ГЛАВА 2. КОЛИЧЕСТВЕННЫЕ
ЗАКОНОМЕРНОСТИ
ФОТОЛЮМИНЕСЦЕНЦИИ.
ПЕРЕНОС ЭНЕРГИИ ЭЛЕКТРОННОГО
ВОЗБУЖДЕНИЯ В БИОСИСТЕМАХ
2.1.	Зависимость интенсивности фотолюминесценции
соединений от их концентрации
Будем освещать образец, в котором содержится одно соедине-
ние, способное поглощать свет и люминесцировать, монохрома-
тическим светом с интенсивностью ZQ. Поток люминесценции (Z),
т.е. количество фотонов, излучаемых всем объектом в единицу
времени, должен быть пропорциональным потоку поглощаемого
возбуждающего света (количеству фотонов возбуждающего све-
та, поглощаемых в единицу времени):
F = qQ(IQ~I) = qQIQ(l-T) = qQI^,	(9)
где q - коэффициент пропорциональности, называемый кванто-
вым выходом фотолюминесценции. Это физический параметр
люминесцирующих молекул; 1>у>0. Введем обозначение J=F!Q.
Это отношение имеет размерность интенсивности и его часто на-
зывают интенсивностью люминесценции. Поскольку
: =е”Р', то
<	J = qIQ(l-10^a); J - #0(/ -	(10)
Эти уравнения - общая количественная зависимость интен-
, сивности фотолюминесценции от характеристик молекул {q, е) и
всего объекта (С, Z). Если оптическая плотность объекта невели-
ка (eCZccl; (3Z«1),
"	J-~ qIQnsl = ql^.Cl ln\Q.	(11)
2.2.	Закономерности фотолюминесценции
в многокомпонентных объектах
В многокомпонентном образце поток (интенсивность) люми-
несценции данного соединения ниже вследствие экранирования.
Действительно, согласно пропорциональности потоку люминес-
ценции и потока поглощаемого света, который в данном случае
19
описывается уравнением (5), выходит, что
(12)
где р и (30 - показатель поглощения люминесцирующего соеди-
нения, равный ns, и общий показатель поглощения объекта.
Сравнение уравнений (10)—(12) показывает, что интенсивности
люминесценции данного соединения в чистом виде и в много-
компонентном образце будут близки лишь при условии pQ/«l.
2.3.	Спектры люминесценции и спектры возбуждения
люминесценции биообъектов
Система молекул люминесцирующего соединения излучает
фотоны не с одной длиной волны, а совокупность фотонов в оп-
ределенном спектральном интервале. Зависимость монохромати-
ческого потока (или интенсивности) люминесценции образца, т.е.
количества фотонов с длиной волны от X до lAdk, испускаемых в
единицу времени, от ее длины волны называют спектром люми-
несценции. В ходе электронных переходов с испусканием кван-
тов люминесценции (рис. 2) часть энергии электронного возбуж-
дения растрачивается на колебания. Поэтому спектр фотолюми-
несценции данного соединения располагается в более длинновол-
новой области, чем его спектр поглощения (закон Стокса). Спектр
фосфоресценции сдвинут в длинноволновую область по отноше-
нию к спектру флуоресценции, так как уровень Т, с которого
излучается квант фосфоресценции, находится по энергии ниже
уровня S'y (рис. 2), с которого излучается квант флуоресценции.
Интенсивность люминесценции варьирует при изменении дли-
ны волны возбуждения. Зависимость величины от длины
волны падающего (возбуждающего) на объект света при постоян-
ной длине волны регистрации люминесценции - спектр возбуж-
дения люминесценции. Величина q не зависит от длины волны
возбуждающего света (закон Вавилова). Поэтому и согласно урав-
нению (9) спектр возбуждения люминесценции чистого соедине-
ния по форме совпадает со спектральной кривой поглощения
света, выраженной в виде зависимости а от X.
Способностью к люминесценции (q заметно выше нуля) обла-
дают следующие группы биологически важных соединений:
1)	ароматические аминокислоты: триптофан, тирозин и
фенилаланин и содержащие эти аминокислоты белки; спек-
20
тры люминесценции аминокислот и белков занимают об-
ласть 280 - 450 нм;
2)	некоторые нуклеотиды и нуклеиновые кислоты при очень
низких температурах; спектральный диапазон их люминесцен-
ции 290 - 500 нм;
3)	простетические группы некоторых ферментов : фосфопи-
ридоксаль, НАД*Н9, окисленный ФАД; их спектры люминес-
ценции располагаются в диапазоне 350-600 нм;
4)	некоторые производные порфирина и родственные соеди-
нения: хлорофилл, протопорфирин, гемопорфирины без атома
железа; их люминесценция занимает красную область спектра.
2.4.	Количественные закономерности переноса энергии
возбуждения при кинетическом соударении
Энергия электронного возбуждения биомолекулы (ЛГ*), нахо-
дящейся в состоянии ^или Т (рис. 2), может передаваться на
другую молекулу Л. В результате этого М'1: дезактивируется (пе-
реходит в основное состояние), а молекула А переходит в элект-
ронное возбужденное состояние. Для фотобиологических процес-
сов наиболее важны два типа переноса энергии электронного
возбуждения: перенос при кинетическом соударении и мигра-
ция энергии. Следует подчеркнуть, что известно много процес-
сов, когда при кинетическом соударении М* и А происходит лишь
дезактивация первой молекулы, а молекула А не переходит в
возбужденное состояние; это называют кинетическим тушением
М*. Дезактивация Л/* при переносе энергии и просто тушение
при кинетическом соударении количественно описываются оди-
наково.
Совокупность процессов, разыгрывающихся при поглощении
фотонов в молекуле М, описывается кинетической схемой, кото-
рая изображена на рис. 11. Важнейшие характеристики перено-
са энергии - его скорость и изменение количества возбужденных
молекул М. Выражения для этих характеристик нетрудно полу-
чить на основании приведенной кинетической схемы. Скорость
перехода М в возбужденное состояние равна количеству фото-
нов, поглощаемых в единицу времени, т.е. величине	Для
состояния М*& скорость убыли возбужденных молекул равна
<Лд + А« + А}>л Н Ан Ь A. [-4sl)As> гДе 1Л1 и NS " концентрация
молекул Ад и количество возбужденных молекул М во^всем объек-
те. Примем, что [Ag] равна исходной концентрации А&, т.е. в
21
Рис. 11. Кинетическая схема процессов, происходящих в молекула)
при поглохдении фотонов.
и - молекулы М в состояниях и Т; Р - продукт фотохи
мических реакций; к и у - константы скоростей процессов (нижние
индексы обозначают вид процесса). As и - невозбужденные молеку
лы-акцепторы энергии (тушители) при ее переносе; сами тушители не
поглощают энергию падающего излучения.
результате переноса энергии эта концентрация мало изменяется.
Скорость перехода в триплетное состояние равна ^HK^VS, а
скорость убыли количества молекул 7И*Т равна (уд + уфос + уфх Ф
уп [Ар])А7т, где [Ар] и AZT - концентрация молекул Af и колите
ство молекул М в триплетном состоянии во всем объекте. Для
стационарного состояния имеем:
=w0 - D/k,	(13)
.	(14,
где А=ЛД 4АИК +£фл +£фх [АД; у = Уд +уфоо +уфх +ул [Ар].
Скорость переноса энергии находится на основании этих урав-
нений. Например, для переноса энергии с М* на Ag его скорость
равна	k. В отсутствие переноса энергии ([АД=0 или
[Ар]=0) будут действительны выражения
Ако " «к - ДА0.	(15.
А'т,0 " A. «А, " А)А0.	(15.
22
в которых	4^ик + Л>фл + kфХ; у0 =Уд +уфос +уфх. Поделим
уравнение (15) на уравнение (13). Будем иметь выражение, кото-
рое описывает зависимость стационарного количества молекул в
состоянии АГ* от концентрации акцептора энергии в виде ли-
нейной функции:
Ns,o^s - 7+'6»МА	W
Аналогично для триплетного состояния АЙрПри [Ag]=0
A^q/A^, [АгЬ'То-	(18)
Интересно отметить, что отношения Ns q/A^ и Nt q/A^ лег-
ко определить, измеряя потоки люминесценции. Например,
для синглетного возбужденного состояния в присутствии А&
поток флуоресценции	а без As поток флуоресцен-
ции А0=Лфл A^q. Следовательно, ArSj0/A's=/’0/A’.
В биологических объектах очень важный пример кинетичес-
кого переноса энергии - передача энергии возбуждения органи-
ческих биомолекул, находящихся в триплетном состоянии, на
молекулы кислорода (см. главу 12).
2.5.	Роль миграции энергии электронного возбуждения
в фотобиологических процессах
Перенос энергии электронного возбуждения называют мигра-
цией энергии, если он совершается на значительные расстояния
(превышающие межатомные) без излучения фотонов и без кине-
тического соударения молекул донора и акцептора. Миграцион-
ный перенос энергии важен для фотобиологических явлений, во-
первых, потому, что представляет собой способ быстрой
транспортировки энергии на расстояния, значительные в моле-
кулярных масштабах. Во-вторых, при совместном действии мно-
гих молекул доноров энергии с одной молекулой акцептора про-
цесс миграции энергии может обеспечивать эффективное
поступление энергии в одно место. Все это наблюдается в фото-
синтезирующем аппарате высших растений, водорослей и фото-
синтезирующих бактерий и имеет чрезвычайно важное значение
для эффективного протекания фотосинтеза. В этом аппарате вы-
деляют особые образования - фотосинтетические единицы. Они
включают 1-2 молекулы фотохимически активного (участвует в
фотохимических реакциях) хлорофилла а, а также больщое ко-
личество фотохимически неактивных молекул хлорофилла а (ан-
23
Рис. 12. Спектры поглощения хлорофилла а (кривая 1) и хлорофил-
ле! Ъ (кривая 2) в органических растворителях.
тенный хлорофилл). Хлорофилл а наиболее сильно поглощает'
синий и красно-оранжевый свет (рис. 12). В фотосинтетическую
единицу входят еще молекулы так называемых дополнительных
пигментов: хлорофилл Ь, каротиноиды, а в красных и сине-зеле-
ных водорослях также фикобилины (соответственно фикоэрит-
рин и фикоцианин). Дополнительные пигменты сильно погло-
щают свет в спектральном диапазоне, в котором хлорофилл а
слабо поглощает излучение (рис. 12 и 13). Энергия, поглощенная
молекулами антенного хлорофилла а, хлорофилла b и других
пигментов передается на фотохимический центр (фотохимичес-
ки активную молекулу хлорофилла а) по эстафете или прямо.
24
Благодаря такой миграции энергии фотосинтез может происхо-
дить при очень низкой интенсивности света; при этом для обес-
печения хода темновых биохимических реакций, начинающих-
ся с превращения активных молекул хлорофилла а, требуется
небольшое количество ферментных систем.
Длина волны, нм
Рис. 13. Спектры поглощения каротиноидов (1), фикоэритрина (2) и
фикоцианина (3).
D - оптическая плотность при данной длине волны, - то же в
максимуме светопоглощения.
При поглощении света в антенном хлорофилле а, хлорофилле
Ь, фикобилинах и каротиноидах эффективность миграции энер-
гии на активный хлорофилл а составляет соответственно около
100, 100, 80-90 и 20-50 %.
В молекулах белков, нуклеиновых кислот, комплексах бел-
ков энергия электронного возбуждения может мигрировать между
следующими парами химических групп: с фенилаланина на ти-
25
розин, с тирозина на триптофан, с ароматических аминокислот
на гем, ретиналь, ФАД и НАД‘Н2, с НАД • Н2 на ФАД, с
НАД • Но или ФАД на гем, с основания на другое азотистое осно-
вание в нуклеиновых кислотах.
2.6.	Механизмы миграции, энергии
Миграция энергии электронного возбуждения может проис-
ходить по синглетным уровням (с синглетного возбужденного
уровня донора на синглетный уровень акцептора) и по триплет-
ным уровням донора и акцептора. Второй вид миграции энергии
можно однозначно выявить в особой паре молекул (рис. 14): ниж-
ний синглетный возбужденный уровень акцептора характеризу-
ется большей энергией, чем нижний синглетный возбужденный
уровень донора; энергия триплетного уровня акцептора меньше
энергии триплетного уровня донора, как это, например, имеет
место в случае ацетофенона и тимина (для ацетофенона харак-
терна высокая степень интеркомбинационной конверсии). Обна-
ружение перехода акцептора в триплетное состояние при погло-
щении света только донором свидетельствует о переносе энергии
по триплетным уровням, поскольку перенос энергии на синглет-
ный возбужденный уровень в данной ситуации не возможен.
Ацетофенон Тимин
Рис. 14. Диаграмма энергетических уровней, поясняющая миграцию
энергии электронного возбуждения по триплетным уровням.
Е - энергия; Г И 7а - триплетные уровни энергии донора (ацетофе-
нона) и акцептора (тимина). В молекуле донора происходит поглоще-
ние фотонов hv с длиной волны около 350 нм, которые не поглощаются
в молекуле акцептора.
i
26
Миграция энергии в зависимости от ряда обстоятельств мо-
жет осуществляться по нескольким физическим механизмам.
Для биологических систем важнее всех индуктивно-резонанс-
ный и обменно-резонансный механизмы. Упрощенно индук-
тивно-резонансный механизм можно представить себе как воз-
действие электромагнитного поля, создаваемого осцилляцией
заряда (диполя) в возбужденной молекуле донора, на молеку-
лу акцептора с индукцией в ней электрического диполя. Если
молекулы донора и акцептора характеризуются близкими ча-
стотами осцилляции зарядов (возможен резонанс), энергия
может эффективно перейти в акцептор. Указанная близость
частот означает, что возбужденные энергетические уровни
донора и акцептора должны быть близки друг к другу. Поэто-
му показателем возможности миграции энергии по индуктив-
но-резонансному механизму в данной паре служит перекры-
вание спектра люминесценции донора (точнее, флуоресценции)
со спектром поглощения акцептора энергии. Индуктивно-ре-
зонансная миграция энергии совершается на расстояния до
нескольких нанометров, является переносом по синглетным
уровням. Обменно-резонансная миграция энергии реализует-
ся при некотором перекрывании орбитали возбужденного элек-
трона донора с орбиталью электрона акцептора. В месте пере-
крывания электроны не различимы, возможен их обмен с
переносом энергии возбуждения. В этом случае возбужденные
энергетические уровни взаимодействующих молекул также
должны быть близкими. Обменно-резонансный механизм ле-
жит в основе переноса энергии по триплетным уровням, отно-
сится к категории близкодействующих механизмов.
Контрольные вопросы и задачи
1.	При какой величине D интенсивность фотолюминесценции с
точностью 10 % пропорциональна концентрации люминесцирующего
соединения?
2.	Постройте график зависимости потока люминесценции от
концентрации люминесцирующего соединения.
3.	Каким образом будет трансформирован спектр возбуждения
фотолюминесценции белка в присутствии нуклеиновой кислоты?
4.	Исходя из кинетической схемы электронных переходов, выведите
формулу зависимости интенсивности флуоресценции от времени цосле
выключения возбуждающего света.	.	1
24
6.	Выведите формулу тушения фосфоресценции при условии, что на
молекулы акцептора кинетический перенос энергии происходит и t
синглетного, и с триплетного уровней донора.
7.	Рассчитайте, сколько необходимо молекул антенного хлорофилла
для фиксации 1 молекулы С02 за 2 с, происходящей в результате
поглощения 8 фотонов; интенсивность падающего света равна 5-1O15
квант, (см2 • с); е = 105 л/(моль*см).
8.	Постройте график зависимости потока флуоресценции донора
энергии от концентрации акцептора в условиях кинетического переноса
энергии электронного возбуждения.