диацетила + [3]
Действие на казеин -М - [51
* В — варьируют или не ферментируют; остальные обозначения см. табл. 28.
** У одного и того же штамма это свойство варьирует. [1] — по Deibel, 1964;
[2] — по Langston, Gutierrez, Bouma, 1960b; [3]— no Mundt, Johnson, 1959; [4]— no Papa-
vassillou, 1962; [5] — no Orla-Jensen, 1942; [6] — no Whittenbury, 1965.
*** По [6] используют 0,04% теллурита калия, 0,01% метиленовой сини; восстанов-
ление изучают через 8 час.
доступе кислорода в качестве акцептору водорода. Дейбл с сотруд-
никами (Deibel et al., 1963) утверждали, однако, что способность
сбраживать глицерин в присутствии фумарата — не надежный
признак для разграничения двух видов энтерококков.
Несмотря на то что в ряде приведенных выше работ имелись
данные в пользу существования внутри группы энтерококков двух
видов — Str. faecalis и Str. faecium — все же следует указать на
нечеткую выраженность, вариабельность большинства признаков,
предложенных для их отличия (табл. 31). В связи с этим Хан с
сотрудниками (Hahn et al., 1970) считают, что для отличия Str.
Таблица 32
Дифференциация Str. faecalis и Str. faecium с помощью дополнительных
признаков (по Whittenbury, 1965) •
! Признак Str. fae- calis Str. fae- cium
Сбраживание глицерина в присутствии фумарата + А
Образование Н2О2 на основной среде (о-дианизидиновый агар с гретой кровью) — +
Перекись из глицерина — 1 ♦*
сорбита — 1 #*
маннита — + **
Использование яблочной кислоты в качестве источни- ка энергии #*♦ —
Газ на среде с яблочной кислотой и глюкозой — +
Использование цитрата как источника энергии при pH 8,0 + —
Каталаза (в присутствии гретой крови) **** —
* Плюс — признак имеется; минус — признак отсутствует; ± признак не по-
стоянен; А — не сбраживают или сбраживают в аэробных условиях.
** Если субстрат использован.
*** Два штамма не использовали.
Подавляющее большинство образовывало.
165
faecalis и его разновидностей от Str. faecium (и Str. durans) следу-
ет использовать следующие тесты: изменение агара с кровью;
восстановление тетразолия; устойчивость к теллуровокислому ка-
лию; сбраживание глицерина (анаэробно), арабинозы, мелибиозы;
потребность в фолиевой кислоте; усвоение пировинограднокислого
натрия.
Мы в наших исследованиях пытались использовать большое
число тестов, в том числе и предложенных Виттенбари (Whitten-
bury, 1965), для дифференциации видов энтерококков (Квасников
и др., 19706). Были взяты микроорганизмы, выделенные из эпифит-
ной и ризосферной микрофлоры, рубца крупного рогатого скота, а
также музейные штаммы, полученные из Чехословацкой (ССЕВ)
и Американской (АТСС) коллекций микроорганизмов. Изучались
следующие свойства: сбраживание углеводов и спиртов (Whitten-
bury, 1963), восстановление метиленовой сини и лакмуса в моло-
ке через 8 час. роста, восстановление 2,3,5-трифенилтетразолий
хлорида (Barnes, 1956b), устойчивость бактерий к 0,04% теллуро-
вокислого калия (Skadhauge, 1950), потребность энтерококков в
фолиевой кислоте (Ford et al., 1958), разложение яблочной и ли-
монной кислот без глюкозы и в ее присутствии, образование бакте-
риями перекиси при использовании ими маннита, сорбита и
глицерина (Whittenbury, 1964, 1965), гемолиз эритроцитов.
Мы пришли к выводам, что по способности восстанавливать
лакмус и метиленовую синь, сбраживанию арабинозы, маннита,
сорбита и глицерина, гемолитической активности и потребностям
в фолиевой кислоте удается отнести большую часть штаммов к
видам Str. faecalis, Str. faecium или Str. durans. В то же время мы
наблюдали существование группы энтерококков, которые облада-
ли одновременно свойствами двух видов, например, сбраживали
источники углерода, подобно Str. faecium, но энергично восстанав-
ливали краски, подобно Str. faecalis. Такие же штаммы, обладаю-
щие свойствами как Str. faecalis, так и Str. faecium, были изоли-
рованы нами и от насекомых (Квасников и др., 1971а). Часто
выделяются они из различных источников и другими авторами
(Mundt et al., 1958; Mundt, Johnson, 1959; Langston, Bouma, 1960a;
Langston et al., 1960b, и др.).
Ввиду того, что многие штаммы стрептококков группы D имеют
признаки как Str. faecalis, так и Str. faecium, Колоберт и Морелис
(Colobert, Morelis, 1958) предлагают отбросить видовое название
Str. faecium.
В пользу этого мнения, как нам кажется, могут свидетельство-
вать и исследования Колуэлла и сотрудников (Colwell et al., 1967).
Авторы изучили нуклеотидный состав ДНК у ряда энтерококков
и показали, что у Str. faecalis и Str. faecalis var. liquefaciens содер-
жание ГЦ составляло 37—38 мол.%, у Str, faecium и Str. bovis —
40—42 мол.%, что свидетельствует о существовании определенно-
го, хотя и незначительного отличия между Str. faecalis и Str.
faecium.
166
О нецелесообразности разделения энтерококков на указанные
два вида, очевидце, свидетельствуют и результаты нумерической
таксономии. Так, Рей и Колуэлл (Raj, Colwell, 1966), изучив боль-
шое число штаммов энтерококков (главным образом по морфоло-
го-культуральным и физиологическим признакам), нашли, что
они объединяются в гомогенный пучок (к энтерококкам авторы
отнесли Str. bovis, но не Str. equinus). Впоследствии Колмен
(Colman, 1968) также исследовал большое число морфологических,
физиологических, биохимических и серологических признаков (75)
у значительного числа стрептококков (216).
Полученные данные были обработаны по трем программам для
электронно-вычислительных машин, основанным на так называе-
мом методе единичного сцепления, методе Гаррисона и методе
Роджерса и Танимото. На основании результатов, полученных по
двум из трех программ, были образованы группы, соответствующие
ранее хорошо обозначенным видам — Str. agalactiae, Str. pneumo-
niae, Str. pyogenes, Str. salivarius. По методу единичного сцепле-
ния и методу Гаррисона Str. faecalis и Str. faecium были объедине-
ны в одну группу. Автор считает, что эти виды очень близки.
В дальнейшем Зейфрид (Seyfried, 1968), используя электронно-
вычислительную машину в нумерическом анализе стрептококков,
показала, что род Streptococcus имеет четыре подгруппы. Первая,
наибольшая подгруппа, с коэффициентом подобия 86%, включает
Str. faecalis с разновидностями, а также Str. faecium и Str. durans.
В пределах этой подгруппы Str. faecalis и его варианты очень
близки между собой, имея коэффициент подобия 94%, что свиде-
тельствует, как нам кажется, о правомочности рассмотрения
последних только вариантами вида Str. faecalis. Str. durans обра-
зует гомогенную группу, отличающуюся от остальных фекальных
стрептококков.
Вторую подгруппу рода, как указывает Зейфрид, составляют
пиогенные стрептококки (Str. pyogenes, Str. zooepidemicus, Str.
agalactiae); членами третьей являются стрептококки молочной
группы — Str. lactis и Str. cremoris. Обе эти подгруппы отчетливо
разграничиваются, имея соответственно коэффициент подобия 81
и 86%. К четвертой подгруппе (коэффициент подобия 69%) Зейф-
рид отнесла ароматобразующие стрептококки — Str. citrovorus и
Str. diacetilactis. Эти виды, по данным нумерического анализа, не
идентичны, ибо коэффициент подобия их равен только 76%.
Учитывая существование разногласий по поводу возможности
и целесообразности разграничения видов Str. faecalis и Str. faeci-
um, большой интерес представляют данные Канцлера и сотрудни-
ков (Kandler et al., 1968b) о химическом составе клеточных сте-
нок большого числа штаммов видов Str. faecalis и Str. faecium. Им
удалось установить четкую зависимость между физиологическими
свойствами штаммов и типом муреина клеточных стенок бактерий.
Авторы показали, что устойчивость энтерококков к теллуриту калия
и рост их в среде с пировиноградной кислотой в качестве единст-
167
венного источника энергии всегда позволяли отличить вид Str.
faecalis от Str. faecium. В несколько меньшей степени (выявляют-
ся штаммы с «промежуточными» свойствами) могли быть исполь-
зованы такие тесты, как анаэробное сбраживание глицерина,
ферментация сорбита, мелецитозы, мелибиозы и арабинозы.
Канцлер и другие (Kandler, 1968b) считают оправданным де-
ление энтерококков на виды Str. faecalis и Str. faecium с разновид-
ностью Str. faecium var. durans. Это четко подтверждается нали-
чием в клеточных стенках Str. faecalis (и Str. bovis) муреина типа
лизин-аланин, а у Str. faecium и Str. faecium var. durans муреи-
на типа лизин — аспарагиновая кислота. Авторами высказывается
предположение о возможности использования состава муреина
клеточных стенок для установления систематического положения
«промежуточных» штаммов, о существовании которых мы неодно-
кратно упоминали.
О необходимости обособления видов Str. faecalis и Str. faecium
свидетельствуют результаты серологических исследований. Еще
в 1950 г. Скадхаг (Skadhauge, 1950) на основании изучения
культуральных, физиологических и серологических свойств боль-
шого числа штаммов энтерококков высказался в пользу того,
что Str. faecalis и его варианты Str. faecium и Str. durans
следует считать самостоятельными видами, входящими в
состав группы D. Впоследствии был сделан вывод о том, что Str.
faecalis и Str. faecium отличаются не только по видоспецифичес-
ким антигенам, представляющим собой белковые вещества (Bar-
ber et al., 1964), но и по химическому составу глицеринтейхоевых
кислот, ответственных, как мы указывали, за групповую специ-
фичность микроорганизмов группы D. Так, в клетках бактерий,
идентифицированных как Str. faecalis, была обнаружена глице-
ринтейхоевая кислота, в состав которой (кроме уже известных
ингредиентов) входил олигосахарид койибиоза, тогда как глице-
ринтейхоевая кислота бактерий вида Str. faecium содержала еще
и моносахарид койитриозу, а также L-лизин (Wicken, Baddiley,
1963). Весьма перспективным для дифференциации Str. faecalis
и Str. faecium считают и использование фагов (Hahn et al., 1970).
В пользу целесообразности выделения Str. faecalis и Str. faeci-
um в отдельные виды свидетельствуют и данные, полученные при
применении методов нумерической таксономии. Так, Колоберт и
Блонде (Colobert, Blondeau, 1962) исследовали 137 штаммов энте-
рококков по 38 признакам и установили существование двух глав-
ных групп — одна включала Str. faecalis и его разновидности, а вто-
рая — Str. faecium, Str. durans и новый вид Str. innominatus. Дан-
ные исследований, полученные Девисом и другими (Davis et al.,
1969) с помощью нумерических методов, также показали, что Str.
faecalis и Str. faecium относятся к разным группам (фенонам).
Джонс с соавторами (Jones et al., 1972) для исследований
стрептококков серологической группы D с помощью вычислитель-
ной машины привлекли сравнительно небольшой набор важных
168
признаков (45 тестов), рекомендуемых сейчас для идентификации
видов энтерококков (табл. 31). Использованная авторами ориги-
нальная программа «Таксон», разработанная для компьютера Кар-
мичеллом, дала возможность распределить большинство из 122
штаммов стрептококков в ряд групп. Эти группы были представ-
лены не в виде дендрограммы, а в виде окружностей, диаметры
которых пропорциональны расстоянию между наиболее различаю-
щимися (по коэффициенту подобия признаков) двумя организмами
данной группы (Carmichael, Sneath, 1969).
В первую группу попали штаммы, ранее идентифицирован-
ные как Str. faecalis, Str. faecalis var. liquefaciens и Str. faecalis
var. zymogenes; во вторую — Str. faecium и Str. durans; в третью,
близкую ко второй,— Str. avium; в четвертую — Str. equinus; пя-
тую — Str. bovis. Что касается последней группы, то штаммы, сбра-
живающие маннит, не составляли отдельной группировки, т. е. не
было подтверждено представление о существовании в пределах
вида Str. bovis двух биотипов (Medrek, Barnes, 1962, и др.).
По мнению Джонса и сотрудников, следует присоединиться к
выводам Дейбла (Deibel, 1964) и не употреблять названия «lique-
faciens»n «zymogenes», считая разновидности Str. faecalis его био-
типами. Не следует так же, как полагают авторы, сохранять ви-
довые названия Str. faecium и Str. durans. Эти организмы настолько
близки, что их целесообразно объединить под названием Str. fae-
cium Orla-Jensen (1919).
Авторами было установлено тесное родство между Str. bovis и
Str. equinus. Следует отметить также, что результаты объединения
стрептококков серологической группы D по программе «Таксон»
совпадали с данными, полученными при выборе и других программ
(Sokal, Sneath, 1962; Ross, 1969).
Сравнивая сведения, накопленные различными авторами при
использовании нумерических методов и касающиеся разделения
стрептококков группы D на виды, следует отметить, что различие
в выводах, вероятно, объясняется выбором штаммов, набором при-
знаков и программами для исследования (Colman, 1968).
В заключение следует отметить, что в настоящее время не су-
ществует единого мнения о видовом составе группы энтерококков.
В частности, противоречивы представления о способах и целесо-
образности разграничения фекальных стрептококков на виды Str.
faecalis (с разновидностями Str. faecalis var. liquefaciens и Str. fae-
calis var. zymogenes) и Str. faecium (с разновидностью Str. durans).
Для дифференциации этих видов предложены многие признаки,
таксономическая значимость которых в настоящее время изучает-
ся. Пригодность рекомендуемых тестов для дифференциации Str.
faecalis и Str. faecium может быть установлена только в приложе-
нии к большому набору штаммов энтерококков, выделенных из
различных природных и производственных субстратов. Ждет ре-
шения вопрос и о целесообразности вычленения группы энтеро-
кокков в отдельный род Enterococcus Thiercelin et Jouhand (Ка-
лина, 1970).
169
Молочные стрептококки
Молочные стрептококки широко распространены в природе и пи-
щевых производствах — растительных материалах (силос, мука,
сенаж, овощи), почве, навозе, на поверхности вымени и кожи ко-
ров, в сыром молоке, инвентаре и помещениях молочных заводов
(Квасников, 1960; Sandine et al., 1972, и др.).
В эту группу включаются виды Streptococcus lactis (Lister,
1873) Loehnis, 1909, Streptococcus cremoris Orla-Jensen, 1919 и
Streptococcus diacetilactis Matuszewski et al., 1936.
В 1937 г. Шетток (Shattock, 1937) сообщила о том, что, при-
меняя методику Ленсфилд, удается установить серологическое
различие между Str. lactis и Str. faecalis. Впоследствии была по-
лучена специфическая сыворотка против Str. lactis, которая пре-
ципитировала HCl-экстракты из клеток Str. lactis, но не энтеро-
кокков и представителей серологических групп А—М (Sherman,
1938; Sherman et al., 1940). Новая серологическая группа была
названа группой N (Shattock, Mattick, 1943) и к ней были при-
числены виды Str. diacetilactis, а также Str. cremoris (Swartling,
1951; Briggs, 1952; Briggs, Newland, 1952). В настоящее время
установлено, что у стрептококков группы N за групповую специ-
фичность ответственна глицеринтейхоевая кислота, которая ло-
кализуется, возможно, между цитоплазматической мембраной и
клеточной стенкой. Детерминантной группой группового антиге-
на является галактозофосфат (Hahn et al., 1970).
Три вида группы N дифференцируются от других стрептокок-
ков, как указано в табл. 27. Между собой они различаются по
ряду свойств, хотя нередко эти свойства и варьируют.
Ниже приводятся признаки, которые можно использовать для
дифференциации Str. lactis, Str. cremoris и Str. diacetilactis (no
Sherman, 1937; Reiter, Moller-Madsen, 1963).
Свойства Str. lactis Str. cre- moris Str. diace- tilactis
Образование ЫНз из аргинина + — +
Декарбоксилирование тирозина + — +
Рост при 40° + — +
в среде с 0,3% + — +
метиленовой сини
в среде с 4% NaCl + — +
в среде с pH 9,2 + — +
Кислота из мальтозы + ± +
Кислота из декстрина + + +
Цитритаза — +
Мы не будем здесь подробно останавливаться на характери-
стике видов молочной группы. По поводу этого имеется обшир-
170
ная литература (Богданов, 1957; Непомняща, Тевшевич, 1955;
Тевелевич, 1961; Sherman, 1937; Orla-Jensen, 1942, и др.).
Str. lactis и Str. cremoris являются одними из важнейших ком-
понентов заквасок при приготовлении молочных продуктов. Str.
cremoris близок к Str. lactis, хотя и отличается от него рядом
свойств (см. выше): имеет большие клетки, часто расположенные
в цепочках; как правило не растет при 37°. Он образует меньше
кислоты в молоке и является менее энергичным бродилыциком.
Молоко, сквашенное Str. cremoris, несколько более тягучее, чем
в случае свертывания его Str. lactis (Sherman, 1937). Точные
данные о естественном местообитании Str. cremoris отсутствуют
(Sandine et al., 1972).
Str. diacetilactis имеет . большое значение при изготовлении
заквасок, применяемых в маслоделии. Употребление этих бакте-
рий дает ряд преимуществ перед введением в закваску других
ароматобразователей (Богданов, 1957; Белоусова, 1962, и др.).
Однако физиологические особенности Str. diacetilactis еще недо-
статочно изучены; до сих пор нет общего мнения относительно
систематического положения этих организмов. Между тем, пра-
вильная диагностика их очень важна в практике приготовления-
заквасок.
В 1936 г. из самозабродившего картофеля Матушевский с соав-
торами (Matuszewski et al, 1936) впервые выделили штаммы кок-
ковых молочнокислых бактерий, сбраживающие лимонную кисло-
ту с образованием диацетила и ацетоина, которым дали название
Streptococcus diacetilactis. В этом же году Ван Бейнум и Петте
(van Beynum, Pette, 1936) описали два организма, усваивающие
цитрат, которые продуцировали в молоке молочную кислоту и ди-
ацетил. Авторы назвали их Streptococcus citrophilus. Затем Карна-
дом (цит. по Swartling, 1951) был изолирован ароматобразующий
Str. diacetilaromaticus, а Йоши и Рам Айаром (Joshi, Ram Ayyar,
1936) — Str. lactis var. aromaticus.
Суотлинг (Swartling, 1951) из заквасок выделил ряд штаммов,
образующих в молоке D-молочную кислоту, летучие кислоты, СО2
и ацетоин. Он отнес их к Str. diacetilactis Matuszewski et al. На ос-
новании тщательного сравнения изолированных штаммов с вида-
ми Str. citrophilus van Beynum et Pette и Str. lactis var. aromaticus
Joshi et Ram Ayyar Суотлинг сделал вывод о том, что все организ-
мы следует отнести к одному виду — Str. diacetilactis.
Str. diacetilactis нередко затруднительно отличить от других
кокковых форм (лейконостоков, энтерококков). Известно, напри-
мер, что Str. faecalis способны образовывать ароматические веще-
ства из солей лимонной кислоты. Установлено также, что этот вид
накапливает в молоке значительные количества диацетила (Тер-
Казарьян и др., 1972). Указанные признаки сближают энтерокок-
ки со Str. diacetilactis. Кроме того, работами Суотлинга (Swart-
ling, 1951) было показано, что некоторые представители вида Str.
diacetilactis растут в среде с 6,5% NaCl и выдерживают нагрева-
171
ние при 60° в течение 30 мин. Однако автор обнаружил, что между
энтерококками и Str. diacetilactis нет серологического родства.
Можно отличать их и по ряду физиологических признаков — росту
в среде с pH 9,6, при 45°.
Str. diacetilactis в противоположность лейконостокам не образует
газа из глюкозы, продуцирует аммиак из аргинина, сквашивает
обезжиренное молоко через 48—72 часа культивирования при 30°
и восстанавливает молоко с лакмусом. Для отличия этих организ-
мов применяют реакцию Вогес-Проскауэра. Закваски, содержащие
Str. diacetilactis, дают позитивную реакцию в течение нескольких
дней, тогда как содержащие лейконостоки (имеют более высокий
редуцирующий потенциал) дают негативную реакцию ко времени
свертывания молока (Reiter, Moller-Madsen, 1963).
По данным Эшенбруха (Eschenbruch, 1970), Str. diacetilactis
при наличии в среде глюкозы образует диацетил, а в ее отсутст-
вие — только ацетоин. Добавление яблочной и пировиноградной
кислот не сказывается на образовании ароматических веществ.
В то же время Leuconostoc mesenteroides накапливает ацетоин и
диацетил только в среде, не содержащей глюкозу, причем яблоч-
ная и пировиноградная кислоты способствуют образованию этих
продуктов.
Str. diacetilactis имеет много общего с видами серологической
группы N. Так, ряд авторов сообщил о штаммах Str. diacetilactis,
которые не росли при 40° и в среде с 4% NaCl. У одной из иссле-
дованных культур Str: diacetilactis Суотлинг (Swartling, 1951)
не обнаружил способности образовывать аммиак из аргинина,
что сближало ее со Str. cremoris. Имеются штаммы Str. cremoris,
которые могут сбраживать цитрат, но отличаются от Str. lactis и
Str. diacetilactis их отношением к температуре, pH и NaCl (Reiter,
Moller-Madsen, 1963).
В литературе описаны случаи образования мутантов Str. dia-
cetilactis, не сбраживающих цитрат и таким образом не отлича-
ющихся от Str. lactis (Kneteman, 1952). Str. diacetilactis может
утрачивать способность усваивать лимонную кислоту при культи-
вировании бактерий на лабораторных средах (Гибшман, 1951;
Swartling, 1951). Сближает этот вид со Str. lactis и Str. cremoris и
способность последних продуцировать иногда диацетил в молоке
(Krishnaswamy, Babel, 1951). Однако свойство накапливать зна-
чительные количества ароматических веществ, СО2 и других про-
дуктов из лимонной кислоты и ее солей присуще только Str. dia-
cetilactis.
По серологическим, культуральным и физиологическим приз-
накам Str. diacetilactis наиболее близок к Str. lactis. Основным и,
пожалуй, единственным отличием между ними является способ-
ность Str. diacetilactis энергично усваивать цщграт с образовани-
ем СО2, летучих кислот и ароматических веществ. По Сендайну и
другим (Sandine et al., 1961, 1962), Str. diacetilactis можно диф-
ференцировать от Str. lactis и Str. cremoris по следующим призна-
172
кам: 1) образует диацетил и много СО2 в молоке, 2) сбраживает
цитрат и при этом интенсивно продуцирует СО2. Авторы считают,
что наличие в клетках Str. diacetilactis фермента цитритазы, осу-
ществляющей расщепление лимонной кислоты, и отсутствие тако-
вого у Str. lactis и Str. cremoris являются убедительным основани-
ем для выделения Str. diacetilactis в отдельный вид.
Как известно, среди представителей Str. diacetilactis имеются
штаммы, продуцирующие как диацетил, так и ацетоин. Учитывая
это важное свойство стрептококков, используемое в молочной про-
мышленности, М. Н. Пименова (1958) считает возможным выде-
лить Str. diacetilactis и Str. acetoinicus в отдельные виды. В то же
время, по мнению Рейтер и Меллер-Мадсен (Reiter, Moller-Mad-
sen, 1963), тот факт, что некоторые штаммы Str. diacetilactis со-
держат диацетилредуктазу, восстанавливающую диацетил в аце-
тоин, говорит в пользу вычленения двух разновидностей — Str.
lactis var. diacetilactis и Str. lactis var. acetoinicus.
Такие же разновидности ранее были предложены и Л. Луков-
никовой (1960). Нам представляется целесообразным рассматри-
вать Str. diacetilactis в качестве разновидности вида Str. lactis,
считая ее основной характерной особенностью усвоение лимонной
кислоты с образованием ароматических веществ (Нестеренко,
19636).
В связи с приведенными фактами кажется справедливым за-
мечание Суотлинга (Swartling, 1951): следует ли считать Str. di-
acetilactis отдельным видом или нет, зависит от того, какой вес
придавать способности сбраживать лимонную кислоту. В обстоя-
тельной статье Шермена (Sherman, 1955) высказывается мысль
о том, что в настоящее время нет достаточно веских оснований
для того, чтобы считать Str. diacetilactis отдельным видом.
Н. А. Красильников (1949), Э. М. Фостер с соавторами (1961) рас-
сматривают Str. diacetilactis как разновидность Str. lactis. В 7-ом
издании определителя Берджи этот микроорганизм вообще не
упоминается.
Род Leuconostoc
Бактерии рода Leuconostoc представляют собой удлиненные яйце-
видные кокки, располагающиеся единично, парами или короткими
цепочками. Нередко их бывает трудно отличить от укороченных
гетероферментативных молочнокислых палочек.
Характерной особенностью лейконостоков является их неспо-
собность образовывать аммиак из аргинина. Они, как правило, не
образуют каталазу, хотя Ленгстон и Боума (Langston, Вошпа,
1960а) описали каталазоположительные штаммы. Лейконостоки
лакмус в молоке не восстанавливают, несколько подкисляют сре-
ду, а некоторые сквашивают молоко спустя длительное время.
Гейлслут (Galesloot, 1950) описал штаммы лейконостоков, вос-
станавливающие лакмус и сквашивающие молоко. Однако все эти
173
штаммы cP временем утратили способность редуцировать лакмус
и ничем не отличались от других лейконостоков.
Представители этого рода в обезжиренном молоке или молоке
с лакмусом образуют незначительное количество газа или вовсе
его не образуют (Garvie, 1960; Sandine et al., 1962). Молоко с
дрожжевым автолизатом сквашивают. При сбраживании углево-
дов наряду с молочной кислотой продуцируют СО2, этиловый спирт
и летучие кислоты. Некоторые лейконостоки образуют маннит из
фруктозы. Растут при 10°, но не при 45°.
Отдельные представители рода Leuconostoc (например, L. me-
senteroides) растут и сбраживают сахара только при наличии аэ-
робных условий. Культуры при этом быстро поглощают кислород
и продуцируют перекись водорода (Whittenbury, 1963).
Впервые бактерии рода Leuconostoc под названием Ascococcus
mesenteroides были описаны Л. Ценковским (1878). Автор устано-
вил, что эти микроорганизмы являлись причиной образования мощ-
ных студенистых осадков, накапливающихся в соке или оборудо-
вании при производстве сахара в заводских условиях.
Впоследствии Орла-Иенсен (Orla-Jensen, 1919, 1942) отнес ге-
тероферментативные коккщ которые в отличие от гомофермента-
тивных представителей рода Streptococcus образовывали левовра-
щающую (иногда DL) молочную кислоту, к роду Betacoccus. Он
считал, что среди бактерий этого рода существуют представители,
сбраживающие и арабинозу, и ксилозу. Подобные штаммы выде-
ляются из различных растительных материалов. Некоторые штам-
мы сбраживают или один из этих сахаров, или вовсе их не сбражи-
вают. Они изолируются из навоза и молочных продуктов.
Орла-Иенсен описал два вида рода — Вс. arabinosaceus и Вс.
bovis. Впоследствии Гукер и Педерсон (Hucker, Pederson, 1930,
1931), детально изучив газообразующие кокки, выделенные из мо-
лока и молочных продуктов, квашеных овощей и ослизнившихся
сахарных растворов, объединили их под родовым названием Leu-
conostoc и установили три вида, вошедшие в 7-ое издание опреде-
лителя Берджи — Leuconostoc mesenteroides (Cienkowski, 1878)
van Tieghem, 1878, сбраживающий арабинозу или ксилозу, а так-
же сахарозу и образующий из нее слизь; Leuconostoc dextranicum
(Beijerinck, 1912) Hucker et Pederson, 1930, не сбраживающий пен-
тоз, и Leuconostoc citrovorum (Hammer, 1920) Hucker et Peder-
son, 1930, не ферментирующий пентозы и не образующий слизь из
сахарозы. В 1940 г. О. А. Бакушинской был подробно описан Leu-
conostoc agglutinans, близкий по своим свойствам к L. mesentero-
ides, но отличающийся от него способностью склеивать дрожжевые
клетки. Автор предлагает рассматривать L. agglutinans в качест-
ве разновидности L. mesenteroides.
По мнению ряда исследователей (Abd-el-Malek, Gibson, 1948;
Garvie, 1960; Whittenbury, 1966), к роду следует отнести и вид
Str. kefir (L. lactis no Garvie, I960), Характерным свойством это-
го вида следует считать сбраживание ограниченного набора угле-
474
водов и спиртов. Представители этого вида не образуют декстраны,
хотя ферментируют сахарозу; они растут при 37—40°, выдержива-
ют нагревание при 60° в течение 30 мин. Выделяются из молока
(часто превалируют в нем) и молочных продуктов.
Способность видов Leuc. dextranicum и L. citrovorum сбражи-
вать лимонную кислоту молока с образованием диацетила (а так-
же ацетилметилкарбинола и 2,3-бутиленгликоля) и положитель-
но влиять на рост молочнокислых стрептококков привлекла к ним
внимание, как желательным компонентам заквасок, применяю-
щихся в масло- и сыроделии.
В настоящее время на основании многочисленных и обстоятель-
ных работ, посвященных представителям рода Leuconostoc, стала
ясна несостоятельность и уязвимость широко используемой схе-
мы дифференциации видов по Гукеру и Педерсону. Остановимся
более подробно на ключевых признаках видов рода.
Мнения авторов по вопросу стабильности признака образова-
ния декстрана при использовании сахарозы расходятся. Так, Пе-
дерсон и Албери (Pederson, Albury, 1955) показали, что многие
штаммы, не образующие декстран, стали образовывать его после
серии пересевов культур в томатный и мандариновый сок или буль-
он с сахарозой. Ленгстон и Боума (Langston, Вошла, 1960а) на-
блюдали, что большинство выделенных ими лейконостоков образо-
вывали декстран после 32 пересевов их в томатно-глюкозный и
мандариновый бульон. В то же время Виттенбари (Whittenbury,
1966) на основании собственных исследований считает признак
декстранообразования стабильным и потому имеющим важное
таксономическое значение.
Способность лейконостоков ферментировать пентозы и сахаро-
зу, как считает большинство исследователей, вряд ли можно класть
в основу разграничения видов в качестве единственных критери-
ев. Так, в опытах Виттенбари (Whittenbury, 1966) из четырех
штаммов вида L. citrovorum три давали сбраживающие сахарозу
мутанты, которые не способны были образовывать слизь из саха-
розы. Такие мутанты по схеме Гукера и Педерсона можно считать
не образующими декстран вариантами вида L. dextranicum. Автор
отмечает, что следует иметь ввиду наблюдения Орла-Иенсена о
способности лейконостоков (бетакокков) утрачивать свойство сбра-
живать пентозы. В отношении вида L. dextranicum Виттенбари ука-
зывает, что его характеристика была основана на описании Бейе-
ринком вида Lactococcus dextranicus, причем в описании говори-
лось только о том, что этот организм не способен сбраживать кси-
лозу. Следовательно, он мог быть подобен не сбраживающим кси-
лозу штаммам L. mesenteroides.
Изучив большое число гетероферментативных кокков, Виттен-
бари отметил, что некоторые (в иных отношениях очень близкие)
организмы отличались один от другого только способностью слабо
сбраживать пентозы. На основании этого одного, к тому же не-
стойкого признака, их идентифицировали или как L. dextranicum,
175
или как L. mesenteroides. Подобные наблюдения и выводы были
сделаны и при изучении лейконостоков, выделенных из эпифит-
ной микрофлоры растений Украины (Нестеренко, 1964).
Попыткой усовершенствовать идентификацию бактерий рода
Leuconostoc явились недавние исследования Гарви (Garvie,
1967а, Ь). Автор предложила, кроме уже описанных, ряд новых
видов, дифференциация которых строится не только на способно-
сти бактерий сбраживать пентозы и образовывать слизь из сахаро-
зы (табл. 33).
Таблица 33
Дифференциация видов рода Leuconostoc (по Garvie, 1967а)*
Признак L. mesen- teroides L. dextra- nicum L. para- mesente- roides L. lactis L. cremo- ris L. oenos
Образование слизи из саха- розы Образование кислоты из + + — - —
арабинозы — И + и — — ±
лактозы ± м ± м ± м -4- + —
мальтозы И + и + и + + -— —
сахарозы и + И + и + — —
трегалозы + + + и — — +
Гидролиз эскулина и + и — ± — — +
» салицина и 4- и — — — — и +
Рост при pH 4,8 — или с — или с 4- — — +
» » 4,2 — — — — — +
» » 3,7 — — — — — +
* Юридическая комиссия Международного комитета noj номенклатуре бактерий
включила Leuconostoc citrovorum в список отклоненных названий (Clark, 1971); и-f-
болыпинство штаммов имеют этот признак; и — большинство не имеет признака;
± признак не постоянен; м — медленно; с — слабо.
До работ Гарви группа организмов, объединенных автором под
названием L. paramesenteroides, считалась не образующим декс-
тран вариантом вида L. mesenteroides. Гарви предложила для
разделения этих видов (кроме свойств, указанных в табл. 33)
использовать' такой тест, как способность декстранобразующих
штаммов образовывать наполненный газом сгусток в молоке с
лакмусом, глюкозой и дрожжевым автолизатом. Не продуцирую-
щие декстран формы часто не дают сгустка, а в случае образования
его он не наполнен газом. Типовым штаммом вида L. paramesen-
teroides Гарви предлагает штамм NCDO 803 (Garvie, 1967b).
Вид L. dextranicum Гарви разделяет на две группы (IV и V),
одна из которых сбраживает ксилозу, но не арабинозу. Такое деле-
ние соответствует классификации Орла-Иенсена (Orla-Jensen,
176
1942). Как отмечает Гарви, мутанты L. cremoris, сбраживающие
сахарозу, могли бы рассматриваться как не образующие декстран
варианты L. dextranicum, если использовать классификацию по
Гукеру и Педерсону.
Гарви (Garvie, 1967а) описала новый вид рода — L. oenos,
выделенный из вина (.рис. 11). Характерной особенностью нового
вида считается рост в среде с pH 3,7, а иногда — с pH 3,2.
Для дифференциации представителей этого вида от других лейко-
ностоков предлагается выращивать бактерии в среде (СМБ)
с pH 4,2. Только представители вида L. oenos способны расти
Рис. И. Leuconostoc oenos, выделенный из вин, X 18 400 (Weiller, Radler,
1970)
в этой среде. Кроме кислотоустойчивости, новый вид обладает
и рядом иных характерных признаков (табл. 33). Так, например,
от вида L. cremoris он отличается неспособностью ферментировать
лактозу и /обычно/ галактозу и способностью образовывать
кислоту из фруктозы, трегалозы, арабинозы и мелибиозы.
L. oenos, кроме того, более устойчив к этиловому спирту, чем дру-
гие виды этого рода. Типовым штаммом вида Гарви предлагает
считать штамм NCDO 1674 (рис. 11).
Данные о подвижности лактатдегидрогеназ в полиакриламид-
ном геле у L. mesenteroides, L. dextranicum, L. paramesenteroides,
L. lactis и L. cremoris показали, что эти виды близкородственны и
содержат NAD-зависимую лактатдегидрогеназу, специфичную в
отношении D (—)-молочной кислоты. В то же время среди видов
L. mesenteroides и L. paramesenteroides обнаружены штаммы, со-
держащие и NAD-независимые ферменты, субстратом для которых
являются как D (—)-, так и L (+)-молочная кислота (Garvie,
1969).
Изучив потребность в аминокислотах, витаминах (рибофла-
вине, пиридоксале, фолиевой кислоте), пуринах, урациле и твине
80 различных штаммов шести видов рода Leuconostoc, Гарви
(Garvie, 1967b) показала, что потребность микроорганизмов в не-
177
одинаковом числе аминокислот и различных факторах роста
свидетельствует в пользу разделения рода на шесть видов
(табл. 33). Наряду с этим, подобно представителям других родов
молочнокислых бактерий, не все штаммы отдельных видов лейко-
ностоков проявляют одинаковые потребности в указанных ве-
ществах. Это свидетельствует об ограниченной возможности при-
менения данных о питательных потребностях лейконостоков
при идентификации их, т. е. об использовании этих тестов толь-
ко в качестве дополнительных.
Исследование типа муреина у многих музейных (NCDO
и АТСС) штаммов лейконостоков оказалось весьма плодотворным
(Kandler, 1970). Было установлено, что большинство представи-
телей рода имело L-Лиз-Б-Сер-(L-Ала) 2-тип муреина и только
у некоторых серин был заменен аланином (табл. 34). Тип муреина,
обнаруженный в клеточных стенках бактерий вида L. cremoris,
отчетливо коррелировал с физиологическими признаками вида.
В пределах других видов лейконостоков были обнаружены раз-
личные типы муреина. Например, три штамма вида L. lactis
имели Ь-Лиз-(Ь-Ала) 2-тип, а другие Ь-Лиз-L-Cep (L-Ала) 2-тип
муреина.
На основании двух типов муреина, сбраживания арабинозы
и лактозы предложено разделить вид L. paramesenteroides на два
подвида (табл. 34). Это же было сделано и с видом L. mesenteroides,
где отсутствие у бактерий способности сбраживать раффинозу
и мелибиозу коррелировало с типом муреина в клеточных стенках
микроорганизмов (L-Лиз (L-Ала) 2 (табл. 34).
Канцлер (Kandler, 1970) провел дальнейшее изучение описан-
ного Гарви (Garvie, 1967а) вида L. oenos, объединяющего штам-
мы, изолированные из вина.
Следует отметить, что номенклатура этих организмов весьма
запутана. Мюллер-Тургау и Остервальдер (Muller-Thurgau, Oster-
walder, 1913b, 1918) дали название Bacterium gracile организмам,
выделенным из вин. Впоследствии на основании работ Педерсона
они были включены в шестое издание определителя Берджи
как представители рода Leuconostoc. Позднее гетероферментатив-
ные кокки, изолированные из вина, были названы Leuconostoc
gracile (Bidan, 1956). Нономура и сотрудники (Nonomura et al.,
1965) отнесли кокковые организмы, выделенные из вин, к трем
видам (Leuconostoc lactosum, L. infrequens и L. vinarium), а затем
переименовали их в три подвида одного вида — Leuconostoc
blayaisense. Гарви (Garvie, 1967а) назвала организмы, обитающие
в винах и обладающие рядом характерных свойств (табл. 33),
Leuconostoc oenos.
Канцлер исследовал 23 штамма, полученные от Гарви, Ноно-
мура и Радлера, и установил идентичность их в отношении способ-
ности расти при низком значении pH, образовывать перекись
и по отсутствию продуцирования декстрана, хотя они и отлича-
лись по сбраживанию отдельных сахаров. Все изученные штаммы
178
Таблица 34
Типы муреина у бактерий рода Leuconostoc* (по Kandler, 1970)
Вид
L. cremoris
L. lactis
2
4
8
8
1
18
5
23
L. paramesenteroides
ssp. paramesenteroi-
des
ssp. lactophilum
L. gracile (syn.
L. oenos)
L. dextranicum
L. mesenteroides ssp.
mesenteroides
ssp. amelibiosus
и «
о я
K0
Ь-Лиз-Ь-Сер-(Ь-Ала)г
Ь-Лиз-Ь-Сер-(Ь-
Ала)г-|-Ь-Лиз-(Ь-Ала)2
Ь-Лиз-(Ь-Ала)2
Ь-Лиз-Ь-Сер-(Ь-Ала)2
Ь-Лиз-Ь-Ала-Ь-Сер -)-
+ Ь-Лиз-(Ь-Сер)2
Ь-Лиз-Ь-Сер-(Ь-Ала)г
Ь-Лиз-Ь-Сер-(Ь-Ала)г
Ь-Лиз-(Ь-Ала)г
Тип муреина
* Обозначения см. табп. 27.
обладали не обнаруженным у других видов лейконостоков (но най-
денным у Lactobacillus viridescens ssp. viridescens) типом муреина
Ь-Лиз-Ь-Ала-Ь-Сер (или L-Лиз- (L-Cep) 2.
По мнению Канцлера, организмы, описанные Нономура с со-
трудниками (Nonomura, 1965), а также Гарви (Garvie, 1967а),
следует включить в один вид. Следуя правилам номенклатуры,
им нужно дать название Leuconostoc gracile (Muller-Thurgau)
Bidan, а название L. oenos и наименование, предложенные Ноно-
мура и соавторами (1965), должны считаться синонимами.
Необходимо в заключение заметить, что данные, полученные
при исследовании типов муреина клеточных стенок ряда видов
лейконостоков еще раз убедительно подтверждают близкое родст-
во этих видов и представителей гетероферментативных палочко-
видных бактерий, о чем мы уже говорили выше.
Род Pediococcus
Род Pediococcus представлен грамположительными, неспоро-
образующими, неподвижными кокками, располагающимися куч-
ками, тетрадами, парами, единично; иногда упоминают и об обра-
зовании коротких цепочек, состоящих из 4—6 клеток (рис. 12).
Педиококки — микроаэрофилы или анаэробы, часто требую-
179
щие присутствия С02 для обеспечения удовлетворительного роста.
Они, как правило, не образуют каталазу, не восстанавливают
нитраты в нитриты, не разжижают желатин. Редко подкисляют,
сквашивают молоко и восстанавливают в нем лакмус. Некоторые
штаммы продуцируют слизь из сахарозы. На агаре с кровью
иногда образуют небольшие зоны ^-гемолиза. Педиококки вызы-
вают гомоферментативное молочнокислое брожение, образуя
при этом до 1% оптически неактивной [иногда L (+)] молочной
кислоты, а также другие продукты — ацетальдегид, диацетил,
ацетоин, следы 2 или З-метил-1-бутанола, изобутанола и др.
(Radler, Gerwarth, 1971). pH среды при этом снижается до 3,7.
Рис. 12. Pediococcus pentosace-
us, выделенный из вин,
Х15 700 (Weiller, Radler, 1970)
Потребность педиококков в лейковорине (фолиновая кислота)
и способность развиваться в пиве не являются их универсальными
свойствами (Gunther, White, 1961а). Для обеспечения макси-
мального роста нередко требуется добавление в среду ионов Мп2+
(Efthymiou, Joseph, 1972).
Эти микроорганизмы обитают в бродящих растительных ма-
териалах (например, квашеных овощах, силосе), сыре, молоке,
пиве, сусле, мясных продуктах, пищеварительном тракте и фека-
лиях животных (Harrison, Hansen, 1950с; Bauman, Foster, 1956;
Dacre, 1958; Frazier, 1958; Deibel, Niven, 1960; Langston, Bouma,
1960a; Perry, Sharpe, 1960).
Co времени обнаружения Пастером (Pasteur, 1876) в пиве сар-
циноподобных организмов, связанных с его порчей, а затем
работ Бэлка (Balcke, 1884а, Ь), давшего им биноминальное наз-
вание Pediococcus cerevisiae неоднократно высказывались разно-
речивые мнения относительно систематического положения этих
микроорганизмов (Pederson, 1949).
В шестом издании определителя Берджи педиококки были
включены в семейство Micrococcaceae с типичным видом Pediococ-
cus cerevisiae Balcke. Многие авторы, однако, полагают, что они
должны быть отнесены к молочнокислым бактериям. Так, Шиму-
эл с сотрудниками (Shimwell, Kirpatrik, 1939; Shimwell, 1940,
1ЯП
1947, 1948) утверждают, что педиококки нельзя обособлять в от-
дельный род Pediococcus (с признаками: оптически неактивная
молочная кислота и образование тетрад), т. к. их трудно отличить
от гомоферментативных представителей рода Streptococcus, по-
скольку последние также иногда образуют тетрады, а педиокок-
ки — цепочки.
Йенсен и Силей (Jensen, Seeley, 1954), однако, полагают, что
нахождение каталазы у педиококков не дает возможности отне-
сти их к роду Streptococcus. Педиококки в отличие от стрептокок-
ков способны интенсивно окислять парафенилендиамин, что
указывает, по мнению авторов, на присутствие у них цитохрома с.
Однако, как впоследствии было показано, способность продуциро-
вать каталазу (вернее, псевдокаталазу) присуща не только пе-
диококкам, но и стрептококкам (Langston, Вошла, 1960а).
По мнению Педерсона (Pederson, 1949), образование педио-
кокками тетрад, значительное накопление оптически неактивной
молочной кислоты говорят в пользу вычленения их из родов Strep-
tococcus, Micrococcus и Sarcina и дают основание рассматривать
их представителями отдельного рода Pediococcus, принадлежащего
к трибе Streptococceae семейства Lactobacteriaceae. Это предложе-
ние было принято в седьмом издании определителя Берджи. Его
придерживаются авторы и более поздних работ (Gunther, White,
1961а).
Необходимо, однако, отметить, что указанные систематиче-
ские признаки, предложенные для отличия рода Pediococcus, не-
достаточно специфичны. Так, Ленгстон и Боума (Langston, Во-
йта, 1960а) сообщили о S,tr. faecalis var. liquefaciens, изолиро-
ванном из силоса и образующем DL-молочную кислоту.
На практике педиококки отличают от других родов кокковых
бактерий по ряду свойств. От лейконостоков, например, их диф-
ференцируют по морфологии, гомоферментативному сбра-
живанию углеводов с образованием, как правило, DL-молочной
кислоты, частому продуцированию аммиака из аргинина (Gar-
vie, 1960; Gunther, White, 1961а). Исследование типов муреина
у ряда видов педиококков (Р. cerevisiae, Р. acidilactici, Р. pento-
sum) показало, что все штаммы имели L-Лиз-О-Асп-тип муреи-
на. Учитывая то, что ни один из изученных, представителей рода
Leuconostoc не обладал аспарагиновой кислотой в качестве со-
ставной части муреина, нахождение этой аминокислоты в гидро-
лизатах клеточных стенок можно также использовать в качест-
ве дополнительного критерия дифференциации двух родов (Kand-
ler, 1970).
От представителей рода Streptococcus педиококки отличают
по морфологии. В противоположность микрококкам, они не ра-
стут на простых средах (питательный агар без соответствующего
углевода), не усваивают соли аммония в качестве единственного
источника азота, не восстанавливают нитраты до нитритов или
N2, не разжижают желатин, не растут в средах с pH 9,0, под-
181
кисляют бульон с глюкозой до pH 4,5 и ниже (Perry, Sharpe, 1960;
Gunther, White, 1961a).
Вильямс с соавторами (Williams et al., 1953) описали новый
род Aerococcus, отличающийся от педиококков величиной кле-
ток, количеством образуемой кислоты, продуцированием аммиа-
ка из аргинина, по сбраживанию маннита. Йенсен и Силей (Jen-
sen, Seeley, 1954) предполагают, что, возможно, Pediococcus и
Aerococcus следует объединить в один род. При этом необходимо
все же учесть, что в отличие от педиококков аэрококки хорошо
растут на средах более простого состава, только в аэробных ус-
ловиях; они очень чувствительны к кислотности среды (при pH
6,8 рост угнетен), растут в средах с pH 9,0.
Гюнтер и Уайт (Gunther, White, 1961а) считают, что еще не
ясно, являются ли указанные отличия между двумя группами
организмов родовыми или видовыми. Сравнение содержания
Г+Ц в ДНК педиококков (37,8—41,2 мол.%) и аэрококков (42,0—
43,2 мол. %) свидетельствует о нецелесообразности разделения
этих организмов на два рода (Bonacek et al., 1969).
Видовой состав рода Pediococcus еще нельзя считать уста-
новленным. Ряд авторов полагает, что к этому роду следует от-
нести только один вид (Pederson, 1949; Jensen,- Seeley, 1954). Так,
Педерсон показал, что большое число штаммов (121) из рода
Pediococcus, выделенных из бродящих овощей, подобны по их
свойствам (в частности, способности сбраживать определенные
углеводы). Автор причислял эти микроорганизмы к виду Р. ce-
revisiae. Они образовывали DL-молочную кислоту, следы лету-
чих кислот и небольшие количества СО2. Сбраживали глюкозу,
фруктозу, маннозу, галактозу, мальтозу, часто арабинозу, сахаро-
зу, лактозу, раффинозу, салицин и амигдалин. Большинство штам-
мов не ферментировало маннит, а-метил-В-глюкозид, инулин,
крахмал и декстрин. Оптимум роста бактерий — 25—32°.
Этот вид педиококков Педерсон находил в пиве, больном
«сарцинной болезнью», в бродящем растительном материале и
маринадах. Автор подчеркнул, что небольшие различия в спо-
собности усваивать некоторые соединения углерода не должны
считаться основанием для установления новых видов. По мне-
нию Педерсона (Pederson, 1949), слизистому варианту Р. cerevi-
siae может быть дано название Pediococcus viscosus Lindner, а
организмам с более высокой оптимальной температурой роста —
Pediococcus acidi-lactici Lindner или Pediococcus hennebergi Sol-
lied. Ленгстон и Боума (Langston, Bouma, 1960a) из силосов вы-
делили 79 штаммов педиококков и все отнесли к Р. cerevisiae.
В определителе Берджи (1957), согласно исследованиям Пе-
дерсона, род Pediococcus разделяется на два вида: Pediococcus
cerevisiae Balcke, 1884 и Pediococcus acidi-lactici Lindner, 1887.
Первый растет в охмеленном сусле, пиве, оптимальная температу-
ра его роста —25—32°. Второй вид растет в неохмеленном сусле,
но не пиве и имеет оптимум роста 45°.
182
Работы, выполненные в последнее время, свидетельствуют о
необходимости усовершенствования способов идентификации
бактерий этого рода (Nakagawa, Kitahara, 1959; Gunther, White,
1961a; Coster, White, 1964; Sharpe et al., 1966). Об этом говорит
хотя бы тот факт, что, по данным Гюнтера и Уайта (Ciinther,
White, 1961а), ни один из изученных ими штаммов (около 100)
не рос в пиве, а добавление хмеля действовало на бактерии уг-
нетающе. Авторы считают, что использование термина «рост в
пиве» без дальнейшей оценки пива не имеет смысла, ибо пиво
может быть различным по кислотности, по содержанию хмеля,
концентрации этилового спирта, СО2, наличию источников пита-
ния (аминокислот, витаминов и т. д.).
Накагава и Китахара (Nakagawa, Kitahara, 1959) включают
в род Pediococcus пять видов. Одним из видовых признаков ав-
торы предлагают использовать способность бактерий расти в сре-
дах с различным значением pH. Однако такой критерий трудно
применить к штаммам, изолированным из разнообразных источ-
ников (Coster, White, 1964).
В дальнейшем Гюнтер и Уайт (Gunther, White, 1961а) также
отнесли к роду Pediococcus пять видов, каждый из которых ха-
рактеризуется признаками, приведенными в табл. 35.
Первая группа отличается тем, что ее представители способ-
ны интенсивно подкислять бульон с глюкозой и дрожжевым эк-
страктом (ГИБ) до pH 3,7—3,9. Большинство штаммов растет
при 45°, образует каталазу (очевидно, псевдокаталазу) и угне-
тается 6,5% NaCl. Добавление к среде 0,01 и 0,05% типола не
оказывает влияния на рост бактерий; только некоторые штаммы
требуют лейковорин.
Вторая группа характеризуется отсутствием способности
образовывать каталазу, расти при 45°, в среде с 4% NaCl в тече-
ние 24 час., а также медленным ростом при pH 4,2. Среда ГИБ под-
кисляется только до pH 3,9—6,4. Подгруппа штаммов этой груп-
пы не растет при 40° через 24 часа и не образует кислоту из тре-
галозы.
Следует отметить, ч’/о третья группа педиококков недостаточно
хорошо очерчена. Она близка к первой группе, хотя отличается от
нее отсутствием способности образовывать каталазу и расти при
45°. Для бактерий третьей группы характерно образование кисло-
ты из декстрана. По этому и иным свойствам они напоминают орга-
низмы, описанные как Streptococcus damnosus var. diastaticus
(Andrews, Gilliland, 1952). Впоследствии Костер и Уайт (Coster,
White, 1964) показали, что бактерии третьей группы ближе к Р. се-
revisiae, чем к Str. damnosus var. diastaticus.
Характерным свойством Р. halophilus, как отмечено в табл. 35,
является потребность его в повышенных концентрациях NaCl
(5%). При этом важно отметить следующее. Дейбл и Нивен (Dei-
bel, Niven, 1960) изучили большое число тетрадообразующих кок-
ков, выделенных из копченых мясных продуктов и мясных рассо-
183
лов, и показали, что эти бактерии обладают значительной солеус-
тойчивостью, вызывают гомоферментативное молочнокислое броже-
ние с образованием L (+) -молочной кислоты. От Р. cerevisiae они
отличались чувствительностью к низкому значению pH среды, спо-
собностью вызывать сильное позеленение агара с кровью, сбражи-
ванием маннита, меньшей устойчивостью к азиду натрия, отсутст-
вием потребности в лейковорине. Дейбл и Нивен считают, что ука-
Таблица 35
Основные признаки, на которых может быть основано подразделение
педиококков (по Gu.nth.er, White, 1961а) *
Рост
Рост в среде
с 4% NaCl
через
Вид
Р. cerevisiae
«Р. parvulus»
Р. damnosus
Р. halop hilus
I
II
III
30°
30°
30°
22°
30°
0,6—1,2
0,3-0,4
0,6-1,0
0,3-0,6
0,6—0,8
++-ь
+
++
м
м
+
Почти
всегда
* ТДжА — агар с томатным соком; ТДжБ — бульон с томатным соком; АМК — аце-
тилметилкарбинол; -НЧ— рост обильный; -р-|— рост хороший; -]— рост умеренный;
± — растут не всегда; м — медленно.
занные штаммы по морфолого-физиологическим свойствам очень
близки к видам Gaffkya homari, а также Aerococcus viridans. Все
эти организмы предлагается поместить в род Pediococcus и назы-
вать их Pediococcus homari nov. comb. Гюнтер и Уайт (Gunther,
White, 1961а) полагают, что последний, возможно, можно будет
отождествлять с Pediococcus halophilus Mees, 1934 только после
проведения дальнейших исследований свойств этих организмов.
Гюнтер и Уайт обсуждают и систематическое положение Р. uri-
nae equi. По мнению авторов, их можно считать подгруппой первой
группы (Р. cerevisiae), хотя они не растут в среде при pH 4,2, не
образуют аммиак из аргинина, ацетоин из глюкозы или лактозы,
чувствительны к типолу, сравнительно мало накапливают кислоты
(среда подкисляется до pH 5,0). В связи с последней особенностью
Педерсон и другие (Pederson et al., 1954) полагали, что Р. urinae
equi не следует включать в род Pediococcus. Отметим также, что не
установлено серологического родства Р. urinae equi с Р. cerevisiae
(Coster, White, 1964).
184
Что касается остальных видов, описанных в табл. 35, то Р. dam-
nosus отличается от других педиококков низкой оптимальной тем-
пературой роста; они не сбраживают салицин и пентозы. Интерес-
но заметить, что Гюнтер и Уайт никогда не выделяли штаммов пе-
диококков, которые образовывали бы слизь из сахарозы или имели
высокую оптимальную температуру роста.
Исследования, на которых мы останавливались, были в даль-
нейшем расширены. Так, Костер и Уайт (Coster, White, 1964), под-
твердив, в основном, изложенные выше данные, уточнили характе-
ристику ряда видов педиококков. Авторы указывают, что Pedio-
coccus parvulus Gunther and White можно легко определить по при-
веденным в табл. 35 свойствам. В то же время некоторые вновь
выделенные штаммы проявляют большую устойчивость к NaCl на
среде с твином 80, который влияет и на размер колоний. В связи с
этим вряд ли солеустойчивость и размер колоний могут служить
ключевыми признаками вида Р. parvulus. Последний от Р. cerevi-
siae можно дифференцировать по отсутствию роста в среде с pH 8,6.
Авторы предлагают Р. damnosus разделить на три разновидно-
сти: Р. damnosus var. damnosus, Р. damnosus var. diastaticus и
P. damnosus var. limosus.
Костер и Уайт сообщили, что у Р. halophilus ярко выражена по-
требность в NaCl — он хорошо растет в присутствии 1—20% NaCl
(особенно 7—10%). Представители вида растут в среде с pH 8,6 и
не растут при pH 4,2.
Таблица 36
Виды и разновидности рода Pediococcus (по Coster, White, 1964)
Вид Синоним Автор
Р. cerevisiae Balcke P. pentosaceus P. acidi lactici Nakagawa, Kitahara, 1959 » »
var. dextranicus Группа III Giinther, White, 1961a
var. urinae equi P. parvulus Gunther and White P. urinae equi Nakagawa, Kitahara, 1959 Giinther, White, 1961a
P. damnosus Claussen var. diastaticus P. damnosus P. cerevisiae Streptococcus damnosus var. diastaticus Mees, 1934 Nakagawa, Kitahara, 1959 Andrews, Gilliland, 1952
var damnosus var limosus Streptococcus damnosus Streptococcus damnosus var. limosus Shimwell, 1949 » »
P. halophilus Mees P. soyae Sakaguchl, 1958
Aerococcus viridans Wil- liams, Hirsch, Cowan P. homari Deibel, Niven, I960
185
Таблица 37
Физиологические признаки членов рода Pediococcus (по Sharpe et al. 1966) *
Признак Р. cerevisiae Группа III no Gunther, White Р. parvulus Р. damnosus Р. halophilus P. homari или Aero coccus viridans
Рост
при 37° + + + — + +
45° + — — — — —
в среде с pH 4,4 + — + + — —
8,6 + — — — + +
10% NaCl с — — — + +
в среде Рогозы + + + + — —
Образование каталазы ± — — — — —
Потребность в 5% NaCl — — — — + —
NHs из аргинина + Обычно — — — + —
Ацетоин из глюкозы Кислота из: + — — ± + —
сахарозы — — — — + +
арабинозы + — — — + —
раффинозы — — — — — +
сорбита — — — — + —
декстрина — + — — — —
мальтозы + ± + — + +
Молочная кислота DL L(+) DL DL L(+) L(+)
•С - слабо; остальные обозначения см. табл. 27.
Дальнейшее изучение свойств Р. homari дало возможность уста-
новить, что этот вид, в отличие от других, плохо растет в бульоне
ТДж, на агаре СЛ (табл. 6) и в среде с pH 4,4. Рост этого вида уг-
нетен в анаэробных условиях и при посеве бактерий уколом. Хоро-
шо растет при 4, 6,5 и 10%, но не, 15 или 20% NaCl; pH среды 8,6
является благоприятным для Р. homari. Способность к росту при
высокой концентрации соли отличает Р. halophilus от Р. homari
и Aerococcus viridans, а такие общие с аэрококками признаки, как
чувствительность к кислоте, способность сбраживать сахарозу
и маннит, образование оптически активной молочной кислоты по-
мещают Р. homari в промежуточное положение между аэрококками
и видами педиококков (Coster, White, 1964).
В настоящее время установлены виды и разновидности рода
Pediococcus, приведенные в табл. 36. Из нее вытекает, что опреде-
ленные расхождения в номенклатуре создают неизбежные ослож-
нения при идентификации педиококков.
186
На основании ряда обсужденных выше работ (Pederson, 1949;
Gunther, White, 1961а; Coster, White, 1964; Deibel, Niven, 1960)
Шарп с сотрудниками (Sharpe et al.,1966) составлена таблица, в ко-
торой приведен ряд признаков для идентификации видов рода Pe-
diococcus (табл. 37). Рекомендуется пользоваться указанной схе-
мой в целях унификации подходов к изучению систематического
положения педиококков.
БИФИДОБАКТЕРИИ
Систематическое положение бифидус-группы до настоящего вре-
мени остается дискуссионным. Таксономия их еще не установилась.
Названия отдельных видов неоднократно претерпевали изменения.
По ряду свойств эти микроорганизмы близки к молочнокислым и
поэтому отдельные исследователи включают их в род Lactobacillus;
другие авторы вычленяют бифидобактерии в самостоятельную так-
сономическую единицу, далекую от лактобацилл. Вовлечение но-
вых методов исследований, особенно на молекулярном уровне, по-
зволяет освещать многие стороны биологии этой важной группы
бактерий и подходить с позиций филогении к пониманию их мес-
та среди других микроорганизмов. Познание бифидобактерий на-
ходится в процессе становления. Мы остановимся на основных ве-
хах этих исследований.
Впервые бифидусные бактерии из стула грудных детей изолиро-
вал Тиссье (Tissier, 1900) и из-за способности их ветвиться назвал
Bacillus bifidus. Позже их называли Lactobacillus bifidus, а также
Bacterium bifidum.
Морфологически L. bifidus представляет собой неспорообразую-
щие, грамположительные, иногда грамотрицательные палочки
(0,5—0,7X2—8 мк); клетки их при первичном выделении из фека-
лиев прямые или в виде запятой, с булавовидными утолщениями на
конце, иногда ветвящиеся (У,-Т-формы), зернистые; в чистых куль-
турах они более полиморфны; наблюдается тенденция к образова-
нию цепочек (Weiss, Rettger, 1934). По данным Шулера с соавто-
рами (Schuler et al., 1968), сразу после выделения L. bifidus и
выращивания культур на печеночном агаре, молоке, бактерии Г+,
ветвятся. После пересевов в молоке ветвление исчезает, клетки ста-
новятся грамвариабельными; слабее окрашиваются кислыми и ще-
лочными красителями, появляется много гранулированных форм,
которые иногда можно принять за кокки. Для некоторых предста-
вителей бифидобактерий (L. bifidus var. pennsylvanicus) характер-
но образование так называемых амфороподобных клеток (Sund-
man et al., 1959).
Бифидобактерии обладают способностью образовывать разбух-
шие, инволюционные, шаровидные формы при развитии в неблаго-
приятных условиях — неподходящая кислотность среды, темпера-
187
тура выращивания, недостаток питательных компонентов среды,
присутствие кислорода (Tissier, 1900; Hayward et al., 1955).
Сандмен и Бьоркстен (Sundman, Bjorksten, 1958) нашли, что
эти формы образуются на агаре с томатным соком (рис. 13, 14).
При добавлении к нему 5 об. % триптического гидролизата молока
клетки приобретают обычный вид. Авторы подтвердили наблюде-
ние Орла-Иенсена о том, что шаровидные клетки характерны для
культур, сбраживающих только ксилозу или ксилозу и арабинозу
(IV и V группы по Деннерту), и предположили, что они появля-
ются в результате отсутствия в среде компонентов, необходимых
для нормального синтеза бактериальных клеточных стенок.
Исследователи считают, что способность бифидобактерий обра-
зовывать разбухшие тела на агаре с томатным соком может быть
использована как общий систематический признак группы «би-
фидус», отличающий ее от родственных организмов.
Сравнительное изучение ультратонких срезов бактериальных
клеток Lactobacillus acidophilus и L. bifidus в электронном микро-
скопе при контрастировании уранилацетатом (Lickfeld, 1967) по-
казало существенные различия в толщине клеточных стенок и мор-
фологии изученных форм, что ставит под сомнение отнесение L. aci-
dophilus и L. bifidus к одному роду Lactobacillus.
В настоящее время бифидобактерии разделены на отдельные
морфологические группы и показано, что ветвление происходит в
среде, неполноценной в отношении источников питания (Sundman,
Bjorksten, 1958; Sundman et al., 1959). Появление плеоморфных,
Таблица 38
Группы Bacterium bifidum (по Dehnert, 1957b)
Сахар и спирт Группы * Сахар и спирт Группы *
I—II III IV V I—II III IV V
1 (+)-Арабиноза — —• — + Инулин — — + —
d (+)-Ксилоза — — + 4- Сорбит — + — —
I (+)-Рамноза — — — dl-Инозит — — 4- —
Глюкоза 4- + + + d (+)-Маннит — + + -/+
d (+)-Галактоза + + + + i-Эритрит — — — —
d (— )-Фруктоза + + + + Дульцит — — — —
d (4-)-Манноза — + + 4" d (+)-Мелибиоза- (+) 4- + +
Сахароза (+) + 4" + гидрат
Мальтоза (+) + 4" 4" d (-(-)-Мелецитоза- — + — +
Лактоза + + + гидрат
<1(+)-Трегалоза d (+)-Раффиноза -/+ -/+ + -/+ d (+)-Целлобиоза Адонит Сорбоза -/+ — -/+
Салицин — + — -/+
* В. Ф. Семенихина (1968а) установила биотип VI, сбраживающий арабинозу, но не
ксилозу.
188
Рис. 13. Инволюционные шаровидные клетки групп I—V Lactobacillus bifidus
(по J. Dehnert, 1957b) на агаризованной среде с томатным соком, посев уко-
лом (Sundman, Bjorksten, 1958)
ветвящихся клеток у L. bifidus индуцируется и катионами одно-
валентных щелочных металлов — К+, Na+, Li+, Rb+, Cs+, а также
исключением из среды для культивирования бифидусных бактерий
какой-либо из четырех аминокислот (DL-аланин, DL-аспарагино-
вая кислота, L (+)-глутаминовая кислота, DL-серин), смесь кото-
рых предотвращает появление разветвленных клеток (Kojima et al.,
1968; Husain et al., 1972). Бифидобактерии неподвижны, спор не
образуют.
При первичном выделении L. bifidus является строгим анаэро-
бом; в процессе лабораторного культивирования он приобретает
способность развиваться при доступе кислорода (Friedman,
Black, 1941; Schuler et al., 1968), а в высокопитательных средах
может расти и в полностью аэробных условиях (Weiss, Rett-
189
Рис. 14. Клетки отдельных групп Lactobacillus bifidus на агаризованной сре-
де с томатным соком, поверхностный посев (Sundman, Bjorksten, 1958).
Группы те же, что и на рис. 13.
ger, 4934). Исходя из характера роста бифидобактерий в агаровых
столбиках и роста их в жидкой среде (например, печеночно-цисти-
новой) при доступе кислорода, их рассматривают как микроаэро-
фильные организмы (Семенихина, 1968а).
L. bifidus не образует каталазу, H2S, не восстанавливает нит-
раты в нитриты, не обладает уреазной активностью, не разжижает
желатин. При сбраживании углеводов наряду с молочной обра-
зует уксусную кислоту (1,0:1,5) (Scardovi et al., 1971); некоторые
штаммы продуцируют ацетоин (Schuler et al., 1968). Предельная
кислотность сквашенного бифидобактериями молока через 2—4 су-
ток составляет 100—130° Т (Семенихина, 1970). Спектр сахаров,
сбраживаемых L. bifidus, довольно широк (Weiss, Rettger, 1934).
Денерт (Dehnert, 1957b) штаммы анаэробных бифидобактерий,
190
выделенных из кала грудных детей, на основании спектра сбражи-
ваемых субстратов, а также коррелирующих с ним морфологичес-
ких и серологических признаков, разделил на пять групп (табл. 38).
Представители последних стойко сохраняли свои особенности.
Интересно подчеркнуть, что группы бифидобактерий, установ-
ленные на основании изучения морфологии клеток (Sundman et al.,
1959) и по физиологическим свойствам, в частности, по особенно-
стям их питания (Dehnert, 1957b; Gyllenberg, Carlberg, 1958), сов-
падают.
Подобно молочнокислым бактериям, потребности L. bifidus в
биологически активных веществах велики и разнообразны. Они
нуждаются в биотине, пантотеновой кислоте, цистеине (цистине),
рибофлавине, пуриновых и пиримидиновых основаниях, пептидах
и аминосахарах, факторах, содержащихся в морковном соке, ко-
ферменте A (Hassinen et al., 1951; Gyllenberg, Carlberg, 1958; Ta-
mura et al., 1972).
В то же время многие бифидобактерии синтезируют ряд вита-
минов (мкг°/о): пантотеновую кислоту — 0—12; рибофлавин —
О—16; тиамин—1—2,5; фолиевую кислоту — 3—8; кобаламин —
0,007—0,01 (Семенихина, 1970).
Для выделения и культивирования L. bifidus применяются раз-
личные среды (Weiss, Rettger, 1934; Blaurock, 1939; Petuely, Ly-
nau, 1954; Gyorgy, 1953; Sundman, Bjorksten, 1958; Beck, 1967,
и др.). В. Ф. Семенихина (19686) показала, что выделение бифидо-
бактерий удобно производить на следующих средах.
1. Печеночно-цистиновая среда по Блауроку: 500 г мелко нарезанной пече-
ни кипятят в литре дистиллированной воды в течение двух часов, со-
держимое отфильтровывают через складчатый бумажный фильтр. Филь-
трат доливают до 1 л водой и добавляют следующие ингредиенты:
пептон.............10 г цистин .... 1 мл
(раствор концентрации 1:10 000)
NaCl................5 г агар..............20 г
лактоза .... 10 г pH среды . . . 7,0—7,2
2. Среда по Хенелю (без сорбиповой кислоты):
томатный сок . . . .400 мл мясной гидролизат по
панкреатический пере- Хоттингеру..............10 мл
вар казеина...........100 мл агар.....................20 г
дрожжевой автолизат 100 мл дистиллированная вода 370 мл
pH среды..............7,0
При необходимости добавляют 0,04% сорбиновой кислоты.
Бактерии можно изолировать и на агаризованной среде с дрожжевым авто-
лизатом и лактозой (1%).
В. Ф. Семенихина рекомендует для выделения Lactobacterium
bifidum использовать девятое и десятое разведения фекалий. При
этом наиболее крупные колонии бифидобактерий (1,5—4 мм) выра-
стают на среде по Хенелю, а мелкие — на печеночно-цистиновом
агаре (0,5—2 мм). На нем обнаруживается наибольшее число вет-
вящихся клеток, а среда по Хенелю способствует образованию бу-
191
лавовидных и веретенообразных форм. Указанные среды пригодны
и для хранения L. bifidus (при 2—5°). Пересевы культур следует
проводить через каждые 7—10 суток. Хорошо сохранять их в лио-
филизированном состоянии. Для этого суспензию L. bifidus высу-
шивают (до содержания остаточной влаги 1,3%) в среде, имеющей
8% сахарозы, 1,5% желатина, 5% обезжиренного молока и хранят
в ампулах под вакуумом (Damjnovic et al., 1969).
Г. И. Гончарова (1968) для выделения и культивирования
В. bifidum рекомендует модифицированную ею среду Блаурока.
В этом случае к 1 л печеночного бульона добавляют 750 мг агара
и 1 мл твина 80. pH среды 7,2—7,4.
Систематическое положение L. bifidus
Мы отмечали уже, что мнения различных исследователей относи-
тельно положения L. bifidus в системе микроорганизмов противо-
речивы.
Вейс и Ретгер (Weiss, Rettger, 1934) предложили назвать эти
бактерии Lactobacillus bifidus и считали их вариантом L. acidophi-
lus. Норрис с соавторами (Norris et al., 1950) присоединились к
этому мнению. Подобной точки зрения придерживаются и Н. А.
Красильников (1949), а также японский исследователь Т. Томио-
ка (1960, цит. по Семенихиной, 1968а).
Орла-Иенсен еще в 1924 г. отнес организм, выделенный Тиссье
(Орла-Иенсен называл его Bacterium bifidum Tissier) к роду Bifi-
dobacterium и утверждал, что эти микроорганизмы не принадле-
жат к молочнокислым палочкам, а могут рассматриваться как
звено, связывающее их и пропионовокислые бактерии (Orla-Jen-
sen et al., 1936а; Orla-Jensen, 1942). По мнению автора, клюшко-
подобные формы, зернистые включения и активное сбраживание
пентоз В. bifidum свидетельствует о принадлежности его к кори-
небактериям, в то время как наличие ветвления сближает с акти-
номицетами. Плото (von Plotho, 1947) также считал возможным
отнести Bacterium bifidum к коринебактериям и назвать его Согу-
nebacterium bifidum причем автор отмечал, что распространен-
ное название Bacillus bifidus противоречит правилам номен-
клатуры. К коринебактериям относят этот организм и другие ис-
следователи (Blaurock, 1939; Gyllenberg, Carlberg, 1958). Хейуорд
с сотрудниками (Hayward et al., 1955) также не причисляли Lac-
tobacillus bifidus к молочнокислым бактериям и полагали, что
образование ветвящихся септированных палочек и нитей говорит
в пользу отнесения бифидобактерий к Actinomycetales, подпоряд-
ку Mycobacteriineae. Авторы считают, что родовое название Bi-
fidobacterium, предложенное Орла-Иенсеном для объединения
бифидобактерий, наиболее удачно.
Сандмен с сотрудниками (Sundman et al., 1959) утверждают,
что три из четырех установленных ими подтипов L. bifidus наибо-
лее близки к роду Butyribacterium, а четвертый — к роду Actino-
192
myces. За причисление L. bifidus к роду Actinomyces высказыва-
лись и другие авторы (Rosebury, 1962). Так, Снайдер с сотрудни-
ками (Snyder et al., 1967) полагают, что присутствие в клеточной
стенке L. bifidus (штамм, изолированный из кала грудного ребен-
ка) большого количества серина сближает этот организм с пред-
ставителями вида A. bovis (штамм А-9). При этом нужно иметь
в виду, что серин в клеточных стенках бактерий вида A. bovis ря-
ду исследователей не удалось найти, что ставит под сомнение вы-
вод Снайдера и соавторов.
Камминс и Гленденнинг (Cummins, Glendenning, 1957) показа-
ли большую вариабельность химического состава клеточных сте-
нок штаммов L. bifidus. По мнению авторов, состав клеточных сте-
нок бифидобактерий не соответствует таковому клеточных стенок
грамположительных бактерий и их нельзя отнести ни к Согуне-
bacterium (содержащем в стенках клеток арабинозу и а-, е-диа-
минопимелиновую кислоту), ни к какой-либо группе Actinomyce-
tales.
Ряд исследований, проведенных за последнее время (Dehnert,
1957а; Lerche, Reuter, 1961; Schuler et al., 1968), убедительно по-
казали, что L. bifidus должны быть выделены из рода лактобацилл.
Об этом, в частности, свидетельствуют и новые данные о путях
анаэробного превращения глюкозы бифидобактериями (de Vries,
Stouthamer, 1967, 1968; de Vries et al., 1967; Scardovi, Trovatelli,
1969; Scardovi et al., 1969, и др.).
Было установлено, что бифидобактерии, выделенные от челове-
ка, из рубца животных и кишечника пчел, в отличие от молочно-
кислых бактерий, анаэробных актиномицетов, коринебактерий и
других ветвящихся форм бактерий, осуществляют брожение глю-
козы по так называемому фруктозо-6-фосфатному пути. Особен-
ностью этого пути является, с одной стороны, участие фермента
фруктозо-6-фосфат фосфокетолазы (обнаруженного ранее у обли-
гатного аэроба Acetobacter xylinum), с другой — то, что только
здесь одновременно важную роль играет транскетолаза и ксилу-
лозо-5-фосфат фосфокетолаза. В бесклеточных экстрактах Bifido-
bacterium bifidum (L. bifidus) не обнаружено ни альдолазы, ха-
рактерной для гликолиза, ни дегидрогеназы глюкозо-6-фосфата,
присущей гексозомонофосфатному пути сбраживания гексоз (de
Vries, Stouthamer, 1967). Ниже приводится путь сбраживания
глюкозы бифидобактериями (по Scardovi, Trovatelli, 1969).
Бифидобактерии превращают гексозы во фруктозо-6-фосфат,
который затем расщепляется фосфокетолазой с образованием эрит-
розо-4-фосфата и ацетилфосфата. Затем эритрозо-4-фосфат и
фруктозо-6-фосфат под действием трансальдолазы и транс-
кетолазы превращаются в два моля пентозофосфата. Ксилулозо-5-
фосфат расщепляется фосфокетолазой с образованием ацетилфос-
фата и 3-фосфоглицеринового альдегида, который превращается в
пируват. Последний может редуцироваться до лактата или расще-
пляться в результате фосфорокластической реакции до ацетата и
7 Е. И. Квасников, О. А. Нестеренко 193
формиата (лактат в этом случае не обнаруживается). Баланс бро-
жения можно суммировать уравнением (по Anderson, Wood, 1969).
Глюкоза—>(1,5 + 0,5 х) ацетат+ (1,0 — х) лактат + 0,5 х этанол+х формиат,
2 Глюкоза
I
I
2 Фруктозо-6-Ф«—
Эритрозо-4-Ф + Ацетил-Ф-
-----»Глицеральдегид-3-Ф------>
-----»Седогептулозо-3-Ф-------1
1
I
Рибозо-5-Ф<----------
Ксилулозо-5-Ф<-------
.------------1
I I
2 Ацетил-Ф 2 Глицеральдегид-З-Ф
I I :
1 I :
2 Ацетата 2 Лактата : —» .
1
Ацетат
Наличие своеобразного (фруктозо-6-фосфатного) пути превра-
щения глюкозы бифидобактериями, изолированными из организма
человека и животных, показывает, что выделение бифидобактерий
в отдельный род Bifidobacterium обоснованно (de Vries, Stouthamer,
1967; Scardovi, Trovatelli, 1969; Scardovi et al., 1971).
В пользу этого, как считают Скардови с сотрудниками (Scardo-
vi et а]., 1969), свидетельствует и специфический нуклеотидный
состав ДНК бифидобактерий, отличающийся от такового у лакто-
бацилл. ДНК исследованных до сих пор бифидусных бактерий со-
держит в среднем 60 мол.% ГЦ (Scardovi et al., 1970). Гассер и
Мандель (Gasser, Mandel, 1968) методом измерения плавучей
плотности ДНК установили, что в ДНК В. bifidum содержится 58
мол.% ГЦ.
Прево (Prevot, 1961) отнес L. bifidus к подроду Bifidobacterium
рода Actinobacterium семейства Actinomycetaceae. Однако Шарп
(Sharpe, 1962) считает, что сейчас нет еще достаточно веских дан-
ных для установления точного систематического положения L. bi-
fidus и его нельзя отнести к какому-либо определенному семей-
ству.
По мнению Ройтера (Reuter, 1963,1971),бифидус-группадолж-
на быть вычленена в род Bifidobacterium (Orla-Jensen), в пределах
которого следует различать восемь видов, в том числе В. bifidum
(Tissier) (табл. 39). Доказательства в пользу целесообразности де-
ления бифидобактерий на виды по Ройтеру были получены при ис-
следовании их антигенного состава. Так, изучение полных и раст-
воримых антигенов методом иммуноэлектрофореза и двойной
диффузии в агаре показало значительные качественные отличия
между видами Bifidobacterium bifidum (штамм Tissier) и В. Ion-
gum, выделенными из испражнений грудных детей (Breuillaud et
al., 1971).
Из кишечного тракта пчел Apis mellifera L., обитающих в раз-
личных областях Италии и Европы, выделен новый вид — Bifido-
bacterium asteroides n. sp. (Scardovi, Trovatelli, 1969), отнесенный
к группе «constellatus» ввиду сходства нового вида с Bacillus сон-
stellatus, найденным Уайтом в пищеварительном тракте пчел и
причисленным Прево к Bifidobacterium constellatum (White) Pre-
vot (1938).
Представители нового вида характеризуются образованием ра-
диальных скоплений или звездоподобных групп клеток, особенно
при росте в твердой среде. При неблагоприятных условиях обра-
зуются булавовидные, амфороподобные и иные клетки так назы-
ваемой «бифидной» формы. Выделенные бактерии, которым необ-
ходим СО2, растут и в смеси кислорода воздуха с СО2 (2:1), обра-
зуя при этом каталазу. В условиях строгого анаэробиоза каталаза
не образуется. Новый вид не ферментирует лактозу, крахмал и
использует глюконат с образованием СО2. Бифидобактерии ’из
пчел обладают дегидрогеназами, присущими гексозомонофосфат-
ному шунту, благодаря чему 6-Ф-глюконат превращается в пенто-
зы и СО2. В нормально растущих на глюкозе клетках гексозомоно-
фосфатный шунт не действует; тем не менее, как считают Скар-
дови и Трователли, бактерии из пчел следует рассматривать как
потенциальных продуцентов СО2.
Кроме описанного вида, из пчел A. mellifera L. был выделен
Bifidobacterium coryneforme n. sp., характеризовавшийся корине-
подобными клетками, а от пчел A. indica F., полученных из Ма-
лайзии, изолирован Bifidobacterium indicum n. sp. Он отличался
от В. asteroides n. sp. только морфологией (никогда не образует
звездоподобных группировок). Каталаза образуется только в ге-
минсодержащих средах.
Указанные выше три вида были отнесены к роду Bifidobacterium
исключительно на основании наличия у них фруктозо-6-фосфатного
пути превращения глюкозы. Вместе с тем, описываемые бифидо-
бактерии, выделенные от пчел (в отличие от таковых из фекалиев),
характеризовались наличием дегидрогеназ глюкозо-6-фосфата.
Дальнейшие исследования показали, что использование глюко-
ната В. asteroides, В. coryneforme и В. indicum осуществляется
путем фосфорилирования его при участии глюконокиназы, дегид-
рирования 6-фосфоглюконата, декарбоксилирования его с образо-
ванием пентоз и последующего расщепления их на двух- и трех-
195
7*
Таблица 39
Описание типовых штаммов видов рода
Вид В. adolescentis Reuter В breve Reuter В. infantis Reuter
Типовой штамм ATCC 15703 ATCC 15700 ATCC 15697
Источник выделе- Кишечпик взрос- Кишечник младея- Кишечник младен-
НИЯ лых цев цев
Морфология Короткие, искрив- ленные палочки, некоторые имеют V-форму Очень короткие, тонкие, булавовид- ные палочки, мо- гут иметь V-форму Короткие, часто разбухшие палоч- ки, нет V-форм
Окраска по Граму + + + (часто в центре клетки гранулы)
Рост в жидкой сре- де без добавления редуцирующих ве- ществ — (+) (+)
Сбраживание
L (+)-Арабинозы 4- — —
D (-(-)-Ксилозы + —
D (+)-Маннозы — + d
D (Ч-)-Трегалозы + — d
D (-(-)-Целлобиозы + + d
Мелецитозы (d) (d) (d)
Крахмала + (d)
Гликогена d + —
Инулина + — +
Маннита + +
Сорбита + + —
Инозита — — —
Эскулина + + —
Салицина + + +
Амигдалина + d 1
* Все не образуют каталазу, нитратазу, споры, капсулы (кроме В. longum), непод-
розу, мелибиозу, D (Н-)-раффинозу, декстрин, не сбраживают рамнозу, сорбозу, адонит,
углеродные соединения. В результате образуются СО2, молочная и
уксусная кислоты (Sgorbati et al., 1970).
Из бычьего рубца Скардови с сотрудниками (Scardovi et al.,
1969) выделили два новых вида анаэробных, аэротолерантных
бифидобактерий — В. globosum и В. ruminale, а также отличаю-
щуюся от них серологически и сбраживающую маннит группу би-
фидобактерий неопределенного систематического положения.
196
Bifidobacterium (no Reuter, 1971) *
В. lactentis Reuter В. liberoruin Reuter В. longum Reuter В. parvulorum Reuter
АТСС 25962 АТСС 15702 АТСС 15707 АТСС 15698
Кишечник мла- Кишечник мла- Кишечник взрос- Кишечник мла-
денцев денцев лых денцев
Тонкие палочки, Длинные, тонкие Длинные, искрив- Короткие, толстые
нет V-форм или разбухшие палочки, нет V- форм ленные, разбухшие или гантедеподоб- ные палочки, мо- гут иметь V-форму палочки, нет V-форм
+ (часто в центре клетки гранулы) + (гранулы) + (грам-вариабель- ная) + (гранулы)
— — (+) (+)
-1-
+ + + —
d — — +
d d d —
— (d) — d
— — + —
(d) (d) — +
— — — +
+ — — —
+ — — —
— — —
+ + — —
— — — d
— d — +
— — — +
В1ВДНЫ, анаэробы; сбраживают рибозу, глюкозу, галактозу, фруктозу, лактозу, саха-
дульцит, эритрит; d—замедленное сбраживание (после 4-х суток); (d)—слабая реакция.
Изолированные из рубца штаммы (в отличие от выделенных от
человека) характеризуются тем, что их бесклеточные экстракты
содержат альдолазу, а также дегидрогеназы, присущие гексозомо-
нофосфатному пути превращения глюкозы (дегидрогеназы глюко-
зо-6-фосфата и 6-фосфоглюконата). Как указывают авторы, эти
микроорганизмы следует считать потенциальными гетерофермен-
тативными бактериями.
197
В. globosum n. sp. характеризовался коринойдной формой кле-
ток, серологической специфичностью, содержанием 64 мол % ГЦ в
ДНК, специфической последовательностью аминокислот в муреи-
не (Holzapfel et al., 1969).
В. ruminale n. sp. обособляется в новый вид главным образом на
основании его морфологии, отсутствия способности сбраживать лак-
тозу и содержания 60 мол. % ГЦ в ДНК. К сожалению, авторы не
провели должного сопоставления свойств этого вида с не сбражи-
вающими лактозу бифидными организмами, изолированными от
пчел, а при установлении нового вида большое место было отведено
его местообитанию.
Новый вид рода Bifidobacterium — В. suis n. sp. — был изолиро-
ван недавно из фекалиев свиней. Бактерии сбраживают глюкозу
по фруктозо-6-фосфатному пути с образованием молочной и ук-
сусной кислот (в отношении 1,0:1,7—1,0: 2,0). Организмы это-
го вида по составу оснований ДНК (62 мол. % ГЦ) и в опытах по
гомологии ДНК не обнаружили родства с иными видами рода Bi-
fidobacterium (Matteuzzi et al., 1971).
К настоящему времени описано 16 видов рода. Отличительные
признаки их (наряду со свойствами подвидов и биотипов) обобще-
ны Скардови с сотрудниками (Scardovi et al., 1971).
Следует отметить, что видовая дифференциация в пределах
рода Bifidobacterium несовершенна. Морфолого-физиологические,
экологические, серологические, биохимические признаки (в част-
ности, наличие ряда ферментов, участвующих в сбраживании
глюкозы), потребности в источниках питания не всегда с успехом
могут использоваться при определении видов. Если В. bifidum до-
вольно легко идентифицируется по сбраживанию ряда субстратов,
то В. infantis, В. breve, В. parvulorum различаются с трудом; это
же относится к В. liberorum и В. lactentis, а также иным видам би-
фидобактерий (Scardovi et al., 1971). Сейчас довольно широко ве-
дутся исследования по изучению гомологии ДНК бифидобактерий,
выделенных от различных животных, с помощью метода гибриди-
зации ДНК-ДНК, дающего возможность установить родственные
взаимоотношения между видами (Scardovi et al., 1970).
Так, из клеток бифидобактерий, сбраживающих маннит и изо-
лированных из рубца крупного рогатого скота, выделяли ДНК и
определяли ее гомологию с ДНК, полученной из В. ruminale, В.
globosum и В. adolescentis. Оказалось, что одна группа изолирован-
ных бактерий обнаруживает высокую степень гомологии их ДНК
с ДНК В. globosum, другая — с ДНК из В. adolescentis, выделен-
ных из фекалиев человека. ДНК из В. ruminale негомологична ни
одному изученному препарату ДНК, полученному из исследуемых
изолятов, сбраживающих маннит (Crociani et al., 1970).
Высокая степень генетического сходства обнаружена методом
гибридизации ДНК-ДНК у видов В. breve и В. parvulorum; В. the-
rmophilum и В. ruminale; В. pseudoIongum и В. globosum. В то же
время выявлена незначительная степень гомологии при гибридиза-
198
ции ДНК, полученных из штаммов, изолированных от человека или
животных, например, В. breve и В. thermophilum; В. longum и В.
pseudoIongum (Scardovi et al., 1971). Метод гибридизации ДНК
бифидусных бактерий различных видов может явиться весьма по-
лезным для разработки вопросов систематики этих микроорга-
низмов.
Многообещающими для целей видовой и родовой диагностики
бифидобактерий является исследование состава клеточных липи-
дов (в частности, фосфолипидов) (Exterkate et al., 1971), а также
структуры муреина клеточных стенок. Удалось показать, что тип
муреина действительно является полезным диагностическим приз-
наком, четко коррелирующим с иными свойствами принятых в на-
стоящее время видов (табл. 40)' (Holzapfel et al., 1969; Kandler,
Таблица 40
Типы муреина, обнаруженные у видов рода Bifidobacterium
(по Kandler, 1970) *
Вид
Тип муреина
В. bifidum —
В. infantis —
В. breve —
В. lactentis —
В. adolescentis +
В. longum +
В. globosum о
В. asteroides (Ва- о
cillus constellatus)
+
+
(+)
+
L-Op н-L-Cep-D- Асп
L-Лиз-Глу
L-Лиз-Глу
L-Opn-L-Cep-L-Ала-Тре-
L-Ала
Ь-0рн-(Ь-Лиз)-О-Асп +
Ь-Лиз-Ь-Сер-(Ь-Ала)г
L-Opn-L-Cep-L-Ала-Тре-
L-Ала
Ь-0рн-(Ь-Лиз)-(Е-Ала)з
L-Лиз-Глу
* о — не испытаны, (+) кислота образуется медленно; ± большинство штаммов обра-
зует кислоту.
1970). Выяснилось также, что типы муреина в клеточных стенках
бифидобактерий весьма разнообразны. Такая тенденция к разно-
образию аминокислотного состава межпептидных мостиков в муре-
ине ранее отмечалась нами у гетероферментативных молочнокис-
лых палочек.
Ряд штаммов Bifidobacterium bifidum и штамм Lactobacillus var.
pennsylvanicus АТСС И 863 характеризовались ранее не обнару-
женным типом муреина L-OpH-L-Cep-D-Acn. Позднее Виркамп
199
(Veerkamp, 1971) также показал, что в муреине клеток В. bifidum
var. pennsylvanicus тетрапептиды, присоединенные к мурамовой
кислоте, соединены поперечными межпептидными мостиками, со-
стоящими из дипептидов серина и аспарагина. Автор считает, что
наличие дипептидных мостиков является характерным признаком
пептидогликана В. bifidum var. pennsylvanicus.
Канцлер (Kandger, 1970) установил, что штаммы видов В. as-
teroides, В. infantis и В. breve характеризуются L-Лиз-Глу-типом
муреина. Сложный межпептидный мостик найден в муреине кле-
точных стенок бактерий видов В. longum (изолируется из фекалий
взрослых) и В. lactentis (изолируется из фекалий младенцев)
(табл. 40). Интересно отметить, что клеточные стенки бифидобак-
терий В. adolescentis, часто обнаруживаемых в фекалиях взрослых
людей, характеризуются двумя типами муреина. Это Ь-Лиз-L-Cep-
(L-Ала) 2-тип, который найден и у видов рода Leuconostoc, а так-
же Ь-Орн-(Ь-Лиз)-В-Асп-тип, выявляемый у большинства лакто-
бацилл. При этом, в отличие от последних, бактерии вида В. ado-
lescentis в муреине стенок содержат одновременно две диамино-
кислоты, количественное соотношение которых меняется в зави-
симости от штамма.
Одновременное нахождение орнитина и лизина отмечено также
в муреине бифидобактерий, изолированных из рубца овцы и опи-
санных как В. globosum (табл. 40) (Holzapfel et al., 1969; Kandler,
1970). Межпептидные мостики в муреине этих бактерий содержат
три L-аланина, что обнаружено также у стрептококков и микро-
кокков, которые, однако, имеют в муреине только одну диамино-
кислоту — лизин.
Данные о типах муреина, хотя зачастую и полученные на ос-
нове изучения единичных штаммов (Kandler, 1970), дают
основания для решения спорных вопросов о систематическом по-
ложении рода Bifidobacterium. Эти сведения не исключают связь
рода с семейством Actinomycetaceae, хотя в настоящее время име-
ются лишь немногочисленные данные о последовательности ами-
нокислот в пептидах муреина актиномицетов. Так, на основании
работ ряда авторов (Cummins, Harris, 1958, и др.) вполне вероят-
но, что виды актиномицетов характеризуются Ь-Лиз-(П-Орн)-П-
Асп-типом муреина. Очевидно, имеются и иные межпептидные
мостики, что свидетельствует о значительной вариации типов му-
реинов у представителей Actinomycetales (Kandler, 1970).
С другой стороны, близость путей сбраживания глюкозы гете-
роферментативными лактобациллами и бифидобактериями и общ-
ность определенных типов муреина могут свидетельствовать и в
пользу явного родства между Betabacterium и Bifidobacterium. По-
этому, по мнению Кандлера, род Bifidobacterium все же следует
рассматривать в пределах семейства Lactobacillaceae. Наличие
родства бифидобактерий с актиномицетами требует дальнейшего
экспериментального подтверждения.
МОЛОЧНОКИСЛЫЕ
БАКТЕРИИ
В ПРИРОДЕ
ЭПИФИТНАЯ МИКРОФЛОРА
Молочнокислые бактерии, обитающие на поверхности растений,
издавна стали привлекать к себе внимание отечественных и за-
рубежных исследователей. И хотя данные отдельных авторов бы-
ли нередко противоречивы, анализ литературных сведений в целом
позволяет получить достаточно полное представление о содержа-
нии молочнокислых бактерий в эпифитной микрофлоре и об их
видовом составе.
Мы не станем останавливаться на обзоре работ раннего пери-
ода исследований. Они достаточно полно освещены в ряде моно-
графий и сводок (Мишустин, 1933; Квасников, Сумневич, 1954;
Квасников, 1960; Квасников, Щелокова, 1968, и др.).
Укажем, что первые исследователи в своих работах при выде-
лении молочнокислых бактерий из эпифитной микрофлоры поль-
зовались примитивной методикой. Высев смыва с растений про-
изводили (количественно), как правило, в агаризованные среды
(мясо-пептонный агар, сусло-агар, агар с глюкозой и уксусной
кислотой и др.), в которые добавляли мел или индикатор для
установления образования кислоты бактериями. В последующие
годы методы несколько усовершенствовались. Стали практико-
вать высевы водных смывов в различные обогатительные среды,
приготовленные на растительных отварах, сусло с автолизатом
дрожжей, молоко с лакмусом и т. д. (Stark, Sherman, 1935).
Одни авторы (Sherman, 1916; Hunter, 1921; Weigmann, Wolff,
1922; L5ehnis, 1926; W511er, 1929; Buschmann, Harder, 1931; De-
ger, 1932; A. Cunningham, A. M. Smith, 1939), используя указан-
ные методы, или совсем не находили молочнокислые бактерии на
поверхности различных растений, или обнаруживали их в незна-
чительном количестве — до 102—104 клеток в 1 г растений, обыч-
но листьев.
Другие исследователи (Buschmann, Koch, 1930а, b; Stark,
Sherman, 1935; Allen et al., 1937, и др.) на растениях (овощных,
зерновых, зернобобовых) обнаруживали большее количество мо-
лочнокислых бактерий — до 104—10е клеток па 1 г растительного
материала. Были сделаны сообщения о том, что молочнокислые
бактерии и бактерии группы coli составляют основную микрофло-
ру свежей травы (Allen et al., 1937).
Активное развитие работ по физиологии, биохимии и система-
тике молочнокислых бактерий в последние два десятилетия со-
202
здало предпосылки для разработки новых элективных сред для
выделения из эпифитной микрофлоры кокковых и палочковидных
форм и особенно для углубленного изучения их видового состава.
Но и с применением совершенных методов данные о содержании
молочнокислых бактерий на поверхности растений были принци-
пиально близки к результатам, полученным в ранние периоды
исследований.
Кедди (Keddie, 1951) предложил специальную селективную
среду с твином 80 («твин-агар»), которой широко пользовались
авторы (Stirling, 1953; Kroulik, Burkey, Wiseman, 1955, и др.)
для изолирования молочнокислых бактерий с поверхности расте-
ний. Стирлинг находила незначительное количество молочнокис-
лых бактерий в составе микрофлоры райграсса, тимофеевки, ежи,
овсяницы, клевера, сахарной свеклы и других растений. Позднее
ряд исследователей (Kroulik, Burkey, Gordon et al., 1955; Gibson
et al., 1958; Keddie, 1959) также отметил, что молочнокислые
бактерии на поверхности зеленых растений, в том числе различ-
ных трав, представлены очень слабо. Так, например, Джибсон
и Стирлинг (Gibson, Stirling, 1959) из 5 образцов трав в 4 не обна-
руживали более 25 клеток лактобацилл в 1 г растения и только
в одном случае нашли до 5000 клеток в 1 г сухой травы. Очень
редко авторы выделяли и молочнокислые кокки (роды Streptococ-
cus, Leuconostoc, Pediococcus), в некоторых случаях лишь при
посеве на элективные среды 1 мл неразведенной болтушки.
Однако Ленгстон с соавторами (Langston, Bouma, 1960b; Lang-
ston et al., 1962) отмечают, что им удавалось обнаружить стреп-
тококки на свежей траве в довольно большом количестве, причем
они преобладали на траве первого укоса, а молочнокислые палоч-
ки — в более поздние периоды. В дальнейшем Стирлинг совме-
стно с Виттенбари (Stirling, Whittenbury, 1963) больше всего
молочнокислых бактерий обнаружили на ножках и основаниях
листьев трав, а также на частично засохших и отмирающих
листьях. Они утверждают, что 80% изолированных штаммов пред-
ставлено лейконостоками, 10% — педиококками, а остальные мо-
лочнокислыми палочками. Количество молочнокислых бактерий
резко возрастало на срезанных растениях, лежащих в поле или
собранных для силосования. Авторы считают, что эти бактерии
могут заноситься с хозяйственного инвентаря и механизмов во
время обработки растений перед силосованием. Исследователи по-
лагают, что молочнокислые бактерии обычно не являются частью
нормальной микрофлоры растущего растения.
Незначительное количество молочнокислых бактерий обнару-
живали в эпифитной микрофлоре овса, райграса, красного клеве-
ра и других растений и Нильсоны (G. Nilsson, Р. Е. Nilsson, 1956).
Авторы учитывали молочнокислые бактерии на «твин-агаре» с
томатным соком, сахаром и индикатором, указывающим на обра-
зование кислоты. Они нашли, что общее количество бактерий на
растениях возросло к концу вегетации от 50—200 клеток до
203
2—7 млн. на 1 г сырого материала; возрастало и число грибов
(от 3—17 до 9 тыс. особей). Молочнокислые бактерии им удава-
лось обнаруживать на красном клевере только в первых числах
июля — к началу силосования, а также в конце периода вегета-
ции растений.
Следует отметить, что и в Болгарии Недялков (1958) в эпифит-
ной микрофлоре растений, идущих на силос, также мало находил
молочнокислых бактерий (от 103 до 104 в 1 г растительной массы).
Процент молочнокислых бактерий в эпифитной микрофлоре
овса выше, чем вики (RaSovic, Miskovic, 1970). Больше всего
этих микроорганизмов находили в фазу полного цветения вики и
и налива зерна у овса. На семенах ряда растений (в частности,
отобранных в Италии) редко выявляли молочнокислые бактерии
(Verona, 1960).
Обнаруживали, что видовой состав молочнокислых бактерий
меняется с сезоном, например, в летние месяцы в эпифитной мик-
рофлоре преобладают кокковые, а осенью — палочковидные
формы (Weigmann, Wolff, 1922; Акопян, 1967).
Интересно отметить, что Мандт и Грэхем (Mundt, Graham,
1968) описали новую разновидность — Streptococcus faecium var.
casseliflavus nov var., выделенную из растений и обладающую свой-
ствами Str. faecalis и Str. faecium. Эти стрептококки подвижны,
образуют бледный лимонно-желтый пигмент, сбраживают араби-
нозу, мелибиозу, салицин, но не мелецитозу. Авторы считают эти
бактерии нормальными обитателями растений.
Позднее эти же авторы (Mundt et al., 1969) изучили распро-
странение на растениях и педиококков. 1 г материала они высе-
вали в жидкую среду Рогозы (СЛ) (табл. 6), инкубировали посев
при 45°, после чего делали высев на агар МРС. Отсев выросших
колоний производили в жидкую среду СЛ. Было установлено,
что Pediococcus acidi lactici и Р. pentosaceus встречались в 4%
образцов семян злаков, 6 % —зерен кукурузы, 10 % —кормовых
трав, 2% — свежих овощей, 43—68% — овощей, подготовленных
для переработки. Число педиококков в свежих образцах незначи-
тельно и составляет 10—23 клетки в 1 г материала.
На растениях СССР изучение содержания молочнокислых
бактерий проводили ряд авторов. Укажем на основные из этих ра-
бот в порядке их публикации.
Л. А. Гардер и сотрудники (1935) утверждали, что культур-
ные растения (кормовые), как правило, более обсеменены молоч-
нокислыми бактериями, чем дикие. Эти микроорганизмы занима-
ют незначительное место среди обитающих на растениях других
бактерий. Нужно, однако, отметить тот факт, что указанные ав-
торы обнаруживали в ряде случаев гораздо больше молочнокис-
лых бактерий (на луговых травах и вике их десятки миллионов
клеток в 1 г сырого материала), чем многие последующие иссле-
дователи. Определения видового состава авторы не проводили.
Н. В. Семйгановская е соавторами (1935) в эпифитной микро-
204
флоре фацелии выявили очень незначительное число молочно-
кислых бактерий. К сожалению, при выделении этих бактерий
они пользовались только мясо-пептонным агаром и сусло-агаром
с мелом.
А. А. Зубрилин, Е. Н. Мишустин, В. А. Харченко (1950) отме-
чают, что молочнокислые бактерии в эпифитной микрофлоре со-
держатся в незначительном количестве. На основании обобще-
ния ряда работ они приводят следующие цифры количественно-
го соотношения отдельных представителей эпифитной микрофло-
ры: Bact. herbicola—30—60% от общего числа микроорганизмов
эпифитной микрофлоры; Bact. fluorescens и близкие формы —
40%; группа coli — aerogenes —2%; спорообразующие — 2% ;
остальные, в том числе молочнокислые,— около 10%.
М. М. Макарова (1946, 1955, 1961) на капусте белокочанной и
краснокочанной, а также на клевере обнаружила до 104—105
молочнокислых бактерий в 1 г.
По данным Н. А. Красильникова (1958), молочнокислые па-
лочки иногда обнаруживаются в эпифитной микрофлоре различ-
ных травянистых и древесных растений средней полосы СССР.
Ю. М. Возняковская и Я. П. Худяков (1960), применяя капуст-
ные среды, обогащенные суслом и кукурузным экстрактом, из
некоторых растений выделили молочнокислые бактерии рода La-
ctobacterium. Д. Л. Шамис (1961) утверждал, что на хорошо си-
лосующихся растениях численность и активность молочнокис-
лых бактерий выше, чем на трудносилосующихся.
Используя для выделения и количественного учета молочно-
кислых бактерий среды с гидролизатом молока и мелом, а также
сусло-агар с мелом, Г. Д. Гурьева (1966) в пробах зеленой мас-
сы кукурузы, отавы, трав перед укосом, обнаружила до 50 тыс.
клеток молочнокислых бактерий. Она считает, что количественное
содержание молочнокислых бактерий является показателем све-
жести и доброкачественности корма. Выявлены эти бактерии и на
поверхности семян риса (Кокорина, 1970).
Кроме молочнокислых, на поверхности растений обнаружены
другие микроорганизмы, главным образом аэробные, которые
чаще всего превалируют над молочнокислыми бактериями (Зубри-
лин и др., 1950; Квасников, 1960; Квасников, Щелокова, 1968,
и др.). Так, ряд авторов отмечают наличие в эпифитной микрофло-
ре большого числа пигментообразующих микроорганизмов (Квас-
ников, 1947; Возняковская, Худяков, 1960; Сумневич, 1961;
Kroulik et al., 1955а, b). На растениях (нередко ко времени их
силосования) обнаруживают значительные количества аэробных
коринебактерий; находят грамотрицательные палочки (107—
108/г), в частности, виды рода Pseudomonas, а также виды рода
Bacterium (Зубрилин и др., 1950; Красильников, 1958; Ochi et al.,
.1965 а, Ъ, и др.). Спорообразующих аэробов и анаэробов в эпифит-
ной микрофлоре, как правило, содержится мало (Зубрилин и др.,
1950; Gibson et al., 1958, и др.).
205
Установлено, что значительное место среди различных групп
микроорганизмов в эпифитной микрофлоре занимают дрожжи,
особенно пигментные и слизеобразующие (роды Sporobolomyces,
Rhodotorula, Torulopsis, Hanseniaspora, Candida, Cryptococcus,
Pullularia, Trichosporon, Oospora (Квасников, Сумневич, 1953,
1954; Квасников, Щелокова, 1968; Квасников, Щелокова, Нагор-
на, 1971; Нагорна, 1972, и др.). Сведения о распространении плес-
невых грибов на поверхности растений весьма ограниченны. Име-
ется указания (Kroulik et al., 1955b; Nilsson, Nilsson, 1956), что
количество их увеличивается по мере созревания растений.
Следует также указать, что многие исследователи отмечают
общее возрастание количества микроорганизмов на поверхности
растений с созреванием их, и что эпифитная микрофлора куль-
турных растений, как правило, более богата по видовому соста-
ву, чем дикорастущих.
Влияние экологических факторов на распространение молоч-
нокислых бактерий в эпифитной микрофлоре изучено недоста-
точно, а имеющиеся по этому вопросу данные часто разноречивы.
Выше мы останавливались на обзоре отдельных работ.
В течение ряда лет нами проводились исследования количе-
ственного и видового состава молочнокислых бактерий в эпифит-
ной микрофлоре многих культурных и дикорастущих растений,
произрастающих в некоторых эколого-географических районах
СССР. Особое внимание уделяли количественному содержанию
этой группы микроорганизмов в зависимости от различных фак-
торов, в частности, вида и фазы развития растений, экологиче-
ских условий и т. д.
Растения отбирали в стерильные широкогорлые колбы, кото-
рые доставляли в лабораторию, и в них немедленно определяли
содержание молочнокислых бактерий по нашему методу, а так-
же другими методами, описанными выше. Все основные исследо-
вания были проведены в десятикратной повторности.
Культурные и дикорастущие растения
Средней Азии
Содержание молочнокислых бактерий в эпифитной микрофлоре
растений Средней Азии по нашим данным (Квасников, Сумневич,
1953, 1954; Квасников, 1960) в известной степени определяется ви-
дом растений. Как правило, культурные растения (кукуруза, свек-
ла, капуста, люцерна и др.) более обсеменены ими, чем дикорасту-
щие (камыш, осока, полынь, тугайные травы и т. д.). Существен-
ное влияние на эпифитные молочнокислые бактерии оказывает
место произрастания растений. При анализе одних и тех же рас-
тений, взятых в Ташкентском оазисе в приусадебных участках и
на расстоянии 0,5—3,0 км от жилья, а также вдали от поселков и
проезжих дорог, было установлено, что максимальное количество
молочнокислых бактерий содержится вблизи населенных пунктов.
206
С удалением от жилья количество молочнокислых бактерий на ра-
стениях падает (табл. 41).
Приведенный материал иллюстрирует влияние человека на
распространение микроорганизмов в природе. Жилье человека
является фактором, содействующим в настоящее время опреде-
Таблица 41
Количество молочнокислых бактерий в эпифитной микрофлоре растений
Ташкентского оазиса в зависимости от места произрастания (1951)
Количество бактерий на 1 г растений
Растение Дата сбора в усадьбах на расстоя- нии 0,5—3,0 км от жилья вдали от по- селков и про- езжих дорог
Кукуруза Люцерна Хлопчатник Джугара Дыня Тыква Сахарная свекла Картофель Капуста Тал Тополь Вишня Клен Орех грецкий Тростник (Phragmites communis) BHTaKj(Alhagi sparsifolia) Осока (Carex nutans) Репейник (Arctium ma- jus) Полынь (Artemisia absin- thium) Пальчатка (Cynodon dac- tilon) Щирица (Amaranthus re- troflexus) Синяк (Echium italicum) Солодка (Glycyrrhiza glabra) 28.VIII 15.IV 23.IX 18.XI 25.VII 23.IX 23.IX 25.VII 20.IX 18.VII 15.IV 18.IV 20.IV 20.IV 29.IV 14.1 20. IV 29.V1 18.IV 29.1V 28.Ill 29.VI 28.11 14.1 15.VII 15.IX 15.IX 5.IX 17.IV 18.IV 105 102 102 1 10* 102 102 102 IO2 10е 10 1 0,1 102 102 0,1 102 103 10 105 1 102 Не найдено 10 10 10 1 0,1 10 102 Не Не Не Не 102 1 10 0.1 102 1 10 102 10 105 0,1 0,1 найдено 1 10 найдено 10 10 1 10* 0,1 102 найдено » 10 0,1 найдено » 0,1 ОД Не Не Не Не 102 10 0,1 1 1 1 1 0,1 0,1 1 найдено 10 найдено » 10 0,1 ОД найдено » 0,1 найдено 1 0,1
207
ленному сосредоточению флоры молочнокислых бактерий. По-
добный вывод был сделан позднее и Мандтом с сотрудниками
(Mundt et al., 1958), показавшими, что молочнокислые бактерии
^главным образом, близкие к Str. faecalis) изолируются из 62%
образцов растений и окультуренных почв и только из 22% образ-
цов, взятых в районах, удаленных от жилья. Авторы предпола-
гают, что фекальные стрептококки в таком случае попадают на
растения с испражнениями животных и человека.
Существенное влияние на содержание молочнокислых бакте-
рий в эпифитной микрофлоре оказывают эколого-географические
условия. На растениях пустынь и полупустынь (Каракумы, Кы-
зылкумы, Ташаузская область Кара-Калпакской АССР и др.)
молочнокислые бактерии или вовсе не обнаруживались, или вы-
являлись их единичные клетки на 1 г растения.
На растениях, взятых в горах (заповедник Кандара Акаде-
мии наук Таджикской ССР) на высоте 1—2 км над ур. м., уда-
лось обнаружить до десяти клеток на 1 г. Интересно отметить,
что они выявлялись и в тех местах, которые по своему положе-
нию были полностью недоступны для выпаса скота. Здесь молоч-
нокислые бактерии мы обнаруживали в эпифитной микрофлоре
не только цветковых растений, но и мхов и лишайников.
На растениях исследуемые бактерии в максимальном коли-
честве содержатся в теплое время года, причем ранней весной
их обычно меньше, чем в начале лета; осенью количество их
несколько снижается и резко падает зимой (табл. 42).
На кукурузе молочнокислые бактерии содержатся во все фазы
ее развития. Их больше в фазу цветения и молочновосковой
спелости. Сосредоточиваются эти бактерии как на верхних, так
и на нижних листьях и на початках; меньше всего их на султа-
не. На цветках различных культурных растений нам обычно уда-
валось обнаруживать от единиц до тысяч клеток молочнокислых
бактерий в 1 г.
На неповрежденных гроздьях зрелого винограда эти бактерии
выявляются в весьма незначительном количестве (до единиц
клеток в пересчете на одну ягоду) или вовсе не обнаруживают-
ся. На поврежденных и испорченных ягодах их больше (иногда
тысячи и миллионы). Аналогичные данные были получены при
исследовании яблок и других плодов, идущих на переработку на
винодельческие заводы. Содержатся молочнокислые бактерии и
на зернах злаков.
Определение видового состава молочнокислых бактерий, выде-
ленных из эпифитной микрофлоры, показало, что среди кокко-
вых форм на поверхности растений преобладает Streptococcus
lactis, выделяется также Str. cremoris и, преимущественно на по-
ливных участках, Str. faecalis и Str. faecalis var. liquefaciens.
На растениях, взятых в самых различных местностях, в большем
количестве содержатся Lactobacillus plantarum, иногда выделяют-
ся L. brevis и L. fermenti. Н'а надземных частях растений среди
208
Таблица 42
Содержание молочнокислых бактерий в эпифитной микрофлоре растений
Средней Азии е зависимости от времени года (1951 г.)
Растение Место сбора (Ташкентская обл., Орджо- никидзевский Р-н) Количество бактерий на 1 г растений
весной летом осенью зимой
1.Ш-1.VI 1.VI-1.IX 1.IX- 1.XII 1.XII- 1.Ш
Кукуруза Пос. Майское 10 105 103 1
Люцерна Пос. Луна- чарское 1 10‘ 102 0,1
Свекла столовая » 103 10s Ю2 Не найдено
Свекла сахарная » 102 103 103 1
Картофель » 102 102 10 —
Капуста » 102 105 103 10
Дыня » Не найдено 102 1 0,1
Хлопчатник » » 103 102 1
» » 10 Не найдено 1 1
Вишня » 0,1 10 Не найдено Не найдено
Яблоня » 10 10 0,1 »
Тростник (Phragmites communis) » 102 103 0,1 0,1
Янтак (Alhagi sparsifolia) Пос. Майскоь 102 103 10 0,1
Осока (Carex'nutans) » 102 102 10 1
Полынь (Artemisia absin- thium) » 102 10 1 Не найдено
Тугайные травы » 1 10 Не' найдено »
молочнокислых бактерий палочки обычно преобладают над кок-
ками.
Выделенные из эпифитной микрофлоры различных растений
молочнокислые бактерии (около 700 штаммов) в процессе работы
исследовались в направлении выявления их кислотообразующей
способности. Для этого они непосредственно после изолирования
высевались в сахарсодержащие среды (люцерновую среду или
солодовое сусло с 10% сахара), которые затем выдерживались в
термостате при 25° в течение 10 суток. Периодически в среде
производилось определение общей титруемой кислотности и лету-
чих кислот по Матье.
Исследования показали, что по активности кислотообразования
молочнокислые бактерии эпифитной микрофлоры весьма варьиру-
ют. В значительном количестве здесь сосредоточиваются малоак-
тивные штаммы (накапливающие кислот до 30—60° по Тернеру),
209
однако содержатся в ней и более энергичные кислотообразователи
(дающие 60—100° и более).
Меньшее количество кислот образуют кокки, более активны па-
лочки. Нам удавалось выделять и штаммы, обладающие совершен-
но исключительной способностью кислотонакопления. Так, были
изолированы несколько штаммов L. plantarum и L. buchneri, обра-
зовавшие 200—400° кислоты по Тернеру и один даже до 500°.
Гетероферментативные молочнокислые бактерии на растениях
преобладали над гомоферментативными.
Исследование соотношения молочнокислых бактерий с другими
микроорганизмами в эпифитной микрофлоре производилось нами
по обычной методике почвенных микробиологических исследова-
ний. Определялось содержание основных физиологических групп
и некоторых видов микроорганизмов.
На растениях в основном обнаруживаются одни и те же группы
микроорганизмов, причем растения, произрастающие на поливных
землях, значительно более обсеменены ими, чем богарные. В эпи-
фитной микрофлоре преобладают аэробные формы. На всех расте-
ниях главным образом обитают аммонифицирующие бактерии;
много бактерий группы кишечной палочки, однако типичные
Escherichia coli выявляются только на поливных почвах и к тому
же исключительно редко. Из ряда растений высеваются бактерии,
разлагающие клетчатку в аэробных условиях.
Типичный азотобактер нами ни разу не был обнаружен. При
высеве на среду Виноградского для нитрифицирующих бактерий
и среду Гильтая для денитрификаторов также вырастает значитель-
ное количество микроорганизмов. Анаэробные бактерии на расте-
ниях обнаруживаются в значительно меньших количествах. Среди
них почти всегда выявляются маслянокислые бациллы, в частно-
сти, вызывающие разложение пектиновых веществ. Типичный
Clostridium pasteurianum почти никогда не встречается. Бактерии,
разлагающие клетчатку в анаэробных условиях, на поверхности
растений находятся чрезвычайно редко.
Интересно отметить нахождение в эпифитной микрофлоре
большого количества бактерий, образующих хромофорные пигмен-
ты. Эти пигменты, содержащие каротиноиды, играют существенную
роль в предохранении клеток от губительного действия ультра-
фиолетовых лучей (Имшенецкий, 1946; Квасников, 1947).
Дрожжи содержатся в эпифитной микрофлоре культурных ра-
стений и нередко в значительном количестве. На богарных расте-
ниях их обычно мало. Среди дрожжей в относительно большем коли-
честве встречаются формы с преобладанием аэробного типа дыхания
и тенденцией к обитанию на поверхности субстратов, в частности,
пленчатые дрожжи (около 40%). Эти формы обладают большей
резистентностью к солнечной радиации, чем виды с преобладанием
анаэробного типа дыхания, что является приспособительным приз-
наком (Квасников, 1947).
С поверхности растений удавалось изолировать несколько видов
21П
дрожжей, относящихся к родам Saccharomyces, Zigosaccharomyces,
Debaryomyces, Hanseniaspora, Torulopsis, Pichia, Hansenula. С ра-
стений высевается большое количество плесневых грибов. При
этом на богарных растениях их даже несколько больше, чем на
поливных.
Микрофлора растений, произрастающих в пустынях и полупу-
стынях, особенно бедна. Так, летом в Ленинабадском районе Таша-
узской области на янтаке (Alhagi sparsifolia) и итсигеке (Anabasis
aphylla), растущих на такырных почвах, мы находили лишь десят-
ки и сотни клеток микроорганизмов на 1 г листьев.
Дальнейшие работы по изучению эпифитной микрофлоры ра-
стений Средней Азии были проведены в нашей лаборатории
М. Г. Сумневич (1961). Исследования показали, что с поверхности
местных растений выделяются преимущественно представители ро-
дов Micrococcus, Chromobacterium, Bacterium, Sarcina, Bacillus.
Состав эпифитных микроорганизмов в известных пределах из-
меняется в зависимости от фазы развития растений. Наибольшее
количество микроорганизмов находится па растениях в периоды,
близкие к цветению: у одних растений — в период бутонизации
(янтак), у других — во время цветения (люцерна) и начальной
фазы созревания (кукуруза). В эти же фазы обычно в максималь-
ном количестве развиваются и молочнокислые бактерии. В конце
вегетации на всех растениях количество микроорганизмов обычно
уменьшается.
Создается впечатление, что типичные эпифитные микроорганиз-
мы в основном подчиняются тем же закономерностям изменения по
фазам развития растений, что и типичные микроорганизмы ризо-
сферы; содержание их на растениях обычно достигает максимума
в периоды, близкие к цветению, и падает в конце вегетации. Не-
типичные же микроорганизмы этой закономерности не подчиня-
ются. Они иногда в максимальном количестве содержатся в конце
вегетации.
Выло проведено также изучение локализации эпифитных мик-
роорганизмов на поверхности листовой пластинки. С этой целью
применялись два способа. По способу «отпечатков» на поверхность
элективных агаризованных питательных сред в чашках Петри
накладывался лист и тщательно притирался шпателем Дригаль-
ского, после чего лист снимался.
При анализе микрофлоры по способу «нативной культуры» на
поверхность листа каплями наносился слой элективной агаризован-
ной среды. Производились наблюдения за ростом колоний микро-
организмов, образующихся на элективных средах, и их располо-
жением. С помощью этих приемов было установлено, что типич-
ные эпифитные микроорганизмы, в том числе и молочнокислые
бактерии, располагаются преимущественно по краям листовой
пластинки, причем на верхнем эпидермисе их содержится значи-
тельно больше, чем на нижнем. Видовой же состав микроорганиз-
мов на верхнем и нижнем эпидермисе близок.
211
Растения некоторых областей Украинской ССР
При исследовании растений Украинской ССР (Нестеренко,
1963а, б, в, 1964, 1966) было обнаружено, что содержание молочно-
кислых бактерий зависит от метеорологических условий. Так, на
листьях кукурузы в засушливое лето 1961 г. мы находили очень
незначительное количество молочнокислых бактерий (от единиц
до сотен клеток на 1 г листьев). То же наблюдалось в холодные,
дождливые месяцы лета 1962 г. Однако в июле — начале августа
1962 г. в фазу цветения кукурузы, когда после периода дождей
наступила теплая солнечная погода, мы почти во всех пробах об-
наруживали от сотен тысяч до миллионов клеток молочнокислых
бактерий. Возрастание числа микроорганизмов в это же время на-
блюдали и на листьях картофеля (10е), капусты (105), гороха
(106), фасоли (10°), подсолнечника (103), ряда древесных и ку-
старниковых пород (102—105).
В летние засушливые месяцы 1961 г. очень мало молочнокис-
лых бактерий находили и на клевере и люпине. На них только в
период цветения отмечали до сотен клеток в 1 г растения.
Водные дикорастущие растения, обитающие на затопленных и
высохших участках, так же как и культурные, весьма слабо обсе-
менены молочнокислыми бактериями в засушливые, жаркие или
очень дождливые и холодные летние месяцы. В единичных случа-
ях мы находили до десятка тысяч их на тростнике заливного луга.
Однако интересно отметить, что на тростнике и травах выпасных и
невыпасных лугов удавалось почти всегда обнаруживать до десят-
ка миллионов клеток молочнокислых бактерий в солнечную, теп-
лую погоду после дождей в конце июля 1962 г., тогда же возраста-
ние их числа наблюдали и на культурных растениях.
Соотношение молочнокислых бактерий с иными группами мик-
роорганизмов в эпифитной микрофлоре подчиняется закономерно-
стям, которые были установлены при изучении микрофлоры расте-
ний в Средней Азии (Квасников, 1960). Так, на поверхности
растений преобладали аммонифицирующие бактерии. Кишечная
палочка и азотобактер почти не выявлялись. Иногда обнаружива-
ли анаэробные микроорганизмы (десятки — сотни клеток на 1 г
растений). Много бактерий выделялось нами на безазотистой
среде Эшби (особенно с водных растений); отмечено и значитель-
ное число пигментообразующих форм.
Видовой состав молочнокислых бактерий, обнаруженных в
эпифитной микрофлоре растений Украины, довольно разнообра-
зен. Среди них преобладают кокковые формы, близкие к предста-
вителям родов Leuconostoc, а также Streptococcus. Среди молочно-
кислых палочек больше всего обнаружено гомоферментативных
видов, близких к Lactobacillus plantarum.
Гомоферментативные кокки представлены видами Str. lactis,
Str. lactis var. diacetilactis, образующими значительное количест-
во ацетоина при использовании лимоннокислого натрия, и груп-
па
пой энтерококков. Следует указать, что Л. Луковникова (1960) так-
же неоднократно выделяла из растений молочные стрептококки,
например Str. diacetilactis, продуцирующие диацетил. Эти штам-
мы автор использовала в заквасках при производстве масла; они
стойко сохраняли способность образовывать достаточное количест-
во диацетила. Растения, таким образом, можно считать источни-
ком, где следует проводить поиски стрептококков, обладающих
производственно-ценными свойствами.
Гетероферментативные кокки рода Leuconostoc, выделен-
ные с поверхности растений, мы отнесли к видам Leuc. mesentero-
ides и Leuc. dextranicum. Изолированные из эпифитной микро-
флоры лактобациллы причислили к трем видам — L. plantarum,
L. casei (с разновидностями L. casei var. rhamnosus и L. casei var.
casei) и L. brevis.
Известно, что лимонная и яблочная кислоты принадлежат к
числу наиболее распространенных у многих высших растений.
По данным некоторых авторов (Hirst, Ramstad, 1957; MacPherson
et al., 1957), из органических кислот, встречающихся в заметных
количествах в травах, только лимонная и яблочная исчезают в
процессе силосования этих трав. Вероятно, молочнокислые бакте-
рии.играют при этом известную роль.
У эпифитных штаммов L. plantarum мы изучили способность
использовать в качестве источников углерода лимонную и яблоч-
ную кислоты. Оказалось, что все они сбраживают яблочную кисло-
ту с образованием газа. Большинство образует газ и из лимонной
кислоты, что свидетельствует против использования этого призна-
ка для дифференциации L. casei и L. plantarum (Gibson, Abd-el-Ma-
lek, 1945; Rogosa, Sharpe, 1959, и др.).
Результаты, полученные нами при исследовании количествен-
ного и видового состава молочнокислых бактерий, были в дальней-
шем подтверждены и другими авторами. Так, Я. И. Клаар (1961)
установил зависимость распространения молочнокислых бактерий
от фазы развития растений; их больше в фазах цветения и обра-
зования репродуктивных органов (104—105 клеток в 1 г расте-
ния) . Ни на одном из обследованных растений молочнокислые бак-
терии не преобладали в составе эпифитной микрофлоры. На расте-
ниях автор находил Lactobacterium plantarum, L. breve, L. fer-
mentii, Streptococcus mesenteroides.
Водные растения
Интересно отметить, что нам также удавалось выделять молочно-
кислые бактерии с поверхности водных растений, взятых из пру-
дов, рек, озер, например горного озера Иссык-Куль; находили мы
их и на поверхности водорослей (Квасников, 1960; Сиренко и др.,
1966) (табл. 43). Так, в скоплениях живых синезеленых водорос-
лей Microcystis aeruginosa обнаруживали молочнокислые бактерии,
вызывающие как гомо-, так и гетероферментативное брожение.
213
Были выделены гомоферментативные кокки Str. lactis, образую-
щие кислоты при использовании глюкозы до 48° Т, а при сква-
шивании молока — до 80° Т. Гетероферментативные кокки, пред-
ставленные видом Leuc. mesenteroides, продуцировали из углево-
дов, кроме молочной кислоты, и летучие органические кислоты.
Таблица 43
Содержание молочнокислых бактерий на водорослях, растущих в оросителях
и чеках рисовых полей на лугово-болотной почве Узбекской рисовой
опытной станции (1958 г.)
Водоросль Место исследования Дата Содержание бактерий в 1 г
воздушно-сухих водорослей ВОДЫ
смыв растертая ткань
Spirogira sp. Ороситель 5.IV 5-10» 5-105 102
Chara foetida (вода из Чирчика) 10.V 3,3103 1,3.10е Не найдено
Рисовый чек 20.VI 1,5-10е 105 102
Oscillatoria sp. Ороситель 10.V 10’ 4-101 103
Рисовый чек 20.VI 10» IO® Ю2
То же 12.VIII 6-103 Не найдено 10
» 12.VIII —. 3-105 10
» 26.IX — 2,4-10* 10
Из бродящей массы водорослей, представленных, в основном,
Aphanizomenon flos-aquae и собранных на Кременчугском водо-
хранилище (1965), мы изолировали L. plantarum, образующие до
100° Т молочной кислоты в капустном бульоне с глюкозой и до
140° Т в молоке. L. plantarum удавалось выделять также из молодых
скоплений синезеленых водорослей и воды, взятой вблизи этих
скоплений. Были выделены нами молочнокислые бактерии и с раз-
личных растений Черного моря.
Обобщая результаты личных исследований и литературные дан-
ные, можно считать, что эпифитная микрофлора представлена сле-
дующими видами молочнокислых бактерий и других групп микро-
организмов (табл. 44).
Природа взаимоотношений
эпифитных молочнокислых бактерий с растением
и другими обитающими на нем микроорганизмами
Молочнокислые бактерии на растениях, очевидно, находят для себя
определенные условия, способствующие их развитию. В этом пла-
не интерес представляют данные Виттенбари (Whittenbury, 1964,
1966). Автор из трав изолировал молочнокислые бактерии, расту-
щие в аэробных условиях (близкие к Leuc. mesenteroides), кото-
214
Таблица 44
Видовой состав бактерий эпифитной микрофлоры
Вид
Растение
Автор
Streptococcus lactis
Str. lactis var. diacetilactis
Bacterium delbrucki
Lactobacillus plantarum
L. casei var. rhamnosus, L. ca-
sei var. casei
L. brevis
Leuconostoc mesenteroides
Leuc. dextranicum
Pediococcus acldi lactici.P. pe-
ntosaceus
Streptococcus faecium var.
casseliflavus
Str. faecalis var. liquefaciens,
Str. faecalis и др. энтерококки
Pseudomonas herbicola (В.
herbicola)
Ps. herbicola aureum
Ps. liqulda, Mycobacterium
citreum
Micrococcus sulfureus, M. cin-
nabareus, M. albus, M. chlo-
rlnus
M. rubens, Sarcina lutea
Bacillus mesentericus, Вас.
megaterlum
Вас. subtills
Вас. idosus, Вас. brevis, Вас.
mycoldes, Вас. tenuisslmus
Вас. pumilis, Вас. circulans,
Вас. Ilcheniformls
Clostridium butyricum, Cl,
bifermentans, Cl. welchll (Cl.
perfringens)
Cl. pasteurianum
Cl. propionlcum
Кукуруза, подсолнечник,
красный клевер, одуванчик,
капуста (головки), салат, го-
рох (листья, стручки), пше-
ница (зерна), люпин, карто-
фель (листья), фасоль (ли-
стья), яблоня (листья), поле-
вые ягоды, яблоки, полевые
травы, синезеленые водорос-
ли (Microcystis aeruginosa)
Тростник, малина (листья)’
полевые ягоды, яблоки, ка"
пуста, полевые травы
Кукуруза, подсолнечник
Кукуруза, подсолнечник,
люпин, озимая пшеница (ко-
лосья), тростник, горох (ли-
стья), синезеленые водоросли
(Aphanizomenon flos-aquae),
кормовые травы
Кукуруза, ежа сборная, лю-
церна
Кукуруза, подсолнечник,
луговые травы, люцерна
Сахарный тростник, куку-
руза, бобовые, подсолнечник,
капуста, ежа сборная, люцер-
на, сине-зеленые водоросли
(Microcystis aeruginosa) _
Горох, фасоль'(листья)
Семена злаков, зерна куку-
рузы, кормовые травы, овощи
Зерновые, бобовые, травы,
спелый виноград, плоды и
листья овощей
Бобы, кукуруза, рис, капу-
ста, зерна ячменя, картофель
(листья), луговые травы,
люцерна
Кукуруза, трава
Кукуруза, люцерна
Кукуруза
Кукуруза, люцерна, янтак
Люцерна, янтак
Кукуруза, люцерна
То же и трава
Люцерна
Трава
»
Люцерна
Трава
Buschmann, Koch, 1930а; Бе-
ger, 1932; Stark, Sherman, 1935;
Квасаиков, 1960; Луковни-
кова, 1960; Нестеренко, 1964.
Луковникова, 1960; Несте-
ренко, 1964
Buschmann, Koch, 1930а ’”Т
Buschmann, Koch, 1930а; La-
ngston, Bouma, 1960,а, b; Ху-
дяков, Возняковская, 1956;
Квасников, 1960; Клаар, 1961;
Нестеренко, 1964
Langston, Bouma, 1960а, Ь;
Нестеренко, 1964
Langston, Bouma, 1960а, b;
Клаар, 1961; Нестеренко, 1964.
Mayeux, Coltner, 196'); Lang-
ston, Bouma, 1960а, b; Клаар,
1961; Нестеренко, 1964
Нестеренко, 1964
Langston, Bouma, 1960b;
Mundt et al., 1969
Mundt, Graham, 1968
Mundt et al., 1958, 1962; Lan-
gston, Bouma, 1960a, b; Stark,
1970; Нестеренко, 1964
Gibson et al., 1958; Васильева,
1959
Сумневич, 1961
Васильева, 1959
Сумневич, 1961
Сумневич, 1961
Сумневич, 1961
Gibson et al., 1958; Сумневич,
1961
Сумневич, 1961
Gibson et al., 1958
Gibson et al., 1958
Сумневич, 1961
Johns, 1952
215
рыв, как он полагает, способны усваивать субстраты, выделяемые
отмирающими тканями растений. Эти микроорганизмы в присут-
ствии экстрактов из листьев трав образовывали каталазу и расще-
пляли Н2О2. Обоснованно предположение Виттенбари о том, что
каталаза, очевидно, продуцируется бактериями в присутствии же-
лезо-порфирина, имеющегося в соке листьев. Это позволяет опре-
деленным видам молочнокислых бактерий размножаться на расте-
ниях, не подвергаясь губительному действию перекиси водорода,
продуцируемой ими.
По мнению ряда исследователей, некоторые виды молочнокис-
лых бактерий можно рассматривать в качестве типичных эпифи-
тных микроорганизмов. Мандт с соавторами (Mundt et al., 1958),
например, таким видом считают Str. faecalis, обитающий на опреде-
ленных растениях (главным образом, бобовых). Доказательством
того, что энтерококки обнаруживаются на растениях не вследствие
попадания их туда с фекалиями животных, служит, как считают
авторы, тот факт, что во многих растительных пробах обнаружива-
ли энтерококки, но не находили обычных обитателей кишечника
(Esch, colt и др.).
Мандт и сотрудники (Mundt et al., 1962) изучали размножение
Str. faecalis var. liquefaciens на надземных частях бобов, кукурузы,
риса, капусты после обработки семян этих растений определенны-
ми штаммами этого вида. В результате было установлено, что мик-
роорганизмы с семян переходят на надземные части растений и
там размножаются, а это, по мнению авторов, свидетельствует о
том, что Str. faecalis является эпифитом. Типичным представителем
эпифитной микрофлоры рассматривают некоторые исследователи
и Str. lactis (Stark, Sherman, 1935; Sherman, 1955).
Орла-Иенсен (Orla-Jensen, 1942) отмечал потерю способности
многими штаммами Str. lactis сквашивать молоко после культиви-
рования их на искусственных средах в лаборатории. Это же наблю-
дали и другие авторы в случаях спонтанных мутаций Str. lactis,
Str. cremoris и Str. diacetilactis, в результате которых стрептококки
не сбраживали лактозу и не коагулировали молоко (Mckay et al.,
1972). Указанная особенность, а также то, что многие штаммы
Str. lactis предпочитают мальтозу лактозе, дает возможность, по
мнению Орла-Иенсена, предположить, что молоко не является ес-
тественным субстратом обитания исследуемых штаммов.
Некоторые авторы придерживаются другой точки зрения. Де-
гер (Deger, 1932) считал, что растения не могут быть естествен-
ным резервуаром нахождения данного вида. Гирш (Hirsch, 1952)
полагал, что Str. lactis — эволюционно молодой организм, а «молоко
становится или уже стало истинным экологическим источником
молочнокислых стрептококков». По мнению автора, тот факт, что
молочнокислые стрептококки не всегда обнаруживаются на расте-
ниях, говорит о том, что не растения являются их естественной
средой обитания. В молоке же Str. lactis обнаруживается всегда в
большом количестве.
216
С целью выяснения вопроса, насколько молочнокислые бакте-
рии обладают способностью размножаться на надземной части рас-
тений, т. е. являются ли они типичными представителями эпифит-
ной микрофлоры, в нашей лаборатории М. Г. Сумневич была пос-
тавлена серия опытов. Семена растений стерилизовались одним из
принятых способов (концентрированной серной кислотой, раство-
ром сулемы и т. д.) и тщательно промывались стерильной водой.
Доза и экспозиция, достаточные для стерилизации семян каждого
из растений, устанавливались предварительными опытами. Затем
семена бактеризовали суспензией молочнокислых бактерий и вы-
ращивались в песке, пропитанном раствором Гельригеля, в сосу-
дах при стерильных условиях. В момент высева семян в контроль-
ной порции проверяли количество микробных тел, попавших на
поверхность одного семени. В другом варианте опытов аналогич-
ным образом бактеризовали не семена, а проростки.
Опыты проводили с кукурузой ВИР 37 и люцерной арабской.
Каждое растение обрабатывали шестью штаммами Str. lactis и та-
ким же количеством штаммов L. plantarum. Все растения выращи-
вали при 20—24°. Через определенные промежутки времени (обы-
чно через 15—20 суток) надземную часть растений срезали и на
ней по нашему методу определяли содержание молочнокислых
бактерий. Повторность опытов была не ниже пятикратной.
Подсчет количества бактерий показал, что не все штаммы мо-
лочнокислых бактерий обладают способностью активно размно-
жаться на надземных частях растений. Отчетливо выраженное
размножение при бактеризации семян люцерны было установлено
у двух штаммов Str. lactis (один из них был выделен из прикорне-
вой зоны люцерны, второй — из эпифитной микрофлоры). Эти же
штаммы и дополнительно один штамм, выделенный из эпифитной
микрофлоры, хорошо размножались при бактеризации проростков.
В этих опытах при нанесении на поверхность семян и проро-
стков десятков и сотен тысяч клеток молочнокислых бактерий по-
следние были обнаружены на надземной части растений в количе-
стве от миллионов до сотен миллионов. Близкие результаты были
получены и с кукурузой.
Штаммы L. plantarum обладали такой же или даже несколько
большей по сравнению со Str. lactis способностью к размножению
на поверхности растений.
Способность некоторых штаммов молочнокислых бактерий раз-
множаться на поверхности растений была показана и в опытах
при выращивании в почве бактеризованных ими семян.
Немногочисленность молочнокислых бактерий в эпифитной
микрофлоре, по мнению отдельных исследователей (G. Nilsson,
Р. Е. Nilsson, 1956), объясняется тем, что некоторые группы бакте-
рий продуцируют антибиотические вещества, активные против
молочнокислых бактерий. С другой стороны, как полагает Ст. Не-
дялков (1958), и молочнокислые бактерии образуют «ингибитор-
ные вещества», оказывающие бактериостатическое и бактерици-
217
дное действие на протеолитические бактерии и группу coli — aero-
genes. Однако мы считаем, что роль этих факторов в
регулировании состава эпифитной микрофлоры, при нахождении
молочнокислых бактерий на поверхности листьев в условиях рез-
ко заторможенного метаболизма, сомнительна.
Таким образом, на основании личных исследований (проведен-
ных на Украине и в Средней Азии) и анализа литературных дан-
ных отечественных и зарубежных авторов (Болгария, ГДР, Ита-
лия, Англия, США и др.) мы приходим к выводам, что на
поверхности различных растений обитает сравнительно небольшое
количество молочнокислых бактерий (как правило, не свыше со-
тен и десятков тысяч, редко миллионов клеток в 1 г).
Содержание молочнокислых бактерий в эпифитной микрофлоре
варьирует в широких пределах в зависимости от ряда факторов,
в частности вида растения, фазы его развития, места произраста-
ния, сезона года, количества осадков.
Молочнокислые бактерии в относительно больших количествах
содержатся в эпифитной микрофлоре культурных растений. Дико-
растущие растения вдали от населенных пунктов бедны ими.
Повсеместно молочнокислые бактерии в большем количестве
обнаруживаются в эпифитной микрофлоре в сезоны, характеризу-
ющиеся влажной теплой погодой; однако после длительных и
сильных дождей их на растениях меньше.
На растениях пустынь и полупустынь Средней Азии молочно-
кислые бактерии обычно не обнаруживаются. Незначительное ко-
личество их на произрастающих здесь растениях объясняется гу-
бительным действием инсоляции и сухости воздуха.
Содержание молочнокислых бактерий возрастает на большин-
стве культурных и дикорастущих растений к моменту цветения
или образования на них репродуктивных органов.
В относительно значительном количестве молочнокислые бак-
терии сосредотачиваются в эпифитной микрофлоре водорослей
пресных и соленых водных бассейнов.
На исследованных растениях нами обнаружены Str. lactis, Str.
cremoris, Str. lactis var. diacetilactis, Str. faecalis, Leuc. mesenteroides,
Leuc. dextranicum, L. plantarum, L. brevis, L. casei, L. buchneri,
L. fermenti.
Молочнокислые бактерии, выделенные из эпифитной микро-
флоры, очень варьируют по своей биохимической активности. На-
ряду со слабыми кислотообразователями выделяются, хотя и ред-
ко, штаммы с высокой способностью накопления кислот.
Природа взаимоотношений молочнокислых бактерий с расте-
ниями окончательно не выяснена. Ряд видов этих бактерий (Str.
faecalis, Str. lactis, L. plantarum) можно отнести к типичным пред-
ставителям эпифитной микрофлоры. Прямыми лабораторными опы-
218
тами нами показано, что штаммы некоторых видов бактерий (Str.
lactis и L. plantarum) обладают способностью переходить с бакте-
ризованных ими семян на надземную часть растений и там размно-
жаться.
Молочнокислые бактерии в эпифитной микрофлоре растений,
произрастающих во всех эколого-географических районах, не зани-
мают доминирующего положения и над ними суммарно превали-
руют другие группы микроорганизмов. Это особенно резко наблю-
дается на дикорастущих и пустынных растениях.
В целом состав микроорганизмов, обитающих на надземных ча-
стях растений, определяется специфическими условиями среды оби-
тания и носит отпечаток влияния обсемененности их почвенной
микрофлорой. Поэтому наряду с типичными эпифитными микро-
организмами здесь содержатся и формы почвенных микроорганиз-
мов. В районах с субтропическим континентальным климатом дли-
тельное отсутствие осадков приводит к скоплению пыли на поверх-
ности растений и большому сосредоточению здесь некоторых поч-
венных микроорганизмов (в частности, аммонифицирующих бак-
терий, особенно споровых, нитрифицирующих, маслянокислых
и др.).
ПОЧВА И РИЗОСФЕРА РАСТЕНИЙ
Почва и ризосфера растений как среда обитания молочнокислых
бактерий систематически никем не исследовались. О нахождении
молочнокислых бактерий в почве имеются лишь отрывочные све-
дения у отдельных авторов, которые интересовались этим вопро-
сом в связи с изучением источников происхождения молочнокис-
лых бактерий в молоке и молочных продуктах.
Вейгман и Вольф (Weigmann, Wolff, 1922) не смогли выде-
лить типичных молочнокислых бактерий из почвы. Авторы ут-
верждают, что эти бактерии в почве или совершенно не содержат-
ся, или имеются в крайне незначительных количествах. Гюттигу
(Huttig, 1927) удавалось находить в почве молочнокислые бакте-
рии (Bact. acidi lactici Hiippe), которые образовывали много кис-
лот и газ из лактозы и придавали молоку горький вкус. Кислото-
образующие кокки выделялись реже, они накапливали мало кис-
лот (0,5%) и делали молоко тягучим. Все эти бактерии почвы
расценивались автором как вредные для молочного хозяйства.
Только в редких случаях из почв, взятых вблизи жилья, компоста
и навоза, Гюттигу удавалось изолировать типичные молочнокис-
лые бактерии.
Мы не будем останавливаться на обзоре других исследований,
они уже рассматривались нами. Данные, приводимые отдельными
авторами, близки между собой. Основной причиной, обусловлива-
ющей недооценку почвы как среды обитания молочнокислых бак-
219
терий, являлось то, что при выделении данных микроорганизмов
применялись методы, обычно принятые при изучении их в молоч-
ных продуктах. При этом посторонние микроорганизмы, энергично
размножающиеся на используемых средах, подавляли молочно-
кислые бактерии и не позволяли исследователям их обнаружить.
К тому же, как правило, авторы учитывали только виды, сбражи-
вающие лактозу, и не концентрировали внимание на видах, не раз-
лагающих ее. В цитируемых выше определителях бактерий и ра-
ботах, посвященных систематике молочнокислых бактерий, содер-
жатся немногочисленные указания на нахождение отдельных ви-
дов молочнокислых бактерий в почве.
Изучению закономерностей распространения молочнокислых
бактерий в почве и ризосфере и некоторых особенностей природы
взаимоотношений этих микроорганизмов с растением был посвя-
щен ряд наших работ, проведенных нами с сотрудниками (Квас-
ников, Сумневич, 1953, 1954; Квасников и др., 1956; Квасников,
Михайлова, 1958; Квасников, 1960; Квасников, Тевелевич, 1964,
и др.).
Ризосфера как среда обитания молочнокислых бактерий при-
влекла к себе внимание и других исследователей (Богданов, 1957,
1958; Луковникова, 1960), которые выделили из нее ряд штаммов,
ценных для молочного хозяйства.
Распространение
молочнокислых бактерий
Методика исследований. Отбор проб для изучения почвы и ризо-
сферы растений мы производили по обычно принятой методике поч-
венных микробиологических исследований. Количество молочно-
кислых бактерий в исследуемых объектах учитывалось по нашей
методике, описанной выше.
Селекционирующее действие корневой системы растений на оп-
ределенные группы и виды микроорганизмов удобно выражать от-
ношением количества их в ризосфере к количеству в почве. Мы
(Квасников и др., 1956) для обозначения селекционирующего влия-
ния корней предложили термин «коэффициент избирательности»,
который, как нам кажется, более точно отображает сущность яв-
ления (вычисляется как частное от деления количества микроор-
ганизмов в ризосферной, прикорневой и корневой зонах на коли-
чество их в почве).
Штаммы бактерий, изолированные из элективных спиртсодер-
жащих сред в чистые культуры на твердые питательные среды,
подвергались затем разносторонним исследованиям. Некоторые
штаммы типичных молочнокислых бактерий исследовались в на-
правлении выявления их способности размножения и длительности
выживания при высеве в почву.
220
Почва
Были проведены исследования большого количества образцов (око-
ло двухсот) различных типов почв Средней Азии и единичные об-
разцы почв Европейской части СССР.
В результате проведенных работ удалось установить, что коли-
чество молочнокислых бактерий в отдельных типах почв в значи-
тельной степени определяется их свойствами и особенно содержа-
нием в них органических веществ. В почвах пустынь и полупу-
стынь Средней Азии эти бактерии или не выявляются, или обна-
руживаются в очень малом количестве, обычно не превышающем
единиц в 1 г. Так, их обычно не удавалось находить в такырах и
такырных почвах. Весной (апрель) в верхнем горизонте целинно-
го серозема молочнокислые бактерии обнаруживаются до десятков
и редко сотен клеток в 1 г, причем в типичном сероземе их несколь-
ко больше, чем в светлом. В луговых и лугово-болотных почвах в
это же время содержание исследуемых бактерий достигает уже со-
тен, а иногда и тысяч клеток. При окультуривании целинных
почв Средней Азии содержание в них молочнокислых бактерий
возрастает в десятки, сотни, а иногда и тысячи раз. Они появляют-
ся и при обводнении пустынь, в которых ранее не обнаружива-
лись. В образцах черноземных почв (поле, засеянное пшеницей,
близ Чернигова) находилось до тысячи клеток молочнокислых
бактерий в 1 г.
Молочнокислые бактерии в наибольшем количестве концентри-
руются в верхних горизонтах почвы; с глубиной численность их
уменьшается. В орошаемых почвах они проникают в значительно
более глубокие горизонты, чем в целинных. Сезонная динамика мо-
лочнокислых бактерий в почве носит тот же характер, что и у мно-
гих почвенных микроорганизмов. Количество их достигает макси-
мальных цифр весной и понижается к осени.
На молочнокислые бактерии в почве существенное влияние ока-
зывает характер и степень ее засоления. Их не удалось обнаружи-
вать в светлом сероземе с сильным засолением хлоридно-сульфат-
ного типа. Однако после промывки и освоения солончака под куль-
туру хлопчатника эти бактерии развивались хорошо. Концентра-
ция солей в количестве около 1% (общая сумма) уже не оказы-
вает на них отрицательного действия.
Размножение молочнокислых бактерий в почве. В литературе
есть указания, что молочнокислые бактерии, внесенные в стериль-
ную почву, могут в ней длительное время выживать и сохранять
свою активность. Бартель (Barthel, 1937) отметил это в опытах со
Streptococcus lactis и другими видами бактерий.
Нами (Квасников, 1960) было показано, что молочнокислые
бактерии (Lactobacillus buchneri и L. plantarum) обладают способ-
ностью размножаться в почвах и длительно в них сохраняются.
В стерильных сероземах они выживают более семи месяцев и хо-
рошо сберегают свою активность. На этом основании почва была
221
предложена в качестве среды для длительного сохранения лабора-
торных штаммов молочнокислых бактерий.
С. С. Щелоковой (1959) изучалась размножаемость молочно-
кислых бактерий в зависимости от влажности и количества органи-
ческого вещества в почве. Опыты проводились с типичным серозе-
мом (1,3% гумуса) и лугово-болотной почвой (3,8% гумуса) при
влажности, постоянно поддерживаемой на уровне 3—8 и 16% по
весу, в двух вариантах. В первом варианте почва оставалась несте-
рильной, во втором она стерилизовалась (при 2 атм. в течение
2 час.). В почву высевались культуры Str. lactis, изолированные из
этого же типа почв. Периодически в почвах определялось количест-
венное содержание молочнокислых бактерий. Размножения бакте-
рий не наблюдалось при влажности почвы 3%, но происходило при
содержании 8% влаги и особенно энергично — при 16%. Кривые
размножения типичны для роста популяции микроорганизмов в ог-
раниченных объемах субстратов. Количество клеток в почве возра-
стает в тысячи и десятки тысяч раз в течение первых десяти суток
и затем постепенно падает. В этих опытах при достаточной влаж-
ности почвы бактерии также сохранялись свыше семи месяцев. Та-
ким образом, размножение молочнокислых бактерий в стерильной
почве шло энергичнее, чем в нестерильной, что, по-видимому, объ-
ясняется отсутствием в первой конкурентных микроорганизмов. В
стерильной почве, более богатой органическими веществами (луго-
во-болотная), размножение бактерий происходит активнее, чем в
почве, содержащей их в меньшем количестве (типичный серозем).
Ризосфера растений
Молочнокислые бактерии аккумулируются в ризосфере растений,
причем вокруг корней культурных растений их, как правило, боль-
ше, чем вокруг дикорастущих (табл. 45, 46). Величина коэффици-
ента избирательности молочнокислых бактерий в ризосфере отдель-
ных растений различна (рис. 15).
Из дикорастущих растений молочнокислые бактерии в незначи-
тельном количестве содержатся в ризосфере камыша, янтака (верб-
люжьей колючки), солодки, каперсов. Несколько больше их у паст-
бищных растений, произрастающих на адырах. Из культурных рас-
тений особенно интенсивно молочнокислые бактерии сосредоточи-
ваются в ризосфере кукурузы, сорго пониклого (джугары) и вино-
града. Избираются они также люцерной, рыхлокустовыми злаками
и хлопчатником.
В сущности, нам не удавалось выявить ни одного растения, в ри-
зосфере которого при тщательном исследовании нельзя было бы
найти молочнокислых бактерий. В наибольшем количестве они
обычно содержатся в прикорневой зоне, но аккумулируются также
на корнях и в ризосферной зоне. Молочнокислые бактерии изби-
раются корнями растений во все фазы их развития, главным об-
разом в цветение и в ранние фазы. Однако отдельные растения
222
различаются между собой по фазам, в которые они максимально
селекционируют эти бактерии. Так, вычисленный С. С. Щелоковой
коэффициент избирательности показал, что корневая система сор-
го сахарного, джугары местной, хлопчатника, винограда, тростни-
ка и янтака наиболее интенсивно избирает молочнокислые бакте-
рии в фазу цветения, а кукуруза и люцерна — в ранние фазы и к
созреванию.
Существенно отметить, что в ризосфере растений молочнокис-
лые бактерии содержатся в большем количестве, чем в эпифитной
Рис. 15. Коэффициент избирательности молочнокислых бактерий в корне-
вой, прикорневой и ризосферной зонах некоторых растений в фазу цвете-
ния на типичных сероземах Ташкентского оазиса
1— корневая; 2 — прикорневая, 3 — ризосферная зоны; а — янтак, б — тростник,
о— каперсы, г — солодка, д — хлопчатник, е - люцерна, ж — кукуруза, з - джугара,
и— виноград
микрофлоре. Эта закономерность отчётливо выступала во всех
исследованиях как дикорастущих, так и культурных растений.
Многолетние исследования видового состава молочно-
кислых бактерий показали, что в ризосфере растений и почве оби-
тает ряд видов этих микроорганизмов. Среди кокковых форм наи-
более часто изолируются Streptococcus lactis, Str. cremoris, Str. du-
rans, Str. faecalis, Leuconostoc dextranicum. Из палочковидных
форм чаще всего встречаются Lactobacillus plantarum, L. brevis, L.
fermenti, L. buchneri, L. leichmannii.
Ризосфера растений, особенно культурных, как правило, пред-
ставлена большим разнообразием видов, чем почва, взятая вдали
от корней. Почвы, более богатые органическим веществом, содер-
жат большее количество видов молочнокислых бактерий, чем бед-
ные им.
По активности кислотообразования отдельные штаммы молоч-
нокислых бактерий, выделенные из ризосферы растений и почв,
варьируют в широких пределах. Наряду с малоактивными штам-
мами, образующими при высеве в сахаросодержащие жидкие сре-
ды (солодовое сусло и др.) незначительное количество кислот,
223
Таблица 45
Содержание молочнокислых бактерий в ризосфере и почве некоторых дикорастущих и культурных растений
в фазу цветения (1953 г.)
Растение Место исследования Почвенная разность Количество бактерий в 1 г
корней прикорне- вой почвы ризосферной почвы почвы вдали от корней
Ташкентская область
Янтак (Alhagi sparsifolia) Пос. Луяачарское Типичный серозем 102 1,7-102 IO2 10
Тростник (Phragmites communis) » » » 1,4-102 1,9-104 103 102
Солодка (Glycyrrhiza glabra) » » » 7-10 103 102 102
Каперсы (Capparis spinosa) » » » Ю2 1,2-102 IO2 10
Кузиния мягковолокнистая (Cousinia Урта-Сарайский рай- » » 6,6-103 2-Ю4 Ю2 10
pseudomollis) он, пастбище
Зопник Регеля (Phlomis Regelii) То же » » 6,6-10 2-Ю4 103 Не найдено
Мальва белоцветная (Alcea nudi- flora) » » » 6,6-Ю3 2-Ю4 103 102
Эгилопс толстый (Aegilops crassa) » » » 6,6-Ю3 2-Ю4 Не найдено 10
Вьюнок шерстистый (Convolvulus subhirsutus) » » 6,6-Ю4 2-Ю4 104 Не найдено
Псоралея костянковая (Psoralea dru- » » » 6,6-Ю4 2-Юз Не найдено
pace»a) Хлопчатник Пос. Луяачарское » » IO2 104 IO2 10
Люцерна Колхоз им. Пушкина Светлый серозем 103 5-10® 2-10г 10
Кукуруза Пос. Луначарское Типичный серозем 3,1-10* 5,5-108 2-Ю3 2-10
Джугара » » » 3-103 2,1-10® 103 102
Андижанская область
Рис Андижанский район Луговая 10® 1,7-10® 1,6-10® 1,2-10*
Виноград Сел. Кибрай Типичный серозем 1,2-104 1,8-10® 1,3-104 10
Таблица 46
Содержание молочнокислых бактерий на растениях и в почве (1952 г.)
Растение Дата сбора Место сбора Количество бактерий в 1 г
надзем- ной части растений корней ПОЧВЫ прикор- ; невой : ЗОНЫ S S 3 S й s к ПОЧВЫ вдали от корней
Кукуруза 10.VII Ташкент- ская обл., пос. Луна- чарское 10? 103 4,5-10® 10® 10®
Райграс 10. VII То же 10? 10? 1,3-10® 10* 10
Клевер 10.VII » 10 102 1,5-10* 10* 10
Люцерна 10. VII » 10 102 3,7.10? 10* 10
Лебеда 10. VI » 10 103 2,0-Юз 102 1
Хлопчатник 10. VII Не 102 6,7-102 103 102
Камыш 6.VI » 10 10 3,0-10* 103 102
Я итак 10. VIII » 10 103 2,5-Юз 103 Не йай- дено
Каперсы 23. V » 10 102 1,2-102 102 10
Кейреук 10.V Ташауз- ская обл., Не найдено 10 Ю2 Не най- дено Не най- дено
Итсигек 10. VII Куня-Ур- генчский р-н То же Не найде- но Ю2 То же То же
выделяются, хотя значительно реже, и энергичные, накапливаю-
щие их в количестве 60—100° Тернера и более. Молочнокислые
бактерии, изолированные из почвы, характеризовались как гетеро-
ферментативным, так и гомоферментативным типом брожения,
причем взаимоотношение между молочной и летучими кислотами
у отдельных штаммов варьировало в очень широких пределах.
Некоторые особенности взаимоотношений
молочнокислых бактерий и растений
С целью изучения способности молочнокислых бактерий разви-
ваться вокруг корневой системы и установления характера и не-
которых сторон природы их влияния на растения была поставлена
серия опытов на искусственных средах и в почве.
Основными объектами исследований являлись люцерна араб-
ская 721, некоторые рыхлокустовые злаки (райграс, ежа и др.) и
хлопчатник. В опытах использовались штаммы молочнокислых
бактерий, выделенные из ризосферы растений, преимущественно
L. plantarum (штамм 72 — из корневой зоны люцерны, 66 — из
ризосферной зоны хлопчатника и др.). Штаммы бактерий в лабо-
8 Е. И. Квасников, О. А. Нестеренко 225
раторных условиях культивировались на люцерновой среде с пеп-
тоном и глюкозой.
Для бактеризации семена растений подбирались равные по ве-
личине, обеззараживались концентрированной серной кислотой в
течение трех минут, тщательно промывались стерильной водой и
увлажнялись водной суспензией двухсуточной культуры молоч-
нокислых бактерий, содержащей в 1 мл около 100 млн. микробных
тел. Иногда семена обрабатывались непосредственно двухсуточной
культурой бактерий на люцерновой среде. Бактеризованные семе-
на высевались в стерильные искусственные среды (в широкогор-
лые пробирки под ватными пробками) или в почву (в вегетацион-
ных сосудах). Почва при этом бралась нестерильная или простери-
лизованная (при 2 атм. в течение двух часов). В вегетационных
сосудах с почвой в течение всего опыта поддерживалось 30 % влаж-
ности от полной влагоемкости (поливом стерильной водопроводной
водой). Растения, выращиваемые на искусственных средах, выдер-
живались в комнатных условиях на подоконнике (при 18—25°),
а культивируемые в почве — содержались в теплице (при 18—23°).
Все опыты ставились не менее чем в пятикратной повторности.
Периодически измерялась высота растений, подсчитывалось коли-
чество листьев, учитывалось содержание молочнокислых бактерий
в ризосфере.
Было установлено, что молочнокислые бактерии, развиваясь в
почве, могут принимать участие в процессах, связанных с раство-
рением труднорастворимых соединений фосфора. Так, при высеве
штаммов, выделенных из ризосферы хлопчатника и люцерны на
среды, обычно используемые для выращивания фосфоробактерий,
но обогащенные необходимыми для молочнокислых бактерий ис-
точниками азотного и витаминного питания, многие из них уже
через 3—4 суток вызывают растворение трехкальциевого фосфата
с образованием характерных зон просветления (рис 16). Отдель-
ные штаммы различаются между собой по интенсивности, с кото-
рой они растворяют данную соль. Наибольшее растворение ее на-
блюдается у активных кислотообразователей.
Молочнокислые бактерии могут усваивать и нуклеиновую кис-
лоту, вызывая при этом интенсивное растворение мела (рис. 17).
На основании полученных экспериментальных данных можно
предположить, что если молочнокислые бактерии переводят нера-
створимые соли трехкальциевого фосфата в растворимое состояние,
они должны благоприятствовать развитию растений в среде, где
фосфор находится в виде этой соли. Это предположение полностью
подтвердилось в опытах с песчаными культурами.
Через 25 суток содержание молочнокислых бактерий у расте-
ний, семена которых были бактеризованы, достигало сотен тысяч
и десятков миллионов клеток на 1 г прикорневой почвы, у конт-
рольных же растений бактерии не обнаруживались. Бактеризован-
ные растения развивались несколько лучше контрольных. Питание
молочнокислых бактерий в песчаной культуре происходило за
226
Рис. 16. Зоны растворения трехкальциевого фосфора при росте молочнокис-
лых бактерий Lactobacillus plantarum штамм 66
Рис. 17. Зоны растворения мела в среде с нуклеиновой кислотой при росте
молочнокислых бактерий Lactobacillus plantarum штамм 66
счет корневых выделений растений. Молочнокислые бактерии, раз-
виваясь вокруг корней, могут содействовать усвоению ими фос-
фора из нерастворимых солей и тем оказывают благоприятное вли-
яние на развитие растения.
Развитие молочнокислых бактерий в ризосфере. Исследовалась
способность молочнокислых бактерий к активному размножению
в ризосфере растений при бактеризации их семян. Основные опы-
ты проведены с люцерной. Семена обрабатывали по приведенной
выше методике суспензией молочнокислых бактерий, изолирован-
ных из ризосферы, и высевали в вегетационные сосуды с 400 г ти-
227
8
личной сероземной почвы, взятой из-под старопашни хлопчатника.
Периодически сделанные анализы ризосферной микрофлоры бакте-
ризованных растений показали, что молочнокислые бактерии об-
ладают способностью размножаться в ней как в стерильной, так и
в нестерильной почве. Особенно энергично размножались штам-
мы, выделенные из прикорневой и корневой зон люцерны. Так,
в 1 г через два месяца количество их достигло десятков и сотен
миллионов клеток. Несколько слабее размножались штаммы, вы-
деленные из ризосферной зоны — до сотен тысяч и десятков мил-
лионов в 1 г. В контрольной нестерильной почве содержание мо-
лочнокислых бактерий в прикорневой зоне было значительно
ниже — десятки и тысячи клеток в 1 г; при выращивании же
стерильных семян растений в стерильной почве эти бактерии во-
круг корней не обнаруживались. В ряде опытов бактеризация се-
мян оказала благоприятное влияние на рост и развитие растений.
Аналогичные опыты были также проведены в полевых услови-
ях (1956 г., 1958 г.) на сероземных и луговых почвах. Обработка
семян люцерны молочнокислыми бактериями и здесь приводила к
накоплению их в ризосфере в десятки и сотни раз большему, чем у
небактеризованных растений.
В лабораторных и полевых опытах, проведенных с другими
растениями, нам также удавалось наблюдать увеличение содержа-
ния молочнокислых бактерий в ризосфере растений, выращенных
из семян, обработанных штаммами, выделенными из их ризос-
феры. В частности, это было установлено в исследованиях с хлоп-
чатником, рыхлокустовыми злаками и янтаком.
Исследования, проведенные с применением описанных выше
методов, позволяют дать новую трактовку экологии группы молоч-
нокислых бактерий.
Основной средой обитания большого количества представителей
этих микроорганизмов в природе является почва, где они сосредо-
тачиваются вокруг корневой системы дикорастущих и особенно
культурных растений.
Количество молочнокислых бактерий в почве находится в пря-
мой зависимости от типа почв, содержания в ней органических ве-
ществ и влажности. При окультуривании целинных почв числен-
ность этих бактерий возрастает. Титр молочнокислых бактерий в
почве является косвенным показателем богатства ее органическим
веществом и степени окультуренности. Молочнокислые бактерии се-
лекционируются корневой системой растений во все фазы их разви-
тия, преимущественно в ранние и в период цветения. При бакте-
ризации семян растений молочнокислыми бактериями, приспособ-
ленными к развитию в ризосфере, они в ней размножаются.
Следовательно, многих представителей группы молочнокислых
бактерий мы можем отнести к типичным микроорганизмам ризо-
сферы растений.
228
Нам представляется возможным очертйть ряд сторон во взаимо-
отношениях молочнокислых бактерий с растениями.
Развиваясь в ризосфере, эти бактерии питаются в значитель-
ной степени за счет корневых выделений. Прихотливые потребно-
сти многих их представителей в ряде витаминов и аминокислот
удовлетворяются также ауксоавтотрофными ризосферными микро-
организмами, которые, как известно, синтезируют и выделяют в
окружающую среду биотин, витамины Вь В6, никотиновую и пан-
тотеновую кислоты и ряд других биологически активных веществ.
В свою очередь, молочнокислые бактерии могут содействовать со-
зданию вблизи корней среды, благоприятной для развития расте-
ний. Это особенно сказывается в щелочных среднеазиатских поч-
вах. Молочнокислые бактерии в почве обладают свойствами фос-
форобактерий. Трехкальциевый фосфат они переводят в раствори-
мую форму, что обусловливается их действием как бактерий-кис-
лотообразователей. Интенсивно они усваивают и нуклеиновую ки-
слоту. Размножаясь в ризосфере, молочнокислые бактерии могут
благоприятствовать растению в усвоении фосфора.
Молочная кислота, образуемая этими бактериями, содействует
развитию вокруг корней ряда других микроорганизмов, которые
используют ее в качестве питательного компонента. Поэтому спо-
собность микроорганизмов ризосферы использовать соли молочной
кислоты, отмечаемая в работах многих исследователей, в известной
степени находит себе объяснение.
Можно предположить, что группа молочнокислых бактерий в
процессе эволюции была глубоко взаимосвязана с растением. По-
видимому, и корни большой ауксогетеротрофности этих микро-
организмов в значительной степени следует искать в их приспособ-
ленности к развитию в ризосфере, как одной из основных и пер-
вичных сред их обитания.
ЖЕЛУДОЧНО-КИШЕЧНЫЙ ТРАКТ ЧЕЛОВЕКА
Полость рта
В полости рта обитает значительное количество молочнокислых
бактерий. Они, преимущественно, относятся к родам Streptococcus,
Lactobacillus и Leuconostoc (Bisset, G. H. G. Davis, 1960). Видовой
состав молочнокислых бактерий ротовой полости является, в изве-
стной мере, отражением микробного пейзажа пищевых продуктов.
В микрофлоре ротовой полости как здоровых лиц, так и стра-
дающих кариесом зубов, нередко превалируют представители раз-
личных видов стрептококков. При этом имеются указания, что
штаммы, характеризующиеся большей сахаролитической актив-
ностью, более характерны для кариозного рта (Bisset, G. Н. G.
Davis, 1960).
229
В ротовой полости (в частности, в слюне) преобладают Str.
salivarius, а также иные «-гемолитические стрептококки, напри-
мер Str. mitis; часто обнаруживается Str. bovis. В то же время
Str. faecalis находят в полости здорового рта далеко не всегда, хо-
тя его можно выделить из инфицированных каналов зубов, в ка-
риозных тканях. Srt. pneumoniae во рту встречается регулярно,
куда попадает из носоглотки; представители вида Str. lactis изо-
лируются спорадически. Большинство стрептококков сосредото-
чивается в мукозной мембране десны, а также на миндалинах
(Перетц, 1962). Гетероферментативные кокки рода Leuconostoc
немногочисленны.
Значительное число палочковидных молочнокислых бактерий
полости рта относится к роду Lactobacillus (Rogosa et al., 1953;
G. H. G. Davis, 1959b; Bisset, G. H. G. Davis, 1960). Среди них
обнаруживают как гомоферментативные виды (L. casei, L. plan-
tarum, L. acidophilus, L. salivarius), так и гетероферментатив-
ные (L. fermenti, L. brevis, L. buchneri). Среди гомоферментатив-
ных преобладает L. casei, а гетероферментативных — L. fermenti.
Имеются сведения о том, что частота выделения молочнокис-
лых бактерий возрастает по мере развития кариеса зубов. Так,
Шоулин и Гиллис (Shovlin, Gillis, 1969) постоянно находили
лактобациллы в случаях активных кариозных поражений. Изо-
лировали молочнокислые палочки (чаще всего L. casei и L. fer-
menti) из кариозных зубов, слюны и поверхности языка пациен-
тов и другие авторы (Takei et al., 1971).
Желудок и тонкие кишки
Многочисленными исследованиями установлено, что микрофло-
ра желудка довольно бедна. Если желудок и верхний отдел тон-
ких кишок не содержат пищи, то при нормальной желудочной
секреции они остаются почти стерильными (Басина, 1931; Нае-
nel, 1961). Горбач с сотрудниками (Gorbach et al., 1967 а, b), на-
пример, показали, что у здоровых людей в тонком кишечнике, а
также часто в желудке содержится только небольшое количество
стрептококков, лактобацилл, грибов и стафилококков. Ограни-
ченное развитие микроорганизмов в этих отделах желудочно-ки-
шечного тракта человека обусловливается не одним бактерицид-
ным действием пищеварительных соков. В опытах с паренхима-
тозными органами цыпленка (Haenel, 1962) было показано, что
ткани желудка и тонкого кишечника проявляют выраженную
антибиотическую активность в отношении ряда микроорганиз-
мов (Bacillus cereus, Escherichia coli, Micrococcus aureus, M. ly-
sodeicticus, Lactobacillus casei, Streptococcus faecalis, Neurospora
crassa, Candida albicans и Saccharomyces carlsbergensis).
Основными представителями молочнокислых бактерий же-
лудка человека являются энтерококки и молочные стрептококки
(Басина, 1931; Перетц, 1955, 1962, и др.).
9.ап
Толстые кишки
В толстом кишечнике содержится огромное количество микроор-
ганизмов. В грамме испражнений обнаруживается от 1 до 100
млрд, микробных тел (Перетц, 1955, 1962; Haenel et al., 1957а, b;
Feldheim, 1958; Gyllenberg et al., 1960; Haenel, 1962; Zubrzycki,
Spaulding, 1962).
После исследований Л. Г. Перетца (1955), в отечественной ли-
тературе утвердилось ошибочное мнение, что кишечная палочка
является основным представителем микробного ценоза фекалий.
У обследованных лиц (в возрасте от года до 60 лет), по мнению
автора, энтерококки составляют 49%, кишечная палочка — 42%,
прочие кокки — 5 %, спороносные аэробные бактерии — 1 %, иные
микроорганизмы — свыше 2%. Перетц не обнаружил микроорга-
низмов, для выделения который необходимы анаэробные условия
культивирования и сахаросодержащие среды. Утверждение о том,
что Bact. coli является преобладающим видом в фекалиях взрос-
лых, встречалось и в других работах, посвященных микрофлоре
желудочно-кишечного тракта человека (Максимов, 1962). В то же
время Мата с сотрудниками (Mata et al., 1969) установили, что
в фекалия!х взрослых и детей 2—3 лет находятся главным обра-
зом бактероиды.
Другая микрофлора существует у детей, находящихся на груд-
ном вскармливании (Вогулкин, 1949; Перетц, 1955, 1962; Mata
et al., 1969, и др.). Основным микроорганизмом кишечника у 4—
5-дневного младенца является Lactobacillus bifidus. В 1 г фека-
лий грудных детей, вскармливаемых грудью, обнаруживали до
1012 бифидобактерий.
В настоящее время работами многих ученых показано, что
L. bifidus составляет от 50 до 99% микробного содержимого ис-
пражений не только детей, но и взрослого человека (Геймберг,
1958; Feldheim, 1958; Haenel, 1958; Hawley et al., 1959; Zubrzycki,
Spaulding, 1962; Gorbach et al., 1967 a, b, и др.).
В составе микрофлоры кишечника взрослых содержание би-
фидусных бактерий в 10—100 раз выше, чем численность группы
кишечной палочки и энтерококка: L. bifidus — 590 106, Bact. co-
li— 25-106, энтерококки — 8-IO6 (Gyllenberg et al., 1960).
Хенель (Haenel, 1958) отмечает, что в утробе матери ребенок
стерилен. При рождении он инфицируется микроорганизмами ма-
теринской вагины и фекалий. Через 3—4 суток в кишечнике пре-
обладают лактобациллы. Под влиянием материнского молока лак-
тобациллы, растущие в условиях аэробиоза («аэробные» лактоба-
циллы), замещаются бифидусной палочкой; при этом подав-
ляются клостридии (но не кишечные палочки). После отнятия
ребенка от груди содержание L. bifidus в кишечнике остается
высоким, а количество «аэробных» лактобацилл и клостридий
увеличивается, возвращаясь к прежнему уровню.
Энтерококки составляют вторую по численности после бифи-
добактерий группу молочнокислых бактерий, населякицих тол-
231
стый кишечник, и представлены Str. faecalis и его разновидностя-
ми. Обнаруживаются также и Str. lactis (Басина, 1931; Hirsch,
Wheater, 1951, и др.).
Молочнокислые палочки, для выделения которых не требуют-
ся анаэробные условия культивирования, встречаются в таких же,
а чаще в меньших разведениях, чем энтерококки (10~4—10~9)
(Gyllenberg et al., 1960; Smith, Crabb, 1961; Zubrzycki, Spaulding,
1962). По частоте выделения видов из кишечника они располага-
ются в убывающей последовательности: 1) гомоферментативные —
L. acidophilus, L. plantarum, L. casei, L. salivarius; 2) гетерофер-
ментативные — L. fermenti и L. brevis (Davis, 1959a).
Изменение рациона питания приводит к варьированию коли-
чества энтерококков, кишечной палочки, «аэробных» палочковид-
ных молочнокислых бактерий, споровых палочек и дрожжей; со-
держание же L. bifidus подвержено незначительным колебани-
ям. При мясной диете в испражнениях обнаруживается меньшее
количество кишечных палочек, энтерококков, «аэробных» лакто-
бацилл и протеолитических бактерий, чем при растительной. Пи-
тание растительной пищей сопровождается увеличением числа эн-
терококков. Смешанный стол приводит к равномерному увеличению
численности указанных микроорганизмов (Haenel, Miiller-Beuthow,
Scheunert, 1957 a, b; Zubrzycki, Spaulding, 1962; Haenel, 1962).
Важную роль в выяснении функции нормальной кишечной
микрофлоры, в частности молочнокислых бактерий, имеют опы-
ты на стерильных животных (Dubos, Schaedler, 1962; Schaedler,
Dubos, 1962; Касивадзаки и др., 1967; Morishita et al., 1971; Yo-
shida, 1972). Так, стерильно выведенную линию мышей (Schaedler,
Dubos, 1962) держали на диете, способствующей развитию молоч-
нокислых бактерий. Такие животные быстро размножались, интен-
сивно прибавляли в весе. Применение же антибиотиков, изменение
диеты и условий содержания животных вело к исчезновению мо-
лочнокислых бактерий из кишечника и отрицательно сказывалось
на размножении и росте животных. Полноценная диета восстанав-
ливала количественный состав молочнокислых бактерий в ки-
шечнике.
Проведено значительное число наблюдений над влиянием хи-
миотерапевтических и антибиотических веществ на кишечную ми-
крофлору организма человека и животных (Геймберг, 1958; Грин-
зайД, 1959; Планельес, Харитонова, 1960, и др.). Показано, что
при длительном употреблении некоторых лечебных препаратов
изменяется состав микрофлоры и содержание витаминов в орга-
низме (Чернух, Кивман, 1962). При этом часто наблюдается уг-
нетение развития бифидусной палочки, молочнокислых стрепто-
кокков, кишечной и молочнокислых палочек.
Так, в испражнениях взрослых людей, больных хроническим
колитом, бифидобактерии обнаруживаются в 16% случаев, стра-
давших дисбактериозом кишечника в результате контакта с анти-
биотиками в процессе их производства — в 30 %; от здоровых же
232
людей они изолируются в 92,7% случаев и в гораздо большем ко-
личестве (из разведений испражнений 10^10), чем от больных (из
разведений 10~7—10~8) (Гончарова, Вилыпанская, 1968). Такая
же тенденция наблюдается и при обследовании здоровых детей от
месяца до 3,5 лет и детей с расстройствами кишечника, а также
применявших антибиотики (Гончарова, 1970)
Вопрос о возможной патогенности молочнокислых бактерий
для человека неоднократно поднимался в литературе. В настоя-
щее время можно считать установленным, что выявляемые в ро-
товой полости и желудочно-кишечном тракте представители родов
молочнокислых бактерий (за исключением общеизвестных возбу-
дителей заболеваний человека из пиогенной и зеленящей групп
рода Streptococcus) непатогенны.
Правда, в литературе приводится ряд исключений, хотя и не
совсем убедительных. Так, молочнокислые бактерии, близкие к
L. acidophilus, выделяли из крови и органов людей, больных гене-
рализованным сепсисом. Причем, в некоторых случаях было по-
казано, что пациенты страдали заболеваниями зубов (Mar-
schall, 1938; Biocca, Seppilli, 1947). В США описан случай эндокар-
дита, вызванного, как считают авторы (Axelrod et al., 1973), видом
L. plantarum; источником инфицирования была полость рта. Факт
исключительной роли молочнокислых бактерий в этиологии карие-
са зубов не доказан (Green, Dodd, 1956), хотя они в известной сте-
пени и ответственны за развитие данного заболевания.
Особо ставился вопрос о патогенности различных видов энте-
рококков. Считают, что они являются возбудителями ряда забо-
леваний человека и животных — затяжного септического эндо-
кардита, родового сепсиса, менингита, кожных болезней. Энте-
рококки вызывают и воспалительные процессы в желчных,
мочевыврдящих и дыхательных путях (Hahn et al., 1970). Д. Ф.
Перфильеву (1972) неоднократно удавалось выделять энтерокок-
ки (Str. faecalis и Str. faecium) у больных перитонитом из очагов
поражения. Причем, почти пятая часть изолированных штаммов
обладала ферментами патогенности, а около половины — дермо-
некротическими свойствами, что свидетельствует в пользу точки
зрения о патогенности энтерококков.
Мнения исследователей относительно энтерококков как причи-
ны пищевых отравлений противоречивы. По данным Н. Н. Седо-
вой (1970), исследование проб творога и творожных изделий, при-
готовленных из пастеризованного и непастеризованного молока,
показало, что в 1 г продуктов содержится до 4-106 энтерококков
(главным образом, Str. faecalis и Str. faecium var. zymogenes). По-
требление этих изделий детьми разного возраста было совершенно
безвредным. В то же время другие исследователи утверждают, что
попадая, например, с мясными продуктами в желудочно-кишеч-
ный тракт, отдельные представители энтерококков могут вызвать
явления отравления (Frazier, 1958; Levetzow, 1972).
233
Не патогенны для человека и представители бифидобактерий.
Их роль в организме исследовалась в последние годы особенно де-
тально. Установлено, что эта группа микроорганизмов, занимаю-
щая по численности главенствующее место среди всей остальной
кишечной флоры и сопутствующая человеку на протяжении жиз-
ни, не только не патогенна, но и играет важную положительную
роль в здоровье человека. Это обусловливается тем, что данные
микроорганизмы продуцируют кислоты, которые подавляют раз-
витие грамотрпцательных бактерий и газообразующих анаэробов,
а также усиливают перистальтику кишечника, чем способствуют
нормализации переваривания пищи; способствуют резорбции Са,
Fe; влияют на обмен аминокислот и, вероятно, витаминов груп-
пы В (Schuler et al., 1968, и др.).
Благоприятное воздействие бифидобактерий на организм бы-
ло продемонстрировано в опытах на стерильных животных. Так,
Танами (цит. РЖБ 20Б271, 1962) показал, что отрицательное дей-
ствие Esch, coli, введенных стерильным морским свинкам, снима-
ется после введения L. bifidus; отмечается исчезновение из ки-
шечника Esch. coli. Указания на защитную роль L. bifidus имеют-
ся в ряде других работ (Miller, Finegold, 1967).
Следует отметить, что бифидобактерии обнаружены в инфици-
рованных мочевых путях, хотя они не являются патогенными
(Miller, Finegold, 1967). Мюллер и Пех (Muller, Pech, 1967), при-
менив печеночно-цистиновый агар и агар с женским молоком, по-
казали, что бифидобактерии встречаются и в вагинальном содер-
жимом женщин, независимо от гормонального состояния и со-
путствующей флоры. Сведений о патогенности бифидобактерий,
обитающих в вагине, в литературе не имеется.
Таким образом, на всем протяжении желудочно-кишечного
тракта человека (от ротовой полости до прямой кишки) обнару-
живаются молочнокислые бактерии. В ротовой полости преобла-
дают стрептококки, главным образом Str. salivarius. Молочнокис-
лые палочки из слюны выделяются реже и относятся главным об-
разом к видам L. casei и L. fermenti.
В желудке и верхних отделах тонких кишок при нормальной
секреции обнаруживается весьма скудная микрофлора; значитель-
ное место занимает Str. faecalis.
В конечном отделе тонкого кишечника (подвздошная кишка)
и на всем протяжении толстого преобладают анаэробные неспоро-
носные палочки, систематическое положение которых до сих пор
остается спорным. Большинство исследователей классифицирует
их как L. bifidus.
Молочнокислые стрептококки в толстом кишечнике представ-
лены, в основном, Str. faecalis и его разновидностями. Молочнокис-
лые палочки, которые не нуждаются в анаэробных условиях куль-
234
тивирования, при выделении из фекалий человека, относятся ли-
бо к L. acidophilus (реже к L. plantarum или L. casei), либо к
L. fermenti и L. brevis.
Представители молочнокислых бактерий (за немногими ука-
занными выше исключениями) не патогенны для человека.
В кишечном тракте человека молочнокислые бактерии играют
большую, сложную и еще не вполне раскрытую роль, которая пре-
имущественно определяется теми взаимоотношениями, в кото-
рые они вступают с обитающей в нем микрофлорой.
ЖЕЛУДОЧНО-КИШЕЧНЫЙ ТРАКТ
ТЕПЛОКРОВНЫХ ЖИВОТНЫХ
Жвачные животные
Рубец является органом, где интенсивно протекают биохимиче-
ские превращения веществ корма. В нем переваривается до 90%
общего сухого вещества корма, до 70% целлюлозы. Эти превраще-
ния в значительной степени связаны с жизнедеятельностью микро-
организмов, общее число которых достигает нескольких миллиар-
дов клеток в 1 мл содержимого. Истинными обитателями рубца
считаются лишь те группы бактерий, которые принимают актив-
ное участие в биохимических превращениях веществ кормов и на-
ходятся в нем в большом количестве — 10е—107 микроорганизмов
в 1 мл содержимого (Elsden, Phillipson, 1948; Gall, Huhtanen, 1951;
Oxford, 1958). В рубце содержатся также микроорганизмы, кото-
рые, попадая туда с кормом, не приживаются в нем и поэтому не
являются его истинными обитателями. Часто бывает трудно ре-
шить, играет ли тот или иной организм существенную роль в об-
мене веществ в рубце или нет.
Микроорганизмы рубца выполняют разнообразные функции.
Они вызывают превращение клетчатки, крахмала, сахаров и мо-
лочной кислоты; принимают активное участие в расщеплении и
синтезе белков; важную роль играют также в синтезе витаминов
группы В (пропионовокислые, микококки, микрококки, молочно-
кислые бактерии, дрожжи и др.).
Молочнокислые бактерии занимают важное место среди раз-
личных групп микроорганизмов, обитающих в рубце жвачных жи-
вотных. В 1 мл содержимого рубца находят до 107—1011 их кле-
ток (Jensen et al., 1956; Bauman, Foster, 1956, и др.).
Первые сообщения о выделении молочнокислых бактерий из
рубца встречаем з работе Анкерсмита (Ankersmit, 1905, цит. по
Higginbottom, Wheater, 1954), который у жвачных животных об-
наружил Streptococcus acidi lactici. Из содержимого рубца крупно-
го рогатого скота и овец Фи{шер (Fischer, 1916, цит. по Higginbot-
tom, Wheater, 1954) и Геннеберг (Henneberg, 1919, цит, по Hig-
235
ginbottom, Wheater, 1954) изолировали подобные стрептококки, а
Крип (Kreipe, 1927, цит. по Higginbottom, Wheater, 1954) — Str.
bovis. Этот же вид в рубце находили и другие исследователи (Van
der Wath, 1948; Gall, Huhtanen, 1951; Huhtanen et al., 1952).
Мак Ферсон (MacPherson, 1953) более детально изучил ами-
нолитические микроорганизмы рубца. Выделенные автором штам-
мы Str. bovis характеризовались хорошим ростом в присутствии
кислорода и способностью ферментировать углеводы в аэробных и
анаэробных условиях культивирования. Они были причислены к
группе D по Ленсфилд. Впоследствии принадлежность Str. bovis,
изолированных из рубца овцы, к серологической группе D была
подтверждена Меном с сотрудниками (Mann et al., 1954b). В то
же время ряд авторов (Higginbottom, Wheater, 1954; Perry et al.,
1955) сообщил о выделении из рубца коров штаммов Str. bovis,
обладавших общими морфолого-физиологическими признаками,
но отличавшихся друг от друга по антигенным свойствам.
Обычно авторы, изолировавшие из рубца жвачных животных
Str. bovis, отмечали у него признаки, характерные для этого ви-
да (Mann et al., 1954b; Higginbottom, Wheater, 1954). Однако
описаны представители Str. bovis (например, из рубца телят), ко-
торые вызывали гемолиз на агаре с кровью, сбраживали маннит,
не гидролизовали крахмал, не были устойчивыми к нагреванию
(Mann, Oxford, 1955; Ziolecki, Briggs, 1961, и др.). Крог (Krogh,
1961b, 1963) описал, например, штаммы, не сбраживающие крах-
мал, и назвал их Streptococcus inulinaceus.
Среди других видов молочнокислых кокковых бактерий в руб-
це обнаружен Str. faecalis (Mann et al., 1954b; Ziolecki, Briggs,
1961; Krogh, 1961b), Str. faecalis var. zymogenes, Str. durans
(Ziolecki, Briggs, 1961) и Str. lactis (Сосновская, 1959).
Из гомоферментативных лактобацилл в рубце обитают Lacto-
bacillus plantarum, L. casei, штаммы, близкие к L. delbrueckii
(Krogh, 1961b, 1963). Удается выделять разновидность L. casei
var. alactosus, представители которой не сбраживают лактозу.
Причем не исключено, что микроорганизмы, описанные некото-
рыми авторами как L. delbrueckii или L. leichmannii (на основа-
нии отсутствия у них способности ферментировать лактозу), мо-
гут принадлежать в действительности к указанной разновидно-
сти (Jensen et al., 1956).
Из рубца выделяют и гетероферментативные бактерии —
L. fermenti, L. brevis, L. buchneri, L. cellobiosus, (Jensen et al.,
1956; Krogh, 1961b, 1963).
Вассерман с сотрудниками (Wasserman et al., 1953) изолиро-
вали также L. bifidus и отметили способность их использовать
азот аммиака в качестве единственного источника азота. Это
свойство, по мнению авторов, говорит о возможности активного
участия L. bifidus в превращении минерального азота в белковый
в рубце животных. L. bifidus обнаружили и другие авторы
(Krogh, 1961b, 1963).
ass
На протяжении ряда лет исследователи уделяют большое
внимание выяснению вопроса о времени появления микрооргани-
змов в рубце; изучают также изменение количественного' содер-
жания и видового состава микрофлоры его содержимого в nept
вые недели и месяцы жизни животного. Решение указанных
вопросов позволит более точно установить время перевода молод-
няка на грубый корм и понять этиологию частых заболеваний
желудочно-кишечного тракта в первые дни жизни животного. При
этом особенно важно изучение молочнокислых бактерий, преоб-
ладающих среди нормальной микрофлоры содержимого рубца.
О количественном содержании и видовом составе молочно-
кислых бактерий в рубце телят различного возраста имеются про-
тиворечивые данные.
Некоторые авторы (Ziolecki, Briggs, 1961, и др.) считают, что
первыми микроорганизмами, которые заселяют рубец телят после
рождения их, являются стрептококки и бактерии группы coli —
aerogenes. В течение первой недели жизни теленка последние пре-
валируют в рубце, тогда как Str. faecalis и Str. bovis составляют
около трети микрофлоры рубца животных. Затем на протяжении
следующих двух недель преобладающим видом становится Str. bo-
vis (до 90 % всей микрофлоры рубца). В течение первой недели
лактобациллы не встречаются в рубце. Они изолируются только
со второй недели жизни телят (L. plantarum), а после двух недель
в рубце среди лактобацилл преобладает L. acidophilus, но редко
встречается L. fermenti.
По мнению других исследователей (Белоновский, Калинин,
1935; Никольский, 1958; Водянникова, 1958), молочнокислые
бактерии обнаруживаются в значительном количестве (до 108)
в рубце уже на 2—5-е сутки жизни телят. Больше всего их на-
ходится в рубце телят в возрасте от 1 до 3 недель (Bryant et al.,
1958а); затем содержание их уменьшается и у 9—13-недельных
телят молочнокислых бактерий в рубце столько же, сколько и у
взрослых животных. Причем некоторые авторы (Mann, Oxford,
1954, 1955) считают, что у телят уже в возрасте 5 суток в рубце
преобладают амилолитические стрептококки серологической груп-
пы D (Str. bovis).
В противоположность вышеприведенным данным о лактоба-
циллах, Менн и Оксфорд (Mann, Oxford, 1954, 1955) показали,
что из рубца и сычуга 10—11-дневных телят и козлят, питаю-
щихся молоком, можно выделить L. fermenti и L. acidophilus.
Причем, кроме типичных представителей последнего вида, были
изолированы и штаммы, которые ферментировали крахмал, дек-
стрин и характеризовались устойчивостью к ауреомицину. Они
были отнесены к новой разновидности — Lactobacillus acidophi-
lus var. саргае. От 1,5—2-месячных телят авторы выделяли ДО
105—10е клеток L. brevis в 1 мл содержимого рубца.
Следует подчеркнуть, что видовой состав и количественное
содержание молочнокислых бактерий в рубпе жвачных живот*
337
ных следует рассматривать в тесной взаимосвязи с условиями
кормления и' содержания их.
Установлено, что в течение первых трех месяцев жизни, ко-
гда телята питаются молоком, в их желудочно-кишечном тракте
преобладают бифидобактерии и молочнокислые бактерии (лакто-
бациллы, стрептококки), содержание которых достигает 60—
95% от числа всех иных видов микроорганизмов. С переходом
животных (например, в возрасте четырех месяцев) на расти-
тельный корм, процент молочнокислых бактерий постепенно сни-
жается (да 60—25%), они уступают место споровым бактериям,
кишечной палочке, а также микроорганизмам, разлагающим клет-
чатку и пектиновые вещества. У телят старшего возраста, полу-
чающих концентраты и грубые растительные корма, микрофлора
поджелудка близка к той, что характерна для животных, пита-
ющихся растительным кормом (Гольцева, 1953; Тараканов,
1965а).
Данные различных авторов о влиянии рациона кормления на
видовой состав молочнокислых бактерий рубца жвачных живот-
ных в значительной мере дополняют друг друга. Так, при корм-
лении животных сеном и концентратами исследователи, как пра-
вило, находили Str. bovis (Bryant, Burkey, 1953a, b; Mann et al.,
1954b; Perry et al., 1955; Hungate, 1957). Из рубца животных,
которых кормили сеном, выделяли и Str. faecalis (Mann et al.,
1954b), а у получавших концентрированные корма обнаружи-
вали неидентифицированные факультативно-анаэробные, не ге-
молитические стрептококки, образующие длинные цепочки и не
гидролизующие крахмал (Bryant, Burkey, 1953а, b). В опытах
Баумена и Фостера (Bauman, Foster^ 1956) при кормлении живот-
ных концентратами в их рубце доминировали педиококки.
При кормлении жвачных животных сеном с мочевинно-мелас-
совой добавкой в содержимом рубца их развивается Lactobacillus
bifidus (Wasseman et al., 1953). Этот же вид бактерий, а также
L. parabifidus были найдены при применении в кормовом рационе
и грубых кормов (Bauman, Foster, 1956). Однако Йенсен с соав-
торами (Jensen et al., 1956) обнаружили в рубце крупного рогато-
го скота и овец (при том же режиме кормления) значительно
большее количество видов молочнокислых бактерий. Среди них —
L. acidophilus, L. brevis, L. buchneri, L. casei, L. casei var. alacto-
sus, L. fermenti и L. plantarum.
Молочнокислые бактерии, принадлежащие к L. plantarum,
L. acidophilus, L. casei и L. fermenti, выделили из рубца коров,
кормящихся силосом и концентратами, Перри, Бригс (Perry,
Briggs, 1957); причем, L. acidophilus преобладали у животных,
получавших концентраты, a L. casei — силос. Б. В. Тараканов
(19656) наблюдал повышение количества L. plantarum в’ рубце
телят при скармливании им зеленых кормов.
Как указывают Зиолески и Бригс (Ziolecki, Briggs, 1961),
у телят, получающих концентрированные корма, в рубце преоб-
238
ладали лактобациллы (стрептококки выделялись очень редко),
тогда как при кормлении молоком основную часть рубцовой мик-
рофлоры составляли стрептококки.
В литературе имеются данные и о влиянии характера кормо-
вого рациона на количественное содержание отдельных видов мо-
лочнокислых бактерий в рубце. При обычном кормовом рационе
число Str. bovis в рубце коров на протяжении суток колеблется от
105 до 107 в 1 мл содержимого. Как правило, увеличение количе-
ства бактерий этого вида на 2—3 порядка связано с увеличением
содержания в рубце растворимых углеводов, попадающих с кор-
мом. Затем количество стрептококков снижается и достигает пер-
воначального уровня (Higginbottom, Wheater, 1954). Аналогичные
результаты были получены при изучении содержимого рубца овец
и коз.
В то же время при добавлении в кормовой рацион коров ячме-
ня, в состав которого входит крахмал, не наблюдается увеличения
числа Str. bovis, находящихся в количестве 2-105—1,4-108 кле-
ток в 1 мл рубцового содержимого коров, которые предварительно
получали сено и концентрированные корма (Hungate, 1957). Ко-
личество Str. bovis в рубце коров может и снижаться, если живот-
ных кормить не травой (способствующей увеличению числа кле-
тЦк от 108 в 1 мл содержимого рубца до 109—1011 в 1 мл), а кон-
центратами.
Грамположительные, анаэробные палочки, принадлежащие к
L. bifidus или L. parabifidus, в количестве 1010—1011 клеток в
1 мл обнаруживали в рубце жвачных животных, когда их корми-
ли грубыми кормами (Bauman, Foster, 1956). С введением в ра-
цион концентрированных кормов содержание этих бактерий
уменьшалось.
Рацион питания коров, по-видимому, влияет и на содержа-
ние в рубце животных L. acidophilus и L. casei. Так, в случае
кормления коров грубыми кормами количество бактерий этих
видов не превышало 103—104 клеток в 1 мл содержимого рубца
(Jensen et al., 1956), а при использовании концентратов достигало
1013 и 1010 (Perry, Briggs, 1957).
Изучение микрофлоры рубца, как правило, проводилось боль-
шинством исследователей на животных, у которых не обнару-
живали каких-либо патологических изменений со стороны же-
лудочно-кишечного тракта. Однако смертельные случаи, которые
наблюдались при заболевании животных острой кислотной не-
сваримостью в результате поедания животными большого коли-
чества концентратов, а также при добавлении в их корм сахарозы,
лактозы и крахмала, заставили изучить микрофлору рубца жи-
вотных, страдающих этим заболеванием (Krogh, 1959, 1960,
1961а; Hungate et al., 1952). Оказалось, что в данном случае в
рубце в большом количестве развиваются молочнокислые бакте-
рии — стрептококки и палочки. Причем, увеличения содержания
стрептоккоков не наблюдалось в ряде опытов, хотя в рацион жи-
239
вотных добавлялся крахмал. Этот факт не совсем понятен, так
как все выделенные из рубца бактерии были отнесены к Str. bo-
vis, который принимает активное участие в разложении крахма-
ла. На этом основании Крог (Krogh, 1961а) делает вывод, что в
рубце, по-видимому, существуют более подходящие условия для
развития лактобацилл, чем стрептококков. Благодаря этому мо-
лочнокислые палочки быстрее размножаются и становятся доми-
нирующими в рубце.
На протяжении ряда лет в наших отделах проводились ис-
следования молочнокислых бактерий рубца крупного рогатого
скота, а также желудочно-кишечного тракта и других теплокров-
ных животных (Квасников, 1960; Квасников и др., 1967; Подгор-
ский, *1967, 1969).
Изучение молочнокислых бактерий содержимого рубца коров,
отобранного в убойном цехе мясокомбината Киева в зимний пе-
риод и высеянного на среду В. В. Леонович и Т. М. Поперековой
(1963), показало, что преобладающим видом является Lactobacil-
lus casei (миллионы клеток в 1 мл содержимого); обнаружены
также L. plantarum и L. brevis (тысячи клеток в 1 мл). В летний
период чаще других изолируются штаммы вида L. plantarum
(тысячи клеток в 1 мл). Гетероферментативные молочнокислые
бактерии в рубце представлены видами L. brevis и L. fermenti.
В процессе роста животных видовой состав молочнокислых
бактерий рубца телят изменяется. В первые месяцы их жизни
преобладают Str. lactis, Str. faecalis и Str. bovis (табл. 47). Воз-
можно, они попадают в желудочно-кишечный тракт из окружа-
ющей среды (особенно с молоком при кормлении). Начиная с
четвертого месяца, преобладающим видом в поджелудке живот-
ных (независимо от возраста и рациона кормления) остается Str.
bovis. Широкое распространение этого вида в рубце, вероятно,
можно объяснить тем, что помимо сбраживания крахмала и про-
стых сахаров Str. bovis, в отличие от других видов молочнокис-
лых бактерий, обладает способностью усваивать минеральные
источники азота.
Палочковидные формы молочнокислых бактерий встречаются
в рубце телят лишь в конце первого месяца жизни. Их появле-
ние, очевидно, связано с изменением кормового рациона, в ко-
торый стали, кроме молочных продуктов, вводить концентраты
и свеклу.
Заметное влияние на развитие в рубце других видов молочно-
кислых бактерий оказывает тип корма. Так, при кормлении жи-
вотных силосом из него обычно выделяются L. plantarum, L. casei
и L. brevis. Интересно при этом отметить, что, если L. plan-
tarum выделяется из рубца животных, находящихся на различных
рационах кормления, то L. casei и L. brevis обнаруживаются лишь
при добавлении в корм силоса. Представители L. buchneri, L. fer-
menti, Str. faecalis var. liquefaciens изолируются периодически и
в небольшом количестве (табл. 47).
240
Таблица 47
Содержание и видовой состав молочнокислых бактерий рубца телят
в зависимости от возраста животных, рациона кормления и времени
отбора пробы на протяжении суток
Возраст жи- вотных, ме- сяцы Суточный рацион кормления Вид Количество в 1 мл *
a 6
1 Молоко —4 л Str. bovis 10« 106
Str. faecalis 107 106
Str. lactis 107 10»
2 Обрат —4,5 л; отруби пшенич- Str. bovis 108 106
ные—0,5 кг; свекла корме- Str. lactis 10» 106
вая — 1 кг; сено — 1 кг L. plantarum 103 103
L. buchneri 10* io1
3 Обрат —4 л; концентрирован- ные корма — 0,3 кг; свекла кор- Str. bovis 107 106
Str. lactis IO8 107
мовая—1,5 кг; сено—0,75 кг Str. faecalis var. lique- faciens 107 106
L. plantarum 103 106
4 Обрат — 3 л; концентрирован ные корма — 0,3 кг; свекла кор- Str. bovis 107 106
L. plantarum 106 10*
мовая — 1,5 кг; сено —1,5 кг L. buchneri 106 10*
5 Концентрированные корма — Str. bovis 107 107
1,7 кг; свекла кормовая—1,5 кг; L. plantarum 10’ 10»
силос — 2 кг; сено — 2 кг L. brevis 10е 106
L. fermenti 107 108
6 Концепт рированные корма — Str. bovis 10» 103
3 кг; свекла кормовая — 5 кг; L. plantarum 103 106
сено — 2,5 кг L. brevis 103
* а — пробы отбирали перед кормлением;
б — через два часа.
При исследовании содержимого рубца на протяжении несколь-
ких часов было обнаружено, что количество молочнокислых кок-
ков уменьшается через два часа после кормления животных. За-
тем, через четыре — шесть часов число кокковых форм увеличива-
ется до значений, которые наблюдались перед кормлением живот-
ных. Среди молочнокислых палочек такой закономерности наблю-
дать не удавалось.
Следует отметить, что штаммы вида Str. bovis, выделенные из
рубца, отличались друг от друга по сбраживанию арабинозы,
ксилозы, маннита и по способности восстанавливать лакмус и ме-
тиленовую синь в молоке. На этом основании они были разделены
на две группы. Изолированные Str. bovis обладают наименьшей
гетеротрофностью в отношении витаминов группы В. Для их ро-
ста необходима лишь никотиновая кислота и биотин, а тиамин и
241
Таблица 48
Рост молочнокислых бактерий, выделенных из рубца, на синтетической
среде с гидролизатом казеина при наличии витаминов группы В *
Среда с полным набором витаминов группы В
за исключением
Вид
и
в
о
к
о
и
S
а
s
к
и
Str. faecalis
Str. faecium
Str. faecalis var. li-
quefaciens
Str. bovis
Str. lactis
L. plantarum
L. casei var. casei
2
10
6
12
5
L. casei var. rham- 3
nosus
L. casei var. ala-
ctosus
L. brevis
L. buchneri
L. fermenti
L. cellobiosus
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
* Контроль I — среда со всеми витаминами группы В; контроль II — среда без
витаминов группы В; плюс — рост; минус — отсутствие роста; С — слабый рост.
пантотеновая кислота стимулируют рост отдельных штаммов
(табл. 48).
При дифференциации видов L. plantarum и L. casei было
установлено, что представители последнего дают яркую положи-
тельную реакцию на ацетоин в средах с лимонной кислотой, то-
гда как L. plantarum этой способностью, как правило, не обла-
дает. Указанные виды четко различались и по потребностям их
в рибофлавине и фолиевой кислоте; изучение потребностей
штаммов в витаминах оказалось важным и для отличия видов
L. brevis от L. buchneri, а также Str. faecalis от Str. faecium
(табл. 48).
Другие теплокровные животные
Все млекопитающие, которых подвергали исследованиям, неиз-
менно содержали в кишечном тракте большое количество молоч-
нокислых бактерий.
242
В кишечном тракте поросят обнаружены L. acidophilus, L. fer-
menti, L. salivarius (Wilssens, van de Gasteele, 1969).
Лактобациллы наряду с дрожжами найдены в слизистой и сек-
ретирующем и несекретирующем эпителии ряда видов крыс и мы-
шей (Savage, 1969). Так, методом отпечатков в микрофлоре же-
лудка крыс обнаружено большое количество лактобацилл (L. fer-
menti и представители подрода Thermobacterium), которые распо-
лагались на поверхности слизистой эпителия (Brownlee, Moss,
1961). У этих животных с поверхности зубов и из зубных бляшек
часто высевались Str. salivarius, реже — Str. mutans (Huxley,
1972).
Streptococcus faecalis, Str. faecium, Str. durans, реже Str. bovis и
Str. equinus находят в испражнениях лошадей, лосей, свиней, ко-
шек, мышей, рыб (Ильин, Касторский, 1968 а).
Стрептококки и лактобациллы преобладают в микрофлоре ки-
шечного тракта взрослых здоровых собак, причем количество их
возрастает от верхних к нижним отделам пищеварительного трак-
та животных (Matsumoto et al., 1972).
Мы не изучали специально видовой состав бактерий кишечно-
го тракта различных животных, однако в процессе работ, проведен-
ных в Узбекистане, был определен ряд штаммов. Они принадле-
жали к следующим видам: L. acidophilus (корова, лошадь,) L. bi-
fidus (винторогий козел), L. leichmannii(косуля), Str. bovis (ко-
рова), Str. faecalis (корова, лань, як), Str. faecalis var. liquefaciens
(корова, зебра). Содержание молочнокислых бактерий в фекали-
ях животных варьирует в широких пределах. С помощью нашего
метода мы выявляли в 1 г фекалиев овцы, лошади, коровы тысячи
и десятки тысяч, а верблюда — сотни и тысячи молочнокислых
бактерий.
Молочнокислые бактерии являются обычными обитателями и
кишечного тракта птиц. Так, например, в фекалиях здоровых ин-
дюков преобладают палочковидные и кокковые молочнокислые
бактерии (Harrison, Hansen, 1950а, b, с). Кокковые формы пред-
ставлены видами Str. faecalis, Str. faecalis var. liquefaciens, Str.
equinus. Среди анаэробных форм чаще всего обнаруживается L.
bifidus; L. acidophilus является наиболее многочисленным видом
среди факультативных анаэробов. Выделяются также L. planta-
rum и L. fermenti, хотя и в меньшем числе. Интересно отметить,
что изолированные штаммы вида L. plantarum характеризовались
высокими температурными точками роста — они не росли при тем-
пературе ниже 20°. Один штамм оказался подвижным.
Виды Str. faecium, Str. faecalis, Str. durans были обнаружены
в содержимом кишечника голубей, чаек, кур; эти же виды, а так-
же Str. bovis и Str. equinus выделяют и от водоплавающей птицы
(Ильин, Касторский, 1968а).
Английскими исследователями было установлено, что лакто-
бациллы, изолированные от кур, обладают способностью прикреп-
ляться к клеткам эпителия стенки зоба цыплят. Этим свойством
243
не обладали другие виды бактерий, а также большое число штам-
мов лактобацилл, изолированных от млекопитающих. По-видимо-
му, зоб играет существенную роль в регуляции кишечной микро-
флоры, цыплят (Fuller, 1973).
Таким образом, приведенные данные показывают, что молочно-
кислые бактерии в большом количестве постоянно обитают в же-
лудочно-кишечном тракте теплокровных животных — млекопи-
тающих и птиц.
Особенно детально исследованы молочнокислые бактерии руб-
ца жвачных животных, где количество их обычно составляет
107—1010 клеток в 1 мл содержимого.
Видовой состав молочнокислых бактерий рубца в значительной
степени определяется возрастом животных и характером рациона
кормления. Кокковые формы (Str. lactis, Str. faecalis, Str. faecium,
Str. bovis) обычно преобладают в рубце в первые месяцы жизни
животных. Начиная с четвертого месяца, первые два вида не об-
наруживаются; Str. bovis преимущественно развивается среди мо-
лочнокислых бактерий преджелудка.
Лактобациллы появляются в рубце в конце первого месяца.
Количество их вначале невелико (тысячи клеток в 1 мл); затем
постепенно увеличивается и в шестимесячном возрасте животных
исчисляется миллионами клеток в 1 мл. Из рубца выделяются
L. plantarum, L. casei var. rhamnosus, L. casei var. alactosus,
L. casei var. casei, L. fermenti, L. buchneri, L. brevis, L. acidophilus
и L. cellobiosus.
При кормлении животных молоком среди молочнокислых бак-
терий преобладает Str. lactis. Когда в кормовой рацион включа-
ется силос, в рубце появляются в значительном количестве L. plan-
tarum, L. casei и L. brevis.
Отдельные виды молочнокислых бактерий, постоянно находясь
в рубце, принимают активное участие в происходящих в нем про-
цессах метаболизма. Они ферментируют большое число углеводов
и спиртов, некоторые гидролизуют крахмал, синтезируют биологи-
чески активные вещества, в том числе белок.
Определенная роль принадлежит молочнокислым бактериям
в создании микробного ценоза в рубце. Продукты метаболизма мо-
лочнокислых бактерий, в частности молочная кислота, служат
важным источником энергии для иных микроорганизмов рубца.
Как покажем мы ниже, молочнокислые бактерии оказывают опре-
деленное влияние на микрофлору рубца также и антибиотическими
веществами, которые продуцируют.
344
ХОЛОДНОКРОВНЫЕ ЖИВОТНЫЕ
Насекомые
Молочнокислые бактерии являются обитателями кишечного тракта
насекомых, где они развиваются наряду с другими микроорганиз-
мами.
У многих насекомых часто обнаруживают представителей груп-
пы энтерококков. От таракана и цикады выделяют Streptococcus
faecalis (Штейнхауз, 1950). В кишечнике саранчи часто находят
Str. faecalis, Str. faecalis var. liquefaciens, Str. faecalis var. zymo-
genes, а также Str. lactis и подвижные молочнокислые стрептокок-
ки (Bucher, Stephens, 1959; Stevenson, 1966). Str. faecalis является
постоянным обитателем кишечника здоровых личинок вощинной
моли даже тогда, когда их переводят на скармливание стерильной
пищей (Stephens, 1962). В кишечнике непарного шелкопряда,
красноголового пилильщика найдены подвижные стрептококки,
близкие к Str. faecalis, характеризующиеся пигментированными
колониями и наличием единичных жгутиков (Cosenza, Lewis,
1965).
Домашние (комнатные) мухи содержат в кишечнике большое
количество фекальных стрептококков (Минкевич, 1949; Штейн-
хауз, 1950; Radvan, 1960; Greenberg, 1962, и др.). Пост и Фостер
(Post, Foster, 1965) от 18 видов мух изолировали молочнокислые
бактерии, которые разделили на ряд групп: 1 — энтерококки (Str.
faecalis и его варианты, а также Str. durans); 2 — Str. mitis и Str.
salivarius; 3 — Str. bovis; 4 — Str. equinus — Str. acidominimus;
5— группа энтерококкового биотипа, представленная небольшим
числом штаммов и включенная в группу энтерококков. Интересно
отметить, что у 75% особей мух, отловленных в сельской местности
(в том числе на птичьих и животноводческих фермах), авторы об-
наружили представителей энтерококков и энтерококкового био-
типа, но почти не выделяли Str. bovis, Str. equinus, Str. acidomini-
mus, Str. mitis и Str. salivarius. Указанные результаты, по мнению
Поста и Фостера, можно объяснить частым контактом мух как
с фекалиями человека, птиц и коров, так и с эпифитной микрофло-
рой, где энтерококки представлены в большом количестве. Из ки-
шечника мух изолируются также Str. agalactiae, Str. lactis и
Str. pyogenes (Штейнхауз, 1950).
Энтерококки изолированы от насекомых 37 систематических
групп и другими исследователями (Eaves, Mundt, 1960; Martin,
Mundt, 1972). Причем, Str. faecalis выделен от 32% насекомых,
Str. faecium var. casseliflavus — 44% и Str. faecium — 22%, питаю-
щихся преимущественно сочными кормами. По-видимому, распро-
странение энтерококков на растениях связано с активностью насе-
комых в природе.
Молочнокислые бактерии были обнаружены и в кишечном со-
держимом колорадского жука (Приставке, 1966), озимой севки
34?
(Сирко, 1968), сибирского шелкопряда (Полтев, Гриценко, 1966;
Гукасян, 1960, 1966а, б), бабочек (Danaus plexippus) (Kingsley,
1972), взрослых особей комаров (Whistreich, Chao, 1960; Ferguson,
Micks, 1961). В дальнейшем было, однако, показано, что большой
процент взрослых комаров вовсе не содержит бактерий (Micks,
Ferguson, 1963; Whistreich, Chao, 1961).
Молочнокислые бактерии пищеварительного тракта гусениц ту-
тового шелкопряда представлены видом, который первоначально
был идентифицирован как Streptococcus bombycis и часто изоли-
ровался во время эпизоотий от больных насекомых и рассматри-
вался условно патогенным для тутового шелкопряда (Штейнхауз,
1950, 1952; Михайлов, 1950, 1958, и др).
Изучение точного систематического положения Str. bombycis
долгое время никем не проводилось. Лысенко (Lysenko, 1958,
1959, 1963) убедительно доказал, что данные бактерии (со мно-
жеством синонимов) представляют собой гетерогенную группу,
родственную видам Str. faecalis или Str. faecium. Автор опроверг
существовавшие до него взгляды, что этот микроорганизм явля-
ется возбудителем бактериозов тутового шелкопряда, так как по-
стоянно находил его в кишечном содержимом здоровых личинок
различных возрастов. Он считал, что наименование Str. bombycis
должно быть признано неудовлетворительным. К подобным выво-
дам пришли и другие авторы (Bucher, 1963).
Однако в определителе бактерий насекомых В. И. Полтева с со-
трудниками (1969) Str. pastorianus и Str. bombycis описаны в ка-
честве самостоятельных видов. Ранее эти виды рассматривались
Э. Штейнхаузом (1952) и О. Лысенко (Lysenko, 1958) как си-
нонимы.
Ряд других исследователей (Штибен и др., 1933; Busu, Bica,
1963) редко выделяли молочнокислые стрептококки из кишечни-
ка тутового шелкопряда в личиночной стадии. Они считают, что
у здоровых насекомых собственной бактериальной флоры нет всле-
дствие неблагоприятных условий для ее жизнедеятельности. По
мнению В. И. Полтева и сотрудников (1969), видовой и количест-
венный состав микрофлоры Bombyx mori L. беден ввиду того, что
насекомые питаются только зеленой частью кроны деревьев.
Микрофлора пчел и пчелиной семьи, согласно данным некото-
рых авторов (Александрова, 1951; Триленко, 1964; Полтев и др.,
1969; White, 1921; Kluge, 1963, и др.), представлена различными
микроорганизмами, в частности, обитателями эпифитной микро-
флоры (Егорова, 1968).
Типичный возбудитель европейского гнильца в пчелином рас-
плоде — Streptococcus apis — был впервые описан Барри в 1906 г.,
как самостоятельный вид. Впоследствии он был отнесен автором к
молочнокислым бактериям на основании сходства этого вида со
Str. liquefaciens и Str. glycerinaceus. Однако точное систематиче-
ское положение этого микроорганизма долгое время оставалось не-
ясным. Г. Камбуров (1963) считает, что указанные стрептококки
246
неверно относить к отдельному виду, так как среди них имеются
организмы, близкие к Str. faecalis var. liquefaciens, Str. faecalis, Str.
faecalis var. zymogenes, Str. faecium. В книге В. И. Полтева с со-
авторами «Микрофлора насекомых» (1969) Str. apis описан как
синоним Str. faecalis var. liquefaciens.
Следует отметить, что молочнокислые бактерии из кишечного
содержимого пчел выделяются не всегда. Есть данные о том, что
кишечник насекомых стерилен при выходе их из ячеек (Таранов,
1968; Егорова, 1968; White, 1921; Kluge, 1963).
Лактобациллы (L. constellatus, L. rigidus apis) изолируются из
различных отделов пищеварительного тракта взрослых особей
здоровых пчел, причем больше всего их (до 106 клеток/мл) в со-
держимом медового зобика, среднем и заднем отделах кишечника
(Kluge, 1963). По данным Клюге, у молодых пчел преобладающим
видом является L. rigidus apis, у более старых —• L. constellatus.
В. М. Черепов (1966), кроме указанных видов, изолировал от
здоровых пчел также Str. faecalis и Str. faecalis var. liquefaciens.
По мнению автора, лактобациллы, являясь постоянными обитате-
лями пищеварительного тракта рабочих пчел, маток и трутней,
способствуют лучшему перевариванию перги. Энтерококки он счи-
тал непостоянными обитателями кишечника пчел. К такому же
выводу впоследствии пришли Тиссе и Руссо (Tysset, Bousseau,
1968), утверждавшие, что стрептококки серологической группы D
являются случайными обитателями пищеварительного тракта пчел
и попадают к ним во время сбора нектара и пыльцы.
Другой точки зрения придерживаются В. И. Полтев (1967) и
А. И. Егорова (1968). Исследуя микрофлору кишечника здоровых
особей медоносных пчел, они ни в одном случае не выделили
Str. faecalis или Str. faecalis var. liquefaciens. Эти микроорганизмы
постоянно присутствовали в кишечнике насекомых, больных евро-
пейским гнильцом. Авторы утверждают, что кишечник пчелиных
личинок стерилен только в одно-двухдневном возрасте вследствие
питания насекомых маточным молочком, действующим бактери-
цидно. С трехдневного возраста личинки начинают питаться ме-
дово-перговой смесью. В их кишечнике создается высокая кон-
центрация сахара (до 17%), устанавливается pH 6,8 и в нем начи-
нают доминировать молочнокислые палочки Lactobacterium polli-
nis (очевидно, разновидность L. plantarum), являющиеся ос-
новным компонентом микробного биоценоза перги (Егорова, 1966;
Егорова, Полтев, 1965). Поскольку L. pollinis постоянно встреча-
ется в здоровых пчелиных семьях, авторы отнесли этот вид к нор-
мальной микрофлоре пчел.
От пчел изолированы и виды рода Bifidobacterium, о чем нами
подробно сообщалось в соответствующем разделе.
На внешние покровы и в пищеварительный тракт насекомых
молочнокислые бактерии попадают из окружающей среды, с кото-
рой контактируют насекомые. Так, энтерококки могут попа чать из _
почвы и растений. Чем больше этих бактерий на растению^Ч¥«1О
247
чаще они выявляются и у насекомых (Mundt, 1961). Кишечник
пчел, питавшихся медом, в котором не было молочнокислых бак-
терий, не содержит их. При скармливании же пчелам стерильного
сахарного сиропа со свежей пыльцой, содержащей незначительное
количество молочнокислых бактерий, уже через трое суток обнару-
живаются сотни миллионов клеток их в 1 мл содержимого кишеч-
ника (Kluge, 1963). Очевидно, с помощью пчел-сборщиц микрофло-
ра цветков медоносных растений вместе с нектаром и пыльцой
поступает-в корм и оттуда попадает в организм пчел различного
возраста (Егорова, 1966; Полтев и др., 1969).
Бактериальная флора насекомых может изменяться в зависи-
мости от сезона года. Это изменение представляет собой не толь-
ко результат влияния температурных условий, влажности и т. д.,
но и является следствием изменения характера питания насеко-
мого.
Учитывая противоречивость и неполноту сведений о молочно-
кислых бактериях большинства насекомых, мы провели исследо-
вание видового состава и количественного содержания молочно-
кислых бактерий кишечного тракта, внешних покровов насекомых
в зависимости от стадии их развития, возраста, а также сезона
года (Коваленко, 1970, 1971; Квасников и др., 1971а, б).
Молочнокислые бактерии у насекомых и в среде их обитания
мы изучали в течение весенне-летне-осеннего периодов 1967—
1970 гг. в Киевской и Винницкой областях. Объектами исследова-
ния служили полезные насекомые — тутовый шелкопряд и медо-
носная пчела. Изучались также насекомые — возможные пере-
носчики инфекций на предприятиях пищевой и бродильной про-
мышленности — плодовая мушка и комнатная муха. Объектом
исследования служили и места обитания указанных насекомых —
листья шелковицы, ульи, цветы медоносных растений, овощи и
фрукты, заводское оборудование и т. д.
Пищеварительный тракт пчел и тутового шелкопряда препа-
рировали по способу Е. Н. Павловского (1957). Отпрепарирован-
ный кишечник одного насекомого вместе с содержимым взвешива-
ли в стерильном бюксе и тщательно гомогенизировали, добавляя
стерильный физиологический раствор. При исследовании молочно-
кислых бактерий у мух и дрозофил их (в количестве 30—100
штук) усыпляли парами эфира, быстро обрабатывали спиртом,
остатки которого удаляли пламенем, взвешивали и растирали
в стерильном бюксе до получения гомогенной суспензии. С внеш-
них покровов насекомых, стенок и рамок ульев, а также с цвет-
ков и листьев растений делались смывы. Количественный учет
молочнокислых бактерий проводили на среде МРС. Штаммы
идентифицировали с помощью описанных выше методов.
Способность молочнокислых бактерий развиваться в кишеч-
ном тракте насекомых изучали на гусеницах тутового шелкопря-
да моновольтинной породы пятого возраста. С этой целью личи-
нок предварительно расселяли по 100 штук в отдельные садки
248
и инфицировали путем введения микробной суспензии (1 млн.
клеток в 1 мл) шприцем в количестве 0,02 мл на одну гусеницу.
В контроле вводили гусеницам того же возраста по 0,02 мл сте-
рильного раствора Рингера (Роскин, Левинсон, 1957). Измерение
pH кишечного содержимого проводили стеклянным микроэлектро-
дом на pH-метре МПМ-60 М по методу В. П. Приставко (1964).
Для обработки цифрового материала применяли методы матема-
тической статистики (П. Ф. Рокицкий, 1967).
Медоносная пчела (Apis mellifera L.). Пчелы, подвергавшиеся
изучению, были отобраны из сильной, средней и слабой семей. Ис-
следования показали, что независимо от силы пчелиной семьи,
кишечник опытных насекомых был свободен от молочнокислых
бактерий на первом этапе их развития. Они не выявлялись во всех
возрастах личиночной стадии и в имагинальной фазе непосред-
ственно после выхода молодых пчел из ячеек. Отрицательные ре-
зультаты получены также при исследовании молочнокислых бак-
терий в кишечнике 4—12-дневных пчел, что, возможно, объясня-
ется обитанием насекомых в этот период строго в рамках улья. В
кишечнике пчел 13—21-дневного возраста мы обнаруживали де-
сятки тысяч клеток молочнокислых бактерий в 1 г содержимого,
а в возрасте 22—40 дней их насчитывались сотни миллионов,
что, на наш взгляд, было вызвано сменой функций и места обита-
ния пчел в этом возрасте.
Видовой состав молочнокислых бактерий в кишечном тракте
рабочих пчел представлен как палочковидными формами — Lacto-
bacillus plantarum, так и кокковыми — Streptococcus faecalis,
Str. faecalis var. zymogenes, Str. faecalis var. liquefaciens, Str. fa-
ecium, Str. durans. Доминирующее положение занимали Str. faeci-
um (30,0%), энтерококки co свойствами Str. faecalis и Str. faecium
(37,5%) и незначительное место — гетероферментативные кокки
со свойствами энтерококков (до 3,6%).
Наши исследования показали, что содержание молочнокис-
лых бактерий в кишечном тракте рабочих пчел подвержено зна-
чительным изменениям в зависимости от времени года. Так,
в одном грамме содержимого кишечника пчел, находившихся
в зимовнике до первых вылетов, обнаруживались всего сотни
клеток, а весной, к середине мая,— десятки тысяч; к началу цве-
тения медоносных растений их насчитывалось десятки миллионов,
а максимум — в разгар цветения медоносов. Начиная с июля,
количество молочнокислых бактерий в кишечнике пчел постепен-
но уменьшалось, и в сентябре мы обнаруживали всего лишь де-
сятки тысяч их клеток в кишечнике взрослых особей (рис. 18, а).
Видовой состав молочнокислых бактерий пчел также изменя-
ется на протяжении года. В период зимовки регистрировались
кокковые (Str. faecium) и палочковидные (L. plantarum) формы.
К началу лёта пчел за взятком микробный фон стал разнообраз-
нее за счет представителей группы энтерококков. В разгар цвете-
ния медоносных растений в кишечнике пчел-сборщиц нектара
249
и пыльцы обнаруживаются только Str. faecium и энтерококки со
свойствами Str. faecalis и Str. faecium. В августе число видов
энтерококков увеличивается и вновь появляется L. plantarum.
В раннеосенний период кокковые формы молочнокислых бактерий
исчезают из состава микрофлоры пчел, уступив место палочковид-
ным формам — L. plantarum.
Тутовый шелкопряд (Bombyx mori L.). Непосредственный
контакт тутового шелкопряда с окружающей средой осуществля-
ется в личиночной стадии, для которой характерно чередование
периодов активного питания с фазами полного покоя (сна). Сме-
на этих периодов означает переход гусениц младшего возраста
в старший.
Проследив количественный и видовой состав молочнокислых
бактерий содержимого кишечного тракта личинок тутового шел-
копряда моно- и поливольтинной пород в разных возрастах, мы
установили, что число этих микроорганизмов постепенно увели-
чивается с возрастом насекомого: от тысяч клеток (на 1 г содер-
жимого кишечника) во втором и третьем возрастах и до сотен
тысяч в последнем, пятом возрасте, личиночной стадии тутового
шелкопряда. Переход личинок в стадию куколок влечет за собой
исчезновение молочнокислой флоры, что, возможно, объясняется
физиологическим состоянием насекомого в этой фазе, характери-
зующейся процессами гистолиза (рис. 18, б).
Рис. 18. Количество молочнокислых бактерий в содержимом кишечника
(на 1 г)
а — Apis mellifera L. в разное время года; С — Bombyx mori L. на разных стадиях раз-
вития
250
Видовой состав молочнокислых бактерий кишечного тракта
гусениц тутового шелкопряда, в основном, представлен различны-
ми видами энтерококков — Str. faecalis, Str. faecium, Str. durans,
энтерококками co свойствами Str. faecalis и Str. faecium. Иногда
выделяются гетероферментативные кокки со свойствами энтеро-
кокков. Изолирован из содержимого кишечника гусениц тутового
шелкопряда пятого возраста и штамм Lactobacillus cellobiosus.
Комнатная муха (Musca domestica L.) и дрозофила (Drosophi-
la melanogaster). Выделение молочнокислых бактерий из содер-
жимого кишечного тракта мелких насекомых связано с техничес-
кими трудностями. Поэтому количественное определение этой
группы микроорганизмов проводили по отношению к весу одной
особи. Исследовали комнатных мух и дрозофил в раннеосенний
период, когда проходила массовая переработка овощей, фруктов
и винограда.
В среднем количество молочнокислых бактерий в организме
дрозофил достигает десятков миллионов клеток на одно насеко-
мое. У комнатных мух их значительно меньше — до двух мил-
лионов.
Содержание молочнокислых бактерий в организме плодовой
мушки зависит от места ее обитания. В цехах консервного завода
их насчитывалось от десятков тысяч до сотен миллионов в орга-
низме одной особи. Дрозофилы, обитавшие на зрелых гроздьях
винограда, содержали лишь от десятков до сотен бактериальных
клеток; на дрозофилах же, отловленных на винодельческих заво-
дах Средней Азии в сезоны переработки винограда, мы обнару-
живали десятки и сотни миллионов клеток этих бактерий в пере-
счете на одно насекомое. У комнатных мух подобной зависимости
в отношении количественного содержания молочнокислых бакте-
рий мы не наблюдали (табл. 49).
Молочнокислые бактерии дрозофил представлены группой эн-
терококков (Str. faecalis, Str. faecium, Str. faecalis var. zymogenes,
энтерококками co свойствами Str. faecalis и Str. faecium), гете-
роферментативными кокками co свойствами энтерококков и L. plan-
tarum, составляющими почти половину всех выделенных от дро-
зофил штаммов. У комнатных мух доминируют L. plantarum.
Кокковая микрофлора бедца в видовом отношении и состоит толь-
ко из Str. faecalis и энтерококков со свойствами Str. faecalis и Str.
faecium (табл. 49).
На внешних покровах насекомых количественное содержание
молочнокислых бактерий определяется видом хозяина. Больше
всего (десятки миллионов) их обнаруживается на гиподерме гу-
сениц тутового шелкопряда независимо от возраста насекомого и
лишь единичные клетки — на внешних покровах комнатных мух
и дрозофил. На поверхности тела пчел количество молочнокис-
лых бактерий зависит от места обитания насекомого: ульевые пче-
лы содержат сотни бактериальных клеток, а летающие за взят-
ком — миллионы.
251
Таблица 49
Видовой и количественный состав молочнокислых бактерий в организме
дрозофил и комнатных мух (на одно насекомое)
Место отлова насекомых Дата исследо- вания (1967 г.) Количество бактерий при температуре инкубации Вид
28° 40°
Д розофила
Консервный завод, цех 1.IX 3,3-106 3,3-10» Str. faecalis, Str. fae-
по разделке яблок 4. IX. 1,9-104 1,9-10» cium, энтерококки co
4.IX 2,4-Ю4 2,4-10» свойствами Str. faeca-
4.IX 0,5-10’ 0,5-10» lis и Str. faecium, Str.
То же, слив 6.IX 0,9.10s 0,9-10» faecalis var. zymo де-
nes, гетерофермента-
» томатов b.iX 3,4-106 3,4-10» тнвные кокки, L. plan-
Консервы «Зеленый го- 6.IX 1,9-10’ 1,9-10’ tarum
рошек»
Винзавод совхоза «КИМ», 12.IX 0,4-108 0,4-10»
виноградный жом 12.IX 0,4-10» 0,4-104
14.IX 2,8-10 Не обна-
ружены
То же, виноград 14.IX 2,3-10» 2,3-10
» оборудование 12.IX 0,4-104 Не обна-
ружены
Муха комнатная
Территория консервного 8.IX 1,6-10» — L. plantarum, Str.
завода 8.IX 1,6-10» — faecalis, энтерококки
9.IX 0,8-10’ — co свойствами Str. fae-
9.IX 0,8-10» — calis и Str. faecium
12.IX 1,5-10» __
12.IX 1,5-10» —
Видовой состав микрофлоры внешних покровов насекомых ме-
нее разнообразен. У гусениц тутового шелкопряда нами изоли-
рован лишь Str. faecium, а у комнатной мухи только L. plantarum.
На поверхности тела медоносных пчел и плодовых мушек обна-
руживаются энтерококки (рис. 19), гетероферментативные кок-
ки со свойствами энтерококков и L. plantarum.
Изучение видового и количественного состава молочнокислых
бактерий мест обитания насекомых показало, что чем шире круг
объектов, посещаемых ими, тем разнообразнее микробный фон
среды их обитания.
В улье, в смывах с рамок и стенок его найдены всего лишь
единичные клетки молочнокислых бактерий на площади 10 см2.
Несколько больше бактерий изолировано из перги, взятой из сот.
На цветах медоносных растений количество молочнокислых бак-
терий зависит от вида растения. Постоянно в большом количест-
ве изолировались молочнокислые бактерии с поверхности листьев
шелковицы. Число бактериальных клеток на 1 г исследуемого
252
листа в среднем составило 2 • 10?. На томатах, сливах, бобах зеле-
ного горошка количество их было ничтожным — оно не превышало
десятка клеток на поверхности одного плода. На яблоках и зре-
лых гроздьях винограда молочнокислые бактерии отсутствовали.
Рис. 19. Колонии Streptococcus
faecium, выделенные с внеш-
них покровов дрозофилы, на
агаре МРС с мелом, возраст
48 час., X 5
Видовой состав исследуемых бактерий среды обитания и корма
насекомых близок к обнаруживаемому в микрофлоре кишечного
тракта и внешних покровов и представлен как кокковыми, так и
палочковидными формами.
Некоторые особенности молочнокислых бактерий,
изолированных из насекомых
Остановимся вкратце на характеристике штаммов кокковых
и палочковидных форм молочнокислых бактерий, выделенных на-
ми из насекомых.
Энтерококки. Кокковые формы этой группы составляют пре-
обладающую часть выделенных и изученных нами культур.
Для идентификации штаммов группы использовали следую-
щие бактериальные признаки: сбраживание различных углеводов
и спиртов (23 источника углерода), способность расти при 50 и
10°, восстановление лакмуса и метиленовой сини в молоке через
восемь часов инкубации, восстановление 2, 3, 5-трифенилтетра-
золий хлорида, гемолитическая активность, усвоение цитрата, раз-
жижение желатина, образование аммиака из аргинина. Изучив
указанные свойства у 183 штаммов, мы установили, что только у
74 наблюдается корреляция определенных признаков, по кото-
рым нам удалось определить их видовую принадлежность. Из ки-
шечного тракта насекомых, их внешних покровов и среды обита-
ния часто выделяли штаммы, имеющие одновременно свойства
как Str. faecalis, так и Str. faecium. Следует отметить, что в орга-
низме пчел, тутового шелкопряда, плодовых мушек, а также на
поверхности пчел и мушек мы обнаружили представителей кок-
ковых форм бактерий, которых также отнесли к группе энтеро-
кокков, хотя они и обладали способностью продуцировать неболь-
шие количества газа из глюкозы.
253
Нами не отмечено существенных различий в свойствах отдель-
ных видов энтерококков, изолированных из разных источников.
Палочковидные молочнокислые бактерии из кишечного трак-
та насекомых выделяются реже. Мы изолировали и изучили
40 штаммов; подавляющее большинство из них является гомофер-
ментативными и отнесены к виду L. plantarum.
Свойства штаммов L. plantarum, выделенных от различных на-
секомых, близки. Исключение составляют лишь штаммы, изоли-
рованные от пчел; они обладают способностью активно сбражи-
вать ксилозу.
От гусениц тутового шелкопряда выделен штамм, отнесенный
к виду L. cellobiosus. В содержимом кишечника различных насе-
комых находили и лактобациллы, по свойствам близкие к пред-
ставителям подрода Thermobacterium.
Способность молочнокислых бактерий размножаться
в кишечном тракте насекомых
В литературе, как указывали мы выше, существует мнение о
том, что количество микроорганизмов в кишечнике насекомого за-
висит от величины его pH. С. Я. Демяновский и В. А. Рождест-
венская (1958) отмечают, что у тутового шелкопряда pH кишеч-
ного содержимого у личинок всех возрастов поддерживается по-
стоянно на уровне 9,6—9,7. Эти условия неблагоприятны для
развития молочнокислых бактерий. Е. Н. Михайлов (1958) утвер-
ждает, что в кишечнике гусениц тутового шелкопряда не проис-
ходит размножения бактерий вследствие высокой щелочности ки-
шечного сока насекомого.
Проведя многочисленные измерения pH содержимого кишеч-
ника гусениц тутового шелкопряда на протяжении всех дней
пятого возраста, мы установили, что величина pH не является по-
стоянной. Изменения ее в среднем находятся в интервале 8,9—9,4,
иногда она достигает 9,5.
Учитывая неблагоприятные условия для обитания молочно-
кислых бактерий в кишечнике гусениц, а также тот факт, что pH
влияет на количество микроорганизмов, мы проследили те изме-
нения, которые происходят в кишечном тракте насекомых при
инфицировании их культурой молочнокислых бактерий. Опыты
проводили на гусеницах пятого возраста. Выкормка насекомых
проходила в разные годы при различных погодных условиях, од-
нако результаты получились однотипные.
Гусениц инфицировали культурами Str. durans, Str. faecium и
энтерококками со свойствами Str. faecalis и Str. faecium, выделен-
ными ранее из содержимого кишечника личинок тутового шелко-
пряда. У насекомых, которым была введена per os суспензия мо-
лочнокислых бактерий, наблюдалось постепенное увеличение ко-
личества этих микроорганизмов в кишечном тракте, начиная с ты-
сяч клеток (в 1 г содержимого) в первые сутки и до миллионов —
254
на седьмые. Величина pH содержимого равномерно снижалась
(при увеличении количества бактерий ) от 9,0 до 7,6—7,5; у конт-
рольных гусениц мы не наблюдали изменений в составе кишеч-
ной микрофлоры.
Сравнительное ежесуточное изучение физиологического сос-
тояния опытных и контрольных насекомых показало, что сущест-
венных различий в развитии обеих партий насекомых не наблю-
далось. Опытные и контрольные личинки одинаково прибавляли
в весе и мало отличались от насекомых общей выкормки, что, на
наш взгляд, весьма важно, ибо этот факт говорит о безвредности
исследованных штаммов энтерококков для гусениц тутового шел-
копряда в пятом возрасте.
Рыбы
Среди довольно обширной литературы, посвященной изуче-
нию микрофлоры рыб, данные о группе молочнокислых бактерий
весьма скудны. Большинство исследователей либо совсем не сооб-
щает о выделении этих микроорганизмов, либо отмечает лишь на-
личие их наряду с другими группами.
Феллере (Fellers, 1926) из слизи лососей изолировал молоч-
нокислые бактерии рода Streptococcus. О грамположительных, не-
спорообразующих кокках, выделенных из желудков пикши (раз-
новидность трески), сообщили Рид и Спенс (Reed, Spence, 1929).
Молочнокислые бактерии родов Lactobacillus и Streptococcus об-
наружили в желудке лососей Северного моря Сноу и Берд (Snow,
Beard, 1939). Среди 1838 изолированных авторами культур па-
лочковидные формы молочнокислых бактерий составили 21%,
кокковые — 0,2%. Наличие лактобацилл в микрофлоре иных мор-
ских рыб (макрелей, скумбрии) отметили и другие авторы (Ki-
ser, Beckwith, 1944).
Молочнокислые бактерии были изолированы не только из мор-
ских, но и из пресноводных рыб. Их выделили из пресноводных
окуней Северной Америки; они составили 4% от общего числа
найденных микроорганизмов (Emerson et al., 1966; Kazanas, 1966,
1968). Представителей рода Streptococcus обнаружили и в пище-
варительном тракте пресноводных рыб Западной Африки (Du-
rand, Toumanoff, 1967).
Изучению специально молочнокислых бактерий рыб было по-
священо незначительное количество работ (Kraus, 1961; Meyer,
1961; Priebe, 1962 и др.). Шредер (Schroder, 1964), исследуя слизь
свежевыловленной рыбы (трески, морского окуня, сайры, палту-
са, зубатки, сельди), выделил гомоферментативные (L. plantarum,
L. delbrueckii), гетероферментативные (L. fermenti и близкие
к L. buchneri и L. fermenti) лактобациллы, а также L. bifidus.
Однако этот автор так же, как и Мейер (Meyer, 1962), полагал,
что молочнокислые бактерии не являются нормальными компонен-
тами микрофлоры рыб, а заносятся путем вторичной инфекции.
Мы совместно с Н. К. Коваленко и Л. Г. Материнской изуча-
255
ли молочнокислые бактерии прудовых рыб семейства карповых:
карпа, белого толстолобика, пестрого толстолобика. Бактерии вы-
деляли на среде МРС-1 при 28 и 40°. Работу проводили на опыт-
ной базе «Нивка» Украинского института рыбного хозяйства, где
в разные сезоны года исследовали только благополучные в инфек-
ционном отношении пруды.
Молочнокислые бактерии были обнаружены на внешних по-
кровах и в пищеварительном тракте рыб.
На стадии икринок молочнокислых бактерий мы не находили.
У личинок пестрого и белого толстолобика, независимо от их воз-
раста, молочнокислые бактерии или вовсе не выявлялись, или их ко-
личество было незначительным (до десятка клеток на 1 г веса ли-
чинок) . Сеголетки этих видов рыб содержали сотни и тысячи ис-
следованных бактерий в 1 мл кишечного содержимого. Число их у
сеголеток снижалось до десятков клеток к осени. На коже белого
толстолобика молочнокислые бактерии выявлялись только в начале
августа, тогда как на поверхности тела пестрого толстолобика они
присутствовали почти всегда (102—103 клеток на 1 см2).
Интересно отметить, что на стадии малька в 1 мл кишечного
содержимого прудового карпа нам удавалось обнаруживать сотни
миллионов клеток молочнокислых бактерий, т. е. гораздо больше,
чем у карпов старших возрастов. Возможно, это определяется бо-
лее обильным искусственным подкармливанием рыб в этом возрас-
те. У сеголеток карпа, независимо от возраста и сезона года, число
молочнокислых бактерий составляло десятки и сотни миллионов
клеток в 1 г содержимого кишечника. Число молочнокислых бак-
терий на кожных покровах карпа было непостоянно и колебалось
от десятков до миллионов клеток в 1 см2.
Изолированные молочнокислые бактерии представлены кокко-
выми и палочковидными формами (стрепто-, бета- и термо-
бактерии) .
Особый интерес представляют изолированные нами с кожных
покровов сеголеток и из кишечного содержимого карпа штаммы
подвижных, каталазонегативных, анаэробных палочковидных бак-
терий, близких по ряду свойств к молочнокислым бактериям
(рис. 20). Концы клеток бактерий одного из штаммов были не-
сколько утолщены, принимая спороподобную форму (рис. 21).
В прудовой воде, в которой обитали исследованные рыбы, со-
держание молочнокислых бактерий нарастало к осени. В октябре
в 1 мл воды насчитывались миллионы клеток. Они обнаружены и
в иле — тысячи и десятки тысяч клеток в 1 г. Несколько меньше
данных бактерий на прудовых растениях — до сотен клеток в 1 г
растения.
Как показали наши исследования, молочнокислые бактерии
входят и в состав нормальной микрофлоры желудочно-кишечного
тракта рыб искусственных водоемов (Кременчугское водохранили-
ще). Изучались главным образом рыбы, имеющие промысловое
значение — язь, лещ, щука, судак, сазан, синец, плотва. Было по-
256
Рис. 20. Колонии подвижных молоч-
нокислых бактерий Lactobacillus
spp.
а — штамм 38, изолированный с поверх-
ности кожи карпа;
б — штамм 114, изолированный из кишеч-
ного содержимого карпа
Рис. 21. Молочнокислые бактерии
Lactobacillus sp. штамм 114, изоли-
рованные из кишечного содержимо-
го карпа
казано, что количественный состав молочнокислых бактерий у этих
видов рыб колеблется в зависимости от характера питания, стадии
развития, возраста рыб, сезона года. Эти данные подтверждают
результаты, полученные при исследовании молочнокислых бакте-
рий прудовых рыб. В то же время в организме рыб внутренних
водоемов видовой состав молочнокислых бактерий несколько от-
личается: на протяжении весенне-летнего сезона превалируют лак-
9 Е. И. Квасников, О. А. Нестеренко 257
тобациллы. Количество молочнокислых палочек в содержимом же-
лудочно-кишечного тракта, жабер, кожных покровов исчисляется
миллионами в 1 г исследуемого материала весной и достигает де-
сятков и сотен миллионов в летние периоды.
Интересно отметить, что среди исследованных штаммов молоч-
нокислых бактерий, изолированных из рыб искусственных водо-
емов, довольно часто выявляются анаэробные, подвижные па-
лочковидные лактобациллы.
Исследования, проведенные отечественными и зарубежными
авторами, а также данные собственных работ, показывают, что в
кишечном тракте насекомых, принадлежащих к различным систе-
матическим группам, обитают молочнокислые бактерии (стрепто-
кокки, лактобациллы, бифидобактерии).
Количество и видовой состав их определяется видом насекомо-
го, стадией его развития, возрастом, физиологическим состоянием,
особенностями воздействия низкой активной кислотности кишеч-
ного сока и характером питания.
У пчел молочнокислые бактерии не выявляются в личиночной
стадии и в первые дни имагинальной стадии. Они начинают обна-
руживаться в кишечном тракте медоносных пчел, начиная с двух-
недельного возраста. Количество их возрастает и достигает макси-
мума (сотен миллионов клеток в 1 г содержимого) в период мас-
сового цветения медоносных растений, затем снижается осенью и
резко падает (до сотен клеток) зимой.
У тутового шелкопряда молочнокислые бактерии выявляются
только в личиночной стадии. Количество их в кишечном тракте
увеличивается в процессе роста гусениц и достигает максимума в
пятом возрасте (сотни тысяч клеток в 1 г содержимого). Мухи и
дрозофилы содержат сотни миллионов клеток на 1 г веса.
Находятся молочнокислые бактерии и на внешних покровах
насекомых.
Из кишечного тракта названных насекомых чаще всего изоли-
руются кокковые формы молочнокислых бактерий (Str. faecium,
Str. faecalis, Str. faecalis var. liquefaciens, Str. faecalis var. zymo-
genes, а также Str. durans). Многие выделенные энтерококки об-
ладают свойствами двух или более видов. Изредка удается нахо-
дить энтерококки, образующие газ из глюкозы. Лактобациллы
представлены, преимущественно, L. plantarum.
В опытах с гусеницами тутового шелкопряда показано, что мо-
лочнокислые бактерии (стрептококки) обладают способностью ак-
тивно размножаться в кишечном тракте насекомого и не являются
патогенными.
Насекомые играют роль существенного экологического факто-
ра, обусловливающего распространение молочнокислых бактерий
в природе.
258
Приведенные данные свидетельствуют также о том, что мо-
лочнокислые бактерии являются обитателями кишечного тракта и
внешних покровов морских и пресноводных рыб. Удается обнару-
живать как гетероферментативных, так и гомоферментативных
представителей родов Lactobacillus, Streptococcus, а также бифи-
добактерии.
ВЗАИМООТНОШЕНИЕ МОЛОЧНОКИСЛЫХ БАКТЕРИЙ
С ДРУГИМИ МИКРООРГАНИЗМАМИ
Молочнокислые бактерии, развиваясь в природных и производст-
венных субстратах, вступают в сложные взаимоотношения с дру-
гими микроорганизмами. Характер этих взаимоотношений зависит
от многих факторов. Существенную роль играет видовая принад-
лежность совместно развивающихся микроорганизмов и даже
штаммы их. Направленность взаимоотношений в большей степени
определяется условиями среды обитания и может изменяться в
процессе развития микроорганизмов.
Антагонизм молочнокислых бактерий и их антибиотики
Антагонистические свойства молочнокислых бактерий стали сти-
хийно применять в практике уже в глубокой древности. Консер-
вирующее действие молочнокислого брожения использовали при
заквашивании овощей, фруктов, силосовании кормов, засолах ры-
бы; в квашеных овощах хранили мясо.
Продукты жизнедеятельности молочнокислых бактерий, веро-
ятно, были одними из первых антисептиков микробного происхож-
дения народной медицины. Кисломолочные продукты применяли
для лечения ожогов и ран. В Узбекистане и других местностях
Средней Азии с этой целью использовали сузьму, предварительно
выдержанную в мешочке, закопанном в землю. Аналогичным обра-
зом на севере России для лечения использовалась сметана. Очень
давно и широко многие народы кисломолочные продукты употреб-
ляли для профилактики и лечения желудочно-кишечных заболева-
ний. Находили применение в лечебных целях и рассолы квашеных
овощей и фруктов.
Во всех этих продуктах в той или иной степени антагонисти-
ческие свойства молочнокислых бактерий нередко сочетались с ан-
тагонистическими свойствами дрожжей, развивающихся с ними
в сообществе.
Но не всегда эти свойства молочнокислых бактерий оказыва-
лись полезными. При развитии на ряде пищевых продуктов, в бро-
дильной промышленности и т. д. молочнокислые бактерии могут
подавлять полезные микроорганизмы и приносить вред.
И. И. Мечников первый привлек внимание исследователей к
использованию антагонистических свойств молочнокислых бакте-
259
9*
рий в борьбе с гнилостной микрофлорой кишечного тракта. Он по-
лагал, что всасывание продуктов жизнедеятельности гнилостных
микробов, обитающих в кишечном тракте человека, оказывает от-
равляющее действие и вызывает преждевременное старение его.
Для борьбы с преждевременной старостью он рекомендовал систе-
матическое употребление в пищу простокваши, приготовленной на
штаммах болгарской палочки. Однако дальнейшими исследовани-
ями было показано, что штаммы бактерий, выделяемые из болгар-
ской простокваши, не обладают способностью приживаться в ки-
шечном тракте. Вместе с тем, путь, идти по которому звал великий
исследователь, путь использования «благодетельных микробов» в
борьбе с вредными, явился одним из наиболее прогрессивных
в биологической науке и оказал огромное влияние на развитие
учения об антагонизме микроорганизмов и антибиотиках.
Факты подавления молочнокислыми бактериями различных
микроорганизмов, особенно аммонифицирующих, вначале поясня-
лись лишь подавляющим действием органических кислот (в первую
очередь молочной), образуемых бактериями. И действительно, эти
продукты брожения играют существенную роль в борьбе с конку-
рентными микроорганизмами.
Возникла обширная литература вопроса. Взаимоотношения мо-
лочнокислых бактерий с различными микроорганизмами всесто-
ронне исследуются.
Развитие в течение последних десятилетий учения об антибио-
тиках, разработка методов их исследования и, особенно, выделения
в чистом виде, позволили не только поставить, но и решить вопрос
о том, является ли антагонизм молочнокислых бактерий исключи-
тельно их свойством как кислотообразователей или же они облада-
ют способностью образовывать специфические антибиотики.
Расхождения во взглядах на природу антагонистического дей-
ствия молочнокислых бактерий особенно остро выявились при
трактовке характера влияния их на микрофлору кишечного тракта
человека и животных, в частности, на бактерии кишечно-тифозно -
дизентерийной группы. Дискутировался вопрос, обусловливается
ли антагонистическое действие молочнокислых бактерий исключи-
тельно влиянием образуемых ими органических кислот, или дей-
ствие данных бактерий вызывается специфическими антибиоти-
ческими веществами.
В последние десятилетия ряду исследователей удалось обнару-
жить среди молочнокислых бактерий явления специфического анта-
гонизма, не сводимого полностью к действию продуцируемых ими
органических кислот, и показать, что они синтезируют антибио-
тики, хотя и не обладающие высокой активностью. Так, Streptococ-
cus lactis, например, выделяет низин (Mattick, Hirsch, 1944, 1947),
Str. cremoris — диплококцин (Oxford, 1944), Lactobacilus acido-
philus— ацидофилин и лактоцидин (Vincent et al., 1959), L. plan-
tarum — лактолин (Kodama, 1953), L. brevis — бревин (Квасников,
Суденко, 1967a, б).
260
Антибиотические свойства молочнокислых кокков
Значительное количество работ было посвящено изучению анта-
гонистических свойств молочнокислых кокков и образуемых ими
антибиотиков.
Роджерс (Rodgers, 1928) считал, что смена микрофлоры при ес-
тественном сквашивании молока объясняется антагонистическим
действием молочнокислых бактерий (Str. lactis) и развивающихся
позже Bact. casei. Антагонистическое действие, по мнению автора,
зависит от накопления ингибирующего вещества, стойкого к наг-
реванию в кислой среде, и способности к адсорбции на фарфоро-
вых фильтрах.
Были сделаны наблюдения, что молоко после размножения в
нем некоторых штаммов Str. cremoris и штаммов, близких к Str.
mastitidis, приобретает антибиотические свойства по отношению к
ацидофильной палочке, и будучи после прогрева засеянным ею, не
сквашивается (Whitehead, 1933, и др.).
Дальнейшие исследования пошли по пути изыскания отдель-
ных антагонистов, выделения продуцируемых ими антибиотичес-
ких веществ и изучения их свойств.
Антибиотическое вещество, образуемое Str. cremoris, было изу-
чено Оксфордом (Oxford, 1944) и названо им диплококцином. Он
накапливается в среде при ее кислой реакции. Растворим в воде и
нерастворим в абсолютном этиловом спирте. По-видимому, это про-
теиноподобное вещество с относительно небольшим молекулярным
весом, не содержащее серы и фосфора. Диплококцин не теряет
активности после кипячения в кислой среде (с добавлением 0,4%
уксусной кислоты) в течение двух часов, но инактивируется в ще-
лочной. В бульоне диплококцин при pH , 7 сохраняется в течение
недели.
Меттик и Хирш (Mattick, Hirsch, 1944, 1947) из культуры Str.
lactis выделили антибиотик низин.
В настоящее время установлено, что низин — полипептид с мо-
лекулярным весом 3500, по аминокислотному составу и другим
свойствам сходный с субтилином (Gross et al., 1969). На основа-
нии механизма биосинтеза и небольшого молекулярного веса
антибиотика предполагают, что низин является не полипептидом,
а основным белком, составляющим 20% от всех основных белков
(не являющихся антибиотиками), синтезируемых стрептококком-
продуцентом (Hurst, 1966, 1967). Большая часть низина связана
с мембранами и клеточными стенками, где он находится не в
свободном состоянии, а в комплексе с другими полимерами, обра-
зуя кальций-низиновый комплекс (Hurst, Lasarus, 1968; White,
Hurst, 1967, 1968).
В клетках Str. lactis низин принимает участие в функциях кон-
тролирующего механизма, который задерживает начало нового
роста продуцента, но не влияет на скорость его роста. Во время
лаг-фазы синтеза антибиотика не происходит, в отличие от синтеза
261.
других внутриклеточных белков (Hurst, 1966, 1967; Hurst, Dring,
1968).
Антибиотик бактериостатически действует на пропионовокислые
бактерии, стафилококки, сардины, но не подавляет рост дрожжей,
плесеней и грамотрицательных бактерий. Термоустойчивость бак-
териальных спор снижается под действием низина. Адсорбируясь
на их поверхности, антибиотик нарушает проницаемость цитоплаз-
матической мембраны и ингибирует размножение клеток.
Низин может угнетать развитие и некоторых молочнокислых
бактерий. Отсюда понятно, почему применение в сыро- и маслоде->
лии смешанных заквасок, содержащих низинобразующие стрепто-
кокки, не давало должных результатов. (Луковникова, 1961; Denny
et al., 1961; Teply, 1962, и др.).
Чувствительные к низину бактерии при длительном культиви-
ровании в его присутствии приобретают определенную резистент-
ность к антибиотику.
Низин разрушается многими микроорганизмами. Так, по дан-
ным Гейлслута (Galesloot, 1956), его инактивировало около 50%
штаммов стрептококков, выделенных из сырого молока. Разруше-
ние низина происходит и под действием фильтратов культур за
счет возможного образования неадаптивного экзофермента низи-
назы. Было установлено (Jarvis, 1967), что ферменты, выделенные
из Вас. polymyxa, способны инактивировать низин в результате
превращения низина А в его малоактивные формы.
Механизм действия низина на клетки связывают со способ-
ностью его реагировать с сульфгидрильными группами и таким
образом выключать действие ряда важных ферментов (глутатион,
ацетилкоэнзим A) (Gross, Morell, 1967).
В лабораторных исследованиях разработан ряд сред и оптими-
зированы условия для интенсивного роста продуцента и накопления
им антибиотических веществ (Баранова, Егоров, 1967, 1969, 1973;
Егоров и др., 1968, 1973; Козлова и др., 1972). В промышленных
условиях низин получают главным образом на обрате и сыворотке
(Шкундова, 1968).
Антибиотик не токсичен; его используют для лечения мастита
у коров (Овчарова, Масленникова, 1969); есть данные и о антима-
лярийном действии низина (Gross, Morell, 1967).
Низин не нашел применения в медицине, так как плохо раство-
рим в жидкостях с нейтральной реакцией. Использование низина в
пищевой промышленности разрешено органами здравоохранения
во многих странах (СССР, Англия, ФРГ, Австралия и др.). Его
используют главным образом при консервировании продуктов для
предотвращения порчи их термофильными споровыми бактериями
(консервирование овощей, ряда фруктов, супов, соусов, свиных и
говяжьих изделий и т. д.). Добавление 100—200 мг низина на 1 кг
продукта сокращает время стерилизации и предотвращает плоско-
кислую порчу их (Овчарова, 1972; Jarvis, Morisetti, 1969). В мо-
лочной промышленности низин применяют для сокращения време-
262
ни пастеризации молока без сахара, для улучшения качества
плавленых сыров.
У нас в стране Всесоюзным научно-исследовательским институ-
том консервной и овощесушильной промышленности разработан
способ консервирования с помощью низина зеленого горошка, то-
матного сока, гарнирных моркови и свеклы, ряда заправок, овощ-
ных закусок и т. д. (Овчарова, 1972).
Методы для изыскания продуцентов низина и изучения его ак-
тивности в настоящее время хорошо разработаны.
Чашечный метод, основанный на диффузии в агар активного
начала, дает возможность обследовать значительное число образцов
и оценить активность продуцента по величине зон угнетения роста
тест-культуры вокруг цилиндриков или фильтровальных дисков с
испытуемым веществом (Neri, 1962). Но низин не способен быстро
диффундировать в агаровых средах (Hirsch, Wheater, 1951). Зоны,
в которых отсутствует рост тест-объекта, появляются лишь в том
случае, когда чашки Петри предварительно выдерживают в холо-
дильнике в течение одних-двух суток. За это время низин успевает
продиффундировать в среду; при последующей инкубации чашек
в термостате наблюдается угнетение роста тест-культур (Beach,
1952).
Антибиотическое действие низина можно наблюдать и в про-
бирках с агаризованной средой. Для этого в расплавленную среду
засевают тест-культуру и быстро охлаждают ее «столбиком», на
поверхность которого наливают испытуемый раствор, после чего
пробирки выдерживают на холоде. Антибиотик диффундирует в
твердую среду, и если затем пробирки поместить в термостат, то
под слоем жидкости наблюдается торможение роста культуры. Эта
методика удобна при выявлении низина в культуральной жидкости
различных штаммов стрептококков. Скорость диффузии низина
увеличивается при добавлении в агар низких концентраций твина
80 и крила 10 или 20; при этом достаточно только суточной экспо-
зиции (Beach, 1952). Метод дает возможность изучать антагонисти-
ческую активность нестерильных жидкостей и культуральных сред.
Все остальные способы определения антибиотической активности
требуют стерильности и прозрачности исследуемого раствора
(Егоров, 1957; Berridge, Barrett, 1952).
Одним из наиболее распространенных методов, используемых
при исследовании антибиотиков, является метод серийных разве-
дений. Однако он имеет ряд недостатков — трудность получения
культуральной жидкости, лишенной бактериальных клеток; по-
явление в небольших концентрациях антибиотических веществ
устойчивых форм, препятствующих учету реакции; трудоемкость
работы (Егоров, 1957; Чизар, Пулей, 1958; Oxford, 1944; Ritter,
1951; R. Nilsson, G. Nilsson, 1958).
При испытании бактерицидного действия низина можно приме-
нить и турбидиметрический метод (Berridge, Barrett, 1952; Vincent
et al., 1959), основанный на определении мутности суспензии
263
тест-культур, растущих в присутствии небольших количеств анти-
биотика.
Для выявления низина в продуктах применяют следующие ме-
тоды: 1) метод серийных разведений с использованием чувстви-
тельной к низину культуры Str. cremoris. О присутствии антибио-
тика судят по скорости восстановления метиленовой сини или
резазурина в обезжиренном молоке; 2) турбидиметрический метод
с использованием тест-культуры Str. agalactiae; 3) пластинчато-
диффузионный, где тест-культурой служит L. lactis (Овчарова,
1972; Гудков и др., 1973).
Гирш и Витер (Hirsch, Wheater, 1951) утверждали, что из всех
культур молочнокислых стрептококков, выделенных из свежего и
пастеризованного молока, сыра, человеческих, бычьих и свиных
фекалиев, а также отделяемого носоглотки человека, только штам-
мы Str. lactis образовывали антибиотик низин.
Впоследствии И. М. Шаинская (1958) из растений, а Р. Ниль-
сон и Г. Нильсон (R. Nilsson, G. Nilsson, 1958) из шведского тягу-
чего молока выделили штаммы Str. lactis, которые обладали антаго-
нистическим действием по отношению к кишечной палочке. Воз-
можно, штаммы молочнокислых стрептококков, выделенные из
эпифитной микрофлоры, образуют, кроме низина, иной антибиотик,
разрушающийся при 52°, который и угнетает кишечную палочку.
Антибиотическое вещество, обнаруженное Р. Нильсоном и Г. Ниль-
соном, подавляло развитие различных грибов и, в отличие от низи-
на, разрушалось при нагревании. Угнетение роста кишечной
палочки в молоке отдельными штаммами Str. lactis и Str. cremoris
отмечала и Т. С. Сухова (1971).
Коллинз (Collins, 1961) обнаружил, что ''антагонистической
активностью обладают не только штаммы видов Str. lactis и Str.
cremoris, но и Str. diacetilactis.
Автор показал, что представители двух последних видов обра-
зуют однотипные антибиотики, отличающиеся от низина и других
веществ, синтезируемых Str. lactis.
В литературе имеются данные и об антагонистических свойст-
вах энтерококков, проявляемых по отношению к возбудителям
кишечных заболеваний. Так, С. П. Сатуновская (1952) показала,
что эти свойства ярче выражены у штаммов, выделенных от здоро-
вых лиц, чем от больных (особенно с заболеваниями желудочно-
кишечного тракта). Автор утверждала, что энтерококки безвредны
не только при приеме per os, но и при парэнтеральном введении
подопытным животным. Несколько позже Г. Христов и С. Марков
(1960) из кишечника новорожденного изолировали энтерококки,
близкие к Str. faecalis, подавлявшие рост особенно дцспептических
колибактерий. Авторы показали, что при введении энтерококков
белым мышам их кишечник освобождается от патогенной кишечной
палочки. Они подтвердили данные С. П. Сатуновской о том, что
энтерококки не обладают патогенными свойствами при оральном и
интраперитонеальном введении.
264
По данным Машкова с сотрудниками (Машков и др., 1968),
значительный процент штаммов энтерококков, выделенных из
фекалиев детей, обладает бактериостатическим действием по от-
ношению к стафилококкам. Позднее Калмансон с сотрудниками
(Kalmanson et al., 1970) наблюдали, что Str. faecalis образует бак-
териоцин, подавляющий рост L-форм стрептококков, стафилокок-
ков, Esch, coli, Proteus mirabilis и Serratia marcescens.
Продукты метаболизма Leuconostoc citrovorum подавляют рост
стафилококков, Salmonella gallinarum и ряд видов рода Pseudomo-
nas (Sorrells, Speck, 1970). Как установили Парк и Март (Park,
Marth, 1972 а, b), все испытанные ими кокковые молочнокислые
бактерии (Str. lactis, Str. diacetilactis, Str. cremoris. Leuc. citrovo-
rum и др.) в различной степени подавляли и рост Salmonella ty-
phimurium в обезжиренном молоке. Особенно эффективное дейст-
вие оказывали Str. thermophilus, которые при введении их в ка-
честве закваски в молоко (1%) при температуре 42° вызывали
быструю гибель салмонелл. Антагонистическое действие этих
стрептококков еще более усиливалось, когда заквашивание прово-
дили и L. bulgaricus (или L. helveticus). Однако, по мнению авто-
ров, на салмонеллы действует главным образом молочная кислота,
образуемая микроорганизмами закваски.
В заключение следует сказать, что антагонистическая актив-
ность молочнокислых бактерий не всегда проявляется по отноше-
нию к микроорганизмам только других систематических групп.
'Гак, показано, что Str. lactis, Str. cremoris и Str. diacetilactis угне-
тают как не образующих антибиотики представителей своего вида,
так и штаммы других видов лактобацилл и кокков, независимо
от их способности продуцировать антибиотические вещества (Rod-
gers, 1928; Hoyle, Nichols, 1947; Collins, 1961; Teply, 1962). В про-
изводстве твердых сыров, например, наблюдали, что низин сильнее
угнетает лактобациллы, чем кокки. Среди первых наиболее чув-
ствительны к нему L. acidophilus, L. bulgaricus, L. casei и L. hel-
veticus. Более устойчивым оказался L. plantarum. Наибольшей ре-
зистентностью обладают штаммы Str. durans и Str. faecalis. Инте-
ресно отметить, что смешанная культура молочнокислых палочек
и кокков менее чувствительна к угнетающему действию низина
(Teply, 1962). Однако низин слабее подавляет молочнокислые
бактерии, чем пенициллин, стрептомицин, ауреомицин и эритро-
мицин (Shahani, 1958).
Молочнокислые стрептококки, населяющие кишечник утят и
жеребят, по данным В. В. Леонович (1953), резко подавляют рост
ацидофильной палочки. Str. mitis и Str. salivarius, выделенные из
ротовой полости, оказывают угнетающее действие на рост лакто-
бацилл; при этом шероховатые варианты последних более чувстви-
тельны к действию стрептококков чем гладкие (Green, Dodd,
1956).
265
Антибиотические свойства ацидофильной палочки
Изучению антибиотических свойств молочнокислых палочковид-
ных бактерий было посвящено большое количество работ. Особое
внимание привлекала ацидофильная палочка. Исследования глав-
ным образом были подчинены вопросам борьбы с вредной и пато-
генной микрофлорой кишечного тракта человека и животных.
Ряд исследователей утверждает, что ацидофильная палочка
обладает способностью приживаться в кишечном тракте, и приме-
нение ацидофильных продуктов (ацидофильного молока и пасты, а
также ацидофильного кефира) действует благоприятно на орга-
низм, подавляет вредную и патогенную микрофлору кишечника,
способствует выздоровлению от ряда желудочно-кишечных заболе-
ваний; после лечения дизентерии ацидофильными кисломолочны-
ми продуктами уменьшается выделение ее возбудителей (Moro,
1900; Smith, 1924; Гартье, 1940; Кудзин, 1940; Мелкумян, 1961;
Hawley et al., 1959, и др.).
Л. А. Ерзинкян (1954, 1965, 1971) выделил из фекалиев груд-
ных детей палочковидные бактерии, которые отнес к Lactobacte-
rium acidophilum. Штамм группы Ер-1 был использован для при-
готовления ацидофильного молока. Автор сообщает, что оно с ус-
пехом применялось для лечения дизентерии, энтероколитов, токси-
ческой диспепсии детей и взрослых. Под влиянием ацидофильного
молока прекращалось бациллоносительство и бацилловыделение
через 15 суток. Дети, принимавшие его, скоро поправлялись и при-
бавляли в весе, стул нормализовался. Исследователь утверждает,
что ацидофильное молоко при заболевании дизентерией следует
применять как основное лечебное средство. Этот продукт был эф-
фективен в комплексном лечении брюшного тифа. Лечебный эф-
фект автор объясняет антимикробными веществами, продуцируе-
мыми штаммом.
Второй штамм ацидофильной палочки группы Ер-2 был исполь-
зован Л. А. Ерзинкяном для приготовления другого ацидофильного
продукта (молока «Наринэ»), который автор предложил приме-
нять детям младшего возраста с лечебно-профилактической целью,
а также грудным со смешанным и искусственным вскармлива-
нием. Оба ацидофильных продукта оказывают благотворное влия-
ние на организм (усиливают работу поджелудочной железы, нор-
мализуют функцию желудочно-кишечного тракта, возбуждают ап-
петит и т. д.).
Ацидофильная паста используется в акушерско-гинекологи-
ческой практике, дерматологии и хирургии (лечение ожогов, фу-
рункулов, язв).
По мнению Л. А. Ерзинкяна (1971), предложенное им ацидо-
фильное молоко снимает у лиц, долго находившихся на солнце,
симптомы солнечного удара — вялость, головную боль, потерю ап-
петита и т. д. Эти наблюдения, как утверждает автор, согласуются
с данными японских исследователей о благоприятном воздействии
266
йогурта при лечении больных лучевой болезнью, а также исследо-
ваниями югославского ученого Крупа Каровича, проведенными
в 1965 г. Последйий с помощью изолированного им штамма ЛБК
получал ацидофильное молоко, отличавшееся высокими антибио-
тическими свойствами и содержанием фолиевой кислоты. Продукт
оказывал лечебный эффект при кормлении им облученных жи-
вотных.
Имеются сообщения о том, что применение ацидофильного мо-
лока и нативной биомассы, полученной из штаммов L. acidophilus,
в кормлении сельскохозяйственных животных и птиц уменьшает
процент желудочно-кишечных заболеваний и падеж животных
(Леонович и др., 1953; Подкопаев, 1970; Ерзинкян, 1971, и др.).
Для профилактики и лечения желудочно-кишечных заболеваний,
авитаминозов, алиментарных анемий сельскохозяйственных жи-
вотных эффективен и сухой белково-ацидофильный препарат
(БАК). В состав его входят ацидофильная палочка, некоторые
микроэлементы и витамины. Этот препарат можно вводить в состав
комбикормов (Рощин, 1971). Он оказался эффективным в опытах
с цыплятами.
Предложен французский патент (Новый лактобациллиновый
препарат..., 1969), в котором дается описание препарата антибиоти-
коустойчивых штаммов молочнокислых бактерий L. acidophilus,
L. bulgaricus и Str. lactis. Препарат предназначен для поддержания
или восстановления равновесия кишечной флоры млекопитающих,
которое было нарушено1 в результате применения антибиотиков.
Причем, данный препарат получают высушиванием экстракта
всей культуральной среды.
Отмечено, что под влиянием ацидофильной палочки желтая
сарцина быстро прекращает деление, форма клеток ее изменяется
и она лизируется (Дубинский, 1956), причем, полный лизис бакте-
рий наступает через 3—4 часа пребывания ее совместно с ацидо-
фильной палочкой.
Было высказано также предположение, что терапевтический
эффект от применения кисломолочных продуктов при лечении
туберкулеза в значительной мере обусловлен непосредственным
воздействием на микобактерии туберкулеза антибиотических ве-
ществ, образуемых ацидофильными палочками и другими молочно-
кислыми бактериями (Скородумова, 1956, 1958). Однако вряд ли
невысокие концентрации всасываемых антибиотиков, к тому же
относительно мало активных, могут подавлять туберкулезную па-
лочку. Прямых опытов по определению концентрации их в крови
не проводилось, и можно предположить, что определение это дало
бы отрицательные результаты.
Ряд других исследователей не получили положительного эф-
фекта при использовании ацидофильных продуктов при борьбе с
патогенной микрофлорой, развивающейся в кишечном тракте. Так,
употребление ацидофильного молока не уменьшало выделения ти-
фозных и паратифозных бактерий хроническими носителями
267
(R. P. Smith, 1924). Использование L. acidophilus и лактулозы
(синтетический дисахарид, ферментируемый в нижней части ки-
шечника) не вызывало существенных изменений и в составе мик-
рофлоры кишечника больных энцефалопатией. Не происходило
вытеснения токсинобразующих протеолитических бактерий, от-
ветственных за синдром энцефалопатии (Conn, Floch, 1970).
Считают, что антагонистические свойства ацидофильной палоч-
ки обусловлены как продуцируемой ею молочной кислотой, так и
антибиотиками (Полонская, 1952, 1959; Полонская и др., 1953; Ду-
бинский, 1958; Tomic-Karovic et al., 1959; Vincent et al., 1959;
Neri, 1962, и др.). Среди ее антибиотических веществ описаны аци-
дофилин, накапливающийся в период максимальной жизнедея-
тельности культуры, и лактоцидин, синтезируемый позже. Аци-
дофилин термостабилен, проходит через мембранные фильтры,
максимум активности проявляет при pH 5,0—5,6. Он угнетает раз-
витие гнилостных бактерий, стрептококков и стафилококков, воз-
будителей брюшного тифа, паратифов А и В, дизентерии, туберку-
леза и дифтерии.
Лактоцидин продуцируют ацидофильные палочки, выделенные
из кишечника человека, хомяков, крыс, кроликов и мышей. Наи-
большей антагонистической активностью отличались штаммы, вы-
деленные от кролика. Патогенные виды более чувствительны к
лактоцидину, чем сапрофитные, а грамотрицательные бактерии ме-
нее устойчивы, чем грамположительные. Активен он и против кис-
лотоустойчивых бактерий, а также плесневых грибов. Установле-
но, что в процессе очистки активность препарата падает. Штаммы
ацидофильной палочки чувствительны к высоким концентрациям
своего собственного антибиотика (Vincent et al., 1959).
Из фильтратов двухсуточных культур ацидофильной палочки
выделен и антибиотик, угнетающий развитие Candida albicans.
Это вещество растворимо в воде, адсорбируется активированным
углем в нейтральной или кислой среде и разрушается в течение
20 мин. при 110°. Устойчиво при комнатной температуре. Возмож-
но, ацидофильная палочка ограничивает развитие этих микроорга-
низмов в организме человека и животных (Guillot, 1958). Следует
отметить, что другими авторами (Koser et al., 1960) при исследо-
вании антагонистического действия ацидофильной палочки на Can-
dida albicans не были получены столь четкие результаты.
Ацидофильная палочка в кишечном тракте детей — дизенте-
рийных бациллоносителей. Наши исследования в области изучения
антагонистических свойств ацидофильной палочки по отношению
к возбудителям инфекции кишечного тракта человека проводились
в нескольких направлениях. Существенным представлялось выяс-
нить степень приспособленности ацидофильной палочки к услови-
ям обитания в кишечнике и ее антибиоз к одной из групп патоген-
ных бактерий — дизентерийной палочке, трудно поддающейся те-
рапевтическому воздействию при длительном бациллоносительстве.
Анализ приведенных выше литературных данных показал, что
268
исследования по санации дизентерийных хроников кисломолочны-
ми продуктами, содержащими ацидофильную палочку, обычно не
сопровождались тщательными бактериологическими исследова-
ниями. Важной стороной наших работ поэтому мы считали тща-
тельные и многочисленные бактериологические анализы фекалиев
в процессе санации ацидофильными продуктами. Работа проводи-
лась коллективом сотрудников в Ташкенте (Квасников, Кузьми-
нова, Мисорина, Семенова, Коенман, 1953; Квасников, 1960).
Наши исследования показали, что степень выделяемости ацидо-
фильной палочки из фекалий детей ясельного возраста зависит от
состояния их кишечного тракта. У здоровых детей приживаемость
ацидофильной палочки дастигает максимума (выделяется у 25%);
у детей с длительно неустойчивым стулом содержание ацидофиль-
ной палочки падает более, чем в три раза и, наконец, у детей ди-
зентерийных бациллоносителей она вытесняется и в фекалиях
обычно не обнаруживается.
Ацидофильная палочка проявляет антагонизм по отношению
к ряду возбудителей желудочно-кишечных заболеваний. Степень
ее антагонизма зависит от состава питательной среды. Отдельные
штаммы ацидофильной палочки значительно отличаются друг от
друга по способности подавления дизентерийных бактерий. От-
дельные штаммы последних также значительно варьируют по чув-
ствительности к ацидофильной палочке.
Другие молочнокислые палочковидные бактерии-антагонисты
Антагонистические свойства и синтез антибиотиков, как упомина-
ли мы выше, к настоящему времени описаны у многих молочно-
кислых палочек.
Кодама (Kodama, 1953) установил, что L. plantarum образует
антибиотик лактолин. Впоследствии было найдено, что L. planta-
rum, выделенные из разнообразных источников (молочных про-
дуктов, силосов и т. д.), задерживают рост Clostridium tyrobutiri-
cum, Saccharomyces carlsbergensis, Candida albicans (Гудков, Алек-
сеева, 1970; Koser et al., 1960; Nakamura, Hartman, 1961).
Ряд авторов обнаружил, что L. casei обладает антагонистиче-
скими свойствами по отношению к кишечной и сенной палочкам,
пиогенному микрококку, а также бактериями тифа и дизентерии
(Masek, 1959; Nakamura, Hartman, 1961; Neri, 1962). Так, Нери
(Neri, 1962) нашел, что максимум антибиотической активности
L. casei приходится на И —13 сутки, а нейтрализованная культу-
ральная жидкость L. casei не угнетает рост Brucella melitensis.
Мазек (Masek, 1959) утверждает, что L. casei, выделенная из мо-
лока, активнее подавляет развитие кишечной палочки, чем L. bul-
garicus и L. helveticus. Есть данные о способности L. casei подав-
лять развитие Candida albicans (Koser et al., 1960).
Обнаружено, что L. helveticus и L. lactis в состоянии образовы-
вать (в течение первых суток инкубации в молоке) антибиотиче-
269
ское вещество, угнетавшее развитие кишечной палочки (Ritter,
1951).
В литературе имеются многочисленные данные о положитель-
ном действии кисломолочных продуктов на организм человека и
об использовании лактобацилл для лечебных целей (Reuter, 1969;
Sandine et al., 1973). Установлено, например, что фильтрат
йогурта, полученный фильтрованием продукта через марлю,
а также свежий и выдержанный йогурт содержат антибиотическое
вещество, устойчивое к нагреванию и обладающее антибактери-
альным действием против патогенного штамма кишечной палочки
и Ps. pyocyaneus, устойчивых к ряду антибиотиков (Yazicioglu,
Yilmaz, 1966). В последнее время были выполнены исследования
по дальнейшему выявлению антибактериальных веществ, образу-
емых рядом видов молочнокислых бактерий, входящих в состав
кисломолочных продуктов. Так, из болгарского кислого молока
изолирован штамм Lactobacterium bulgaricum В219, который син-
тезирует антимикробные вещества, активные по отношению к
Esch, coli и Вас. mesentericus (Начев и др., 1972). Янтарная кис-
лота и лактоза (как источники углерода) и гидролизат молока
(как источник азота) существенно повышают выход указанных
веществ.
Было выявлено (Wheater et al., 1951), что около 3% штаммов
молочнокислых палочек, выделенных из молодых сыров во Фран-
ции, обладали антагонистическими свойствами по отношению к зо-
лотистому стафилококку (Staphylococcus aureus). При этом раз-
мер зон угнетения при исследовании «методом цилиндрических
пластинок» достигал 20—30 мм в диаметре. Один из штаммов го-
моферментативных бактерий, близких к L. helveticus, был особенно
детально исследован. На пептоно-глюкозной среде культура обра-
зовывала антибиотик при 30—40°. Однако наибольший его выход
был при более низких температурах. Культуральная жидкость ока-
залась в 20 раз более активной против St. aureus, чем низин, но
она была чувствительна к нагреванию. Авторы считали, что инги-
бирующее действие вызывается антибиотиком и назвали его лакто-
бациллином. Впоследствии исследователи доказали, что это не
антибиотик, а перекись водорода (Wheater et al., 1952).
Работами М. Л. Горбуновой (1970), А. С. Архипова (1968),
проведенными в содружестве с нами, показано, что из организма
человека и животных (кроликов, собак, лошадей и т. д.) также
выделяются молочнокислые кокковые и палочковидные бактерии,
продуцирующие перекись водорода. Авторы установили, что они
оказывают защитное действие против некоторых возбудителей
инфекции.
Накоплены ценные данные и об антагонистических свойствах
бифидобактерий. L. bifidus обладает большей антагонистической
активностью в отношении различных микроорганизмов, чем ки-
шечная палочка. L. bifidus угнетает рост энтеропатогенных ки-
шечных палочек, салмонелл, палочек дизентерии, стафилококков;
энтерококки и протей угнетаются слабее (Перетц, 1955; Rusch-
mann, 1958; Mayer, 1960). Применяя живые культуры бифидобак-
970
терий, Л. Г. Перетц (1955), Д. Танами (1962) и другие нашли, что
эти микроорганизмы оказывают лечебное действие при инфекци-
онных процессах и интоксикациях, связанных с различными
сдвигами в микрофлоре кишечника. Есть данные и о том, что би-
фидобактерии резко угнетают рост холерного вибриона Эль-Тор
в опыте in vitro. Особенно отчетливо антагонистическая активность
отдельных штаммов этих бактерий проявлялась при их совместном
выращивании с Esch, coli (Покровская и др., 1972). По сведениям
японских авторов (Минагава, 1970), L. bifidus продуцирует лизо-
цимы, имеющие значение в питании грудных детей.
Интерес к L. bifidus особенно возрос в связи с явлениями на-
рушения состава нормальной кишечной микрофлоры при длитель-
ном лечении детей и взрослых антибиотиками. Во многих странах
мира начали уделять внимание вопросам восстановления бифидо-
флоры с помощью препаратов, содержащих живые бифидобакте-
рии и бифидогенные факторы. Во Франции были разработаны пре-
параты «Lyo-Bifidus» и «Bifidigene»; в Австрии—«Eugalan»; в
ГДР и ФРГ «Omniflora», представляющий собой смесь чистых лио-
филизированных культур L. bifidus, L. acidophilus и Esch, coli (Са-
merer, 1961; Гончарова, 1970).
В СССР разработан и применяется в лечебной практике препа-
рат «Сухой бифидумбактерин» (Гончарова, 1970). Действующим
началом его являются живые бифидобактерии, содержащиеся в
таблетке в количестве 108—109 клеток. Препарат назначают детям
и взрослым для лечения затяжных форм дизентерии, хронических
форм колитов, кишечных расстройств невыясненной этиологии,
а также дисбактериозов, возникших в результате применения ан-
тибиотиков и химиотерапевтических препаратов. Сухой бифидум-
бактерин эффективен и при санации реконвалесцентов после ди-
зентерии. У больных уже к 12—14-му дню нормализуется стул,
улучшается общее состояние; значительно возрастает число бифи-
добактерий в фекалиях. Особенно показано применение бифидум-
бактерина для детей первого полугодия жизни.
Использование бифидобактерий оказалось эффективным при
лечении диарей у больных кишечной карциномой. Размножение
бифидобактерий в кишечнике предотвращает исчезновение кишеч-
ной палочки и энтерококков, происходящее при облучении боль-
ных (Mettler et al., 1973).
Предполагается, что использование продуктов (масла, сыров,
творога, йогурта), в состав которых входили бы компоненты нор-
мальной кишечной микрофлоры — L. bifidus и L. acidophilus, будет
весьма эффективным для лечепия и профилактики заболеваний,
вызванных использованием антибиотиков (Schuler-Malyoth et al.,
1968; Mulhens, Stamer, 1969).
Имеются сообщения о положительных результатах, получен-
ных в борьбе с желудочно-кишечными заболеваниями и при при-
менении молочнокислых бактерий в сочетании с другими микро-
организмами, например, дрожжами (Буканова, 1952; Аскалонов,
271
Добрйер, 1958; ЭмануйЛов, Натшев, 1958; Феофилова, 1959). Од-
нако вопрос о возможности использования для этих целей дрож-
жей нуждается в дальнейших исследованиях.
Наконец, следует отметить, что антагонистические взаимоотно-
шения существуют не только между палочковидными и кокковыми
формами молочнокислых бактерий, о чем мы упоминали выше,
но и между отдельными видами лактобацилл. Так, Крерк и Котци
(de Krerk, Coetzee, 1961) в 10-суточной культуральной жидкости
L.Acidophilus и L. fermenti обнаружили термоустойчивый антибио-
тик, подавлявший рост L. bulgaricus, L. salivarius и L. helveticus
при pH 3,6—7,0; чувствительны к нему пневмококки и многие эн-
терококки. Активность антибиотика выше у культур суточной ин-
кубации. Антибиотик не подавлял рост L. casei, L. plantarum и
L. brevis.
По мнению авторов, механизм действия найденного антибиоти-
ка общий с колицинами. Впоследствии Крерк и Смит (de Krerk,
Smith, 1967) детальнее исследовали свойства и состав бактериоци-
на, образуемого L. fermenti, и нашли, что он представляет собой
липополисахаридно-белковый комплекс.
Видовой состав молочнокислых бактерий-антагонистов
в желудочно-кишечном тракте человека
Видовой состав молочнокислых бактерий кишечного тракта, обла-
дающих антагонистическими свойствами по отношению к пато-
генным микроорганизмам, как указывали мы выше, изучен недо-
статочно. Главное внимание сосредоточивалось на исследовании
ацидофильной палочки и бифидобактерий. Исследованиями Отдела
физиологии промышленных микроорганизмов Института микро-
биологии и вирусологии АН УССР мы попытались восполнить этот
пробел (Суденко, 1963,1964а, б, в; Квасников, Суденко, 1967а, б, в).
Количественный учет молочнокислых бактерий (в фекалиях)
и выделение их в чистые культуры (из слюны и испражнений)
проводили по нашему методу (Квасников, 1960). Пробы отбирали
в стерильную посуду и высевали на питательную среду через 2—4
часа от момента забора. Было установлено, что для изолирования
молочнокислых бактерий оптимальной концентрацией является
10—12 об. % этилового спирта.
В результате обследования 60 человек обоего пола в возрасте
от 18 до 50 лет установлено, что молочнокислые стрептококки со-
держатся в количестве десятков и сотен миллионов, а молочнокис-
лые палочки — от сотен тысяч до сотен миллионов клеток в 1 г
фекалиев. Из смывов ротовой полости и экскрементов было выде-
лено около 400 штаммов.
Антагонистические свойства выделенных культур изучали ме-
тодом диффузии в агар с использованием цилиндриков. В качестве
тест-культуры были взяты золотистый стафилококк, кишечная па-
лочка, дизентерийные бактерии Флекснера, Ньюкестл и Зонне,
272
а также дрожжеподобные грибы из рода Candida. Молочнокислые
стрептококки выращивали в течение суток при 37° на жидкой ка-
пустной среде. После заливки агара с тест-организмом (200 тыс.
в 1 мл) и внесения культуральной жидкости в цилиндрики, чашки
Петри выдерживали в холодном месте 16—18 час., после чего их
инкубировали в течение суток при 37° и учитывали ширину зон
угнетения роста тест-культуры.
Антагонистические свойства присущи далеко не всем выделен-
ным из желудочно-кишечного тракта человека штаммам молочно-
кислых бактерий. Из 200 изученных штаммов молочнокислых кок-
ков только 14% и из 195 штаммов палочек 42% образуют веще-
ства, угнетающие рост одного или ряда тест-культур. Ниже при-
водится видовой состав молочнокислых бактерий желудочно-ки-
шечного тракта человека, обладающих антагонистическими свой-
ствами.
Вид Количество штаммов, выделенных
из ротовой полости из фекалий
Streptococcus faecalis 19
Str. faecalis var. liquefaciens — 1
Str. lactis 1 7
Lactobacillus casei 19 22
L. plantarum 6 16
L. acidophilus 1 5
L. brevis — 7
L. buchneri 1 —
Существенно, что большинство штаммов L. casei активно про-
тив всех исследованных тест-культур и довольно интенсивно за-
держивает рост дизентерийных палочек Зонне. Штаммы L. planta-
rum давали значительные зоны отсутствия роста кишечной палоч-
ки и дизентерийных бактерий Зонне и Флекснера, a L. acidophi-
lus — дизентерийных палочек Зонне. Было установлено, что штам-
мы L. brevis сильнее действовали на дизентерийные бактерии, чем
на условно-патогенные. Фекальный стрептококк проявлял актив-
ный антибиоз против дизентерийных палочек; обладали этим свой-
ством и многие штаммы Str. lactis (особенно против дизентерийной
палочки Флекснера).
Среди исследованных тест-культур кишечная палочка и дизен-
терийная палочка Зонне оказались относительно более стойкими
против большого количества штаммов молочнокислых бактерий.
Более чувствительны Bact. dysenteriae Newcastle и, особенно, Bact.
dysenteriae Flexneri; последняя угнетается большинством штам-
мов почти всех видов молочнокислых бактерий. Не удалось обна-
273
ружить среди изученных молочнокислых бактерий антибиоза по
отношению к дрожжам из рода Candida.
Корреляции между антимикробной активностью исследуемых
штаммов молочнокислых бактерий и интенсивностью кислотообра-
зования (pH, кислотность в градусах Тернера) не наблюдали. От-
метим, что работы наших аспирантов по исследованию молочно-
кислых бактерий рубца крупного рогатого скота (Подгорский,
1967) и кишечного тракта насекомых (Коваленко, 1971) дали ана-
логи^йше результаты. Антагонизм по отношению к ряду возбуди-
телей кишечных инфекций этих животных удалось выявить
у многих видов молочнокислых бактерий. Антагонистические свой-
ства их также не коррелировали с активностью кислотообразо-
вания.
Использование мутагенных факторов
для повышения антагонистической активности
Streptococcus lactis, Lactobacillus casei и L. brevis
по отношению к дизентерийным бактериям Флекснера
Среди изученных молочнокислых бактерий отдельные штаммы
L. casei, Str. lactis и L. brevis наиболее значительно подавляли
дизентерийные палочки Флекснера. Для повышения антагонисти-
ческой активности их применяли ультрафиолетовое облучение
(источник— лампа БУВ-15) и некоторые химические мутагены
(этиловый эфир уретана, диметил-, диэтилсульфат и этиленимин).
Ультрафиолетовые лучи дозировали прибором УФД-4.
Антагонистическую активность полученных вариантов опреде-
ляли с использованием фильтровальных дисков методом диффузии
в капустный агар с pH 6,8 (Str. lactis, L. brevis) или мясопептон-
ный агар с pH 5,5 (L. casei.) Вычисляли процент вариантов, обла-
дающих неизмененной, повышенной и пониженной активностью
(по ширине зон угнетения роста дизентерийных бактерий
Флекснера).
Опыты показали, что под влиянием чередующихся воздействий
указанных выше физических и химических факторов антибиотичес-
кие свойства молочнокислых бактерий могут быть усилены.
Были получены варианты L. casei, по активности более чем в два
раза превышающие контрольные. Удалось значительно увеличить
и антибиотическую активность Str. lactis и L. brevis.
Исследования показали идентичность антибиотического веще-
ства L. brevis как в контрольном штамме, так и у вариантов, полу-
ченных под воздействием испытанных факторов.
Оно концентрируется в клетках и относится к группе эндоан-
тибиотиков. Антибиотическое вещество наиболее эффективно
экстрагируется 0,5 %-ной уксусной кислотой, петролейным эфи-
ром и хуже дистиллированной водой. Лучше всего оно сохраняет-
ся в 0,5 %-ной уксусной кислоте (все исследования проводились с
этими экстрактами); не разрушается на протяжении суток в упо-
мянутых растворителях и хлороформе. R/ в них при нейтральной
274
реакции равен 0. Антибиотическое вещество наиболее стойко в
кислой среде при pH 3,0—6,0.
Клеточные экстракты L. brevis угнетают рост как грамполо-
жительных (золотистый стафилококк), так и грамотрицательных
(кишечная палочка и ее патогенные серотипы 055 и 0111, дизен-
терийные бактерии Флекснера, Ньюкестл и Зонне).
Наибольшую антагонистическую активность имели уксуснокис-
лые экстракты бактериальных клеток 4—24-часовой экспозиции
на холоде (+4°). При увеличении времени экстракции до 3—5 су-
ток активность вытяжки резко уменьшалась, а через 7—14 суток
она почти полностью утрачивала антибиотические свойства.
С помощью хроматографии на бумаге (растворитель — дистил-
лированная вода, насыщенная петролейным эфиром) антибиоти-
ческое вещество при pH 1,0—2,0 разделяется на две фракции
(кислого и амфотерного характера), одна из которых движется с
фронтом растворителя (7?/=1,0), а другая остается в месте нанесе-
ния пробы. В суточных экстрактах клеток при pH 6,8 также
обнаруживаются две зоны угнетения роста тест-микроба: на месте
старта и на расстоянии 16 см от места нанесения экстракта
(Я/=0,8). Последняя фракция не обнаруживается без предвари-
тельной диффузии на холоде в течение суток, а также после
длительного хранения экстрактов (3—8 суток). Все обнаружен-
ные фракции не различаются между собой по спектру антимик-
робного бактериостатического действия.
Обнаруженный антибиотик имеет полипептидную природу, не
проходит через бактериальный фильтр, медленно диффундирует в
агар, термолабилен. Он был назван лактобревином. Следует отме-
тить, что в литературе не имеется указаний на наличие антибио-
тиков в клетках L. brevis.
Полученные под воздействием ультрафиолетовых лучей и неко-
торых мутагенных факторов варианты Str. lactis, L. casei и L. bre-
vis могут оказаться перспективными в профилактике и терапии
желудочно-кишечных заболеваний.
Взаимоотношения между молочнокислыми бактериями
Различные виды молочнокислых бактерий могут вступать между
собой не только в антагонистические, но и симбиотические взаи-
моотношения (Nurmikko, 1959; Devoyod, Desmazeaud, 1970, и др.).
Например, при исключении некоторых факторов роста (вита-
минов группы В и аминокислот), необходимых для двух штаммов,
из полноценной в иных отношениях синтетической среды, оба ор-
ганизма могли расти в симбиозе, так как каждый из них продуци-
ровал биологически активные вещества, используемые другим.
Так, L. arabinosus 17-5 (требует фенилаланин) и Str. faecalis R
(требует фолиевую кислоту, треонин, гистидин, серин или глицин)
растут в симбиозе, когда фенилаланин, треонин и фолиевая кисло-
та или фенилаланин и гистидин, или фенилаланин, серин и глицин
275
опущены из среды. Аналогичные наблюдения были сделаны и при
выращивании L. fermenti АТСС 9338 (требует фенилаланин) и
Str. faecalis R в среде без фолиевой кислоты и фенилаланина (Nur-
mikko, 1959).
Молочнокислые бактерии при дефиците в среде ростовых фак-
торов могут расти в ассоциациях, включающих до шести компо-
нентов. Выделение витаминов и аминокислот в среду, тесно свя-
занное с интенсивностью роста культур, было значительным глав-
ным образом в течение логарифмической фазы роста. Указанное
явление обусловливается тем, что культуры молочнокислых бак-
терий выделяют в среду отдельные ростовые вещества (фенила-
ланин, пролин, треонин, гистидин, глицин, фолиевую и фолиновую
кислоты, витамин В 12) и взаимно дополняют потребность в них
друг друга.
Основываясь на вышеуказанных наблюдениях, разработана
методика количественного учета витаминов и аминокислот, проду-
цируемых молочнокислыми бактериями, позволяющая измерять
количество веществ непосредственно в растущих культурах. Обра-
зованный ростовой фактор диффундирует через мембрану в отде-
ление, где находится тест-организм, требующий это вещество; рост
бактерий измеряется турбидиметрически или взвешиванием высу-
шенных клеток (Nurmikko, 1957).
Наличие явления симбиотических взаимоотношений среди мо-
лочнокислых бактерий явилось основой для разработки методов
изучения путей синтеза ряда ростовых факторов. Принцип метода
может быть иллюстрирован схемой симбиотической системы, об-
разованной двумя молочнокислыми бактериями (по Nurmikko,
1959).
Организм Имеются энзимати- ческие системы, ка- тализирующие сле- дующие реакции Отсутствуют фер- ментные системы, ка- тализирующие сле- дующие реакции Требуется в качестве су- щественного фактора роста Ростовой фак- тор. выделен- ный в среду
1-Й А— в—С—»Р D—»Е Е с
2-й С—D—Е А-» В^С С Е
Р
Если необходимо исследовать возможные промежуточные про-
дукты реакции С — D — Е, то из среды исключают вещества С,
D и Е, что ведет к отчетливому замедлению симбиотического рос-
та. Затем изучают, какие из веществ, родственных С, D или Е (на-
пример, di, йг, йз; 11, Ь, 1з) обладают способностью восстанавли-
вать рост культур. В результате можно получить представление о
последовательности синтеза ростового фактора Е из предшествен-
ника С: С —> di -> d2 ds -> D -> ]t —> 12 —> 13 Е. Используя сим-
биотическую систему, образованную видами L. arabinosus 17-5 и
276
Str. faecalis R, был исследован путь биосинтеза п-аминобензойной
кислоты (Nurmikko, 1959).
Метод изучения ассоциативных культур важен и перспективен,
так как позволяет приблизиться к изучению сложных взаимоотно-
шений, складывающихся между видами молочнокислых бактерий
в природных (почва, эпифитная и ризосферная микрофлора, пи-
щеварительный тракт животных и человека) и производственных
субстратах.
Таким образом, антагонистические свойства представителей
группы молочнокислых бактерий определяются не только их спо-
собностью продуцировать органические кислоты, но и определен-
ные антибиотические вещества. Их образуют кокковые и палочко-
видные гомо- и гетероферментативные формы. Это свойство играет
существенную роль в борьбе данных бактерий с конкурентными
микроорганизмами. Антибиотики, образуемые некоторыми мо-
лочнокислыми бактериями (особенно низин), используются в пи-
щевой промышленности.
Возрастающий интерес исследователей вызывают молочнокис-
лые бактерии желудочно-кишечного тракта человека и животных,
как антагонисты патогенных бактерий.
Данные о терапевтическом эффекте, получаемом от примене-
ния ацидофильных продуктов при лечении желудочно-кишечных
заболеваний (особенно дизентерии), у отдельных исследователей
различны. Одни описывают, что им удавалось получать разитель-
ный эффект, у других он был более скромен и давал результаты в
комплексной терапии, третьи же его отрицают.
Нам представляется, что это в значительной степени обуслов-
лено тем, что отдельные авторы в своих исследованиях пользова-
лись различными штаммами, видовая принадлежность которых не
была четко установлена. Необходимо сравнительное таксономичес-
кое исследование с использованием новых методов как штаммов
заводских, так и имеющихся у отдельных исследователей для вне-
сения ясности в этот вопрос.
Безусловно самого пристального внимания заслуживают бифи-
добактерии как антагонисты ряда возбудителей желудочно-кишеч-
ных инфекций. Препараты, приготовленные с их использованием,
находят возрастающее применение в практике.
Исследование молочнокислых бактерий желудочно-кишечно-
го тракта человека, проведенное с использованием нашего метода,
показало, что их количество в содержимом толстых кишок дости-
гает сотен миллионов в 1 г и они разнообразны по видовому соста-
ву. Антагонизмом к возбудителям дизентерии обладает ряд видов.
Активность проявляют многие штаммы Str. lactis, а также Str.
faecalis. Еще более активны палочки L. brevis и L. casei. Удалось
обнаружить новое антибиотическое вещество, синтезируемое клет-
ками L. brevis,— лактобревин.
277
Исследования показали, что ряд видов молочнокислых бакте-
рий рубца жвачных животных и насекомых также способен по-
давлять возбудителей инфекций этих животных.
Под влиянием физических и химических мутагенных факторов
нам удавалось значительно повысить антагонистические свойства
Str. lactis, L. casei и L. brevis.
Борьба с дисбактериозами, возникающими под воздействием
различных факторов, особенно употребления антибиотических пре-
паратов, одна из актуальных задач здравоохранения. В цепи меро-
приятай по борьбе за нормализацию микрофлоры желудочно-ки-
шечного тракта, формирование биоценозов в его содержимом, в ко-
торые входили бы специально селекционированные молочнокис-
лые бактерии, очень важно. При этом перспективно обогащение
флоры не только одной монокультурой, но комплексом подобран-
ных штаммов, обладающих высокой приспособленностью к данной
среде обитания. Антибиоз отдельных компонентов следует повы-
шать генетическими воздействиями. Для размножения полезных
микроорганизмов кроме молочных необходимо изыскивать и иные
пищевые субстраты. Нет сомнения, что созданию в желудочно-ки-
шечном тракте «управляемой ассоциации микроорганизмов», кото-
рая своими функциями оказывала бы разностороннее благотвор-
ное влияние на организм, принадлежит большое будущее. Даль-
нейшая разработка этих вопросов ждет своих исследований.
Взаимоотношения молочнокислых бактерий и дрожжей
в природных и производственных субстратах
Молочнокислые бактерии и дрожжи глубоко приспособились к
совместному развитию на одних и тех же субстратах. В них при
содержании значительного количества сбраживаемых углеводов
активно развиваются или обе группы микроорганизмов, или в за-
висимости от условий перевес получает одна из них.
Человек с незапамятных времен стихийно начал использовать
деятельность обеих групп микроорганизмов для приготовления
многих продуктов питания (кефира, кумыса, мацони, йогурта и
др.). Деятельность дрожжей с древних времен использовалась и
для изготовления напитков из растительных материалов (квас,
брага и т. д.). В процессах приготовления некоторых хлебных про-
дуктов, в частности ржаного хлеба, помимо дрожжей принимают
участие молочнокислые бактерии. В этих продуктах совместная
деятельность обеих групп микроорганизмов, развивающихся в оп-
ределенных соотношениях, обусловливает соответствующее каче-
ство.
В то же время человек в своей практике начал проявлять инте-
рес к процессам, связанным только с одной из групп этих микро-,
организмов. Развитие второй вызывало нежелательное брожение,
снижало вкусовые качества и подчас совсем портило продукты.
Развитие ряда отраслей промышленности (производства хле-
278
бопекарских дрожжей, пивоваренного, спиртового производства и
т. д.) особенно остро поставило вопрос о необходимости чистоты
процесса брожения. Практика постепенно вырабатывала приемы,
создающие в зависимости от поставленных задач условия для раз-
вития только одной из групп микроорганизмов. Применение в про-
изводствах чистых культур дало возможность вести процесс бро-
жения на определенных, предварительно отселекционированных
и изученных расах и облегчило его регулирование. Эти требования
впервые выкристаллизовались именно для производств, связанных
с использованием жизнедеятельности дрожжей.
Однако и сейчас молочнокислые бактерии могут проникать в
производственные субстраты и приносить значительный урон. По-
этому знание природы взаимоотношений молочнокислых бактерий
и дрожжей имеет существенное практическое значение, так как
дает ключ к регулированию процессов размножения и брожения
их в производственных условиях.
Вопросы совместного развития молочнокислых бактерий и дрож-
жей уже давно привлекали внимание исследователей.
Мы выше осветили вопросы, связанные с изучением влияния
молочнокислых бактерий на дрожжи рода Candida, которые при-
обрели особую остроту в связи с возникновением кандидозов на
почве антибиотикотерапии. Здесь мы остановимся на описании об-
щих закономерностей взаимоотношений этих важных групп мик-
роорганизмов, которые служили объектом наших многолетних ис-
следований (Квасников, 1948, 1949, 1951а, б, 1952а, б, 1960; Квас-
ников, Кондо, 1956а, б, 1957, и др.).
Как же следует оценивать характер взаимоотношений молочно-
кислых бактерий и дрожжей?
Противоречивость суждений но данному вопросу у различных
исследователей в значительной степени обусловлена отсутствием
единого мнения о том, что же является критерием оценки. Отдель-
ные авторы определяют характер взаимоотношений микроорга-
низмов в сообществе по их численности или по активности броже-
ния. Так, Г. Л. Селибер и А. Л. Бычковская (1956) возрастающую
активность кислотообразования бактерий в сообществе рассма-
тривают как проявление антагонистических свойств к дрожжам.
Нам представляется, что к оценке сложной природы взаимоот-
ношений микроорганизмов следует подходить с общебиологических
позиций — содействуют ли они сохранению вида, благоприятству-
ют ли ему в конкретных условиях среды обитания, облегчают ли
ему борьбу с конкурентными видами микробов? С этих позиций
значительное удлинение жизни отдельных микроорганизмов при
их совместном развитии в том или ином субстрате является одним
из основных критериев в оценке характера щ^щй^ортношений как
симбиотических. '
279
Корни взаимоотношений молочнокислых бактерий и дрожжей
очень глубоки. Они сформировались в процессе развития этих мик-
роорганизмов в одной и той же среде обитания. Ферментативный
аппарат этих микроорганизмов близок. Человек уже с первых ша-
гов развития хозяйственной деятельности сосредоточивал вблизи
себя многие сахаросодержащие продукты. При развитии бродиль-
ной промышленности скопление таких веществ стало особенно зна-
чительным. Совместное развитие молочнокислых бактерий и дрож-
жей на этих субстратах углубило и сделало разносторонней связь
этих групп микроорганизмов.
Дрожжи и молочнокислые бактерии при совместном развитии
выигрывают многое.
В микробиологии бытует мнение, что бродильные микроорга-
низмы, как правило, проявляют наибольшую резистентность к про-
дуктам, образующимся в результате их собственной жизнедеятель-
ности. Некоторые из этих продуктов (органические кислоты, спир-
ты и т. д.), накапливаясь в среде в процессе брожения, играют
определенную роль «защитных веществ» для продуцирующего их
микроорганизма в его борьбе с конкурентными видами.
Однако многие дрожжи (особенно виды Saccharomyces cerevi-
siae, Sacch. ellipsoideus, Sacch. bayanus) резистентнее как к актив-
ной кислотности среды, так и высокому содержанию молочной кис-
лоты в ней, чем молочнокислые бактерии. Молочнокислые же бак-
терии, в свою очередь, обладают большей стойкостью к продукту
брожения дрожжей — спирту, нередко превосходящей таковую у
самих дрожжей. Это свойство является одним из существенных
факторов, позволяющих данным микроорганизмам развиваться в
одних и тех же субстратах.
Известно, что бактерицидное действие спирта на все микроор-
ганизмы, как правило, возрастает с увеличением кислотности сре-
ды. Накопление дрожжами и молочнокислыми бактериями при
совместном развитии в субстратах спирта и молочной кислоты не
допускает развития в них посторонних микроорганизмов. Поэтому
сочетание двух продуктов брожения значительно повышает защит-
ные свойства описываемого нами сообщества. Продукты брожения
этих микроорганизмов, накапливаясь в средах, делают их слабо
пригодными или вовсе непригодными для развития посторонних
видов. Именно благодаря этому дрожжи и молочнокислые бактерии
являются микроорганизмами, наиболее активно осваивающими са-
харосодержащие субстраты. В процессе эволюции данного сооб-
щества, по-видимому, определенную роль играло приспособление
одной группы микроорганизмов к использованию «защитных ве-
ществ» другой.
Сложную и еще не вполне раскрытую роль в этих взаимоотно-
шениях играют витамины и аминокислоты. В самых общих чертах
эта сторона взаимоотношений молочнокислых бактерий и дрожжей
сводится к следующему.
Большинство молочнокислых бактерий для своего развития ост-
280
ро нуждается в ряде витаминов и аминокислот. Дрожжи по способ-
ности синтеза витаминов значительно варьируют. Как правило,
виды дрожжей, о которых мы упоминали выше, менее требователь-
ны к составу питательной среды, чем молочнокислые бактерии,
и обладают большей способностью к синтезу биологически актив-
ных веществ.
В процессе своего роста дрожжи обогащают среду рядом экст-
рацеллюлярных продуктов своего метаболизма и делают ее более
благоприятной для развития молочнокислых бактерий. Особенно
много аминокислот и витаминов выделяется в среду в процессе
автолиза дрожжевых клеток. Наличие в среде ряда этих веществ
помогает данным бактериям лучше противостоять воздействию
неблагоприятных факторов. Молочнокислые бактерии в при-
сутствии дрожжей могут развиваться на средах, на которых они
самостоятельно не развиваются. Это наблюдается на средах, ли-
шенных ряда витаминов, аминокислот, пуриновых и пиримидино-
вых оснований.
Молочнокислые бактерии, приходя в тесный контакт с дрожжа-
ми в осадках, находят здесь среду обитания, очень благоприятную
для своего существования. Это в сочетании с действием спирта,
тормозящим скорость клеточного деления и тем уменьшающим
старение популяции, суммарно приводит к резкому увеличению
продолжительности жизни молочнокислых бактерий в сообществе
(в наших опытах они выживали свыше 4, 5 лет), сравнительно с
жизнью их в чистой культуре, т. е., в конечном счете, благоприят-
ствуют сохранению вида.
Несколько сложнее и может быть более спорен вопрос о том,
что же извлекают для себя дрожжи, развиваясь в ассоциации с мо-
лочнокислыми бактериями.
Дрожжи при развитии в субстратах, достаточно обеспеченных
наряду с сахаром и азотсодержащими веществами, а также при ре-
акции среды, близкой к нейтральной, встречают большое количест-
во конкурентов, видовой состав которых определяется в значитель-
ной степени реакцией среды (это могут быть гнилостные бактерии,
маслянокислые бациллы и т. д.). Продукты жизнедеятельности
некоторых из них на дрожжи действуют токсически. Поэтому ес-
тественно, что подкисление среды, вызываемое молочнокислыми
бактериями, дает дрожжам преимущество в борьбе с конкурен-
тными видами.
Некоторые из молочнокислых бактерий обладают более полной,
чем дрожжи, системой протеолитических ферментов; расщепляя
сложные азотсодержащие соединения, они благоприятствуют пи-
танию дрожжей. Определенные виды дрожжей обладают способ-
ностью в известной степени ассимилировать и органические кисло-
ты, образуемые молочнокислыми бактериями в процессе брожения.
Переходя в осадок в сообществе с молочнокислыми бактериями,
дрожжи в кислых средах лучше сопротивляются развитию посто-
ронних микробов.
281
Таким образом, в целом отношения молочнокислых бактерий
и дрожжей должны быть оценены как симбиотические. Однако в
определенных условиях среды обитания, особенно в условиях,
создаваемых при том или ином технологическом процессе, одна из
групп может тормозить процессы размножения и брожения другой.
Существенную роль при этом играет видовая принадлежность изу-
чаемых микроорганизмов.
При совместном развитии представителей родов Sacciiaromyces
и Lactobacillus в определенных условиях среды обитания может на-
блюдаться прикрепление молочнокислых бактерий к клеткам
дрожжей. Наиболее резко это проявляется при совместном нахож-
дении обоих микроорганизмов в «голодных средах» (в воде) и
средах, односторонне обеспечивающих питание молочнокислых
бактерий (особенно в сахарных растворах) и не возникает при из-
быточном обеспечении данных микроорганизмов полноценным пи-
танием (например, в средах с автолизатом и глюкозой, сусле и т. д.).
Существенную роль играет также реакция среды. При высо-
кой активной кислотности (pH 3,5—4,0) прикрепления молочно-
кислых бактерий к дрожжевым клеткам не наблюдается. Оно
наблюдается при реакции, более благоприятной для развития мо-
лочнокислых бактерий (pH выше 4,0 и особенно при pH 5,0—6,0).
Этим объясняется почему данное явление не было описано в ви-
ноделии и отмечено нами впервые в малокислотных среднеазиат-
ских винах. Многолетнее совместное культивирование молочно-
кислых бактерий с дрожжами направленно усиливает это свойство.
Опыты по изучению характера изменений дрожжей и молочно-
кислых бактерий под влиянием длительного (до нескольких лет)
совместного культивирования их показали, что при этом не
наблюдается изменения морфологических и культуральных приз-
наков микроорганизмов.
Продолжительное совместное культивирование исследуемых
микроорганизмов не вызывает снижения их биохимической актив-
ности. При выращивании их на средах, полноценно обеспеченных
питательными компонентами (с частыми пересевами), у молочно-
кислых бактерий нередко отмечается даже увеличение кислотооб-
разующей способности. В то же время как у молочнокислых бак-
терий, так и у дрожжей после длительного совместного пребывания
в активном состоянии, во многих опытах было отмечено снижение
способности образования летучих кислот. У дрожжей, однако, эти
изменения нестойки.
Дрожжи и молочнокислые бактерии, длительно находящиеся
в активном состоянии в сообществе и затем выделенные в чистые
культуры и вновь помещенные в сообщество с исходным штаммом,
приобретают способность несколько тормозить размножение его и
брожение. Описанные явления в известной степени поясняют при-
способленность молочнокислых бактерий к условиям бродильных
производств, использующих деятельность дрожжей, и показывают,
что наибольшую угрозу для заводов представляют именно те бак-
терии, которые уже длительно развивались в бродящих субстратах.
Действие антибиотиков на молочнокислые бактерии
Крупные успехи в области применения антибиотиков в медицине
и бурное развитие производства этих веществ явились стимулом
к постановке исследований в направлении изыскания путей их
применения в ряде отраслей народного хозяйства.
Изучалось действие на молочнокислые бактерии антибиотиков,
переходящих в молоко из организма сельскохозяйственных живот-
ных, получающих их в качестве лечебных препаратов (мастит
коров и пр.) или в качестве стимуляторов роста. Было показано,
что антибиотики, вводимые коровам, поступая в молоко, подав-
ляют ряд функций молочнокислых бактерий при использовании
их в молочной промышленности в виде заквасок и оказывают
отрицательное влияние на ход технологического процесса и ка-
чество продукции.
Обширные исследования были проведены по использованию
антибиотиков для борьбы с молочнокислыми бактериями как од-
ной из основных групп микроорганизмов, инфицирующих произ-
водственные субстраты на предприятиях пищевой и бродильной
промышленности.
Получены определенные положительные результаты по исполь-
зованию антибиотиков в пивоваренном производстве и для борь-
бы с инфекцией семенных дрожжей, бродящего сусла и готового
пива. Антибиотиками с успехом подавляли развитие молочнокис-
лых бактерий в дрожжевом производстве и производстве кормовых
дрожжей. Имеются сведения об эффекте, достигаемом при исполь-
зовании антибиотических препаратов в виноделии и при произ-
водстве водки саке. В ряде стран данные препараты применяются
и для удлинения сроков хранения рыбы и птицы. Все эти работы
проводились преимущественно с медицинскими антибиотиками
(пенициллин, бациллин, стрептомицин, окситетрациклин дигид-
рат, хлортетрациклин гидрохлорид, тетрациклин, неомицин, поли-
миксин и др.).
Обзор данных исследований не входит в нашу задачу. Отме-
тим лишь, что несмотря на многочисленные сведения о благо-
приятном технологическом эффекте, использование антибиотиков
медицинского назначения в пищевой и бродильной промышлен-
ности, как общее правило, нежелательно. Это опасно с точки зре-
ния возможности появления антибиотикоустойчивых форм микро-
организмов. К тому же применение данных препаратов в произ-
водстве не всегда и экономически выгодно. Однако в литературе
нам не известны работы по изысканию антибиотических веществ,
активных в отношении молочнокислых бактерий.
283
Лактоцид
На протяжении ряда лет нами совместно с Г. И. Лаврентьевой
и Т. П. Слюсаренко проводились исследования по направленному
изысканию микроорганизмов-антагонистов молочнокислых бакте-
рий и разработке путей их использования (Квасников и др., 1965;
Порошина, 1964; Лаврентьева, 1965).
В опытах в качестве тест-объектов были взяты Streptococcus
lactis, Leuconostoc mesenteroides, Leuc. dextranicum, Lactobacillus
plantarum, L. delbrueckii, L. brevis, L. fermenti, L. buchneri. Штам-
мы ба/терий были выделены из различных производственных суб-
стратов, реже их брали из музея. Поиски микроорганизмов-антаго-
нистов проводили среди микроскопических грибов (испытано
1046 штаммов), актиномицетов (740 штаммов), споровых аэроб-
ных бактерий (36 штаммов). Антибактериальную активность
устанавливали методом серийных разведений на жидких питатель-
ных средах и методами, основанными на диффузии в агар.
Наибольшую активность проявили актиномицеты. Среди изу-
ченных штаммов около 20% угнетали рост молочнокислых
бактерий. Эти актиномицеты принадлежали, в основном, к
четырем группам: фиолетовой, глобиспориновой, хромогенной и
буро-зеленой. Наибольшее количество активных штаммов было
представлено фиолетовой и глобиспориновой группами. Антибакте-
риальным действием обладали в большинстве случаев как их
культуральные жидкости, так и ацетоновые экстракты из мицелия.
Чаще всего актиномицеты оказывали подавляющее действие на
Str. lactis и L. brevis.
В процессе исследования было отобрано два наиболее активных
штамма актиномицетов (26/3 и 135/1). Штамм 26/3 по ряду
морфолого-физиологических свойств близок к актиномицетам хро-
могенной группы. Однако он отличается от них рядом признаков
и особенностями антимикробного спектра. Штамм 135/1 относится
к актиномицетам фиолетовой группы (близок к виду Act. janthi-
nus). Препараты антибиотиков были получены из этих штаммов
экстракцией органическими растворителями. Препараты действу-
ют на грамположительные бактерии и имеют наибольшую актив-
ность по отношению к молочнокислым бактериям (табл. 50). На
дрожжи они не оказывают ингибирующего действия.
В присутствии суббактериостатических доз препаратов антибио-
тиков у молочнокислых кокков наблюдается образование раздутых,*
нередко разорванных клеток, у палочек — их удлинение и набу-
хание; бактерии слабее окрашиваются по Граму. Препараты обоих
антибиотиков подавляют размножение и процесс кислотообразова-
ния всех испытанных штаммов молочнокислых бактерий: наибо-
лее активно — L. brevis, наименее — Leuc. mesenteroides.
При выращивании культур в присутствии незначительных доз
препаратов как у гомоферментативных, так и у гетерофермента-
тивных молочнокислых бактерий происходит сдвиг процесса бро-
жения в сторону образования большого количества уксусной кис-
284
Таблица 50
Антибактериальная активность препаратов антибиотиков, выделенных
из штаммов актиномицетов 26/3 и 135/1
Тест-культура Бактериостатическое действие^ мкг/мл Тест-культура Бактериостати- ческое действие, мкг/мл
26/3 135/1 26/3 135/1
Streptococcus lactis Leuconostoc mesen- teroides Lactobacillus plan- tarum L. delbrueckii L. brevis Staphylococcus au- reus 209 Staph, aureus 209 (УФ-3) 0,39 0,39 0,195 0,39 0,39 50 25 0,195—0,097 0,39 0,097—0,048 0,048—0,012 0,097—0,012 50 0,195 Sarcina lutea Bacillus anthracoi- des Bae. mycoides Вас. subtilis Mycobacterium B-5 Pseudomonas tu- mefaciens 6,25 50 50 6,25 50 4,0 3,12 25 1,56 25 50 0,78
лоты. Наблюдается угнетение скорости дегидрирования ряда суб-
стратов: у Str. lactis по отношению к лактозе, арабинозе и
^-аланину, у Leuc. mesenteroides — к лактозе, сахарозе, арабинозе
и ^-аланину, у L. plantarum — к сахарозе, арабинозе и сорбиту, у
L. brevis — к галактозе, лактозе, сахарозе, арабинозе и fl-аланину.
При совместном выращивании штаммов всех видов молочно-
кислых бактерий в присутствии препарата антибиотика 26/3 про-
цесс накопления кислот в среде полностью тормозится уже начи-
ная с концентрации антибиотика 5—10 мкг/мл, а препарата
135/1 — с 200 мкг/мл. Введение в среду небольшого количества фор-
малина (0,006%) повышает активность препарата 135/1 в 8 раз.
Эти препараты даже в высоких концентрациях (до 1000
мкг/мл) не оказывают угнетающего влияния на процесс размно-
жения кормовых дрожжей Candida tropicalis (раса К-41) и спирто-
вых Saccharomyces cerevisiae (раса Я), и морфология их клеток не
изменяется. Бродильная активность дрожжей (раса Я) на мелас-
совом сусле при высокой концентрации препаратов (200 мкг/мл)
не только не тормозится, но даже несколько стимулируется.
Полученный комплексный препарат антибиотиков был назван
нами лактоцидом.
Необходимо подчеркнуть, что выделенный штамм актиномице-
та 135/1 хорошо растет и образует антибиотические вещества на
ряде производственных сред. На этих средах можно получить зна-
чительную антибактериальную активность в культуральной жид-
кости (в разведении 1 :2560—1:5120 и выше). Это указывает на
возможность применения ее (а не только препарата антибиотика)
для подавления инфекции, вызываемой молочнокислыми бактери-
ями в условиях спиртового производства. Культуру актиномицета
возможно выращивать на производственных субстратах при опре-
285
Характеристика некоторых свойств'1 препаратов антибиотиков,
продуцируемых штаммами актиномицетов
Видовая принадлежность ,продуцента Продуцент, № 26/3
Выделение препарата антибиотика экстракцией Внешний вид
Не установлена Хлороформом при pH 4,5 из нативного раствора Аморфный порошок светло- бежевого цвета
Растворимость Устойчивость к Максимумы по- нагреванию при глощения в УФ- 1000 в течение лучах, ммк 1 часа Антибактериальные свойства
Вода (при pH 7,5—8,0), ме- танол, етанол, пиридин, ди- метилформамид, в хлоро- форм, ацетон Не инактиви- Не обнаружены руется Действует на Г+, преимущественно на молочнокислые бак- терии
Продуцент М 135/1
Видовая принадлежность продуцента Выделение препарата антибиотика экстракцией Внешний вид
Близок к виду Act. janthl- nus, Кг ass., I960 н-Бутанолом из нативного раствора при pH 7,5; из ми- целия при pH 4,5 Аморфный порошок красно- фиолетового цвета
Растворимость Устойчивость к Максимумы по- нагреванию при Глощения в УФ- 1000 в течение лучах, ммк 1 часа Антибактериальные свойства
Вода (при pH 8—9), мета- нол, етанол, бутанол, диме- тилформамид, ацетон, бен- зол, хлороформ Та же, 258 и 490 (метанол, что и у 26/3 этанол) Та же, что и у 26/3
деленном заданном режиме, гарантирующем накопление лактоци-
да, и затем вводить ее в маточные дрожжи или бродильный чан в
количестве, необходимом для предупреждения развития в них ин-
фекции.
Некоторые химические свойства лактоцида. В. А. Цыганов с
сотрудниками (1969) нашли, что из мицелия штамма актиномице-’
та 135/1, полученного при выращивании культуры в ферментерах,
наиболее эффективная экстракция антибиотика происходит при
обработке этанолом. Из этанольных экстрактов были получены
смолообразные, трудно поддающиеся высушиванию препараты
сырцов антибиотика. Из них выделены две отдельные фракции.
Большая часть веществ, обладающих антибиотической активно-
стью, находилась в препаратах первой фракции.
Обе фракции, по данным электрофореза на бумаге, содержат
сходные по подвижности антибиотики, обладающие основными
286
свойствами. Первая фракция по отношению к молочнокислым бак-
териям наиболее биологически активна. Для выделения активных
компонентов этого комплекса была проведена препаративная бу-
мажная хроматография в системе бензол — формамид — вода и
элюирование активных зон. Получены аморфные порошки компо-
нентов с R/ 0; 0,76; 0,89 и 0,95, причем установлено, что антибио-
тики с Ry, равными 0,76, 0,89 и 0,95, являются гомогенными.
Наибольшую антибиотическую активность в отношении молоч-
нокислых бактерий имеет компонент первой фракции препарата
с R/ 0,76. На основании УФ-спектров поглощения антибиотически
активных компонентов актиномицета 135/1 с Ry 0,76, R, 0,89 и
Rf 0,95 полученные препараты были отнесены к производным
1,4,5-триоксиантрохинона.
Использование лактоцида в производстве. Селекционированные
нами штаммы актиномицетов 26/3 и 135/1 и разработанный режим
их выращивания с успехом применены в производственных усло-
виях при получении спирта из зерно-картофельных материалов
(Пыхова и др., 1966). Показано также, что внесение лактоцида в
дозе 0,005% подавляет инфекцию и в сбраживаемых мелассных
рассиропках и не оказывает отрицательного влияния на качество
спирта (Швец и др., 1974).
Цикл ценных исследований по разработке технологии использо-
вания лактоцида в спиртовом производстве выполнен под руковод-
ством В. Л. Яровенко (1968а, б; Маслечкина, 1971) во Всесоюзном
институте продуктов брожения (авторы препарат лактоцид иног-
да называли «лактомицином»).
Авторы рекомендуют глубинное культивирование продуцентов
лактоцида проводить на питательной среде следующего состава
(в %): соевая мука— 1,0; крахмал— 2,0; поваренная соль — 0,5;
мел — 0,1; азотнокислый калий или натрий — 0,2; К2НРО4— 0,02.
Посевной материал вносится в количестве 5 %. Выращивание ведут
при аэрации (сульфитное число 13—18 мг Oz/л мин.) при 26—28°
в течение 96 час. Препарат используется или в виде нативной
культуральной жидкости, или ее предварительно высушивают. Вы-
сушивание проводят на распылительной сушилке, при температуре
при входе 140° и на выходе 73—75°. При использовании сухого
препарата из него предварительно экстрагируют антибиотик эти-
ловым спиртом, раствором спирта в воде или кипячением в воде
(в течение 5—10 мин.). Эффект от применения спиртовых и вод-
ных вытяжек одинаков, поэтому для промышленного использова-
ния рекомендуются последние как более простые.
В производственных условиях применение лактоцида дает
неизменно положительные результаты. Добавление в дрожжевое
сусло препарата лактоцида в дозе 0,05—0,2% (2,5—10 мкг/мл)
или культуральной жидкости в количестве 0,5—1,0% позволяет из-
бежать пастеризации и подкисления сусла. Это приводит к эко-
номии в расходе пара и кислоты. Качество маточных дрожжей,
приготовленных с лактоцидом, улучшается — содержание живых
287
дрожжевых клеток в них значительно возрастает, а мертвых
уменьшается. Производительность дрожжевого отделения при этом
увеличивается на 25—30%. Дополнительное внесение препарата
в сбраживаемое сусло в количестве 0,02% (0,25 мкг/мл) позволя-
ет проводить непрерывный процесс брожения в батарее ферменте-
ров без нарастания кислотности в течение более длительного вре-
мени и с большим коэффициентом притока, так как антибиотик по-
давляет развитие инфекции. Производительность бродильного
отделения при этом увеличивается на 20—25%.
Применение лактоцида имеет и другие преимущества. Он не
действует на амилолитические ферменты осахаривающего агента
(солода или мицелиальных грибов) и поэтому их возможно вно-
сить в сусло одновременно. В головных ферментерах с антибиоти-
ком создается более благоприятная активная кислотность для дея-
тельности ферментов — pH 4,8—4,9. Это, в свою очередь, способст-
вует протеканию процесса брожения. Достигаются отброд и
количество несброженных углеводов более низкие, чем плановые.
Использование препарата лактоцида в спиртовом производстве
дает значительный экономический эффект.
Проведенные лабораторные исследования и производственный
опыт показывают, что применение антибиотиков в пищевой и, осо-
бенно, бродильной промышленности, использующей жизнедея-
тельность дрожжей, несомненно перспективно. Исключительное
значение приобретают антибиотики при проведении непрерывных
процессов переработки сырья в нестерильных условиях, так как
при этом особенно остро стоит вопрос об изыскании способов борь-
бы с адаптирующейся к производственным условиям вредной ми-
крофлорой, среди которой молочнокислым бактериям принадлежит
главенствующая роль. Использование медицинских антибиотиков
в данных отраслях промышленности нежелательно.
Нам в результате направленного поиска удалось изыскать
штаммы актиномицетов, активных против молочнокислых бакте-
рий. Комплексный антибиотический препарат, синтезируемый про-
дуцентами, был назван лактоцидом. Препарат подавляет размно-
жение и брожение молочнокислых бактерии, не только не действу-
ет отрицательно на дрожжи, но даже стимулирует их жизнедея-
тельность; не тормозит он деятельность и гидролитических фер-
ментов. Внесение лактоцида в сусло позволяет снизить расход
пара и кислот и, что самое главное, препятствуя развитию инфек-
ции, дает возможность проводить процесс брожения непрерывно,
повышая при этом выход спирта. Использование препарата в спир-
товой промышленности дает значительный экономический эффект.
Лактоцид рекомендуется к испытанию для борьбы с инфекцией
молочнокислыми бактериями и в других отраслях бродильной про-
мышленности, использующих дрожжи.
288
ИСПОЛЬЗОВАНИЕ
МОЛОЧНОКИСЛЫХ
БАКТЕРИЙ
В НАРОДНОМ ХОЗЯЙСТВЕ
10 Е. И. Квасников, О. А. Нестеренко
Молочнокислые бактерии широко и издавна используются во мно-
гих отраслях народного хозяйства. Вопросы их применения освеще-
ны в многочисленных работах по технологии ряда производств.
Мы остановимся только на микробиологических аспектах исполь-
зования молочнокислых бактерий в хлебопечении, мясной и рыбной
промышленности, получении молочной кислоты, биологическом
консервировании кормов (силосовании), овощей и фруктов.
Вопросы микробиологии молока и молочных продуктов доста-
точно полно изложены в крупных монографиях и обзорах (Коро-
лев, 1932; Скородумова, 1949; Войткевич, 1948; Непомнящая и др.,
1961; Фостер и др., 1961; Богданов, 1962; Королева, 1966; Богда-
нов и др., 1969; J. G. Davis, 1955, и др.). Поэтому мы не рассмат-
риваем их специально." Характеристика видов молочнокислых
бактерий, знание которой важно для работников молочной промыш-
ленности, дана нами в соответствующих разделах.
ХЛЕБОПЕЧЕНИЕ
Приготовление хлеба связано с рядом глубоко идущих физических
и химических изменений теста, оказывающих влияние на свойства
получаемого продукта (Козьмина, 1971; Ауэрман, 1972).
В состав муки, используемой для выпечки пшеничного и ржано-
го хлеба, входят компоненты, необходимые для развития многих
микроорганизмов. Там, кроме крахмала, имеется до 0,7—1,8%
(в пересчете на сухое вещество) сбраживаемых сахаров — глюко-
зы, фруктозы, мальтозы, сахарозы, раффинозы, мелибиозы и др.
При брожении теста микроорганизмы используют и те сахара,
которые накапливаются в тесте в процессе расщепления крахмала
муки амилолитическими ферментами ее.
Азотсодержащие вещества муки состоят главным образом из
разнообразных белков (альбумин, глобулин, пуротионин, глутеин,
глиадин); в ней имеются, хотя и в незначительном количестве,
и небелковые азотистые вещества — большой набор свободных
аминокислот и амиды. Кроме того, протеиназы муки, расщепляю-
щие белки пшеницы или ржи, обогащают тесто водорастворимыми
азотсодержащими соединениями, используемыми затем микроор-
ганизмами.
Мука содержит до 2% жиров и жироподобных веществ. В сос-
тав ее входит до 2% минеральных веществ, в том числе микроэле-
290
менты. Зерно пшеницы и ржи может обеспечить микроорганизмы
и почти всеми необходимыми им витаминами (Островский, 1949;
Ильинская, 1966; Ауэрман, 1972; Гришин и др., 1973; и др.)
Ниже дается химический состав зерна ржи и пшеницы (на
100 г сухих веществ ) (по Гришину и др., 1973).
Компонент Рожь ' Пшеница Компонент Рожь Пшеница
В % В мг
Вода 13,7 13,2 Са 115,0 44,0
Белок 11,6 11,7 Р 373,, 0 406,0
Жир 1,7 2,0 Каротин 0,25 0,23
Углеводы 69,0 69,3 Bi 0,35 0,48
Клетчатка 2,1 2,0 Ва 0,17 0,14
Минеральные ве- 1,9 1,8 Пантотеновая кис- 1,18
щества лота
В мг в6 — 0,44
Na 40,0 7,8 Е — 3,2
К 530,0 502,0
Mg 140,0 173.,0
Жизнедеятельность микроорганизмов, наряду с ферментами му-
ки, играет решающую роль в приготовлении хлеба. Мука всегда
содержит значительное количество различных микробов; число их
зависит от степени загрязненности зерна, способов очистки его
и т. д. (Мишустин, Трисвятский, 1963). Вносятся микроорганизмы
и с добавками к тесту. Из всего разнообразия микрофлоры муки
важнейшую роль в брожении теста играют дрожжи и молочнокис-
лые бактерии, для которых в тесте имеются все необходимые ус-
ловия: влажность (40—50%), незначительное содержание кисло-
рода и наличие необходимых, указанных выше, питательных ве-
ществ.
Практика хлебопечения издавна стала использовать закваски,
способствующие поднятию теста. Так, для разрыхления теста из
ржаной муки использовались куски квашеного теста от предыду-
щей выпечки, прибавляемого в качестве замеса к новому тесту;
использовали осадки, образуемые при приготовлении кваса
(«гущу»). Для хлебопечения употребляли также осадки дрож-
жей, полученные при приготовлении вина или пива. В середине
XIX столетия начали применять прессованные дрожжи, которые
изготавливались на специальных дрожжевых заводах. Дрожжам,
как известно, принадлежит ведущая роль в образовании пористо-
сти пшеничного и ржаного хлеба, от которой в значительной сте-
пени зависит его усвояемость.
291
10*
Молочнокислые бактерии заквасок и теста
Существенную роль в создании вкуса и аромата хлеба, особенно
ржаного, а также его усвояемости, играют различные виды
гомо- и гетероферментативных молочнокислых бактерий. В ре-
зультате сбраживания сахаров в тесте они образуют молочную,
уксусную, пропионовую, муравьиную кислоты, спирт и углекис-
лый г^з. Гомо- и гетероферментативные лактобациллы осуществ-
ляют 'также протеолиз белков пшеничной (Тульчинский, 1950) и
ржаной (Юргенсон, 1951) муки, способствуя накоплению
в заквасках и тесте азотсодержащих и водорастворимых веществ.
Они играют также определенную роль в создании аромата
хлеба. Так, М. Н. Тульчинский с сотрудниками (1938) пока-
зали, что хлеб, приготовленный с использованием выделенных
ими молочнокислых палочковидных бактерий (группа А), имел
большее содержание ацетилметилкарбинола, чем хлеб, выпеченный
только на дрожжах. При брожении кислого теста развивается
Streptococcus diacetilactis, способный, как известно, продуцировать
ароматические вещества — ацетоин и диацетил (Селибер, Пумпян-
ский, 1959). Образуемые молочнокислыми бактериями кислоты,
не влияя на дрожжи, подавляют гнилостные, маслянокислые, ук-
суснокислые бактерии, представителей группы кишечной палочки.
Совершенствование процессов хлебопечения было тесно связано
с развитием микробиологии. Углубленное изучение бактериальной
флоры заквасок и теста началось в конце прошлого и начале нас-
тоящего века. Первые исследователи описывали микрофлору
«самопроизвольного» брожения теста, т. е. брожения, возникающе-
го после замешивания муки с водой и вызываемого обитающими
в ней микроорганизмами.
Центральное внимание во все периоды исследований уделялось
вопросу микробиологии заквасок — селекции активных рас и со-
вершенствованию приемов их изготовления. Вопросы селекции
молочнокислых бактерий были тесно связаны с разносторонними
исследованиями их в заквасках и ржаном тесте, изучением осо-
бенностей физиологии и биохимизма.
Подробное описание ранних исследований по микробиологии
заквасок кислого теста и хлеба можно найти в работах В. Л. Оме-
лянского (1953а, б, в), В. А. Николаева (1932) и Шпихера (Spi-
cher, 1957). Ввиду того, что диагностика выделяемых штаммов мо-
лочнокислых бактерий, особенно в первый период исследований,
проводилась на основании изучения лишь немногих признаков,
виды описывались неполно и им давались нередко буквенные или
цифровые обозначения. Поэтому анализ результатов этих исследо-
ваний очень труден; укажем лишь на основные вехи работ.
Еще в 1888 г. М. Ф. Попов показал, что в ржаных заквасках
присутствуют не только дрожжи, но и специфические бактерии,
способные разрыхлять тесто и накапливать в нем кислоту благода-
ря их газообразующей и кислотообразующей способности.
292
Холлигер (Holliger, 1902) в работе «Бактериологическое иссле-
дование брожения теста» указывал на отсутствие принципиальной
разницы между брожением кислого (на заквасках из старого те-
ста) и дрожжевого (закваска на прессованных дрожжах) теста.
В анаэробных условиях выделения в заквасках и тесте автор об-
наружил три различных типа негазообразующих бактерий —про-
дуцентов молочной кислоты: 1) Bacillus lactis acidi Leichmann;
2) Вас. acidificans longissimus Lafar; 3) Bacterium lactis acidi
Leichmann. Следует отметить, что автор видел роль этих бактерий
не только в том, что они продуцировали кислоту в тесте, но и в их
антагонистическом действии на постороннюю микрофлору — ук-
суснокислые, маслянокислые и иные бактерии, вносимые с мукой.
Первые сведения об участии гетероферментативных молочно-
кислых бактерий в брожении кислого теста имеются у Геннеберга
(Henneberg, 1909). Он обнаружил в тесте два вида — Bacillus lac-
tis acidi Leichmann и Вас. panis fermentati Henneberg и считал,
что брожение теста происходит как за счет дрожжей, так и бак-
терий.
Беккард (Beccard, 1921, 1929) обнаружил в закваске гетеро-
ферментативные молочнокислые бактерии, образующие наряду
с молочной кислотой летучие кислоты, спирт и углекислый газ, и
считал, что только эти микроорганизмы следует употреблять для
приготовления теста без дрожжей. Как гомо-, так и гетерофермен-
тативные молочнокислые бактерии Беккард обозначил как «бак-
терии кислого теста».
Датский ученый Кнудсен (Knudsen, 1924) (цит. по Spicher,
1957) изучил большое число заквасок кислого теста различных дат-
ских пекарен и выделил молочнокислые бактерии, которые разделил
на две группы — А и В. К группе А автором отнесены гомофер-
ментативные бактерии Streptobacterium plantarum и термобакте-
рии «группы F». К группе В принадлежали культуры, образующие,
помимо молочной кислоты, значительное количество побочных про-
дуктов, главным образом летучих кислот (к ним отнесены пред-
ставители Betabacterium а, Р и 7, отличающиеся между собой по
ряду признаков).
В Советском Союзе был выполнен ряд крупных работ по изуче-
нию молочнокислых бактерий хлебных заквасок и теста, а также
возможности использования их в хлебопечении.
В. Л. Омелянский, изучавший в 1924 г. самопроизвольное бро-
жение теста, подтвердил данные разных исследований о том, что
самопроизвольное брожение теста происходит под влиянием специ-
фических бактерий-газообразователей, характерных для микрофло-
ры муки (В. Л. Омелянский, 19536)). Он показал, что эти микро-
организмы могут служить в качестве закваски для поднятия ржа-
ного теста.
Вопрос об использовании чистых культур бактерий кислого те-
ста для приготовления заквасок у нас в стране был поставлен, на-
чиная с 20-х годов, и другими авторами. При этом совершенно спра-
2931
ведливо исходили из того положения, что применение заквасок
гарантирует процесс хлебопечения от нежелательного влияния
посторонней микрофлоры муки и позволяет использовать нужные
штаммы в заданных количествах (Пасвик, 1923; Селибер, Бовшик,
1924; Палладии и др., 1932).
В. А. Николаев (1932) из пшеничных и ржаных хлебных заква-
сок и теста, изготовляемых в различных районах СССР, выделил
при ^2 и 37° на сусловом агаре с автолизатом дрожжей молочнокис-
лые*1 бактерии (a, fh, р2 и -f), отнесенные им к виду Lactobacillus
panis acidi sp. nov. Эти бактерии образовывали незначительное ко-
личество побочных продуктов; автор обнаружил также Streptococ-
cus lactis acidi Berg. В. А. Николаев считал, что в кислом брожении
теста бактерии спонтанного брожения (Bact. levans) не участвуют
и уживаются с типичными бактериями теста — а и Выделенные
автором микроорганизмы использовались для приготовления зак-
васок. При этом хлеб в опытных выпечках получался лучшего ка-
чества, чем при применении только прессованных дрожжей.
Г. Л. Селибер с сотрудниками (1933) из заквасок ленинград-
ских хлебозаводов, пекарен и лабораторных заквасок выделили мо-
лочнокислые бактерии, обозначенные как группы A (Streptobacte-
rium plantarum), В (род Betabacterium),С (родThermobacterium)
и Е (близкие к Bacterium lactis acidi Leichmann). По мнению Сели-
бера (1939), бактерии групп А и В наряду с дрожжами явля-
ются основными возбудителями брожения кислого теста. Специ-
ально поставленные опыты показали, что закваски, приготовленные
на культурах бактерий группы В, могут поднять тесто без дрож-
жей. В Ленинградском институте сельскохозяйственной микробио-
логии (Селибер, 1939) был разработан и способ приготовления за-
кваски на чистых культурах бактерий групп А и В, а также на
' дрожжах. Этот способ применялся на хлебозаводах Ленинграда и
других городов. Были получены и консервированные закваски по-
средством высушивания чистых культур молочнокислых бактерий
(или заквасок из теста, приготовленных на них) с мукой.
Чистые культуры бактерий для приготовления хлеба были в те
годы применены и рядом других исследователей (Мишустин, Мир-
зоева, 1936).
В центральной лаборатории Ленинградского треста хлебопече-
ния М. Н. Тульчинский с сотрудниками (1938) впервые в СССР
разработали способ применения бактериальных заквасок для при-
готовления густых головок при выпечке ржаного хлеба в широких
производственных масштабах, что послужило толчком к примене-
нию заквасок и для пшеничного хлеба. Авторы выделили на сусле
с мелом при 30—32° из заквасок микроорганизмы — представители
групп А, В, С, Е, сходные с описанными Кнудсеном (Knudsen,
1924) и Г. Л. Селибером с соавторами (1933). Изолированные чи-
стые культуры бактерий группы В увеличивали объем опары на
77,7%, закваски— на 28% и теста — на 42,5%, т. е. вполне могли
быть применимы для разрыхления ржаного теста, хотя на это тре-
294
бовалось значительно больше времени, чем при использовании
культур дрожжей. Смесь чистых культур молочнокислых бактерий
(вместе с дрожжами) группы А (штамм 6—33%) и В (штамм 8—
34%‘ и штамм 27—33%) была внедрена в производство на хлебо-
пекарных предприятиях ряда городов СССР и употребляется в
настоящее время.
Для приготовления ржаного хлеба употребляют и другие куль-
туры молочнокислых бактерий. А. Г. Егорова и соавторы (1963,
1964) из ржаных заквасок хорошего качества выделили
101 штамм молочнокислых бактерий группы А (образуют 87,9%
молочной и 7,4% летучих кислот) и В (образуют 72% молочной и
21%’ летучих кислот). Авторы показали, что хлеб, выпеченный с
применением гетероферментативных молочнокислых бактерий,
имеет лучший вкус, чем с использованием гомоферментативных.
Совместное введение в закваску одной культуры из группы А (А6з)
и двух из группы В (Вб и B?s) в соотношении 1:1:1 позволяет
получать наилучший вкус и аромат хлеба.
Авторы установили, что применение штамма А63 благотворно
сказывается на состоянии мякиша хлеба, а штаммы Bs и В?8 спо-
собствуют улучшению вкуса и аромата продукта. Важно, что,
по данным А. Г. Егоровой (1964), использование селекционирован-
ных чистых культур для приготовления густых заквасок обеспе-
чивает постоянство количественного содержания и качественного
состава продуктов молочнокислого брожения. Смесь трех культур
А63В5В78 апробирована в производственных условиях и внедрена
на ряде хлебозаводов для приготовления формового хлеба из ржа-
ной обойной муки.
Широкие опыты по изготовлению ржаного хлеба с применением
заквасок из молочнокислых бактерий (без дрожжей) были прове-
дены П. М. Плотниковым с сотрудниками (1953а, б, 1956). Авторы
показали, что на густой закваске с газообразующими молочнокис-
лыми бактериями без дрожжей при повышенной температуре (33—
35°) можно выпекать доброкачественный хлеб. Однако длительное
ведение закваски при этой температуре приводит к тому, что необ-
ходимая подъемная сила заквасок сохраняется лишь в течение 5—
7 суток, а затем снижается за счет уменьшения количества газооб-
разующих микроорганизмов. Это происходит в результате отсутст-
вия размножения дрожжей, снабжающих молочнокислые бактерии
витаминами при повышенной температуре. Добавление в закваску
витаминов Bi, В2 и В6 способствует повышению активности
молочнокислых бактерий и улучшению подъемной силы заквасок
(Плотников и др., 1961).
Е. А. Гладкова (1955) для приготовления жидкой закваски при
выпечке ржаного хлеба использовала штаммы гетероферментатив-
ных молочнокислых бактерий, относящихся к группе В. Закваска
была названа «Саратовская первая» (С-1). Эти работы явились на-
чалом использования на хлебозаводах способов выпечки ржаного
хлеба на жидких заквасках при непрерывном брожении теста.
295
Однако ржаной хлеб, полученный в течение первых суток, нередко
обладал низким качеством из-за недостаточной подъемной силы
закваски в разводочном цикле.
Лучшие результаты дают ржаные закваски, в которые вводятся
совместно специально отселекционированные чистые культуры
дрожжей и молочнокислых бактерий. Такие закваски успешно по-
добрали Ф. В. Тропин и Б. Д. Брагилевская (1956). Их закваска
(«Ивановская первая» — И-1) изготавливалась также из гетеро-
ферментативных бактерий группы В, но они были представлены
штаммами с оптимумом брожения 28—30° и 33—35°. Первый
применялся в холодное время года, второй — в теплое. В закваску
также вводится активная раса дрожжей. Готовая закваска име-
ет кислотность 9—11°. Образцы хлеба, приготовленные на этих
жидких заквасках, получили более высокую оценку, чем на «го-
ловках».
Г. М. Смирновой (1962) была изучена микрофлора ржаного
жидкого полуфабриката, схема приготовления которого непрерыв-
но-поточным методом (новая технологическая схема приготовления
хлеба) была разработана сотрудниками Центрального научно-ис-
следовательского института хлебопекарной промышленности
(ЦНИИХП). При этом способе происходит более активное накопле-
ние молочнокислых бактерий и дрожжей в жидком полуфабрикате.
В случае непрерывного тестоведения, как и при периодическом
подмолаживании заквасок, в них постепенно формируется опре-
деленная микрофлора, отличная от первоначально внесенных чи-
стых культур.
Следует остановиться на некоторых наиболее значительных ра-
ботах по изучению микрофлоры заквасок и кислого теста, выпол-
ненных и в других странах. Пелсенке с сотрудниками (Pelshenke et
al., 1939) из различных заквасок выделили не только Bacillus
lactis acidi Leichmann и Bacillus panis fermentati, но и Bacterium
cereale, Streptobacterium plantarum и Betabacterium у по Кнудсену
(Knudsen, 1924). Позднее Шульц (Schulz, 1941) изолировал из
ряда заквасок для кислого теста штаммы, подобные обнаруженным
Геннебергом (Henneberg, 1909) (табл. 51). Доминирующим кис-
лотообразователем был организм, близкий к Bact. (Bacillus) panis
fermentati Henneberg. Шульц в большом количестве обнаружил
также Streptococcus lacticus.
Описанные различными авторами молочнокислые бактерии за-
квасок и кислого теста и соответствующие им видовые названия
по определению Берджи (Breed et al., 1948) обобщены в табли-
це, составленной Шпихером (Spicher, 1957) (табл. 51).
С конца 50-х — начала 60-х годов микрофлору ржаного теста
широко изучают в ФРГ. Исследователи причислили многие из ра-
нее описанных организмов, выделенных из заквасок и кислого те-
ста, к известным в настоящее время и принятым в современных
определителях видам молочнокислых бактерий. Этим до некоторой
степени был упорядочен хаос, наблюдавшийся при установлении
296
видовых названий организмов, которое велось на основании раз-
личных принципов и по различным определителям.
Ранние исследователи выделение молочнокислых бактерий про-
водили на сусловом агаре с автолизатом и мелом, мясо-пептонном
агаре с глюкозой, средах из желатинизированных, профильтрован-
ных через свечи экстрактов из ржаных отрубей и т. д. Шпихер и
Фоуда (Spicher, Fonda, 1958) для этих целей рекомендовали сре-
ду: томатный сок — 400 мл, пептон — 10 г, пептонизированное мо-
локо —10 г, агар —Иг, дистиллированная вода —1 л’; pH среды —
6,1. Из каждого предварительно приготовленного разведения теста 4
(исходное —10 г теста в 90 мл физиологического раствора NaCl)
делается высев в указанную среду, разлитую высоким столбиком
в обычные пробирки или трубки Бурри и после плавления охлаж-
денную до 45°. Сверху наслаивают 1—2 мл стерильного голодного
агара. Три засеянные пробирки каждого разведения выращивают
в течение 3—5 дней при 30, 37 и 45°. После периода инкубации из
столбика агара, перенесенного в чашку Петри (по возможности из
нижней части его), петлей отбирают отдельные колонии, которые
переносят в жидкую среду указанного выше состава. Сверху нас-
лаивают 1—2 мл парафинового масла и посевы инкубируют при
25—30° в течение трех суток для обнаружения инфекции. После
этого растертые агаровые кусочки в питательном бульоне культи-
вируют при соответствующей температуре. Путем последователь-
ных высевов на твердые и жидкие среды проверяют чистоту
культур.
Пользуясь описанным методом выделения молочнокислых бак-
терий, Шпихер (Spicher, 1958а, Ь) изолировал молочнокислые бак-
терии из различных образцов теста и заквасок. Полученные штам-
мы отнесены к пяти группам (каждая группа соответствовала
определенному виду по определителю Берджи, 1957). Следует
отметить, что среди каждого вида обнаруживали штаммы (вариан-
ты), отклоняющиеся по признакам сбраживания того или иного
сахара или спирта от характеристики вида, данного в определителе.
Из взятых образцов теста и заквасок чаще всего автор выделял
вид Lactobacillus plantarum (2-ая группа), затем L. brevis (4-я),
реже — L. fermenti (5-ая), L. leichmannii (3-я) и очень редко —
L. delbruckii (Бая).
В дальнейшем Шпихер (Spicher, 1959а, Ь, 1961а, Ь) продолжил
исследования по изучению молочнокислых палочек кислого теста.
Изолированные штаммы автор отнес к восьми группам: 1— L. del-
bruckii, 2— L. leichmannii, 3— L. plantarum, 4— L. casei, 5— L. bre-
vis, 6—L. fermenti, 7—L. pastorianus, 8—L. buchneri. Наиболее
часто, как и прежде, изолировались L. plantarum, L. brevis, а так-
же L. casei. Причем, последний вид, наряду с L. pastorianus, впер-
вые был обнаружен в кислом тесте. По мнению Шпихера, Betabac-
terium соответствует скорее L. fermenti, a Bbm. 7 — L. buchneri
(табл. 51). Каждая из перечисленных выше групп организмов
отличается характерными свойствами, обусловливающими различ-
ную кислотность и величину pH в тесте при разных температурах.
лм
Бактерии 3, 5, 7 групп имеют температурный оптимум 30—35°; 1
и 8—35°; 2, 4 и 6—35° и 40°. Все представители групп (за исклю-
чением первой) растут при температуре ниже 20°; среда с pH 4,5
и ниже заметно угнетает рост «бактерий кислого теста».
В ряде работ немецких авторов (Schulz, Stephan, 1958; Spicher,
1959b, с, 1960, 1961a, 1968a, b, c; Rohrlich, Stegemann, 1958, и др.)
имеются представляющие интерес, особенно для исследователей,
занятых в области хлебопечения, данные о физиологии молочнокис-
лых бактерий, выделенных из заквасок и кислого теста, закономер-
ностях их развития, влиянии условий культивирования бактерий
на их свойства и ряд иных сведений. Тщательный подбор материа-
ла и критическая оценка некоторых из этих исследований даны в
работе Л. Я. Ауэрмана (1963).
Немецкими исследователями вводится такое понятие, как «кри-
тическая величина pH» (Rohrlich, Stegemann, 1958), обозначаю-
щее величину pH, при которой молочнокислые бактерии теста уже
не размножаются. Было показано, что она различна для разных бак-
терий. Так, L. brevis приостанавливает рост при более высоком pH
(4,2), чем L. plantarum (pH 4,0). Этим и объясняется тот факт, что
при длительном брожении теста, когда приостанавливается размно-
жение L. brevis при критическом значении pH, изменяется и соот-
ношение молочной кислоты и летучих в пользу молочной ввиду
продолжающегося размножения гомоферментативных бактерий
(L. plantarum).
В опытах Шпихера и Штефана (Spicher, Stephan, 1965) кислое
тесто с типичным для него ароматом было получено только с ис-
пользованием L. fermenti (6-ая группа) и L. brevis (5-ая группа),
но не микроорганизмов видов L. delbriickii (1-ая группа) или
L. pastorianus (7-ая группа).
Управление ходом микробиологических процессов в заквасках
и тесте, в частности, регулирование жизнедеятельности дрожжей
и, особенно, молочнокислых бактерий, является важным условием
интенсификации процессов приготовления хлеба и улучшения ка-
чества продукции.
Известно, что вкусовая кислотность и в какой-то мере аромат
ржаного хлеба определяются соотношением в нем летучих и мо-
лочной кислот. Если в хлебе содержание летучих кислот превы-
сит 30% от общего количества кислот, хлеб будет резко кислым.
Определенное влияние на вкус хлеба оказывает и присутствие ди-
и трикарбоновых кислот — винной, янтарной, лимонной, яблоч-
ной (Егорова, 1964; Ауэрман, 1972).
Регулирование накопления молочной и уксусной кислот в ржа-
ном тесте, по мнению одних исследователей (Егорова, 1964), можно
осуществлять подбором определенного соотношения гомо- и гетеро-
ферментативных бактерий, вводимых в ржаную закваску. Однако
другие авторы (Ауэрман, 1972, и др.) отмечают, что такой путь
недостаточно эффективен, так как со временем, через 3—4 суток,
видовой состав молочнокислых бактерий и соотношение молочной
298
и уксусной кислот в тесте приближаются к тем, которые устанав-
ливаются в заквасках и тесте спонтанно, при данном режиме их ве-
дения. В связи с этим основным способом регулирования накопле-
ния желаемого количества летучих и молочной кислот в тесте яв-
ляется изменение режима приготовления заквасок. Оно
предусматривает подбор определенного соотношения муки и воды,
повышение температуры приготовления заквасок и теста (Ауэр-
ман, 1972).
Уже давно специалистами хлебопечения изучаются вопросы ре-
гулирования жизнедеятельности дрожжей и бактерий в ржаном и
пшеничном тесте путем использования поваренной соли, соды, оки-
си кальция, соляной кислоты. Л. И. Рубенчик и М. В. Гальперин
(1935) отмечали, что 0,5% NaCl, добавленной в опару,стимулиру-
ет, а 2—3%! соли тормозит размножение дпожжей. Было установ-
лено, что при внесении до 0,8% NaCl во все фазы технологического,
приготовления хлеба улучшаются физические свойства хлеба,
а кислотность его понижается на 0,5—1°. Важно, что соленые опары
могли выдерживать 10-часовые простои. В ряде случаев при до-
бавлении соли отмечалось снижение кислотообразующей активно-
сти молочнокислых бактерий, используемых при приготовлении
жидких дрожжей; при этом тормозилась жизнедеятельность дрож-
жей (Ройтер и др., 1957; Берзина и др., 1957; Смирнова и др.,
1960).
Выделенные из кислого теста гетероферментативные бактерии
прекращают расти при 4%' соли, а гомоферментативные выдержи-
вают до 6—8% NaCl, при этом энергиякислотообразованияснижа-
ется (Spicher, 1961b). Добавление соли не только задерживает кис-
лотообразование, но и приводит к изменению состава микрофлоры
кислого теста, результатом чего является возрастание числа гомо-
ферментативных молочнокислых бактерий. При непрерывном при-
готовлении полуфабрикатов из ржаной и пшеничной муки кислото-
образование в готовой опаре, где имеется активная микрофлора,
можно затормозить прибавлением более 1,5%' соли (Смирнова
и др., 1960).
Добавление к тесту СаСОз тормозит падение pH, которое дер-
жится на уровне 5,3—4,7 (Rohrlich, Stegemann, 1958). Из-за бу-
ферного действия СаСОз в тесте из двух видов — L. brevis и
L. plantarum — быстрее развивается L. plantarum, в результате
чего накапливается больше молочной кислоты (возрастает коэф-
фициент брожения).
Некоторые особенности приготовления ржаного
и пшеничного теста
Ржаное тесто
Ржаной хлеб должен обладать более высокой кислотностью, чем
пшеничный. Это обусловлено не только необходимостью придания
ржаному хлебу определенного специфического вкуса, но также и
299
Таблица 51
Молочнокислые бактерии, выделенные различными авторами из кислого теста, и их современные названия (Spicher, 1957)
Автор Гомоферментативные Гетероферментативные Другие
L. lactis L. delbrueckii L. plantarum L. brevis L. fermenti
Holliger, 1902 Henneberg, 1909 Beccard, 1921 Knudsen, 1924 Вас. lactis acidi Leichmann Вас. lactis acidi Leichmann Вас. acidificans longissimus Lafar «Бактерйй кислого теста» Группа F (Ther- mobacterium) Streptobacterium plantarum Bacillus panis fer- mentati Henneberg «Бактерии кислогс Betabacterium a, ₽ теста» , T Bact. lactis aci- di(-Streptococ- cus lactis)
Pelshenke et al., 1939 Селибер, 1939 Schulz, 1941 Heinz, Klausho- fer, 1952 Вас. lactis acidi Leichmann Штамм 16 Bacterium cereale Streptobacterium plantarum Streptobacterium plantarum Bact. panis fermen tabacterium т Hem Betabacterium Штамм 28 Bacterium (Bacil- lus) panis fermen- tati tati или Be- leberg Streptococcus lacticus
тем, что повышенная кислотность (pH 4,4—4,2) и, особенно, при-
сутствие молочной кислоты тормозит деятельность некоторых фер-
ментов ржаной муки (например, а-амилазы). Это ведет к улучше-
нию физических свойств ржаного теста — нормализуется его влаж-
ность, липкость и т. д. (Смирнова, 1962; Ройтер, 1971; Ауэр-
ман, 1972).
Ржаное тесто готовят на заквасках, которые обеспечивают раз-
рыхление и кислотонакопление в тесте. Часто с этой целью исполь-
зуют, густые закваски — головки и квасы. Производственные гу-
стые закваски готовят в разводочном цикле, который состоит из
нескольких стадий подмолаживания закваски мучной питательной
средой до накопления ее в достаточном количестве (Богданов и
др., 1969; Ройтер, 1971; Ауэрман, 1972; Гришин и др., 1973).
В разводочном цикле в заквасках .развивается бактериальная
микрофлора, преимущественно молочнокислые палочки, обуслов-
ливающие дальнейшее брожение в тесте и высокую кислотность
его. Если в пшеничных заквасках отношение молочнокислых бак-
терий к дрожжам обычно 30 : 1, то в ржаных оно составляет 80:1
(Елецкий, 1967).
На многих хлебозаводах густые закваски приготавливают с по-
мощью чистых культур молочнокислых бактерий и дрожжей, кото-
рые добавляют в разводочном цикле вместо порции производст-
венной закваски предыдущего приготовления и прессованных
дрожжей. Это ускоряет приготовление заквасок и позволяет полу-
чать хлеб высокого качества.
В последнее время хлебопекарная промышленность широко ис-
пользует жидкие закваски, готовящиеся по непрерывно-поточно-
му способу, в которые также вводятся специально отселекциони-
рованные культуры молочнокислых бактерий. Известны четыре
основные схемы приготовления теста на жидких заквасках — Са-
ратовская первая (С-1), Ивановская первая (И-1), Ленинград-
ская и схема ВНИИХП (Технологическая инструкция по выра-
ботке хлебо-булочных изделий, 1960; Ройтер, 1966, 1971; Богданов
и др., 1969; Ауэрман, 1972, и др.).
Пшеничное тесто
Пшеничное тесто готовят двумя способами — опарным и безопар-
ным. При безопарном (т. н. однофазном) мука, дрожжи и все сы-
рье дается одновременно; при опарном способе сначала готовится
опара (более жидкое тесто из части муки и воды) с добавлением
дрожжей, а затем на основе забродившей опары замешивают те-
сто нормальной консистенции (Ройтер, 1971; Ауэрман, 1972; Гри-
шин и др., 1973, и др.). Технологические схемы приготовления
пшеничного теста постоянно совершенствуются. Готовят его обыч-
но на прессованных дрожжах. Вместе с тем многие хлебозаводы
для разрыхления теста используют жидкие закваски или жидкие
дрожжи, изготовляемые непосредственно на предприятиях,
301
Жидкие закваски представляют собой полуфабрикат, при
получении которого на осахаренных заварках или жидких водно-
мучных смесях при 28—30° одновременно размножаются мезо-
фильные молочнокислые бактерии и дрожжи, попавшие туда
спонтанно (с мукой и т. д.) или же внесенные специально. При-
готовление жидких заквасок производится по разработанным схе-
мам — Ленинградская-4 и др. (Островский, 1955; Ауэрман, 1972,
и ДР-)/
В пшеничном тесте, приготовленном на прессованных дрож-
жах, pH снижается незначительно (например, до pH 5,7), и молоч-
нокислые бактерии, попадающие в тесто с мукой и дрожжами, иг-
рают в брожении теста второстепенную роль. При использовании
же жидких заквасок в тесте протекает не только спиртовое, но и
активное молочнокислое брожение, и при этом pH теста спижа-
ется сильнее — до 4,7—4,8. Такое существенное подкисление мо-
жет быть желательно только при приготовлении из пшеничной или
ржаной муки теста, требующего высокой конечной кислотности.
Использование жидких заквасок для изготовления теста из пше-
ничной сортовбй муки может привести к нарастанию кислотности,
превышающему вкусовые и технологические нормы. Указанное
обстоятельство вынудило применять для разрыхления теста из выс-
ших сортов муки не жидкие закваски, а жидкие дрожжи.
Жидкие дрожжи — это полуфабрикат, в котором (в отли-
чие от жидкой закваски) основным компонентом, ведущим броже-
ние в тесте, являются не молочнокислые бактерии, а дрожжи. Для
достижения этого осахаренная и охлажденная до 50° мучная за-
варка заквашивается Lactobacillus delbrueckii до 10—14° Н (pH
3,7—3,9). На закисшем заторе затем при 28° в другой емкости
культивируют дрожжи, используемые для разрыхления теста. Низ-
кая кислотность затора служит, таким образом, для подавления
развития в тесте мезофильных молочнокислых бактерий и предо-
храняет его от нежелательного нарастания кислотности.
Рациональная непрерывно-поточная схема приготовления жид-
ких дрожжей была разработана А. И. Островским (1955). В настоя-
щее время более половины пшеничного хлеба (особенно из муки
второго сорта) изготавливается на жидких дрожжах, масштабы
применения которых возрастают (Ройтер, 1971).
При использовании L. delbrueckii для приготовления жидких
дрожжей заквашивание заварки 15—20 %-ми закисшего затора
до 12—14° Н длится от 12 до 18 час. И. М. Ройтер и Р. С. Баширо-
ва (1959; Баширова, I960) из кислых заквасок и муки Симферо-
польского хлебозавода выделили штамм молочнокислых бактерий
Э-1— энергичный кислотообразователь, заквашивающий зато-
ры в соотношении муки и воды 1:3 до. той же кислотности за 6—
8 час. При внесении в ржаную заварку 10—15% закваски (ки-
слотности 12—14° Н), сброженной штаммом Э-1, кислотность 12°Н
достигается за 4—6 час. Если же закваску вносить в заварку
из пшеничной муки II сорта, то эта кислотность нарастает через
7—8 час. (12 час. требовалось для бактерий Дельбрюка). Цикл
приготовления жидких дрожжей резко сокращается, так как на
закисание заторов тратилось в 4—5 раз больше времени, чем на
выращивание самих дрожжей.
В заварках, заквашенных штаммом Э-1, обнаруживается боль-
ше водорастворимого и аминного азота, чем в заварках, заква-
шенных бактериями Дельбрюка. Поэтому дрожжи, выращенные в
заторах, заквашенных штаммом Э-1, лучше размножаются и отли-
чаются большей подъемной силой (Ройтер, 1971).
Выделенный штамм Э-1 отличается по ряду признаков от L.
delbrueckii. В мучных заторах (мука:вода в соотношении 1:1,75 и
1:2) он образует до 4,1% молочной кислоты, a L. delbrueckii —
1,4%. Систематическое положение выделенного штамма требует
специального исследования.
По мнению Л. М. Кизенко и С. П. Другобицкой (1960), недо-
статком штамма Э-1 является снижение кислотообразования при
повышении начальной температуры заквашивания заварки до
54—56°, что часто наблюдалось в дрожжевых цехах хлебопекар-
ных заводов Украины. Однако Р. С. Баширова (1960) сообщила,
что ей удалось адаптировать бактерии Э-1 к повышенным темпера-
турам и получить вариант с оптимумом роста 52°, продуцирующий
повышенное количество кислоты. Его можно вводить в заторы с
температурой 55°.
Ряд хлебозаводов Украины и других республик полностью за-
менил L. delbrueckii штаммом Э-1, в результате чего продолжи-
тельность молочнокислого брожения сократилась более, чем в два
раза; уменьшилось и число заквасочных чанов. Быстрое накопле-
ние в заторах молочной кислоты предотвращает развитие посто-
ронней микрофлоры и позволяет работать длительное время без
обновления культуры.
Изложенные выше достижения в области изучения молочнокис-
лых бактерий, в целом, сыграли существенную роль в развитии
хлебопекарной промышленности.
Важное значение имели работы по селекции активных рас для
изготовления заквасок. Изучение особенностей физиологии и био-
химизма данных микроорганизмов создали предпосылки для раци-
ональной организации отдельных звеньев производства; для пере-
стройки их на непрерывные процессы. Повышена производитель-
ность заводов, улучшено качество и ассортимент изделий.
Однако еще много задач требуют своего решения. Молочнокис-
лые бактерии, принимающие участие в брожении теста, изучены
еще недостаточно полно.
Чрезвычайно важно дальнейшее изучение видового состава мо-
лочнокислых бактерий, выделенных из теста, на основе использо-
вания новейших достижений в области систематики этой группы
микроорганизмов. Необходимо коренным образом ликвидировать
303
ту путаницу, которая и поныне существует в названиях молочно-
кислых бактерий теста. Существующий хаос затрудняет анализ
полученных различными исследователями данных и делает невоз-
можным использование результатов ряда работ.
Важна дальнейшая селекция штаммов, которые можно исполь-
зовать для улучшения вкуса и аромата хлеба, особенно ржа-
ного.
Предстоят углубленные исследования процессов метаболизма
разлщ/пых групп молочнокислых бактерий, их взаимоотношений
с дрожжами и разработка принципов регулирования их жизнедея-
тельности в ассоциативных культурах в производственных суб-
стратах.
Новые задачи ставятся и в области изучения поведения мо-
лочнокислых бактерий в заквасках и тесте с целью дальнейшего
усовершенствования непрерывных процессов хлебопечения.
СИЛОСОВАНИЕ КОРМОВ
Высокая кормовая ценность силоса установлена давно. Доказано,
что он не уступает зеленому корму, сохраняя почти все питатель-
ные вещества и витамины зеленой массы. Кормление силосом
улучшает пищеварение животных и поедаемость других кормов,
входящих в рацион, повышает продуктивность коров, способствует
хорошему развитию молодняка. Силосованию кормов в нашей
стране уделяется исключительно большое внимание.
Научные основы силосования кормов достаточно полно раз-
работаны и освещены в обширной литературе (Мишустин, 1933;
Гардер и др., 1935; 1938; Зубрилин, 1943, 1947а, б; Зубрилин, Бо-
лотин, 1944; Зубрилин и др., 1950; Зубрилин, Мишустин, 1958;
Квасников, Сумневич, 1954; Henneberg, 1926; Virtanen, 1937;
Ruschmann, 1941; Richard, 1946; Барнет, 1955; и др.).
Силосование — сложный микробиологический процесс. С расти-
тельной массой в силосохранилище попадает огромное количество
разнообразных микроорганизмов. Во время силосования на отмер-
ших растениях многие из них начинают бурно размножаться. Пи-
тательной средой для микроорганизмов при этом являются соки
растений.
Одна из основных задач техники силосования заключается в
том, чтобы создать все условия для жизнедеятельности молочно-
кислых бактерий и подавления вредной микрофлоры.
Знание особенностей микрофлоры, развивающейся в силосе,
последовательности изменений в ее составе, факторов, которыми
возможно регулировать ее жизнедеятельность, в значительной сте-
пени дает ключ к управлению технологическими процессами си-
лосования. Направленность микробиологических процессов при
304
силосовании кормов определяется рядом факторов: составом расти-
тельной массы, ее водно-воздушным режимом, окислительно-вос-
становительным потенциалом и т. д.
Микрофлора силоса
Исследователями выделен из силоса ряд видов микроорганизмов,
характерных для отдельных фаз его созревания (табл. 52).
Ранние стадии силосования
Значительное увеличение числа микроорганизмов на растениях
(в 5—8 раз) наблюдается уже в течение двух-пяти часов после их
скашивания при увядании, резании и перевозке (Kroulik, 1953;
Kroulik et al., 1955a).
После закладки растительной массы в силосные сооружения и
плотной утрамбовки аэробные бактерии начинают быстро отми-
рать (Квасников, Сумневич, 1954; Kroulik et al., 1955а; Gibson et
al., 1958; Gibson, Stirling, 1959). Эти бактерии удавалось находить
в силосе только в первые несколько часов после силосования.
Строго же аэробные грамотрицательные пигментные (от желтого
до розового цвета колоний) палочки вытесняются уже вскоре
после начала силосования. Только в течение восьми часов обна-
руживаются плеоморфные формы аэробных микроорганизмов
(Langston et al., 1962).
В силосе, в ранней фазе, общее количество микроорганизмов
постепенно увеличивается и может достигать при 22—40° через
1—8 суток двух биллионов в 1 г (Kroulik, 1953). Активно размно-
жаются бактерии, способные к росту в анаэробных условиях,—
группа кишечной палочки, виды родов Clostridium, Bacillus, Strep-
tococcus, Leuconostoc, Pediococcus и Lactobacillus.
В первые дни в силосе из группы молочнокислых бактерий до-
минируют кокки (педиококки, Str. faecalis, Str. faecalis var. lique-
faciens, Str. faecium и Leuconostoc mesenteroides), попадающие в
него с растительной массой. Появляются в этот период и молочно-
кислые палочки — L. plantarum, L. casei, L. brevis, L. fermenti
(Михайлова, 1958; Квасников, 1960; Burkey et al., 1953; Langston,
Bouma, 1960b; Langston et al., 1962). Однако даже в тех случаях,
когда в микрофлоре трав второго и третьего укосов содержалось
много молочнокислых палочек, они в первые два дня силосования
вытесняются кокками (Langston, Bouma, 1960b).
Почти сразу же после наполнения силосного сооружения начи-
нают размножаться и анаэробные клостридии — Cl. butyricum,
Cl. paraputrificum, Cl. sporogenes, Cl. bifermentans (Bryant et al.,
1952; Gibson et al., 1958). Сахаролитические клостридии [Cl. sphe-
noides, Cl. skatol, Cl. perfringens (Cl. welchii) ] и несколько других
неидентифицированных типов анаэробов встречаются в силбсе
регулярно. Однако их отрицательная роль отчетливо проявляется
.305
Таблица 52
Видовой состав микрофлоры силоса
Вид
Автор
Ранняя фаза
Streptg«occus faecalis, Str. faecalis
var. liquefaciens, Pediococcus cerevi-
siae
Str. lactis
Str. lactis, Str. cremoris
Leuconostoc mesenteroides
Str. faecium var. mobilis
Lactobacillus plantarum
L. acidophilus
L. casei
L. brevis
Clostridium butyricum
Cl. tyrobutyricum
Cl.,paraputrificum
Cl. sporogenes, Cl. bifermentans
силосования
Langston, Bouma, 1960a
Михайлова, 1958
Квасников, 1960
Langston, Bouma, 1960a, Квасников, 1960
Langston et al., 1960b
Burkey et al., 1953; CHbson et al., 1958; Ми-
хайлова, 1958; Langston, Bouma, 1960a;
Квасников, 1960
Gibson et al., 1958; Keddie, 1959
Pette, 1947; Langston, Bouma, 1960a; Несте-
ренко, 1964
Keddie, 1959; Langston, Bouma, 1960a;
Квасников, 1960
Чижик, 1955; Rosenberger, 1956; Gibson et
al., 1958 ‘
Bryant et al., 1952; Bryant, Burkey, 1956;
Gibson et al., 1958, 1961
Rosenberger, 1956; Gibson et al., 1958, 1961
Rosenberger, 1956
Зрелый силос
L. plantarum, L. fermenti, L. buch-
neri
L. brevis
L. arabinosus, L. bifidus, L. pento-
sus
Cl. welchii (Cl. perfringens), Cl. sca-
tologenes, Cl. acetobutylicum
Cl. sphenoides
Propionibacterium freudenreichii, Prb.
zeae
Zygosaccharomyces mrackii, Torulop-
sis wickerhamii
Candida krusei, C. tropicalis, C. solani,
C. mycoderma, Hansenula anomala,
Torulopsis holmii, T. famata, Zygo-
fabospora marxiana, Rhodotorula mu-
cilaginosa, Rh. minuta, Pichia alco-
holophila, Zygopichia chevalieri, Z.
farinosa, Trichosporon sericeum, Sac-
charomyces cerevisiae
Gibson et al., 1958, 1961; Квасников 1960
Pette, 1947; Olsen, 1951; Квасников, 1930;
Langston, Bouma, 1960a
Langston, Bouma, 1960a
Rosenberger, 1956
Gibson, 1965
de Man, 1957
Caprlottl, 1958a, b
Щолокова, 1964
306
Таблица 52 (окончание)
Вид Автор
C. krusei, C. tropicalis, Sacch. cerevi- siae, Sacch. heterogenicus, S. prosto- serdovi, Sporobolomyces albo-rubes- cens, Trichosporon margariti ferum, Tr. fermentans, Tr. behrendii Федулина, 1965
Alterharia tenuis, Asp. fumigatus, Fusarium moniliforma, Monascus pur- pureus, Mucor janssenii, M. racemo- sus, Geotrichum candidum, Penicil- lium purpurogenum, Chlamydomyces palmarum, Cladosporium elatum Bonner, Fergus, 1960
в «неустойчивом силосе». Cl. sphenoides способен ферментировать
малаты и цитраты, Cl. skatol на питательных средах продуцирует
скатол (Rosenberger, 1959). Подавлению развития клостридиев в
силосе способствуют два фактора: накопление молочной кислоты
и уменьшение содержания воды в растительном материале (Gib-
son, 1965; Beck, 1972).
Наибольшее количество дрожжей в силосе обнаруживается в
начале силосования, а на вторые-третьи сутки оно начинает сни-
жаться (Мишустин, 1933; Зубрилин, Мишустин, 1958; Щолокова,
1964, и др.). Е. Н. Мишустин и В. А. Мирзоева (1963) считают,
что депрессивное состояние дрожжей в силосе обусловлено тем,
что они не могут развиваться в условиях низкого окислительно-
восстановительного потенциала, создаваемого молочнокислыми
бактериями. Существенную роль во взаимоотношениях молочно-
кислых бактерий и дрожжей в силосе играют и видовые особен-
ности культур молочнокислых бактерий (Квасников, Щолокова,
1967).
После увеличения до максимума содержание хромогенных и
колиподобных бактерий быстро снижается, и они исчезают совсем
в течение 15 суток. Уменьшение же факультативных анаэробов,
в частности микроорганизмов из рода Flavobacterium, как счита-
ют Лангстон и соавторы (Langston et al., 1962), связано скорее с
действием кислоты, чем с их потребностями в кислороде.
В этот период силосования (от 8 до 15 суток) молочнокислые
бактерии вытесняют первоначальную микрофлору. Как указывали
мы выше, в начале брожения доминируют стрептококки, а когда
они вытесняются, увеличивается количество педиококков, лейко-
ностоков и гомоферментативных лактобацилл, а позже гетерофер-
ментативных. Особенно важную роль играют стрептококки, так
как они способны конкурировать с грамотрицательными бактерия-
ми в начальный период силосования (Gibson, Stirling, 1959; Langs-
ton et al., 1962).
3071
В основной и конечной стадиях брожения, протекающего в си-
лосах, ведущую роль играют три вида молочнокислых бактерий —
L. brevis, L. plantarum и педиококки. В плохом силосе из трав,
на последней стадии, кроме этих микроорганизмов, обнаружива-
ются в довольно большом количестве еще слабоферментирующие
штаммы L. casei (Langston, Bouma, 1960b).
Последовательность изменений в силосе от пигментных грам-
отрицательных бактерий к кислотообразующим лактобациллам наб-
людали также другие исследователи (Зубрилин, Мишустин, 1958;
Квасников, 1960; Burkey et al., 1953; Kroulik et al., 1955b; Nilsson,
1956; Dobrogozc, Stone, 1958; Kempton, San Clemente, 1959; Ochi
et al., 1965a).
Постепенное уменьшение общего числа бактерий, начинающе-
еся после 15 суток силосования, охватывает период приблизитель-
но в 60 суток. Количество микроорганизмов за это время снижа-
ется примерно до 1 млн. (Kroulik, 1953). Быстрое размножение
бактерий до высокого пика, за которым следует резкое уменьше-
ние количества жизнеспособных клеток, считается показателем
хорошего процесса брожения.
Поздние стадии силосования
О микробиологических изменениях, происходящих при длитель-
ном хранении силоса, мало сведений. Вопрос еще осложняется тем,
что во многих работах не проводится разграничений между ростом
бактерий и выживанием их в этот период (Gibson, Stirling, 1959).
Небольшое увеличение количества микроорганизмов на поздней
стадии брожения наблюдал Кроулик (Kroulik, 1953). В силосе,
где pH не стабилизировалось кислотой, отмечался вторичный рост
педиококков (Kroulik et al., 1955а). Джибсон с соавторами (Gib-
son et al., 1958) отмечали нерегулярность развития в силосе мо-
лочнокислых бактерий: в одних образцах они доминировали, в дру-
гих полностью отсутствовали, независимо от того, был ли силос
хорошего или плохого качества. Грамотрицательные палочки из
рода Flavobacterium находили не только на ранних, но и на позд-
них стадиях силосования (Kempton, San Clemente, 1959).
Барнет (1955), исходя из подсчета количества спор в старом
силосе, высказал предположение, что анаэробы становятся актив-
ными в период его хранения, если pH среды повышается. По мне-
нию других исследователей (Kempton, San Clemente, 1959), повы-
шение pH в силосе и его порча наступают лишь в результате энер-
гичного размножения клостридиев в начальный период силосования
и потребления ими молочной кислоты. Об этом же свидетельству-
ют опыты Ленгстона с соавторами (Langston et al., 1958), которые
установили, что в плохом силосе потребляющие лактат анаэробы
размножаются в начале процесса брожения и число их достигает
максимума в несколько суток. Количество же спор этих бактерий
увеличивается только в конце периода хранения.
308
В ряде работ (Зубрилин, Мишустин, 1958; Szember, 1952;
Bujak, Kasperzycka, 1956; Szember, Slupczynski, 1964; Ochi et al.,
1965a) сообщается об увеличении числа дрожжей в конце процес-
са силосования.
В литературе нам не удалось найти убедительных данных о
развитии в силосе пропионовокислых бактерий, хотя пропионовая
кислота часто в нем обнаруживается. Де Мен (De Man, 1957) изо-
лировал два штамма Propionibacterium freudenreichii и четыре
штамма Р. zeae, но активность этих бактерий в силосе не была ус-
тановлена. Пропионовокислые бактерии, возможно, и могут участ-
вовать в разрушении лактата, однако их действие на лактат или
сукцйнат сопряжено с малым снижением кислотности (Gibson,
1965).
Большинство исследователей придерживается того мнения,
что пропионовая кислота при силосовании образуется главным
образом в результате протеолитической активности анаэробов.
Cl. propionicum в силосе не был обнаружен, хотя этот вид был най-
ден на траве (Johns, 1952).
Свойства молочнокислых бактерий, выделенных из зрелых си-
лосов, характеризуются, как правило, рядом общих черт. В боль-
шинстве случаев они развиваются при температурных границах
6—42°, с оптимумом 25—30°. Однако есть указания на развитие
в силосах бактерий, размножающихся и при более низкой темпе-
ратуре. Так, из силосов, созревающих зимой при низкой темпе-
ратуре (около 4°), Е. Н. Мишустину (1933) удалось выделить мо-
лочнокислые стрептококки, вполне жизнедеятельные при 4—5°.
Помимо кокков при низкой температуре развиваются и палочки.
Установлено также, что некоторые молочнокислые бактерии мо-
гут развиваться при очень высоких температурах силосования.
Нам из силосов, закладываемых в зимнее время (мякина, ке-
наф и др.) в Средней Азии, удалось выделить молочнокислые бак-
терии (стрептококки и палочки), активные при 3—5°. Верхние же
температурные границы развития некоторых местных штаммов
достигали 55—57°, а у единичных — даже 60°.
Изучая температурные границы развития этих бактерий, мы
смогли выделить ряд штаммов, обладающих более широким ин-
тервалом между минимальной и максимальной температурой (в
среднем на 2—3°), чем формы, описываемые исследователями, ра-
ботавшими в Европейской части СССР и зарубежными исследова-
телями. Так, широкие интервалы мы наблюдали у L. plantarum,
L. brevis и Str. lactis. Указанное явление, очевидно, обусловлено
приспособлением микроорганизмов к развитию в условиях резко
континентального климата с сильными суточными колебаниями
температур.
Штаммы L. plantarum, выделенные нами из силосов, в опти-
мальных условиях размножаются при крайних значениях pH 3,4
и 8,0. Развиваясь в силосе, молочнокислые бактерии значительно
уменьшают окислительно-восстановительный потенциал среды.
309
Состав продуктов брожения в силосе в известной степени опре-
деляется в зависимости от имеющихся в нем сахаров. При сбражи-
вании пентоз образуется много уксусной кислоты (Зубрилин и др.,
1950, и др.). Так как в растениях всегда содержатся пентозаны,
часть уксусной кислоты силоса накапливается за счет их сбражи-
вания гетероферментативными молочнокислыми бактериями. Об-
разуется она и при сбраживании ими других сахаров. На взаимо-
отношение органических кислот, образующихся при силосовании,
влияний оказывает и температура брожения. Некоторые авторы
(Афанасьева, Чижик, 1938) полагают, что оптимальная температу-
ра для наибольшего выхода молочной кислоты и наименьшего ук-
сусной — 25°.
Таким образом, состав растительной массы, а также темпера-
турный режим влияют на характер молочнокислого брожения при
силосовании кормов. Можно предположить, что лучшая силосуе-
мость растительных смесей, по сравнению с отдельными компо-
нентами, в значительной степени объясняется взаимным обогаще-
нием их веществами, необходимыми для полноценной деятельно-
сти молочнокислых бактерий.
О природе подавляющего влияния молочнокислых бактерий на
вредную микрофлору силоса существует несколько мнений.
Молочная кислота, образующаяся при брожении, создает в сре-
де активную кислотность, неблагоприятно действующую на микро-
организмы, обитающие на растительной массе. Влияние активной
кислотности на развитие различных микроорганизмов изучалось
многими авторами.
Приведем крайние границы pH развития различных групп
эпифитных микроорганизмов.
Группа бактерий Примерный интервал развития мик робов Примерный Группа бактерий развития микробов
Гнилостные бактерии 4,4—8,5 Группа кишечной палоч- 5,0—8,0
Молочнокислые кокки 3,5-8,0 ки
Молочнокислые палочки 3,3—8,0 Плесневые грибы 1,0—9,0
Маслянокислые палочки 4,5-8,5 Дрожжи 3,0—7,0
Высокая активная кислотность быстро подавляет гнилостные и
маслянокислые бактерии и представителей группы кишечной па-
лочки, которые к ней менее устойчивы, чем молочнокислые бакте-
рии. Лишь немногие микроорганизмы (ряд видов дрожжей и плес-
невых грибов) обладают большей кислотоустойчивостью, чем мо-
лочнокислые бактерии.
Некоторые авторы считают, что высокая активная кислотность,
образующаяся при молочнокислом брожении, обладает основным
консервирующим действием в сохранении силоса. Так, Бейнум и
310
Пит (van Beynum, Pette, 1936) делят все силосы на «стабильные»
и «лабильные» в зависимости от их pH. Силос с pH 4,0 — 4,2 они
оценивают как «стабильный», а свыше 4,2 — как «лабильный», не-
устойчивый.
А. А. Зубрилин (1947а, б, 1950, и др.) в ряде своих работ дает
оценку силосуемости растений по «сахарному минимуму», подра-
зумевая под ним такое количество сахара, которое необходимо для
накопления в силосуемом корме молочной кислоты в количестве,
обеспечивающем сдвиг активной кислотности силоса до pH 4,2 при
данной буферности исходного сырья. Однако нередко силос с мень-
шей активной кислотностью хорошо сохраняется и оказывается
очень стойким. На это указывают Ричард (Richard, 1946) и другие.
При силосовании кормов в Средней Азии мы неоднократно наблю-
дали то же явление.
Имеется ряд работ, указывающих, что существенную бактери-
цидную роль играет и недиссоциированная часть молочной кисло-
ты. Ричард на основании своих работ пришел к заключению, что
одни минеральные кислоты (недиссоциированная их часть) не
влияют губительно на маслянокислые бактерии (Clostridium buty-
ricum). Добавлением этих кислот необходимо pH снизить до
4,0—4,2, но и это не всегда оказывает бактерицидное действие. Ав-
тор считает, что слабодиссоциированные органические кислоты
сильнее действуют на маслянокислые бактерии, чем минеральные.
Он приходит к выводу, что самое главное получить в силосе боль-
ше молочной кислоты, т. е. повести процесс силосования по пути
гомоферментативного молочнокислого брожения. Взгляды Ричарда
нашли сторонников и среди более поздних исследователей. Ессен и
Швердт (Jessen, Schwerdt, 1951) также полагают, что токсическим
фактором в силосе является не активная кислотность, а недиссо-
циированная часть молочной кислоты.
Таким образом, взгляды на природу консервирующего действия
молочнокислых бактерий в силосе достаточно противоречивы. Ана-
лизируя их и учитывая описанные выше результаты исследований
свойств молочнокислых бактерий, мы можем утверждать, что роль
молочнокислых бактерий в процессе силосования кормов не сле-
дует сводить к одному фактору. Несомненно, ведущее значение в
консервировании растительных материалов имеет активная кис-
лотность среды, но существенное бактерицидное действие оказы-
вает и недиссоциированная часть молекулы молочной кислоты.
Следует также учитывать и способность молочнокислых бактерий
образовывать специфические антибиотические вещества (Mattick,
Hirsch, 1947; Полонская, 1952; Vincent et al, 1959; Квасников, Су-
денко, 1967в, и др.).
Лишь в последнее время началось изучение антагони-
стического действия различных микроорганиз-
мов силоса на молочнокислые бактерии. Нильсон
(Nilsson, 1956) обнаружил много антагонистов молочнокислых
бактерий как в аэробных, так и анаэробных условиях силордвания
311
и полагал, что им принадлежит определенная отрицательная роль
в процессе консервирования. Антагонист силосных молочнокислых
бактерий был выделен П. И. Соколовым (1959), однако видовая
принадлежность этого микроорганизма им не была установлена.
С. Недялков (1964) описал ингибирование молочнокислых бакте-
рий грамотрицательными бактериями и некоторыми штаммами
группы subtilis-mesentericus. Однако Джибсон с сотрудниками
(Gibson et al., 1958) не наблюдали в своих опытах антагонистичес-
ких отношений между силосными бактериями.
Наши многолетние наблюдения показывают, что микроорганиз-
мы, обитающие в силосе, не оказывают сколько-нибудь значитель-
ного антагонистического действия по отношению к молочнокислым
бактериям.
Роль различных факторов
при регулировании микробиологических процессов
в силосе
Направленность микробиологических процессов в растительной
массе, заложенной в силосные сооружения, определяется воздейст-
вием на нее ряда факторов. При разработке научно обоснованных
приемов силосования, их влияние принято оценивать преимуще-
ственно по биохимическим показателям и кормовой ценности го-
тового силоса. Характер воздействия отдельных факторов на мик-
рофлору силоса изучен значительно слабее.
Сырье для силосования. Вопрос о подборе сырья для изготов-
ления силоса является одним из наиболее изученных. Содержание
растворимых углеводов и других составных частей в раститель-
ной массе оказывает существенное влияние на развитие отдель-
ных групп микроорганизмов в силосе.
А. А. Зубрилин и Е. Н. Мишустин (1958) указывают, что кон-
центрация моно- и дисахаридов в растительной массе является од-
ним из факторов, лимитирующих молочнокислое брожение в сило-
се. В силосе с небольшим количеством сахара развитие молочно-
кислых бактерий прекращается в более ранние сроки, чем в силосе
с высоким содержанием сахара (Langston et al., 1962).
Внесение'дополнительных питательных веществ в силосуемую
массу для направленного стимулирования развития микрофлоры
уже давно использовалось в практике. Добавление мелассы
(1—3%) при силосовании люцерны и других трудносилосующих-
ся растений стимулирует размножение молочнокислых бактерий
особенно тогда, когда добавляются закваски для подавления посто-
ронней микрофлоры (Квасников, Сумневич, 1955; Stone et al., 1943;
Watson, Smith, 1951; Archibald et al., 1954; Smyk, 1957; Bal-
zar et al., 1962; Svenson, Tveit, 1964, и др.).
Данные об эффективности внесения муки (овсяной, ячменной,
кукурузной) на протекание микробиологических процессов в сило-
се противоречивы. Таким методом улучшали качество клеверного
и травяного силоса (Jarl, 1951, цит. по Rydin, 1956; и др.).
312
Положительные результаты были получены и при силосовании
люцерны с добавлением 2—3% любой муки грубого помола, предва-
рительно осахаренной, а также при совместном внесении муки и
солода (Квасников, Сумневич, 1955; Rydin et al., 1956, и др.). Од-
нако при добавлении крахмала благоприятного эффекта не полу-
чили (Rydin et al., 1956). Наоборот, при этом усиливалось образо-
вание масляной кислоты, так как маслянокислые бактерии способ-
ны активно ферментировать крахмал. Особенно отрицательным бы-
ло воздействие крахмала на процесс брожения при 32°. При 16°,
когда рост маслянокислых бактерий значительно подавлялся, си-
лос с крахмалом получался хорошим.
Расхождение в результатах отдельных исследователей, по-ви-
димому, объясняются тем, что внесенный неосахаренный крахмал
не во всех условиях опытов глубоко и быстро гидролизовался амило-
литическими ферментами растительной массы. Оставшийся неоса-
харенный крахмал активно атаковался маслянокислыми и другими
бактериями, в результате чего качество силоса резко ухудшалось.
При внесении в растительную массу мочевины в силосе размно-
жаются микроорганизмы с активной уреазой. Особенно много этих
бактерий выделяется из образцов, взятых из силоса 2,5-месячного
возраста. При дальнейшем хранении силоса количество их заметно
снижалось (Гусев, 1964).
Влажность. Наиболее благоприятной для развития молочнокис-
лых бактерий в силосе является влажность порядка 70—75% (Зуб-
рилин и др., 1950; Burkey, Kroulik, 1953, и др.). При избыточной
влажности наблюдается усиленный рост Cl. butyricum, накапли-
вающего в силосе значительное количество масляной кислоты (Ar-
chibald, Kusmesky, 1954, и др.). Грибы обычно наиболее активно
растут при влажности 85—95% и температуре 25°. С уменьше-
нием влажности до 80% рост их замедляется, а ниже 65% растут
только Asp. fumigatus и Monoascus purpureum (Bonner, Fer-
gus, 1960).
В последние годы в практике силосования все большее место
завоевывает приготовление сенажа. Биологическому консервирова-
нию в силосных сооружениях при этом подвергается предвари-
тельно подсушенная (подвяленная) чаще всего до 55—65% влаж-
ности измельченная растительная масса.
Консервирующим веществом в сенаже является молочная кис-
лота и углекислота, которая выделяется при дыхании зеленой мас-
сы при созданных условиях (клетки еще живы, достаточно тепла).
Превращение сахаров в молочную кислоту происходит только на
15—20% от общего их содержания в растениях. Вследствие этого
сенаж по кормовой ценности превышает обыкновенный силос—
около 80% сахаров растительной массы в нем остаются несбро-
женными.
Подвяливание трудносилосующихся растений в опытах ряда
исследователей давало положительные результаты. Удавалось ус-
пешно силосовать люцерну, предварительно подвяленную до 65—
313
68% влажности (Stone et al., 1943; Квасников, Сумневич, 1955,
и др.). Многие злаковые и ряд бобовых трав подвяливали до со-
держания сухого вещества в растительном материале 55—65% и
силосовали в герметизированных силосных сооружениях. При
этом потери питательных веществ снижались и составляли в сред-
нем 6,8% (Лемминг, 1971). В подвяленной траве увеличивается
содержание сахара, что, по-видимому, связано не только с потерей
воды,, но и с активизацией деятельности некоторых видов бакте-
рий, образующих амилазы (споровые бактерии группы subtilis-me-
sentericus, Вас. mycoides). На этом основании Ридин (Rydin, 1957)
высказал предположение, что бактериальные энзимы могут играть
важную роль в гидролизе полисахаридов, который наблюдается
во время завядания растений и в силосе, особенно при высоком
проценте сухого вещества.
Согласно данным Ленигена (Lanigan, 1963), некоторые молоч-
нокислые бактерии, особенно L. plantarum, устойчивы к уменьше-
нию содержания воды. В силосах с пониженной влажностью у
L. plantarum наблюдается тенденция опережать в росте L. brevis
и Р. cerevisiae. Хотя количество молочнокислых палочек в силосе
из подсушенной травы достигает максимума лишь к 9—16 суткам
(Kroulik et al., 1955b; Wieringa, 1958; McDonald et al., 1965), а мо-
лочной кислоты — к 20 (Orth et al., 1960), он сохраняется хорошо.
В результате повышения осмотического давления развитие масля-
нокислых бактерий подавляется. В подвяленном травяном силосе
обнаружены Str. faecalis, Str. faecalis var. liquefaciens, Leuc. me-
senteroides и P. cerevisiae (Langston et al., 1960b).
Микробиологические процессы в сенаже идут медленнее, чем
в силосе. В нем максимальное число микроорганизмов обнаружи-
вается только на 15-е сутки после его закладки. При хранении в
сенаже так же, как и в силосе, через месяц число жизнеспособных
клеток бактерий резко снижается (Коленько и др., 1972). Ми-
шустин и Лапотышкин (1974) утверждают, что в подвяленном
клевере с 64 и 50% влажности максимальное число микроорга-
низмов обнаруживается на седьмые сутки созревания сенажа (в
силосе с 74% влажности — на третьи). В подсушенном корме
размножаются, в основном, молочнокислые бактерии; другие эпи-
фитные бактерии развиваются слабее, чем во влажном. Условия
относительной физиологической сухости, создаваемые в сенаже,
только замедляют развитие молочнокислых бактерий и в то же
время оказывают губительное влияние на рост нежелательных
микроорганизмов. Проведенные авторами опыты убедительно по-
казали, что культуры молочнокислых бактерий, выделенные из се-
нажа, являются более осмофильными, чем другие, обитающие на
растениях микроорганизмы.
Анаэробиоз. Практика уже давно установила, что для получе-
ния высококачественного силоса огромное значение имеет созда-
ние анаэробных условий в растительной массе, заложенной в си-
лосные сооружения. Исследования показали, что только при плот-
314
ной укладке, хорошей трамбовке и укрытии микробиологические
и биохимические процессы обеспечивают биологическое консерви-
рование корма с минимальными потерями питательных веществ.
В последние годы ряд работ был посвящен сравнительному изуче-
нию микробиологических процессов в силосах при закладке его
с плотной утрамбовкой растительного материала и при доступе
воздуха.
В аэробном силосе количество молочнокислых бактерий быстро
падает после начального подъема; в анаэробном оно остается вы-
соким (Р. Е. Nilsson, 1956). Значительное количество анаэробов,
которое обнаруживается в аэрируемом силосе, как полагает автор,
обусловлено тем, что условия для их развития создаются в резуль-
тате деятельности аэробных бактерий. Благоприятное воздействие
на рост маслянокислых бактерий, по наблюдениям Г. Я. Чижик
(1955), оказывает развитие гнилостных бактерий, дрожжей и
плесневых грибов. При аэрации силоса нарушается смена форм
бактерий, характерная для растительной массы, засилосованной в
анаэробных условиях, резко снижается содержание стрептококков
и они уже не могут конкурировать с грамотрицательными бакте-
риями; быстро исчезают и лейконостоки. К седьмым суткам в за-
крытом силосе наблюдается высокий процент гомоферментативных
молочнокислых бактерий, в аэрируемом — педиококков. Хотя позд-
нее в этом силосе и появляется достаточное количество молочно-
кислых палочек, они уже не могут предотвратить разложение ра-
стительной массы (Langston et al., 1962).
Температура. Характер влияния различных температур на мик-
робиологические процессы в силосе достаточно полно был изучен
в работах ранних исследователей. Последующие работы не внесли
ничего принципиально нового в установленные положения.
Высокая температура способствует быстрому протеканию про-
цессов брожения в клеверно-травяном силосе. При этом усили-
вается разрушение белковых веществ и образование аммиака, ко-
торый повышает pH среды. В результате создаются благоприятные
условия для развития анаэробной микрофлоры. Силос плохого
качества получается при 24 и 32°; лучший — при 20°. По-видимо-
му, температура 32° является оптимальной для размножения в си-
лосе как молочнокислых, так и маслянокислых бактерий, а при
16 и 20° рост маслянокислых бактерий заметно подавляется.
При 28° анаэробных спорообразователей было почти в 10 раз боль-
ше, чем при 16° (В. Nilsson et al., 1956; Rydin et al., 1956).
Эти данные подтверждает работа Джибсона с соавторами (Gib-
son et al., 1958), которые показали, что в силосах, приготовленных
при 40 и 22°, развитие грамотрицательных бактерий больше тор-
мозится при высокой температуре, а представителей родов Clos-
tridium и Bacillus — при низкой.
Педиококки хорошо растут при 45°, в то время как для силос-
ных штаммов L. brevis и L. plantarum оптимальной температурой
роста является 30—35°, выше 40° их количество резко падает,
315
а при 45° они совсем не развиваются или развиваются очень слабо.
Даже L. fermenti, которые энергично растут на лабораторных сре-
дах при 45°, не способны конкурировать в силосе с педиококками
при этой температуре (Lanigan, 1965).
Консервирующие вещества. Виртанен (Virtanen, 1937) в усло-
виях Финляндии предложил свой способ силосования, известный
под названием A. I. V. Его основой является подкисление свежего
материала до pH между 4 и 3. Для этих целей автор рекомендует
минеральные кислоты (серная, соляная). По его данным, консер-
вирование кормов по способу A. I. V. предупреждает развитие в
силосе процессов, целиком зависящих от концентрации водород-
ных ионов. При этом происходит инактивация протеолитических
энзимов зеленых растений, приостанавливающая разрушение ами-
нокислот, уменьшаются потери питательных веществ. Минераль-
ные кислоты сильно действуют на все группы бактерий, вредящие
силосованию, особенно на группу кишечной палочки, желатино-
разжижающие бактерии и маслянокислые бациллы. Жизнедея-
тельность этих микроорганизмов почти полностью приостанавли-
вается при pH 4—5, между тем как при pH ниже 4 молочнокислые
бактерии лишь ослабляются.
Виртанен, анализируя микрофлору силоса из клевера, приго-
товленного по его способу, нашел, что в нем, как правило, присут-
ствуют длинные палочки молочнокислых бактерий и бактерий из
рода Betacoccus. Находил он также дрожжи, споры сенной палоч-
ки, картофельных и маслянокислых бацилл. Вегетирующих форм
маслянокислых бацилл в своем силосе автор не обнаружил.
Для консервирования кормов с успехом применяли и ряд дру-
гих консервантов — «силосный фосфат», состоящий из комплекса
кислого фосфата натрия и кислого сульфата натрия, смесь соляной
и фосфорной кислот, муравьиной кислоты с соляной и т. д. (Непп-
berg, 1954; Барнет, 1955, и др.).
Особая эффективность силосования с добавлением кислот от-
мечена при консервировании сырья, богатого протеинами, в райо-
нах с большим количеством осадков. Положительные результаты
были получены и в наших опытах при силосовании этим способом
люцерны в условиях Узбекистана.
Детальные микробиологические исследования силосов, приго-
товленных путем добавления минеральных кислот из трав, бога-
тых азотом, были проведены Каннингхемом и Смитом (Cunning-
ham, Smith, 1940). В результате этих исследований авторы пришли
к выводу, что микрофлора силоса, полученного по способу A. I. V.,
состоит преимущественно из молочнокислых бактерий: молочно-
кислых палочек и стрептококков, а также микрококков и сарцин,
Некоторые образцы содержат дрожжи.
Среди молочнокислых палочек встречаются гомо- и гетерофер-
ментативные типы. Первые включают виды L. plantarum, вто-
рые — L. brevis. Интересно отметить, что авторами были выделены
из силосов подвижные гомоферментативные палочки. Гомофермен-
316
тативные стрептококки отнесены к Str. lactis, а гетерофермента-
тивные — к Leuc. mesenteroides. Стрептококки, микрококки и по-
движные формы молочнокислых бактерий выявляются в силосе
вскоре после изготовления; в более старых силосах преобладают
молочнокислые бактерии — палочки и «сардины».
Наши исследования, проведенные по силосованию люцерны
способом A. I. V., подтвердили эти выводы. Микрофлора силоса сос-
тояла преимущественно из тех же молочнокислых бактерий, что и
при обычном силосовании, вредные же микроорганизмы были рез-
ко подавлены.
Таким образом, видовой состав молочнокислых бактерий сило-
са, приготовленного с добавлением минеральных кислот, близок по
своему составу к бактериям силоса, полученного молочнокислым
брожением. И это понятно, так как при различных способах си-
лосования молочнокислые бактерии проявляют себя как кислото-
устойчивые микроорганизмы. Отличаются силосы по составу
остальной микрофлоры, которая при приготовлении их по спосо-
бу А. I. V. подавляется более быстро и резко, чем в силосах, по-
лученных только с помощью молочнокислого брожения. Дальней-
шие исследования по изучению влияния различных консервирую-
щих веществ на микробиологические процессы в силосе также
показали, что ни одно из них полностью не подавляет всей микро-
флоры. Кислотные препараты («ААЗ», «АИВ», «С-2», «ВИК»
и др.), в основном, действуют на колиподобные, гнилостные и мас-
лянокислые бактерии и в меньшей степени на молочнокислые.
Небольшое угнетение молочнокислых бактерий наблюдается толь-
ко в первые два дня силосования, а затем молочнокислое броже-
ние протекает достаточно активно (Вараксина, 1961).
В силосе с метабисульфитом натрия уменьшается как общее
количество бактерий, так и количество молочнокислых (Anderson,
1956). Но Мардок с соавторами (Murdock et al., 1956) утвержда-
ют, что добавление метабисульфита натрия снижает лишь образо-
вание летучих кислот и не влияет значительно на молочнокислое
брожение. Эти данные более достоверны. К пиросульфату натрия
молочнокислые бактерии также менее чувствительны, чем споро-
образующие и газообразующие бактерии (Чуканов, 1963, 1965).
Большую устойчивость к нему проявляет Esch. coli. Ее рост по-
давляется лишь в присутствии 3%' этого препарата. Пиросульфит
натрия, по мнению Е. Н. Мишустина (1964), является одним из
лучших консервирующих веществ.
Значительное уменьшение общего числа микроорганизмов по
сравнению с контролем наблюдается в силосах, законсервирован-
ных хлористым аммонием, бисульфитом аммония и бисульфатом
аммония (Коленько, Здорик, 1966). Наиболее сильное действие
оказывает хлористый аммоний. Добавление в растительную массу
перед силосованием сернокислого аммония приводит к некоторому
угнетению гнилостных и маслянокислых бактерий (Ильина, 1959,
1960; Крукланде, 1964).
317
В качестве консервирующих веществ используют и NaNO2, гек-
саметилентетрамин бензойнокислый и пропионовокислый натрий,
муравьинокислый кальций, сорбат калия, а также выпускаемые
промышленностью консерванты — кофазил, амазил, силофертин и
другие (Gross, Beck, 1972). Некоторые из этих веществ, взятые от-
дельно или в смеси (например, NaNO2, бензойнокислый и пропио-
новокислый натрий, кофазил), благоприятно влияют на процесс
силосования кормов, в частности, трудносилосующихся растений
(Текенова и др. 1968; Gross, Beck, 1972). Причем, применение
метабисульфита натрия и кофазила сказывается на видовом сос-
таве молочнокислых бактерий в силосе. В первом случае изоли-
руются преимущественно гомоферментативные, а во втором —
гетероферментативные лактобациллы, главным образом L. casei и
L. buchneri соответственно (Киров, 1972).
Наконец, следует указать и на попытки использовать при силосо-
вании в качестве консервантов антибиотики. Об уменьше-
нии бактериальной активности при обработке силоса бацитраци-
ном, хлортетрациклином, стрептомицином и другими антибиотика-
ми сообщают Винг и Вилкокс (Wing, Wilcox, 1960). Однако, по
данным японских исследователей (Miura et al., 1965; Ochi et al.,
1965b), силос, инокулированный молочнокислыми бактериями, по
качеству был лучшим, чем обработанный бацитрацином. Сомни-
тельно, что антибиотики найдут применение в практике силосова-
ния.
Применение культур молочнокислых бактерий
при силосовании кормов
Вопрос о целесообразности искусственного обогащения расти-
тельной массы перед ее силосованием молочнокислыми бактерия-
ми, т. е. вопрос о применении заквасок, до настоящего времени
еще не нашел окончательного решения, хотя имеет уже длитель-
ную историю.
Еще Геннеберг (Henneberg, 1926) показал, что сквашивание
растительных материалов происходит значительно лучше, если в
них вводятся определенные, предварительно размноженные куль-
туры молочнокислых бактерий.
В СССР сторонником и пропагандистом применения заквасок
при силосовании кормов с 1935 г. являлся Л. А. Гардер с сотруд-
никами (Всесоюзный научно-исследовательский институт сельско-
хозяйственной микробиологии). Им были выделены расы молочно-
кислых бактерий (Streptobacterium plantarum), а также разрабо-
тана инструкция по их применению. Лабораторная закваска
приготавливалась на солодовом сусле с дробиной и мелом. В про-
изводственных условиях перед внесением в растительную массу
бактерии размножались (изготавливалась рабочая закваска). В си-
лосуемый материал она вносилась в количестве 0,5—1,0%.
О положительных результатах применения культур молочнокис-
лых бактерий при силосовании, особенно трудносилосующихся кор-
348
мов, сообщает ряд авторов (Мишустин, 1933; Мишустин, Мирзоева,
1963; Соколов, 1965; Макарова и др., 1968; Крукланде, 1970; Лем-
минг, 1971; Березина и др., 1972; Соколов и др., 1972; Smyk, 1957;
Kroulik, Flam, 1959; Киров, 1959, 1962; Rojahn et al., 1964; Hyl-
mar, Vokounova, 1964, и др.).
Исследователи Института микробиологии и вирусологии Акаде-
мии наук КазССР сообщили что ими из силоса были выделены
амилолитические молочнокислые стрептококки Str. lactis diastati-
cus, которые обладают способностью гидролизовать крахмал и
другие полисахариды. По их данным, применение этих бактерий
при силосовании тростника, люцерны и эспарцета увеличивает на-
копление органических кислот до уровня, необходимого для кон-
сервирования зеленого корма. В опытно-промышленных условиях
культуру амилолитического стрептококка выращивали также при
непрерывном процессе и использовали в Казахстане в практике си-
лосования в виде высушенного препарата (1лялетд1нов, 1973).
Менее значительный, но тоже положительный эффект дости-
гался в опытах с хорошо силосуемыми растениями, в частности с
кукурузой (Макарова, 1962; Лемминг, 1971. Киров, 1972; Rojahn
et. al., 1963, 1964, и др.). Благоприятные результаты были полу-
чены при использовании для силосования кормов антибиотиков
(стрептомицин, ауреомицин) и устойчивых к ним культур — кок-
ковых и палочковидных молочнокислых бактерий (Какен, 1970).
Под влиянием обогащения растительной массы молочнокислы-
ми бактериями улучшается микробиологический состав силоса; в
нем образуется больше молочной кислоты и меньше масляной и
уксусной; содержание аммиака снижается; потери питательных
веществ уменьшаются; силос охотнее поедается крупным рогатым
скотом. В целом по всем показателям качество силоса, приготов-
ленного с применением чистых культур молочнокислых бактерий,
выше, чем силоса, изготовленного без них.
В то же время отдельные исследователи считают, что исполь-
зование заквасок не целесообразно и экономически невыгодно.
Не наблюдали улучшения качества силоса из люцерны от приме-
нения заквасок Стоун с соавторами (Stone et al., 1943). Уотсон и
Смит (Watson, Smith, 1951) отмечают, что в их опытах использо-
вание культур молочнокислых бактерий для силосования не имело
успеха. Дубинский и сотрудники (Dubinski et al., 1955) также не
получили улучшения качества силоса из тростника, изготовленно-
го на заквасках, незначительный эффект был получен лишь при си-
лосовании осоки (в контроле pH 4,33, с закваской — 4,18). Орт
(Orth, 1954) считает, что применение бактериальных препаратов
(«агроцим») не оказывает существенного влияния на потерю пи-
тательных веществ при силосовании и не повышает переваривае-
мости силоса. В своей монографии А. Дж. Барнет (1955) также не
высказывается в пользу применения заквасок при силосовании кор-
мов. Он' разделяет мнение Эриксона, работы которого цитирует,
о том, что прибавление препарата молочнокислых бактерий «си-
319
лоферма» не улучшает качества силоса, изготовленного в экспери-
ментальных условиях.
Можно было бы значительно увеличить список авторов, явля-
ющихся сторонниками и противниками применения культур моло-
чнокислых бактерий при силосовании кормов.
Исследования по селекции рас для силосования и их испытания
мы проводили в Средней Азии и на Украине (Квасников, Сумне-
вич, 1954, 1955; Квасников, 1960),
£ е лекцию рас производили из различных источников.
Штаммы молочнокислых бактерий изолировали из силосов высоко-
го качества, заложенных без применения чистых культур (для сра-
внения и из силосов низкого качества), а также из эпифитной
микрофлоры культурных и дикорастущих растений.
Собранные штаммы (свыше 300) предварительно изучались.
Среди них выявлялись перспективные для использования при си-
лосовании кормов. При отборе культур к ним предъявлялись сле-
дующие основные требования: молочнокислые бактерии должны в
процессе брожения образовывать молочную кислоту и лишь ничто-
жное количество других кислот; быть хорошо приспособленными
к конкретным условиям силосования и обладать способностью ак-
тивно размножаться в растительной массе; обладать способно-
стью быстро подавлять постороннюю микрофлору; должны прида-
вать силосуемой массе высокие вкусовые качества.
По нашим данным, активность кислотообразования у штаммов
молочнокислых бактерий, выделенных из эпифитной микрофлоры,
варьирует в очень широких пределах. Аналогичное явление, хотя
и в меньшей степени, наблюдается также при исследовании куль-
тур, изолированных из силосов. Наряду со штаммами, обладающи-
ми низкой кислотообразующей способностью, выделяются, хотя и
значительно реже, весьма активные. Интересно отметить, что наи-
большую кислотообразующую способность проявили штаммы, вы-
деленные из силосов низкого качества и эпифитной микрофлоры
местных растений. Некоторые из них непосредственно после выде-
ления в солодовом сусле с 10% сахара образовывали кислот до
200° Тернера. В отдельные годы из эпифитной микрофлоры расте-
ний выделялись еще более активные штаммы. При культивирова-
нии в лабораторных условиях на растительных отварах и сусле ки-
слотообразующая способность штаммов обычно положительно кор-
релировала с высокой спиртоустойчивостью.
Лабораторные полупроизводственные и производственные опы-
ты проводились преимущественно с отдельными наиболее актив-
ными штаммами. Кроме того испытывались и естественные ком-
плексы элективных культур, а также искусственно составляемые
смеси штаммов. Оценка штаммов проводилась на основании хими-
ческих и микробиологических анализов силоса, а также по поедае-
мости его крупным рогатым скотом. Наилучшие результаты были
получены при изготовлении силоса с гомоферментативными мо-
лочнокислыми бактериями АН-11 (L. plantarum). Штамм в тече-
320
Рис. 22. Молочнокислые бактерии Lactobacillus plantarum раса АН-11/16
а— односуточная культура на агаризованной люцерновой среде, X 1350; б — коло-
нии бактерий на той же среде в чашке Петри
ние ряда лет подвергался многократному улучшающему отбору.
В результате была выведена раса АН-11/16, которая была внедрена
для силосования в условиях Узбекистана (рис. 22).
В лабораторных условиях было также проведено силосование со
смешанной культурой, состоящей из штамма гомоферментативных
палочек (раса АН-11/16) и кокков (Streptococcus lactis). Подбирая
комплекс данных штаммов, мы исходили из той предпосылки, что
кокковые формы молочнокислых бактерий первыми осваивают суб-
страт как формы, более энергично размножающиеся. Молочнокис-
лые палочки размножаются позднее. Однако полученный со сме-
шанной культурой готовый силос по своим химическим и микробио-
логическим показателям лишь незначительно превосходил силос,
заложенный с одной расой гомоферментативных палочек, или был
таким же. Поэтому дальнейшие опыты по производственному сило-
сованию проводились только с одной расой. Во всех лабораторных
и полупроизводственных опытах местные расы, особенно АН-
11/16, давали лучшие показатели, чем расы 1 и 2, выведенные Все-
союзным институтом сельскохозяйственной микробиологии.
Нами также было показано, что добавление гетерофермента-
тивных молочнокислых бактерий (L. brevis, L. buchneri) в расти-
тельную массу кукурузы только в начальный период вызывало на-
копление молочной кислоты в количестве большем, чем в контроле
(рис. 23). В дальнейшем содержание молочной кислоты в силосе,
как с добавлением культур бактерий, так и без них, уравнивалось.
Накопление же молочной кислоты с гомоферментативными лакто-
бациллами (L. plantarum), уже начиная с третьих суток, шло бо-
лее активно, чем с гетероферментативными бактериями и чем в
контроле. Уксусной кислоты в силосе при развитии гомофермента-
11 Е. И. Квасников, О. А. Нестеренко 324
тивных бактерий образуется значительно меньше, чем при разви-
тии гетероферментативных.
Напомним, что при молочнокислом брожении, идущем по типу
гомоферментативного, калорийность корма изменяется очень не-
значительно. Одна граммолекула сахара при сгорании дает 674 кал.,
а две молекулы образовавшейся из нее при брожении молочной
кислоты содержат 653 кал., т. е. потеря энергии при молочнокис-
лом брожении не превышает 3%.
Щирокое внедрение селекционированных рас при силосовании
различных растений и смесей дало отчетливые, полностью совпа-
дающие с лабораторными и полупроизводственными опытами, ре-
зультаты.
Силос, заложенный с расой АН-11/16, обладал более высокими
показателями, чем приготовленный без нее. В силосе, приготовлен-
ном с заквасками, содержалось меньше, чем в контрольном, вред-
ной микрофлоры (маслянокислых бацилл, бактерий-аммонифика-
торов, бактерий группы кишечной палочки и разлагающих цел-
люлозу в аэробных условиях). Соответственно улучшались и хи-
мические показатели. В силосе, обогащенном молочнокислыми
бактериями, накапливалось больше молочной кислоты; масляная
кислота в нем отсутствовала. Такой силос имел и более благопри-
ятную для его хранения активную кислотность. Он лучше поедал-
ся скотом.
Применение культур молочнокислых бактерий дает наиболь-
ший эффект при силосовании трудносилосующихся материалов,
особенно дикорастущих и богатых протеинами растений. Улучша-
ет оно и качество силоса из хорошо силосующихся растений (ку-
куруза, сорго пониклое и др.).
Выведенная нами культура L. plantarum АН-11/16 оказалась
весьма эффективной и при силосовании в условиях Украины (1ль-
гна и др., 1968). Так, внесение чистой культуры L.plantarum АН
11/16 в силос из листьев и стеблей кукурузы разного возраста и си-
лос из кукурузного зерна повышенной влажности, ускоряло созре-
Рис. 23. Динамика накопления
молочной кислоты в силосе
из кукурузы, заложенном с
культурами гомо- и гетеро-
ферментативных молочнокис-
лых бактерий. Содержание
кислоты вычислено по вели-
чине пятен на хроматограммах
1 — контроль (без добавления
культур),
2 —l actobacillus plantarum штамм
АН-11/16;
3 - L. brevis
322
вание и способствовало лучшему сохранению силосуемой массы,
стимулировало процесс молочнокислого брожения. При этом сни-
жалась степень дезаминирования аминокислот силосуемого корма,
распад белка и потери сухого вещества.
Таким образом, несмотря на противоречивость литературных
данных, трудно согласиться с мнением о том, что вопрос об эффек-
тивности применения заквасок для биологического консервирова-
ния кормов следует оценивать как дискуссионный. Чистые куль-
туры при силосовании должны применяться дифференцированно
с учетом ряда факторов, особенно эколого-географических усло-
вий животноводческого района. Силосование кормов — бродиль-
ный процесс. Общие принципы управления микробиологическими
процессами бродильных производств хорошо разработаны и апро-
бированы практикой. Давно установлено, что применение отселек-
ционированных рас микроорганизмов, как правило, обладает ря-
дом преимуществ перед ведением процесса на «спонтанной микро-
флоре».
Многолетняя практика бродильной промышленности вырабо-
тала и ряд принципов использования чистых культур. Нет нужды
здесь останавливаться на их описании. Подчеркнем только, что га-
рантированный успех достигается в том’ случае, если отселекцио-
нированная раса микроорганизмов, обладающая необходимыми
ценными для производства свойствами, вводится в производствен-
ный субстрат в стадии высокой физиологической активности в
большом количестве маточной культуры. Это позволяет культур-
ным микроорганизмам быстро освоить среду и вести процесс бро-
жения в нужном направлении. Размножение маточных культур
отселекционированных рас микроорганизмов в ферментерах при
заданном технологическом режиме позволяет обеспечить эти тре-
бования. Ведение процесса брожения при силосовании кормов
должно подчиняться тем же закономерностям. Однако изготовле-
ние заквасок для силосования в настоящее время, как правило,
производится кустарно, с нарушением элементарных требований,
выработанных бродильной технологией. Это в значительной степе-
ни и обусловливает противоречивость результатов отдельных ис-
следователей. Поэтому неудивительно, что некоторые авторы при
организации процесса силосования идут по принципу «производ-
ственной элективности», т. е. считают достаточным соответственно
подготовить материал и создать в нем ряд приемов условия для
оптимального развития нужных эпифитных микроорганизмов,
а применение заквасок считают ненужным.
Силосование кормов в нашей стране — крупное многотоннажное
производство. Когда закладка кормов производится вблизи про-
мышленных предприятий, вопрос о размножении культур для био-
логического консервирования корма находит простое решение. Так,
при закладке жома молочнокислые бактерии возможно выращи-
вать, используя отходы сахарного завода в специально сконструи—-.
рованных ферментерах непосредственно на заводе. Нами (Кшгсни- 1
/$>
323 1 lA
If-» А ЧХ/
ков и др., 1963, 1966; Квасников, Васильева и др., 1967) на протя-
жении ряда лет разрабатывались основные принципы регулирова-
ния микробиологических процессов при силосовании кормов, в
частности жома.
Известно, что сахарные заводы СССР ежегодно получают в ви-
де отходов свыше 38 млн. т жома. Жом легко усваивается живот-
ными, но при длительном сохранении в ямах, где масса подверга-
ется уплотнению и самозакисанию, его кормовая ценность утрачи-
вается. За счет развития вредной микрофлоры (гнилостных, мас-
лянокислых бактерий, плесневых грибов и др.) иногда тратится
до 20—40% ценных кормовых веществ жома.
До последнего времени при применении молочнокислых бакте-
рий для силосования жома не было получено устойчивых положи-
тельных результатов. Это можно объяснить тем, что в жом вноси-
лось (по опыту силосования кормовых растений и зерно-карто-
фельной барды) небольшое количество закваски, которая слабо уг-
нетала вредную микрофлору.
Нами совместно с Институтом ботаники АН УССР (А. Ф. Бе-
ренштейн) и Всесоюзным научно-исследовательским институтом
сахарной промышленности (К. П. Захаров) сконструирована уста-
новка, на которой непосредственно на сахарном заводе произво-
дится размножение молочнокислых бактерий L. plantarum
АН-11/16.
Средой для их выращивания служит жомовая вода, к которой
добавляется меласса и фильтрпрессная грязь. Содержание саха-
ра — 2%. Среда Стерилизуется и в нее высеваются молочнокислые
бактерии. Их размножают в непрерывном потоке и в стадии высо-
кой физиологической активности разбрызгивают на жом, поступа-
ющий на хранение в ямы.
Опыты, проведенные на сахарных заводах Украины (Львов-
ский, Киевский и Харьковский сахаротресты), показали, что вне-
сенные в жом молочнокислые бактерии активно размножаются в
нем и угнетают вредную микрофлору. В жоме с закваской было
меньше гнилостных (в тысячи раз) и маслянокислых бактерий
(оТ*десятков тысяч до миллионов раз) по сравнению с контроль-
ным. Жом с закваской всегда имеет ненарушенную структуру,
светло-желтый цвет. Он стойко сохраняется. Благоприятны и био-
химические показатели жома, обогащенного молочнокислыми
бактериями. Так, через три месяца опытный жом имел pH 4, 2, конт-
рольный— 4,6; молочной кислоты в жоме с закваской было на 38%
больше, а уксусной — на 37 % меньше, чем в контрольном. В опыт-
ном жоме лучше сохраняются белковые вещества. Благоприятное
влияние оказал жом с закваской и на надои молока и увеличение
привесов молодняка крупного рогатого скота. Инструкция по
биологическому консервированию жома утверждена Главсахаром
и используется на сахарных заводах (Инструкция по биологиче-
скому консервированию жома молочнокислыми бактериями, 1973).
Благоприятные результаты при сквашивании жома молочно-
324
кислыми бактериями получили и польские авторы (Ziemkiewicz,
1972). Они показали, что заквашивание протекает особенно хоро-
шо, если концентрация сухого вещества в жоме составляет 20%.
В заключение следует отметить, что вопрос об использовании
чистых культур в силосовании кормов не нашел еще конструктив-
ного, технологического и организационного решения. Но нам пред-
ставляется, что оно должно быть найдено. Все больше и больше на-
капливается положительных данных об использовании микроорга-
низмов в различных отраслях животноводства и растениеводства
(обогащение и биологическое консервирование кормов, биологичес-
кие методы борьбы с вредителями, бактериальные удобрения
и т. д.). Только тогда, когда принципы технической микробиоло-
гии станут на вооружение сельскохозяйственной микробиологии,
ее достижения найдут широкое внедрение и окажут должное
влияние на практику. Нам представляется, что уже своевременно
поставить вопрос, и для этого есть все предпосылки, о создании
крупных межсовхозных и межколхозных установок для размно-
жения необходимых микроорганизмов до стадии заданной физио-
логической активности в количестве, полностью удовлетворяю-
щем разнообразные потребности сельского хозяйства. На данной
установке возможно будет размножать и культуры для силосова-
ния кормов. Это позволит использовать растительные материалы
и улучшить качество всего закладываемого в хозяйстве силоса,
уменьшит потери в нем питательных компонентов, т. е увеличит
продуктивность животноводства.
Отметим также, что в последние годы проведен ряд исследова-
ний по использованию при силосовании кормов, кроме молочнокис-
лых бактерий, и представителей других групп микроорганизмов
(дрожжей, пропионовокислых бактерий и др.). Будущее покажет,
насколько эффективно их использование в практике.
Таким образом, качество силоса в большей степени определя-
ется направленностью и активностью происходящих в нем микро-
биологических процессов. При этом важную роль в создании хоро-
шего силоса играют не только количество молочнокислых бакте-
рий, содержащихся на растительной массе и поступающих в си-
лосные сооружения, но и их свойства.
Регулирование процесса брожения при силосовании кормов и
направление его по типу гомоферментативного молочнокислого
брожения имеет первостепенное значение в получении высокока-
чественного силоса. Ведущим при этом является соблюдение комп-
лекса мероприятий по технике силосования, которые сводили бы к
минимуму потери питательных веществ в растительной массе; сре-
ди них — закладка корма с пониженным содержанием влаги —
сенажа.
Обогащение растительной массы специально отселекциониро-
ванными активными культурами гомоферментативных молочнокис-
325
лЫх бактерий приводит к преобладанию этой группы микроорга-
низмов в силосе и подавлению вредной микрофлоры. Гомофермен-
тативные молочнокислые бактерии содействуют созданию в силосе
благоприятной для его хранения активной кислотности, вызывают
быстрое накопление в нем молочной кислоты и обеспечивают низ-'
кое содержание летучих кислот. Гетероферментативные молочно-
кислые бактерии не оказывают столь благоприятного влияния на
качестве силоса.
Применение культур гомоферментативных молочнокислых бак-
терии дает наибольший эффект при силосовании трудносилосую-
щихся материалов, особенно дикорастущих и богатых протеинами
растений, а также отходов производств (жом). Силос, изготовлен-
ный из них с применением чистых культур, по органолептическим
признакам даже похожий на контрольный, неизменно содержит
меньше вредной микрофлоры и обладает лучшими биохимическими
показателями.
Во всех производствах, связанных с жизнедеятельностью мик-
роорганизмов, чистые культуры умело отселекционированных
микроорганизмов и их комплексы шаг за шагом завоевывали себе
прочное место. Применение их явилось крупным прогрессом в раз-
витии бродильной промышленности. Нет сомнения, что эти чис-
тые культуры завоюют прочное место и в силосовании кормов.
Технология их приготовления и использования должна быть
значительно усовершенствована с учетом достижений микробио-
логической промышленности. Начинают успешно применять су-
хие закваски.
Несомненно перспективен поиск ассоциаций микроорганизмов,
введение которых в корм не только вызывало бы биологическое
консервирование, но и ряд биохимических превращений, в резуль-
тате которых он становился бы более доступным для усвоения жи-
вотным организмом и обогащался за счет микробного синтеза пи-
тательными компонентами, особенно аминокислотами и витами-
нами.
БИОЛОГИЧЕСКОЕ КОНСЕРВИРОВАНИЕ ОВОЩЕЙ
И ФРУКТОВ
Молочнокислое брожение издавна используется человеком для
биологического консервирования различных растительных продук-
тов питания. Этот способ их хранения обладает рядом крупных
достоинств. При нем в продукты, как правило, не вводятся хими-
ческие консерванты, и они не подвергаются большим термическим
воздействиям.
Сохранение продукта достигается благодаря развитию в нем
молочнокислых бактерий. Вещества, образующиеся в процессе
их жизнедеятельности (особенно молочная кислота), оказывают
подавляющее воздействие на микроорганизмы — потенциальные
326
возбудители порчи (гнилостные, маслянокислые и др.); квашеные
овощи и фрукты приобретают приятные органолептические
свойства и оказывают определенное воздействие на организм че-
ловека.
Технология изготовления квашеных овощей и фруктов, про-
исходящие при этом физико-химические процессы, требования к
готовым продуктам изложены в ряде руководств и инструкций
(Промышленная переработка плодов и овощей. Сборник ин-
струкций, 1935; Каменев, Листовничий, 1940; Вернер, 1951; Вы-
щепан, Мельман, 1952; Овощи соленые, квашеные, консервиро-
ванные. Сборник стандартов, 1953; Технологическая инструкция
по квашению капусты, 1956; Коршунов, 1956; Инструкция по
технологии соления огурцов и помидоров, 1957; Усатюк, 1960;
Лопухов, 1964; Назин и др., 1964; Дмитриевский, 1966; Pederson,
Albury, 1956; Frazier, 1958; Ван, 1959, и др.). Мы будем останавли-
ваться на описании только тех элементов технологии, которые
необходимы для понимания микробиологических процессов, про-
исходящих в процессе биологического консервирования.
Квашение капусты
Кочанная капуста широко используется человеком уже на
протяжении четырех тысяч лет, причем одним из наиболее рас-
пространенных способов консервирования ее является квашение.
Молочнокислое брожение осуществляется в присутствии по-
варенной соли. Соль добавляют к нарезанной капусте, чтобы из-
влечь сок из растительных тканей, подавить развитие нежела-
тельных микроорганизмов и этим способствовать жизнедеятель-
ности молочнокислых бактерий.
Ассортимент и способы приготовления квашеной капусты
весьма разнообразны. Известна капуста кочанная, шинкованная,
рубленая. Последние два вида изготовляются с различными
приправами и пряностями. Готовят капусту квашеную с мор-
ковью, тмином, лавровым листом, яблоками, клюквой, брусникой,
виноградом, сливой, столовой свеклой и т. д. Из кочанной ква-
шеной капусты приготавливают капусту-провансаль. Зрелую ка-
пусту квасят с 2,5% соли (для ранних сортов берут 3—4%) в
той или иной не пропускающей сок таре (чанах, дошниках, сте-
клянной, эмалированной таре и т. д.).
При 21—24° молочнокислое брожение протекает обычно за
6—8 суток. Хорошо заквашенная капуста должна быть хрустя-
щей, светлой, иметь приятный запах и содержать до 1,25—1,7%
молочной кислоты. Когда капуста готова, из бочек ее можно вы-
кладывать в банки и прогревать для придания большей стойко-
сти до 60—82°. В бочках длительно капусту хранят в холодном
помещении (например, при 0—5°) для прекращения молочно-
кислого брожения и предохранения продукта от действия неже-
лательных микроорганизмов.
327
Микроорганизмы, участвующие в квашении капусты, начали
исследоваться с конца прошлого века. Описание этих ранних ра-
бот, выполненных немецкими, американскими и другими авто-
рами (Конрад, Бутагин, Вемер, Рунд, Геннеберг и др.) имеется
в обзорах (Шугаевская, 1939, и др.). Было показано, что ква-
шеная капуста приобретает специфический вкус не только бла-
годаря молочнокислому, но также и спиртовому брожению, осу-
ществляемому дрожжами.
Самопроизвольное брожение в подготовленной для квашения
капусте начинается при 15—24° (оптимальная 21—24°) через
несколько часов. Сначала развиваются бактерии соИ-группы, Ае-
robacter cloacae, Flavobacterium rhenanus и др., образующие ряд
продуктов (муравьиную, уксусную кислоты, небольшое количе-
ство молочной и янтарной, спирт, газ и др.), придающих ей спе-
цифический запах (G. Muller, 1968).
Вскоре начинают быстро размножаться молочнокислые ге-
тероферментативные кокки (Leuconostoc mesenteroides), кото-
рые становятся преобладающими микроорганизмами к концу
2—3 суток брожения; именно их считают ответственными за за-
пах доброкачественной капусты. В условиях начальной фазы
сквадпивания капусты (pH 6,2; 2,5% NaCl) эти бактерии харак-
теризуются относительно большой скоростью роста и одновре-
менно быстрой скоростью гибели их клеток (Stamer et al., 1971).
В течение указанного периода общая кислотность продукта по-
вышается до 0,7—1,0% (в пересчете на молочную). Кроме молоч-
ной кислоты образуются также уксусная, этиловый спирт, эфи-
ры, СО2, маннит; присутствие последнего придает капусте
горьковатый привкус.
Затем, через 4—6 суток брожения, кокковую флору сменяют,
в основном, гомоферментативные молочнокислые палочки (Lacto-
bacillus plantarum), которые накапливают до 1,5—2% кислоты и
доводят молочнокислое брожение до конца. L. plantarum исполь-
зуют маннит и этим устраняют горький привкус. Если после
брожения, осуществляемого L. plantarum, в соке еще останутся
сахара (капуста содержит 2,9—6,4% сахара, главным образом
глюкозы) и маннит, начинают расти в преобладающем количе-
стве гетероферментативные лактобациллы, преимущественно
L. brevis, относительно слабо чувствительные к понижению pH
среды и содержанию в ней соли (Stamer et al., 1971). Эти бакте-
рии могут продолжать накопление кислот до 2,4%; при этом ка-
пуста приобретает нежелательно острый привкус.
Качество капусты во многом определяется условиями ее при-
готовления. Так, высокая концентрация соли в рассоле и повы-
шенная температура (до 30°) угнетают развитие Leuc. mesentero-
ides и способствуют росту Pediococcus cerevisiae, что приводит к
образованию нежелательного запаха. Низкая же температура
и длительное брожение нарушают последовательность появления
ведущих процесс молочнокислых бактерий, что приводит к неже-
328
дательному вкусу и запаху продукта (Наместников, 1957; Fra-
zier, 1958).
Педерсон и Албери (Pederson, Albury, 1954) показали, что
при пониженном содержании NaCl (1%) ведущая роль в броже-
нии капусты принадлежит Leuc. mesenteroides и L. brevis. При
повышенном же содержании соли брожение тормозится, а раз-
витие L. brevis почти полностью подавляется; на первый план
выступает Р. cerevisiae, который наряду с L. plantarum осуще-
ствляет гомофермеНтативное брожение. В капусте при внесении
3,5% соли общая кислотность и pH ниже, чем при 1% соли. По
качеству капуста, приготовленная с 1 % соли, лучше, чем с
3,5% ее. Приведенные данные подтверждаются и результатами
опытов Стемера и соавторов (Stamer et al., 1971).
Скорость молочнокислого брожения в капусте в значитель-
ной степени определяется и температурой. Педерсон и Албери
(Pederson, Albury, 1954) показали, например, что при низкой
температуре (7,5°) брожение протекает настолько медленно, что
могут развиться нежелательные микроорганизмы. В то же время
при 32 и 37° капуста подкисляется в достаточной степени за 2
недели, хотя при этом и не обеспечивается хорошее качество про-
дукта. Авторы отмечают, что при повышенной температуре и
низком содержании соли в брожении капусты большую роль иг-
рает Р. cerevisiae. В значительном количестве и неоднократно
выделялся также Str. faecalis.
Касаясь порчи квашеной капусты, следует подчеркнуть, что
размягчение или гниение ее может возникнуть под действием не-
желательных микроорганизмов — бактерий, дрожжей, плесеней.
В связи с этим нужно строго следить за своевременным правиль-
ным укрытием поверхности бродящей капусты (Ерохина, 1967).
Важно брожение проводить в герметической посуде, чтобы избе-
жать утечки сока. С этой целью в последнее время рекомендуют
использовать для приготовления капусты полиэтиленовые мешки
(Кондратенко, 1963).
Чистые культуры микроорганизмов для квашения капусты
были предложены еще в начале нашего столетия (Henneberg,
1917, цит. по Шугаевской, 1939; Церевитинов, 1931, цит. по Шу-
гаевской, 1939; и др.). Однако полученные результаты были про-
тиворечивы и рекомендации не нашли применения в производ-
стве.
Исследования по квашению капусты с помощью молочнокис-
лых бактерий и дрожжей были осуществлены во Всесоюзном на-
учно-исследовательском институте плодоовощной промышлен-
ности П. Г. Шугаевской (1939). Изолированные из квашеной ка-
пусты лактобациллы Bacillus brassica fermentati и дрожжи Sac-
charomyces brassica fermentati использовались для квашения ка-
пусты. Рабочую закваску готовили на капустном соке или
капустном отваре; в состав ее входило четыре части бактериаль-
ной закваски и одна — дрожжевой. Этой смесью в количестве
329
1,25% по отношению к весу сырья поливали капусту слой за слоем
во время укладки ее в производственных условиях в дошники. В
опытах с чистыми культурами быстрее подавлялась нежелательная
микрофлора (маслянокислые бактерии, представители группы
coli и др.), интенсивнее накапливалась молочная кислота, хотя
общее направление микробиологических процессов в образцах
капусты с чистыми культурами и без них было одинаковым. Ка-
пуста, заквашенная чистыми культурами лактобацилл и дрожжей
в производственных условиях, имела лучший вкус и аромат. При-
менение чистых культур не дает эффекта в том случае, если пос-
ле ферментации капуста хранится в неохлажденных помещениях
(Выщепан, Мельман, 1952). Положительные результаты были по-
лучены и сотрудниками Всесоюзного научно-исследовательского
института сельскохозяйственной микробиологии (Дмитриевский,
1966). В частности, было показано, что в капусте с заквасками
лучше, чем в контрольной, сохраняются витамины, снижается
распад белков. Выл предложен сухой препарат молочнокислых
бактерий для заквасок с длительным сроком годности.
М. В. Ерохина (1967) нашла, что при температуре брожения
18—22° в капусте, заквашенной чистой культурой L. plantarum,
число молочнокислых бактерий быстро увеличивается и достигает
максимума на третьи сутки брожения (500 млн./г вместо 93 млн./г
в контроле). К шестому дню созревания капусты с закваской мик-
рофлора ее состоит преимущественно из молочнокислых бакте-
рий. Понижение температуры (до 10—12°) тормозит активность
L, plantarum и замедляет процесс брожения, хотя качество капу-
сты остается хорошим. Если же температуру снизить до 3—5°,
то применение заквасок, по мнению автора, нецелесообразно.
В пользу применения чистых культур гомо- и гетерофермента-
тивных молочнокислых бактерий при кващении капусты выска-
зывается и ряд зарубежных авторов (Balan et al., 1960; G. Mul-
ler, 1968, и др.). Так, Бэлэн с сотрудниками заквашивали капу-
сту, огурцы и помидоры с помощью чистых культур Lactobacte-
rium plantarum cucumeris fermentate и L. plantarum brassicae. При
этом органолептические качества продуктов были намного лучше
контрольных, полученных без внесения заквасок. При брожении
возрастало общее число молочнокислых бактерий, содержание мо-
лочной и уксусной кислот.
Немногие авторы считают нецелесообразным использование
чистых культур при квашении капусты. Так, Ван (1959) по-
лагает, что их применение может вызвать нарушения последова-
тельности естественной смены видов молочнокислых бактерий,
которая имеет место при самопроизвольном брожении продукта.
Мы в течение ряда лет по запросам различных плодоовощных
производственных организаций передавали им лабораторную за-
кваску, состоящую из L. plantarum АН-11/16. Раса была селек-
ционирована в Средней Азии для силосования кормов (Квасников,
Сумневич, 1954). Размножение бактерий проводилось (по состав-
330
ленной инструкции) на капустном отваре. Рабочая закваска в ко-
личестве 0,5% вносилась в подготовленную капусту. Дегустация
образцов неизменно показывала хорошие результаты. Капуста по
органолептическим качествам была выше, чем контрольная, приго-
товленная без заквасок; она была и более устойчивой при длитель-
ном хранении. Биологические исследования показали, что в процес-
се ее приготовления вредная микрофлора резко подавлялась.
Указания по использованию чистых культур молочнокислых
бактерий для квашения капусты можно найти в инструкциях
(Технологическая инструкция по квашению капусты, 1956, и др.).
Соление огурцов
Соление огурцов является одним из наиболее широко распростра-
ненных приемов их консервирования.
Существуют различные способы соления огурцов. В Европе и
Америке, например, получили распространение огурцы, которые
засаливают без специй сперва в некрепких рассолах (7—8%
NaCl), а затем засолку их ведут в более концентрированных рас-
солах (12—16% NaCl). Полученный продукт (т. н. огурцы основ-
ного засола) затем обессоливают горячей водой, раскладывают
в мелкую тару и заливают маринадом (сладкие, кислые, аромати-
зированные огурцы и т. д.). Распространены и соленые огурцы с
укропом (Frazier, 1958; Ван, 1959).
У нас в стране издавна большой известностью пользуются не-
жинские соленые огурцы, своеобразный вкус которых обусловлен
как сортом огурцов, так и «нежинским» способом их соления
(Камнев, 1918; Каменев, 1933). В настоящее время для внутрен-
него рынка огурцы чаще всего засаливают со специями в спе-
циальных чанах, бочках или стеклянной таре. В этом случае ото-
бранные овощи заливают рассолом (6—8% соли, в зависимости
от размеров огурцов) и добавляют различные специи (укроп,
чеснок, хрен, перец, эстрагон, листья смородины, вишни, дуба, пе-
трушку, мяту и т. д.). Набор специй и количество их зависит от
сорта соленых огурцов — пряных, острых, чесноковых и т. д. За-
литые рассолом огурцы в бочках оставляют на специальных пло-
щадках для прохождения предварительной ферментации, дли-
тельность которой зависит от температуры воздуха (как правило,
20—25° в течение 24—28 час.). Ее считают законченной после на-
копления в рассоле до 0,3—0,4% молочной кислоты. После цред-
варительно1*о брожения бочки хранят при пониженных темпера-
турах в ледниках, ледниковых буртах или траншеях со льдом
и т. д., где в течение 40—45 дней происходит дальнейший процесс
накопления молочной кислоты (около 1%). При приготовлении
малосольных огурцов рассолы от соленых огурцов, содержащие до
0,9% молочной кислоты, можно использовать для заливки свежих
овощей с пряностями в стеклянных банках.
Микробиологические процессы, протекающие при квашении
331
огурцов, стали изучаться в конце прошлого столетия. Эти ранние
исследования (Адергольд, Гейнце, Вемер, Ран, Фурман, Коссович
и др.) достаточно полно освещены в ряде отечественных работ
(Камнев, 1918; Насальская, 1934; Шугаевская, 1939; Каменев,
Листовничий, 1940).
Самопроизвольное брожение огурцов при их засолке происхо-
дит за счет присутствующих на них микроорганизмов. Направлен-
ность процесса определяется наличием сбраживаемых веществ,
конг(ентрацией соли, температурой, степенью обсемененности
огурцов и рассолов.
Весь процесс, происходящий при. самопроизвольном брожении
огурцов, можно условно разделить на три стадии — первичную,
промежуточную и конечную, каждая из которых характеризуется
определенной бактериальной флорой. Ниже дается перечень бакте-
рий, преобладающих на различных стадиях молочнокислого бро-
жения огурцов (по Вану, 1959).
Стадия брожения Вид
Первичная Aerobacter aerogenes, A. cloacae, Escherichia freundii, Esch, intermedium, Bacillus mesentericus — Вас. mega- terium, Bacillus (Aerobacillus) polymyxa, Bacillus (Aerobacillus) macerans
П ромежуточная Leuconostoc mesenteroides, Lactobacillus plantarum, L. brevis, L. fermenti
Конечная L. plantarum, L. brevis, L. fermenti
На первичной стадии (2—3 суток), особенно вначале ее, в боль-
шом количестве обнаруживаются плесневые грибы, дрожжи, ви-
ды родов Pseudomonas, Flavobacterium, Achromobacter, Bacillus,
группа кишечной палочки. Все эти микроорганизмы в количест-
венном отношении превалируют над молочнокислыми бактериями.
Любой из нежелательных микроорганизмов на этой стадии может
стать доминирующим и вызвать порчу продукта. Первичная ста-
дия характеризуется небольшим подкислением рассола, накопле-
нием газов (Н2 и СО2), причем эти продукты частично образуются
за счет жизнедеятельности бактерий группы coli. В конце первич-
ной стадии начинает возрастать число молочнокислых бактерий,
некоторых видов дрожжей; увеличивается кислотность рассола.
Вместе с тем количество нежелательных микроорганизмов посте-
пенно уменьшается.
В промежуточной фазе брожения (до 14 суток) преобладают
гомо- и гетероферментативные кокки и палочки — Leuc. mesentero-
ides, L. brevis, L. plantarum; обнаруживается и довольно много
дрожжей. Если в начале указанной стадии преобладает Leuc. me-
senteroides, то к концу ее, по мере увеличения кислотности рассола,
доминируют виды рода Lactobacillus и, в первую очередь, L. plan-
332
tarum. При переходе к конечной стадии брожения титруемая кис-
лотность среды нарастает до 0,5—1% (в пересчете на молочную
кислоту), pH снижается до 3,5—3,8. Брожение при этом полнос-
тью осуществляется кислотоустойчивыми видами рода Lactobacil-
lus.
На конечной стадии брожения истощение питательных ве-
ществ (а при изготовлении огурцов основного засола и возрос-
шая до 15% концентрация NaCl) приводит к снижению или
прекращению жизнедеятельности молочнокислых палочковидных
бактерий (L. plantarum). Готовые соленые огурцы, кроме молоч-
ной кислоты (0,5—1%), содержат уксусную кислоту и спирт, сле-
ды глицерина и маннита, небольшие количества ароматических ве-
ществ.
Содержание и видовой состав молочнокислых бактерий сущест-
венно изменяются при брожении в различных условиях (Peder-
son, Ward, 1949; Pederson, Albury, 1950, 1956; Costilow, Fabian,
1953, и др.). Однако всюду в начале брожения обнаруживаются
слабые продуценты кислот — лейконостоки. и стрептококки (если
они вообще развиваются), а затем, более сильные — педиококки,
гетероферментативные молочнокислые палочки и, наконец, гомо-
ферментативные бактерии.
Порча огурцов во многих случаях обусловливается дея-
тельностью нежелательных микроорганизмов. Ослизнение и раз-
мягчение огурцов, вызываемое споровыми и плесневыми грибами,
наблюдается при хранении огурцов с недостаточной концентраци-
ей соли. Так называемые «дутыши» образуются благодаря накоп-
лению газа в результате жизнедеятельности бактерий coli-группы,
а также дрожжей и гетероферментативных молочнокислых бакте-
рий L. brevis (Ван, 1959; Frazier, 1958; Etchells et al., 1968).
Этчелз с сотрудниками наблюдали, что подавление дрожжей (Sac-
charomyces delbrueckii и Pichia polymorpha) сорбиновой кислотой
или ее солями (0,025, 0,05 и 1%) не предохраняет огурцы от обра-
зования пустот. Вспучивание огурцов обусловливается развитием
L. brevis, рост которых подавляется 8—10% NaCl. Почернение
огурцов вызывают Bacillus nigrificans.
После окончания молочнокислого брожения, при хранении
огурцов в емкостях, часто начинает активироваться деятельность
дрожжей, как пленчатых (из родов Debaryomyces, Endomycopsis,
Candida), так и бродящих (из родов Torulopsis, Brettanomyces,
Zygosaccharomyces), разрушающих молочную кислоту и этим спо-
собствующих развитию нежелательной микрофлоры. Поэтому при
хранении огурцов приходится часто удалять с поверхности емко-
стей дрожжевую пленку, что является трудоемким процессом. Для
подавления развития дрожжей используют минеральные соли, мас-
ла, горчицу. Особенно эффективной борьба с дрожжами стала после
того, как было предложено добавлять к огуречным рассолам сор-
биновую кислоту (до 0,1%). Костилов и соавторы (Costilow et al.,
1955) показали, что сорбиновая кислота почти не оказывает влия-
333
ния на рост молочнокислых бактерий и способность их образовы-
вать молочную кислоту. Только при pH 4,0 0,1% сорбиновой кис-
лоты приостанавливает процесс кислотообразования. Эта работа
подтвердила исследования Эмарда и Вана (Emard, Vaughn, 1952)
об угнетении сорбиновой кислотой каталазоположительных микро-
организмов и устойчивости к ней не образующих (или слабо обра-
зующих) каталазу различных видов молочнокислых бактерий.
Вопросы интенсификации процессов брожения при засолке
огурХов ставились неоднократно. В русской практике еще издав-
на для получения огурцов высокого качества и удлинения сроков
их хранения к рассолу прибавляли ложку кислого молока или лож-
ку меда. В Нежине, например, при получении «уксусных» огур-
цов давали в рассол сахар. Указанные приемы вели в конечном
счете к обогащению рассола молочнокислыми бактериями. Инте-
ресно отметить, что в Египте существует способ приготовления за-
соленных огурцов с применением старых рассолов, использующих-
ся в качестве закваски. Эти рассолы содержат L. plantarum, L.
brevis и L. fermenti, имеют достаточную кислотность (0,7—1% мо-
лочной кислоты) и низкое pH. Употребление старых рассолов, по
мнению арабских исследователей (Taha et al., 1966), укорачивает
первую стадию брожения, где преобладают протеолитические бак-
терии, а весь процесс засола существенно ускоряется.
Вопрос подбора эффективных рас микроорганизмов для засол-
ки огурцов еще не нашел окончательного решения.
Немецкий исследователь Адергольд (Aderhold, 1899, цит. по
Шугаевской, 1939) пытался использовать при засолке огурцов чис-
тые культуры Bacterium Guntneri.
Во Всесоюзном научно-исследовательском институте плодо-
овощной промышленности из огуречных рассолов были изолирова-
ны молочнокислые бактерии Bacillus cucumeris fermentati Henne-
berg, которые использовали для засолки огурцов в промышленном
масштабе (Насальская, 1934; Шугаевская, 1938, 1939, 1940). Ав-
торы сообщают, что применение чистых культур приводило к
интенсивному развитию молочнокислого брожения уже в первые
сутки; активному подавлению гнилостных, маслянокислых бакте-
рий, группы coli-aerogenes. Кислотность рассола к пятым суткам
достигала 0,5—0,6% в образцах с чистыми культурами и 0,4—
0,44% — без них. Опытные огурцы не ослизнялись, были значи-
тельно вкуснее и по всем показателям превосходили огурцы, за-
соленные обычным способом.
Возможность использования чистых культур молочнокислых
бактерий изучали и зарубежные исследователи (Pederson, Albury,
1953, 1961; Etchells et al., 1964, и др.). Педерсон и Албери рассолы
инокулировали различными видами (L. plantarum, L. brevis, Р. ce-
revisiae, Str. faecalis, Leuc. mesenteroides) и проводили брожение
при 18 и 32°. Они утверждают, что при использовании L. planta-
rum иные виды молочнокислых бактерий не принимают участия
в молочнокислом брожении. В этом случае создается самая низкая
кислотность по сравнению с другими вариантами опытов. Введе-
ние в рассол Р. cerevisiae приводит к тому, что только начальные
стадии брожения осуществляются этим видом, после чего развива-
ется L. plantarum, заканчивающий процесс брожения. Лучшие ре-
зультаты получены при введении в рассол Leuc. mesenteroides.
Этот вид преобладает только в ранних стадиях брожения, затем его
сменяет L. plantarum и до некоторой степени L. brevis. Str. faeca-
lis не находит в рассолах благоприятных условий для своего раз-
вития; уже через сутки после введения его развивается Leuc. me-
senteroides.
В опытах авторов огурцы худшего качества (по сравнению с
контролем без закваски) получали при введении в рассолы L. plan-
tarum, и лучшего, когда они инокулировались гетероферментатив-
ными молочнокислыми бактериями (Leuc. mesenteroides). Возмож-
но, это объясняется тем, что последние образуют в рассолах раз-
нообразные продукты — уксусную кислоту, этиловый спирт, ман-
нит (влияющие на проницаемость клеточных стенок растительных
тканей), а также углекислоту (вытесняющую воздух и этим соз-
дающую анаэробные условия, отрицательно сказывающиеся на
развитии пленчатых дрожжей на поверхности емкостей с огурца-
ми). Эти вещества придают продукту и более оригинальный вкус.
Этчелз с сотрудниками (Etchells et al., 1964) в предварительно
стерилизованные горячей водой (при 66—80° в течение 5 мин.) или
гамма-лучами огурцы также вводили различные виды молочнокис-
лых бактерий. При содержании соли 5,4—5,6% лучше всего раз-
множались, накапливали кислоты и снижали pH среды Р. cerevi-
siae, L. plantarum и L. brevis. Причем, при введении смеси этих
культур они на разных стадиях размножались в той же последо-
вательности, как и в естественных условиях брожения (сначала
Р. cerevisiae, затем L. plantarum и L. brevis). Эти же виды оказа-
лись наиболее солеустойчивыми.
Соление маслин (оливок)
Консервированные зеленые и спелые оливки — основной про-
дукт пищевой промышленности в ряде стран (например, в США,
Калифорния). Изготовляют их и в нашей стране.
Способы соления оливок разнообразны и зависят от сорта пос-
ледних. Оливки чаще всего обрабатывают сначала 0,5—2%-ным
раствором щелочи при 15—21° для удаления глюкозида олеуро-
пеина, придающего горечь продукту, затем замачивают в воде.
После этого их помещают в бочки и заливают рассолом. В зави-
симости от вида оливок употребляют разные концентрации пова-
ренной соли (от 5 до 8%), которые и поддерживаются в течение
ферментации. Брожение оливок продолжается обычно в течение
6—10 мес. После его окончания оливки сортируют, моют, упако-
вывают в стеклянную посуду и пастеризуют.
Изменения в составе микрофлоры и химические изменения в
рассоле при брожении зеленых и зрелых оливок подобны описан^
335
ным выше для капусты и огурцов, но происходят значительно мед-
леннее, особенно, если в зимнее время помещение, где они готовят-
ся, не утепляется.
Первая стадия брожения длится 7—14 суток и характеризуется
размножением нежелательных организмов (представителей родов
Aerobacter, Pseudomonas, а также Clostridium, Bacillus и дрож-
жей). В конце этой стадии начинает размножаться Leuc. mesente-
roides, вытесняющий вредную микрофлору. Во второй, промежу-
точной, стадии, которая протекает 2—3 недели, брожение осущест-
вляет Leuc. mesenteroides, а затем L. plantarum и L. brevis. В ко-
нечной стадии преобладает L. plantarum (Vaughn et al., 1943).
Успешное протекание молочнокислого брожения зависит от
многих факторов. Оно определяется наличием достаточного коли-
чества сахара в плодах и прибавляемого в рассол. Снижение чис-
ла молочнокислых бактерий в рассоле может происходить из-за на-
рушений режима щелочной обработки олив и использования повы-
шенных концентраций соли. Важно создавать благоприятные
температурные условия для брожения, особенно в зимнее время.
Быстрее всего оно протекает при 24°; при этом в готовом продукте
общая кислотность (в пересчете на молочную) составляет 0,7—1%,
а pH рассола — 4,0—3,8 и ниЖе (Vaughn et al., 1943).
Концентрация соли существенно влияет на содержание и ви-
довой состав молочнокислых бактерий в рассолах (Ван, 1959). Так,
при приготовлении маслин с 7—8% соли в рассолах обнаружи-
вается только L. plantarum, тогда как в рассолах с 3—5% ее изо-
лируются и гетероферментативные лактобациллы. В обоих
случаях выделяются Leuc. mesenterodes. Если в рассолах присут-
ствует 10% соли, то молочнокислые бактерии обычно уже не вы-
деляются. Виды рода Leuconostoc и L. plantarum, таким образом,
обладают большей солеустойчивостью по сравнению с гетерофер-
ментативными лактобациллами.
Активность молочнокислого брожения, протекающего с учас-
тием L. plantarum в рассолах с зелеными маслинами, значительно
интенсифицируется после обработки маслин горячим раствором
щелочи (например, 2,18 % -ным); брожения не происходит в непа-
стеризованных рассолах, обработанных 1,25—1,5%-ным раствором
щелочи (juven et al., 1968; Borbolla et al., 1969). Тепловая щелоч-
ная обработка маслин, по-видимому, разрушает антибиотические
вещества сока зеленых плодов, которые подавляют рост и кислого-
образование L. plantarum.
Советский исследователь Ф. С. Апт (1954) сообщил, что при
приготовлении зеленых маслин (Olea Europaea) естественная
микрофлора, остающаяся после щелочной обработки их, не мо-
жет обеспечить нормальный процесс брожения в период заква-
шивания. Так, при спонтанном сквашивании на протяжении трех
месяцев преобладающими видами микроорганизмов являются
Lactobacterium breve и дрожжи. Кислотность достигает только
0,05—0,1% (в пересчете на молочную), а pH 6,0—5,5 (редко4,9).
336
Процесс квашения маслин можно значительно ускорить при
использовании чистых культур молочнокислых бакте-
рий. Для этого маслины заливают горячим рассолом (5 % соли,
1% сахара и 2% томатного сока), добавляют 2—3% солодовых
ростков и 2% жидкой культуры молочнокислых бактерий. Рост
их значительно стимулируется внесением дополнительных пита-
тельных веществ. Через 10—12 дней (вместо трех и более меся-
цев) накапливается 0,2—0,3% кислоты, а pH снижается до 4,4.
На этой стадии брожения маслины имеют хороший вкус, цвет и
консистенцию и считаются готовыми для дальнейшей перера-
ботки.
Порча маслин может возникнуть при преобладании в рас-
солах, в частности па первых фазах брожения, нежелательных
микроорганизмов (группа coli, споровые и др.). Они могут выз-
вать такой дефект, как размягчение маслин и «газовый поплавок»,
который обусловливается образованием значительных количеств
водорода.
Оливки бракуются в результате образования между внутрен-
ней поверхностью кожицы и мякотью плода белых точек, так на-
зываемых «дрожжевых пятен», хотя с дрожжами такие дефекты
в действительности не связаны. Пустулы появляются в результа-
те интенсивного субэпидермального роста L. plantarum (Vaughn
et al., 1953). Оливки с указанными дефектами неприятны по
внешнему виду, хотя они и считаются здоровыми (такие же пу-
стулы могут образовываться на сброженном итальянском перце и
соленых зеленых томатах).
Нередко в сброженных зеленых оливках, расфасованных в бан-
ки, начинается вторичное молочнокислое брожение за счет оста-
точного и внесенного с добавками сахара. Рассол при этом делается
мутным, образуется осадок, газ. Избежать порчи возможно полным
дображиванием остаточных сахаров в главном брожении оливок,
промывкой их перед расфасовкой; следует также создавать в бан-
ках анаэробные условия и применять пастеризацию.
Другие растительные продукты
Процесс мочения или квашения яблок также основан на молочно-
кислом брожении. Для мочения используют сорта яблок, обладаю-
щие достаточной кислотностью и сахаристостью (8—12%) в ста-
дии технической зрелости. Яблоки в тех или иных емкостях обычно
заливают рассолом, содержащим до 1,5% соли, 3% сахара, 1%'
ячменного или ржаного солода (в виде солодового сусла), 0,25%
сухой горчицы. В благоприятных температурных условиях (12—
19°) предварительная ферментация проходит в течение 8—10 су-
ток, при этом в рассолах накапливается 0,3—0,4% молочной кис-
лоты. Затем яблоки помещают в погреб или ледник, где молочно-
кислое брожение продолжается до образования 0,6—1,5% молоч-
ной кислоты.
337
Из яблочных рассолов был изолирован ряд видов молочнокис-
лых бактерий — Lactobacillus listen, L. brevis, L. busaasiaticus,
L. plantarum, L. mannitopoeus, L. wehmeri, L. pastorianus, L. wort-
mannii, L. gracilis, L. pentoaceticus (Титоренко, 1938).
Положительные результаты получены при использовании для
квашения яблок заквасок, состоящих из чистых культур молочно-
кислых бактерий и дрожжей. Их можно размножать на отварах
из яблок, к которым добавляют сахар (иногда и ржаную муку с
отрубами). Предаожено использовать L. brevis и Sacch. cerevisi-
ae, атакже L. listen и Sacch. ellipsoideus; бактериальную заква-
ску вносят в количестве 2 %, а дрожжевую — 0,5 % к объему
яблок (Титоренко, 1938).
Мы для мочения яблок предложили использовать активную
расу молочнокислых бактерий АН-11/16 и холодостойкую расу
дрожжей Sacch. bayanus Киевскую, селекционированную нами
для шампанизации вина по резервуарному способу.
Закваски добавляли в количестве 0,5%. Яблоки, полученные
в производственных условиях с применением чистых культур,
обладали значительно лучшими показателями, чем контрольные
(приготовленные без заквасок). Они были ароматнее, вкуснее,
обладали лучшей консистенцией. Яблоки, заквашенные только
молочнокислыми бактериями, также были лучше контрольных,
но хуже приготовленных с использованием обоих микроорга-
низмов.
Для засолки помидоров используют 7—8% (иногда 5—6%)
соли в зависимости от зрелости и размеров помидоров; добавляют
специи. Если готовую продукцию есть возможность хранить в
ледниках, то помидоры, залитые рассолом, предварительно выдер-
живают на ферментационных площадках до накопления в рас-
солах 0,3—0,4% молочной кислоты.
На юге Украины, в частности, в Крыму, квасят синие бакла-
жаны и красный перец. Плотно уложенные овощи пересыпают
солью (2,5% от веса овощей), накрывают грузом и оставляют для
брожения при 20—25° в течение 12—14 дней до накопления в
рассоле 1,2—1,5% молочной кислоты, после чего продукцию хра-
нят при 2—4°„ При другом способе овощи заливают рассолом
(7% соли) и проводят предварительную ферментацию в течение
одних (при 20°) или двух (при 12—15°) суток. Бочки затем хра-
нят в леднике, где в течение 40—50 суток проходит дальнейшее
молочнокислое брожение и накапливается 0,6—1,2% молочной
кислоты.
Соление арбузов широко распространено в нашей стране. Солят
арбузы в рассолах крепостью 8—10% поваренной соли (в зависи-
мости от размеров и сорта арбузов), без специй. Арбузы готовы к
употреблению при содержании в рассоле 1—2% молочной кис-
лоты.
По мнению отдельных авторов (Выщепан, Мельман, 1952),
соление арбузов следует проводить с использованием чистых куль-
338
тур гомоферментативных молочнокислых бактерий, а хранение их
желательно при пониженных температурах (до +5°).
На Украине принято изготавливать квашеную столовую свек-
лу. Для приготовления ее овощи заливают рассолом (до 4% со-
ли); ферментацию проводят в течение 10—12 суток при 20—25°.
При этом в рассоле образуется 0,75—1,2% молочной кислоты; го-
товый продукт хранят при 2—5° (Рудченко, 1933).
Солят также морковь и другие овощи (шпинат, турнепс и др.)
(Дмитриевский, 1966; Frazier, 1958). На Гавайских островах широ-
ко употребляют в пищу кислый или сброженный пои (Frazier,
1958).
При засолке яблок, помидоров, свеклы и других овощей проте-
кает молочнокислое брожение с участием тех же видов, о которых
мы упоминали выше при описании процессов заквашивания кислой
капусты (Frazier, 1958).
Молочнокислые бактерии развиваются и при так называемом
«мокром» способе обработки кофе. Зерна кофе после удаления ко-
журы помещают в воду и сбраживают в течение 18—48 час. для
освобождения их от пектиновой мякоти. Мякоть после этого уда-
ляют, а зерна высушивают. Брожение осуществляют гетеро- и го-
моферментативные бактерии — Leuc. mesenteroides, L. brevis, обра-
зующие значительные количества уксусной кислоты, а также
L. plantarum и Str. faecalis. Однако молочнокислое брожение вряд
ли способствует освобождению зерен от пектиновой мякоти (Fra-
zier, 1958).
Молочнокислое брожение играет определенную роль в процес-
се замачивания зерна при получении кукурузного крахмала. При
температуре 40—50° в кукурузной замочной воде с 0,2—0,3%
сернистого газа в течение двух суток протекает молочнокислое
брожение. Его вызывают различные виды гомоферментативных
молочнокислых бактерий за счет использования ими редуцирую-
щих сахаров зерна, а также иных' компонентов замочной воды,
стимулирующих кислотообразование (Johnson et al., 1971).
Образуемая молочная кислота подкисляет среду до pH ниже 4,
в результате чего погибают нежелательные микроорганизмы (гни-
лостные, споровые и др.), а зерно приобретает качества, способст-
вующие лучшему помолу его.
Молочнокислые бактерии попадают в замочную жидкость с
зерном; однако главным источником их считают саму замочную
воду, которая употребляется для этой цели после ее предваритель-
ного использования в различных процессах очистки кукурузного
крахмала (Watson et al., 1955).
Следует, наконец, отметить, что и качество кукурузного экст-
ракта, который используется в промышленности антибиотиков, в
значительной мере обусловлено жизнедеятельностью термофиль-
ных молочнокислых бактерий (Lactobacterium sp.), образующих
характерные непрозрачные, волокнистые колонии (Кузнецов,
1957 а, б). Они преобладают над остальными микроорганизмами
83ft
при диффузионном способе замочки зерна в замочных водах голов-
ного чана и накапливают до 1 % молочной кислоты. Можно думать,
что повышенная концентрация сернистого ангидрида в замочной
воде, температура ее при длительной работе замочного цеха спо-
собствует отбору термофильных молочнокислых бактерий, более
приспособленных к условиям существования в данной среде. Раз-
витие молочнокислых бактерий (Lactobacterium sp.) и дрожжей ве-
дет в большинстве случаев к улучшению качества экстракта (уве-
личение содержания общего и аминного азота). Выход антибиоти-
ка Пенициллина, ауреомицина) повышается на экстракте, полу-
ченном с использованием молочнокислых бактерий (в 1,2 раза по
сравнению с контролем).
Низкокачественный кукурузный экстракт получается при ста-
ционарном способе замачивания зерна, предшествующем диффу-
зионному. В это время в экстракте обнаруживаются молочнокис-
лые бактерии, отличающиеся от описанных выше по своим приз-
накам и накапливающие только 0,2—0,5% молочной кислоты.
Таким образом, в процессе микробиологического консервиро-
вания растительных пищевых продуктов происходит закономер-
ная смена видов микроорганизмов, обладающая как рядом общих
черт, так и определенной специфичностью, зависящей от состава
сырья и режима технологии.
Ведущая роль в квашении овощей и фруктов принадлежит кок-
ковым и палочковидным гомоферментативным и гетерофермента-
тивным молочнокислым бактериям. Основной продукт их жизнеде-
ятельности (молочная кислота) оказывает консервирующее дей-
ствие, а побочные (этиловый спирт, уксусная и другие летучие
кислоты, ароматические вещества, СО2 и др.) придают продуктам
характерные органолептические свойства.
Многочисленные лабораторные исследования и производствен-
ный опыт показывают, что при биологическом консервировании
различных овощей и фруктов целесообразно пользоваться заквас-
ками из селекционированных рас микроорганизмов. Важно, чтобы
используемые закваски гарантировали развитие наиболее ценных
форм микроорганизмов, не нарушали общий ход смены микрофло-
ры, определяющий получение продукта высокого качества и поз-
воляли стабилизировать технологический процесс. Использование
заквасок особенно необходимо при больших объемах производства.
При квашении измельченных продуктов (квашение капусты)
хорошие результаты достигаются в том случае, когда применяются
расы гомоферментативных молочнокислых бактерий (L. planta-
rum) в монокультуре, а также в смеси с дрожжами.
Наилучший же эффект при консервировании цельных овощей
и фруктов дает использование смеси рас, подбор которой должен
производиться с учетом их сложного влияния на растительные тка-
840
ни (особенно покрова) и формирование органолептических свойств
готового продукта. Целесообразно в смесь включать расы гомофер-
ментативных и гетероферментативных молочнокислых бактерий.
Положительные результаты получены в производственных ус-
ловиях при проведении процесса заквашивания капусты и яблок
смесью селекционированных нами рас L. plantarum АН-11/16 и
холодостойкой шампанской Sacch. bayanus Киевская.
МЯСНАЯ И РЫБНАЯ ПРОМЫШЛЕННОСТЬ
Мясо и мясные продукты
Мясо и мясные продукты являются весьма благоприятной средой
для развития многих микроорганизмов. В мясе они находят все
необходимые для себя вещества — источники углерода, азота, ви-*
тамины, минеральные соли; pH и влажность мяса также способ-
ствуют развитию микроорганизмов.
Молочнокислые бактерии относятся к числу наиболее распро-
страненных в мясных продуктах, не только прошедших термиче-
скую обработку (как правило, недостаточно жесткую), но и ох-
лажденных. Как показали, например, Ениста и Плецес (Jenistea,
Pleceas, 1967b), при хранении рубленого замороженного свиного
мяса в течение одного года при—20° число энтерококков, перво-
начально обнаруженных в мясе (45 000—140 000/1 г), существен-
но не уменьшалось. При этом авторы указали, что наибольшее
допустимое число энтерококков в продукте не должно превышать
тысячи клеток на 1 г замороженного рубленого мяса.
Посолочные ингредиенты, такие, как поваренная соль, не вли-
яют отрицательно на развитие молочнокислых бактерий, ибо
многие виды способны выдерживать значительные концентрации
соли (Niven, 1953). А. Е. Михайлова (1967) обнаружила, что
представители вида Lactobacillus plantarum, культивируемые в
рассольной среде, устойчивы к посолочным компонентам рассола
и растут в средах с 0,15% нитрита, 1,2% нитрата, 9,6% сахара и
16% NaCl.
Температура оказывает определенное влияние на солеустой-
чивость молочнокислых бактерий, выделенных из мясных рассо-
лов. При оптимальной температуре роста они выдерживают са-
мые высокие концентрации соли. Определенные дозы NaCl даже
стимулируют рост (Goldman et al., 1963). С повышением темпера-
туры инкубации у данных бактерий появляется обязательная по-
требность в поваренной соли, но уменьшается устойчивость к ней.
Голдмен и сотрудники считают, что некоторые молочнокислые
бактерии, выделенные из рассолов и мясных продуктов, должны
рассматриваться как галотолерантные организмы; им свойственны
признаки галофилов при повышенных температурах роста.
Ml
В мясо и мясные продукты молочнокислые бактерии попадают
с почвой, воздухом, водой, из оборудования; вносятся они и с по-
солочными ингредиентами.
Роль молочнокислых бактерий в мясной промышленности раз-
нообразна и еще недостаточно изучена. Они могут вызывать раз-
личные виды порчи мяса и мясных продуктов; на этих вопросах
мы не будем останавливаться. В последние два десятилетия нача-
ли развиваться исследования по изысканию путей использования
молочнокислых бактерий для изготовления определенных видов
мясных продуктов.
Молочнокислые бактерии очень важны при получении неко-
торых видов так называемых «ферментативных» колбас («Leba-
non», «Thuringer» и др.). По данным ряда исследователей (Niven,
1953; Frazier, 1958, и др.), эти микроорганизмы придают изделию
специфический букет. Развиваясь при созревании сырокопченых
колбас, молочнокислые бактерии снижают pH среды до таких ве-
личин (pH 5,5 и ниже), при которых рост гнилостных микроорга-
низмов существенно тормозится (Старостин, Козлова, 1961; Кух-
линг, 1963). Иногда понижение pH бывает настолько сильным, что
колбаса приобретает резкий вкус (Lerche, 1956).
Молочнокислые бактерии оказывают благоприятное влияние
и на консистенцию и связанность колбасного фарша при изготов-
лении сырокопченых колбас. Это объясняется изменением поверх-
ностного натяжения фарша в результате воздействия на раство-
римые белки мяса молочной кислоты, образующейся к концу соз-
ревания колбас (Кухлинг, 1963).
Положительная роль молочнокислых бактерий состоит также
в том, что они способствуют образованию и сохранению цвета не-
которых колбасных изделий (Niven, 1953; Кухлинг, 1963).
Особую же роль, по мнению ряда исследователей (Niven, 1953;
Кухлинг, 1963, и др.), играют молочнокислые бактерии в создании
приятного аромата некоторых мясных изделий, в частности сыро-
копченой колбасы и ветчины.
Наибольшее количество работ было посвящено изысканию пу-
тей использования молочнокислых бактерий при изготовлении
сырокопченых колбас. Было показано, что в них развиваются ви-
ды родов Streptococcus (энтерококки), Leuconostoc, Lactobacillus
наряду с представителями Micrococcus, Aerobacter, Proteus, Staphy-
lococcus, Achromobacter, Pseudomonas, Bacillus, Sarcina и др.
В первые дни созревания или сушки колбас грамотрицательные
бактерии погибают, тогда как число молочнокислых бактерий воз-
растает. В процессе копчения колбасы количество энтерококков
сначала несколько снижается, а затем возрастает и может к концу
второй недели после копчения достигать миллионов клеток в 1 г
продукта; к концу сушки содержание энтерококков резко падает.
Следует отметить, что в процессе приготовления колбас сокраща-
ется и число лейконостоков. Молочнокислые палочковидные бак-
терии (например, L. plantarum) преобладают на всех этапах тех-
342
нологического процесса, начиная со второго дня созревания кол-
бас (Ceretti, 1956а, Ь; Кухаркова, 1959; Кухаркова и др., 1960,
1964; Кухлинг, 1963, и др.). Хорошо высушенная сырокопченая
колбаса отличается от иных сортов тем, что в ней содержатся поч-
ти исключительно молочнокислые палочковидные бактерии.
Преобладание молочнокислых бактерий в сырокопченых (т. н.
«ферментативных») колбасах отмечает и Дейбл с соавторами (Dei-
bel et al., 1961). Авторы показали, что при выдерживании мясно-
го фарша в течение 3—4 суток при 1,6—4,4° перед копчением в
нем не наблюдается микробиологической активности. Восстановле-
ние нитратов в нитриты, образование кислоты отмечается лишь
через 2—16 час. после начала копчения. Преобладающим видом в
различных образцах колбас является L. plantarum, причем многие
штаммы его образуют полисахарид из сахарозы. Нередко обнару-
живается также Р. cerevisiae; присутствие его наиболее характер-
но для колбас типа «Thuringer». Содержание молочнокислых бак-
терий незначительно снижается в процессе высушивания колбасы
при 10—15°.
Ройтер (Reuter, 1967а, Ь) показал, что в колбасах типа «Сер-
велат», «Салями», получаемых в заводских условиях, среди раз-
личных микроорганизмов (типичных молочнокислых палочек,
стрептококков, микрококков, дрожжей) доминирующими явля-
ются так называемые «атипичные» молочнокислые бактерии
(стрептобактерий). Автор рассматривает их как наиболее важную
группу микрофлоры сухих колбас. В процессе созревания быстро-
созревающей сухой немецкой колбасы развиваются молочнокис-
лые бактерии — палочковидные (108—109/г), лейконостоки и пе-
циококки, а также дрожжи и микрококки (Reuter et al., 1968). В то
же время количество представителей семейства Enterobacteriaceae
быстро снижается.
В свинокопченых мясных продуктах — беконе, окороках, гру-
динке, корейке — после посола (исследовали некоторые образцы
и после копчения) также преобладают молочнокислые бактерии
(Str. lactis, L. leichmannii, L. plantarum, энтерококки) и микро-
кокки (Кухаркова и др., 1965). Ни один из изученных штаммов
молочнокислых бактерий, выделенных из этих изделий, не обла-
дал протеолитическими, липолитическими и денитрифицирующи-
ми свойствами.
Большое число молочнокислых бактерий обнаружила и
А. Е. Михайлова (1968) при изучении микрофлоры заливочных
рассолов, используемых для сокращенных (6 суток) и длитель-
ных (34 суток) посолов окороков. К концу посола в рассоле пре-
обладают молочнокислые бактерии (80,8—99,2% от общего коли-
чества микроорганизмов), относящиеся главным образом к видам
Str. lactis и L. plantarum. В свежеприготовленном рассоле эти
бактерии не размножаются; увеличение их числа наблюдается
после сокращенного и, особенно, длительного посола, что, очевид-
но, можно объяснить недостатком питательных компонентов в
343
свежем рассоле. Поэтому использовать молочнокислые бактерии
в качестве закваски при посоле окороков целесообразно только в
рассолах, содержащих необходимые молочнокислым бактериям
питательные вещества.
Молочнокислые бактерии родов Streptococcus и Lactobacillus
преобладают и в рассолах, используемых для шприцевания око-
роков, приготовления сырых шпига, языков и окороков; реже там
обнаруживаются лейконостоки и педиококки. Полагают, что не
следует использовать рассол, количество энтерококков в котором
превышает 50/мл (Дыклоп, 1959).
В ветчинных рассолах, а также на поверхности ветчины обна-
ружены необычные молочнокислые палочковидные бактерии, со-
ставлявшие, однако^ большую часть микрофлоры (Deibel, Niven,
1958). Они характеризовались искривленной формой клеток, под-
вижностью, высокой солеустойчивостью, слабой ферментативной
активностью, продуцированием L (+)-молочной кислоты при
сбраживании глюкозы. Подвижные молочнокислые палочки обла-
дают некоторыми признаками, сближающими их с L. casei и
L. plantarum. Выявлены и подобные им неподвижные штаммы.
Подвижные молочнокислые бактерии, очевидно, не играют какой-
либо роли в процессе получения ветчины.
Ряд интересных и многообещающих исследований был прове-
ден в области применения молочнокислых бактерий (наряду с
другими группами) в качестве заквасок для изготовления не-
которых мясных продуктов. Использование чистых культур бак-
терий открывает широкие возможности для подбора штаммов
с желаемыми свойствами — ароматобразователей, продуцентов
антибиотиков и т. д., что может способствовать получению мясных
продуктов высокого качества и в более короткий срок.
За рубежом уже в течение ряда лет используются чистые куль-
туры молочнокислых бактерий при приготовлении «ферментатив-
ных» колбас (Стоянов, Литвиненко, 1971; Kornchild, Olsen, 1971;
Reuter, 1972). Впервые начали применять закваски молочнокис-
лых бактерий в производстве сухих колбас в США еще в 1940 г.
Полученные колбасы оказались более стойкими при хранении.
Отселекционированы штаммы Р. cerevisiae и L. plantarum, кото-
рые нашли широкое применение.
Дейбл и Нивен (Deibel, Niven, 1961) предложили использо-
вать лиофилизированную культуру Р. cerevisiae для получения
различных сортов «ферментативных» колбас. Введение Р. cerevi-
siae благоприятствует получению необходимой кислотности, цве-
та и консистенции колбас. Наблюдаемое в процессе лиофилизации
снижение солеустойчивости культуры повышают путем культиви-
рования ее в среде, содержащей 6,5% NaCl.
В Финляндии в производстве сырокопченых колбас применя-
ют также культуру микрококка (М 33). В колбасе при этом наб-
людается более быстрое восстановление нитратов и образование
красного цвета мякоти, более интенсивное кислотообразование и
«их
уменьшение микроорганизмов, вызывающих порчу колбас. Микро-
биологический анализ большого числа разнообразных проб колбас,
приготовленных с заквасками, показал, что в них содержатся пре-
имущественно молочнокислые бактерии и микрококки. Сырокоп-
ченые колбасы, pH которых составляет 5—5,3, влажность — 35—
40%, а содержание соли доходит до 5%, хорошо сохраняются
(Рефераты и обзоры иностранной технической литературы, 1958).
В Советском Союзе также проводятся исследования по подбору
и применению различных видов молочнокислых бактерий в произ-
водстве сырокопченых, сыровяленых и сухих колбас (Каргаль-
цев, 1963; Кухаркова и др., 1964; Кухаркова, Фрейдлин, 1968, и
др'.). Так, А. Старостин и Ж. Козлова (1961) получили положи-
тельные результаты при изыскании вариантов режима технологии
производства сырокопченой колбасы с применением культур Р. ce-
revisiae. Авторы показали, что введение закваски способствует
быстрому очищению колбасы от кишечной палочки и протея.
Бактериальная закваска, состоящая из смеси культур молочно-
кислых бактерий, близких к Str. lactis и L. plantarum, рекомендо-
вана к применению и при посоле окороков; была получена ветчина
с хорошими органолептическими свойствами (Михайлова, 1968).
Необходимо отметить, что в практике рекомендованные штам-
мы бактерий со временем нередко утрачивают часть ценных
свойств. Так случилось, например, с финской бактериальной зак-
ваской М-35, которая в 1955 г. была очень эффективной, а через
некоторое время полностью утратила прежние свойства (Niiniva-
ara, Pohja, 1957). Эти факты свидетельствуют о необходимости
постановки углубленных исследований по селекции активных куль-
тур для мясной промышленности.
Отдельные исследователи (Schormuller, Schilling, 1961) счита-
ют целесообразным и перспективным использовать не бактериаль-
ные закваски, а бактериальные ферменты. При лиофильном высу-
шивании бактериальной массы культур L. plantarum и L. leichman-
nii, характерных представителей полезной микрофлоры колбас, был
получен препарат фермента, сохранявший свои свойства на про-
тяжении нескольких месяцев при 20°. Применение этого препара-
та при изготовлении колбас привело к хорошим результатам. В
литературе, однако, содержится очень мало сведений об использо-
вании ферментов молочнокислых бактерий в мясной промышлен-
ности.
Мы совместно с Л. А. Мельниченко провели исследования на
Киевском, Днепропетровском и Полтавском мясокомбинатах.
Молочнокислые бактерии выделяли с помощью нашего метода
при высеве на среды с 6—8%1 этилового спирта по ходу технологи-
ческого процесса производства.
Было установлено, что молочнокислые бактерии (главным об-
разом кокковые формы) содержатся в посолочных рассолах в коли-
честве десятков и десятков тысяч клеток в 1 мл. В сырокопченых
колбасах в начале их приготовления молочнокислых бактерий
345
немного —11—12%' от общего числа микроорганизмов. Количество
молочнокислых бактерий возрастает во время созревания колбас,
а в конце их приготовления данные бактерии преобладают над
остальными микроорганизмами (составляют 96—99% от всей
микрофлоры). Выделяются (преимущественно лактобациллы) в
количестве десятков тысяч и десятков миллионов клеток на 1 г
колбасы.
Видовой состав изолированных бактерий разнообразен — Str.
lactis. Str. faecalis. P. cerevisiae, Leuc. mesenteroides, L. plantarum,
L. casei, L. leichmannii, L. brevis, L. fermenti.
Весьма существенно, что отдельные штаммы, выделенные из
производственных субстратов, проявляют жизнедеятельность даже
при содержании в среде 22—24% NaCl. Нами было установлено,
что поваренная соль оказывает существенное влияние на функции
выделенных культур.
Повышение концентрации NaCl в среде, как правило, подав-
ляет процесс образования органических кислот. В присутствии
4% NaCl изолированные из сырокопченых колбас L. plantarum
интенсивнее сбраживают мальтозу, маннит и декстрин; Str. lactis
начинает сбраживать сахарозу и маннит. При 20%поваренной со-
ли Р. cerevisiae, выделенный из рассола, ферментирует лактозу
и маннит.
Поваренная соль оказывает воздействие и на дегидрирование
молочнокислыми бактериями различных субстратов. Так, у Leuc.
mesenteroides 4% NaCl в среде угнетает процесс дегидрирования
лактозы, арабинозы, маннозы, лизина и треонина; у L. plantarum —
глюкозы, арабинозы, сахарозы, галактозы, а у L. casei — глюкозы,
сахарозы, маннозы, мальтозы и триптофана. Однако те же концент-
рации соли активируют дегидрирование галактозы и мальтозы
Р. cerevisiae.
Около половины культур молочнокислых бактерий, выделенных
нами из рассолов и колбас, обладают способностью продуцировать
ацетилметилкарбинол.
Исследованные гомо- и гетероферментативные молочнокислые
бактерии (Str. lactis, Р. cerevisiae, L. plantarum, L. leichmannii,
L. brevis) потребляют из среды никотиновую кислоту, тиамин и
рибофлавин. Некоторые же штаммы обладают способностью на-
капливать эти витамины в среде. Так, L. leichmannii выделяет в
нее тиамин (до 0,008 мкг/мл), никотиновую кислоту и рибофлавин
(до 0,032 мкг/мл). Наличие в среде 4%' NaCl стимулирует этот
процесс.
Многие культуры молочнокислых бактерий, изолированные
нами из производственных субстратов (мяса, рассолов, сырокопче-
ных колбас), обладают способностью угнетать рост ряда других
бактерий — Esch, coli, Staph, aureus, Вас. proteus.
Прямая коррелятивная зависимость между активностью кис-
лотообразованпя и антагонистическими свойствами молочнокис-
лых бактерий наблюдается далеко не всегда. Антагонизм отдель-
346
ных штаммов обусловливается, так же как и у исследованных ра-
нее культур, изолированных из других субстратов, действием не
только органических кислот, но и специфических антибиотических
веществ. Характер действия активных молочнокислых бактерий
на все испытанные тест-культуры — бактериостатический.
Степень подавляющего влияния молочнокислых бактерий на
тест-организмы в значительной степени зависит от содержания в
среде поваренной соли.
При 0,5% NaCl, например, ингибирующее действие молочно-
кислых палочек (L. plantarum, L. casei, L. leichmannii, L. brevis)
и кокков (Str. lactis, Str. faecalis, P. cerevisiae, Leuc. mesenteroi-
des) на кишечную палочку выражено слабо (ширина зон угнете-
ния до 1,0 мм). В то же время эти же штаммы на среде с 4%
NaCl проявляют значительно большую активность (зоны до
7,0 мм). При этом активные штаммы L. plantarum, L. casei,
L. brevis, вызывая в присутствии 4% NaCl значительные задерж-
ки роста кишечной палочки, в меньшей мере подавляют золотис-
тый стафилококк и палочки протея.
Следует отметить также, что стимулирующее влияние повы-
шенных концентраций хлористого натрия на антагонистическую
активность молочнокислых бактерий по отношению к различным
тест-объектам проявляется не всегда. Так, среди Str. faecalis, Р.
cerevisiae, Leuc. mesenteroides не обнаружено штаммов, которые
давали бы зоны угнетения роста Staph, aureus и Вас. proteus как
на средах с 0,5%, так и 4% NaCl.
Наши исследования показали, что возрастание угнетающего
влияния молочнокислых бактерий на тест-микроорганизмы в сре-
дах с определенными дозами хлористого натрия — сложный про-
цесс. В ряде случаев он может быть пояснен суммированием дей-
ствия органических кислот, а иногда и антибиотических веществ,
образуемых молочнокислыми бактериями, с действием поваренной
соли. У некоторых же штаммов определенных видов молочнокис-
лых бактерий наличие поваренной соли в среде, вероятно, стиму-
лирует образование антибиотиков.
Расы молочнокислых бактерий, используемых в мясной про-
мышленности, должны удовлетворять следующим требованиям:
обладать способностью достаточно активно сбраживать углеводы;
не разжижать желатин; не образовывать газ; расти в средах с
большими концентрациями соли; иметь широкие температурные
границы роста; сдвигать pH не ниже 5,0; обладать способностью
подавлять вредную микрофлору; продуцировать вещества, прида-
ющие изделиям характерные приятные органолептические свой-
ства.
В результате предварительных опытов, проведенных в произ-
водственных условиях, мы рекомендуем к апробации следующий
метод селекции рас молочнокислых бактерий для использования
при изготовлении сырокопченых колбас.
Выбираются лучшие по органолептическим свойствам батоны
347
колбас. Из них по нашему методу изолируются молочнокислые
бактерии; среди них отбираются культуры, удовлетворяющие
описанным выше требованиям. Бактерии размножают (на тех
или иных оптимальных средах) и добавляют из расчета около
10 млн. клеток на 1 г фарша. В течение опыта проводят хими-
ческие и микробиологические исследования колбас.
Мы наблюдали, что в опытных батонах колбас, в которые были
введены активные расы молочнокислых бактерий, количество их
клетотг достигает максимума обычно через две недели, причем
Esch, coli к этому времени полностью исчезает. В контрольных же
батонах кишечная палочка выделяется и через месяц. Активная
кислотность в батонах с закваской держится на более высоком
уровне — конечное pH в опытных батонах — 5,2 , в контроль-
ных — 5,4.
Среди опытных батонов после дегустации отбирают образцы,
обладающие наивысшими органолептическими показ'ателями, и
расы бактерий, на которых они были изготовлены, подвергают
более широкому производственному испытанию. Селекциониро-
ванные расы мы апробировали при приготовлении сырокопче-
ных и сыровяленых колбас. Опыты показали, что наилучшими
органолептическими показателями обладали колбасы, изготовлен-
ные с применением отдельных селекционированных рас молочно-
кислых бактерий (в частности, L. plantarum). Опытные партии
характеризовались и более благоприятным составом микрофлоры;
кишечная палочка в них исчезала значительно скорее, чем в кон-
трольных.
Обобщая литературные данные и личные исследования, необ-
ходимо отметить, что молочнокислые бактерии завоевывают еще
одну область, где их использование дает положительные резуль-
таты,— мясную промышленность.
Высокая приспособленность молочнокислых бактерий к усло-
виям новой среды обитания (в частности, большая солеустойчи-
вость) позволяет им развиваться в мясе, мясных продуктах и рас-
солах.
Применение селекционированных рас открывает перспективы
для получения изделий с новыми ценными качествами (ориги-
нальный вкус, аромат, соответствующий цвет, консистенция).
Целесообразно, чтобы выведенные расы обладали и способностью
активно подавлять вредную микрофлору, развивающуюся в мяс-
ных продуктах.
Особенно положительные результаты достигнуты при приме-
нении заквасок для изготовления некоторых сортов колбас. Най-
дут они место в технологии изготовления и иных мясных изде-
лий. В мясной промышленности нашей страны молочнокислые
бактерии еще не нашли должного применения. Необходима поста-
новка дальнейших углубленных работ по селекции эффективных
348
рас. Безусловного внимания заслуживает развитие исследований
по подбору микробных ассоциаций и разработке условий регули-
рования их жизнедеятельности в производственных условиях с
целью получения новых типов мясных изделий высокого качест-
ва. Самого пристального внимания требует изучение мяса и дру-
гих продуктов как среды для развития молочнокислых бактерий
с целью оптимизации в них условий для максимального выявле-
ния полезных функций микроорганизмов.
Рыба и рыбные продукты
Имеются сведения об участии молочнокислых бактерий в со-
зревании посоленной рыбы (Равич-Щербо, Иванова, 1952).
Известно, что некоторые рыбы, например сельдевые, после посо-
ла в процессе хранения приобретают новые вкусовые качества,
новый «букет». Изучение процессов, происходящих при этом, пока-
зало, что такое созревание рыбы имеет место как в результате ка-
чественных изменений в химическом составе белков рыбы, вызы-
ваемых ее ферментами, так и благодаря жизнедеятельности
микроорганизмов.
Роль последних стала привлекать к себе внимание особенно
после обнаружения микроорганизмов в тузлуках (рассолах), ко-
торые содержат 23—24% NaCl. Микробиологические процессы
при созревании посолов начали сравнивать с процессами, идущи-
ми при созревании сыров. Такая аналогия проводилась в связи с
установлением случаев скисания соленой рыбы и возникновения
в ней сырных запахов. На севере был давно известен способ полу-
чения квашеной рыбы (Иванова, 1947). В тузлуках пытались об-
наружить микроорганизмы, принимающие участие в создании
специфического аромата и вкуса рыбы. Мнения исследователей
о группах микроорганизмов, принимающих в этом участие, рас-
ходились. Определенное место отводилось кислотообразующим
формам, которые доминировали в рассолах в процессе созревания
рыбы.
Был проведен ряд работ и по исследованию молочнокислых
бактерий рыбных баночных презервов. Рыбные презервы — это
соленые продукты, изготовленные из мелких сельдевых рыб (киль-
ка, салака, хамса) с добавлением соли (10—14%), сахара, ан-
тисептиков, пряностей и т. д., и не подвергавшиеся тепловой
обработке. Они употребляются в пищу после 1—3 мес. созрева-
ния.
С. И. Иванова (1940, 1947, 1959) из мурманских, балтийских и
каспийских килек, мурманской сельди, астраханских тузлуков
выделила ароматобразующие кокковые молочнокислые бактерии
(Str. citrovorus) и высказала предположение об их участии в об-
разовании аромата рыбы. Автором было показано, что хранение
банок при 35—37° приводит к сильной активизации фермента-
тивных процессов распада белков рыбы и одновременному резко-
349
му увеличению количества ароматообразующих «цитроворусов»
за счет снабжения их необходимыми питательными веществами.
Значительное число таких микроорганизмов (сотни миллионов в
1 мл тузлука) обнаруживается и при хранении презервов в тече-
ние двух месяцев при 6—10° или 14—18°; из презервов, созревав-
ших при +2—2°, они не выделяются.
Рост изолированных гетероферментативных кокков стимули-
руется дрожжевым автолизатом и продуктами ферментативного
расщфд белков рыбы. При этом интересно отметить, что на жидких
питательных средах с тузлуком эти микроорганизмы выдержива-
ли до 20% соли, тогда как без тузлука их рост отсутствовал уже
при 8% NaCl.
Повышенное содержание сахара и более высокая температу-
ра хранения (при наличии антисептика — бензойнокислого нат-
рия и др.) презервов способствуют протеканию молочнокислого
брожения. Гнилостная флора при этом подавляется. В то же вре-
мя излишнее образование кислоты нежелательно, ибо приводит к
скисанию презервов (Иванова, 1959).
Из презервов выделяются и молочнокислые бактерии, близкие
к Str. lactis (Иванова, 1947). Они характеризуются высокой энер-
гией кислотообразования, устойчивостью к NaCl (24%) и анти-
септикам.
Молочнокислые бактерии вида Str. citrovorus были найдены и
А. И. Куликовым (1952) в свежепосоленной зернистой икре осет-
ровых рыб.
Об участии молочнокислых бактерий в приготовлении рыбно-
го продукта (Burong Dalag) сообщают Орилло и Педерсон (Gril-
lo, Pederson, 1968). Этот продукт является национальным блю-
дом, используемым жителями Филиппин. Он приготовляется из
смеси сброженного мяса, рыбы и отваренного риса. Как показали
авторы, главную роль в брожении рыбной мякоти играют Leuco-
nostoc mesenteroides, Pediococcus cerevisiae и L. plantarum. При-
чем, в результате брожения через неделю после приготовления
pH продукта бывает ниже 4,0.
Молочнокислые бактерии играют важную роль и при изготов-
лении рыбных силосов. В этом случае силосуют смесь из измель-
ченной целиком рыбы, солодовой и зерновой муки.
Микробиологические процессы, протекающие в рыбных сило-
сах, в общем, схожи с теми, которые имеют место в силосах из
зеленых кормов, т. е. в первый день силосования возрастает чис-
ло Str. lactis и Leuc. mesenteroides, после чего эти виды сменяют-
ся Str. faecalis, гетероферментативными лактобациллами (ко 2—
4 суткам), а затем-гомоферментатцвными (к 4—5 суткам), число
которых составляет 1010 клеток/г; pH силоса достигает 4,5. При
этом виды молочнокислых бактерий, способные разлагать крахмал
(в результате чего в силосе накапливаются простые сахара), обе-
спечивают развитие видов, не расщепляющих крахмал (Чомаков,
Киров, 1967; Wirahadikusumah et al., 1972).
350
Таким образом, установлена роль отдельных видов молочно-
кислых бактерий в процесссе созревания посоленной рыбы, при
изготовлении рыбных силосов. Они синтезируют ароматические
вещества, которые придают изделиям характерный букет; про-
дуцируемые молочнокислыми бактериями кислоты подавляют
вредную микрофлору. Деятельность молочнокислых бактерий в
рыбных презервах регулируется воздействием внешних факторов
(температура, добавление определенных доз сахара, соли и т. д.).
ПОЛУЧЕНИЕ МОЛОЧНОЙ КИСЛОТЫ
И ДЕКСТРАНА
Молочнокислые бактерии используются для получения молочной
кислоты и декстрана.
Молочная кислота находит широкое применение в ряде отрас-
лей народного хозяйства и медицины. Пищевая промышленность
использует ее для подкисления дщемов, желе, конфет, шербетов,
напитков, экстрактов; ее добавляют в рассолы при изготовлении
маринованных огурцов, маслин, рыбы, а также к молоку (для луч-
шего усвоения детьми) и т. д.
Техническая молочная кислота используется для извлечения
извести из шкур (декальцинирование), получения различных эфи-
ров, средств для стирки белья, отделки натурального и искусствен-
ного шелка, а также изготовления хлопчатобумажных изделий,
при крашении шерсти. Предлагают применять ее и в сельском хо-
зяйстве для борьбы с грызунами и приготовления фунгицидных
препаратов для тканей. Молочнокислый кальций находит место в
гальваностегии, а молочнокислый натрий во время второй мировой
войны заменял глицерин для обработки тканей, бумаги, клея, та-
бака и т. д.; это соединение может быть перспективным и в каче-
стве антифриза.
В медицине молочнокислый кальций широко применяется при
лечении различных заболеваний (как средство, уменьшающее
проницаемость сосудов; при аллергических болезнях; для борьбы с
усиленным выделением кальция из организма; как кровеостанавли-
вающее средство; при недостаточной функции паращитовидных
желез и т. д.). Препарат хорошо переносится больными, так как не
раздражает слизистые оболочки.
В настоящее время в СССР и ряде зарубежных стран (Англии,
Дании и др.) для получения молочной кислоты в промышленных
масштабах используют молочнокислые бактерии.
Преимущество микробиологического способа получения молоч-
ной кислоты перед химическим состоит в возможности направлен-
ного синтеза определенного изомера кислоты [например, L (+)].
Разделение смеси изомеров молочной кислоты, производимой на
351
основе химического синтеза, технически сложно и существенно
удорожает производство.
При производстве молочной кислоты применяют различные ви-
ды молочнокислых бактерий, что обусловлено характером сбражи-
ваемого сырья.
У нас в СССР пищевую молочную кислоту получают с помо-
щью Lactobacillus delbrueckii (штаммы БДШ, БД-ХП). Бактерии
предварительно размножают в культиваторах на питательной сре-
де, обстоящей из солодового сусла и производственного затора
(1:1). Через 12—18 час. культуру затем задают в бродильный чан
(2—3 об. %), где молочнокислое брожение протекает на среде, ком-
понентами которой являются кормовая или рафинадная патока, со-
лодовые ростки и фосфорнокислый аммоний, при 49—50°. Обра-
зующуюся молочную кислоту периодически нейтрализуют мелом.
Весь цикл брожения заканчивается за 7—10 дней. Сброженное сус-
ло нагревают, обрабатывают гашеной известью до слабощелочной
реакции и отстаивают. Отстоявшийся лактат кальция обрабаты-
вают серной кислотой. Молочную кислоту очищают и упаривают
в вакуум-аппарате до концентрации 40%. Прозрачную кислоту пос-
ле дополнительной фильтрации сушат. В производстве выход мо-
лочной (40 %-ной) кислоты по отношению к содержанию исходных
сахаристых веществ составляет около 65 %.
Показано, что, добавляя к тростниковой мелассе некоторые от-
ходы, например замочную кукурузную жидкость (3—15%), жмы-
хи горчицы, арахиса, льняных семян, проросшие семена фасоли
(по 5%), удается сократить время брожения, возбудителем кото-
рого является L. delbrueckii, и повысить выход молочной кислоты
до 95,6% в расчете на сброженный сахар (Tewari, Vyas, 1970, 1971,
1972).
Для получения молочной кислоты в качестве сырья может быть
использована и молочная сыворотка. По данным X. X. Шопмейера
(1959), из 45,1 млн. т молока для брожения при получении молоч-
ной кислоты можно использовать 1,2 млн. т лактозы. Наиболее эф-
фективно сыворотка сбраживается L. bulgaricus.
L. plantarum предложено применять для сбраживания сульфит-
ных щелоков (pH 6,3—6,7), предварительно обработанных изве-
стью и отфильтрованных. В качестве дополнительных питатель-
ных веществ в этом случае очень важно вводить солодовые ростки
или кукурузную вымочку.
Гетероферментативный вид L. brevis можно использовать для
сбраживания сырья, содержащего пентозы, — гидролизатов куку-
рузных кочерыжек, стеблей, шелухи хлопковых семян, соломы и
др. По данным лабораторных исследований, из 1 т стержней куку-
рузных початков после их гидролиза и сбраживания L. brevis по-
лучают 135 кг уксусной и 145 кг молочной кислоты (Шоп-
мейер, 1959). Для получения молочной кислоты с помощью молоч-
нокислых бактерий были предложены и иные виды сырья — кар-
тофель, свеклосахарный сок и т. д.
352
Декстран находит применение в качестве стабилизатора при
приготовлении сахарных сиропов, мороженого, кондитерских изде-
лий.
Важен декстран и в медицинской практике. В ней используют
препарат полиглтэкин — среднемолекулярную фракцию частично
гидролизованного декстрана, растворенную в изотоническом раст-
воре хлористого натрия. Полиглюкин является активным противо-
шоковым препаратом, замещающим плазму крови. При введении
в кровяное русло он долго в нем циркулирует и не проникает через
сосудистые мембраны (благодаря относительно высокому молеку-
лярному весу, почти такому же, как у альбумина крови). При ост-
рой потере крови введение полиглюкина быстро и на длительное
время повышает артериальное давление.
Для получения декстрана используют специально селекциони-
рованные штаммы Leuconostoc mesenteroides. Технологический про-
цесс проводят при их выращивании на очищенных средах с саха-
розой.
ПРИНЦИПЫ ИСПОЛЬЗОВАНИЯ молочнокислых
БАКТЕРИЙ В КАЧЕСТВЕ ИНДИКАТОРНЫХ
МИКРООРГАНИЗМОВ ПРИ ОПРЕДЕЛЕНИИ ВИТАМИНОВ
И АМИНОКИСЛОТ
Использование молочнокислых бактерий в качестве индикатор-
ных микроорганизмов при определении биологически активных ве-
ществ основано на ярко выраженной способности их отдельных
штаммов требовать для своего роста определенные витамины и
аминокислоты. Отсутствие в среде тех или иных из этих веществ
резко сказывается на нормальном развитии данных микроорганиз-
мов.
Предпосылкой при разработке методов количественного опре-
деления этих биологически активных веществ явилось изучение
пищевых потребностей молочнокислых бактерий. При этом боль-
шое внимание уделялось подбору полноценных сред, содержащих
незаменимые аминокислоты, витамины и стимулирующие рост фак-
торы (пурины, пиримидины и др.), которые обеспечивают потреб-
ности микроорганизма. Среды такого состава, дефицитные по тем
или иным необходимым аминокислотам или витаминам, которые
следует определить в субстрате, и используются в работах с инди-
каторными штаммами молочнокислых бактерий. Отсутствие роста
индикаторного штамма в полноценной по составу среде, из кото-
рой исключен витамин или аминокислота, подлежащие определе-
нию (контроль), но наличие роста в той же среде с внесенным ис-
пытуемым субстратом (опыт) свидетельствует о
данного биологически активного вещества.
!Д12 Е. И. Квасников, О. А. Нестеренко 353
Молочнокислые бактерии отвечают требованиям, предъявляе-
мым к индикаторным культурам: они очень чутко реагируют на то
вещество, по отношению к которому являются тест-объектом, и не
развиваются в его отсутствии; ответная реакция тест-организмов
на анализируемое вещество пропорциональна количеству послед-
него; они сравнительно быстро растут и не патогенны. Но в то же
время использование молочнокислых бактерий в качестве индика-
торных связано с рядом трудностей ввиду исключительной слож-
пост/i приготовления сред для их выращивания (в них должны вхо-
дить реактивы весьма высокой степени очистки).
С помощью молочнокислых бактерий возможно определять во-
семь витаминов и до восемнадцати аминокислот (Snell, 1950; Bar-
ton-Wright, 1952; Kavanagh, 1963а; Shockman, 1963, и др.).
Витамины
Молочнокислые бактерии используются в исследовательских лабо-
раториях и отдельных отраслях промышленности (например, фар-
мацевтической) для определения фолиевой кислоты, биотина, ви-
тамина В 12, пантотеновой кислоты и ее производных.
При определении того или иного витамина, содержащегося в
испытуемом материале, используют различные способы учета жиз-
недеятельности индикаторных бактерий — ацидометрический или
титрометрический (накопление кислоты определяется титровани-
ем), турбидиметрический (устанавливается оптическая плотность
бактериальной взвеси). При использовании этих методов при-
меняются жидкие среды. Перед проведением анализа строят кри-
вые, стандартные для каждого определяемого вещества. Кривая ха-
рактеризует зависимость увеличения количества образующихся в
среде клеток тест-организма (или кислоты, продуцируемой ими)
от добавления возрастающих концентраций необходимого для мик-
роорганизма вещества. С помощью стандартных кривых опреде-
ляют количество вещества в исследуемом образце.
Применяют также и диффузионные методы (так называемые
чашечные и больших агаровых пластинок). При этом индикатор-
ный организм высевают на агаризованные указанные выше среды,
а исследуемый материал вносят в цилиндрики, высверленные лун-
ки или на бумажные микродиски. Величину зоны роста молочно-
кислых бактерий вокруг внесенного материала измеряют; она явля-
ется показателем наличия исследуемого витамина.
Чашечный метод применяется для определения тиамина, рибо-
флавина, никотиновой кислоты, биотина, витамина В12, однако он
непригоден для выявления незначительных концентраций данных
веществ; в последнем случае лучше использовать пробирочный спо-
соб (Tittsler et al., 1952).
Ввиду микроаэрофилии молочнокислых бактерий методы, осно-
ванные на диффузии вещества в агар, не рекомендуется применять
как самостоятельные для определения витаминов (Eigen, Shock-
354
man, 1963). Однако они могут быть с успехом использованы в со-
четании с методами хроматографии на бумаге (биоаутография).
При этом хроматографически на бумаге разделяют смеси различ-
ных форм того или иного биологически активного вещества; затем
местоположение различных форм на хроматограмме выявляют с по
мощью микроорганизма-индикатора. Локализация веществ демон-
стрируется помещением сухой хроматограммы на чашку с агари-
зованной средой, которая засевается организмом, реагирующим на
данный ростовой фактор. Этот метод применяют для изучения ком-
плекса витаминов группы В 6, фолиевой кислоты, ее аналогов и ан-
тагонистов; иногда биоаутографию проводят с использованием со-
лей тетразолия для лучшего выявления роста микроорганизмов
(Eigen, Shockman, 1963).
В качестве индикаторов применяют ряд штаммов молочнокис-
лых бактерий.
Lactobacillus plantarum АТСС 8014 (L. arabinosus 17-5) исполь-
зуют при определении свободного биотина. Установление содержа-
ния биотина затрудняется, однако, в присутствии в испытуемом об-
разце жирных кислот и липоидных материалов. Известно, что олеи-
новая кислота (150 мкг или более) при наличии аспарагиновой
кислоты заменяет биотин для роста микроорганизмов. В связи
с этим содержащие жир материалы рекомендуется предварительно
удалять из образца путем фильтрования через бумагу при pH 4,5.
Если же концентрация жировых веществ высока, образцы следует
экстрагировать равными объемами эфира перед разведением их и
определением витамина. Сравнение данных анализов перед и после
эфирной экстракции испытуемого образца дает представление о
степени влияния содержащих жир материалов на результаты ко-
личественного определения витамина в образце (Skeggs, 1963а).
Биотин можно определять и с помощью L. casei АТСС 7469.
Этот организм, в отличие от L. arabinosus, не растет в присутствии
биотин-й-сульфоксида; дестибиотин для L. casei является антаго-
нистом биотина.
Фолиевую кислоту турбидиметрически и биоаутографически
определяют с помощью Streptococcus faecalis АТСС 8043; приме-
няют также и L. casei. Недостатком последнего, однако, является
более медленный (40 час.) по сравнению со Str. faecalis (16 час.)
рост.
Эйген и Шокмен (Eigen, Shockman, 1963) отмечают, что если
говорить об «активности фолиевой кислоты», то на сегодняшний
день мы очень мало знаем о том, что же мы в действительности
определяем. Соединения активной фолиевой кислоты в естествен-
ных материалах существуют в свободной и связанной формах, ко-
торые по разному влияют на рост различных молочнокислых тест-
организмов. Например, птероилгептаглутаминовая кислота актив-
на для L. casei и Str. faecalis, а птероилглутаминовая кислота и
птероилтриглутаминовая кислота — для указанных организмов, но
не для Pediococcus cerevisiae. Этот вид не реагирует на присутствие
355
12*
10-формилптероевой кислоты, тогда как последняя очень активна
для Str. faecalis. Обсуждение и сравнение результатов трудно осу-
ществлять, так как не исключено, что определяется только какая-
либо отдельная фракция «потенциально активного материала».
В связи с этим авторы дают некоторые указания в отношении опре-
деления фолиевой кислоты: например, «общая» фолиевая кислота
определяется с помощью L. casei (хотя нужно иметь в виду, что
L. casei «теряет» некоторые члены группы фолиевой кислоты);
птеррилглутаминовая кислота — только Str. faecalis; фолиниевая
кисйота (лейковорин) — только Р. cerevisiae.
Для определения пантотеновой кислоты и родственных соеди-
нений используют L. casei ATCC 7469 и L. plantarum ATCC 8014;
пантетина — L. helveticus ATCC 12046 (хотя в последнем случае
отмечается реакция и на пантотеновую кислоту); рибофлавина —
L. casei ATCC 7469. Использование L. fermenti ATCC 9338 для оп-
ределения тиамина не было достаточно эффективным, так как он
мог обходиться и без этого витамина. Сколе (Scholes, 1960) исполь-
зовал для учета тиамина в небольших количествах L. viridescens
ATCC 12706 и показал, что он менее чувствителен, чем L. fermenti
к стимуляторам иным, чем тиамин. Гутман (Guttman, 1963) и
Скеге (Skeggs, 1963b) описывают использование L. leichmannii
ATCC 4797 или 7830 в качестве тест-объектов при определении ви-
тамина В 12. Однако недостатком последних организмов является
неспецифичность их реакции на присутствие псевдовитаминов Bi2,
дезоксириботидов и дезоксирибозидов (например, тимидина).
В последние годы предложены и некоторые другие тест-культу-
ры молочнокислых бактерий для микробиологического определения
витаминов группы В (Betraux et al; 1969; Saito, Kuniyoshi, 1970;
Chanarin et al., 1972, и др.). Детальное описание техники опреде-
ления биотина, тиамина, рибофлавина, пантотеновой кислоты и
родственных веществ, никотиновой кислоты, группы пиридоксина,
фолиевой кислоты, В 12 имеются в ряде сводных работ (Пушкин-
ская, Куцева, 1955; Рубенчик, 1972; Bird, 1963; Eigen, Shockman,
1963; Guttman, 1963; Kavanagh, 1963b, Skeggs, 1963a, b, с), в свя-
зи с чем мы эти данные не приводим.
Аминокислоты
Микробиологические методы определения аминокислот по сравне-
нию с другими методами (хроматографическим, физико-химичес-
ким, химическим, биологическим) имеют те преимущества, что
они просты, часто специфичны, удобны в повседневной работе; тре-
буют небольшого количества испытуемого материала. К недостат-
кам этих микробиологических методов следует отнести необходи-
мость контроля за специфичностью реакции того или иного штам-
ма, использование большего количества материала, чем это нужно
для хроматографии. Использование микробиологических методов
затрудняется из-за необходимости освобождать аминокислоты из
356
их связанных форм, находящихся в исследуемом материале. Мо-
лочнокислые бактерии плохо растут на поверхности агаризованных
сред. Кроме того, как и при исследовании витаминов, использова-
ние этой группы микроорганизмов в качестве индикаторов ограни-
чено труднодоступными реактивами для приготовления сред (Ру-
бан и др., 1968; Shockman, 1963).
На практике, особенно за рубежом, для выявления отдельных
аминокислот используют определенные штаммы молочнокислых
бактерий (табл. 53).
Таблица 53
Молочнокислые бактерии, рекомендуемые для определения аминокислот
(по Shockman, 1963)
ИО 8 i(Ped. , 8081) u и
и и © 00 8 До?
Аминокислота aecalis AT mesentero (Str. sp. A dbrueckll 7 C 9649) abinosus 1 lantarum . citrovorum islae ATCC <! § S ilbrueckil 1 isel ATCC sei ATCC ichmannii C 7830) chmannii C 4797) evis ATCC , 09 £§
QO-— 50^ Д1 oo Ji Leuc л cerevi L. fei 9338 «3 jj TO о J SO L. lei (АТС L. br 8257 o «55 д is
Аланин + +’• + ” 1 *♦ + +
Аргинин + + + + + + + +
Аспарагиновая + + + +
кислота
Цистип + + + + +
Глутаминовая кис- + + + + + + +
лота
Глицин + +
Гистидин + + + + + + +
Изолейцин + + + + + + + +
Лейцин + + + + + + +
Лизин + +
Метионин + + + 1 + +
Фенилаланин + + + + + + +
Пролин + + +
Серин + + +
Треонин + + + + + +
Триптофан + + + + + +
Валин + + + + + + + +
Тирозин + + + + + +
* Str. faecium vt ir. du rans (n о D. G. Smi th, 1970).
• * L. delbrueckii АТСС 9649 рекомендуется для определения D-или L-аланина.
Leuc. citrovorum (Р. cerevisiae АТСС 8081) использован для определения DL-аланина.
L. easel АТСС 7469 может использоваться для определения D-аланина, хотя витамин
В6 мешает определению этой аминокислоты.
* ** Str. faecalis АТСС 9790 используется для определения L- метионина. L. fermenti
АТСС 9338 был рекомендован для определения DL-метионина.
357
Для выращивания тест-объекта используют полностью синтети-
ческие среды, хотя в случае определения D-аланина с помощью
L. delbrueckii применяют гидролизат казеина, освобожденный от
витамина В6; окисленный пептон (обработан перекисью водорода)
употребляют для изготовления сред при определении метионина,
цистина и тирозина, а кислотный гидролизат казеина — триптофа-
на. Состав многих синтетических сред для выращивания индика-
торных культур приведен в обзоре Шокмена (Shockman, 1963).
По сравнению с другими бактериями, например, Esch, coli, ис-
пользуемыми как тест-организмы, молочнокислые бактерии стой-
ко сохраняют свои специфические потребности в аминокислотах; о
мутационных изменениях их имеются лишь единичные указания.
При учете результатов опытов по определению аминокислот
с помощью молочнокислых бактерий, в основном, применяют аци-
диметрический и турбидиметрический способы. Можно использо-
вать также диффузионный способ (с применением дисков), если
при этом контролировать доступ кислорода, например, заливая
чашки со средой и тест-объектом верхним слоем чистого агара.
В некоторых случаях в среду добавляют трифенилтетразолий
хлорид, чтобы облегчить определение зон роста бактерий и таким
образом увеличить чувствительность метода. Метод биоаутографии
широко не используется (Shockman, 1963).
Описание техники применения этих методов можно найти в ря-
де работ (Рубан и др., 1968; Рубенчик, 1972; Shockman, 1963; Во-
linder, 1968; Wozniak, Szepietowska, 1968, и др.).
Таким образом, при определении ряда витаминов и аминокис-
лот методы, основанные на использовании индикаторных культур
молочнокислых бактерий, несмотря на ряд трудностей, завоевы-
вают заслуженное место в практике исследовательских и производ-
ственных лабораторий.
На страницах настоящей монографии мы попытались возмож-
но более полно осветить современное состояние знаний о молочно-
кислых бактериях, в течение многих лет служивших предметом
наших исследований. Мы стремились осветить те особенности их,
которые оставались в тени и не привлекали к себе внимание.
G применением новых методов исследований разносторонне изу-
чены свойства этих микроорганизмов; показано широкое распро-
странение их в природе; закономерности тесной взаимосвязи с ор-
ганическим миром, обусловленные особенностями метаболизма;
пути «одомашнивания» многих представителей, играющих огром-
ную роль в нашей повседневной жизни.
На основе познания биологии молочнокислых бактерий разра-
ботаны принципы регулирования их жизнедеятельности в ряде
отраслей промышленности, сельского хозяйства и здравоохране-
ния.
Нет сомнения, что дальнейшие исследования вскроют много
нового в биологии этих важных и интересных микроорганизмов.
Это позволит еще шире использовать их в различных областях
практики.
358
ЛИТЕРАТУРА
Акопян Л. Г. 1967.—Изв. Мин-ва
с. х. АрмССР, № 10, 57.
Александрова Л. В. 1951. Выделение
возбудителя европейского гниль-
ца Bact. pluton в чистую культуру
и изучение его морфологических и
физиологических свойств. Авто-
реф. канд. дисс., Л.
Апт Ф. С. 1954. Микробиологические
исследования процесса переработ-
ки зеленых маслин (Olea euro-
раеа). Автореф. канд. дисс., М.
Архипов А. С. 1968. Бактерии-анта-
гонисты, продуценты перекиси во-
дорода, обитающие в кишечнике
животных. Автореф. канд. дисс.,
Днепропетровск.
Асатиани В. С. 1957. Биохимическая
фотометрия. М., Изд-во АН СССР.
Аскалонов С. П., Добриер И. В. 1958.
В сб. «12-ая научная сессия Ин-
ститута питания». Тезисы докл.,
стр. 139. М.
Ауэрман Л. Я. 1963. Новые данные
о молочнокислых бактериях ржа-
ных заквасок. М., ЦИНТИпище-
пром.
Ауэрман Л. Я. 1972. Технология
хлебопекарного производства. М.,
«Пищевая промышленность».
Афанасьева О. В., Зубжицкий Ю. Н.
1969.— Микробиол., 38, 914.
Афанасьева М. В., Чижик Т. Я.
1938.— Труды Всес. ин-та с.-х. ми-
кробиол., 10, 3.
Ахмеджанов Ю. А. 1957.— Научные
труды Ташкентского медицинско-
го ин-та, Ташкент, стр. 427.
Бакушинская О. А. 1940.— Микроби-
ол., 9, 444.
Банникова Л. А., Максимова А. В.
1969.— Молочн. пром-сть, № 3, 15.
Баранова И. П., Егоров В. С. 1967.—
Микробиол., 36, 958.
Баранова И. П., Егоров В. С. 1969.—
Прикл. биохим. и микробиол,, 5,
175.
Баранова И. 11., Егоров В. С. 1973.—
Биол. науки, 4, 106.
Варбашова Н. М., Шушунова А. В.
1969.— Бюлл. Всес. н.-и. ин-та
с.-х. микробиол., № 14, 69.
Барнет А. Дж. 1955. Процессы бро-
жения в силосе. М., ИЛ.
Басина С. 1931,— ЖМИ, № 8, 94.
Баширова Р. С. 1960. Улучшение
бродильной активности микрофло-
ры жидких пекарских дрожжей.
М., Канд. дисс.
Беленовский Г. Д., Калинин А. М.
1935.— Советская ветеринария, 2,
54.
Белоусова Я. В. 1962. Микробиоло-
гия заквасок для молочных про-
дуктов. М.
Березина Г. О., Попенко А. К., Ша-
мис Д. Л., Баяхунов Я. К., Моисе-
ева В. В. 1972.— Изв. АН КазССР,
сер. биол., № 6, 35.
Берзина В. И., Ройтер И. М., Баши-
рова Р. С. 1957.—Труды КТИПП,
вып. 17, 75.
Билетова В. В. 1965. Серологическая
идентификация молочнокислых
стрептококков. Автореф. канд.
дисс., М.
Богданов В. М. 1950.— Микробиол.,
19, 147.
Богданов В. М. 1957. Микробиология
молока и молочных продуктов. М.,
Пищепромиздат.
Богданов В. М. 1958. Биологические
методы повышения качества сли-
вочного масла. Автореф. докт.
дисс., М.
Богданов В. М. 1962. Микробиология
молока и молочных продуктов. М.,
Пищепромиздат.
Богданов В. М., Баширова Р. С., Ки-
рова К. А., Корнеев И. П., Костро-
ва Е. И., Петржиковская Л. М.,
Панкратов А. Я., Свитыч К. А.
1969. Техническая микробиология
пищевых продуктов. М,, «Пищевая
промышленность».
Буканова В. И. 1952.— Гигиена и са-
нитария, 8, 32.
Ван Р. X. 1959. В кн. «Бродильные
359
производства», 2, 359. М., Пище-
промиздат.
Вараксина В. С. 1961.— Микробиол.,
30, 140.
Васильева Т. Я. 1959.— Труды объ-
единенной научной сессии, 1, 271.
Кишинев.
Вернер Д. О. 1951. Консервування
плод!в та овоч1в. Ки1в, Держтех-
видав Украши.
Веселов И. Я., Левачева В. М., Фро-
лбва Э. Г. 1955. В сб. «Сессия АН
СССР по мирному использованию
атомной энергии». Заседания отде-
ления биол. наук. М., Изд-во АН
СССР.
Виноградова И. Я. 1962. В кн. «Ру-
ководство по микробиологии, кли-
нике и эпидемиологии инфекцион-
ных болезней», 1, 339. М., Гос. изд-
во мед. лит-ры.
Вогулкин Е. Я. 1949. Изменение ки-
шечной микрофлоры ребенка в
связи с возрастом, характером
вскармливания и при некоторых
заболеваниях. Автореф. канд.
дисс. Свердловск.
Водянникова А. А. 1958.— Труды
Свердловского с.-х. ин-та, вып. 4,
91.
Войткевич А. Ф. 1948. Курс микро-
биологии молока и молочных про-
дуктов. М., Пищепромиздат.
Возняковская Ю. М., Худяков Я. Я.
1960.— Микробиол., 29, 97.
Вуд У. 1963. В кн. «Метаболизм бак-
терий». М., ИЛ.
Выщепан А. Г., Мельман М. Е. 1952.
Физико-химические основы соле-
ния и квашения овощей. М., Гос-
торгиздат.
Гардер Л. А., Балин Е. И., Богда-
нова А. А., Макарова М. 1935.—
Труды Всес. ин-та с.-х. микроби-
ол., 6, 100.
Гардер Л. А., Чесноков В. А., Балин
Е. Я., Жаботинский Т. X. 1938.—
Труды Всес. ин-та с.-х. микробиол.,
5, вып. 2.
Гартье Э. Э. 1940. Ацидофильные
бактерии кишечника детей (к би-
ологическому значению кишечных
бактерий). Практическая медици-
на, СПб.
Геймберг В. Г. 1958. В сб. «12-ая на-
учи. сессия Ин-та питания». Тези-
сы докл... М.
Гибшман М. Р. 1951.— Микробиол.,
20, 193.
Гладкова Е. А. 1955. Новая техноло-
гия приготовления ржаного хле-
ба на жидкой закваске «Саратов-
ская первая» (С-1). М., Пищепром-
издат.
Гальцева А. А. 1953. Нормальная
микрофлора желудочно-кишечно-
го тракта телят. Автореф. канд.
дисс., Сьердловск.
Гончарова Г. И. 1968.— Лаборатор-
ное дело, 1, 100.
Гончарова Г. И. 1970. Изучение би-
фидобактерий, разработка препа-
рата «Сухой бифидумбактерин» и
его эффективность при кишечных
заболеваниях детей первого года
жизни. Автореф. канд. дисс., М.
Гончарова Г. И., Вильшанская Ф.Л.
1968 — ЖМЭИ, № 7, 55.
Горбунова М. Л. 1970. Бактерии-
продуценты Н2О2, обитающие в
организме человека. Автореф. докт.
дисс., Днепропетровск.
Гречушкина Я. Я. 1962. Роль физи-
ко-химических факторов внешней
среды в гетероферментативном
молочнокислом брожении Lacto-
bacterium pentoaceticum. Автореф.
канд. дисс., М.
Гриневич А. Г. 1967. Действие гам-
ма- и УФ-лучей на молочнокис-
лые бактерии. Ташкент, «ТАН».
Гринзайд М. Я. 1959. Сб. научн.
трудов Куйбышевского н.-и. ин-та
эпидемиологии, микробиологии и
гигиены, 3, 67.
Гришин А. С., Ильинская Г. Я.,
Зелъман Г. С. 1973. Современное
хлебопекарное производство. М.,
«Пищевая промышленность».
Гудков А. В., Алексеева К. Я. 1970.—
Молочн. пром-сть, № 1, 25.
Гудков А. В., Любимова Л. А., Тро-
фимова Т. И., Силева М. Я., Лит-
винова М. Я. 1973,—Антибиотики,
18, 346.
Гудков А. В., Хандак Р. Я. 1972.—
Молочн. пром-сть, № 8, 9.
Гукасян А. В. 1960. В сб. «Сибирский
шелкопряд». Новосибирск, изд-во
СО АН СССР.
Гукасян А. Б. 1966а. В кн. «Микро-
организмы в борьбе с вредителя-
ми лесного хозяйства». М., «Нау-
ка».
Гукасян А. Б. 19666. В кн. «Материа-
лы IX Междунар. конгресса по
микробиологии». Тезисы докл. М.,
«Медгиз».
Гурьева Г. Д. 1966 (1967).—Труды
360
по микробиологии. Тезисы докл.
М., «Медицина».
Егорова А. И. 1968. Микрофлора ме-
доносной пчелы (Apis mellifera
L), здоровой и больной европей-
ским гнильцом. Автореф. канд.
дисс., Душанбе.
Егорова А. И., Полтев В. И. 1965.
В кн. «XX Юбилейный междунар.
конгресс по пчеловодству». Л.,
«Колос».
Елецкий И. К. 1967. Микробиология
хлеба и мучных кондитерских из-
делий. М., «Пищевая промышлен-
ность».
Ерзинкян Л. А. 1954. Методика при-
готовления и применения лечеб-
ного ацидофильного молока. Ере-
। ван, Изд-во АН АрмССР.
Ерзинкян Л. А. 1965. Приготовление
I и применение лечебного ацидо-
фильного молока и молока «Нари-
нэ». Ереван, Изд-во АН АрмССР.
Ерзинкян Л. А. 1971. Биологические
особенности некоторых рас мо-
лочнокислых бактерий. Ереван,
Изд-во АН АрмССР.
Ерохина М. В. 1967. Исследование
химического состава, микрофлоры
.'ч и товарных свойств квашеной ка-
.) пусты при разных температурных
режимах ферментации и хранения.
Семипалатинского зоовет. ин-та,
4, 88.
Гусев А. А. 1964.— Ветеринария,
№ И, 89.
Демяновский С. Я., Рождественская
В. А. 1958,— Ученые зап. Моск,
гос. пед. ин-та, 140, вып. 9.
Джесперсон Н. Ж. Тофт. 1971. В кн.
«XVII Междунар. конгресс по мо-
лочному делу». М., «Пищевая про-
мышленность».
Диланян 3. X., Тер-Казарьян С. Ш.,
Иоанисян Т. А. 1970. В сб. «Ос-
новные направления селекции мо-
лочнокислых бактерий в молоч-
ной промышленности». М.
Дмитриевский С. П. 1966. Соление и
квашение овощей. М., «Экопоми-
.-------------- •-----------------х 4
Долин М. 1963. В кн. «Метаболизм/
. .бактерий», М., ИЛ,
Дубинский ~Р. ~~~~1уЬ6.—- Молочн.
пром-сть, № 6, 39.
Дубинский Р. 1958.— Вопросы пита-
ния, № 2, 68.
Дыклоп В. К. 1959. Бактериальные
процессы при посоле мяса, вып.
45. М- П.ИНТИпптцепром.--------
TpoSo Р. 1948. Бактериальная клет- i .
кя М ИЛ ____.------/
Дьяченко U. Ф., Шидловская В. П.
1970.— Труды Всес. н.-и. ин-та мо-
лочн. пром-сти, вып. 27, 9. / Залашко М. В., * Мочалова К. В.
Егоров И. С. 1957. Выделение микро/ 1969.— Молочн. пром-сть, № 3, 18.
бов-антагонистов и биологический v Залашко М. В., Образцова И. В., .
методы учета их антибиотической Савченко Э. И. 1970. В сб. «Физио-
активности. М., Изд-во МГУ \ « логия и биохимия микроорганиз-
Егоров Н. С., Баранова И. П., Мо\, мов». М., «Наука и техника». ——
«“ойк А' Х' 1968-“ МикР°биол< Звягинцев В. //. 197з7-11рикл7~био- ,
37, 286. L хим. и микробиол., 9, 710 ______
Егоров С.^ Баранова И. П., Мак- Д~ЗуЬрилин А. А. 1943. Силосование
’ "" I j кормов. М., Сельхозгиз.
Зубрилин А. А. 1947а. Научные ос-
новы консервирования зеленых
кормов. М., Сельхозгиз.
Зубрилин А. А. 19476. Силосование
кормов. М., Сельхозгиз.
Зубрилин А. А., Болотин Е. А. 1944.
Силосование кормов. М., Сельхоз-
гиз.
Зубрилин А. А., Мишустин Е.
1958. Силосование кормов.
Изд-во АН СССР.
Зубрилин А. А., Мишустин Е.
Харченко В. А. 1950. Силос.
Сельхозгиз.
Иванова С. И. 1940.— Микробиол., 9,
706.
симов В. Н., Силъвестровр. О. И.
1973.— Изв. АН СССР, сер. биол.,
№ 1, 99.
Егорова А. Г. 1964. Исследование мо-
лочнокислых бактерий ржаных за-
квасок и подбор новых штаммов
для улучшения качества ржаного
хлеба. Автореф. канд. дисс., М.
Егорова А. Г., Казанская Л. И., Ло-
банова А. Я., Мелихова 3. В., Бес-
палова Г. И., Щербач В. А. 1963.
Приготовление ржаного формово-
го хлеба с применением новых
штаммов молочнокислых бактерий
и дрожжей. М., ЦИНТИпищепром.
Егорова А. И. 1966. Микрофлора пер-
ги медоносной пчелы. В кн. «Ма-
териалы IX Междунар. конгресса
13 Е. И. Квасников, О. А. Нестеренко 361
и.
м.,
и.,
м„
Jtefru.nea~£L И.\ 1947/— МикробиОЛ„
—16.302.
Иванова С. И. 1959. Анализ микро-
флоры некоторых рыбных продук-
тов в связи с технологией их из-
готовления. Автореф. канд. дисс.,
Л.
Тлялетдънов А. Н. 1973.— М1кроб1ол.
ж., 35, 21.
Ильин В. В., Касторский В. С.
1968а.— Гигиена и санитария,
№ 1$, 39.
Ильин В. В., Касторский В. С.
19686,— ЖМЭИ, № 9, 108.
Ильина Л. Д. 1959. Научн. труды Ки-
евской опытной станции животно-
водства, 5, 143.
Ильина Л. Д. 1960. Влияние добавок
сульфата аммония и мочевины на
процесс силосования кормов. Ав-
тореф. канд. дисс. Киев.
Тлына Л. Д., Танцуров Г. В., Проко-
пенко Л. С. 1968. В сб. «Корми та
год!вля сьтьськогосподарських тва-
рин». Респ. м!жв1д. темат. наук,
зб., вип. 12, 20.
Ильинская Т. И. 1966. Витамины в
хлебопекарной промышленности
СССР и за рубежом. М., ЦИНТИ-
пищепром.
Имшенецкий А. А. 1946.— Микроби-
ол., 15, 422.
Инструкция по технологии соления
огурцов и помидоров. 1957. М.,
Госторгйздат.
Инструкция по биологическому кон-
сервированию жома молочнокис-
ттттипт бпптсрттямп^ 4973, Кирд.-
Al! ал ина Г. И. 1964. В кн. «Руковод-
ство по микробиологии, клинике и
' эпидемиологии инфекционных бо-
лезней», 4, 489. М., «Медицина».
ТГалйна~А. И. ПГ70:—ЖМЭТГ,7ПЖ
Калина Г. И. 1972.— Лаб. дело, №11,
691.
Калина Г. И., Королева Н. С., Семе-
нихина В. Ф. 1973.— Молочн.
пром-сть, № 1, 8.
Камбуров Г. 1963. Научни трудове
на висш. вет.-мед. ин-т, 9, 317.
Каменев А. А. 1933. Эксперименталь-
ная засолка огурцов для внутрен-
него рынка. Киев, Изд-во НКСна-
ба УССР.
Каменев А. А., Листовничий М. Ф.
1940. В сб. «10 лет Всес. научно-
иссл. ин-та плодоовощной промыш-
ленности». Юбил. сб. Киев.
Камнев А. 1918. Нежинское соленье
и маринады. М., Мех.-техн. изд-во
н.-т. отдела ВСНХ.
Канунникова 3. А. 1954.— Микроби-
ол., 23, 641.
Каргальцев И. И. 1963. Эксперимен-
тальные исследования в области
технологии сырокопченых колбас
и сыровяленых, изготовленных с
применением культуры Lactob.
plantarum. Автореф. канд. дисс., М.
Касивадзаки М., Намиока С., Акаи-
кэ Й. 1967. Цит. по РЖБ 7Б832,
1968.
Кац Л. И., Харатьян Е. Ф. 1969.—
Микробиол., 38, 278.
Квасников Е. И. 1947. Некоторые за-
кономерности влияния ультрафио-
летовых лучей на микроорганизмы.
Научная сессия АН УзССР.
Квасников Е. И. 1948. Антагонизм
микробов и пути его практическо-
го использования. Ташкент, Изд-
во АН УзССР.
Квасников Е. И. 1949. Бактериаль
ные болезни крепких и десертных
вин. Ташкент, Изд-во АН УзССР.
Квасников Е. И. 1951а.— Изв. АН
УзССР, № 3, 41.
Квасников Е. И. 19516.— Виноделие
и виноградство СССР, № 2.
Квасников Е. И. 1952а.— Микробиол.,
21, 160.
Квасников Е. И. 19526. В сб. «Вопро-
сы микробиологии в виноделии и
виноградарстве». М., Изд-во АН
СССР.
Квасников Е. И. 1952в.— Микроби
ол., 21, 71.
Квасников Е. И. 1958. В сб. «Вопро-
сы пищевой и бродильной микро-
биологии». Киев. Изд-во АН УССР.
Квасников Е. И. 1960. Биология мо-
лочнокислых бактерий. Ташкент,
Изд-во АН УзССР.
Квасников Е. И., Андрусенко М. Я.
1958а. Узб. биол. ж., № 3, 49.
Квасников Е. И., Андрусенко М. Я.
19586,—Докл. АН УзССР, № 8,49.
Квасников 6. I., Веренштейн О. И.,
Васильева 3. О., Сухов В. В. 1963.—
Мпсробюл. ж., 25, 54.
Квасников в. I., Веренштейн О. И.,
Васильева 3. О., Сухов В. В. 1966.
Застосування молочнокислих бак-
терш для бюлопчного консерву-
вання жому. Виставка передового
досвщу в народному господарств!
УРСР. КиТв, Вид-во АН УРСР.
Квасников 6. I., Васильева 3. О.,
Веренштейн О. И., Коцюбинсъкий
С. В. 1967.— Харчова промисло-
в1сть, № 3, 23.
Квасников Е. И., Гриневич А. Г.,
Пантюхина Е. А. 1961,— Труды ин-
та микробиологии АН СССР, 10,
82.
Квасников Е. И., Жвачкина А. А.,
Михайлова Е. К. 1956.— Изв. АН
УзССР, № 3„ 27.
Квасников Е. JL, Коваленко Н. К.,
Нестеренко О. А. 1971а. Микроби-
ол., 40, 144.
Квасников Е. И.,^Коваленко Н. К.,
Нестеренко О. А. 19716.— Ветери-
нария, № 8, 38.
Квасников Е. И., Кондо Г. Ф. 1956а.—
Докл. АН УзССР, № 7, 57.
Квасников Е. И., Кондо Г. Ф. 19566.—
Виноделие и виноградарство СССР,
№ 8, 5.
Квасников Е. И., Кондо Г. Ф. 1957.
Молочнокислое брожение вина и
борьба с ним. Ташкент, Госиздат
УзССР.
Квасников Е. И., Кондо Г. Ф. 1958.
Труды Всес. научно-иссл. ин-та
виноделия и виноград., 6, в. 2.
Квасников Е. И., Кондо Г. Ф. 1964.
Молочнокислые бактерии вина и
основы регулирования их жизне-
деятельности. М., «Пищевая про-
мышленность».
Квасников Е. И., Кузьминова М. Л.,
Мисорина Н. Е., Семенова Л. В.
Коенман Л. И. 1953.— Вопросы
краевой патологии, вып. III, стр.
32. Ташкент, изд-во АН УзССР.
Квасников Е. И., Лаврентьева Г. И.,
Слюсаренко Т. П. 1965.— Прикл. би-
охимия и микробиол., 1, 4, 414.
Квасников Е. И., Михайлова Е. К.
1958.— Узб. биол. ж., № 1, 75.
Квасников Е. И., Нестеренко О. А.,
Подгорский В. С., Мельниченко
Л. А.—1967. Микробиол., 36, 175.
Квасников Е. И., Нестеренко О. А.
1968.— Прикл. биохим. и микроби-
ол., 4, 68.
Квасников Е. И., Нестеренко О. А.,
Касумова С. А., Качан А. Ф., Кова-
ленко Н. К. 1970а.— Микробиол.,
39, 654.
Квасшков 6. I., Нестеренко О. О.,
Подгорський В. С. 19706,— М1кро-_ /
Квасников Е. ‘<ff^~CydeHKO В. И. Г
1967а.— Цитология и генетика, 1 >5
Квасниковс. Суденко В. I.
19676.— М1кроб1ол. ж., 29, 2.
Квасшков 6. I., Суденко В. I.
1967в.— Мшробшл. ж., 29, 146.
Квасников Е. И., Сумневич М. Г.
1953.— Микробиол., 22, 267.
Квасников Е. И., Сумневич М. Г.
1954. Микробиологические основы
силосования кормов в условиях
Узбекистана. Ташкент, Изд-во АН
УзССР.
Квасников Е. И., Сумневич М. Г.
1955 —Изв. АН УзССР, № 5, 31.
Квасников 6. И., Тевелев1ч М. Б.
1964.— Мшробшл. ж., 26, 40.
Квасников 6. 1., Щолокова 1. П.
1967.— Мшробшл. ж., 29, 1.
Квасников Е. И., Щелокова И. Ф.
1968.— Изв. АН СССР, сер. биол.,
№ 4, 543.
Квасников 6. I., Щолокова I. П., На-
горна С. С. 1971.—Мшробшл. ж.,
33, 1.
Кизенко Л. М., Другобицкая С. П.
I960.— Хлебопекарная и конд.
пром-сть, № 3, 45.
Киров Н. 1959.—Научни трудове
Висш. селскостопанск. ин-т
Г. Димитров, зоотехн. ф-т, 8, 269.
Киров Н. 1962,—Научни трудове.
Висш. селскостопанск. ин-т
Г. Димитров, зоотехн. ф-т, 2, 363.
Киров Н. 1972.— Животновъдни на-
уки, 9, 85.
Кирсанов Г. П. 1969,—Молочн. пром-
сть, <№ 6, 27.
Клаар Я. И. 1961. Сравнительное ис-
следование распространения и фи-
зиологических свойств молочно-
кислых бактерий в составе эпи-
фитной микрофлоры силосуемых ।
растений в Эстонской ССР. Авто-
реф. канд. дисс., Тарту.
Климовский И. И., Звягинцев В. И.,
Гудков А. В. 1969.— Молочн.
пром-сть, № 6, 10.
Ключевич Л. М. 1972.— Лаб. дело,
№ 11, 697.
Коваленко Н. К. 1970.— Мшробшл.
ж., 32, 297.
Коваленко Н. К. 1971. Молочнокис-
лые бактерии насекомых. Авто-
реф. канд. дисс., Киев.
Ковровцева С. А. 1937.— Докл.
'Козлов Ю. А. 1950. Питательные
. среды в медицинской микробиоло-
гии, М., Медгиз.________—------—
Козлова Т&т-ГЕгДТГгоров Н. С., Бара-
нова И. П., Максимов В. Н. 1972.—
Микробиол., 41, 1007.
Козьмина Н. П. 1971. Биохимия хле-
.463
13*
бопечения. М., «Пищевая промыш-
Z—иеадаии-------— --------—1---->
Кокорина Л. М. 1970. В со. «Вопро-<
сы физиологии микроорганизмов»,.
уКоасиодао.-----------•-----—-—
Коленъко Е. И., Здорик О. В. 1966.—
Химия в сельском хозяйстве, 1, 52.
Коленъко Е. И., Горева И. П., Гетма-
нец О. Д. 1972.— Бюлл. ВНИИ фи-
зио.т., биохимии и питания с.-х.
животных, вып. 2 (25), 49.
Кондратенко Р. 1963.— Картофель и
_ овоши, 10, 26._ _
Корнильцева А. 11. 1969? В сб. «Био^
логия и культивирование микроор-,
*~^ганизмов». Красноярск,
Королев С. А. 1Угй. основы техниче-
ской микробиологии молочного
дела. М.— Л., Сельхозгиз.
Королева Н. С. 1966. Техническая
микробиология кисломолочных
продуктов. М., «Пищевая промыш-
ленность».
Королева И. С. 1968.— Труды Всес.
н.-и. ин-та молочн. пром-сти, вып.
26, 97.
Коршунов Д. А. 1956. Соление огур-
цов и помидоров. М., Гос -во
^тщливой ft
'^/Крампитц Л. 1963. В кн. «Метабо-
лизм бактерий». М„ ИЛ. _
Красильников Н. А. 1949. Определи-
тель бактерий и актиномицетов.
М,— Л„ Изд-во АН СССР.
Красильников Н. А. 1958. Микроор-
ганизмы почвы и высшие расте-
ния. М., Изд-во АН СССР.
Красильников Е. Н. 1965. К вопросу
о химизме гомоферментативного
молочнокислого брожения и его
изменении в зависимости от соста-
ва среды. Автореф,- канд. дисс., М.
Крукланде М. 1964.— Труды Всес.
н.-и. ин-та с.-х. микробиол., 21, 30.
Крукланде М. Я. 1970. В сб. «Микро-
организмы и растения», № 4, 123.
Рига, «Зинатне».
Кудзин К. М. 1940. Ацидофильная
палочка, ее природа и терапевти-
ческое значение ее культур.
Минск, Изд-во н.-и. ин-та пищевой
пром-сти БССР.
Кулатунга Р. А. 1973.— Научн. докл.
высш, школы, биол. н., № 3, 101.
Кузнецов В. Д. 1957а,— Микробиол.,
26, 367.
Кузнецов В. Д. 19576.— Микробиол.,
26, 481.
Куликов А. Н. 1952. Микробиологи-
ческие основы технологии пасте-
ризации зернистой икры осетро-
вых рыб. Канд, дисс., М.
Кухаркова Л. Л. 1959. Микрофлора
сырокопченых колбас. Рефераты
и обзоры иностр, техн, лит-ры,
вып. 32. М.
Кухаркова Л. Л., Лаврова Л. П., Со-
ловьев В. И., Фрейдлин Е. М., Пе-
рова П. В., Садикова И. А., Кры-
лова В. В., Бушкова Л. А., Рынди
на В. П., Трудолюбова Г. Б., Кар-
галъцев И. И., Михайлова А. Е.,
Карпова В. И., Полетаев Т. Н.,
Меркулова В. К. 1964.— Труды
Всес. н.-и. ин-та мясной пром-сти,
16, 64.
Кухаркова Л. Л., Перова П. В.,
Илъяшенко М. А., Трудолюбова
Г. Б. 1960.— Труды Всес. н.-и. ин-та
мясной пром-сти, 12, 112.
Кухаркова Л. Л. Фрейдлин Е. М.
1968. Штаммы бактерий Lactobac-
terium plantarum «Д». Авт. свид-во
СССР. кл. 6а, 14 (С 12 к), № 210063,
заявл. 25.05.65, опубл. 4.04.68.
Кухаркова Л. Л., Фрейдлин Е. М.,
Кострулина 3. Н., Бушкова Л. А.,
Еремина Г. К., Соколов А. А.
1965.— Европ. конгресс работни-
ков НИИ мясной пром-сти, докл.
6. М.
Кухлинг Э. 1963,— «Мясная инду-
стрия СССР», 1965, 5, 8.
Лаврентьева Г. И. 1965. Изыскание
антибиотиков, активных по отно-
шению к молочнокислым бактери-
ям. Автореф. канд. дисс., Киев.
Лемминг Э. Я. 1971. Виды, причины
и пути снижения потерь питатель-
ных веществ при силосовании ос-
новных кормовых культур. Авто-
реф. канд. дисс., Тарту.
Леонович В. В. 1953.— Труды Всес.
н.-и. ин-та с.-х. микробиол., 12, 43.
Леонович В. В., Полонская М. С.,
Бибердиева М. П. 1953.— Труды
Всес. н.-и. ин-та с.-х. микробиол.,
12, 48.
Леонович В. В., Поперекова Т. М.,
1963. Труды ин-та с.-х. микробио-
логии. Сб. статей, вып. 18, 39.
Ленцнер А. А. 1966,—Ученые зап.
Тартуского ун-та, в. 191, 51.
Ленцнер А., Тоом М. 1963.— Молочн.
пром-сть, № 9, 43.
Лопухов В. И. 1964.— Консервная
и овощесушильная пром-сть,
№ 8, 6.
Луковникова Л. 1960.— Молочн.
пром-сть, №11, 25.
S64
Луковникова Л. 1961.-— Молочй.
пром-сть, № 10, 39.
Макарова М. М. 1946. В сб. «Микро-
биология на службе сельского хо-
зяйства». Лениздат.
Макарова М. М. 1955.— Докл.
ВАСХНИЛ, вып. 5, 31.
Макарова М. М. 1961. В сб. «Микро-
биология кормов». Труды совещ.
по микробиологии кормов 8—11
декабря 1959 г., Алма-Ата.
Макарова М. М. 1962. Микробиоло-
гия силосования. М.— Л., Сельхоз-
издат.
Макарова М. М., Голикова А. А.,
Шушунова А. В., Барбашова Н. М.
1968. В сб. «Использование микро-
организмов в животноводстве и
для защиты растений», Л.
Максимов В. Ф. 1962.— ЖМЭИ, № 5,
116.
Максимова А. К. 1968.— Труды Всес.
н.-и. ин-та молочн. пром-сти,
вып. 26, 52.
Максимова А. К. 1970,—Труды
Всес. н.-и. ин-та молочн. пром-сти,
вып. 27, 32.
Маслечкина Р. С. 1971. Разработка
режима получения и применения
лактоцида для подавления инфек-
ции при непрерывном сбражива-
нии крахмалистых заторов. Авто-
реф. канд. дисс., Киев.
Машков А. В., Нронштадская-Каре-
ва Б. К., Афонина Л. Г. 1968.-—
ЖМЭИ, № 12, 72.
Мелкумян П. Б. 1961.— Изв. АН
АрмССР, биол. науки, 14, 65.
Минагава К. 1970. Цит. по РЖБ,
6Б1107, 1971.
Минкевич И. Е. 1949. Бактерии груп-
пы кишечной палочки как сани-
тарно-показательные микроорга-
низмы. Л., Медгиз.
Михайлов Е. И. 1950. Шелководство.
М., Сельхозгиз.
Михайлов Е. Н. 1958. Болезни и вре-
дители шелкопрядов. М., Изд-во
с.-х. лит-ры.
Михайлова А. С. 1958.— Труды Всес.
н.-и. ин-та с.-х. микробиол., 15,
192.
Михайлова А. Е. 1967.— Труды Всес.
н.-и. ин-та мясной пром-сти, 19,
117.
Михайлова А. Е. 1968. Изучение роли
молочнокислых бактерий при по-
соле окороков. Автореф. канд.
дисс., М.
Мишустин Е. Н. 1933. Научные ос-
новы силосования кормов. М.—
Л., Сельхозгиз.
Мишустин Е. II. 1964. Силосование
и технология кормов. М., «Колос».
Мишустин Е. Н., Лапотышкин Р. А.
1974.— Изв. АН СССР, сер. биол.,
№ 2, 157.
Мишустин Е. Н„ Мирзоева В. А.
1936,— Микробиол., 5, 855.
Мишустин Е. Н., Мирзоева В. А.
1963.—Изв. АН СССР, сер. биол.,
№ 6, 785.
Мишустин Е. Н., Трисвятский Л. А.
1963. Микробы и зерно. М., Изд-
во АН СССР.
Моисеева Е. Л. 1967.— Молочн.
пром-сть, № 8, 15.
Нагорна С. С. 1972. В сб. «Бшлопч-
Hi властивоста м!крооргашзм1в».
Тезисы докл. I респ. копф. моло-
дых ученых. Киев.
Назин В. С., Писъяук 3. В, Поваро-
ва М. II. 1964. Новые виды соленых
и квашеных овощей. М., «Эконо-
мика».
Наместников А. 1967.— Картофель и
овощи, № 9, 43.
Насалъская Н. Е. 1934. Эксперимен-
тальное квашение огурцов чисты-
ми культурами молочнокислых
бактерий в заводских условиях.
Харьков — Киев, Изд-во Нарком-
снаба УССР.
Начев Л. 1966,— Изв. микробиол.
ин-т. Бълг. АН, 18, 51.
Начев Л., Антонова Т., Никоевска Ц.
1972.— Изв. микробиол. ин-т. Бълг.
АН, 23, 47.
Начев Л., Добрева Е. 1967.— Изв.
микробиол. ин-та Бълг. АН, 19,
101.
Недялков Ст. 1958.— Изв. ин-та по
сравнителна патология на домаш-
ните жнвотни, Бълг. АН, кн. VI.
Недялков Ст. 1964.— Изв. на микро-
биол. ин-т Бълг. АН, 16, 227.
Нестеренко О. О. 1963а.— Доп. АН
УРСР, № 11, 1509.
Нестеренко О. О. 19636.— Мшробюл.
ж„ 25, 29.
Нестеренко О. О. 1963в,-— М1кроб1ол.
ж., 25, 6.
Нестеренко О. А. 1964. Молочнокис-
лые бактерии в эпифитной микро-
флоре растений некоторых обла-
стей Украинской ССР. Автореф.
канд. дисс., Киев.
Нестеренко О. О. 1966.—Мщробюл.
ж., 28, 25.
365
Непомняща М. Л. 1934.— М1кроб1ол.
ж., № 3—4, 55.
Непомнящая М. Л., Медвинская
Л. Ю., Либерман Л. А. 1961. Бак-
териофаг молочнокислых стреп-
тококков и борьба с ним в молоч-
ной промышленности. Киев, Изд-
во АН УССР.
Непомняща М. Л., Тевглевич М. Б.
1955.— Мшробшл. ж., 17, 35.
Николсе В. А. 1932. К микробиоло-
гии хлебных заквасок. М.— Л.,
Снабтехиздат.
Никольский В. В. 1958.— Труды ин-
та биологии АН СССР, Уральский
филиал, вып. 10, 76.
Новый лактобациллиновый препа-
рат, изготовляемый на основе су-
хого экстракта всей культураль-
ной среды молочнокислых бакте-
рий. Франц, пат. кл. А 61 к, с
12d, № 257 САМ, заявл. 220967,
опубл. 31.03.69. Цит. по РЖБ
5Б1144П, 1973.
Овощи соленые, квашеные и консер-
вированные. С б. стандартов. 1953.
М., «Стандартгиз».
Овчарова Т. П. 1972. Применение
низина в консервной промышлен-
ности. М.
Овчарова Т. П., Масленникова Н, М.
1969. Антибиотики в пищевой про-
мышленности. М., «Пищевая про-
мышленность».
Одинцова Е. Н. 1959. Микробиологи-
ческие методы определения вита-
минов. М., Изд-во АН СССР.
Омелянский В. Л. 1953а. Избр. тру-
ды, 1, 501. М„ Изд-во АН СССР.
Омелянский В. Л. 19536. Избр. тру-
ды, 1, 511. М., Изд-во АН СССР.
Омелянский В. Л. 1953в. Избр. тру-
ды, 2, 279. М., Изд-во АН СССР.
Островский А. И. 1949. Техно-хими-
ческий контроль хлебопекарного
производства. М., Пищепромиздат.
Островский А. И. 1955. Жидкие пе-
карские дрожжи. М., Пищепромиз-
дат.
Павловский Е. Н. 1957. Методы руч-
ного анатомирования насекомых.
М,— Л., Изд-во АН СССР.
Палладии Н. В., Карасева А. И.,
Креслине Е. К. 1932.— Труды
Центр, биохим. ин-та пищевой и
вкусовой пром-сти 1, вып. 7.
Палладина О. К. 1941. Биология воз-
будителей молочнокислого броже-
ния. М.— Л., Пищепромиздат.
Пасвик М. А. 1923.— Изв. н.-и. ин-та
им. Лесгафта, VI.
Перетц Л. Г. 1955. Значение нор-
мальной микрофлоры для организ-
ма человека. М., Медгиз.
Перетц Л. Г. 1962. В кн. «Руководст-
во по микробиологии, клинике и
эпидемиологии инфекционных бо-
лезней», 1, 659. М., Гос. изд-во мед.
лит-ры.
Перфильев Д. Ф. 1972.— ЖМЭИ,
№ 11, 75.
Пименова М. Н. 1958,— Микробиол.,
27, 177.
Писарницкий А. Ф., Родопуло А. К.,
Беззубов А. А., Егоров И. А. 1969
— Виноделие и виноградарство
СССР, № 1 (264), 12.
Планелъес X., Харитонова А. 1960.
Побочные явления при антибиоти-
котерапии бактериальных инфек-
ций. М., Медгиз.
Плотников П. М. 1956.—Труды
ЛТИПП, 13, 3.
Плотников П. М., Еремина К. В.,
Базовская К. Г. 1961.— Изв. Высш,
учебных зав., пищевая техноло-
гия, № 1, 35.
Плотников П. М., Княжичев М. И,,
Шмидт 3. И. 1953а.— Труды
ЛТИПП, 3, 13.
Плотников П. М., Княжничев М. И.,
Шмидт 3. И. 19536.— Труды
ЛТИПП, 3, 37.
Подгорский В. С. 1967. Молочнокис-
лые бактерии рубца крупного ро-
гатого скота. Автореф. канд. дисс.,
Киев.
Подгорсъкий В. С. 1969.— Мшробшл.
ж., 31, 407.
Подкопаев В. М. 1970.— Труды Моск,
вет. акад., 54, 92.
Покровская М. П., Эпштейн-Литвак
Р. В., Вилыианская Ф. Л., Рахи-
мова Н. Г., Поспелова В. В., Куд-
рявцева Н. Г., Силъверстова Т. Н.,
Калинина А. М., Сядук В. Ф.
1972,— ЖМЭИ, № 10, 54.
Полонская М. С. 1959.— Микробиол.,
21, 303.
Полонская М. С. 1953. В сб. «Микро-
биология на службе сельского хо-
зяйства». М., Сельхозгиз.
Полонская М. С., Леонович В. В.,
Бибердиева М. П. 1953.— Докл.
ВАСХНИЛ, 8, 21.
Полтев В. И. 1967.— Труды НИИПа,
219.
Полтев В. И., Гриценко И. Н. 1966.
366
В кн. «Биологические методы
борьбы с вредителями сельского
хозяйства». Ташкент, «ТАН».
Полтев В. И., Гриценко И. Н.,
Егорова А. И., Кальвиш Т. К.,
Туркевич Л. Л., Ушакова Н. В.
1969. Микрофлора насекомых.
Новосибирск, Изд-во СО АН СССР.
Порошина Г. И. 1964. В сб. «Фитон-
циды в народном хозяйстве», «На-
укова думка», Киев, стр. 146.
Праве В. Е. 1972. В сб. «Материалы
Междунар. симпозиума по дезин-
фекции и стерилизации. М., «Ме-
дицина».
Приставка В. П. 1964. В сб. «Захист
рослин», вып. 1, 20. Киев, «Уро-
жай».
Приставка В. П. 1966.— Энтомологи-
ческое обозрение, 45, 302.
Промышленная переработка плодов
и овощей. Сб. инструкций. 1935.
Киев, Изд-во Наркомвнуторга
УССР.
Пушкинская О. И., Куцева Л. С.
1955. В сб. «Витаминные ресурсы»,
№ 3, 133. Изд-во АН СССР.
Пыхова С. В., Устинников Б. А., Лав-
рентьева Г. И., Слюсаренко Т. П.
1966.— Ферментная и спиртовая
пром-сть, № 1, 12.
Пятницына И. П. 1968.— Труды
Всес. н.-и. ин-та молочн. пром-сти,
вып. 26, 37.
Равич-Щербо Ю. А., Иванова С. И.
1952,— Труды Всес. н.-и. ин-та
рыбного хоз-ва и океанографии
(ВНИРО), 20, 266.
Рефераты и обзоры иностранной
технической литературы, вып. 28.
М., Э. И. «Пищевая пром-сть»,
вып. 7, 1958.
Ройтер И. М. 1966. Хлебопекарное
производство. Технологический
справочник. Киев, «Техника».
Ройтер И. М. 1971. Современная
технология приготовления теста
на хлебозаводах. Киев, «Техника».
Ройтер И. М., Баширова Р. С. 1959.—
Хлебопек, и конд. пром-сть, № 9,
16.
Ройтер И. М., Берзина Н. И., Баши-
рова Р. С. 1957,—Труды КТИПП,
вып. 17, 57.
Рокицкий П. Ф. 1967. Биологическая
статистика. Минск, «Наука и тех-
ника».
Роскин Г. И., Левинсон Л. Б. 1957.
Микроскопическая техника. М.,
«Советская наука».
Рощин В. П. 1971. В сб. «Качество
и хранение пищевых продуктов»,
вып. 4, 54. М.
Рубан Е. Л., Вербина Н. М., Бутен-
ко С. А., Озолинь Р. К., Заринь
Д. Г. 1968. Биосинтез аминокислот
микроорганизмами. М., «Наука».
Рубенчик Л. И. 1972. Микроорганиз-
мы — биологические индикаторы.
Киев, «Наукова думка».
Рубенчик Л. И., Гальперин М. В.
1935,— Микробиол., 4, 57.
Рудченко А. 1933. Як квасити буря-
ки. Харк1в. Вид. НКПостачання
УРСР.
Саенко Н. Ф. 1950.— Виноградарст-
во и виноделие СССР, № 2.
Сатуновская С. П. 1952. Энтерокок-
ки и молочнокислый стрептококк,
их антагонистические свойства и
вопросы возможности использова-
ния в терапии и профилактике.
Свердловск.
Седова Н. Н. 1970.— Вопросы пита-
ния, № 29, 29.
Селибер Г. Л. 1939.—Микробиол., 8,
463.
Селибер Г. Л., Бовшик Г. А. 1924.—
Изв. н.-и. ин-та им. П. Ф. Лесгаф-
та, 10, 51.
Селибер Г. Л., Бычковская А. Л.,
Вольфсон И. А. 1933.—Труды
Всес. ин-та с.-х. микробиол., 5.
Селибер Г. Л., Бычковская А. Л.
1956.— Микробиол., 25, 675.
Селибер Г. Л., Пумпянский А. Я.
1959,— Микробиол., 28, 287.
Семенихина В. Ф. 1968а.— Труды
Всес. н.-и. ин-та молочн. пром-сти,
вып. 26, 69.
Семенихина В. Ф. 19686.— Труды
Всес. н.-и. ин-та молочн. пром-сти,
вып. 26, 78.
Семенихина В. Ф. 1970 — Труды
Всес. н.-и. ин-та молочн. пром-сти,
вып. 27, 72.
Семигановская И. В., Балин Е. И.,
Гардер Л. А., Жаботинский Г. X.
1935.— Труды Всес. ин-та с.-х.
микробиол., 6, 82.
Силева М. И., Литвинова М. Н.
1972.— Микробиол. пром-сть, 10
(94), 22.
Сиренко Л. А., Черноусова В. Н.,
Нестеренко О. А. 1966.— Гидроби-
ол. ж., вып. 5, 71.
Сирко Л. А. 1968. В сб. «Материалы
к симпозиуму молодых ученых
г. Новосибирска, посвященному
50-летию ВЛКСМ». Новосибирск,
867
Скалой И. С. 1939,— Изв. н.-и. ин-та
им. П. Ф. Лесгафта, 23.
Скородумова А. М. 1949. Практиче-
ское руководство по технической
микробиологии молока и молочных
продуктов. М.— Л., ОГИЗ, Сельхоз-
гиз.
Скородумова А. М. 1956.— Вопросы
питания, № 2, 32.
Скородумова А. М. 1958. В сб. «Воп-
росы пищевой и бродильной мик-
робиологии». Киев, Изд-во АН
УССР.
Смирнова Г. М. 1962. Физиологичес-
кая деятельность микрофлоры
ржаного теста при различных ус-
ловиях тестоведения. Автореф.
канд. дисс., М.
Смирнова Г. М., Егорова Л. А., Ка-
линина В. И. 1960.—Труды Центр,
н.-и. ин-та хлебопекарной пром-
сти, вып. 8, 141.
Снелл Э. 1954. В кн. «Физиология
бактерий». М., ИЛ.
Соколов И. И. 1959.— Труды ин-та
микробиологии и вирусологии АН
КазССР, 3, 205.
Соколов И. И. 1965. Амилолитичес-
кие бактерии в силосовании кор-
мов. Автореф. канд. дисс., Алма-
Ата.
Соколов П. И., Березина Г. О., Бело-
зерова Е. Е. 1972.— Изв. АН
КазССР, сер. биол., 4, 30.
Сосновская Е. А. 1959.— Животно-
водство, № 7, 61.
Старостин А., Козлова Ж. 1961.—
Мясная индустрия СССР, 6, 15.
Старыгина Л. П. 1935.— Микробиол.,
4, 225.
Стоянов Ив., Литвиненко М. 1971. В
кн. «II конгресс по микробиол.»,
1969, ч. 4, стр. 165. София.
Суденко В. I. 1963.— М1кроб1ол. ж.,
25, 13.
Суденко В. I. 1964а,—Мшробшл, ж.,
26, 54.
Суденко В. I. 19646.— М1кроб1ол. ж.,
26, 37.
Суденко В. И. 1964в. Молочнокислые
бактерии желудочно-кишечного
тракта человека и их антагонисти-
ческие свойства. Автореф. канд.
дисс., Киев.
Сумневич М. Г. 1961.— Узб. биол. ж.,
№ 1, 3.
Сухова Т. С. 1971.— Молочн. пром-
сть, № 6, 24.
Тараканов Б. В. 1965а.— Труды
Всес, н.-и, ин-та физиологии и би-
охимии с.-х. животных, вып. 2,
250.
Тараканов Б. В. 19656.— Ветерина-
рия, № 9, 22.
Таранов Г. Ф. 1968. Анатомия и
физиология медоносных пчел. М.,
«Колос».
Тевелевич М. Б. 1961. Биологичес-
кие свойства Str. lactis. Автореф.
канд. дисс., Киев.
Текенова Г. X., Чуканов И. К., Ча-
лова Ф. Б. 1968.— Изв. АН
КазССР, сер. биол., 5, 66.
Тер-Казаръян С. Ш., Диланян 3. X.,
Сагоян А. С. 1972.— Прикл. биохим.
и микробиол., 8, 896.
Технологическая инструкция по
квашению капусты. 1956. М., Гос-
торгиздат.
Технологические инструкции по вы-
работке хлебо-булочных изделий.
1960. М., Пищепромиздат.
Титоренко Г. К. 1938. В сб. работ
Всес. н.-и. ин-та плодоовощной
промышленности за 1936 г. Киев.
Триленко В. А. 1964. Сб. работ Ле-
нинградского ветин-та, вып. 26, 34.
Тропин Ф. В., Брагилевская В. Д.
1956. Приготовление ржаного хле-
ба на жидкой закваске «И-1». М.
Тулъчинский М. Н. 1950,—Микро-
биол., 19, 434.
Тулъчинский М. И., Шмидт 3. И.,
Скалон И. С. 1938. Бактерии кис-
лого теста. М.— Л., Пищепромиз-
дат.
Усатюк М. К. 1960. Мочение яблок.
М., Изд-во Центросоюза.
Федулина И. 1965. Дрожжи силоса и
пути их использования. Автореф.
капд. дисс., Л.
Феофилова Е. П. 1959.— Докл. АН
СССР, 125, 913.
Фостер 9. М., Нелсон Ф. Ю., Спекк
М. Л., Детч Р. Н., Олъсон Дж. С.
1961. Микробиология молока. М.,
Пищепромиздат.
Фробишер М. 1965. Основы микро-
биологии. М., «Мир».
Харатъян Е. Ф., Кац Л. Н., Опарин
А. И. 1967,—Докл. АН СССР, 175.
1154.
Христов Г., Марков С. 1960.— Изв.
микробиол. ин-т Бълг. АН, кн. И,
221.
Худяков Я. П., Возняковская Ю. М.
1956.— Мпкробиол., 25, 184.
Ценковский Л. 1878. О студенистых
образованиях. Харьков.
368
Цыганов В. А., Петрова Л. Я., Лав-
рентьева Г. И., Кудряшова В. В.
Яровенко В. Л.. Устинников Б. А.,
Бурачевский И. И., Маслечкина
Р. С. 1969.— Прикл. биохимия и
микробиол., 5, 3, 309.
Черепов В. М. 1966.— Труды н.-и.
ин-та пчеловодства. М., «Москов-
ский рабочий».
Чернух А. М., Кивман Г. Я. 1962.
Антибиотики группы тетрацикли-
нов. М., Медгиз.
Чижик Г. Я. 1955,—Ученые зап.
Ленинградского ун-та, № 216, сер.
биол. наук, 41, 104.
Чизар И., Пулей Г. 1958. В кн. «14-й
Междунар. конгресс по молочно-
му делу». М., Пищепромиздат.
Чомаков Хр., Киров И. 1967.— Науч-
ни трудове висш. солскосто-
панск. ин-т. Г. Димитров, зоотехн.
ф-т. 18, 197.
Чуканов Н. К. 1963.— Труды ин-та
микробиол. и вирусол. АН КазССР,
7, 22.
Чуканов Н. К. 1965. Микробиологи-
ческие и биохимические процессы
при консервировании кормов ме-
табисульфитом натрия. Автореф.
канд. дисс., Алма-Ата.
Чужова 3., Шубина Л. 1960.— Мо-
лочн. пром-сть, № 2, 40.
Шаинская И. М. 1958. В сб. «Вопро-
сы пищевой и бродильной микро-
биологии». Киев, Изд-во АН УССР.
Шамис Д. Л. 1961. В сб. «Микро-
биология кормов». Труды совеща-
ния по микробиологии кормов,
8—11 декабря 1959 г. Алма-Ата.
Шапошников В. И., Семенова В. А.
1949.— Микробиол., 18, 106.
Швец В. Н., Слюсаренко Т. П., Мель-
ник А. И. 1974.— Ферментная и
спиртовая пром-сть, № 6, 20.
Шершнева В. И., Лагода И. В. 1970.—
Труды Всес. н.-и. ин-та молочн.
пром-сти, вып. 27, 58.
Шкундова Ю. В. 1968.— Прикл. био-
хим. и микробиол., 4, 599.
Шопмейер X. X. 1959. В кн. «Бро-
дильные производства», 1, 328. М.,
Пищепромиздат.
Штейнхауз Э. 1950. Микробиология
насекомых. М., ИЛ.
Штейнхауз Э. 1952. Патология насе-
комых. М,— Л., ИЛ.
Штибен В. Д., Базарова Е. И., Цик-
лаури Е. В. 1933,—Труды Средне-
азиатского н.-и. ин-та шелковод-
ства, вып. 3. Москва — Ташкент,
Изд-во СА ОГИЗ.
Шугаевская П. Г. 1938. В сб. работ
Всес. н.-и. ин-та плодоовощной
пром-сти за 1936 г. Киев.
Шугаевская П. Г. 1939. В сб. работ
Всес. н.-и. ин-та плодоовощной
пром-сти за 1937 г. Киев.
Шугаевская П. Г. 1940. В сб. работ
Всес. н.-и. ин-та плодоовощной
промышленности за 1938 г. Киев.
Щедушнов Е. В., Дьяченко П. Ф.
1972.— Молочн. пром-сть, № 9, 13.
Щелокова С. С. 1959.— Узб. биол. ж,
№ 2.
Щолокова I. П. 1964.— М1кроб1ол. ж.,
26, 20.
Эмануилов И., Натшев Л. 1958. В кн.
«14-й Междунар. конгресс по мо-
лочному делу». М., Пищепром-
издат.
Юргенсон М. П. 1951.— Труды
ВНИИХП, вып. 4.
Яровенко В. Л., Устинников Б. А.,
Маслечкина Р. С., Лаврентьева
Г. И. 1968а.— Ферментная и спир-
товая пром-сть, № 4, 16.
Яровенко В. Л., Устинников Б. А.,
Бурачевский И. И., Маслечкина
Р. С. 19686.— Ферментная и спир-
товая пром-сть, № 8, 17.
Abd-el-Malek Y., Gibson Т. 1948.—
J. Dairy Res., 15, 233.
Abo-Elnaga I. G., Kandler 0.1965a.—
Zbl. Bakt., II. Abt., 119, 1.
Abo-Elnaga I. G., Kandler O. 1965b.—
Zbl. Bakt., II. Abt., 119, 117.
Abo-Elnaga I. G., Kandler O. 1965c.—
Zbl. Bakt., II. Abt., 119, 661.
Allen L. A., Harrison J., Watson S. J.,
Ferguson W. S. 1937.— J. Agric.
Sci., 27, 271.
Anderson K. J. 1956.— Nature, 177,
N 4498, 96.
Anderson R. L., Wood W. A. 1969.—
Ann. Rev. Microbiol., 23, 548.
Andrewes F. W., Border T. J. 1906.—
Lancet ii, 708.
Andrews J., Gilliland R. B. 1952.—
J. Inst. Brew., 58, n. s. 49, 189.
Archibald J. G., Blaisdell M. L., Ger-
sten B., Kinsman D. M. 1954.— Mas-
sachusetts agric. Exp. Sta. Bull.,
477.
Archibald I. G., Kusmesky I. W.
1954,—J. Dairy Sci., 37, 1283.
Axelrod I., Keusch G. T., Bottone E.,
Cohen S. M., Hirschman S. Z. 1973.—
Ann. Intern. Med., 78, 33.
369
Baddiley J., Davison A. L. 1961.—
J. Gen. Microbiol., 24, 295.
Balan N., Georgescu C., Vintu 0. 1959
(I960).—Centr. exptl. ingrasam
bacter, 2, 303.
Balcke J. 1884a.— Wochschr. Brau., 1,
181.
Balcke J. 1884b.— Wochschr. Brau.,
1, 257.
Balzar J., Breberg M., Prsa M. 1962.—
Veterenaria, 4, 459.
Barber C., Beloin I., Pleceas P. 1964.—
Arch, roumain. pathol. exptl. et
microbiol., 23, 714.
Barnes E. M. 1956a.— J. Appl. Bacte-
riol., 19, 193.
Barnes E. M. 1956b.— J. Gen. Micro-
biol, 14, 57.
Barnes E. M. 1959.— J. Sci. Food and
Agric, 10, 656.
Barnes E. M., Ingram 1955.— Ann.
Inst. Pasteur, Lille, 7, 115.
Barnes E. M., Ingram M., Ingram G. C.
1956,— J. Appl. Bacterio!., 19, 204.
Barnes I. J., Seeley H. W., VanDemark
P. J. 1961,— J. Bacteriol, 82, 85.
Barritt M. M. 1936.— J. Path. Bacteri-
ol, 42, 441.
Barthel 0. 1937. Dauerkulturen von
Milchsaurebakterien in sterilisier-
ten Erden, Prof. Burri zum 70 Ge-
burtstag.
Barton-Wright E. C. 1952. Microbio-
logical assay of the vitamin В com-
plex and amino acids. New York.
Bauman H. E., Foster E. M. 1956.—
J. Bacteriol, 71, 333.
Beach A. S. 1952.— J. Gen. Microbiol,
6, 60.
Beccard E. 1921.— Zbl. Bakt, II. Abt,
54, 465.
Beccard E. 1929.— Zeitschr. f. d. ges.
Getreidewesen, 16, 85.
Beck J. 1967.— Ann. biol. clin, 25,
______12 1255.
Beck Th. 1972. Landwirt. Forsch, 25,
Sondern. 27/2, 55.
Becker B., Lechevalier M. P., Gordon
R. E., Lechevalier H. A. 1964.—
Appl. Microbiol, 12, 421.
Berridge N. J., Barrett J. 1952.-—
J. Gen. Microbiol, 6, 14.
Berridge N. J., Cheeseman G. C., Mat-
tick A. T. R., Bottazzi V. 1957.—
J. Appl. Bacteriol, 20, 195.
Bertaux O., N’Guyen C6ng H., Valen-
cia R. 1969.— Ann. nutr. et aliment,
23, A77-A 86.
Beynum J. Van, Pette J. W. 1936.—
Ref. Milchwirtsch. Forschungen, 18,
209.
Bidan P. 1956.— Ann. Tech, agric, 5,
597.
Biocca E., Seppilli A. 1947.— J. Infect.
Dis, 81, 112.
Bird O. D. 1963. In «Analytical micro-
biology» (F. Kavanagh Ed.). New
York — London, Acad. Press.
Bisset K. A., Davis G. H. G. 1960. La-
ctobacilli. In «The microbial flora
of the mouth». London.
Blaurock G. 1939.— Zbl. Bakt, I. Grig,
144, 75.
Bohhcek J., Blazicek G., Kocur M.,
Solberg O., Clausen O. G. 1969.—
Arch. Mikrobiol, 67, 58.
Bolinder A. E. 1968. Acta pharmac.
suec, 5, 401.
Bonner R. D., Fergus C. L. 1960. My-
cologia, 52, 642.
Borbolla у Alcala lose Ma Rodriguez
de la, Ferndndez-Diez Matias J.
Gonzales-Cancho Fernando. 1969.—
Appl. Microbiol, 17, 734.
Bottazzi V. 1958.— Ann. Microbiol, 8,
64.
Bottazzi V., Ledda A., Arizza S.
1971a.— Lait, 51, N 505—506, 328.
Bottazzi V., Battistotti B., Vescovo M.
1971b.— Milchwissenschaft, 24, 214.
Brandsaeter E., Nelson F. E. 1956.—
J. Bacteriol, 72, 73.
Braun W. 1947.— Bacteriol. Revs, 11,
75.
Breed R. S., Murray E. G. D., Smith
N. R. 1957.— Bergey’s Manual of
determinative bacteriology, 7-th ed.
Baltimore: Williams and Wilkins.
Breuillaud I., Michel G., Marvillet H.,
Godfrin A. 1971.—Bull. Assoc, dip-
lomes microbiol. Fac. pharm. Nan-
cy, N 121, 29.
Briggs С. A. E. 1952.— J. Dairy Res,
19, 167.
Briggs M. 1953a.— J. Dairy Res,
20, 36.
Briggs M. 1953b — J. Gen. Microbiol,
9, 234.
Briggs С. A. E., Newland L. G. M.
1952.— J. Dairy Res, 19, 160.
Brown J. P., Edwards M. R., VanDe-
mark P. J. 1968.— Canad. J. Micro-
biol, 14, 829.
Brown J. P., VanDemark P. J. 1968.—
Canad. J. Microbiol, 14, 829.
Brownlee A., Moss W. 1961.— J. Pat-
hol. and Bacteriol, 82, 513.
Bryant M. P. Burkey L. A. 1953a.—
J. Dairy Sci, 36, 205.
370
Bryant M. P., Burkey L. A. 1953b.—
J. Dairy Sci., 36, 218.
Bryant M. P., Burkey L. A. 1956.—
J. Bacteriol., 71, 43.
Bryant M. P., Kroulik J. T., Burkey
L. A., Wiseman H. G. 1952.— Bacte-
rio!. Proc., p. 21.
Bryant M. P., Small N., Bouma C.,
Robinson I. M. 1958a.— J. Dairy Sci.,
41, 1747.
Bryant M. P., Small N., Bouma C.,
Robinson I. M. 1958b.— J. Bacteri-
ol., 76, 529.
Bucher G. E. 1963. In «Insect patho-
logy an advanced treatise», 2. New
York — London. Acad. Press.
Bucher G. E., Stephens J. M. 1959.—
J. Insect. Pathol., 1, 356.
Buckmire F. L. A. 1970,— Int. J. Syst.
Bacterio!., 20, 345.
Bujak S., Kasperzycka A. 1956.—
Acta Microbiol. Polon., 5, 401.
Burkey L. A., Kroulik J. T. 1953.
J. Dairy Sci., 36, 603.
Burkey L. A., Kroulik J. T., Bryant
M. P., Wiseman H. G. 1953.—
USDA —BDI, Inf.- 154.
Buyze G., Van de Hamer J. A., de Ha-
an P. G. 1957.— Antonie Leeuwen-
hoek. J. Microbiol, and SeroL, 23,
345.
Camerer W. 1961.— Mchn. med.
Wschr., 41, 1971.
Camien M. N. 1952.— J. Biol. Chem.,
197, 687.
Camien M. N., Dunn M. S. 1954.—
J. Biol. Chem., 211, 593.
Cantoni C. 1966a.— Boll. 1st. Sierote-
rap. Milan, 45, 92.
Cantoni C. 1966b.— Boll. 1st. Sierote-
rap. Milan, 45, 165.
Cantoni C. 1966c.— Boll. 1st. Sierote-
rap Milan, 45, 309.
Cantoni C., Hill L. R., Silvestri L. G.
1965a.— Appl. Microbiol., 13, 631.
Cantoni C., Manachini P. L., Crave-
ri R. 1965b.— Ann. Microbiol. Enzi-
mol., 15, 151.
Capriotti A. 1958a.— Arch. Microbiol.,
30, 383.
Capriotti A. 1958b.— Arch. Microbiol,
30, 387.
Carmichael J. W., Sneath P. H. A.
1969.— Systematic Zoology, 18, 402.
Carr J. G. 1959.— J. Appl. Bacteriol.,
22 377
Cato E. P., Moore W. E. C. 1965.— Ca-
nad. J. Microbiol., 11, 319.
Catsaras M. 1967.— Ann. Inst. Pasteur
Lille, 18, 121.
Catteau M., Beerens H., Roeloflen M.
1971.— Ann. Inst. Pasteur Lille, 22,
381.
Ceretti K. 1956a.— Fleischwirtschaft,
4, 195.
Ceretti K. 1956b.— Fleischwirtschaft,
5, 260.
Chanarin I., Kyle R., Stacey J. 1972.—
J. Clin. Pathol., 25, 1050.
Chander H., Chebbi N. B., Rangana-
than B. 1973.— Arch. MikrobioL,
92, 171.
Cheeseman G. C. 1959.— J. Appl. Bac-
terio!., 22, 341.
Cheeseman G. C. 1960.— J. Dairy Res.,
27, 33.
Cheeseman G. C., Berridge N. J.
1959.— J. Appl. Bacteriol., 22, 307.
Cheeseman G. C., Berridge N. J., Mat-
tick A. 7’. R., Bottazzi V. 1957.— J.
Appl. Bacteriol., 20, 205.
Cheeseman G. C., Silva M. T. 1959.—
J. Appl. Bacteriol., 22, 294.
Cheng A. L. S., Greenberg S. M. Deu-
el H. J., Melnick D. 1951.— J. Biol.
Chem., 192, 611.
Chesbro W. R., Evans J. B. 1959.— J.
Bacteriol., 78, 858.
Clark W. A. 1971.— Int. J. Syst. Bacte-
riol., 21, 111.
Collins E. B. 1961.—Appl. Microbiol.,
9, 200.
Collins E. B., Bruhn I. C. 1970.— J.
Bacteriol., 103, 541.
Colman G. 1968,—J. Gen. Microbiol.,
50, 149.
Colman G., Williams R. E. O. 1965.—
J. Gen. Microbiol., 41, 375.
Colobert L., Blondeau H. 1962.— Ann.
Inst. Pasteur, Paris, 103, 345.
Colobert L., Morelis P. 1958. Abstracts,
Intern. Congr. Microbiol. 7-th
Congr. Stockholm, 437.
Colwell R. R., Mandel M., Ray H.
1967,—Canad. J. Microbiol., 13, 917.
Conn H. 0., Floch M. H. 1970.— Amer.
J. Clin. Nutr., 23, 1588.
Cosenza B. J., Lewis F. B. 1965.— J.
Invertebr. Pathol., 7, 89.
Coster E., White H. R. 1964.— J. Gen.
Microbiol., 37, 15.
Costilow R. N., Fabian F. W. 1953.—
Appl. Microbiol., 1, 314.
Costilow R. N., Ferguson W. E.,
Ray S. 1955,— Appl. Microbiol., 3,
341.
Cowman R. A., Speck M. L. 1967.—
Appl. Microbiol., 15, 851.
Cowman R. A., Yoshimura S., Swais-
371
good H. E. 1968.— J. Bacteriol., 95,
181.
Crociani F., Scardovi V., Trovatelli
L. D. 1970.— Ann. microbiol. ed en-
zimol., 20, 101.
Cummins C. S., Glendenning О. M.
1957.— Nature, 180, 337.
Cummins C. S., Harris H. J. 1956.— J.
Gen. Microbiol., 14, 583.
Cummins C. S., Harris H. 1958.— J.
Gen. Microbiol., 18, 173.
Cunnlnfgham A., Smith A. M. 1939.—
Zbl. Bakt., II. Abt., 100, 394.
Cunningham A., Smith A. M. 1940.—
J. Dairy Res., 11, 243.
Curran H. R., Rogers L. A., Whittier
E. O. 1933,—J. Bacteriol., 25, 595.
Dacre J. C. 1958,— J. Dairy Res., 25,
409.
Dacre J. C., Sharpe M. E. 1956.— Na-
ture, 178, 700.
Dain J. A., Neal A. L., Seeley H. W.
1956,— J. Bacteriol., 72, 209.
Damjanovic V., Radulovic D., Ven S.
1969.— Bull. Inst. int. froid., 49, 205.
Davis G. H. G. 1955 — J. Gen. Micro-
biol., 13, 481.
Davis G. H. G. 1959a.— Lab. Practice,
8, 161.
Davis G. H. G. 1959b — J. Appl. Bac-
teriol., 22, 350.
Davis G. H. G. 1964.— J. Gen. Micro-
biol., 34, 177.
Davis G. H. G., Bisset K. A., Hale
С. M. F. 1955.— J. Gen. Microbiol.,
13, 68.
Davis G. H. G., Fomin L., Wilson E.,
Newton K. G. 1969.— J. Gen. Micro-
biol., 57, 333.
Davis 1. G. 1955. A dictionary of dai-
rying. London, Leonard Hill, p. 576.
Davis J. G. 1960. The ]actobacilli-I. In
«Progress in industrial microbiolo-
gy», 2. London, Heywood and Co.
Deger H. 1932,— Milchwirtsch. Zeit.,
Berlin, 37, N 37a—38a, 39.
Dehnert J. 1957a.— Zbl. Bakt., I. Ref.,
163, 481.
Dehnert J. 1957b.— Zbl. Bakt., I. Grig.,
169, 66.
Deibel R. H. 1964.— Bacteriol. Revs.,
28, 330.
Deibel R. H., Evans J. B. 1960.— J.
Bacteriol., 79, 356.
Deibel R. H., Evans J. B., Niven С. F.
1957.— J. Bacteriol., 74, 818.
Deibel R. H., Lake D. E., Niven C. F.
1963.— .1. Bacteriol., 86, 1275.
Deibel R. H., Niven C. F. 1958,— Appl.
Microbiol., 6, 323.
Deibel R. H., Niven C. F. 1960.— J.
Bacteriol., 79, 175.
Deibel R. H., Niven C. F. 1961.—Appl.
Microbiol., 9, 239.
Deibel R. H., Niven C. F., Wilson G.D.
1961.— Appl. Microbiol., 9, 156.
Delwiche E. A. 1961.— J. Bacteriol.,
81, 416.
DeMoss R. D. 1953.— J. Cell. Comp.
Physiol., 41, suppl. 1, 207.
DeMoss R. D., Bard R. C., Gunsalus
I. C. 1951a.—J. Bacteriol., 62, 499.
DeMoss R. D., Gunsalus I. C., Bard
R. C. 1951b.— Bacteriol. Proc. Soc.
Amer. Bacteriol., 125.
DeMoss R. D., Gunsalus I. C., Bard
R. C. 1953.— J. Bacteriol., 66, 10.
Denny С. B., Sharpe M. E., Bohrer
C. W. 1961.— Appl. Microbiol., 9,
108.
Devaraj S. K., Zinnemann K. 1969.—
J. Med. Microbiol., 2, 366.
Devoyod J. J., Desmazeaud M. 1970.—
Lait., 50, 374.
Dobrogozc W. J., Stone R. W. 1958.—
Bacteriol. Proc., 10.
Dolin M. I. 1957.— J. Biol. Chem., 225,
557.
Dubinski J., Przoczek T., Siudak F.
1955.— Roczn. nauk roluiczych, N 5.
Dubos R. J., Schaedler R. W. 1962.—
Amer. J. Med. Sci., 244, 265.
Dudani A. T. 1950. Ph. D. Thesis.
Ames, Iowa, Iowa State College Lib-
rary.
Dunican L. K., Seeley H. W. 1965.—
J. Gen. Microbiol., 40, 297.
Durand J., Toumanojj C. 1967,— Cald-
ers ORSTOM Hydrobiol., 1, 101.
Eaves G. N., Mundt J. O. 1960.— J.
Insect Pathol., 2, 289.
Ejthymiou C., Hansen P. A. 1962.—
J. Infect. Dis., 110, 258.
Ejthymiou C. J., Joseph S. W. 1972.—
J. Bacteriol., 112, 627.
Eigen E., Shockman G. D. 1963. In
«Analytical microbiology». F. К a-
v a n a g h (Ed.), New York — Lon-
don. Acad. Press.
Elliker P. R., Anderson A. W., Han-
neson G. 1956.— J. Dairy Sci., 39,
1611.
Elliott S. D. 1966.— J. Hygiene, 64,
205.
Elsden S. R., Phillipson A. T. 1948.—
Rev. Biochem., 17, 705.
Emard L. O., Vaughn R. H. 1952.— J.
Bacteriol., 63, 487.
Emerson J. A., Kazanas N., Greig R. H.,
372
Seagram H. Z., Kempe L. L. 1966.—
Food. Technol., 15, 191.
Etchells J. L., Costilow R. N., Ander-
son T. E., Bell T. A. 1964,—Appl.
Microbiol., 12, 523.
Etchells J. L.. Borg A. F., Bell T. A.
1968.— Appl. Microbiol., 16, 1029.
Eschenbruch R. 1970.— Vitis, 9. 218.
Exterkate F. A., Otten B. J., Wassen-
berg H. W„ Veerkamp J. H. 1971.—
J. Bacteriol., 106, 824.
Facklam R. D., Moody M. D. 1970.—
Appl. Microbiol., 20, 245.
Feldheim G. 1958.— Ernahrungsfor-
schung, 3, 193.
Fellers C. R. 1926.— Univ, of Washin-
gton Publ. in Fish., 1, 157.
Felton E. A., Evans J. B., Niven C. F.
1953.— J. Bacteriol., 65, 481.
Ferguson M. J., Micks D. W. 1961.—
J. Insect. Pathol., 3, 112.
Fischer A. 1916. (Цит. по C. Higgin-
bottom, D. W. F. Wheater, 1954).
Flesch P. 1968.— Arch. Mikrobiol., 60,
285.
Ford J. E., Perry K. D., Briggs С. A. E.
1958.— J. Gen. Microbiol., 18, 273.
Frazier W. C. 1958. Food Microbiolo-
gy. New York — Toronto — London,
McGraw-Hill Book Company, INC.
Franklin J. G., Sharpe M. E. 1964.—
J. Gen. Microbiol., 34, 143.
Fred E. B., Peterson W. H., Ander-
son J. A. 1921.— J. Biol. Chem., 48,
385.
Friedman E., Black L. A. 1941.— J.
Bacteriol., 42, 152.
Fuller A. T. 1938.— Brit. J. exptl. Pat-
hol., 19, 130.
Fuller R. 1973.— J. Appl. Bacteriol.,
36, 131.
Gaddi A. A.. Marth E. H. 1971.— J.
Milk and Food Technol., 34, 124.
Galesloot Th. E. 1956.— Nederl. melk-
en Zuiveltijdschr., 10, 2.
Galesloot T. H. E. 1950,— Ned. melk-en
Zuiveltijdschr., 4, 274.
Gall L. S., Huhtanen C. N. 1951.— J.
Dairy Sci., 34, 353.
Garvie E. I. I960,—J. Dairy Res., 27,
283,
Garvie E. I. 1967а,— J. Gen. Microbi-
ol., 48. 431.
Garvie E. I. 1967b.— J. Gen. Microbi-
ol., 48. 439.
Garvie E. I. 1967c.— J. Dairy Ros., 34,
31.
Garvie E. I. 1969.— J. Gen. Microbiol.,
58, 85.
Garvie E. I., Gregory M. E., Mabbit
L. A. 1961,— J. Gen. Microbiol., 24,
25.
Gasser F. 1962,— Ann. L’lnstitute Pas-
teur, 102, 239.
Gasser F. 1970,— J. Gen. Microbiol.,
62, 223.
Gasser F., Mandel M. 1968.— J. Bac-
teriol., 96, 580.
Gasser F., Mandel M., Rogosa M.
1970.— J. Gen. Microbiol., 62, 219.
Gasser F., Sebald M. 1966.— Ann. Inst.
Pasteur, 110, 261.
Gemmell M., Hodgkiss W. 1964.— J.
Gen. Microbiol., 35, 519.
Gest H.t Lampen J. O. 1952.— J. Biol.
Chem., 194, 555.
Giammanco G., Natoli D., Laura S.,
Lazzara A. 1972.— Ig. mod., 65, 173.
Gibbs M., Dumrose R., Bennett F. A.,
Bubeck M. R. 1950.— J. Biol. Chem.,
184, 545.
Gibbs M., Sokatch J. T., Gunsalus I.C.
1955.— J. Bacteriol., 70, 572.
Gibson T. 1965.— J. Appl. Bacteriol.,
28, 56.
Gibson T., Abd-el-Malek Y. 1945.— J.
Dairy Res., 14, 35.
Gibson T., Stirling A. C. 1959.— J. Na-
tional Agr. Adv. Serv., 10, N 44, 167.
Gibson T., Stirling A. C., Keddie
R. M., Rosenberger R. F. 1958.— J.
Gen. Microbiol., 19, 112.
Gibson T., Stirling A. C., Keddie
R. M., Rosenberger R. F. 1961.— J.
Appl. Bacteriol., 24, 1.
Glastonbury Knox K. W. 1963.—
J. Gen. Microbiol., 31, 73.
Goff R. C., Hartman R. E. 1970.— J.
Bacteriol., 104, 27.
Goldman M., Deibel R. H, Niven C. F.
1963,— J. Bacteriol., 85, 1017.
Gonzalez F. C., Scheffers W. A., Mos-
sel D. A. A. 1971.—Antonie Leeu-
wenhoek. J. Microbiol, and Serol.,
37, 262.
Gooder H. 1970.— Int. J. Syst. Bacte-
riol., 20, 475.
Goulden J. D. S., Sharpe M. E. 1958.—
J. Gen. Microbiol., 19, 76.
Gorbach S. L., Nahas L., Lerner P. I.,
Weinstein L. 1967a.— Gastroentero-
logy, 53, 845.
Gorbach S. L., Plant A. G., Nahas L.,
Weinstein L., Spanknebel G., Levi-
tan R. 1967b.—Gastroenterology, 53,
856'.
Graude H. 1957. Acta pathologica et
microbiologica Scandinavica, 41,
fasc. 5, 403.
373
Green E. G., Dodd M. C. 1956.— J. Ba-
cteriol., 72, 690.
Greenberg B. 1962.— J. Insect. Pathol.,
4, 216.
Gross F., Beck Th. 1972.— Wirtschaft-
seig. Futter, 18, 161.
Gross E., Morell J. C. 1967.— J. Amer.
Chem. Soc., 89, 2791.
Gross E., Morell J., Craig L. 1969.—
Biochemistry, 62, 952.
Guillot N. 1958.— Ann. Inst. Pasteur,
95/94.
Gunsalus I. C. 1947.— J. Bacteriol., 54,
239.
Gunsalus I. C. 1959. In «Proc. 4-th In-
ternal. Congr. Biochem». Vienna,
XIII.
Gunsalus I. C., Niven C. F. 1942.— J.
Biol., Chem., 145, 131.
Gunther H. L., White H. B. 1961a.—
J. Gen. Microbiol., 26, 185.
Gunther H. L., White H. B. 1961b.—
J. Gen. Microbiol., 26, 199.
Guttman H. N. 1963. In «Analytical
microbiology». F. Kavanagh.
(Ed.), N. Y.— London. Acad. Press.
Gyllenberg H., Carlberg G. 1958.—
Acta Path. Microbiol. Scand., 44,
287.
Gyllenberg H., Niemela S., Sormunen
T. 1960.— Appl. Microbiol., 8, 20.
Gybrgy P. 1953,—Pediatrics, 11, 98.
Haenel H. 1958.— Ernahrungsfor-
schung, 3, 493.
Haenel H. 1961.— J. Appl. Bacteriol.,
24, 242.
Haenel H., 1962. Wiss. L. Karl Marx
Univ. Leipzig. Math-naturwiss. Rei-
he, 11, 757.
Haenel H., Miiller-Beuthow W., Sche-
unert A. 1957a.— Zbl. Bakt., I. Abt.,
168, 37.
Haenel H., Miiller-Beuthow W., Sche-
unert A. 1957b.— Zbl. Bakt., I. Abt.,
169, 45.
Hahn G. 1972.— Arch. Lebensmittel-
hygiene, 11, 229.
Hahn G„ Heeschen W.. Tolle A.
1970.— Kiel, milchwirt. Forschungs-
ber., 22, 333.
Hansen P. 1965.— Ernahrungsfor-
schung, 10, 485.
Hansen P. A. 1968. Type strains of
Lactobacillus species. A report by
the taxonomic subcommittee on lac-
tobacilli and closely related orga-
nisms. American Type Culture Col-
lection. Rockville, Md.
Hansen P. A. 1971a.— Int. J. Syst.
Bacteriol., 21, 86.
Hansen P. A. 1971b.— Int. J. Syst.
Bacteriol., 21, 135.
Hansen P. A., Lessel E. F. 1971.—
Int. J. Syst. Bacteriol., 21, 69.
Hansen P. A., Mocquot G. 1970.— Int.
J. Syst. Bacteriol., 20, 325.
Harrison A. P., Jr., Hansen P. A.'
1950a.— J. Bacteriol., 59, 444.
Harrison A. P., Hansen P. A. 1950b.—
J. Bacteriol., 60, 543.
Harrison A. P., Hansen P. A. 1950c.—
J. Bacteriol., 50, 197.
Harrison B. W., Opal Z. Z. 1944.— J.
dent. Res., 23, 1.
Harrison B. W., Zidek Z. C., Hemmens
E. S. 1939,—J. Infect. Dis., 65, 255.
Hartleb W. 1969.— Fleischwirtschaft,
49, 1184.
Hartman В. E. 1970.— J. Bacteriol.,
102, 341.
Hartman P. A., Beinbold G. W., Sa-
ras wat D. S. 1965.— J. Milk and Fo-
od TechnoL. 28. 344.
Hassinen J. B.. Durbin G. T., Toma-
rello В. M., Bernhart F. W. 1951.—
J. Bacteriol., 62, 771.
Hays G. L., Heister D. W. 1952.— Fo-
od Tech. Champaign, 6, 386.
Hayward A. C. 1957.— J. Gen. Micro-
biol., 16, 9.
Hayward A. C., Hale С. M. F., Bisset
K. A. 1955 —J. Gen. Microbiol., 13,
292.
Hawley H. B„ Shepherd P. A., Whea-
ter D. M. 1959.— J. Appl. Bacteriol.,
22, 360.
Heinz L., Klaushofer H. 1952. Mittei-
lungen d. Vers.— Anst. f. d. Ga-
rungsgewerbe in Wien, N. 9/10, 1.
Helleberg A. 1954.— Lantmann, 38,
17.
Henneberg W. 1909. Garun gsbakterio-
logisches Praktikum, Betriebsunter-
suchungen und Pilzkunde. Berlin.
Paul Parey.
Henneberg W. 1926. Handbuch der
Garungsbakteriologie, 2 Auflage, 1
Band. Berlin.
Herrmann C. 1966. In «European Bre-
wery convention, Proceedings of
the congress». Stockholm, 1965. El-
sevier Publishing Company. Am-
sterdam — London — New York.
Hess E. 1972.— Arch. LebensmitteL
hyg., 23, 242.
Higgtnbottom C.. Wheater D. W. F.
1954,— ,T. Agr. Sci., 44. 434.
Higgins M. L., Pooley H. M., Shock-
man G. D. 1971.— J. Bacteriol., 105,
1175.
374
Higgins M. L., Shockman G. D. 1970.—
J. Bacteriol., 103, 244.
Hill D. A., Thornton H. R. 1958,—
Canad. J. Microbiol., 4, 215.
Hirsch A. 1952.— J. Dairy Res., 19,
290.
Hirst E. L., Ramstad S. 1957.— J.
Sci. Fd. Agric., 8, 727.
Hirsch A., Wheater D. M. 1951.— J.
Dairy Res., 18, 193.
Hofmann K., Lucas R. A., Sax S. M.
1952,—J. Biol. Chem., 195, 473.
Hofmann K., Sax S. M. 1953.— J. Bi-
ol. .Chem., 205, 55.
Holden J. T., Snell E. E. 1949.—J.
Biol. Chem., 178, 799.
Holden J. T., Furman C., Snell E. E.
1949,—J. Biol. Chem., 178, 789.
Holliger W. 1902.— Zbl. Bakt., II. Abt.,
9, 305; 361; 395; 473; 521.
Holzapfel W., Kandler O. 1969.— Zbl.
Bakt., II. Abt., 123, 657.
Holzapfel W., Scardovi V., Kandler O.
1969,— Z. Naturforsch., 24, 1524.
Hoyle M., Nichols A. A. 1947.— J. Dai-
ry Res., 15, 398.
Hucker G. J., Pederson C. S. 1930.—
New York State Agr. Exptl. Sta.,
Tech. Bull., N 167, 80.
Hucker G. J., Pederson C. S. 1931.—
Zbl. Bakt., II. Abt., 85, 65.
Huhtanen C. N., Rogers M. R., Gall
L. S. 1952,—J. Bacteriol., 64, 17.
Hungate R. E. 1957.— Canad. J. Micro-
biol., 3, 289.
Hungate R. E., Dougnerty R. W.,
Bryant M. P., Cello R. M. 1952.—
Cornell. Vet., 42, 423.
Hunter C. A. 1921.— J. Agr. Res., 21,
767.
Hurst A. 1966.— J. Gen. Microbiol., 45,
503.
Hurst A. 1967.— Nature, 214, 1232.
Hurst A., Dring G. 1968.— J. Gen.
Microbiol., 50, 383.
Hurst A., Lasarus W. 1968.— Nature,
219, N 5152, 404.
Hurst A., Stubbs J. M. 1969.— J. Bac-
teriol., 97, 1466.
Hurwitz J. 1958,— Biochim. et bio-
phys. acta, 28, 599.
Husain I., Poupard J. A., Norris R. F.
1972.—J. Bacteriol., Ill, 841.
Huttig C. 1927.— Landwirtsch. Jahr-
buch der Schweiz., Bd. 65.
Huxley H. G. 1972.— Arch. Oral. Biol.,
17, 1481.
Hylmar B., Vokounova L. 1964.—
Listy cukrovaru, 80, 88.
Ikawa M., Snell E. E. I960,—J. Biol.
Chem., 235, 1376.
International Committee on Nomen-
clature of Bacteria. Subcommittee
on lactobacilli and closely related
organisms, 1971. Min. 9, 10, Int.
J. Syst. Bacteriol., 21, 210.
Jarvis B. 1967. Abstr. 4-th meeting
FEBS. Oslo.
Jarvis B., Morlsetti M. D. 1969,— In-
ternal. Biodeteriorat. Bull., 5, 39.
Jenistea C., Pleceas P. 1967a.— Arch,
roumain pathol. exptl. et microbiol.,
26, 171.
Jenistea C., Pleceas P. 1967b.— Food
Manufacture, 42, 55.
Jensen R. C., Edmondson J. E. 1957.—
J. Dairy Sci., 40, 180.
Jensen E. M., Seeley H. W. 1954.—
J. Bacteriol., 67, 484.
Jensen R. G., Smith K. L., Edmondson
J. E., Merilan С. P. 1956.— J. Bacte-
riol., 72, 253.
Jessen W., Schwerdt K. 1951.— Land-
wirtsch. Forschung, 2, 2.
Johannsen E. 1972.— J. Appl. Bacteri-
ol., 35, 423.
Johns A. T. 1952.— J. Gen. Microbiol.,
6, 123.
Johnson E. C., Gilliland S. F., Speck
M. L. 1971.— Appl. Microbiol., 21,
316.
Johnson M. K., McCleskey C. S. 1958.—
J. Bacteriol., 75, 98.
Johnston M. A., Delwiche E. A. 1962.—
J. Bacteriol., 83, 936.
Johnston M. A., Delwiche E. A.
1965.— J. Bacteriol., 90, 347.
Jones D., Shattock P. M. F. 1960.— J.
Gen. Microbiol., 23, 335.
Jones D., Sackin M. J., Sneath P.H.A.
1972,—J. Gen. Microbiol., 72, 439.
Jones A. S., Walker R. T. 1968.—
Arch. Biochem. and Biophys., 128,
579.
Joshi N. V., Ram Ayyar C. S. 1936.—
Ind. J. Vet. Sci. and Animal Husb.,
6, 141.
Juven B., Zdenka S., Henis Y., Jaco-
by B. 1968,—J. Appl. Bacteriol., 31,
200.
Kaken. К. К. K. 1970.— Microbiol.
Abstr., Ser. A, 5, A 8279.
Kalmanson G. M., Hubert E. G., Gu-
ze L. B. 1970.— J. Infect. Dis., 121,
311.
Kandler O. 1970,— Int. J. Syst. Bacte-
riol., 20, 491.
Kandler O., Abo-Elnaga I. G. 1966a.—
Zbl. Bakt., II. Abt., 120, 753.
375
Kandler 0., Abo-Elnaga I. G. 1966b.
Zbl. Bakt., II. Abt., 120, 755.
Kandler 0., Koch D., Schleifer К. H.
1968a.— Arch. Mikrobiol., 61, 181.
Kandler 0., Plapp R., Holzapfel W.
1967.— Biochim. et biophys. acta,
147, 252.
Kandler 0., Schleifer К. H., Dandl R.
1968b.— J. Bacteriol., 96, 1935.
Kavanagh F. 1963a.— In «Analytical
Microbiology». F. Kavanagh.
(Edi) New York — London. Acad.
Press.
Kavanagh F. 1963b. In «Analytical
microbiology». F. Kavanagh.
(Ed.) New York — London. Acad.
Press.
Kazanas N. 1966.— Appl. Microbiol.,
14, 957.
Kazanas N. 1968.— Appl. Microbiol.,
16, 128.
Keddie R. M. 1951.— Proc. Soc. Appl.
Bacteriol., 14, 157.
Keddie R. M. 1959.— J. Appl. Bacteri-
ol., 22, 403.
Kempton A. G., San Clemente C. L.
1959,— Appl. Microbiol., 7, 362.
Kingsley V. V. 1972,— J. Invertebr.
Pathol., 20, 51.
Kiser J., Beckwith T. 1944.— Food.
Bes., 9, 250.
Kitahara K., Lai C. 1967.— J. Gen. and
Appl. Microbiol., 13, 197.
Kitahara K., Suzuki J. 1963.—J. Gen.
Appl. Microbiol., 9, 59.
Kitay E., McNutt W. S., Snell E. E.
1950,—J. Bacteriol., 59, 727.
Kludas M. 1959.— Zbl. Bakt., I. Orig.,
B. 174.
Kluge R. 1963.— Zeitschrift fiir Bie-
nenforschung, 6, 143.
Kluyver A. I., Danker H. J. L. 1925.—
Proc. Roy. Acad. Amsterdam, 28,
605.
Kneteman A. 1952.— Antonie Leeu-
wenhoek. J. Microbiol, and SeroL,
18, 275.
Knox K. W., Hewett M. J., Wicken
A. J. 1970,—J. Gen. Microbiol., 60
303.
Knox K. W., Wicken A. J. 1970,—
J. Gen. Microbiol., 63, 237.
Knox K. W., Wicken A. J. 1972.— In-
fect. and Immun., 6, 43.
Kodama R. 1953.— Dairy Sci. Abstr.,
15, 51.
Kojima M., Suda S., Hotta S., Hama-
da K. 1968.—J. Bacteriol., 95, 710.
Kornchild H., Olsen R. H. 1971. Pro-
cess of making sausage (Dairy
Technicks Inc.). Пат. США. кл.
99—109, (A 22 с 11/00), № 3561977,
заявл. 6.03.67. Цит. по РЖБ
11Б1071, 1971.
Koser S. R., Thomas J. D. 1955.— J.
Infect. Dis., 97, N 3.
Koser S. A., Hodges E., Tribby I.,
Stuedell J. T. I960,—J. Infect. Dis.,
106, 60.
Kraus H. 1961 —Arch. Lebensmittel-
hyg., 12, 101.
Krerk H. C. de, Coetzee J. N. 1961.—
Nature, 198, N 4800, 340.
Krerk H. C. de, Smit J. A. 1967.—
J. Gen. Microbiol., 48, 309.
Krishnaswamy M. A., Babel F. J.
1951,—J. Dairy Res., 34, 375.
Krogh N. 1959.— Acta Vet. Scand., 1,
74.
Krogh N. 1960.— Acta Vet. Scand., 1,
383
Krogh N. 1961a.— Acta Vet. Scand., 2,
103.
Krogh N. 1961b.— Acta Vet. Scand., 2,
357.
Krogh N. 1963.—Acta Vet. Scand., 4,
27.
Kroulik J. T. 1953.— J. Dairy Sci., 36,
602.
Kroulik J. T., Burkey L. A., Wiseman
H. G. 1955a.—J. Dairy Sci., 38, 256.
Kroulik J. T., Burkey L. A., Gordon
С. H., Wiseman H. G., Melin C. G.
1955b.— J. Dairy. Sci., 38, 263.
Kroulik A., Flam F. 1959.— Zivocisna
vyroba, R. 4 (XXXII), с. 1, 57.
Kundrat W. 1958 —Zbl. Bakt., II.
Abt., Ill, 249.
Lake D. E., Deibel R. H., Niven C. F.
1957.— Bacteriol. Proc., 57-th. Gen.
Meeting, 13.
Lancefield R. C. 1933.— J. Exptl. Med.,
57, 571.
Lanigan C. W. 1963.— Austr. J. Biol.
Sci., 16, 606.
Lanigan C. W. 1965.— Austr. J. Biol.
Sci., 18, 555.
Langston C. W., Bouma С. 1960a.—
Appl. Microbiol., 8, 212.
Langston C. W., Bouma C. 1960b.—
J. Dairy Sci., 43, 1575.
Langston C. W., Bouma C., Conner
R. M. 1962 —J. Dairy Sci., 45, 618.
Langston C. W., Gutierrez L, Bou-
ma C. 1960a.— J. Bacteriol., 80, 693.
Langston C. W., Gutierrez J., Bouma
C. 1960b.— J. Bacteriol., 80, 714.
Langston C. W., Irvin H., Gordon
С. H., Bouma C., Wiseman H. G.,
376
Melin C. G., Moore L. A., McCal-
mont J. R. 1958 —U. S. Dept. Agr.
Tech. Bull, 1187, 73.
Laxminarayana H., Nambudripad
V. K. N., Lakshminarasim V., Anan-
taramian S. N., Sreenivasamurthy
V., lya К. K. 1952 — Ind. J. Vet. Sci.
and Animal Hush, 22, 27.
Lee Wie-Shing. 1972,— Appl. Microbi-
ol, 24, 1.
Lerche M. 1956.— Fleischwirtschaft,
12, 752.
Lerche M. I960.— Berl. Munch, tie-
rarztl. Wschr, 73, 12.
Lerche M.t Reuter G. 1960.— Zbl.
Bakt, I. Orig, 179, 354.
Lerche M., Reuter G. 1961.— Zbl.
Bakt, I. Orig, 182, 324.
Lerche M., Reuter G. 1962.— Zbl.
Bakt, I. Abt, Orig, 185, 446.
Lessel E. F., Rogosa M. 1971.— Int.
J. Syst. Bacteriol, 21, 238.
Levetzow R. 1972.— Arch. Lebensmit-
telhyg, 23, 240.
Ley J. de. 1962. In «Microbial classi-
fication», 12-th Sympos. Soc. Gen.
Microbiology, Cambridge, p. 184.
Lickfeld K. G. 1967.—Zbl. Bakt, II.
Abt, 121, 479.
Loehnis F. 1910. Handbuch der land-
wirtschaftlichen Bakteriologie. Verl.
Gebr. Borntrager, Berlin.
Loehnis F. 1926. Vorlesungen fiber
landwirtschaftliche Bakteriologie.
II. Anfl. (Gebr. Borntrager), Berlin.
Lysenko 0. 1958.— J. Gen. Microbiol,
18, 774.
Lysenko O. 1959.— Entomophaga, 4,
Lysenko 0. 1963.— J. Insect. Pathol,
5, 78.
Lund D. 1967.— J. Gen. Microbiol, 49,
67.
Mabbit L. A., Zielinska M. 1956.— J.
Appl. Bacteriol, 19, 95.
MacLeod R. A., Snell E. E. 1950.—
J. Bacteriol, 59, 783.
MacPherson M. J. 1953.— J. Path. Bac-
teriol, 66, 95.
MacPherson H. T., Wylam C. B.,
Ramstad S. 1957.— J. Sci. Fd. Ag-
ric, 8, 732.
Man J. C. de. 1956.— Ned. Melk
Zuiveltijdschr, 10, 190.
Man J. C. de. 1957.— Antonie Leeu-
wenhoek. J. Microbiol, and Serol,
23, 81.
Man J. C. de, Rogosa M., Sharpe M. E.
I960,— J. Appl. Bacteriol, 23, 130.
Manderson G. J., Doelie H. W. 1972.—
Antonie Leeuwenhoek. J. Microbiol,
and Serol, 38, 223.
Mann S. O., Oxford A. E. 1954.—
J. Gen. Microbiol, 11, 83.
Mann S. O., Oxford A. E. 1955.— J.
Gen. Microbiol, 12, 140.
Mann S. O., Masson F. M. M., Oxford
A. E. 1954a.— J. Gen. Microbiol,
10, 142.
Mann S. O., Masson F. M., Oxford
A. E. 1954b.-Brit. J. Nutr, 8, 246.
Marmur J., Doty P. 1962.— J. Mol. Bi-
ol, 5, 109.
Marschall F. von. 1938.— Zbl. Bakt,
I. Orig, 141, 153.
Martin J. D., Mundt J. O. 1972,— Appl.
Microbiol, 24, 575.
Masek J. 1959,— Prumysl. potravin,
10, 490.
Mata L. Carrillo C., Villatoro E.
1969.— Appl. Microbiol, 17, 596.
Matsumoto H., Baba E., Ishikawa H.
1972. Цит. по РЖБ ЗБ1140, 1973.
Matteuzzi D., Croclani F., Zani G.,
Trovatelli L. D. 1971.— Z. allg.
Mikrobiol, 11, 387.
Mattick A. T. R., Berridge N. L, Che-
eseman G. C., Mabbit L. A. 1957.—
J. Gen. Microbiol, 17, 111.
Mattick A. T. R., Cheeseman G. C.,
Berridge N. I., Bottazzi V. 1956.—
J. Appl. Bacteriol, 19, 310.
Mattick A., Hirsch A. 1944.— Nature,
N 3919, 557.
Mattick A., Hirsch A. 1947.— Lancet,
5, 253.
Matuszewski T., Plfanowski E., Su-
pinska J. 1936.— Polonisch. Ref. in
Chem, Ztb, 11, 201.
Mayer J. B. 1960. Цит. по РЖБ
16Б275, 1961.
Mayeux P. A., Colmer A. R. 1960.—
Sugar J, 23, 28.
Mayeux I. V., Colmer A. R. 1961.—
J. Bacteriol, 81, 1000.
Mayeux J. V., Sandine W. E., Elliker
P. R. 1962.— J. Dairy Sci, 45, 655.
McDonald I. J. 1971.—J. Gen. Micro-
biol, 17, 897.
McDonald P., Stirling A. C., Hender-
son A. R., Whittenbury R. 1965.—
J. Sci. Food and Agric, 16, 549.
McDonald P., Stirling A. C., Hender-
son A. R., Whittenbury R. 1965.—
J. Sci. Food and Agric, 16, 549.
McDonald P., Stirling A. C., Hender-
son W. A., Dewar W. A., Stark
G. H., Davie W. G., MacPherson
H. T., Reid A. M., Slater J. I960,—
377
The Edinburg School of Agric.
Tech. Bull., 24, 2.
McDonough F. E., Hargrove R. E.,
Tittsler R. P. 1963.— J. Dairy Sci.,
46, 386.
McKay L. L., Baldwin K. A., Zottola
E. A. 1972.— Appl. Microbiol., 23,
1090.
Mees R. H. 1934. Onderzoekingen over
de Biersarcina. Thesis, Delft.
Medrek T. F., Barnes E. M. 1962.—
J. Appl. Bacteriol., 25, 169.
Mettler L., Romeyke A., Brieler G.
1973.— Strahlentherapie, 145, 588.
Meyer V. 1961.— Arch. Lebensmittel-
hyg., 12, 19.
Meyer V. 1962.— Zbl. Bakt., I. Orig.,
184, 296.
Micks D. W., Ferguson M. J. 1963.—
J. Insect. Pathol., 5, 483.
Mikolajcik E. M. 1964.— J. Dary Sci.,
47, 437.
Miller G. L., Finegold S. M. 1967.—
J. Bacteriol., 93, 125.
Miller A., Sandine W. E., Elliker P.R.
1970,— J. Bacteriol., 102, 278.
Miller A., Sandine W. E., Elliker P. R.
1971.— J. Bacteriol., 108, 604.
Miura T., Kano J., Motoyoshi S., Ja-
mazaki K. 1965.— Japan J. zootechn.
Sci., 36, 308.
Mobley R. L. 1937 —Zbl. Bakt., II.
Abt., 96, 329.
Mocquot G., Raibaud P. 1971.— Int. J.
Syst. Bacteriol., 21, 210.
Morichi T., Sharpe M. E., Reiter B.
1968.— J. Gen. Microbiol., 53, 405.
Morishita T., Yura T. 1969.— Ann.
Rept. Inst. Virus Res. Kyoto Univ.,
12. Kyoto, 130.
Morishita T., Mitsuoka T., Kaneuchi
C., Yamamoto S., Ogata M. 1971.—
Jap. J. Microbiol., 15, 531.
Moro E. 1900.— Jahrb. f. Kinderheil.,
52.
Morris W., Weaver R. H. 1954.— Appl.
Microbiol., 2, 282.
Mota J., Silva M. T., Guerra F. C.
1972.— Arch. Microbiol., 83, 293.
Moustardier G., Rosnay D. de, Pas-
quter P. du, Latrille J. 1960.— Ann.
L’institut Pasteur, 99, 444.
Miilhens K., Stamer H. 1969.— Mil-
chwissenschaft, 1, 25.
Muller G. 1968,— Lebensmittel-Ind.,
15, 21.
Muller H., Pech H. 1967.— Arch. Gy-
nakol., 205, 39.
Muller-Thurgau H., Osterwalder A.
1913a. Die Bakterien im Wein und
Obstwein und die dadurch verur-
sachten veranderungen, G. Fischer,
Jena.
Muller-Thurgau H., Osterwalder A.
1913b.- Zbl. Bakt., II. Abt, 36,129.
Miiller-Thurgau H., Osterwalder A.
1918,— Zbl. Bakt, II. Abt, 48, 1.
Mundt J. O. 1961.— Apll. Microbiol,
9, 541.
Mundt J. O., Coggin J. H., Johnson
L. F. 1962.— Appl. Microbiol, 10,
552.
Mundt J. O., Johnson A. H. 1959.— Fo-
od Res, 24, 218.
Mundt J. O., Johnson A. H., Khatchi-
kian R. 1958,—Food Res, 23, 186.
Mundt J. O., Graham W. F. 1968,—
J. Bacteriol, 95, 2005.
Mundt J. O., Graham W. F., Wieland
F. R. 1969 —J. Bacteriol, 98, 938.
Murdock J. C., Holdsworth M. C., Wo-
od M. 1956.— J. British. Grassland,
2, 16.
Naik V. R., Nadkarni G. B. 1968.—
Arch. Biochem. and Biophys, 123,
431.
Nakagawa A., Kitahara K. 1959.— J.
Gen. Appl. Microbiol, 5, 95.
Nakamura L. K., Hartman P. A.
1961,—J. Bacteriol, 81, 519.
Nakayama O., Yanoshi M. 1967,—J.
Gen. Appl. Microbiol, 13, 155.
Naylor J., Sharpe M. E. 1958a.— J.
Dairy Res, 25, 92.
Naylor J., Sharpe M. E. 1958b.— J.
Dairy Res, 25, 421.
Neri A. 1962. Цит. по РЖБ 7B206,
1962.
Niinivaara F. P., Pohja M. S. 1957.—
Fleischwirtschaft, 9, 789.
Nikodemusz I., Javor T., Lazar J.
1955. Цит. по РЖБ, № 17, 54,
№ 43506.
Nilsson P. E. 1956.— Arch. Mikrobiol,
24, 396.
Nilsson G., Nilsson P. E. 1956.— Arch.
Mikrobiol, 24, 412.
Nilsson R., Nilsson G. 1958.— Arch.
Mikrobiol, 31, 191.
Nilsson R., Toth L., Ry din C. 1956.—
Arch. Mikrobiol, 23, 366.
Niven C. F. 1944.— J. Bacteriol, 47,
343.
Niven C. F. 1953.— Food Manufactu-
re, 28, 401.
Niven C. F., Castellani A. C., Allan-
son V. 1949.— J. Bacteriol, 58, 633.
Niven C. F., Sherman J. M. 1944.— J.
Bacteriol, 47, 335.
378
Niven C. F., Smiley К. L., Sherman
J. M. 1942 —J. Bacteriol., 43, 651.
Nonomura H., Yamazaki T., Ohara Y.
1965.— Mitt. Klosterneuburg, 15A,
242.
Norris R. F., Flanders T., Tomarelli
R. M., Gybrgy P. 1950.— J. Bacteri-
ol, 60, 681.
Nowlan S. S., Deibel R. H. 1967.— J.
Bacteriol, 94, 291.
Nurmikko V. 1957 —Appl. Microbiol,
5, 160.
Nurmikko V. 1959. In «Proc. 4th In-
ternal. Congr. «Biochem»», Vienna,
XIII.
Ochi J., Mitsuoka T., Sega T., Ikega-
mi T., Miura T. 1965a.— Jap. J. zo-
otechn. Sci, 36, 8.
Ochi J., Mitsuoka T., Sega T., Ikega-
mi T., Miura T. 1965b.— Jap. J. zo-
otechn. Sci, 36, 353.
Ohmiya K., Sato У. 1972.— Milchwis-
senschaft, 27, 417.
Olsen E. 1951.— J. Gen. Microbiol, 5,
817.
Orillo C. A., Pederson C. S. 1968.—
Appl. Microbiol, 16, 1669.
Orth A. 1954.—Landschaftliche For-
schung, 6, N 2.
Orth A., Kaufmann W., Koch P.
I960,— Futterkonservierung, 1, 1.
Orla-J ensen S. 1919. The lactic acid
bacteria. Copenhagen, Andr. Fred.
Host and Son.
Orla-Jensen S. 1921.— J. Bacteriol,
6, 263.
Orla-Jensen S. 1924.— Lait, 4, 468.
Orla-Jensen S. 1942. The lactic acid
bacteria. 2-d ed, Kobenhavn, I Ko-
mission hos Ejnar Munksgaard.
Orla-Jensen S., Otte N., Snogkfaer A.
1936a. The vitamin and nitrogen
requirements of the lactic acid ba-
cteria. Kobenhavn, Skrifter det. Kgl.
Danske Videnskab. Selskab, Natur-
vidensk og Math, Afd. 9, Rockke 6.
Orla-Jensen S., Orla-Jensen A. D.,
Winter 0. 1936b.—Zbl. Bakt, II.
Abt, 93, 321.
Orland F. J. 1950.— J. Infect. Dis,
86, 63.
Ottogalli G., Galli A. 1967.— Ann.
microbiol. ed enzimol, 17, 135.
Oxford A. E. 1944.— Biochem. J, 38,
178.
Oxford A. E. 1958.— N. Z. Science,
16, 38.
Papavassiliou J. 1962.— Appl. Micro-
biol, 10, 65.
Park H. S„ Marth E. H. 1972a.—J.
Milk and Food Technol, 35, 482.
Park H. S„ Marth E. H. 1972b.—J.
Milk and Food Technol, 35, 489.
Pasteur L. 1876. Etudes sur la biere.
Oeuvres de Pasteur, v. 5. M a s s о n
etCie (Ed.), Paris.
Pederson C. S. 1936.— J. Bacteriol, 31,
217.
Pederson C. S. 1938.— J. Bacteriol,
35, 95.
Pederson C. S. 1949,— Bacteriol. Revs,
13 225.
Pederson C. S., Albury M. N. 1950.
New York State Agric. Exptl Sta.
Tech. Bull, N 744, 31.
Pederson C. S., Albury M. N. 1953.—
Food Res, 18, 290.
Pederson C. S., Albury M. N. 1954.—
Food Technol, 8, 1.
Pederson C. S., Albury M. N. 1955.—
J. Bacteriol, 70, 702.
Pederson C. S., Albury M. N. 1956.—
Appl. Microbiol, 4, 259.
Pederson C. S., Albury M. N. 1961.—
Food Technol, 15, 351.
Pederson C. S., Albury M. N., Breed
R. S. 1954,— Wallerstein Labs. Com-
mune, 17, 7.
Pederson C. S., Ward L. 1949.— New
York State Agric. Exptl Sta. Tech.
Bull, N 288, 29.
Pelshenke P., Weimershaus E.,
Svenson J. 1939.— Vorratspflege und
Lebensmittelforschung, II, 591.
Perry K. D., Briggs.С. A. E. 1957 —J.
Appl. Bacteriol, 20, 119.
Perry K. D., Sharpe M. E. 1960.— J.
Dairy Res, 27, 267.
Perry K. D., Wilson M. K., Newland
L. G. M., Briggs С. A. E. 1955,—J.
Appl. Bacteriol, 18, 436.
Pette J. W. 1947.— Intern. Congr. Mic-
rob. Copenhagen, p. 505.
Pette J. W., van Beynum J. 1943.—•
Versl. Landbouw. K. Ondverz, 49,
313.
Petuely F., Lynau V. 1954.— Bio-
chem. J, 362, 62.
Plapp R„ Kandler О. 1967a.—Z. Na-
turforsch, 22, 1062.
Plapp R., Kandler O. 1967b.— Arch.
Mikrobiol.. 58, 305.
Platt T. B„ Foster E. M. 1958.—J. Ba-
cteriol, 75, 453.
Plotho O. von. 1947.— Zbl. Bakt, I.
Abt, Orig, 90, 152.
Post F. J., Foster F. J., Jr. 1965.— J.
Invertebr. Pathol, 7, 22.
379
Prevot A. R. 1961. Traite de syste-
matique bacterienne, Dounod,
Paris.
Priebe K. 1962.— Arch. Lebensmittel-
hyg, 13, 278.
Puranen A., Nurmikko V. 1962.—
Ann. Acad. Scient. fenn., ser. A., II.
Chemica, 115.
Radler F., Gerwarth B. 1971,—Arch.
Mikrobiol, 76, 299.
Radvan R. 1960.— Folia Microbiol., 5,
85. /
Rahm'anian M., Waller G. R., Smith
W. G. 1971 —J. Biol. Chem, 246,
823.
Raines R. C., Haskell В. E. 1968.—
Analyt. Biochem, 23, 413.
Raj H., Colwell R. R. 1966,—Canad
J. Microbiol, 12, 353.
Ramadan F. M., El-Hawaary S., Abd-
el-Malek Y. 1972,— Zbl. Bakt, II.
Abt, 127, 509.
Rapp M. 1969.— Milchwissenschaft,
24, 208.
Rasovic B., Miskovic K. 1970.— Sav-
remena poljopr, 18, 251.
Reddish G. F. 1954. Antiseptics, desin-
fectans, fungicides and chemical
and physical sterilisation. Phila-
delphia.
Reddy M. S., Vedamuthu E. R., Rein-
bold G. W. 1971.— J. Milk and Food
Technol, 34, 43.
Reddy M. S., Vedamuthu E. R., Wa-
sham C. Reinbold G. W. 1969.—
Appl. Microbiol, 18, 755.
Reed, G. B., Spence С. M. 1929.—
Contr. Canad. Biol, 4, 259.
Reiter B., Meller-Madsen A. 1963.— J.
Dairy Res, 30, 419.
Reiter B., Oram J. D. 1961.— J. Dairy
Res, 28, 175.
Reiter B., Oram J. D. 1968.— J. Dairy
Res, 35, 67.
Reiter B., Sharpe M. E. 1971.— J. Appl.
Bacteriol, 34, 63.
Reuter G. 1963.— Zbl. Bakt, I. Orig,
191, 486.
Reuter G. 1967a.— Food Manufacture,
42, 55.
Reuter G. 1967b.— Fleischwirtschaft,
47, 397.
Reuter G. 1969.— Arzneimittel-Forsch,
19, 103.
Reuter G. 1971.— Int. J. Syst. Bacte-
riol, 21, 273.
Reuter G. 1972.— Fleischwirtschfat, 52,
465.
Reuter G., Langner H. J., Sinell H. J.
1968.— Fleischwirtschaft, 48, 170.
Rtberean-Gayon J. 1956.— Vigne et
vins, XI—XII, N 29.
Richard O. 1946.— Landwirtschaftliche
Monatshefte, H. 7.
Riddle J. M., Kabler P. W., Kenner
B. A., Bordner R. H., Rockwood
S. W. Stevenson H. Л R. 1956.— J
Bacteriol, 72, 593.
Ritter P. 1951.— Schweiz. Z. allgem.
Pathol, und Bacteriol, 14, 599.
Rodgers L. A. 1928.— J. Bacteriol, 16,
321.
Rogosa M. 1961.— J. Gen. Microbiol,
24, 401.
Rogosa M. 1970.— Int. J. Syst. Bacte-
riol, 20, 519.
Rogosa M., Franklin J. G., Perry K. D.
1961.— J. Gen. Microbiol, 25, 473.
Rogosa M., Hansen P. A. 1971,— Int.
J. Syst. Bacteriol, 21, 177.
Rogosa M., Mitchell J. A. 1950.— J.
Bacteriol, 59, 303.
Rogosa M., Mitchell J. A., Wiseman
R. F. 1951,—J. Bacteriol, 62, 132.
Rogosa M., Sharpe M. E. 1959.— J.
Appl. Bacteriol, 22, 329.
Rogosa M., Tittsler R. P., Geib D. S.
1947.— J. Bacteriol, 54, 13.
Rogosa M.. Wiseman R. F., Mitchell
J. A., Disraely M. N., Beaman A. J.
1953.— J. Bacteriol, 65, 681.
Rohrlich M., Stegemann J. 1958.—
Brot und Geback, 12, 41.
Rojahn J., Harnish W., Wagner J.
1963,— Zbl. Bakt, II. Abt, 116, 612.
Rojahn J., Wagner J., Harnish W.
1964,-Zbl. Bakt, II. Abt, 118,
148.
Roseburg T. 1962. Microorganisms in-
digenous to man. McGraw-Hill, New
York.
Rosenberger R. F. 1956.— J. Appl. Ba-
cteriol, 19, 173.
Rosenberger R. F. 1959.— J. Bacteriol,
77, 517.
Ross G. J. S. 1969.—Appl. Statistics,
18, 103.
Ruschmann E. 1958.— Z. Hyg. und
Infektionskrankh, 144, 298.
Ruschmann G. 1941.— Deutsche Land-
schaftliche Presse, 37, 317.
Ruschmann G., Harder L. 1931. Zbl.
Bakt, II. Abt, 83, 325.
Ruschmann G., Koch R. 1930a.— Zbl.
Bakt, II. Abt, 80, 1.
Ruschmann G., Koch R. 1930b.— Zbl.
Bakt, II. Abt, 81, 11.
380
Rush I., Bica V. 1963.— Stat. Centr
de Cercet. Pentru Sericic. si apicul-
tura, IV.
Rydin C. 1957 — Arch. Mikrobiol., 27,
82
Rydin C.. Nilsson R., Toth L. 1956.—
Arch. Mikrobiol., 3, 376.
Saito T., Kuniyoshi I. 1970.— J. Vita-
minol., 16, 70.
Sakaguchi K. 1958,— Bull, agric. Chem.
Soc. Japan, 22, 353.
Sandine W. E., Elliker P. R., Hays H.
1962. Canad. J. Microbiol., 8, 161.
Sandine W. E., Muralidhara K. S., El-
liker P. R., England D. C. 1973.— J.
Milk and Food Technol., 35, 691.
Sandine W. E., Radich P. C., Elliker
P. R. 1972.— J. Milk and Food Tech-
nol., 35, 176.
Sandine W. E.. Seitz E. W., Elliker
P. R., Day E. A. 1961,—J. Dairy
Sci., 44, 1158.
Saraswat D. S., Clark W. S. Jr., Rein-
bold G. W. 1963,—J. Milk and Fo-
od Technol., 26, 114.
Sasaki T. 1972.—J. Bacteriol., 109,
169.'
Savage D. C. 1969.— J. Bacteriol., 98,
1278.
Scardovi V., Trovatelli L. D. 1969.—
Zbl. Bakt., II. Abt., 123, 64.
Scardovi V., Trovatelli L. D., Crociani
F., Sgorbati B. 1969,— Arch. Mikro-
biol., 68, 278.
Scardovi V., Trovatelli L. D., Zani G.,
Crociani F., Matteuzzi D. 1971.—
Int. J. Syst. Bacteriol., 21, 276.
Scardovi V., Zani G., Trovatelli L. D.
1970,—Arch. Mikrobiol., 72, 318.
Schaedler R. W., Dubos R. J. 1962.— J.
Exptl Med., 115, 1149.
Schildkraut C. L., Marmur J., Doty P.
1962,—J. Mol. Biol., 4, 430.
Schinzel A., Lingnau У. 1955.— Arch.
Hyg. und Bakteriol., 139, N 4.
Scholes P. M. I960 — Analyst, 85, 883.
Schormiiller J., Schilling M. 1961.—
Nahrung, 5, 18.
Schleifer К. H., Kandler О. 1967a.-—
Arch. Mikrobiol., 57, 335.
Schleifer К. H., Kandler O. 1967b.—
Arch. MikroboiL, 57, 365.
Schotz F., Abo-Elnaga I. G., Kandler
O. 1965,— Z. Naturforsch., 20b,
790.
Schuler-Malyoth R., Ruppert A., Mul-
ler F. 1968.— Milchwissenschaft, 23,
554.
Schuler R„ Ruppert A.. Muller F.
1968,— Milchwissenschaft, 23, 356.
Schroder I. 1964. Uber die Isolierung,
Identifizierung und Differenzierung
von Laktobazillen (Laktobacterien)
von frischen Fischen, insbesondere
von Heringen, und ihr Verhalten
gegeniiber Konservierungsmitteln
(Sorbinsaure, Benzoesaure, PHB-
Ester und Ameisensaure) und ver-
schieden Temperatur. Hannover,
Inaugural. Dissertation.
Schulz A. 1941. Die Bakterienflora des
Vollkornschrotsauerteiges, Vorratsp-
flege und Lebensmittelforschung,
IV, 74.
Schulz A., Stephan H. 1958.— Brot und
Geback, 2, 22.
Seeley H. W., Dain J. A. 1960.— J.
Bacteriol., 79, 230.
Seyfried P. L. 1968.— Canad. J. Micro-
biol., 14, 313.
Sgorbati B., Zani G.., Trovatelli L. D.,
Scardovi V. 1970 (1971).— Ann. mi-
crobiol. ed enzimol., 20, N 1—3, 57.
Shahani К. M. 1958.— J. Dairy Sci.,
41, 706.
Sharpe M. E. 1948,— Proc. Soc. appl.
Bact., 19th Ann. Conf., 13.
Sharpe M. E. 1952.— J. Hyg. Camb.,
50, 210.
Sharpe M. E. 1955a.— J. Gen. Micro-
biol., 12, 107.
Sharpe M. E. 1955b.—J. Gen. Microbi-
ol., 13, 198.
Sharpe M. E. 1955c.— J. Appl. Bacte-
riol., 18, 274.
Sharpe M. E. 1962.—Dairy Sci. Abstr.,
24, 109.
Sharpe M. E. 1970.— Int. J. Syst. Bac-
teriol., 20, 509.
Sharpe M. E., Fryer T. F. 1965.— Lab.
Practice, 14, 697.
Sharpe M. E., Wheater D. M. 1955.—
J. Gen. Microbiol., 12, 513.
Sharpe M. E., Wheater D. M. 1957.—
J. Gen. Microbiol., 16, 676.
Sharpe M. E., Brock J. H., Knox K. W.,
Wicken A. J. 1973.— J. Gen. Micro-
biol., 74, 119.
Sharpe M. E., Davison A. L., Baddiley
J. 1964.— J. Gen. Microbiol., 34, 333.
Sharpe M. E., Fryer T. F., Smith D. G.
1966.— In «Identification methods
for microbiologists», Part А. В. M.
Gibbs, F. A. Skinner (Eds).
London — New York, Acad. Press.
Sharpe M. E., Garvie E. I., Tilbury
R. H. 1972.— Appl Microbiol., 23,
389.
Sharpe M. E., Latham M. J., Garvie
381
E. I., Zirngibl J., Kandler 0. 1973.—
J. Gen. Microbiol., 77, 37.
Shankman S., Schvo Y. 1958.— J. Am.
Chem. Soc., 80, 1164.
Shankman S., Higa S., Florsheim H.A.,
Schvo Y., Gold V. I960 —Arch. Bi-
ochem. and Biophys., 86, 204.
Shattock P. M. F. 1937. Univ. Reading
Thesis. Цит. по P. M. F. S h a t-
tock, A. T. R. Mattick, 1943.
Shattcfck P. M. F. 1949.— J. Gen. Mic-
robiol., 3, 80.
Shattock P. M. F. 1962. In «Chemical
and biological hazards in food» J. C.
Ayres, A. A. Kraft, S. H. E.
Snyder, H. W. Walker (Eds).
Iowa State University Press, p. 303.
Shattock P. M. F., Hirsch A. 1947.— J.
Path. Bacteriol., 59, 495.
Shattock P. M. F., Mattick A. T. R.
1943 - J. Hyg, 43, 173.
Sherman J. M. 1916.— J. Bacteriol.,
1, 445.
Sherman J. M. 1937,— Bacteriol, Revs.,
1, 3.
Sherman J. M. 1938.— J. Bacteriol.,
35, 81.
Sherman J. M. 1955.— J. Dairy Sci.,
38, 1184.
Sherman J. M., Smiley K. L., Niven
C. F. 1940,—J. Dairy Sci., 23, 529.
Sherwood J. R. 1939.— J. Dairy Res.,
10, 426.
Shimwell J. L. 1940.— Brewing science
and practice. Hind J. L. John Wiley
and Sons, Chap. 37, 658.
Shimwell J. L. 1947.— Amer. Brewer,
80, 27—29, 57.
Shimwell J. L. 1948,—J. Inst. Brew.,
54, 100.
Shimwell J. L. 1949,— Wallerstein
Labs. Communs., 12, 71.
Shimwell J. L., Kirkpatrick W. F.
1939,—J. Inst. Brew., 45, 137.
Shiota T., Clark F. M. 1955.— J. Bac-
teriol., 70, 339.
Shockman G. D. 1956.— J. Bacteriol.,
72, 101.
Shockman G. D. 1963. In «Analytical
microbiology». F. Kavanagh
(Ed.). New York —London, Acad.
Press, p. 567.
Shockman G. D., Martin J. T. 1968.—
J. Bacteriol., 96, 1803.
Shovlin F. E., Gillis R. E. 1969.— J.
Dental Res., 48, 356.
Sijpesteijn A. K. 1970.— Antonie Le-
euwenhoek. J. Microbiol, and Serol.,
36, 335.
Silva M. T., Cheeseman G. C. 1959.—
J. Appl. Bacteriol., 22, 317.
Simonds Hansen P. A., Lakshma-
nan S. 1971.— J. Bacteriol., 107,
382.
Sims W. 1968.— J. Dental Res., 47,
105.
Skadhauge K. 1950. Studies on the en-
terococci with special reference to
the serological properties. Copenga-
gen. Einer Munksgaards.
Skean J. D., Overcast W. W. 1965.—
J. Dairy Sci., 45, 1530.
Skeggs H. R. 1963a. In «Analytical
microbiology». F. Kavanagh
(Ed.). New York and London. Aca-
demic Press, p. 421.
Skeggs H. R. 1963b. In «Analytical
microbiology». F. Kavanagh
(Ed.). New York—London. Acad.
Press, p. 521.
Skeggs H. R. 1963c. In «Analytical
microbiology». F. Kavanagh
(Ed.). New York—London. Acad.
Press, p. 551.
Smith R. P. 1924.—Brit. Med. J.,
3334, 948.
Smith D. G. 1970.— J. Appl. Bacteri-
dl., 33, 474.
Smith H. W., Crabb W. E. 1961,—J.
Pathol, and Bacteriol., 82, 53.
Smith R. E., Cunningham J. D. 1962.—
Canad. J. Microbiol., 8, 727.
Smith D. G.. Shattock P. M. F.
1962.— J. Gen. Microbiol., 29,
731.
Smyk B. 1957.— Roczniki nauk rol-
nicz, Ser. B., 71, 313.
Snell E. E. 1950. In «Vitamin me-
thods», v. I. P. G у б r g у (Ed.). New
York. Acad. Press.
Snell N., Lewie J. C. 1953.— J. Bacte-
riol., 65, 671.
Snow I., Beard P. 1939.— Food. Res.,
4, 563.
Snyder M. L., Bullock W., Parker R. B.
1967 —J. Infect. Dis., 117, 332.
Sokal R., Sneath P. H. A. 1963,—In
«Principles of numerical taxonomy».
San Francisco — London, W. H.
Freeman and Company.
Sokatch J. T., Gunsalus I. C. 1957.—
J. Bacteriol., 73, 452.
Sorrels К. M., Speck M. L. 1970.— J.
Dairy Sci., 53, 239.
Speck M. L., Cowman R. A. 1968.—
In «Culture Collections of Microor-
ganisms». Int. Conf. Culture Collec-
tions. Tokyo.
382
Spicher G. 1957.— Brot und Geback,
9, 196.
Spicher G. 1958a.—Brot und Geback,
3, 56.
Spicher G. 1958b.— Brot und Geback,
6, 127.
Spicher G. 1959a.— Zbl. Bakt., II. Abt.,
113, 80.
Spicher G. 1959b.— Brot und Geback,
2, 32.
Spicher G. 1959c.— Brot und Geback,
6, 110.
Spicher G. I960,— Brot und Geback,
2, 27.
Spicher G. 1961a.— Brot und Geback,
2, 21.
Spicher G. 1961b.— Brot und Geback,
6, 113.
Spicher G. 1968a.— Brot und Geback,
4, 61.
Spicher G. 1968b.— Brot und Geback,
6, 127.
Spicher G. 1968c.— Brot und Geback,
7, 146.
Spicher G., Fouda M. A. 1958.— Brot
und Geback, 2, 27.
Spicher G., Stephan H. 1965.— Brot
und Geback, 5, 91.
Stadthouders J., Galesloot T. E., lea-
dings H. T., Veringa H. A., Lange-
veld L. P. M. 1966.— Nizo Nieuws,
12е, Ser. XI.
Stamer J. B., Albury M. N., Pederson
C. S. 1964.— Appl. Microbiol., 12,
165.
Stamer J. B., Stoyla B. 0. 1968.— Appl.
Microbiol., 16, 536.
Stamer J. R., Stoyla B. 0., Dunckel
B. A. 1971.—J. Milk and Food Tech-
nol., 34, 521.
Stark E. 1970.— Appl. Microbiol., 20,
200.
Stark P., Sherman J. M. 1935.— J. Bac-
teriol., 30, 639.
Steele R. H., White A. G. C., Pierce
W. A. 1954.— J. Bacteriol., 67, 86.
Stephens J. 1962.— J. Insect. Pathol.,
4, 267.
Stevenson J. P. 1966.— J. Invertebr.
Pathol., 8, 205.
Stirling A. C. 1953.— Proc. Soc. Appl.
Bact., 16, 27.
Stirling A. C., Whittenbury R. 1963.—
J. Appl. Bacteriol., 26, 86.
Stone R. W., Bechdel S. I., McAuliffe
H. D., Murdock F. R., Malzahn R. C.
1943.— Bull. Agric. Exptl Station
State Coll., Pensylvania, N 444.
Suganuma A. 1966.— J. Cell. Biol., 30,
208.
Sundman V., Bjbrksten K. A. 1958.—
J. Gen. Microbiol., 19, 491.
Sundman V., Bjbrksten K., Gyllen-
berg H. G. 1959.— J. Gen. Microbi-
ol., 21, 371.
Suzuki J., Kitahara K. 1964.— J. Gen.
Appl. Microbiol., 10, 305.
Svenson L., Tveit M. 1964.— J. Sci.
Ed. Agric., 15, 78.
Swartling P. F. 1951.—J. Dairy Res.,
18, 256.
Swiencicki J. F., Hartman К, E. 1967.—
Canad. J. Microbiol., 13, 1445.
Szember A. 1952.— Acta Microbiol.
Polon., 1, 339.
Szember A., Slupczynski W. 1964.—
Ann. Univer. M. Curie-Skladowska,
Sec. b. 19, 333.
Taha S. M., Mahmoud S. A. Z., Abd-
el-Halim M. A. 1966.— J. Microbiol.
U. A. R„ 1, 117.
Takei M., Kobayashi Y., Iwasaki S.,
Fujihashi T. 1971.— Jap. J. Microbi-
ol., 15, 109.
Tamura Z., Nakajtma T., Samejima
K., Yoshioka M., Saito Y., Ohta K.,
Yoshioka S., Kitamura M. 1972.—
Proc. Jap. Acad., 48, 39.
Teply M. 1962.— Prumysl. potravin,
13, 198.
Tewari H. K., Vyas S. R. 1970,—In-
dian J. Microbiol., 10, 69.
Tewari H. K„ Vyas S. R. 1971 —J.
Res., 8, 460.
Tewari H. K., Vyas S. R. 1972,—J.
Res., 9, 80.
Thomas T. D., Batt R. D. 1969.— J.
Gen. Microbiol., 58, 371.
Thornley M. J., Sharpe M. E. 1959.—
J. Appl. Bacteriol., 22, 368.
Tissier H. 1900. Recherches sur la
flore inlestinale des nourissons
(etat normal et pathologique). Car-
re, Paris, These, Faculte de Mede-
cine de Paris.
Tittsler R. P., Geib D. S., Rogosa M.
1947,— J. Bacteriol., 54, 12.
Tittsler R. P., Pederson C. S., Snell
E. E., Hendlin D., Niven C. F.
1952,— Bacteriol. Revs., 16, 227.
Tomic-Karovic K., Sudic D., Tomlje-
novic C. 1959.— Bull, scient. Conseil
Acad. RPFY, 5, 16.
Troili-Petersson G. 1903— Zbl. Bakt.,
II. Abt., 11, 137.
Turner N., Sandine W. E., ElltkerP.R.
1962,— J. Dairy Sci., 45, 656.
Turner N., Sandine W. E., EllikerP. R.,
383
Day E. A. 1963.— J. Dairy Sci., 46,
380.
Tysset C., Rousseau M. 1968.— Bull,
apicole de documentation scientifi-
que et technique et d’information,
XI, 21.
Uchida K., Mogi K. 1973.— J. Gen.
Appl. Microbiol., 19, 129.
Vannova J. 1957.— Nature, 179,
204.
Vaughjt R. H., Douglas H. C., Gilli-
land J. R. 1943.— Calif. Agr. Exptl
Sta. Bull., 678.
Vaughn R, H., Won W. D., Spencer
F. B., Pappagianis D., Foda I. 0.,
Krumperman P. H. 1953.— Appl.
Microbiol., 1, 82.
Veerkamp J. H. 1971.— Arch. Bio-
chem. and Biophys., 143, 204.
Verigna H. A., Galesloot Th. E., Da-
velaar H. 1968.— Nederl. melk-en
Zuiveltijdschr., 22, 114.
Verona 0. 1960.— Annali della speri-
mertatazione Agraria, Suppl. 11,
19, 14, N 6.
Vincent J. G., Veomett R. C., Rilley
R. F. 1959.— J. Bacteriol., 78,
477.
Virtanen A. I. 1937.— Zbl. Bakt., II.
Abt., 95, 472.
Vries W. de, Stouthamer A. H. 1967.—
J. Bacteriol., 93, 574.
Vries W. de, Stouthamer A. H. 1968.—
J. Bacteriol., 96, 472.
Vries W. de, Gerbrandy S. J., Stout-
hamer A. H. 1967.— Biochim. et bi-
ophys. acta, 136, 415.
Wasserman R. H., Seeley H. W., Loos-
li J. K. 1953.— J. Animal Sci., 12,
935.
Wath J. C. van der. 1948.— J. Vet. Sci.
Animal. Ind., 23, 367.
Watson S. J., Smith A. M. 1951.— Si-
lage. London. Crosby Loockwood
(Ed).
Watson S. A., Hirata Y., Williams
С. B. 1955.— Cereal Chemistry, 32,
382.
Weigmann H., Woljj A. 1922.— For-
schungen auf dem Gebiete der
Milchwirtschaft und Molkereiwe-
sens, 2, 2.
Weiller H. G., Radler F. 1970 — Zbl.
Bakt., II. Abt., 124, 707.
Weiss J. E., Rettger L. F. 1934.— J.
Bacteriol., 28, 501.
Weiss N., Plapp R., Kandler O. 1967.—
Arch. Mikrobiol., 58, 313.
W.eixl-Hofmann H. 1958.— Milchwiss.
Ber., 8, 57.
Wheater D. M. 1955a.— J. Gen. Micro-
biol., 12, 122.
Wheater D. M. 1955b.— J. Gen. Micro-
biol., 12, 133.
Wheater D. M., Hirsch A., Mattick A.
T. R. 1951. National Institute for
Research in Dairing, Shinfield, Nr.
Reading, may 25.
Wheater D. M., Hirsch A., Mattick A.
T. R. 1952,—Nature, 170, 623.
Whistreich G., Chao J. 1960.— J. In-
sect. Pathol., 2, 30.
Whistreich G. A., Chao J. 1961.— J.
Insect. Pathol., 3, 274.
White P. B. 1921.— J. Path, and Bac-
teriol., 24, 64.
White R. J., Hurst A. 1967.— Biochem.
J., 106, 949.
White R. J., Hurst A. 1968.— J. Gen.
Microbiol., 53, 171.
Whitehead H. R. 1933.— Biochem. J.,
27, 1793.
Whittenbury R. 1963.— J. Gen. Micro-
biol., 32, 375.
Whittenbury R. 1964.—J. Gen. Micro-
biol., 35, 13.
Whittenbury R. 1965.— J. Gen. Micro-
biol., 38, 279.
Whittenbury R. 1966.— Arch. Mikrobi-
ol., 53, 317.
Wicken A., Baddiley J. 1963.— Bio-
chem. J., 87, 54.
Wicken A., Elliott S., Baddiley J.
1963,—J. Gen. Microbiol., 31, 231.
Wicken A. J., Knox K. W. 1970,—
J. Gen. Microbiol., 60, 293.
Wieringa C. W. 1958.— Netherlands J.
Agr. Sci., 6, 204.
Wilken T. 1959. In «Proc. 4th Inter-
net. Congr., «Biochem»», Vienna,
XIII, p. 433.
Williams N. W. 1948.— J. Amer. Dent.
Ass., 37, 403.
Williams R. E. O., Hirsch A., Cowan
S. T. 1953,—J. Gen. Microbiol., 8,
475.
Williams R. A. D., Sadler S. A. 1971.—
J. Gen. Microbiol., 65, 351.
Williams N. B., Norris R. F., Gyorgy
P. 1953,—J. Infect. Dis., 92, 121.
Wilssens A., Casteele 1. van de.
1969,— Meded. Rijksfac. landbouw-
wetensch. Gent., 34, 11.
Wing G. M., Wilcox C. G. 1960.— J.
Feedstuffs, 32, 61.
Wirahadikusumah S., Rajala O., Lin-
gren S., Nilsson R. 1972.— Arch.
Mikrobiol., 82, 95.
Woller H. 1929 — Zbl. Bakt., II. Abt.,
79, 173.
384
Work E., Dewey D. L. 1953.— J. Gen.
Microbiol., 9, 394.
Wozniak W., Szepietowska B. 1968.—
Acta polon. pharmac., 25, 85.
Yashtma S., Kitahara K. 1969.— J. Gen.
Appl. Microbiol., 15, 289.
Yazicioglu A., Yilmaz N. 1966,—
Milchwissenschaft, 21, 87.
Yoshida T. 1972.— J. Jap. Soc. Food
and Nutr., 25, 501.
Zant W. C. van der, Nelson F. E.
1954,—J. Dairy Sci., 37, 795.
Ziegler R. J., Daneo-Moore L. 1971.—
J. Bacteriol., 105, 190.
Ziemkiewicz K. 1972.— Artykul dys-.
kus, Gaz. cukr., 80, 261.
Ziolecki A., Briggs С. A. E. 1961.—
J. Appl. Bacteriol., 24, 148.
Zubrzycki L., Spaulding E. H. 1962.—
J. Bacteriol., 83, 968.
СОДЕРЖАНИЕ
Введение ......................................................... 3
/
СВОЙСТВА МОЛОЧНОКИСЛЫХ БАКТЕРИЙ
ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА МОЛОЧНОКИСЛЫХ БАКТЕРИЙ ... 6
Морфология клеток................................................. 6
Форма колоний.................................................... 15
Протеолитическая, липолитическая и нуклеазная активность ... 17
Образование каталазы............................................. 21
Сбраживание углеводов............................................ 22
Участие кислорода в процессе молочнокислого брожения .... 29
Питательные потребности.......................................... 32
Углеродное питание ............................................ 32
Источники азотного питания..................................... 34
Витамины....................................................... 37
Другие органические факторы роста.............................. 43
Неорганические соли............................................ 45
Спиртоустойчивость............................................... 46
Развитие в средах с высоким содержанием этилового спирта ... 47
Особенности действия водных растворов этилового спирта .... 51
Закономерности влияния гомологического ряда одноатомных спиртов 54
ВЫДЕЛЕНИЕ, КОЛИЧЕСТВЕННЫЙ УЧЕТ, КУЛЬТИВИРОВАНИЕ
И ХРАНЕНИЕ МОЛОЧНОКИСЛЫХ БАКТЕРИЙ ОТДЕЛЬНЫХ РОДОВ
Род Lactobacillus Beijerinck, 1901............................. 58
Род Streptococcus Bosenbach, 1884 ............................. 66
Серологическая группа D...................................... 66
Серологическая группа N...................................... 69
Род Leuconostoc van Tieghem emend. Hucker and Pederson. 1930 72
Род Pediococcus Balcke, 1884, emend. Mees, 1934 ............... 75
Спиртсодержащие среды в исследованиях молочнокислых бактерий 76
МЕТОДЫ ИЗУЧЕНИЯ СВОЙСТВ МОЛОЧНОКИСЛЫХ БАКТЕРИЙ
ОТДЕЛЬНЫХ РОДОВ.................................................. 80
Род Lactobacillus................................................ 80
Род Streptococcus................................................ 94
Род Leuconostoc.................................................. 99
Род Pediococcus................................................. 100
386
СИСТЕМАТИКА МОЛОЧНОКИСЛЫХ ВАКТЕРИЙ.........................102
Общие принципы и схемы классификации палочковидных и кокко-
вых форм.................................................. 102
Род Lactobacillus......................................... 109
Номенклатура лактобацилл и новые методы, используемые при их
идентификации............................................. 124
Потребность в витаминах................................. 125
Серологические свойства ................................ 125
Химический состав клеточных стенок...................... 141
Свободные аминокислоты и пептиды клеток................. 145
Содержание гуанина и цитозина в ДНК бактерий............ 147
Электрофоретическая характеристика дегидрогеназ......... 149
Нумерическая систематика.................................152
Род Streptococcus......................................... 153
Энтерококки..............................................159
Молочные стрептококки................................... 170
Род Leuconostoc........................................... 173
Род Pediococcus............................................179
БИФИДОБАКТЕРИИ.............................................187
Систематическое положение L. bifidus.......................192
МОЛОЧНОКИСЛЫЕ БАКТЕРИИ В ПРИРОДЕ
ЭПИФИТНАЯ МИКРОФЛОРА...................................... 202
Культурные и дикорастущие растения Средней Азии............206
Растения некоторых областей Украинской ССР.................212
Водные растения............................................213
Природа взаимоотношений эпифитных молочнокислых бактерий с рас-
тением и обитающими на нем микроорганизмами.................214
ПОЧВА И РИЗОСФЕРА РАСТЕНИЙ.................................219
Распространение молочнокислых бактерий.....................220
Почва................................................... 221
Ризосфера растений...................................... 222
Некоторые особенности взаимоотношений молочнокислых бактерий
и растений................................................. 225
ЖЕЛУДОЧНО-КИШЕЧНЫЙ ТРАКТ ЧЕЛОВЕКА..........................229
Полость рта ...............................................229
Желудок и тонкие кишки.....................................230
Толстые цишки............................................. 231
ЖЕЛУДОЧНО-КИШЕЧНЫЙ ТРАКТ ТЕПЛОКРОВНЫХ ЖИВОТНЫХ
Жвачные животные.......................................... 235
Другие теплокровные животные.............................. 242
337
ХОЛОДНОКРОВНЫЕ ЖИВОТНЫЕ........................................ 245
Насекомые.......................................................245
Некоторые особенности молочнокислых бактерий, изолированных из
насекомых.....................................................253
Способность молочнокислых бактерий размножаться в кишечном
тракте насекомых........................................ 254
Рыбы........................................................... 255
ВЗАИМООТНОШЕНИЕ МОЛОЧНОКИСЛЫХ БАКТЕРИЙ С ДРУГИМИ
МИКРООРГАНИЗМАМИ................................................259
Антагонизм молочнокислых бактерий и их антибиотики..............259
Антибиотические свойства молочнокислых кокков...................261
Антибиотические свойства ацидофильной палочки.................266
Другие молочнокислые палочковидные бактерии-антагонисты . . . 269
Видовой состав молочнокислых бактерий-антагонистов в желудоч-
но-кишечном тракте человека .............................. 272
Использование мутагенных факторов для повышения антагонисти-
ческой активности Streptococcus lactis, Lactobacillus casei и L. bre-
vis по отношению к дизентерийным бактериям Флекснера . . . 274
Взаимоотношения между молочнокислыми бактериями................ 275
Взаимоотношения молочнокислых бактерий и дрожжей в природных
и производственных субстратах............................... 278
Действие антибиотиков на молочнокислые бактерии.................283
Лактоцид ................................................... 284
ИСПОЛЬЗОВАНИЕ МОЛОЧНОКИСЛЫХ БАКТЕРИЙ
В НАРОДНОМ ХОЗЯЙСТВЕ
ХЛЕБОПЕЧЕНИЕ................................................... 290
Молочнокислые бактерии заквасок и теста........................ 292
Некоторые особенности приготовления ржаного и пшеничного теста 299
Ржаное тесто..................................................299
Пшеничное тесто...............................................301
СИЛОСОВАНИЕ КОРМОВ..............................................304
Микрофлора силоса.............................................. 305
Ранние стадии силосования.....................................305
Поздние стадии силосования................................... 308
Роль различных факторов при регулировании микробиологических
процессов в силосе...........................................312
Применение культур молочнокислых бактерий при силосовании
кормов....................................................... 318
БИОЛОГИЧЕСКОЕ КОНСЕРВИРОВАНИЕ ОВОЩЕЙ И ФРУКТОВ . . 326
Квашение капусты................................................327
Соление огурцов ............................................... 331
Соление маслин (оливок).........................................335
Другие растительные продукты....................................337
388
МЯСНАЯ И РЫБНАЯ ПРОМЫШЛЕННОСТЬ........................341
Мясо и мясные продукты............................... 341
Рыба и рыбные продукты............................... 349
Получение молочной кислоты и декстрана................351
ПРИНЦИПЫ ИСПОЛЬЗОВАНИЯ МОЛОЧНОКИСЛЫХ БАКТЕРИЙ
В КАЧЕСТВЕ ИНДИКАТОРНЫХ МИКРООРГАНИЗМОВ
ПРИ ОПРЕДЕЛЕНИИ ВИТАМИНОВ И АМИНОКИСЛОТ...............353
Витамины............................................. 254
Аминокислоты..........................................356
Литература............................................359
ЕВГЕНИЙ ИВАНОВИЧ
КВАСНИКОВ
ОЛЬГА АЛЕКСЕЕВНА
НЕСТЕРЕНКО
МОЛОЧНОКИСЛЫЕ БАКТЕРИИ
И ИХ ИСПОЛЬЗОВАНИЕ
В НАРОДНОМ ХОЗЯЙСТВЕ
Утверждено к печати
Всесоюзным микробиологическим обществом Академии наук СССР
и Институтом микробиологии и вирусологии им. Д. И. Заболотного
Академии наук УССР
Редактор
Т. А. Дапева
Художник А. Г. Кобрин
Художественный редактор
Т. П. Поленова
Технический редактор
Т. В. Полякова
Сдано в набор 12/XI 1974 г. Подписано к печати 24/Ш 1975 г.
Формат бОХЭО1/^. Усл. печ. л. 24,75. Уч.-изд. л. 28.
Тираж 5300. Т-03086. Тип. зак. 1385. Бумага тип. № 1.
Цена 2 р. 01 к.
Издательство «Наука».
103717 ГСП, Москва, К-62, Подсосенский пер., 21
2-я типография издательства «Наука».
121099, Москва, Г-99, Шубинский пер., 10