Text
                    ПРОБЛЕМЫ БИОЛОГИИ РАЗВИТИЯ
А* П. ДЫБАН
РАННЕЕ РАЗВИТИЕ
МЛЕКОПИТАЮЩИХ


АКАДЕМИЯ НАУК СССР ИНСТИТУТ БИОЛОГИИ РАЗВИТИЯ ИМ. Н. К. КОЛЬЦОВА Научный совет по проблеме «ЗАКОНОМЕРНОСТИ ИНДИВИДУАЛЬНОГО РАЗВИТИЯ ЖИВОТНЫХ И УПРАВЛЕНИЕ ПРОЦЕССАМИ ОНТОГЕНЕЗА» ПРОБЛЕМЫ БИОЛОГИИ РАЗВИТИЯ Серия основана в 1974 году А. П. ДЫБАН РАННЕЕ РАЗВИТИЕ МЛЕКОПИТАЮЩИХ ЛЕНИНГРАД «НАУК А» ЛЕНИНГРАДСКОЕ ОТДЕЛЕНИЕ 1988
УДК 599 : 591.39 : 576.3 Дыбан А. П. Раннее развитие млекопитающих. — Л.: Наука, 1988. — 228 с. — (Пробл. биологии развития). Книга посвящена узловым процессам оогенеза и раннего эмбриогенеза млекопитающих. В первой части приведены сведения о возникновении и свойствах первичных половых клеток, механизмах инициации и контроля мейотического цикла, факторах, регулирующих рост и созрева-i ние ооцитов. Во второй части рассматриваются оплодотворение и активация яйцеклеток, дробление и свойства бластомеров у ранних зародышей, анализируются механизмы формирования мо- рулы и бластоцисты и организация зародышей на доимплантационных стадиях развития. На основе сопоставления результатов экспериментально-эмбриологических и молекулярно-биологических исследований формулируются общие представления о генетических и эпигеномных контролирующих механизмах оогенеза и доимплантационного развития зародышей млекопитающих. Библ. 605 назв. Ил. 17. Табл. 17. Редакционная коллегия серии «Проблемы биологии развития» М. С. Мицкевич (главный редактор) Т. А. Детлаф (зам. главного редактора) В. Я- Бродский, С. Г. Васецкий, А. Е. Гайсинович, А. П. Дыбан, Г. В. Лопашов, А. А. Нейфах, Т. М. Турпаев, Н. Г. Хрущов Ответственный редактор книги доктор биологических наук профессор Л. И. Корочкин 2001000000-668 214.88_П1 © Издательство «Наука», 1988 г. 042@2)-88 ISBN 5-02-025636-6
ВВЕДЕНИЕ Долгое время эмбриология млекопитающих значительно отставала от других разделов биологии развития. В эмбриологии млекопитающих доминировали сравнительный и описательный подходы и морфологические методы. Развивающиеся в материнском организме зародыши млекопитающих считались трудными объектами, при изучении которых невозможно применить методы экспериментальной эмбриологии. Хотя в результате многолетних усилий "ученых разных стран и удалось накопить большое количество ценных фактических данных об общем течении гаметогенеза и эмбриогенеза, о процессах имплантации и плацентации, закономерностях органогенеза и гистогенеза у различных видов млекопитающих, включая человека, однако движущие силы и контролирующие механизмы эмбрионального развития, особенно ранних стадий, оставались непонятными. Коренной перелом в эмбриологии млекопитающих произошел лишь в 60-е годы нашего столетия, когда были созданы методы культивирования in vitro ранних зародышей мышей и методы их трансплантации. Вначале много внимания уделялось совершенствованию техники этих экспериментов и изучению метаболических потребностей ооцитов и зародышей мышей, развивавшихся in vitro. Однако вскоре культивирование зародышей в сочетании с различными методами микрохирургии и манипуляции с ранними зародышами начали успешно применять для изучения общих закономерностей созревания ооцитов и раннего эмбриогенеза не только мышей, но и других млекопитающих. Преобразование эмбриологии млекопитающих из описательной в экспериментальную науку произошло очень быстро, причем это совпало с кардинальными изменениями в клеточной биологии, обусловленными успехами молекулярной биологии и генетики, и наложило существенный отпечаток на эмбриологию млекопитающих, которая к середине 70-х годов преобразовалась в одно из наиболее интенсивно разрабатываемых и многообещающих направлений биологии развития.'Стало очевидным, что при исследовании зародышей млекопитающих не только можно внести существенный вклад в решение фундаментальных вопросов, имеющих общебиолргический характер и касающихся общих закономерностей эмбрионального развития, но и что эти работы на зародышах млекопитающих могут иметь непосредственный выход в практику медицины и животноводства. На повестку дня был поставлен вопрос о поисках эффективных подходов и путей управления развитием и наследственностью зародышей млекопитающих. В настоящее время биология развития млекопитающих занимает важное место в решении ряда актуальных медицинских проблем — в разработке научных основ и новых способов контроля рождаемости, в создании новых методов лечения женского и мужского бесплодия, в разработке новых методов прена- тальной диагностики врожденных пороков развития и наследственных болезней человека. Ранние зародыши млекопитающих являются стандартным тест- объектом испытания эмбриотоксической и тератогенной активности новых фармакологических препаратов и оценки опасности для внутриутробного развития различных факторов внешней среды, с которыми человек сталкивается на производстве, в сельском хозяйстве и в быту. 1*
4 Введение Биология развития млекопитающих заняла важное место и в животноводстве, что позволило решить ряд практически новых задач и принесло значительный экономический эффект. Еще не так давно животноводам были совершенно чужды методы работы с яйцеклетками и ранними зародышами млекопитающих in vitro, методы трансплантации ранних зародышей. В настоящее время оплодотворение in vitro, культивирование, микроманипуляция, криоконсервация и трансплантация ранних зародышей широко используются для улучшения породного состава и повышения плодовитости различных сельскохозяйственных животных. Так, общее количество коров, полученных за последние пять лет при трансплантации ранних зародышей, уже исчисляется сотнями тысяч. Примечательно, однако, что такой существенный экономический эффект получен именно в тех странах, в которых много лет интенсивно разрабатывалась экспериментальная эмбриология млекопитающих и где были специалисты, хорошо владеющие современными методами работы с ооцитами и ранними зародышами как лабораторных, так и сельскохозяйственных животных. Сказанное относится и к медицинским аспектам биологии развития, т. е. к использованию ее достижений в медицинской практике. Вначале опыты по оплодотворению яйцеклеток млекопитающих in vitro преследовали чисто теоретические цели, причем попытки оплодотворения яйцеклеток человека in vitro долго оставались безуспешными. В середине 1978 г. весь мир облетело сенсационное сообщение о рождении первого ребенка, «зачатого в пробирке». Прошло менее десяти лет, и рождение детей после оплодотворения in vitro и трансплантации ранних зародышей стало обыденным фактом в практике многих акушерско-гинекологических клиник различных стран мира. В 1986 г. ежедневно рождалось 5—7 таких детей, и количество удачных исходов трансплантации зародышей человека достигло нескольких тысяч случаев и продолжает стремительно увеличиваться. Нельзя, однако, не обратить внимание на то, что этот метод широко используется для лечения некоторых форм женского бесплодия именно в тех странах, где экспериментальной эмбриологии млекопитающих уделяли должное внимание и где уровень работ по биологии развития млекопитающих соответствует требованиям сегодняшнего дня и уровню биологии развития в целом. В последние годы и у нас в стране существенно возрос интерес к биологии развития млекопитающих животных и человека, особенно со стороны врачей и животноводов. С ооцитами и ранними зародышами сельскохозяйственных животных начали работать во многих городах, появились и сообщения о рождении у нас в стране детей, «зачатых в пробирке». Однако осваивать и внедрять в практику методы оплодотворения in vitro, культивирования, криоконсервации и трансплантации ранних зародышей млекопитающих животных и человека приходится в условиях острой нехватки хорошо подготовленных специалистов по биологии развития млекопитающих. Поэтому к работам, имеющим практическую направленность, нередко привлекают биологов и врачей, недостаточно хорошо ориентирующихся в новых методах и современном уровне познания тех проблем, решать практические аспекты которых они призваны. В отечественной литературе отсутствует книга, освещающая современное состояние узловых процессов оогенеза и раннего эмбриогенеза млекопитающих и обращающая внимание на наиболее актуальные проблемы и нерешенные вопросы, изучением которых целесообразно заниматься. Мысль о том, что такая книга была бы полезна нашему читателю, всегда возникала у меня после лекций, прочитанных в разные годы на всесоюзных школах по биологии развития, молекулярной биологии, биотехнологии, медицинской генетике, а также после бесед с преподавателями кафедр гистологии и эмбриологии медицинских
Введение 5 институтов, посещавших отдел эмбриологии ИЭМ АМН СССР. Однако задумать такую книгу оказалось значительно легче, чем ее написать, и я далеко не убежден, что справился с поставленной задачей, тем более, что хотелось бы сделать эту книгу полезной как для тех, кто начинает изучать раннее развитие млекопитающих, так и для тех, кто уже имеет опыт работы в этой области. Книга состоит из двух частей, первая из которых посвящена предзародыше- вому развитию, т. е. становлению структурно-функциональной организации яйцеклетки. Вторая часть книги посвящена оплодотворению, дроблению, формированию бластоцисты и организации зародышей во время гаструляции. В этой части рассматриваются те этапы начального эмбриогенеза млекопитающих, во время которых возможны изменения путей развития зародышей и их наследственности. Оогенезу и раннему эмбриогенезу млекопитающих посвящена весьма обширная зарубежная литература, в том числе несколько многотомных справочных руководств, значительное число монографий, ряд обстоятельных обзоров и очень большое количество журнальных статей. Охватить всю эту литературу не представлялось возможным, да это и не входило в задачи данной монографии. Поэтому в книге не приведена подробная библиография, а, как правило, даны ссылки лишь на обзорные работы, в которых можно найти необходимые литературные источники. Значительное внимание в книге уделено генетическим, цитогенетическим и молекулярно-биологическим аспектам оогенеза и раннего эмбриогенеза, так как эти вопросы близки моим научным интересам. Однако при изложении этого материала учитывалось, что в отечественной литературе уже были опубликованы обстоятельные сводки, затрагивающие данные вопросы. Так, в книгах Нейфаха и Тимофеевой A977, 1978) приводятся основные сведения о репликации ДНК, транскрипции и трансляции генетической информации в оогенезе и раннем эмбриогенезе различных животных, включая и млекопитающих. В книге Кафиани и Костомаровой A978) приведена обширная библиография и даны краткие ссылки на ряд работ по молекулярно-биологическим аспектам оогенеза и эмбриогенеза млекопитающих. В недавно опубликованной книге Айзенштадт A984) освещены цитологические аспекты оогенеза млекопитающих. В монографиях Корочкина A977, 1981) подробно разобраны механизмы регуляции действия генов в развитии различных животных, включая и млекопитающих, а в книге Конюхова A980) рассматриваются узловые проблемы генетики развития позвоночных, и в ней приведены сведения и о раннем развитии млекопитающих. Влияние хромосомных аберраций на эмбриогенез млекопитающих детально разобрано в книге Дыбана и Баранова A978), второе дополненное издание которой содержит как, новые факты, так и подробную библиографию по цитогенетике развития млекопитающих (Дыбан, Баранов, 1987). В связи с этим в данной книге приведены лишь те сведения по генетике и цитогенетике раннего развития млекопитающих, которые необходимы для обсуждения контролирующих механизмов раннего эмбриогенеза и оценки удельного веса генетических и эпигеномных факторов в данных процессах. Хочется надеяться, что предлагаемая вниманию читателей книга будет способствовать дальнейшему расширению исследований по биологии развития млекопитающих у нас в стране и привлечет внимание молодых исследователей к этой области. Если же кто-нибудь из них, выбирая свой путь в науке, решит посвятить себя изучению раннего развития млекопитающих, то это будет для меня самой большой наградой. Я много раз начинал и откладывал работу над этой рукописью, не желая нанести ущерба своей непосредственной исследовательской работе, которая, мне кажется и интереснее, и полезнее. Я убежден, что если бы не моральная
6 Введение поддержка и настойчивость Т. А. Детлаф, то эта книга так и осталась бы ненаписанной. Считаю поэтому своим приятным долгом от всей души поблагодарить Т. А. Детлаф, чье мужество, желание и умение работать заслуживают самого высокого уважения и являются примером, которому нужно стремиться следовать. Я весьма благодарен Н. Г. Хрущову за содействие и помощь в преодолении препятствий, возникших на заключительном этапе работы над рукописью и при сдаче ее в издательство. Выход монографии в свет совпадает с юбилеем Отдела эмбриологии ИЭМ АМН СССР, где 25 лет тому назад нами были начаты работы по экспериментальной эмбриологии и экспериментальной тератологии млекопитающих и где все это время продолжались эти исследования. Буду рад, если коллектив, в котором я работаю, воспримет эту книгу не только как подведение определенных итогов наших исследований, но и как выражение моей признательности и надежды, что и в дальнейшем Отдел будет изучать раннее развитие млекопитающих, гармонично сочетая новые методические подходы с теми методами, которые стали для нас традиционными. Хочу подчеркнуть свою признательность Г. Ф. Голинскому, которому принадлежат некоторые из рисунков, приведенных в книге. Я сердечно благодарен О. В. Лазаревой за то, что она, не считаясь с затратой времени и сил, оказала большую помощь в техническом оформлении рукописи, нарисовала некоторые рисунки и помогла закончить работу над рукописью в сжатые сроки.
Часть первая ПРЕДЗАРОДЫШЕВОЕ РАЗВИТИЕ Глава I ПРОИСХОЖДЕНИЕ И СВОЙСТВА ПЕРВИЧНЫХ ПОЛОВЫХ КЛЕТОК Происхождение половых клеток млекопитающих длительное время вызывало оживленные споры, затрагивавшие не только общебиологические, но и философские вопросы. Исторические аспекты этой проблемы и литература прежних лет рассмотрены в работах Светлова A978а, 19786), в сборнике работ иностранных авторов, вышедшем на русском языке (см.: Вольф, 1968), в обзорах (Семенова-Тян-Шанская, 1971; Семенова-Тян-Шанская, Кнорре, 1972). Затем стало казаться, что проблема потеряла актуальность и не может служить предметом серьезной научной дискуссии. Именно поэтому мы написали: «В настоящее время не вызывает никакого сомнения, что вся популяция гамет у млекопитающих так же, как и у всех других животных, берет начало от первичных половых клеток (гоноцитов), имеющих экстрагонадное происхождение. Это положение твердо доказано многочисленными экспериментальными данными» (Дыбан, Баранов, 1977). За истекшие годы не получено фактических данных, которые могли бы поставить под сомнение справедливость этого вывода, однако это отнюдь не означает, что вопрос о происхождении половых клеток у млекопитающих снят с повестки дня. Хотя внегонадное возникновение первичных половых клеток и должно считаться непреложной истиной, необходимо выяснить, когда и как образуются первичные половые клетки, а эти вопросы еще весьма далеки от окончательного решения. Т. Б. Айзенштадт следующим образом формирует суть задачи: «В проблеме происхождения половых клеток необходимо различать два вопроса: выяснение места первичной локализации этих клеток и установление точного времени обособления линии половых клеток от соматических» (Айзенштадт, 1984, с. 61). Сказанное в полной мере относится и к млекопитающим. Недавно опубликована книга, в которой обстоятельно разобрано современное состояние проблемы происхождения половых клеток и приведена подробная библиография (Айзенштадт, 1984). Этой теме посвящена коллективная монография зарубежных авторов (Hilscher, 1983) и несколько обзоров (Eddy et al., 1981; McLaren, 1981, 1983a, 1983b, 1984), в которых приведена литература последних лет, касающаяся происхождения половых клеток у млекопитающих. Это облегчает освещение современного состояния данной проблемы. 1.1. ЛОКАЛИЗАЦИЯ ПЕРВИЧНЫХ ПОЛОВЫХ КЛЕТОК (ППК) У МЛЕКОПИТАЮЩИХ Этот вопрос наиболее полно изучен у зародышей мышей, хотя существуют сведения и о стадиях развития зародышей других млекопитающих, включая и зародышей человека, когда впервые выявляются ППК (Дыбан, Баранов, 1977). Следует иметь в виду, что у зародышей млекопитающих ППК можно
8 Часть первая. Предзародышевое развитие с уверенностью отличить от соматических клеток лишь на фиксированных препаратах, обработанных гистохимическими методами на выявление щелочной фосфатазы, а у человека — и при окраске на полисахариды. Других надежных маркеров ППК млекопитающих не имеют. Существуют сведения об ультраструктурных особенностях ППК млекопитающих, которые отличают их от других клеток, например наличие в ППК структур типа так называемых «Nuage» («облачко», т. е. перинуклеолярные тельца). Однако, во-первых, эти структуры четко обнаруживаются в ППК только тогда, когда эти клетки уже дают положительную реакцию на, щелочную фосфатазу, а, во-вторых, их не видно или они плохо различимы в неоплодотворенных яйцеклетках или в зиготах мышей и крыс, у которых детально исследована первичная локализация ППК, и хорошо визуализируются лишь в яйцеклетках сирийских хомячков (Eddy, 1975; Eddy et al., 1981), т. е. у животных, линия половых клеток которых исследована недостаточно. Есть сообщение о незаконченных исследованиях (McLaren, 1983a), в которых делалась попытка использовать наличие перинук- леолярных телец в качестве маркера для выявления предшественников ППК у ранних зародышей мышей, однако неизвестно, чем закончились эти работы. Если же исходить из высокого содержания щелочной фосфатазы или полисахаридов, то тогда следует прийти к выводу, что у зародышей млекопитающих ППК появляются на относительно поздних сроках развития. Наиболее полно этот вопрос изучен в эмбриогенезе мыши. Остановимся на этих данных. Показано, что у мыши ППК обнаруживаются на 8—8.5 сут, т. е. на стадии 10—11 (по классификации Дыбана и др., 1975). Эти зародыши завершили имплантацию и имеют хорошо сформированные внезародышевые части: трофобласт, состоящий из первичных и вторичных гигантских клеток, внезародышевую эктодерму, образующую эктопланцентарный конус, и внезародышевые энтодерму и мезодерму, образующих стенку желточного мешка, у них четко виден формирующийся аллантоис. В самом теле эмбриона уже есть все три зародышевых листка, сформирована нервная пластинка, головной отросток и начинает образовываться переднее кишечное впячивание. Эта стадия непосредственно предшествует образованию первых пар сомитов. Характерно, что ППК обнаруживаются незадолго до формирования первых сомитов только в случаях, если зародыши уже содержат зачаток аллантоиса. У эмбрионов этого же возраста (начало стадии 10), но не имеющих еще зачатка аллантоиса, ППК не выявляются (Ozdzenski, 1967). Примечательно, что у десяти исследованных в данной работе зародышей ППК преимущественно располагались в зачатке аллантоиса, где было найдено от 15 до 69 ППК- Лишь у трех ППК были не только в составе аллантоиса (у этих зародышей в аллан- тоисе находились 61, 64, 69 ППК), но и в составе первичной полоски, где, однако, их было очень мало (от 1 до 3 клеток). Случаев, когда ППК располагались бы только в первичной полоске, но не в аллантоисе, не описано (Ozdzenski, 1967). Эти наблюдения были недавно полностью подтверждены при более точном датировании стадии развития зародышей мышей (Tarn, Snow, 1981). Показано, что ППК впервые обнаруживаются у пресомитных зародышей мышей на 7.75 — 8.0 сут развития, причем ППК располагаются в каудальной части первичной полоски и в основании аллантоиса и представляют собой популяцию из 40— 50 клеток. На 8.5 сут ППК находятся в энтодерме желточного мешка и в зачатке задней кишки, где их насчитывается около 150 A45±14). Примечательно, что и у пресомитных зародышей человека единичные ППК впервые обнаруживаются либо в первичной полоске, либо в близлежащем районе зачатка мезодермы (Семенова-Тян-Шанская, 1969, 1971, 1973), причем это заметно на более ранней стадии, чем та, когда ППК обнаруживаются в желточном мешке.
/. Происхождение и свойства первичных половых клеток 9 Могут ли служить приведенные факты прямым доказательством того, что ППК образуются в эктодерме, причем лишь на пресомитной стадии развития? Такой вывод неправомочен, так как, во-первых, наличие ППК в аллантоисе и первичной полоске может быть истолковано по-иному, а, во-вторых, есть данные о том, что клетки, принадлежащие к линии половых клеток (коммитиро- ванные предшественники ППК), возникают раньше, чем на пресомитной стадии. Важно не упускать из вида, что в раннем эмбриогенезе мышей еще на стадии бластоцисты (т. е. на 4.5 сут развития) во внутренней клеточной массе (эмбрио- бласте) выделяется так называемый эпибласт, из которого в дальнейшем развиваются все три зародышевые листка (эктодерма, энтодерма и мезодерма зародыша), а также внезародышевая мезодерма, входящая в состав аллантоиса и стенки желточного мешка (подробнее см. гл. IX. 7). Следовательно, эпибласт отнюдь не равнозначен эктодерме зародыша. Кроме того, следует учитывать способы возникновения мезодермы и механизмы формирования аллантоиса у млекопитающих. У зародышей мышей мезодерма (зародышевая и внезародышевая) образуются при миграции клеток эпибласта через первичную полоску. Этот процесс начинается на б—6.5 сут, и к 7.5 сут мезодерма зародыша мыши уже содержит 6000—6500 клеток (Snow, 1976). Аллантоис не формируется непосредственно из эктодермы зародыша за счет выроста первичной полоски, как это полагал Оженский (Ozdzenski, 1967), а образуется вследствие миграции клеток эпибласта через первичную полоску, т. е. формируется из возникающей при этом мезодермы. Следовательно, наличие у пресомитных зародышей преобладающего большинства ППК в корне аллантоиса и лишь единичных ППК в первичной полоске скорее всего говорит о том, что те ППК, которые находятся в эпибласте, вероятно, еще не успели завершить миграцию через первичную полоску, т. е. не успели войти в состав мезодермы аллантоиса. Складывается впечатление, что ППК приобретают высокое содержание щелочной фосфатазы, т. е. тот признак, который обычно принято считать характерным для их клеточного фенотипа, именно по ходу миграции через первичную полоску. До этого в эпибласте находятся лишь клетки-предшественники ППК, не содержащие, однако, существенного количества щелочной фосфатазы. Получены прямые доказательства существования в эпибласте более ранних зародышей коммитированных предшественников, принадлежащих к линии половых клеток, которых, однако, нельзя заметить при окраске на щелочную фосфатазу. Данный вывод вытекает из работы, в которой проводились микрохирургические операции зародышей мышей 7—7.5 сут развития, а затем прооперированные зародыши и их изолированные части культивировались 24 ч in vitro (Snow, 1981) (рис, 1). Эти опыты послужили основанием для гипотезы о мозаичной организации зародышей мышей во время гаструляции (на стадии яйцевого цилиндра) (подробнее эта гипотеза разобрана в гл. IX). Для рассматриваемого вопроса существенное значение имеют результаты, которые получены при удалении небольшого района зародыша, состоящего примерно из 200—250 клеток и расположенного в области, соответствующей каудальному району первичной полоски (так называемый район 7—8 по: Snow, 1981). Если культивировать in vitro эту часть зародыша, то через 24 ч из нее формируется зачаток аллантоиса и в нем обнаруживается 40—50 типичных ППК, содержащих большое количество щелочной фосфатазы. Эти клетки располагаются по периферии ткани аллантоиса, но без определенного порядка. Если же культивировать in vitro часть зародыша, которая содержит как область 7—8, так и соседний район эпибласта, соответствующий будущему зачатку задней кишки (область 6), то в эксплантате образуется не только ткань аллан-
10 Часть первая. Предзародышевое развитие Рис. 1. Изучение проспективных потенций первичной эктодермы (эпибласта) у постимплантацион- ных зародышей мышей (по: Snow, 1981). А, Б, В— зародыши 7.5 сут развития. Г — зародыш 8.5 сут. А— схема микрохирургических операций, цифрами обозначены удалявшиеся районы; Б, В — зародыши этих же стадий, представленные в форме цилиндра; Б — объемное изображение удалявшихся районов; В — схема аллокаций клеточных территорий в первичной эктодерме, для которых удалось определить проспективные потенции. Черными точками обозначен участок 7—8, в котором располагаются коммитированные предшественники первичных половых клеток. На стадии яйцевого цилиндра, т. е. у зародышей 7.5 сут, участки 7—8 соответствуют каудальной части первичной эктодермы в области первичной полоски (объяснения в тексте); а—аллантоис, б— первичные половые клетки, в — энтодерма задней кишки, г — хвостовая почка, д — туловище зародыша, е — сомиты, ж — краниальные части, з — мезодермальная часть зачатка сердца. тоиса, но и энтодерма, формирующая типичное кишечное впячивание. В этих случаях в эксплантате обнаруживается то же самое количество ППК, однако все они располагаются не в ткани аллантоиса, а в кишечном впячивании, что убедительно говорит о вторичной локализации ППК в энтодерме. При культивировании прооперированного зародыша 7—7.5 сут, у которого удалили область эпибласта, соответствующую району 7—8, первичные половые клетки в зародыше не образуются. Следовательно, в районе 7—8 располагается коммитированная популяция клеток, из которой в дальнейшем (за 24 ч) возникают все ППК, обнаруживаемые при окраске на щелочную фосфатазу в основании аллантоиса и в первичной полоске. Таким образом, у зародышей мышей 7—7.5 сут развития уже произошло выделение линии половых клеток, причем коммитированные клетки занимают определенный район эпибласта. Остальные клетки эпибласта, расположенные в других его районах, хотя и сохраняют способность осуществлять различные типы соматических цитодифференцировок, но уже утратили способность давать начало линии половых клеток. По-видимому, начало выделения линии половых клеток приурочено к более ранним стадиям эмбриогенеза.
/. Происхождение и свойства первичных половых клеток 11 Было постулировано, что линия половых клеток возникает из 3—9 стволовых клеток. Так как на 8-е сут обнаруживается 40—50 ППК, а у 12-суточного зародыша уже есть около 4000 ППК, за эти четыре дня ППК совершают 6—7 клеточных циклов, т. е. делятся каждые 15 ч. Если допустить, что ППК имеют такое же генеративное время и на более ранних стадиях, то тогда нужно 3— 3.5 сут для того, чтобы из 3—9 стволовых клеток образовалось 50 ППК. Следовательно, можно предположить, что линий половых клеток возникает между 4.5 и 5 сут развития зародышей мышей (Mintz, 1974; Eddy et al., 1981). Принимая во внимание частоту химеризма среди половых клеток у мышей — генетических химер, а также стадию развития, когда происходит регуляция размера и скорости роста химерных зародышей, полученных при агрегации двух и больше морул (Buehr, McLaren, 1974), высказано предположение, что это происходит несколько позже, т. е. у зародышей 5.5 сут развития. На этой стадии в эпибласте «зарезервировано» (отложено в сторону — set aside) несколько, но не меньше двух клеток, из которых в последующем возникает вся линия половых клеток (McLaren, 1976, 1978, 1981). К такому же выводу можно прийти и другим путем, исходя из результатов подсчета количества клеток в эпибласте и динамики клеточных циклов у 6—8-суточных зародышей. У зародышей 5.5 сут эпибласт состоит из 100—120 клеток, у 7-суточных — из 4500, а у 7.5-суточных — из 14 000 клеток (Snow, 1976, 1977). Если учесть изменение продолжительности клеточных циклов с 6 по 8 сут и наличие в эпибласте на 6.5 сут так называемой «пролиферативной зоны», клетки которой имеют очень короткий цикл (менее 3 ч) и за счет которой к 7.5 сут образуется 50 % клеток эктодермы, предназначенных в основном на построение нервной пластинки (Snow, 1976, 1977, 1981), а также допустить, что генерационное время ППК находит'ся в границах 14—16 ч, то тогда вполне достаточно, чтобы именно на 5.5 сут среди 100—120 клеток эпибласта было несколько клеток, «зарезервированных» для линии половых клеток, чтобы из них к 7.5—8.0 сут могло образоваться то количество ППК D0—50 клеток), которое реально существует у зародышей этого возраста (Tarn, Show, 1981). Подобного рода расчеты дают сугубо ориентировочные сведения и уязвимы в такой же степени, как и любые другие расчеты, на основании которых пытаются определить исходное количество стволовых клеток, из которых возникает зачаток того или иного органа (McLaren, 1976). Если согласиться с тем, что в эпибласте 5.5-суточного зародыша мыши есть несколько клеток, предназначенных для линии первичных половых клеток, то неизбежно возникает вопрос о свойствах таких клеток-предшественников. Способны ли любые либо определенные клетки эпибласта стать родоначальниками линии половых клеток? Обладают ли «зарезервированные» клетки способностью преобразовываться только в линию половых клеток, или им еще свойственна более широкая потенция, т. е. они могут либо дифференцироваться в направлении соматических клеток, либо давать начало линии половых клеток? Ответить на эти вопросы и проверить заманчивое предположение об отборе клеток эпибласта (в зависимости от их расположения) для будущей линии половых клеток (McLaren, 1981) —дело дальнейших исследований. К -сожалению, очень трудно исследовать потенции эпибласта 5.5-суточных зародышей мышей. Удалить у них определенные районы эпибласта пока еще невозможно, и такие микрохирургические операции не были осуществлены. Попытки ввести в полость бластоцисты клетки от эпибласта 5.5-суточного зародыша дали неопределенные результаты (Rossant, 1977; Rossant, Papaioannou, 1978; Gardner, Rossant, 1979). Были проведены опыты по трансплантации под капсулу почки изолированных зародышевых листов (в том числе только первичной эктодермы, т. е.эпи-
12 Часть первая. Предзародышевое развитие бласта) зародышей крыс 8—9 сут (Skreb et al., 1976). При этом образовывались тератомы, состоящие из зачатков органов и разнообразных тканевых производных трех зародышевых листков. Однако этот факт говорит о том, что эпибласт способен давать начало всем трем дефинитивным зародышевым листкам и их производным, но никак не может быть использован для суждения о наличии или отсутствии в эпибласте клеток, коммитированных в направлении линии половых клеток. Во-первых, в тератомах никогда не образуются половые клетки, этого не наблюдалось и при трансплантации под капсулу почки изолированного эпибласта зародышей крыс на стадии, эквивалентной 6-суточному зародышу мыши. Во-вторых, тератомы могут возникать при трансплантации в эктопические места зародышей, содержащих ППК и не имеющих их (этот вопрос подробно разобран в гл. II). Так как потенции клеток у доимплантационных зародышей мышей исследованы значительно лучше, чем у 5.5-суточных зародышей, закономерен вопрос: нет ли данных в пользу обособлений предшественников линии половых клеток на более ранних стадиях развития? На поставленный вопрос следует дать отрицательный ответ. Рассмотрим факты, подтверждающие эту точку зрения. У зародышей мышей после 5—6 делений дробления формируются бласто- цисты, содержащие две коммитированные клеточные популяции, — трофэкто- дерму (ТЭ) и внутреннюю клеточную массу (ВКМ). Эти две клеточные популяции не только не могут превращаться друг в друга, но и обладают различными свойствами (см. гл. IX). В ранней бластоцисте (зародышах 3.5 сут) ВКМ имеет около 15—16 клеток A6.3±1.1), а на 4.5 сут развития (в поздней бластоцисте) — 40—50 клеток D4.7±5.4), из которых по крайней мере 20 клеток составляют эпибласт, а остальные — первичную энтодерму (McLaren, 1976, Gardner, 1978). Таким образом, в поздней бластоцисте ВКМ в свою очередь уже подразделилась на две коммитированные клеточные популяции, имеющие разные проспективные потенции (см. гл. IX). Так как потомки ТЭ обнаруживаются только в составе внезародышевой эктодермы и эктоплацентарного конуса, а потомки первичной энтодермы — только в составе внезародышевой энтодермы, следовательно, обе эти клеточные популяции не могут служить источником линии половых клеток. Таким образом, остается предположить, что половые клетки возникают из той клеточной популяции, которая у поздних бластоцист составляет эпибласт и должна прослеживаться и в ВКМ ранних бластоцист. Были осуществлены опыты, четко доказывающие справедливость этого положения (Gardner, 1978; Gardner, Rossant, 1979). У мышей — генетических химер, полученных после введения в зародыш-реципиент (в 3.5-суточные бласто- цисты) изолированных клеток от ВКМ ранних бластоцист или из эпибласта более поздних бластоцист, обнаруживаются как половые клетки, образовавшиеся из клеток реципиента, так и половые клетки, возникшие от клеток зародыша-донора, т. е. из потомков ВКМ (ранних бластоцист) или потомков эпибласта (поздних бластоцист)'. Частота генетического химеризма половых клеток у мышей — генетических химер позволяет считать вполне вероятным, что каждая из клеток ВКМ ранней бластоцисты и каждая из клеток эпибласта поздней бластоцисты способны давать начало линии половых клеток (Gardner, 1978; McLaren, 1981; Gardner et al., 1985). По-видимому, клетки раннего эпибласта еще не коммитированы, т. е. могут давать начало линии половых клеток либо дифференцироваться в различные соматические клетки. Об этом говорят и опыты по микрохирургическому разделению бластоцист пополам. Отмечено рождение жизнеспособных и плодовитых близнецов коров и других животных из «половинок» бластоцист, если разрез был проведен
/. Происхождение и свойства первичных половых клеток 13 в такой плоскости, что в обе половины попали клетки эпибласта (см. гл. IX. 4). Трудно допустить, что при этой микрохирургической операции можно было бы разделить пополам небольшую клеточную популяцию коммитированных предшественников линии половых клеток. Более логично думать, что любая часть эпибласта обладает одинаковыми потенциями, т. е. ранний эпибласт состоит из клеточных популяций, способных дифференцироваться как в линию половых клеток, так и образовывать различные типы соматических клеток, входящих в состав зародыша. Вместе с тем по профилю синтезируемых белков, по ультраструктурной организации, по клеточным циклам и по другим свойствам клетки эпибласта существенно отличаются от первых бластомеров и должны расцениваться как клетки, достигшие определенной ступени цитодифференцировки (см. гл. IX. 3). Клетки раннего эпибласта не способны дифференцироваться ни в направлении ТЭ и ее производных, ни в направлении первичной энтодермы и ее производных. Это заставляет серьезно задуматься над тем, в какой мере приложимо к млекопитающим представление об образовании линии половых клеток из тотипотентных клеток, «ускользнувших» от дифференцировки. Клетки эпибласта 4.5—5.5-суточных зародышей мыши таковыми считаться никак не могут. При изучении генетических химер, созданных при агрегации не только двух, но и трех или четырех зародышей (Markert, Peters, 1978), был сделан вывод, что из 15 клеток, входящих в состав ВКМ ранней бластоцисты, на построение тела зародыша предназначены лишь 2—3 клетки, а потомки других клеток используются для построения внезародышевых органов и тканей (Markert, Peters, 1978; Markert, 1984). У генетических химер, полученных при агрегации трех зародышей, найдено три типа половых клеток, соответствующих генотипу каждой мыши, от которой были взяты зародыши для агрегации (Peters, Markert, 1980). Следовательно, вначале происходит выделение клеток, предназначенных на построение всего зародыша, и только после того, как эти клетки осуществят ряд последовательных делений, т. е. их количество в эпибласте достигнет какой-то пороговой величины, среди них выделяется небольшой клон клеток, «зарезервированных» для линии половых клеток, но еще не утративших способности вступать и на иные пути развития. По-видимому, при микрохирургическом разделении бластоцисты на две части и при формировании из каждой части полноценного зародыша происходит реорганизация эпибласта, его клетки пролиферируют и при этом репрограммируются. Затем в эпибласте заново выделяется клон, клеток, предназначенных для образования линии половых клеток. Однако хотя бластоцисты обладают высокой регуляторной способностью, а клетки раннего эпибласта еще способны осуществлять различные типы соматических дифференцировок, а также давать начало линии половых клеток, клетки эпибласта не являются тотипотентными. Тотипотентными в полном смысле этого слова можно считать только бластомеры более ранних зародышей. Изменение потенции бластомеров в ходе раннего развития зародышей мышей разобраны в гл. IX. Приведем лишь некоторые факты, доказывающие, что каждый из бластомеров действительно тотипотентен и может дать начало линии половых клеток иг образовывать соматические клетки' зародыша. Если разрушить у 2-клеточного зародыша мыши или кролика один из бластомеров, то из оставшегося бластомера формируется нормальный зародыш. Развитие этих зародышей завершается рождением жизнеспособных животных (Таг- kowski, 1959). Было получено 6 таких мышей, и все они оказались плодовитыми, т. е. продуцировали нормальные гаметы (Tarkowski, 1959). В последнее время была разработана различная техника получения однояйцевых близнецов овец, коров и лошадей (Seidel, 1983). Для этого можно использовать и одиноч-
14 Часть первая. Предзародышевое развитие Рис. 2. Испытание потенций каждого из индивидуальных бластомеров у 4-клеточного зародыша мыши в опытах с агрегационными химерами (по: Kelly, 1978). Индивидуальные бластомеры 4-клеточного зародыша обозначены буквами А, £, В, Г; потомки каждого из этих бластомеров соответственно — прописными буквами (аа, бб, ев, гг); черным цветом — бластомеры тех зародышей, которые служили источником клеток-носителей. При образовании химерного зародыша клетки-носители располагались снаружи, а сестринские пары бластомеров, потенция которых испытывалась, находились внутри. Объяснения в тексте. ные бластомеры, изолированные не только на 2-клеточной, но и на 4- или 8-кле- точных стадиях, и при этом рождаются жизнеспособные животные, которые, по-видимому, обладают нормальной плодовитостью (Willadsen, 1982 и личное сообщение). Осуществлен опыт на мышах, доказавший, что каждый из индивидуальных бластомеров 4-клеточного, а, по-видимому, и 8-клеточного зародыша обладает одинаковыми потенциями: Из их потомков могут развиваться не только соматические клетки, но и линия половых клеток (Kelly, 1978). На рис. 2 схематически показан этот весьма впечатляющий, хотя пока еще единственный, опыт. Эмбрионы-доноры были взяты от белых мышей, эмбрионы-источники «клеток-
/. Происхождение и свойства первичных половых клеток 15 носителей» были взяты от черных мышей. После диссоциации 4-клеточного зародыша-донора на отдельные бластомеры каждый из бластомеров индивидуально культивировался около 12 ч пока он не разделился на две клетки, т. е. от зародыша-донора было получено четыре пары клеток. Каждая пара бластомеров агрегировалась с тремя парами бластомеров, взятых от разных зародышей черных мышей. Это было необходимо для того, чтобы увеличить общую массу клеток. Таким образом, от одного 4-клеточного зародыша было получено 4 зародыша-химеры. Химерные зародыши трансплантировались псевдобеременным самкам-реципиентам, и всего родилось 47 мышей, из которых 38 имели характерные признаки (окраска шерсти, изоферменты глюко- зофосфатизомеразы), присущие мышам, от которых были взяты зародыши- доноры. От бластомеров, изолированных из 4-клеточных зародышей, родилось 9 химер (по 3 мыши от каждого зародыша-донора) (табл. 1). Таким образом, потомки по крайней мере трех из четырех бластомеров 4-клеточного зародыша стали составной частью организма химерных мышей, давших потомство. Этот опыт не только говорит об отсутствии различий в проспективных потенциях бластомеров 4-клеточного зародыша, но и доказывает, что в каком-то одном определенном бластомере нет морфогенетического фактора, без которого линия половых клеток не может образовываться. Следует обратить внимание еще на один результат этой работы. Все мыши- химеры, развившиеся при участии бластомера, полученного от 4-клеточного зародыша, имели половые клетки, возникшие из потомков этого бластомера, а не из потомков бластомеров-носителей. К этому факту мы вернемся при обсуждении возможных механизмов, определяющих выделение линии половых клеток у зародышей млекопитающих (см. раздел 2, гл. I). Приведенные выше примеры, количество которых легко можно умножить, говорят о том, что на ранних стадиях развития зародышей мышей и других млекопитающих бластомеры обладают тотипотентностью. Потомки любого из бластомеров могут осуществлять различные типы цитодифференцировок, образуя как соматические клетки, входящие в состав внезародышевых частей и в состав тела зародыша, так и давать начало линии половых клеток. Таблица 1 Химерные мыши, полученные при агрегации одиночного бластомера от 4-клеточных зародышей (доноров) с бластомерами от других зародышей (носителей) (по: Kelly, 1978) Номер 4-клеточного зародыша-донора 1 2 3 Родилось химерных мышей всего от одного зародыша донора 3 3 3 номер химеры 1 2 3 . 4 5 6 7 8 9 пол химеры с? с? в Я Я ? 6 в с? Фенотипические особенности взрослой химеры цвет глаз Донора » Донора- носителя Донора » Донора/ носителя То же окраска шерсти Донора » Донора носителя Донора » Донора/ носителя То же » » изоферменты глюкозофосфа- тизомеразы I крови Донора » Донора/ носителя Донора » Донора/ носителя То же » » Происхождение половых клеток у химерных мышей за счет зародыша Донора » » Донора » Донора
16 Часть первая. Предзародышевое развитие Все известные в настоящее время факты однозначно свидетельствуют о том, что у мышей и, по-видимому, у других млекопитающих начальные стадии развития, включая и стадию бластоцисты, когда образуется эпибласт и первичная энтодерма, не могут быть теми стадиями, когда коммитируется линия половых клеток. Это происходит позже, т. е. у зародышей мышей от 5.5 до 7 сут. Более точное датирование этой стадии — дело будущих исследований. 1.2. МЕХАНИЗМЫ ВЫДЕЛЕНИЯ ЛИНИИ ПОЛОВЫХ КЛЕТОК У МЛЕКОПИТАЮЩИХ 1.2.1. ВОЗНИКНОВЕНИЕ ПОЛОВЫХ КЛЕТОК МЛЕКОПИТАЮЩИХ Сформулированы 4 гипотезы возникновения половых клеток у млекопитающих: сегрегационная, половой плазмы, стволовых клеток, зародышевых листков (Eddy et al., 1981). Первые две гипотезы анализируют как причины, так и стадию, когда выделяется линия половых клеток, а другие две — только стадию развития, когда это происходит. Графически они представлены на рис. 3. Согласно сегрегационной гипотезе, в оплодотворенной яйцеклетке возникает область, содержащая цитоплазматические факторы (половые детерминанты), которые попадают только в некоторые бластомеры, и данные бластомеры дают начало линии половых клеток. Это происходит на начальных стадиях дробления, до того, как наступает первая дифференциация бластомеров, т. е. раньше, чем сужается их потенция. Согласно гипотезе половой плазмы, цитоплазматические детерминанты образуются еще во время оогенеза, т. е. они уже содержатся в зрелых женских гаметах. Эти факторы сегрегируются во время дробления и, попадая в определенные бластомеры, детерминируют бластомеры в направлении линии половых клеток, которыми потомки этих бластомеров становятся на последующих стадиях развития. Таким образом, обе гипотезы исходят из наличия половых детерминантов и сегрегации данных цитоплазматических факторов. Обе гипотезы постулируют, что линия половых клеток выделяется очень рано. Согласно гипотезе половин плазмы, это происходит уже при первом делении дробления, а согласно сегрегационной — в ходе последующих делений дробления, но до формирования бластоцисты, т. е. до образования в зародыше двух различных клеточных популяций — трофэктодермы и внутренней клеточной массы. Обе эти гипотезы причиной образования линии половых клеток считают гипотетические цитоплазматические факторы, образующиеся в женских гаметах (гипотеза половой плазмы) или возникающие в оплодотворенном яйце (сегрегационная гипотеза). Если напомнить фактические данные, приведенные в предыдущем разделе этой главы, то ни сегрегационная гипотеза, ни гипотеза половой плазмы в том виде, как они сформулированы (Eddy et al., 1981), не кажутся приложимыми к линии половых клеток у млекопитающих. Если допустить, что половые детерминанты (образовавшиеся в оогенезе или после оплодотворения) попадают только в определенный бластомер, то тогда нужно объяснить развитие линии половых клеток и в тех случаях, когда зародыш образовывался за счет любого бластомера, изолированного на 4—8-клеточной стадии. Можно, конечно, допустить, что при таких перестройках организации зародыша половые детерминанты возникают заново, причем не во всех, а в некоторых бластомерах, что и приводит к дифференциации потомков данных бластомеров в направлении линии половых клеток. Однако такое предположение несовместимо с основным постулатом этой концепции, согласно которому половые детерминанты не воз-
/. Происхождение и свойства первичных половых клеток 17 Рис. 3. Возникновение линий первичных половых клеток у млекопитающих. Заштрихованы участки яйцеклетки или цитоплазмы бластомеров либо участки эпибласта, с которыми связывают возникновение линии первичных половых клеток. В случаях, если заштрихованы участки цитоплазмы, это отражает представление о существовании половых детерминантов (половой плазмы). Заштрихованные участки в бластоцистах и в первичной энтодерме более поздних зародышей соответствуют расположению стволовых клеток, дающих начало линии первичных половых клеток. / — гипотеза половой плазмы, 2 — сегрегационная гипотеза, 3 — гипотеза стволовых клеток, 4 — гипотеза зародышевых листков. Объяснения в тексте.
18 Часть первая. Предзародышевое развитие никают заново в клетках зародыша, а должны были бы быть уже в яйце, т. е. должны передаваться от клетки к клетке. Гипотеза стволовых клеток и гипотеза зародышевых листков более правдоподобно объясняют образование линии половых клеток у млекопитающих. Согласно этим гипотезам, линии половых клеток образуются в ходе развития как одна из разновидностей клеточных линий, детерминированных в определенном направлении и имеющих ограниченные потенции, значительно меньшие, чем потенции бластомеров ранних зародышей. Эти гипотезы различаются только стадиями развития, когда постулируется обособление линии половых клеток от соматических. Согласно гипотезе стволовых клеток, этот процесс происходит во внутренней клеточной массе бластоцисты или в эпибласте раннего постимплантационного зародыша, т. е. до формирования дефинитивных зародышевых листков. В это время выделяются стволовые клетки не только для линии половых клеток, но и возникают стволовые клетки, являющиеся источником различных линий соматических клеток, формирующих в дальнейшем те или иные зачатки органов и тканей. Что касается последней гипотезы, то, как показывает ее название, она постулирует начало линии половых клеток от какого-то дефинитивного зародышевого листка (скорее всего от эктодермы, но не исключает и мезодерму, либо энтодерму зародыша). Предполагается, что образование линии половых клеток происходит вместе с формированием дефинитивного зародышевого листка, т. е. уже после детерминации стволовых клеток (клонов), из которых развиваются различные зачатки. Если допустить, что еще до формирования дефинитивных зародышевых листков в эпибласте возникают коммитированные клетки-предшественники ППК, а затем, по ходу выделения дефинитивных зародышевых листков, они попадают в какой-то зародышевый листок (в мезодерму, но, возможно, и эктодерму) и приобретают при этом свойства, присущие клеточному фенотипу ППК, то тогда гипотеза стволовых клеток и гипотеза зародышевых листков могут быть объединены в одну. Однако даже если не сделать этого, а принять одну из двух гипотез, необходимо иметь в виду, что этим признается отсутствие принципиальных различий между образованием линии половых клеток и любой линии соматических клеток. Так же как по ходу дифференцировки сужаются потенции соматических клеток, так и линия половых клеток, утрачивая поли- потентность в момент своего выделения, при дальнейшем развитии еще в большей степени сужает пути своего развития. Именно таков логичный вывод, вытекающий и из гипотезы стволовых клеток и из гипотезы зародышевых листков. К этому вопросу мы еще вернемся (см. разделы 3—5, гл. II). 1.2.2. ЭПИГЕНЕТИЧЕСКИЕ МЕХАНИЗМЫ, ПРЕДОПРЕДЕЛЯЮЩИЕ ВЕРОЯТНОСТЬ УЧАСТИЯ ПОТОМКОВ ПЕРВЫХ БЛАСТОМЕРОВ В ОБРАЗОВАНИИ ЛИНИИ ПОЛОВЫХ КЛЕТОК Хотя у млекопитающих, по-видимому, нет половых детерминантов и хотя ранние зародыши млекопитающих обладают высокими регуляторными потенциями, а первые бластомеры тотипотентны, несмотря на все эти обстоятельства, есть известные основания считать, чтд вероятность потомков одних бластомеров принять участие в образовании линии половых клеток выше, чем потомков других бластомеров, причем степень вероятности начинает предопределяться еще в первом делении дробления. Показано, что первые два бластомера мышиного зародыша неодинаковы по своей ультраструктурной организации (Graham, Deussen, 1978), а также
/. Происхождение и свойства первичных половых клеток 19 по скорости, с какой они завершают второй клеточный цикл, т. е. деление с 2-х на 4 клетки (Graham, Deussen, 1978; Дыбан, Секирина, 1981). Вполне вероятно, что такая разнокачественность первых двух бластомеров, каждый из которых может дать развитие целого организма, возникает из-за ооплазматической сегрегации, которая, однако, не сводится к различному распределению по первым бластомерам половых детерминантов. Более правдоподобно, что в оба первых бластомера попадает разное количество каких-то цитоплазматических факторов зиготы (или факторов, существоваших еще в неоплодотворенном яйце, но активированных в ходе оплодотворения), влияющих на продолжительность первого, а, возможно, еще одного-двух клеточных циклов. Разное содержание этого гипотетического фактора (или факторов) приводит к тому, что один из первых двух бластомеров делится быстрее другого (Spindle, 1982; Дыбан, 1987), что и служит первоначальной причиной различной степени вероятности путей дальнейшего развития их потомков. При развитии интактного зародыша упорядоченное расположение бластомеров, влияющее на их дальнейшую судьбу, создается уже на стадии морулы. Потомки того бластомера, который быстрее завершил второе деление дробления, чаще попадают внутрь морулы и чаще входят в состав ВКМ бластоцисты. Эти клетки обладают и значительно большей вероятностью образовывать эпибласт (см. гл. VIII, IX). Естественно, что если клетки попадают в состав эпибласта, то вероятность некоторых из них образовывать линию половых клеток существенно возрастает, вероятность же клеток первичной энтодермы участвовать в образовании линии половых клеток крайне мала. Таким образом, можно предположить, что степень вероятности попасть в состав клона, из которого будет развиваться линия половых клеток, начинает предопределяться еще на 2-клеточной стадии. По ходу дальнейшего развития значение цитоплазматических факторов яйца нивелируется, но возрастает роль позиционной информации, т. е. расположения и взаимодействия бластомеров. Следовательно, хотя на начальных стадиях развития судьба бластомеров не детерминирована, а организация зародыша лабильна и пластична, однако в это время функционируют эпигенетические механизмы, определяющие вероятность тех или иных бластомеров войти в состав ВКМ, а затем и в состав эпибласта. Подобного рода эпигенетические механизмы приводят и к тому, что в эпибласте происходит аллокация небольшой группы клеток, «зарезервированных» для линий половых клеток. Вначале это обратимый процесс, но затем клетки коммитируются и, теряя способность давать начало соматическим клеткам, становятся родоначальниками линий половых клеток. Сформулированная гипотеза учитывает как высокие регуляторные возможности ранних зародышей и тотипотентность первых бластомеров, так и те эпигенетические механизмы, которые предопределяют степень вероятности потомков первых бластомеров осуществлять последующие акты цитодифференцировки, одним из возможных путей которых является образование линий половых клеток. Результаты опытов по созданию химер из бластомеров, изолированных от 4-клеточного зародыша, можно истолковать как пример возникновения линии половых клеток за счет потомков опеделенных бластомеров. Нельзя не обратить внимание, что в работе Келли (Kelly, 1978) из потомков бластомеров, взятых от зародышей белых мышей, значительно чаще формировались органы и ткани химер, чем из бластомеров, взятых от зародышей черных мышей. У химерных мышей линия половых клеток образовывалась за счет бластомеров от белых мышей. Это наблюдалось во всех без исключения случаях, когда химеры были плодовитыми и изучалось их потомство. Напомним, что в этом опыте бластомеры от зародышей черных мышей составляли 2*
20 Часть первая. Предзародышевое развитие наружный слой, а бластомеры от зародышей белых мышей находились внутри агрегированной морулы. Существуют веские доказательства того, что при формировании зародыша- химеры клетки не перемешиваются, т. е. в таких морулах сохраняется то расположение бластомеров, которое они заняли при агрегации (Kelly et al., 1978; Spindle, 1982). Бластомеры от зародышей белых мышей, по-видимому, так располагались в моруле-химере, что они приобрели высокую вероятность войти в состав ВКМ, а затем и в состав эпибласта, образуя тело зародыша, включая и линию половых клеток. Не исключено, однако, и иное истолкование этих опытов: возможно, что бластомеры зародышей белых мышей имели селективные преимущества перед бластомерами зародышей черных мышей, т. е. в этих опытах были созданы так называемые несбалансированные химеры. 1.2.3. КОНКУРЕНТНЫЕ ОТНОШЕНИЯ МЕЖДУ ПЕРВИЧНЫМИ ПОЛОВЫМИ КЛЕТКАМИ РАЗНОГО ГЕНОТИПА Сбалансированным сочетанием зародышей разных генотипов считают случаи, когда клетки обоих генотипов принимают равное участие в образовании организма мыши-химеры. При несбалансированном сочетании клетки одного из зародышей, имея какие-то селективные преимущества, вступают в конкурентные отношения с клетками другого генотипа, вытесняя их из состава органов и тканей зародыша или взрослого организма. Такие химеры состоят i преимущественно из клеток одного генотипа, хотя пропорция клеток другого генотипа в разных органах и может существенно варьировать (Gearhart, Oster-Grarute, 1981). Предполагают, что гибель несбалансированных химерных зародышей может происходить еще внутриутробно (McLaren, 1976, 1978). Показано, однако, что у взрослых мышей несбалансированных химер среди популяции зрелых гамет могут преобладать клетки одного генотипа (Mullen, Whitten, 1971). Это же наблюдалось при изучении потомства от самцов-химер C3H*>Cs7BL (Mintz, 1974) и подтверждено у химер, полученных при сочетании зародышей других линий мышей (Gearhart, Oster-Granite, 1981). В последнее время были четко доказаны конкурентные отношения между гаметами в половых железах химерных мышей, полученных при агрегации нормальных и мутантных зародышей. В этих опытах для создания химер использовали мышей, несущих мутацию локуса W. Локус W, расположенный у мышей в пятой аутосоме, вероятно, состоит из регуляторных последовательностей ДНК, влияющих на три структурных гена, каждый из которых имеет решающее значение в дифференциации меланобла- стов, эритробластов и первичных половых клеток (Markert, 1984). Описано по крайней мере 10 мутаций этого локуса. Уже давно было известно, что в гомозиготном состоянии мутация Dominant spotting (символ W) нарушает пролиферацию и миграцию первичных половых клеток, что приводит к полному отсутствию половых клеток в гонадах у новорожденных мышей. Эти животные обладают пониженной жизнеспособностью и погибают в первую неделю после рождения. При мутации Viable dominant spotting (символ Wv) гомозиготы (Wv/Wv) напоминают мышей W/W, но они доживают до полового созревания и позже, хотя и имеют признаки анемии. Если создать химеры между зародышами с генотипом Wv/Wv и зародышами, несущими мутацию Sxr, вызывающую инверсию пола (о мутации Sxr см. раздел 3 гл. III), то популяция гамет, несущих мутацию Sxr, вытесняет в гонадах
/. Происхождение и свойства первичных половых клеток 2 I гаметы с генотипом Wv/Wv. Такие мыши являются жизнеспособными и плодовитыми самками, но они утрачивают гаметы Wv/Wv и передают потомству с гаметами мутацию Sxr (Bradbury, 1983). Еще боле показательно потомство от химер, полученных при агрегации зародышей белых мышей с нормальным (диким) аллелем локуса W (генотип ее ww) с зародышами от пигментированных мышей, гетерозиготных по мутации W (генотип ее Ww). Ww гетерозиготы являются черными мышами и имеют небольшое белое пятно на брюшке, а во всем остальном они не отличаются от нормальных мышей, т. е. жизнеспособны и плодовиты. Однако у химер ее Ww*>cc ww половые клетки возникают только от белых зародышей (генотип ее ww). Примечательно, однако, что полная элиминация гамет от мутантных зародышей происходит лишь у химерных самцов, тогда как химерные самки образуют гаметы как от белых мышей (ее ww), так и гаметы от черных мышей, несущих мутацию Ww (Markert, 1984). Таким образом, наличие одного аллель- ного мутантного гена может существенно влиять на конкурентоспособность линии половых клеток, по крайней мере в мужских половых железах. Следовательно, нельзя сомневаться в реальном существовании конкурентных отношений между половыми клетками разных генотипов, которые, однако, могут быть выражены в различной степени во время сперматогенеза и оогенеза. Опыты с химерными зародышами, имевшими клетки с мутацией локуса W, позволяют думать, что эти конкурентные отношения начинают проявляться еще при пролиферации и миграции первичных половых клеток или при заселении ими зачатка гонады. Приведенные выше данные говорят о том, что и у химер, полученных при агрегации индивидуальных бластомеров от разных зародышей, могут возникать несбалансированные сочетания и конкурентные отношения между гаметами разного генотипа. Однако селективные преимущества клеток одного какого-то генотипа могут проявляться в тех случаях, если В КМ бластоцист будет состоять из клеток двух генотипов. На более ранних стадиях это явление, вероятно, не имеет места, т. е. судьба бластомеров в большей степени зависит от других факторов. Следовательно, логично предполагать, что в опытах Келли (Kelly, 1978) сочетание двух факторов (расположение бластомеров в центральных частях морулы и особенностей их генотипа, дающего селективные преимущества потомкам бластомеров от зародышей белых мышей) привело к тому, что химерные мыши продуцировали половые клетки, которые происходили от зародышей белых мышей. Это предположение настоятельно нуждается в экспериментальной проверке. 1.3. ХАРАКТЕРИСТИКА ПЕРВИЧНЫХ ПОЛОВЫХ КЛЕТОК 1.3.1. МИГРАЦИЯ После того как первичные половые клетки приобретают высокое содержание щелочной фосфатазы и (или) полисахаридов, их можно с уверенностью выявить на гистологических препаратах зародышей последовательных стадий развития и таким образом проследить путь миграции ППК от места их первичной локализации до зачатка гонады. Пути миграции ППК детально изучены у зародышей различных млекопитающих, включая и человека (Дыбан, Баранов, 1977). Вначале ППК обнаруживаются в первичной полоске и в основании аллантоиса, но вскоре попадают в энтодерму желточного мешка и в заднюю кишку, потом их находят в энтодерме средней кишки, в дорсальной брыжейке и целомической
22 Часть первая. Предзародышевое развитие выстилке, после чего они попадают в эпителий, покрывающий зачаток гонады (так называемый зачатковый эпителий), и, пройдя через этот эпителий, обнаруживаются в половых валиках, т. е. в зачатке гонады. По-видимому, тот же путь миграции гоноцитов свойствен не только животным, но и человеку (Фалин, 1968; Семенова-Тян-Шанская, 1969, 1973). Вопрос о том, каким способом происходит у зародышей млекопитающих перемещение первичных половых клеток, окончательно не решен. У человека Семенова-Тян-Шанская A969, 1973, 1976) выделила три способа перемещения гоноцитов: 1) пассивный, происходящий в результате перемещения клеточных слоев в процессе гаструляции, 2) пассивный с кровотоком через систему омфа- лоидных сосудов из стенок желточного мешка, 3) активное движение, особенно заметное при перемещениях ППК из кишки, через брыжейку в половые валики. Эти положения с полным правом могут быть отнесены и к перемещению ППК у других млекопитающих. Вместе с тем перемещение ППК с кровотоком, кроме зародышей человека, наблюдалось еще у зародышей теленка (Ohno, Gropp, 1965) и зародышей крысы (Семенова-Тян-Шанская, 1976) и нуждается в изучении в эмбриогенезе других млекопитающих. На более ранних стадиях эмбриогенеза, когда ППК находятся в первичной полоске, в основании аллантоиса и в заднем кишечном впячивании, гоноциты по своей ультраструктуре не напоминают подвижные клетки. Только попав в заднюю кишку гоноциты приобретают способность к активным движениям (Clark, Eddy, 1975). Способы активного передвижения ППК изучены недостаточно. При помощи цайтраферной киносъемки ППК, изолированных из задней кишки и половых валиков зародышей мыши, было показано, что in vitro гоноциты образуют псевдоподии, т. е. осуществляют амебоидное движение (Blandau et al., 1963). В этой работе описываются патологические внегонадные ППК, имеющие несколько ядер, а также 2- или 3-ядерные оогонии и гигантские оогонии в зачатке яичника. Авторы подчеркивают, что хотя у зародышей 15—17 дня развития пахитенные ооциты продолжают проявлять активные движения, однако эти движения не являются амебоидными, так как цитоплазма мейоцитов ундули- рует, а ядро смещается в единичные, но очень крупные выпячивания цитоплазмы. Не исключено, что эти картины возникали из-за того, что ППК контактировали во время микрокиносъемки с мало подходящим искусственным субстратом (со стеклом). Возможно, что амебоидные движения вообще не отражают истинного способа активного передвижения ППК в теле раннего зародыша (McLaren, 1981). Этот вывод был сделан на основании изучения результатов цейтраферной киносъемки передвижения ППК по различным подложкам (Heasman et al., 1977). Авторы* пришли к выводу, что ППК перемещаются в зародыше ксенопуса не амебоидными движениями, а другим способом, образуя филоподии и выпячивая, а затем волнообразно сокращая все тело клетки. Необходимо исследовать движения гоноцитов млекопитающих при помощи современных, более совершенных способов, сочетая гистологические и прижизненные методы (рис. 4). Примечательно, что и на гистологических препаратах зародышей мыши (Clark, Eddy, 1975), крысы (Семенова-Тян-Шанская, 1976), а также человека (Семенова-Тян-Шанская, 1973; Кожухарь, 1980) в гоноцитах видны псевдоподии. Этот вопрос заслуживает дальнейшего изучения. Не ясны механизмы, определяющие путь гоноцитов к зачатку гонад. Полагают, что это определяется какими-то химическими сигналами, исходящими от зачатка гонад. Эти сигналы, по-видимому, лишены видовой специфичности.
/. Происхождение и свойства первичных половых клеток 23 Так, если трансплантировать часть раннего зародыша мыши на хориоаллан- тоис зародыша цыпленка, то гоноциты мыши будут передвигаться по направлению к зачатку гонад цыпленка (Rogulska et al., 1971). Однако миграция ППК к зачатку гонады является отнюдь не единственным примером передвижения зародышевых клеток на значительные расстояния. Это же осуществляется клетками нервного гребня, образующими меланобласты или нейробласты, стволовыми клетками гемопоэтических органов и другими клетками зародыша. Передвижение клеток направляется в этих случаях воздействиями тех субстратов (т. е. межклеточных структур, базальных мембран, поверхностей других клеток и т. д.), по которым или между которыми эти клетки передвигаются. По-видимому, при продвижении ППК по кишке существенное значение имеет направляющее действие (contact guidance) базальных мембран и какие-то иные взаимодействия ППК с эпителием (Clark, Eddy, 1975; Wylie et al., 1979). Сформулированы представления об участии в процессе, направляющем ППК по определенному пути, специфического атрактанта, вырабатываемого зачатком гонад человека, скорее всего целомическим эпителием, покрывающим половые валики («зачатковым эпителием») (Семенова-Тян-Шанская, 1973; Кожухарь, 1980). Однако не исключено, что в этом процессе принимает участие циклическая АМФ или другие вещества, которые отнюдь нельзя считать специфическими атрактантами (McLaren, 1981). Вопрос о том, привлекают ли зачатки гонад у зародышей млекопитающих гоноциты путем хемотаксиса, как это показано для передвижения гоноцитов к половым валикам зародышей цыпленка, остается открытым и требует экспериментальных доказательств. В равной степени остается неясным, каким образом гоноциты «находят» кратчайший путь к зачаткам гонады. Следует иметь в виду, что отнюдь не все ППК, начиная передвижение от места своей первичной локализации, попадают в зачаток гонады. Многие из них избирают ложный путь. Поэтому ППК можно найти у зародышей мышей в составе кожной эктодермы, в мезенхиме, окружающей нервную трубку, в кишке, в мезонефросе, в надпочечнике и в других эктопических местах. Предполагают, что не попавшие в гонады ППК могут сохраняться не только в антенатальном, но и в постнатальном периоде и служить источником опухолей (см.,например: Гайар, 1961). Однако эта довольно распространенная среди онкологов точка зрения лишена строгих экспериментальных доказательств. Так, например, если трансплантировать в переднюю камеру глаза зачаток задней кишки мышиного зародыша, в котором находится много мигрирующих ППК, то хотя в передней камере глаза этот зачаток осуществляет далеко идущий типичный морфогенез, однако через 3—4 дня гоноциты из трансплантата исчезают (Ozdzenski, 1969). Эти и другие опыты (Ozdzenski, 1972; Ozdzenski et al., 1976) свидетельствуют о малой вероятности непосредственного преобразования «заблудившихся» гоноцитов, задержавшихся вне зачатка гонад, в стволовые опухолевые клетки (см. подробнее раздел 4 гл. II). У мышевидных грызунов период миграции занимает короткое время. Хронология этого периода уточнена в недавней работе (прежнюю литературу см.: Дыбан, Баранов, 1977). Показано, что на 7.75—8 сут ППК у зародышей мыши находятся в задней части первичной полоски, в корне аллантоиса и в желточной энтодерме, на 8.5 сут — в энтодерме желточного мешка и энтодерме зачатка задней кишки, на 9.5 сут часть из них все еще находится в задней кишке, а часть попадает в ее брыжейку. В половых валиках ППК обнаруживаются на 10.5— 11.5 сут (Tam, Snow, 1981).
24 Часть первая. Предзародышевое развитие 1.3.2. ПРОЛИФЕРАЦИЯ ППК У человека мигрирующие ППК не проявляют существенной митотической активности, и их размножение в основном осуществляется после завершения миграции, т. е. в зачатке гонады (Семенова-Тян-Шанская, 1973). Однако, по-видимому, это связано с более продолжительным пребыванием ППК в гонадах зародышей человека до того, как они превратятся в оогонии. У других млекопитающих проявляется высокая митотическая активность мигрирующих гоноцитов. Так, по данным Минц и Рассел (Mintz, Russell, 1957), первоначально небольшое количество гоноцитов у зародышей мышей 8-суточ- ных (накануне начала миграции) к 11-сут (внедрение в гонаду) увеличивается более чем в 50 раз. В последнее время было более точно подсчитано количество гоноцитов во время их миграции (8.5—10.5 сут) и после заселения гоноцитами зачатка гонад у зародышей мыши A1.5—13.5 сут). Установлено, что уже во время миграции ППК активно пролиферируют и после того, как они попадают в гонаду, и их размножение продолжается. При этом не обнаруживается различий в темпах пролиферации ППК, имеющих женский или мужской пол (табл. 2). Таблица 2 Количество первичных половых клеток у зародышей мышей в возрасте от 8.5 до 13.5 сут (по: Tarn, Snow, 1981) Возраст зародышей (сут) 8.5 9.5 10.5 11.5 13.5 Число исследованных зародышей 7 8 13 15 14 Среднее число половых клеток на зародыш 145±17 364 + 32 1012±69 2999 ±184 2579 ±2276 Половые клетки у зародышей мужского пола 1074+120 3316 + 279 27 123 + 3020 женского пола 997+163 2854 + 414 22 463 + 3230 1.3.3. ОРГАНИЗАЦИЯ ЯДЕР И ФУНКЦИОНАЛЬНАЯ АКТИВНОСТЬ ГОНОСОМ И АУТОСОМ В ППК ППК являются диплоидными клетками, т. е. у эмбрионов женского пола они имеют XX, а у мужского — XY гоносомы. Поэтому можно допустить различия в клеточном фенотипе и поведении гоноцитов мужского и женского пола. Однако это предположение лишено фактических доказательств. Мнение некоторых авторов о том, что ППК, имеющие XY набор, двигаются быстрее и поэтому скорее заселяют зачатки гонад (U.takoji, Hsu, 1965), находится в противоречии с данными о том, что в период миграции (т. е. вне гонад) и в зачатке гонад количество ППК не зависит от их генетического пола (Tarn, Snow, 1981). Осмысливание этих данных во многом зависит от решения вопроса о функциональной активности гоносом в ППК женского и мужского пола. Пока еще не получено убедительных фактических данных, позволяющих судить о функциональном состоянии Y-хромосомы в гоноцитах, и остается неизвестным, генетически активна или инертна эта хромосома в ППК- Вместе с тем в профазных ППК, находящихся вне гонады и в гонаде зародышей крыс мужского пола, зачастую видна небольшая гетерохроматизированная хромосома. Неизвестно, служит ли это морфологическим выражением генетической инактивации Y-хромосомы или представляет собой гетерохроматизированный сегмент какой-то аутосомы. Высказана гипотеза (см. гл. III, раздел 5), постулирующая активность если
/. Происхождение и свойства первичных половых клеток 25 не всей, то по крайней мере части Y-хромосомы, необходимой для развития зачатка гонады по мужскому полу (McLaren, 1983b). Однако не выяснено, необходимо ли это для пролиферации и миграции гоноцитов. Остается спорным и вопрос об активности Х-хромосом у первичных половых клеток женского пола, находящихся вне зачатка гонад. Напомним, что в соматических клетках зародышей женского пола этих стадий развития уже произошла компенсация дозы генов Х-хромосомы, т. е. одна из Х-хромосом гетерохромати- зирована и генетически инертна (см. гл. III). Состояние Х-хромосомы у ППК мыши современными методами не изучалось. Однако двадцать лет тому назад была опубликована работа (Ohno, 1964), в которой высказано предположение, что гоноциты, находящиеся в желточном мешке у зародышей мыши женского пола, имеют одну гетерохроматизирован- ную Х-хромосому. Следует подробнее остановиться на этой единственной работе, посвященной Х-хромосомам ППК мыши, так как и по настоящее время именно на нее ссылаются тогда, когда обосновывают распространившееся в зарубежной литературе представление о том, что во вне гонадных ППК одна из Х-хромосом генетически инертна, т. е. в гоноцитах произошла такая же компенсация дозы генов Х-хромосомы, как и в соматических клетках зародыша (McLaren, 1981, 1983а, 1983b; Monk, 1981; Epstein, 1986). В работе Оно (Ohno, 1964), представляющей собою краткое изложение доклада на Международной тератологической конференции, написано: «Каждая профаза у эмбрионов мыши, имеющих 2—3 пары сомитов, содержит четко заметную конденсированную Х-хромосому. Первичные половые клетки в желточном мешке у эмбрионов женского пола также содержат одну конденсированную Х-хромосому» (Ohno, 1964, с. 36). Необходимо иметь в виду, что эта работа была выполнена на давленных препаратах, т. е. при помощи весьма несовершенной техники, применявшейся на заре становления современной цитогенетики. На давленных препаратах зародышей млекопитающих невозможно судить о состоянии хромосом «в каждой профазе» и трудно четко разграничить ядра соматических клеток и ядра первичных половых клеток. Следует обратить внимание на фотографии, иллюстрирующие это краткое сообщение, так как на них не представлено профазное ядро внегонадного гоноцита. На фотографиях показано несколько ядер: анафаза предполагаемой ППК из зачатка гонады зародыша мыши 12-го дня (рис. 1), профаза оогонии из зачатка гонады зародыша 14-го дня развития (рис. 2а), в которой не видна гетерохроматизированная Х-хромосома, и профаза «будущей фолликулярной клетки», т. е. соматической клетки зачатка гонады этого же зародыша (рис. 2в), в которой четко видна одна гетерохроматизированная хромосома. На других микрофотографиях в этой работе представлены пахитена, диплотена и диакинез. Таким образом, автором не показаны ядра ППК, находившиеся вне гонад, и приводятся профазные ядра клеток, входящих в состав зачатка половой железы у мышей 14-го дня развития, когда одни оогонии митотически делятся, а другие — подготавливаются к вступлению в мейоз. На этих сроках развития зародышей мышей в ядрах оогонии может либо сохраняться одна гетерохроматизированная Х-хромосома, либо происходить реактивация ранее инертной Х-хромосомы (см. гл. III). Следовательно, данная работа Оно никак не может служить основанием для вывода о том, что у зародышей мышей женского пола в гоноцитах, расположенных вне гонад, одна Х-хромосома гетерохроматизирована, т. е. генетически инактивирована. Между тем именно такой вывод делается на основании этой работы (см., например: McLaren, 1981, 1983а, 1983b; Epstein, 1986). Состояние Х-хромосом во внегонадных ППК мыши и других млекопитающих животных не изучалось современными (цитологическими, цитогенетическими
26 Часть первая. Предзародышевое развитие или биохимическими) методами. Вместе с тем в нашей лаборатории была выполнена серия работ (Семенова-Тян-Шанская, Паткин, 1977, 1978, 1982; Паткин, 19806) на ранних зародышах человека, у которых состояние Х-хромо- сом в оогенезе оценивали как на гистологических препаратах, так и на суховоз- душных препаратах взвеси изолированных клеток из зачатка гонад при помощи чувствительного метода люминесцентной микроскопии и других цитологических методов, позволяющих с уверенностью выявить наличие или отсутствие тельца полового хроматина — надежного показателя гетерохроматизации одной Х-хромосомы в клетках человека (но не в клетках мышей). Установлено, что при окрашивании препаратов флюорохромом Хёхст 33258 ядра гоноцитов, находящиеся в стенке желточного мешка, четко отличаются от ядер соматических клеток. Ядра гоноцитов имеют более крупные размеры, округлую форму и центрально расположенное большое ядрышко. В отличие от ядер мезенхимных и энтодермальных клеток в ядрах гоноцитов не выявляется структурный гетерохроматин, нет в ядрах гоноцитов и тельца полового хроматина. Вместе с тем в ядрах соседних соматических клеток тельце полового хроматина заметно очень четко (Паткин, 19806). В процессе миграции к зачаткам гонад в ППК сохраняется такой же тип организации ядер, несколько напоминающий ядра бластомеров ранних зародышей. Мигрирующие гоноциты в ядрах не содержат тельце полового хроматина (рис. 5). Когда гоноциты внедряются между клетками эпителия, покрывающего зачаток гонады, в этот период изменяется организация их ядер, что, по-видимому, связано со взаимодействием гоноцитов и клеток эпителия. Описаны ультраструктурные изменения как гоноцитов, так и эпителия, покрывающего гонаду, свидетельствующие о каких-то взаимодействиях, природа которых остается невыясненной (Кожухарь, 1980). После того как гоноциты заселяют зачаток гонады, что происходит у зародышей человека на 35 сут развития, т. е. после их кратковременного пребывания в составе эпителия, покрывающего половые валики, они мигрируют в подлежащую мезенхиму зачатка гонады (Семенова-Тян-Шанская, 1969, 1973). На этой стадии происходят последовательные изменения ядер гоноцитов, в ядрах обнаруживается структурный гетерохроматин, вначале в виде трех околоядрышко- вых хромоцентров, а затем в форме сплошного яркого люминесцирующего ободка вокруг ядрышка. После этого появляются тонкофибриллярные структуры в ядре и возникает глыбка полового хроматина. Таким образом, появление тельца полового хроматина, т. е. гетерохромати- зация одной Х-хромосомы, знаменует превращение гоноцитов в оогонии и это происходит тогда, когда ППК уже находятся в зачатке гонад. В оогониях человека тельце полового хроматина продолжает выявляться на протяжении всего периода их размножения. Когда оогонии завершают предмейотический митоз и клетки вступают в так называемую прелептотеновую стадию, т. е. начинают мейоз, только в это время в ядрах исчезает тельце полового хроматина и обе Х-хромосомы становятся генетически активными (Семенова-Тян-Шанская, Паткин, 1982). Гетерохроматизированная, т. е. генетически инертная, Х-хромосома была выявлена цитогенетическим методом в ядрах оогонии в зачатках гонад 12—13-суточных зародышей мыши (Gartler, 1983). Однако затем, при подготовке к мейозу, т. е. на прелептотенной стадии, обе Х-хромосомы в женских половых клетках в гонадах зародышей мыши становятся изохроматичными и генетически активными (см. гл. IV). Таким образом, описанная в нашей лаборатории динамика изменения состояния Х-хромосомы в оогониях человека хорошо .итадает с результатами исследования состояния Х-хромосомы в оогониях мыши.
/. Происхождение и свойства первичных половых клеток 27 Однако остается все же неясным, можно ли распространить выводы, сделанные в отношении ядер гоноцитов человека, расположенных вне зачатка гонады, на внегонадные гоноциты других млекопитающих, в том числе и мышей. Ответ на этот вопрос имеет важное значение, так как в случае подтверждения данных, полученных на гоноцитах зародышей человека, это будет означать, что гоноциты женского пола отличаются от соматических клеток зародыша тем, что в них значительно позже наступает инактивация одной Х-хромосомы. Все приведенные выше данные говорят о том, что пока еще нельзя сделать определенный вывод о зависимости фенотипа и поведения гоноцитов от набора гоносом, так как функциональное состояние гоносом у ППК мужского и женского пола нуждается в дальнейшем изучении. Вместе с тем получены данные, свидетельствующие о влиянии аутосомных генов как на миграцию, так и пролиферацию гоноцитов. Эти наблюдения проведены на зародышах мышей, несущих мутацию Steel (символ SL) и Dominant spotting (символ W) (подробнее об этой мутации было сказано в разделе 2.3 этой главы). Показано, что при мутации W/W в основном нарушается пролиферация гоноцитов, хотя несколько тормозится и их миграция (Mintz, Russell, 1957). При мутации Steell (локус S1 в аутосоме 10) у гетерозигот S1/+ отмечаются некоторые признаки анемии, но эти мыши жизнеспособны и плодовиты. У гомозигот (S1/S1) возникает тяжелая анемия, и такие плоды обычно погибают на 15—16 дни развития. В зачатках гонад у гомозиготных зародышей S1/S1 очень мало или нет первичных половых клеток, в гонадах у гетерозиготных эмбрионов (S1/+) их значительно меньше, чем в норме (Bennett, 1956). У мутантных эмбрионов S1/S1 возникает нормальное количество ППК и не происходит нарушения их миграции, но пролиферация гоноцитов вскоре прекращается и поэтому в зачаток гонады их попадает очень мало, а гоноциты, находящиеся в половых железах, вскоре погибают (McCoshen, McCallion, 1975). Хотя по характеру своего конечного эффекта на гоноциты, меланобласты и клетки гемопоэтического ряда обе мутации сходны, однако между ними существуют принципиально важные различия. Исследуя поведение мутантных меланоцитов и клеток гемопоэтического ряда (McCuskey, Meineke, 1973), пришли к выводу, что у W/Wv зародышей экспрессия мутации происходит на уровне самих клеток, тогда как при мутации S1/ST это определяется окружением клеток. Таким образом, гемопоэтические клетки W/Wv не могут пролиферировать, находясь в окружении нормальных клеток, тогда как мутантные меланоциты и гемопоэтические клетки SI/ST пролиферируют нормально не только в окружении нормальных клеток, но даже.в теле у зародышей W/Wv. Высказано предположение, что и мутантные гоноциты S1/S1 могут нормализоваться в окружении нормальных соматических клеток (McLaren, 1981). Это интересное предположение заслуживает экспериментальной проверки. Если оно справедливо, т. е. при мутации W/W дефектными являются сами гоноциты, а экспрессия мутации S1/S1 зависит от соматических элементов, окружающих мутантные гоноциты, то это может служить объяснением образования терато- карцином из трансплантированных зародышей, несущих эти мутации (Mintz et al., 1978), и отсутствие формирования опухолей из трансплантированных в эктопические места зачатков гонад мутантных зародышей Sl/Sl (Stevens, 1967). Подробнее эти вопросы разобраны в разделе 4 гл. П. Не только мутации, но и действие цитостатиков может привести к нарушению пролиферации мигрирующих гоноцитов и их гибели. Более того, получены данные о том, что под влиянием митомицина С (ингибитора синтеза ДНК) нарушаются самые ранние стадии обособления линии половых клеток. Так, после действия митомицина С на 7-суточных зародышей количество гоноцитов у 8.5—9.5-суточных резко уменьшается, но затем оставшиеся гоноциты интен-
28 Часть первая. Предзародышевое развитие сивно пролиферируют, причем это происходит во время миграции ППК по дорсальной брыжейке, т. е. с 9.5 до 10. 5 сут. Полной компенсации не происходит, т. е. в гонадах плодов и новорожденных обнаруживается мало половых клеток (Snow, Tarn, 1979; Tam, Snow, 1981). Другой цитотоксический препарат — алкилирующий агент милеран (миэлосан, бусульфан) наиболее сильно повреждает 1 оноциты крыс, когда они пролиферируют в. зачатке гонад, т. е. на более поздней стадии (Merchant, 1975; Merchant-Larios, Coello, 1979). Повреждение половых клеток и ряд уродств у крыс под влиянием миэлосана детально описано в работах Александрова A965). Этот препарат приводит и к гибели гоноцитов в желточном мешке зародыша крысы (Sobis, Vanderputte, 1976). Таким образом, для действия различных ингибиторов синтеза ДНК периоды повышенной чувствительности гоноцитов могут не совпадать. Это укладывается в общие закономерности реакции соматических клеток зародышей, т. е. различных зачатков органов и тканей на химические агенты (Дыбан, 1974, 1977), хотя чувствительность половых и соматических клеток зародыша зачастую может не совпадать. Подводя итоги данной главы, необходимо обратить внимание на ряд вопросов, изучение которых имеет важное значение для понимания механизмов образования первичных половых клеток и оценки их свойств. Нет сомнения в том, что линия половых клеток обосабливается у эмбрионов млекопитающих на стадиях, когда начинается гаструляция и формируются зародышевые листки, т. е. значительно позже, чем в эмбриогенезе у других позвоночных. Вместе с тем у более ранних зародышей млекопитающих, по-видимому, существуют коммитированные клетки-предшественники, от которых начинается линия половых клеток. Есть основания думать, что, по всей вероятности, обособление линии половых клеток является таким же процессом цитодифференцировки, как и процессы, которые приводят к выделению клонов клеток, из которых возникают зачатки различных тканей и органов. Существенно поэтому выяснить, являются ли клоны, из которых возникает линия половых клеток, группами, сохраняющими полипотентность, т. е. обладающими свойствами стволовых клеток, либо при выделении первичных половых клеток они коммитируются и приобретают способность образовывать линию половых клеток, но утрачивают способность осуществлять соматические цитодифференцировки, т. е. не могут преобразовываться в те клетки зародыша, которые являются стволовыми клетками различных тканей и органов. Если справедливо первое предположение, то тогда первичные половые клетки можно расценивать как группы клеток, «ускользнувших от дифференцировки», т. е. сохраняющих полипотентность в зародыше, остальные клетки которого дифференцируются в ходе развития. Для решения данного вопроса существенные данные можно получить при изучении свойств первичных половых клеток при их культивировании in vitro. Однако этот подход пока еще использовать не представляется возможным, так как первичные половые клетки, выделенные из зародыша, не пролиферируют in vitro (De Felici, McLaren, 1982, 1983). Второй подход более реален, и он сводится к изучению взаимосвязи первичных половых клеток со стволовыми клетками раннего зародыша или стволовыми клетками тератокарцином. Если первичные половые клетки действительно обладают полипотентностью, то из них должны образовываться тератокарциномы и по своим свойствам они должны быть близки или идентичны стволовым полипотентным клеткам раннего зародыша. В следующей главе рассматриваются данные вопросы и оцениваются эти свойства первичных половых клеток млекопитающих.
//. Отношение первичных половых клеток к стволовым клеткам 29 Глава II ОТНОШЕНИЕ ПЕРВИЧНЫХ ПОЛОВЫХ КЛЕТОК К СТВОЛОВЫМ КЛЕТКАМ ТЕРАТОКАРЦИНОМЫ И ПОЛИПОТЕНТНЫМ СТВОЛОВЫМ КЛЕТКАМ РАННЕГО ЗАРОДЫША * В качестве одного из доказательств происхождения первичных половых клеток за счет «ускользнувших от дифференцировки» клеток и свидетельства полипотентности первичных половых клеток нередко приводят тератомы и тератокарциномы. Поэтому целесообразно остановиться на этих опухолях и, обратив внимание на стволовые тератокарциномные клетки, рассмотреть их возможную связь с первичными половыми клетками, а также оценить роль первичных половых клеток в возникновении этих опухолей. II. 1. РАЗЛИЧИЯ МЕЖДУ ТЕРАТОМАМИ И ТЕРАТОКАРЦИНОМАМИ В онкологии давно известны опухоли человека, напоминающие дезорганизованный зародыш, аномально развивающийся в атипичном месте. В зависимости от строения и степени злокачественности такие опухоли называют по-разному — тератоидами, тератомами, тератокарциномами и эмбриокарциномами (Stevens, Pierce, 1975). Подобного рода опухоли описаны у многих животных, их получают и в опытах на мышевидных грызунах. Тератомам животных и человека посвящено очень много работ. Более старую литературу можно найти в монографиях Фалина A946), Бреслера A964). Тератомам птиц посвящены работы Михайловского A931) и Фалина A946). Тератомы и тератокарциномы мышевидных грызунов широко используются в современной биологии развития для изучения самых различных вопросов, в том числе и молекулярных механизмов эмбриональной цитодифференцировки. Тератомам и тератокарциномам посвящено много зарубежных экспериментальных работ, труды нескольких международных конференций и симпозиумов и ряд обзоров (см., например: Stevens, 1967, 1975b; 1983; Damjanov, Solter, 1974; Solter, Damjanov, 1979; Martin, 1983). В отечественной литературе опубликован лишь один обзор (П. А. Дыбан, 1979), в котором приведены современные сведения о тератомах и тератокарциномах мышевидных грызунов. Нередко термины тератомы и тератокарциномы используют как синонимы. Однако этого не следует делать, так как между данными опухолями существуют определенные различия, хотя по своему строению они и могут быть весьма сходными. По определению Стивенса и Пирса (Stevens, Pierce, 1975), тератомы — доброкачественные опухоли, состоящие из дифференцированных тканей и остатков зачатков органов. Тератокарциномы — злокачественные опухоли, которые содержат как дифференцирующиеся ткани, достигшие разной степени созревания, так и полипотентные стволовые опухолевые клетки. Поэтому как в тератомах, так и в тератокарциномах можно найти хаотически расположенные участки хряща, кости, железы, эпителиальные кисти, мышцы, нервную ткань, включая и ганглии, и другие производные различных зародыше- Глава написана в соавторстве с П. А. Дыбаном.
30 Часть первая. Предзародышевое развитие вых листков и зачатков. Однако наряду с этими структурами в тератокарциноме находятся и участки, занятые недифференцированными, активно пролифери- рующими клетками. Эти полипотентные клетки составляют самоподдерживающуюся популяцию стволовых клеток, за счет которых в тератокарциноме осуществляются различные типы тканевых дифференцировок и благодаря которым тератокарциномы хорошо перевиваются. Следует иметь в виду, что приведенные выше различия относятся к сформированным опухолям. На начальных же стадиях развития тератомы также содержат полипотентные недифференцированные клетки. Однако по мере развития опухоли эти клетки вступают в те или иные дифференцировки и исчезают из тератомы. Таким образом, различия между тератомами и тератокарциномами становятся заметными не сразу, а лишь в сформированных опухолях. Более того, в тератокарциномах, имевших значительное количество стволовых полипотент- ных клеток, эта популяция клеток по непонятным причинам может исчезнуть и тогда тератокарцинома превратится в тератому, т. е. утрачивает свойства злокачественной опухоли. Следует иметь в виду, что в тератокарциноме злокачественными опухолевыми клетками являются только стволовые полипотентные недифференцированные клетки, тогда как их производные лишены этих свойств, что в особой степени относится к клеткам, осуществившим в тератокарциноме терминальные соматические дифференцировки (Solter, Damja- nov, 1979). П.2. СТВОЛОВЫЕ КЛЕТКИ ТЕРАТОКАРЦИНОМЫ И ЛИНИИ ПОЛИПОТЕНТНЫХ КЛЕТОК, ВЫДЕЛЕННЫЕ ИЗ РАННИХ ЗАРОДЫШЕЙ МЫШЕЙ Тератокарциномные стволовые клетки можно выделить из опухоли и культивировать их in vitro. Получено много линий тератокарциномных клеток, длительное время поддерживающихся в различных лабораториях. Каждая из линий или сублиний тератокарциномных клеток имеет стойкие фенотипические особенности, и в том числе ту или иную потенцию. Есть линии нуллипотентных тератокарциномных клеток, которые не способны вступать в дифференцировку. Есть линии, которые дифференцируясь дают ограниченное количество определенных клеточных типов, а также существуют полипотентные тератокарциномные линии, способные давать начало самым разнообразным типам соматических клеток (см. подробнее: Graham, 1977; Martin, 1983). Если трансплантировать под кожу мышам тератокарциномные клетки, длительное время развивавшиеся in vitro, то у животных возникают солидные тератокарциномы, состоящие из различных тканевых производных. В некоторых случаях образуются малодифференцированные опухоли, в которых преобладают пролиферирующие клетки, напоминающие стволовые тератокарциномные клетки. При введении стволовых тератокарциномных клеток в брюшную полость образуются так называемые эмбриоидные тельца — асцитная форма тератокарциномы. Однако если ввести полипотентные тератокарциномные клетки в бластоцисту или если их агрегировать с бластомерами нормального зародыша, то формируются химерные зародыши, развитие которых может закончиться рождением жизнеспособных химерных мышей, в составе различных органов которых будут потомки тератокарциномных клеток (Mintz, Illmensee, 1975). Хотя у части таких животных образуются опухоли, однако, как правило, большинство потомков тератокарциномных клеток утрачивают свойства опухолевой клетки, т. е. их фенотип нормализуется. К этому вопросу мы еще вернемся.
//. Отношение первичных половых клеток к стволовым клеткам 31 Стволовые тератокарциномные клетки принято называть эмбриональными кар- циномными (или эмбриокарциномными) клетками и обозначать их буквами ЕС или ЕСС (от англ. Embryonal carcinoma cells) (Graham, 1977; Evans, 1981; Martin, 1981). Недавно удалось получить из ранних нормальных зародышей линии полипотентных эмбриональных клеток, используя для этого два приема. Из бластоцист изолировали внутренние клеточные массы (ВКМ) и культивировали ВКМ в среде, в которой до этого росли тератокарциномные клетки (так называемая кондиционированная среда). При многократном перепассировании были получены культуры полипотентных эмбриональных клеток (Martin, 1981). Второй прием сводился к увеличению массы ВКМ в бласто- цистах, используя диапаузу. Для этого беременных мышей овариоэктомировали и вводили им прогестерон или синтетические прогестины. При этом происходило торможение имплантации, но в бластоцистах продолжалась пролиферация клеток в ВКМ, хотя и в замедленном темпе. Затем бластоцисты извлекали из матки и культивировали in vitro на подложке клеток, обработанных мито- мицином С. После этого из бластоцист удаляли ВКМ и многократно перепассировали эти клетки, используя при каждой субкультуре подложку обработанных митомицином С клеток (Evans, Kaufman, 1983). В обоих случаях авторы получили стабильные линии эмбриональных клеток, сохраняющих полипотент- ность. В самое последнее время удалось упростить эту процедуру и существенно ускорить выделение линий полипотентных эмбриональных клеток из бластоцист мыши (Axelrod, 1984; Doetschman et al., 1985). В ряде лабораторий уже получено много стабильных линий полипотентных эмбриональных клеток, причем не только от нормальных, но и от партеногенети- ческих зародышей (Kaufman et al., 1983), а также зародышей мышей, несущих некоторые летальные мутации (Magnuson, Epstein, 1981; Magnuson 1983). Линии эмбриональных полипотентных клеток хорошо культивируются in vitro, сохраняя при этом нормальный кариотип (Evans, Kaufman, 1983), они обладают способностью осуществлять различные типы цитодифференцировок, если для этого созданы определенные условия (Evans, Kaufman, 1983; Doetschman et al., 1985). Если ввести в бластоцисту или агрегировать с нормальными бластомерами клетки, длительно культивировавшиеся in vitro, то они принимают участие в развитии различных органов и тканей. Получены жизнеспособные мыши-химеры, в организме которых обнаружены потомки линий полипотентных эмбриональных клеток, , осуществившие различные типы нормальных цитодифференцировок, в том числе и образовавшиеся нормальные половые клетки (Evans, Kaufman, 1983; Bradley et al., 1984). Однако если ввести мышам под кожу полипотентные клетки, полученные от нормальных зародышей, то у мышей возникают солидные тератокарциномы. Если же ввести эти клетки внутрибрюшинно, образуется асцитная форма тератокарциномы (эмбриоидные тельца) (Evans, Kaufman, 1983; Doetschman, et al., 1985). Таким образом, хотя эти клетки были выделены из нормальных зародышей, а не из тератокарцином, они образуют тератокарциному (т. е. злокачественную опухоль), если попадают в эктопические места. Наряду с этим они способны участвовать в эмбриогенезе и осуществлять нормальные цитодифференцировки, если эти клетки попадают в состав тела зародыша. Следовательно, линии полипотентных клеток, полученных от нормальных зародышей, во многом напоминают стволовые тератокарциномные (эмбрио- карциномные) клетки. Для того чтобы подчеркнуть, что полипотентные линии клеток, изолированные непосредственно из ранних зародышей, различаются своим происхождением от линий стволовых клеток тератокарциномы (ЕС-клеток), но что они одновременно во многом сходны с ЕС-клетками, их обозначают
32 Часть первая. Предзародышевое развитие буквами ЕК [первые буквы фамилий исследователей Эванса (Evans) и Кауфмана (Kaufman)) (Evans, Kaufman, 1983). Предлагают также обозначать линии полипотентных эмбриональных клеток, полученные из доимплантацион- ных зародышей, буквами ESC (от англ. Embryonic stem cells), подчеркивая этим, что они произошли от полипотентных стволовых клеток, реально существовавших в раннем зародыше еще до всех процедур, необходимых для выделения in vitro линий таких клеток (Martin, 1981; Doetschman et al., 1985). II.3. КЛЕТОЧНЫЙ ФЕНОТИП СТВОЛОВЫХ ТЕРАТОКАРЦИНОМНЫХ КЛЕТОК (ЕС-КЛЕТОК), ПОЛИПОТЕНТНЫХ ЭМБРИОНАЛЬНЫХ КЛЕТОК (ЕК-КЛЕТОК) И ПЕРВИЧНЫХ ПОЛОВЫХ КЛЕТОК (ППК) При помощи различных антисывороток, выявляющих специфические антигены клеточных поверхностей, сравнивался клеточный фенотип различных линий эмбриокарциномных клеток, линий дифференцированных клеток, полученных из тератокарцином, а также бластомеров доимплантационных зародышей мышей и первичных половых клеток (см. обзоры: Graham, 1977; Jacob, 1977). В табл. 3 приведены обобщенные данные из работы Грэма (Graham, 1977), согласно которым были найдены общие антигены (например, антиген F9) как в клеточных поверхностях бластомеров доимплантационных зародышей, так и во всех линиях эмбриокарциномных клеток. Эти данные позволили прийти к выводу о сходстве по ряду признаков, в том числе и по антигенным свойствам, ЕС-клеток с клетками ранних зародышей (Graham, 1977). В работах с моноклональными антителами этот вывод был в основном подтвержден (Evans, 1981; Brulet et al., 1983). Так, используя моноклональные антитела (М 1.22.25), которые различают детерминанты антигена Форссмана, было показано (Stern et al., 1978), что этот антиген экспрессируется как в те- ратокарциномных клетках, так и в бластомерах морулы, во внутренней клеточной массе бластоцисты, а также в первичных половых клетках (гоноцитах). Однако при исследовании спектра белкового синтеза при помощи двумерного электрофореза обнаружено, что паттерны полипептидов, синтезируемые ЕС- клетками, бластомерами раннего зародыша и изолированными клетками ВКМ бластоцист, хотя и схожи, но и отличаются между собой (Dewey et al., 1978; Failly-Crepin, Martin, 1979; Lovell-Badge, Evans, 1980). Ближе всего спектр белков, синтезируемых ЕС-клетками, напоминает белки первичной эктодермы (эпибласта) ранних постимплантационных зародышей (Evans, Kaufman, 1983; Martin, 1983). Более детальное сопоставление полипептидов ЕС-клеток, первичных половых клеток (изолированных из зачатков гонад мышиных зародышей), а также района 5.5-суточного зародыша, состоящего из эпибласта вместе с первичной энтодермой, показало как сходство, так и различие в спектре белков, синтезируемых этими клеточными популяциями. Больше всего совпадали белки ЕС-клеток и эпибласта 5.5-суточного зародыша, сохранявшего связь с клетками первичной энтодермы (Evans, 1981; Evans, Kaufman, 1983). Был сделан вывод, что первичные половые клетки и клетки ВКМ 3.5-суточ- ных бластоцист не гомологичны друг другу (рис. 4) и не могут считаться гомологами ЕС-клеток, т. е. что ЕС-клетки скорее всего являются гомологами клеток эпибласта 5.5-суточных зародышей (Papaioannou, 1979; Evans, Kaufman, 1983) Однако при исследовании 6.5-суточных зародышей при помощи моноклональных антител (М 1.22.25 антисыворотки) оказалось, что детерми-
► Ik I i 1 14 4 л ? ■Я|: % t1 "I |f ' :■■■ ;/ '^ ■ £ *fs Т7л J в' 'И: : I € "■: Л \\ * #1 ::::/ Рис. 4. Прижизненные микрофотографии изолированных первичных половых клеток (ППК) и ранних зародышей мышей на стадии бластоцисты. ППК образуют псевдоподии, размеры ППК значительно меньше, чем размеры бластомеров. 1 — первичные половые клетки, 2 — ранняя бластоциста, 3 — поздняя бластоциста. Все фотографии сняты при одном увеличении (об. Х32, ок. ХЮ), интерференционный фазовый контраст по Номарскому. '/j I Зак. 2318
i 1 'V , J, **" #4- T ^ | •* 15* » I gf V ^^ .Jap >ii«j^K--. ■■■■■■ "" I 4 S ■w- * -1< id '• :■' «If ,■#'*»« A J? ж * * m * if m Щ ,«»» УО ff 12 Рис. 5. Микрофотографии изолированных гоноцитов, оогоний и мейоцита, полученных из яичников плодов крыс 17—19 сут развития. Показаны ядра нормальных оогоний и ядра оогоний, дегенерирующих во время митоза. Последовательные стадии дегенерации оогоний во время митоза полностью соответствуют картинам, описанным под названием «предмейотическая конденсация — деконденсация хромосом». Суховоздушные препараты, окрашенные по Романовскому—Гимза. На препаратах сохранились только ядра, так как клетки вначале подвергались действию гипотонии., а затем фиксировались. Все ядра сфотографированы при одном увеличении (об. X 100, к. юп, ок. X 10). / — интерфазное ядро гоноцита, 2 — интерфазное ядро оогони-и, 3—7 — нормальное митотическое деление оогоний, 3 — препрофаза, 4 — ранняя профаза, 5 — поздняя профаза, 6 — прометафаза, 7—метафаза, 8—12 — дегенерация оогоний в ходе предмейотического митоза, 8 — дегенерация во время прометафазы! 9 — дегенерация во время профазы, 10— дегенерация во время метафазы (пикнотизирующиеся хромосомы еще состоят из двух хроматид, общее количество хромосом равно 42, т. е. диплоидному набору крысы); // — две дегенерирующие оогоний, из которых одна погибает во время профазы (слева), а вторая (справа) — во время метафазы (в этой клетке остатки мета- фазных хромосом имеют вид темных, сильно пикнотизированных телец, количество которых соответствует диплоидному набору, т. е. 42); 12 — слева находится ядро оогоний, дегенерирующей во время профазы митоза, а справа — ядро мейоцита на стадии прелептотены (это ядро гомогенно).
if • з tpt Рис. 6. Начало второго деления созревания ооцитов мыши. Тотальные препараты яйцеклеток, окрашенных лакмоидом. Фазовый контраст. / —общий вид овулировав- шей яйцеклетки (метафаза 2, мейотическое веретено располагается в тангенциальном положении в краевой зоне цитоплазмы, об. Х16, ок. ХЮ), 2 — мейотическое веретено метафазы 2 под большим увеличением (заметна бочкообразная форма веретена и скопления перицентриолярного материала на полюсах веретена, об. Х40, ок. ХЮ), 3 — то же, что и на фото 2, но сфокусировано на мейотических хромосомах (нити веретена прикрепляются к отдельным участкам перицентриолярного материала, об. Х40, ок. Х16), 4 — телофаза второго мейотического деления (в центре мейотического веретена находятся «срединные тела», образующие полоску; на полюсах веретена располагаются хромосомы в виде конденсированных скоплений; об. X 16, ок. X 10), 5 — поздняя телофаза второго мейотического деления (начало формирования пронуклеусов; в центре мейотического веретена сохраняются «срединные тела», имеющие вид двух полосок; об. Х40, ок. ХЮ).
Jfc* 'Г и» da я. Рис. 7. Суховоздушные препараты ооцитов мыши, созревавших in vitro 5 ч. Ооциты достигли стадии диакинеза, причем один из бивалентов гетерохроматизирован, т. е. окрашивается темнее, чем другие биваленты. Возможно, что этот бивалент (указан стрелкой) представлен Х-хромосомами. Окраска по Романовскому—Гимза, об. X 100 м. ими., ок. X 16, / — ранний диакинез, 2 — поздний диакинез.
«""С/ vW J.**% SB mi ^ ...... . . ... .'4|: Ф т ш $* t Рис. 9. Завершение второго деления созревания ооцитов мыши после искусственной активации яйцеклеток. Суховоздушные препараты окрашены по Романовскому—Гимза. Об. хЮО, м. имм., ок. Х10. Препараты Е. М. Нониашвили. / — овулировавшая яйцеклетка до активации (метафаза 2 мейоза; в пластинке находится 20 хромосом, диад). 2 — через 15 мин после активации яйцеклетки (начало расхождения хромосом; некоторые диады еще состоят из двух хроматид, так как в них еще не началось расхождение). 3 — через 30 мин после активации яйцеклетки (расхождение хроматид и образование двух групп, стрелкой указана хромосома — диада, в которой хроматиды еще не разошлись). 4 — через 45 мин после активации яйцеклетки (завершение анафазы и образование двух групп хроматид, одна из которых, показано стрелкой, более спира- лизована). 5 — через 70 мин после активации яйцеклетки [поздняя анафаза; деконденсация хромосом и визуализация в каждой хроматиде светлее окрашивающихся центромерных районов; в каждой группе содержится 20 хромосом (хроматид); стрелками показаны ассоциации негомологичных хроматид центромерными районами]. 6 — через 90 мин после активации яйцеклетки (телофаза, конденсация хромосом и начало формирования пронуклеусов; одна хроматида сегрегировалась аномально и не вошла в состав ядер, показано стрелкой).
■/ Ш * :#"«("§ 4 Рис. 10. Завершение второго мейотического деления, и формирование второго полярного тельца. Тотальные препараты яйцеклеток мыши, активированных этиловым спиртом. Окраска, лакмоидом, фазовый контраст, об. Х40, ок. X 10. Препараты Е. М. Нониашвили. / — радиальное расположение веретена, плоскость контрактильного кольца совпадает с серединой мейотического веретена («срединные тела» показаны стрелкой), 2 — поворот веретена и формирование борозды, отделяющей второе полярное тельце. 3 — завершение поворота веретена (поздняя телофаза, мейотические хромосомы представляют спирализован.ную группу без ядерной оболочки). 4 — начало формирования пронуклеуса. (хроматин диспергируется и вокруг него видна ядерная оболочка). 5 — завершение формирования пронуклеуса (в пронуклеусе четко заметно одно крупное первичное проядрышко и ядерная оболочка). 6—тот же препарат (сфокусировано на втором полярном тельце, в котором заметно, пикн.отическое ядро)..
Рис. 11. Формирование пронуклеусов в партеногенетическом зародыше мыши, диплоидизированном цитохалазином Д. В результате действия цитохалазина подавляется цитотомия, второе полярное тельце не выделяется и оба набора хромосом остаются в яйцеклетке и преобразуются в сестринские пронуклеусы. Тотальные препараты, окрашенные лакмоидом, фазовый контраст, об. Х40, ок. Х10. Препараты Е. М. Нониашвили. / — начало формирования пронуклеусов, в которых еще видны спирализованные хромосомы (стрелкой указаны остатки «срединных тел»), 2 — сформировавшиеся пронуклеусы содержат по одному крупному первичному проядрыщку (оба пронуклеуса располагаются в краевой зоне цитоплазмы, причем остатки мейоти- ческого веретена занимают тангенциальную плоскость; «срединные тела» показаны стрелкой; один пронуклеус несколько больше другого), 3 — миграция и сближение пронуклеусов (остатки мейотического веретена располагаются между пронуклеусами в радиальной плоскости, т. е. поворот веретена осуществился несмотря на сохранение обоих пронуклеусов в яйцеклетке и их расположение в тангенциальной плоскости), 4 — профаза первого деления дробления (тесное сближение сестринских пронуклеусов, в каждом из которых профазные хромосомы ассоциируются с проядрышком).
V* ,* ' - ч ■ ■ I i :«h.f ifW0**% '4 -■'" ■■■■i: ■' ^^p^ H » Рис. 13. Первое деление дробления партеногенетических зародышей мышей, диплоидизированных цитохалазином Д. Суховоздушные препараты, окраска по Романовскому—Гимза, об. X 100, м. имм., ок. X 16. J — профаза или ранняя прометафаза (различная спирализация сестринских наборов заметна при сравнении фото 1 и 2). 2 — второй набор хромосом в том же препарате яйцеклетки, что и на фото 1. 3 — поздняя прометафаза (четко заметна гетероцикличность сестринских хромосомных наборов, каждый из которых состоит из 1 9 хромосом; в одном наборе хромосомы более короткие и окрашены темнее, показано стрелкой).
//. Отношение первичных половых клеток к стволовым клеткам 33 Таблица 3 Экспрессия антигенов на поверхности эмбриокарциномных клеток, их различных дифференцированных производных и поверхности клеток ранних зародышей-мышей (по: Graham, 1977) Тип клеток I. Эмбриокарциномные клетки (ЕС-клетки) Нуллипотентные F9 PCCI (полипотентные ЕС-клетки) РСС4 то же LTI (ЕС-клетки от овариальных тератом мышей LT (SV) II. Линии дифференцированных клеток из те- ратокарцином PCDI — миобласты сердца PCD2 — миобласты скелетных мышц PCD3 — фибробласты Endo — энтодермаль- ные клетки висцерального листка желточного мешка PYS2 — клетки париетальной энтодермы III. Зародыши мышей Неоплод отворенные яйцеклетки Одноклеточная зигота 16-клеточная морула Бластоцисты: ВКМ ТЭ F9 + + + + — — — — — — — + + + Экспрессия антигенов РСС4 — + + + — — — — — — — — + Endo — следы ± ? + — — + + — — + ? ■> Н-2 — — — ? ± + + + + — — — ? — 1а — ? — 7> ? ■> ? ? ? — — ? ? нанты антигена Форссмана уже не выявляются в клетках эпибласта, хотя четко обнаруживаются в первичных энтодермальных клетках (Stinnakre et al., 1981; Evans, Kaufman, 1983). Так как нет оснований сомневаться в том, что именно эпибласт является родоначальником всех клеточных линий зародыша и что первичная энтодерма не принимает участия в образовании тела зародыша (Gardner, Papaioannou, 1975, см. также гл. IX), трудно однозначно истолковать эти неожиданные результаты. Авторы предлагают несколько объяснений (Stinnakre et al., 1981; Evans, Kaufman, 1983). Согласно первой альтернативе, экспрессия этого антигена клеточной поверхности является существенным показателем дифференцировки клеток и их детерминации. Так как именно клетки первичной эктодермы (а не энтодермы) являются эмбриональным гомологом тератокарциномных клеток, то, следовательно, эти антигенные свойства уже утрачены в эктодерме 6.5-суточного зародыша, хотя были в клетках эпибласта на более ранних стадиях развития. Вторая альтернатива исходит из предположения, что наличие данного антигена в клеточной поверхности 3 А. П. Дыбан
34 Часть первая. Предзародышевое развитие не отражает степень детерминации клеток. Полагают, что на более поздних сроках происходит дедифференцировка клеток эктодермы и ее клетки становятся способными трансформироваться как in vitro, так и in vivo в предшественники ЕС-клеток (Evans, 1981). Антигенные свойства и паттерны белкового синтеза линий ЕК-клеток только начали изучаться. Опубликованы ссылки на незавершенные работы, предварительные результаты которых говорят в пользу поразительного сходства ЕК- линий с некоторыми линиями ЕС-клеток (Evans, Kaufman, 1983). Однако этот вывод требует подтверждения на более обширном материале, так как приходится иметь в виду, что различные линии ЕС-клеток могут отличаться между собой по антигенным свойствам и по другим фенотипическим признакам (Ga- chelin, 1978; Brulet et al., 1983). Тем не менее целесообразно привести данные о том, что линии ЕК-клеток и ЕС-клеток обладают одними и теми же антигенами клеточных поверхностей, выявляемыми анти S/KR сывороткой (Stern et al., 1975), анти IMA сывороткой и моноклональными антифорссмановскими М 1.22.25 антителами (Stern et al., 1975, 1978; Evans, Kaufman, 1983), а также моноклональной антисывороткой SD4. При двумерном электрофорезе белков, меченных 355-метионином, все характерные полипептиды, описанные для ЕС-клеточных линий (Lovell-Badge, Evans, 1980), были найдены и в ЕК-клеточных линиях (Evans, Kaufmann, 1983). ЕС-клетки имеют в диаметре 12—14 мкм. Ультраструктурно они напоминают недифференцированные эмбриональные клетки. Они содержат крупное ядро, состоящее преимущественно из эухроматина, и большое ядрышко. Для них свойственно высокое ядерно-цитоплазматическое отношение. Цитоплазма представлена узким ободком, окружающим ядро, она лишена большинства органоидов, но содержит много свободных рибосом и лишь единичные митохондрии. Электронно-микроскопические исследования говорят о том, что ультраструктура ЕС-клеток не зависит от их происхождения, т. е. одинакова в тестикуляр- ных, овариальных тератокарциномах или тератокарциномах, произошедших из трансплантированных зародышей (Damjanov, Solter, 1975; Solter, Damja- nov, 1979). Примечательно, что по микроскопическому и субмикроскопическому строению ЕС- и ЕК-клетки также весьма сходны (Martin, 1981; Evans, Kaufman, 1983; Kaufman et al., 1983), но отличаются от гоноцитов, так как имеют меньшие размеры, не способны к активным движениям и имеют иную организацию ядер (Martin, 1981; Robertson et al., 1983). Хотя ЕС-клетки и ЕК-клетки содержат щелочную фосфатазу (Martin, 1981), однако этот фермент существенно отличается от щелочной фосфатазы гоноцитов (Bernstine et al., 1973; Graham, 1977). Таким образом, есть все основания считать, что клеточный фенотип ЕС- и ЕК- линий весьма сходен, если не идентичен. Что касается первичных половых клеток, то они лишь отдаленно напоминают тератокарциномные (ЕС-клетки) и полипотентные клетки, полученные из ранних зародышей (ЕК-клеточные линии). К этому вопросу мы еще вернемся при рассмотрении происхождения тератокарцином (см. раздел 4 этой главы). Весьма интересен вопрос о том, существуют ли в нормальном зародыше стволовые клетки, от которых in vitro или in vivo могут взять начало как линии ЕК-клеток, так и линии ЕС-клеток. Некоторые авторы считают, что выделение линий ЕК-клеток из культивировавшихся in vitro ранних зародышей само по себе говорит о том, что в раннем эмбриогенезе в норме существует клон таких полипотентных клеток (Evans, 1981; Martin, 1981). Однако трудно объяснить, почему из зародышей более поздних сроков, достигших стадии яйцевого цилиндра, не удается получить линии ЕК-клеток, хотя при культивировании эпибласта таких зародышей происходит интенсивная пролиферация
//. Отношение первичных половых клеток к стволовым клеткам 35 недифференцированных клеток (см., например, рис. 1 из работы: Evans, 1981). Необходимо также учитывать, что именно из зародышей на стадии яйцевого цилиндра легче всего возникают тератокарциномы, если трансплантировать такие зародыши взрослым животным в эктопические места. Высказано предположение, что у зародышей мышей не старше 5.5 сут в эпи- бласте весьма непродолжительное время существует очень небольшой клон полипотентных стволовых клеток. При культивировании in vitro BKM, изолированных из бластоцист, создаются благоприятные условия для увеличения количества клеток в этом клоне; они пролиферируют, и, таким образом, возникает линия ЕК-клеток. У более поздних зародышей таких клеток либо нет, либо они находятся в таком окружении, что при культивировании in vitro эпибласта от зародышей, достигших стадии яйцевого цилиндра, клон стволовых полипотентных клеток не пролиферирует, а теряется. Однако хотя из более поздних зародышей не удается получить линии ЕК-клеток, если их культивировать in vitro, но легко образуется тератокарцинома, если трансплантировать зародыши в эктопические места (Solter, Damjanov, 1979; Evans, 1981; Evans, Kaufman, 1983). Это говорит о том, что стволовые тератокарциномные ЕС-клетки могут возникать не только из тех клеток ранних зародышей, из которых образуются in vitro линии ЕК-клеток, но и за счет других клеток, сохранившихся у зародыша на стадии яйцевого цилиндра. При трансплантации разных частей яйцевого цилиндра тератокарциномы образуются только из районов, содержавших эпибласт (первичную зародышевую эктодерму) (Diwan, Stevens, 1976). Поэтому есть основания полагать, что при развитии в эктопическом месте именно на клетки эпибласта оказываются какие-то воздействия со стороны реципиента (т. е. взрослого животного), из-за которых эти клетки трансформируются в полипотентные стволовые тератокарциномы, приобретая свойства, близкие к ЕК-клеточным линиям, образующимся при развитии in vitro более ранних зародышей. К сожалению, известно, к чему сводятся эти воздействия на эмбриональные клетки как при культивировании in vitro изолированных BKM, так и при развитии зародышей в эктопических местах. Это весьма перспективное направление исследований еще не начало разрабатываться. Не только ЕС-клетки, но и ЕК-клетки в одних условиях проявляют себя как нормальные эмбриональные клетки, а в других условиях служат источником злокачественной опухоли. Однако если ЕС-клетки, т. е. стволовые клетки тератокарциномы, исходно обладают свойствами опухолевых клеток и могут потерять эти свойства, попав в состав нормального зародыша, то ЕК-клетки приобретают свойства опухолевых клеток, попав под кожу, под капсулу почки, тестикула, селезенки, т. е. малигнизируются при развитии в этих эктопических местах. Эта точка зрения подтверждается рядом доводов и прежде всего существенными различиями в поведении ЕС-клеток и ЕК-клеток, если эти клетки попадают в состав нормального зародыша (инъецируются в бластоцисту либо агрегируются с нормальной морулой). ЕК-клетки очень часто включаются в развитие, и их производные находят в различных органах, в том числе и в половых железах, где за счет потомков ЕК-клеток в 20 % случаев образуются нормальные половые клетки (Evans, Kaufman, 1983; Bradley et al., 1984). Кроме того, среди химер, полученных при участии ЕК-клеток, не отмечено случаев, когда бы животные имели тератокарциномы или другие опухоли (Bradley et al., 1984). Иная картина наблюдается после введения в ранний зародыш ЕС-клеток. В этих случаях химеры рождаются реже, так как ряд зародышей погибает в ходе развития. По-видимому, ЕС-клетки не только не всегда нормализуются, но могут даже оказывать токсическое действие на зародыш. Во-вторых, частота химе- ризма различных органов значительно реже, чем у химер, полученных при
36 Часть первая. Предзародышевое развитие участии ЕК-клеток, причем потомки ЕС-клеток почему-то попадают в одни, но не в другие органы (Papaioannou et al., 1978). Так описан случай, когда потомков ЕС-клеток не было найдено в мозге, печени, волосяных фолликулах и в селезенке, хотя другие части тела содержали эти клетки (Papaioannou et al., 1975). В другом случае потомки ЕС-клеток составили 75% легкого, но их не было найдено в других органах химеры (Illmensee, Mintz, 1976). В-третьих, из ЕС-клеток, как правило, не возникает линия половых клеток. Описано рождение лишь одного химерного самца, у которого половые клетки образовались за счет потомков ЕС-клеток (Stewart, Mintz, 1981), однако это наблюдение требует подтверждения. По-видимому, ЕС-клетки, имея аномалии кариотипа, элиминируются на определенных стадиях гаметогенеза, скорее всего во время мейоза, т. е. из них не могут образовываться полноценные гаметы. В-четвертых, у родившихся химер нередко возникают опухоли, т. е. ЕС-клетки, попав в состав нормального зародыша, отнюдь не всегда утрачивают свойства опухолевых клеток. В табл. 4 представлены сводные результаты опытов, которые показывают частоту возникновения тератокарцином у химер, созданных при участии ЕС-клеток. Эти опухоли были замечены уже при рождении животных, они быстро увеличивались в размере, и их экспоненциальный рост дал основание думать, что эти опухоли начали образовываться еще во внутриутробном периоде. В этих случаях группы ЕС-клеток сохранили свойства тератокарцином- ных клеток, т. е. нормальные клетки оказали на ЕС-клетки недостаточное влияние и не смогли изменить их путь развития (Papaioannou et al., 1978, 1979). В других случаях опухоли образовывались у взрослых химер и были представлены типичными злокачественными опухолями (фибросаркомой и рабдомио- саркомой) (Papaioannou et al., 1978) или аденомой поджелудочной железы (Illmensee, Mintz, 1976). Таблица 4 Образование опухолей у химерных мышей, полученных после введения в бластоцисты ЕС-клеток (по: Papaioannou, 1979) Тератокарци- нома или ЕС-линия in vivo ОТТ6050 ОТТ6050 Т72484 in vitro PSAI NG2 TK/- SIKR OSB PCC3(A)I C17 OC15SI C86 6145b Fl/9 nF опухоль OTT5568 OTT6050 OTT5568 OTT6050 17 OTT6050 86 145b (СЗНХ Xl29)/9 оисхождение возраст зародыша (сут) 6.5 6.5 спонтанные овариаль- ные тератомы 3.5 3.5 3.5 6.5 6.5 6.5 7.5 6.5 6.5 линия мышей 129 129 LT/Sv 129 129 129 129 СЗН 129 СЗН СЗН FI (СЗНХ Х129) Результаты исследования животных число мышей 60 164 74 44 31 44 86 77 — 74 201 18 число химер 1 31 8 10 3 1 4 13 — 6 0 0 с опухолями 0 6 3 0 0 0 1 8 — 6 0 0 с ЕС- клетками 0 1 ? 0 0 0 0 1 — 6 0 0
//. Отношение первичных половых клеток к стволовым клеткам 37 Полагают, что в этих случаях ЕС-клетки первоначально были направлены на нормальные пути развития. Однако потомки ЕС-клеток тем не менее сохранили свойства злокачественных опухолевых клеток и проявили эти свойства в постнатальном периоде, образовав опухоли, природа которых соответствовала тому органу, где находились ЕС-клетки (Papaioannou, 1979). Как уже было сказано выше, в отличие от ЕС-клеток потомки ЕК-клеток, попав в состав нормального зародыша и прийимая участие в развитии, не образуют опухоли (Evans, Kaufman, 1983; Bradley et al., 1984). Оценивая эти наблюдения, следует учитывать, что изучение химер, полученных за счет ЕК- клеток, начато недавно. Вместе с тем есть некоторые основания считать, что ЕК-клетки не обладают свойствами опухолевых клеток, но могут малигнизи- роваться, попадая в эктопические места. Так как при трансплантации ЕК-клеток под кожу возникают тератокарци- номы, а при введении в брюшную полость из ЕК-клеток можно получить эмбрио- идные тельца, было бы весьма интересно узнать, как скоро ЕК-клетки приобретают типичные свойства ЕС-клеток. Еще более существен вопрос о роли онкогенов в трансформациях клеточного фенотипа стволовых тератокарцином- ных клеток, а особенно стволовых полипотентных клеток ранних зародышей. Этот вопрос был сформулирован давно (см.: Graham, 1977), однако и поныне на него нет ответа. Между тем, если окажется, что ЕС-клетки содержат протоонкогены, активация и экспрессия которых приводит к появлению свойств злокачественных опухолевых клеток, и что подобное же явление имеет место при малигнизации ЕК-клеток, то тогда вся проблема тератокарцином приобретает иной смысл. В этом случае основное значение приобретут поиски факторов, индуцирующих экспрессию онкогенов в дифференцированных эмбриональных клетках, и расшифровка механизмов, предотвращающих это явление. Эти вопросы тесно смыкаются с основной задачей современной экспериментальной онкологии, и есть основания надеяться, что в этом направлении вскоре будут достигнуты существенные успехи. Недавно опубликованы работы, в которых в стволовые тератокарциномные клетки интродуцировали чужеродные клонированные гены (Pellicer et al., 1980; Nicolas, Berg, 1983), а также исследовалась экспрессия в этих клетках некоторых ретровирусов и аденовирусов (Jaenisch, 1983; Sleigh, 1985) (см. гл. X. 2). Необходимо подчеркнуть, что именно это направление исследований, вероятно, приблизит понимание механизмов, изменяющий клеточный фенотип как ЕС, так и ЕК-клеток, когда эти клетки попадают в разные условия. II.4. УЧАСТИЕ ПЕРВИЧНЫХ ПОЛОВЫХ КЛЕТОК В ОБРАЗОВАНИИ ТЕРАТОКАРЦИНОМ В отношении происхождения тератом и тератокарцином нет единой точки зрения, хотя уже давно сформулированы две основных гипотезы генеза этих опухолей: согласно одной из них тератомы и тератокарциномы образуются из первичных половых клеток, тогда как другие авторы полагают, что источником этих опухолей служат недифференцированные полипотентные соматические эмбриональные клетки (см: Stevens, 1967, 1975а, 1975b). Дискуссия по этому вопросу продолжается и в настоящее время, что во многом связано с различной природой тератокарцином, возникающих в зачатках семенников, либо формирующихся из зародышей, трансплантированных в эктопические места. Рассмотрим поэтому раздельно тератомы и тератокарциномы, образующиеся из зародышей или из зачатков половых желез.
38 Часть первая. Предзародышевое развитие Н.4.1. ТРАНСПЛАНТАЦИЯ ЗАРОДЫШЕЙ В ЭКТО ИЧЕСКИЕ МЕСТА При трансплантации зародышей мышевидных грызунов под капсулу почки, тестикула, селезенки, в переднюю камеру глаза и др. эктопические места образуются тератомы и (или) тератокарциномы, причем тип опухоли зависит от ряда факторов. Во-первых, важны видовые особенности зародышей. Так, трансплантация зародышей крыс (Skreb et al., 1976) или хомяков (Solter, Damjanov, 1979) приводит к формированию тератом, но не тератокарцином. При трансплантации зародышей мышей могут возникать либо тератомы, либо тератокарциномы (Solter et al., 1970; Stevens, 1975a). Во-вторых, существенное значение имеет возраст трансплантированных зародышей. Как правило, тератокарциномы возникают из ранних зародышей, а тератомы при трансплантации более старших зародышей. Тератокарциномы описаны после трансплантации доимплантационных зародышей мышей (от стадии 2—4 клеток и до бластоцисты), однако частота этих опухолей не превышала 30 % (Stevens, 1967, 1975b; П. А. Дыбан, 1979). Возможно, что это было обусловлено техническими трудностями трансплантации, т. е. связано с повреждением ранних зародышей. Кроме того, нередко вокруг трансплантата отмечались кровоизлияния из-за инвазивного роста трофобласта. Если же перед трансплантацией удалить трофобласт, то из изолированных внутренних клеточных масс легче получить тератокарциномы (Solter, Damjanov, 1979). После трансплантации постимплантационных зародышей опухоли возникают чаще, чем после трансплантации доимплантационных зародышей. Если удаляют трофобласт и его производные, то при трансплантации постимплантационных зародышей почти во всех случаях образуются тератокарциномы. Максимальный эффект наблюдается, если трансплантировать зародыши мышей в возрасте 6—7 сут, находившихся на стадии 2—3 слойного зародышевого цилиндра (Damjanov, Solter, 1974; Stevens, 1975b). Если же трансплантировать зародыши более старшего возраста (8—9 дней развития), то из трансплантата формируются не тератокарциномы, а тератомы, состоящие из зрелых тканей и остатков органов (Damjanov et al., 1971; Stevens, 1975b, 1975c). Следовательно, после стадии яйцевого цилиндра эмбриональные клетки не могут пролиферировать, оставаясь при этом полипотентными, а именно поэтому в трансплантатах зародышей более старшего возраста не возникают стабильные клоны ЕС-клеток. Было показано, что если трансплантировать изолированную эктодерму (эпибласт) 6-суточного зародыша мыши, то образуется тератокарцинома, содержащая ЕС-клетки. Этого не наблюдалось при трансплантации других частей такого зародыша, включая и первичную энтодерму (Diwan, Stevens, 1976). Таким образом, тератокарцинома возникает при условии, если в трансплантате были некоммитированные клетки эпибласта. В-третьих, способность образовывать тератокарциномы или тератомы зависит от генотипа трансплантированного зародыша. Найдены линии мышей, зародыши которых пермессивны или непермессивны по отношению к терато- карциноме. Так, при трансплантации 6—7 суточных зародышей мышей линий 129, СЗН, А/Не, СВА, BALB/c частота тератокарцином составляет от 50 до 70 %, тогда как после трансплантации зародышей такого же возраста от мышей линии C57/BL/6, AKR менее 5 % трансплантатов образуют тератокарциномы, причем эти опухоли плохо перевиваются, так как содержат мало ЕС-клеток (Damjanov, Solter, 1974; Solter, 1983). В-четвертых, результат зависит от генотипа животного-реципиента, которому трансплантировали зародыши (Solter, 1983). Так, если трансплантиро-
//. Отношение первичных половых клеток к стволовым клеткам 39 вать зародышей—мышей C57BL под капсулу почки мышей той же самой линии, то, как правило, образуются тератомы. Если же осуществить эти опыты с зародышами мышей линии СЗН, то у сингенных реципиентов отмечается высокая частота образования тератокарцином. Однако если трансплантировать зародыши мышей C57BL гистосовместимым гибридным мышам (C57BL/CH3, F), то из зародышей всегда образуются тератокарциномы (Evans, 1981). Описанные выше опыты показывают, что из зародышей того же самого возраста и генотипа могут образовываться либо тератомы, либо тератокарциномы. Это позволяет считать, что под влиянием каких-то факторов (существовавших в организме мыши-реципиента) в трансплантированных зародышах может появляться устойчивая популяция стволовых тератокарциномных клеток либо такие полипотентные клетки исчезают из опухоли. Для рассматриваемого нами вопроса наиболее важными являются следующие факты: во-первых, в тератомах и тератокарциномах, возникших из трансплантированных зародышей, никогда не образуются половые железы или зрелые гаметы. Не найдено в них и первичных половых клеток. Во-вторых, первичные половые клетки появляются у зародышей мышей (при их нормальном развитии) по крайней мере через сутки после той стадии, когда трансплантированные в эктопические места зародыши уже утрачивают способность образовывать тератокарциномы. Следовательно, опыты по трансплантации зародышей в эктопические места, в результате которых были получены тератокарциномы и (или) тератомы, никак не могут свидетельствовать о том, что стволовые тератокарциномные клетки возникают из первичных половых клеток. Более того, есть прямые наблюдения, противоречащие этому предположению. Так, если трансплантировать в переднюю камеру глаза зачаток кишки зародыша мыши на той стадии, когда в этом зачатке находятся мигрирующие гоно- циты, то осуществляется органотипический рост, т. е. дифференциация всех тканевых компонентов кишки. Однако через 3—4 дня гоноциты исчезают из зачатка кишки, и в тканях не образуются скопления недифференцированных клеток, напоминающих ЕС-клетки (Ozdzenski, 1969). Следовательно, мигрирующие первичные половые клетки не могут трансформироваться в полипотентные ЕС-клетки и не выживают в зачатке кишки, т. е. вне зачатка гонады. Об этом же говорят и попытки культивировать первичные половые клетки мыши in vitro. Показано, что первичные половые клетки обладают определенным сродством, т. е. устанавливают контакты с клетками Сертоли или фолликулярными клетками при их совместном культивировании (De Felici, Siracusa, 1985). Однако первичные половые клетки, изолированные из зачатков гонад 11.5— 13.5-суточных зародышей мыши, не пролиферировали в различных культурных средах как без подложек, так и на монослое из стромы зачатка гонады (Evans, 1981; De Felici, McLaren, 1983). О том, что тератокарциномы не возникают из первичных половых клеток, говорят и результаты опытов по трансплантации под капсулу тестикула мышиных 6-суточных эмбрионов. Были трансплантированы как нормальные зародыши, так и гомозиготные мутантные зародыши W/W и S1/S1, при которых нарушается пролиферация первичных половых клеток и их жизнеспособность (Mintz et al., 1978). Хотя обе эти мутации приводят к гибели половых клеток, т. е. к полной стерильности гонад, однако из трансплантированных мутантных зародышей образовались тератокарциномы. При помощи изоферментов фосфо- глюкомутазы доказано, что тератокарциномы действительно произошли из клеток, гомозиготных по мутации W/W (Mintz et al., 1978). Не имеют отношения первичные половые клетки и к возникновению тератом у крыс. Так,были проведены опыты с желточным мешком интактных зародышей
40 Часть первая. Предзародышевое развитие крыс либо зародышей, подвергавшихся действию цитостатика (препарат миеле- ран или бусульфан), избирательно уничтожавшего гоноциты, но не повреждавшего в этих дозах соматические клетки зародыша крыс. Для того чтобы получить из желточного мешка тератомы, проделывалась следующая процедура: у крыс вскрывали стенку матки, удаляли зародыши, но оставляли на месте плаценту, а желточный мешок выводили в брюшную полость через разрез стенки матки. Через несколько дней после этой операции в эктопически расположенном желточном мешке начиналась пролиферация клеток, а затем формировались тератомы, состоящие из тканевых производных всех трех зародышевых листков (Sobis, Vanderputte, 1976). Эта же картина отмечена и после действия миелосана, т. е. желточные мешки зародышей крыс, лишенные первичных половых клеток, тем не менее образовали тератомы, композиционный состав которых не отличался от тератом, возникших из интактных желточных мешков (Sobis, Vanderputte, 1976). Все приведенные выше данные позволяют прийти к однозначному выводу, что при трансплантации зародышей в эктопические места ни тератомы, ни те- ратокарциномы не возникают за счет первичных половых клеток. Наиболее вероятным источником стволовых тератокарциномных клеток являются клетки эпибласта той стадии развития E.5—6.5 сут), пока из эпибласта еще не выделились дефинитивные зародышевые „листки. Именно из эпибласта этих стадий развития могут возникать устойчивые клоны полипотентных стволовых клеток тератокарциномы. Из эктодермы зародышей более поздних сроков развития также могут образоваться клоны полипотентных клеток, однако они не обладают стабильностью, т. е. вступают в дифференцировку. Вероятно, поэтому при трансплантации более поздних зародышей в конечном итоге образуются не тератокарциномы, а тератомы, утратившие популяции полипотентных стволовых клеток. 11.4.2. ТЕРАТОМЫ И ТЕРАТОКАРЦИНОМЫ СЕМЕННИКОВ У человека до 96 % опухолей семенников представляют собой семиномы, эмбриональные карциномы, хориокарциномы, тератокарциномы и тератомы. Полагают, что одни из этих опухолей происходят из половых клеток, утративших полипотентность (например, семиномы, состоящие из клеток, которые напоминают сперматогонии), а другие, весьма злокачественные опухоли (например, эмбриональные карциномы или хориокарциномы) возникают из полипотентных клеток, малигнизировавшихся на,ранних стадиях развития (Stevens, 1967). Уместно отметить, что термин «тератокарцинома» часто применяется именно для обозначения одной из форм опухоли семенников человека, состоящей как из недифференцированных эмбриональных клеток, так и дифференцированных тканей (Melicow, 1955, цит. по: Stevens, 1967). В клинической онкологии существует мнение, что у человека все виды опухолей семенников имеют одинаковое происхождение и, различаясь степенью злокачественности и уровнем дифференциации, могут изменять свое строение и свойства. Полагают, что вначале в семеннике возникает эмбриональная карцинома. Эта злокачественная опухоль может изменять строение и превращаться в хориокарциному — также весьма злокачественную опухоль, в которой, однако, находятся и производные трофобласта. Эмбриональная карцинома может начинать дифференцироваться и становиться тератокарциномой, в составе которой не только сохраняются недифференцированные клетки, но появляются и дифференцированные ткани. Тератокарцинома представляет собой переходную стадию от эмбриокарциномы к доброкачественной опухоли, так как тератокарциномы семенников могут превращаться в тератомы, состоящие из дифференцированных тканей и остат-
//. Отношение первичных половых клеток к стволовым клеткам 41 ков органов (Melicow, 1955; Friedman, 1959, цит. по: Stevens, 1967). Эта точка зрения основана на морфологических исследованиях опухолей семенников человека и требует более убедительных подтверждений. Примечательно, что при исследовании биопсий тестикулов, произведенных у взрослых мужчин по разным показаниям, в некоторых случаях были найдены очаги анаплазии, состоящие из клеток на начальных стадиях малигнизации. Эти предраковые изменения клеток семенника позволяют думать, что терато- карциномы и другие опухоли семенников отнюдь не всегда относятся к врожденным дисплазиям, они могут возникать у взрослого человека из-за тех же мало понятных причин, что и другие злокачественные опухоли. Если это соображение справедливо, то тогда тератокарциномы семенников человека более близки к типичным злокачественным опухолям, чем к тератокарциномам мышевидных грызунов, которые возникают в зачатке семенника еще в эмбриональном периоде развития и, как правило, не являются злокачественными опухолями. Хотя вопрос о том, в какой мере тератокарциномы семенников мышей могут служить адекватной биологической моделью тератокарцином семенников человека, остается весьма спорным, тем не менее определенный прогресс в изучении генеза тестикулярных тератокарцином был достигнут после того, как были найдены мыши со спонтанными опухолями тестикулов, а также получены тератокарциномы тератомы при трансплантации зачатков мужских гонад зародышей мышей. Остановимся вкратце на этих экспериментальных данных. Более подробные сведения о тестикулярных тератомах человека и животных можно найти в обзорах (Graham, 1977; Solter, Damjanov, 1979; Solter, 1983). В работах Стивенса сравниваются тератокарциномы и тератомы семенников человека и мышей (Stevens, 1967, 1975а, 1975b, 1981, 1983). II.4.2.1. Спонтанные тератомы семенников у мышей Спонтанные опухоли семенников встречаются у мышей крайне редко. Впервые тератомы и тератокарциномы семенников были описаны у мышей инбредной линии 129, причем среди 1596 самцов разного возраста обнаружено лишь 16 случаев A %) тестикулярных тератом (Stevens, 1967, 1975а, 1975b). В дальнейшем путем длительной генетической селекции удалось получить сублинию 129 с более высокой A0 %) частотой тестикулярных тератом (Stevens, 1975а). При введении в генотип мышей линии 129 мутантного гена Dominant spotting (символ W), гена Steel (символ S1) была выведена инбреднаялиния 129/ter Sv. У мышей этой линии 30 % самцов имели спонтанные билатеральные тератомы семенников (Stevens, 1975b, 1975c). Генетический анализ показал, что столь высокая частота спонтанных тестикулярных тератом определялась не столько мутантным геном W или геном S1, сколько присутствием еще одного гена, который, однако, остался не идентифицированным (Stevens, 1975b, 1983). Было проведено гистологическое исследование гонад на разных стадиях развития зародышей мышей линии 129/ter Sv и показано (Stevens, 1975a, 1975b), что первые признаки тератокарциномы заметны в зачатке семенника на 15—16 сут развития. Они сводятся к появлению небольших узелков полиморфных клеток, находящихся в составе семенных канальцев. На последующих стадиях развития зародыша A7—19 сут) эти узелки увеличиваются в размерах и, разрывая стенку канальца, врастают в окружающую ткань. По своему строению такое разрастание напоминает дезорганизованную первичную эктодерму (эпибласт) или эктодерму раннего зародыша. Была сопоставлена ультраструктура недифференцированных клеток спонтанных тератокарцином тестикула с клетками Сертоли и сделан вывод, что
42 Часть первая. Предзародышевое развитие злокачественные клетки этой опухоли ближе напоминают первичные половые клетки (имеют упрощенное строение и уменьшенное количество цитоплазмати- ческих органоидов), так как для клеток Сертоли свойствен хорошо развитый аппарат Гольджи и эндоплазматический ретикулум. Поэтому был сделан вывод о происхождении тератом семенника именно из первичных половых клеток (Stevens, 1967). Однако клетки узелков, с которых в семенных канальцах зародышей начинаются разрастания, приводящие затем к тератокарциноме, морфологически сходны не столько с первичными половыми клетками, сколько с недифференцированными соматическими клетками раннего зародыша, а также с некоторыми недифференцированными соматическими клетками зачатка гонады. Необходимо учитывать, что на тех стадиях эмбриогенеза, когда начинается образование тератокарцином, т. е. разрастания семенных канальцев (на 15— 16 сут), в мужских гонадах мышей уже нет первичных половых клеток, а в семенных канальцах находятся популяции просперматогоний-М и просперматого- ний-Т. Эти половые клетки отличаются от тех клеток, которые образуют разрастания стенки канальцев на начальных стадиях возникновения спонтанных тератокарцином. Строение спонтанных тератокарцином тестикула мышей на постнатальных стадиях существенно изменяется. В это время опухоли состоят не только из недифференцированных клеток, но и из участков нейроэпителия и эпителиоподоб- ных пластов, переходящих в разрастающиеся участки, состоящие из беспорядочно расположенных мелких клеток. Эти картины наблюдались в опухолях 3—4 суточных мышат. На более поздних сроках в тестикулярных опухолях начинают преобладать дифференцированные ткани — нейральная ткань, сформированные ганглии, участки хряща, костей, эпителиальные кисты разной формы и строения (Stevens, 1975a, 1975b, 1975c). У взрослых мышей линии 129/ter Sv спонтанные опухоли тестикулов, как правило, доброкачественны и состоят из дифференцированных тканей (нейроэпителия, хрящей, костей, соединительной ткани, желез, эпителиальных кист и др.), т. е. должны быть отнесены к тератомам. Таким образом, спонтанные опухоли семенников мышей линии 129 и ее сублиний на первых стадиях возникновения (у плодов) и начального роста (у новорожденных и молодых мышат) представляют собой тератокарциному и содержат полипотентные стволовые клетки. Однако в дальнейшем эти опухоли утрачивают полипотентные клетки и превращаются в доброкачественные тератомы, состоящие из хорошо дифференцированных тканей. Лишь крайне редко у взрослых мышей обнаруживаются тестикулярные опухоли, содержащие малодифференцированные ЕС-клетки. Эти тератокарциномы хорошо перевивались и метастазировали (Stevens, 1975a). Генез спонтанных тестикулярных тератом мышей остается невыясненным. Высказано предположение, что у мышей линии 129 первичные половые клетки вступают в процесс, сходный с андрогенезом, и вначале образуют популяцию недифференцированных стволовых эмбриональных клеток. Эти клетки детерминируются и формируют зародышевые листки: эктодерму, энтодерму и мезодерму. В результате дальнейшей дифференциации зародышевых листков и образуются тератокарциномы, состоящие из смеси незрелых и хорошо дифференцированных тканей (Stevens, 1975a, 1975b, 1975c). К сожалению, эта стройная гипотеза носит чисто умозрительный характер. Во-первых, остается недоказанным, что мужские половые клетки способны активироваться и вступать в партеногенез (т. е. андрогенез), превращаясь затем в недифференцированные полипотентные стволовые соматические клетки. Существующие факты не только не подтверждают, но и во многом противоречат
//. Отношение первичных половых клеток к стволовым клеткам 43 этому предположению (см. выше). Во-вторых, необходимы более веские доводы для того, чтобы признать гомологами зародышевых листков структуры, обнаруживаемые в тестикулярных тератокарциномах. Микрофотографии, на которые ссылается автор этой гипотезы (рис. 4 и 5 в работе: Stevens, 1975c), отнюдь не могут служить доказательством этого положения. Трудно согласиться с тем, что расположение в тератокарциноме некоторых клеток в форме небольших пластов, отдаленно напоминающих однорядный или многорядный эпителий, достаточно для того, чтобы считать эти структуры гомологами эктодермы или энтодермы раннего зародыша. Цитогенетические исследования спонтанных тератокарцином также не вносят ясности в их генез. Показано, что у мышей тератомы тестикулов состоят из клеток с гоносомами XY (Stevens, 1975b). Однако у человека тератокарци- номы семенников могут состоять как из клеток с гоносомами XY, так и из клеток с гоносомами XX (Solter, Damjanov, 1979). Объяснить эти случаи, а особенно наличие в клетках тестикулярных тератом человека телец полового хроматина крайне трудно. Можно допустить, что тератокарциномы тестикулов человека возникают из половых клеток, завершивших мейоз, однако затем в гаплоидных клетках происходит эндоредупликация ДНК и они диплоидизи- руются. Высказана смелая, но не обоснованная гипотеза об образовании тератокарциномы после слияния («самооплодотворения») двух гаплоидных мужских половых клеток, из-за чего возможны тестикулярные тератокарциномы как с набором XX, так и XY гоносом (Ashley, 1973, цит. по: Solter, Damjanov, 1979). В равной степени можно допустить, что тератокарциномы тестикула возникают при наличии в семенниках двух популяций половых клеток — с XX и XY наборами, т. е. при генетическом химеризме гонад. Все эти предположения лишены фактических доказательств и носят чисто умозрительный характер. Необходимы дальнейшие цитогенетические исследования тестикулярных тератокарцином человека и мышей для того, чтобы разобраться в этих вопросах. В настоящее время можно лишь допустить, что спонтанные тестикулярные тератокарциномы возникают либо из половых клеток, либо из недифференцированных соматических клеток зачатков гонад или, что наиболее вероятно, в результате малигнизации всего зачатка гонады, т. е. процесса, вовлекающего половые и соматические клетки. Именно в пользу последнего предположения говорят результаты исследования тератокарцином, которые можно получить при трансплантации зачатка гонады в эктопические места. И.4.2.2. Образование тератокарциномы после трансплантации зачатков гонады в эктопические места В литературе есть сведения о трансплантации в эктопические места (под капсулу тестикула, почки, селезенку, в переднюю камеру глаза и т. д.) зачатков гонад зародышей различных млекопитающих (мыши, крысы, кролика и др.), и во всех этих случаях наблюдался органотипический рост и дифференциация как соматических элементов, так и половых клеток, т. е. из трансплантатов формировались гонады. При этом не было замечено образования тестикулярных или овариальных тератом либо тератокарцином (см.: Solter, Damjanov, 1979). Если же трансплантировать под капсулу тестикула взрослых мышей половые валики зародышей мышей линии 129 или А/Не либо их гибридов, то в значительном количестве случаев (до 80 %) в трансплантатах возникают тератокарциномы (Stevens, 1975b, 1975c, 1981, 1983). Установлено, однако, что трансформация половых валиков в тератокарци-
44 Часть первая. Предзародышевое развитие ному зависит от ряда факторов. Во-первых, опыты нужно проводить на зародышах указанных линий мышей, ибо из трансплантированных половых валиков зародышей других линий мышей или их гибридов тератокарциномы не возникают. Так, например, после трансплантации под капсулу почки или тестикула половых валиков 12.5—13.5-суточных зародышей мышей линий А или Swiss A из зачатков гонад формировались половые железы, имевшие половые клетки, но в трансплантатах не было малейших признаков образования тератом. Через 30 сут после трансплантации в зачатке мужской гонады сформировались семенные канальцы с половыми клетками, а в зачатке женской гонады — не только примордиальные, но и преантральные и антральные фолликулы, содержащие нормальные яйцеклетки (Ozdzenski et al., 1976). Еще более убедительные результаты получены в работе П. А. Дыбана A979), в которой трансплантированные под капсулу тестикула половые валики зародышей крыс исследовались с первых дней и на протяжении одного-полутора лет после трансплантации. Показано, что из трансплантированного зачатка гонады зародышей мужского пола разных стадий (с 14 по 19 сутки развития) формировались половые железы с хорошо развитыми извитыми семенными канальцами и интерстициальной тканью с лейдиговскими клетками. Семенные канальцы имели типичное строение и состояли из клеток Сертоли и половых клеток, представленных сперматогониями, мейоцитами и немногочисленными сперматидами, а также единичными сперматозоидами. Постепенно сперматогенез в семенных канальцах угасал, хотя митотически делящиеся сперматогонии сохранялись 150 сут и дольше. Затем происходила дегенерация половых клеток, тогда как клетки Сертоли сохраняли жизнеспособность. Ни в одном случае (ни на начальных стадиях, ни на поздних сроках) в трансплантатах не наблюдалось признаков возникновения тератокарциномы. Следовательно, тератокарциномы не образуются из трансплантированных в эктопические места зачатков гонад крыс. Это присуще только зачаткам гонад нескольких линий мышей. Высказано вполне логичное предположение, что у этих мышей произошла мутация какого-то гена или генов, из-за чего и происходит малигнизация зачатка тестикула, попавшего в эктопическое место (Mintz, Fleischman, 1981). Во-вторых, необходимо трансплантировать зачаток гонады от зародышей строго определенного возраста. Для мышей линии 129 — половые валики от 12—12.5-суточных зародышей, а для мышей линии А/Не — 13 сут. Половые валики более ранних зародышей A1 сут) и зародыши более старшего возраста A4 сут и больше) тератом или тератокарцином не образуют, хотя из трансплантата формируются нормальные половые железы, содержащие как соматические, так и половые клетки. В-третьих, следует брать для трансплантации половые валики от зародышей мужского пола. Хотя на этих стадиях развития как зачатки гонад мужского, так и женского пола содержат пролиферирующие половые клетки (проспер- матогонии-М и оогонии) и зачаток гонады еще индифферентен, т. е. в нем не заметно половой дифференцировки соматической части (см. гл. III, раздел 1), однако из трансплантированных в эктопические места половых валиков, зародышей женского пола этих же линий мышей формируется яичник, а тератомы или тератокарциномы никогда не возникают. Полагают это обусловлено тем, что у зародышей женского пола половые клетки в зачатке гонады уже подготовились к вступлению в мейоз или начали мейоз, то'гда как в зачатке гонады мужского пола половые клетки еще пролиферируют, т. е. осуществляют митозы (Stevens, 1975c; Solter, Damjanov, 1979). Однако это предположение не правомочно, так как и при трансплантации половых валиков от зародышей
//. Отношение первичных половых клеток к стволовым клеткам 45 мышей более ранних стадий, когда в зачатках гонад женского пола находится много активно пролиферирующих гоноцитов и оогоний, тератомы или терато- карциномы также не возникают. Связано ли это с тем, что тератомы способны образовывать только мужские, но не женские первичные половые клетки, либо с различной чувствительностью к тератоканцерогенезу соматических клеток зачатка мужской и женской гонады, остается неизвестным. Наконец, немаловажное значение имеет и место, куда трансплантируют половые валики от зародышей мужского пола. Хотя семенник формируется из половых валиков в любом из перечисленных выше эктопических мест, однако тестикулярные тератомы наблюдаются в 80 % при трансплантации половых валиков в тестикул и лишь в 10 % после трансплантации в селезенку и другие места (Stevens, 1975b). Оказалось, что при понижении температуры до +32 °С из культивировавшихся in vitro половых валиков тератомы образовывались значительно чаще, чем из половых валиков, находившихся при +37 °С (Fried- rich et al., 1983). По-видимому, органотипический рост зачатка гонады может происходить при температуре тела мыши, однако для индукции в этом зачатке тератоканцерогенеза необходимо понижение температуры до пермиссивной границы, соответствующей температуре тестикулов, находящихся в мошонке. Непонятно, каким образом пониженная температура приводит к тератоканцерогенезу зачатка гонады мужского пола у одних линий мышей, но не сказывается на развитии зачатков гонад других линий мышей, у которых тератокарциномы тестикулов не возникают. Остается предположить, что мутация, благодаря которой происходит тератоканцерогенез мужских половых желез у указанных линий мышей, температурно-зависимая, подобно многим другим мутациям, описанным в клетках высших позвоночных. Существенное значение для понимания сложного генеза тестикулярных тератом мышей имеет недавно опубликованная работа, в которой под капсулу тестикула взрослых мышей трансплантировались реассоциированные половые и соматические клетки гонад зародышей разных генетических линий (Regenass et al., 1982). В этой работе были использованы зачатки гонад от линий мышей с высокой и низкой частотой образования тестикулярных тератом. Так, после трансплантации половых валиков зародышей мышей линии 129 ХА/Не тератомы возникали в 97 % (от половых валиков 12-суточных зародышей) либо в 85 % (от половых валиков 13-суточных зародышей). Примерно такая частота тератом была найдена при трансплантации половых валиков от зародышей мышей линии ХМ (97 и 85 % соответственно), тогда как после трансплантации половых валиков от зародышей мышей линии XF было лишь 4 и 6 % тератом, а после трансплантации половых валиков от зародышей мышей C57BL/6 тератомы не образовывались. Была произведена диссоциация зачатков гонад зародышей мышей разных линий и разных стадий развития на соматические и половые клетки, а затем клетки реассоциировались (в различных сочетаниях) и полученные реагрегаты трансплантировали под капсулу тестикула, взрослым мышам. Результаты опытов приведены в табл. 3—5. При анализе этих данных необходимо иметь в виду, что популяция соматических клеток, полученных при диссоциация зачатков гонад, не была абсолютно однородной, так как при окраске на щелочную фосфа- тазу в ней обнаружена примесь 1 % половых клеток. Именно этим обстоятельством авторы объясняют результаты некоторых серий опытов, которые не укладываются в их концепцию формирования тератокарцином за счет половых клеток. Однако если вдуматься в результаты подсчета количества половых клеток в зачатках гонад разного возраста (табл. 5), то можно усомниться в обоснованности этого предположения, так как оно означает, что наличие лишь 40 половых клеток A %) может изменить весь ход развития и привести
46 Часть первая. Предзародышевое развитие Таблица 5 Количество половых и соматических клеток в зачатках гонад зародышей мужского пола мышей линии на разных стадиях развития (по: Regenass et al., 1982) Стадия развития зародыша (сут) 12.5 15.5 16.5 17.5 Число клеток в гонадах половые клетки 4.1 Х103 17.1ХЮ' 17.5x10' 23.9X10' соматические клетки П.8ХЮ3 73.3x10' 92.8x10' 108.5x10' Содержание половых клеток в гонаде (%) 25.1 21.1 15.9 18.1 Таблица 6 Образование очагов тератокарциномных клеток после трансплантации в тестикулы диссоциированных и реассоциированных половых и соматических клеток из гонад 12.5-суточных зародышей мышей (по: Regenass et al., 1982) Группа 1 2 3 4 5 6 7 8 Сочетание клеток при реагрегации диссоциированных гонад 12.5-суточных зародышей половые клетки линия мышей 129хАМ 129ХАМ 129ХАМ 129ХА/Не 129xAF 129XAF 129XAF частота те- ратокарцином Высокая Высокая Низкая « соматические клетки линия мышей 129ХАМ 129ХАМ 129ХА/Не 129ХА 120ХА/Не 120ХА 129ХАМ 129ХА/Не частота тератокарцином Высокая « Низкая Высокая Низкая Высокая « Развитие реагрегатов, трансплантированных в текстикулы образовалось гонад 14 13 3 8 12 5 11 4 из них с очагами тератокарциномы число гонад 13 6 2 7 4 0 5 0 число очагов тератокарциномных клеток на одну гонаду От 8 до очень большого количества От 2 до 8 1—9 От 4 до очень большого количества От 1—3 до очень большого количества 0 От 1 до 5 0 Таблица 7 Образование тератокарцином в химерных гонадах, полученных при реагрегации половых и соматических клеток от зародышей разного возраста (по: Regenass et al., 1982) Возраст зачатков гонад (сут) группы 1 2 3 4 5 Развитие реагрегатов в тестикулах половые клетки 12.5 12.5 12.5 15—17 15—17 соматические клетки 12.5 15—17 15—17/12.5 A :1) 15—17 12.5 образовалось гонад 12 12 4 6 12 из них с тератокарциномами число гонад 11 2 4 0 4 количество очагов тератокарцином на одну гонаду От 8 до очень большого количества 1—2 2—13 0 1—3
//. Отношение первичных половых клеток к стволовым клеткам 47 к образованию тератокарциномы из реагрегата, 99 % которого D000 клеток) представлены соматическими элементами гонады. В нормальных зачатках гонад содержание половых клеток колеблется на разных стадиях развития от 25 % до 21 % (на 12.5—15.5 сут) и снижается до 18—15 % на более поздних сроках, что хорошо совпадает и с результатами подсчетов количества половых клеток в зачатках гонад мышей, проведенных другими методами (Tarn, Snow, 1981). Из цифровых данных, приведенных в табл. 6, в которой результаты были сгруппированы иначе, чем в оригинальной таблице (Regenass et al., 1982), хотя при этом цифры, естественно, не изменялись, можно сделать следующие выводы: во-первых, возникновение тератокарцином зависит от генотипа гонадыв целом, а не только от генотипа половых или соматических клеток, что говорит о значении клеточных взаимодействий в тератокарциногенезе зачатка гонады. Так, тератомы могут возникать в случае, если в реагрегате объединены соматические клетки из гонады с высокой частотой опухолей с половыми клетками из гонады с низкой частотой опухолей (группа 7). Тератокарциномы образуются и из одних соматических клеток, полученных из гонады линии мышей, для которых свойственна высокая частота тератоканцерогенеза семенников (группа 2). Всеете с тем соматические элементы не всегда могут оказывать влияние на половые клетки, обусловливая возникновение тератокарцином. Так, при сочетаниях соматических клеток гонады линии мышей 129ХАМ с половыми клетками гонад мышей линии 129XAF тератокарциномы возникают в 50 % случаев (группа 7), а при сочетаниях соматических клеток гонад 129XAF с половыми клетками 129XAF тератомы не образовывались (группа 8). Во-вторых, количество очагов тератокарциномных клеток, как правило, зависело от генотипа половых клеток, а не генотипа соматических клеток гонады. Таким образом, частота опухолей и интенсивность образования очагов тератокарциномных клеток в семенных канальцах определялись разными механизмами. Интересные результаты были получены при ассоциации половых клеток и соматических элементов гонад зародышей разного возраста. Напомним, что при трансплантации интактных половых валиков тератокарциномы образуются лишь из гонад 12—13 сут развития, но не из гонад, полученных из зародышей более позднего возраста. Иная картина наблюдалась при трансплантации реагрегатов из половых и соматических клеток разного возраста (табл. 7). В этих опытах четко заметно, что соматические клетки влияют на частоту тератоканцерогенеза, существенно ее снижая, если в реагрегате находились соматические клетки от гонад более старших зародышей A5—17 сут развития) (группа 2 табл. 7). Соматические клетки гонад более ранних зародышей A2.5 сут) могут привести к терато- канцерогенезу, если в реагрегате были половые клетки зародышей 15—17 сут развития (группа 5). Примечательно также, что высокая частота тератокарцином была при реагрегации половых клеток 12.5-суточных зародышей со смесью соматических клеток из гонад этого возраста и гонад 15—17-суточных зародышей (группа 3). Все эти данные говорят о том, что возникновение тератокарцином из трансплантированных под капсулу тестикула реагрегатированных гонад зависит от возраста половых и соматических клеток, от генотипа как половых, так и соматических клеток и от сложных взаимодействий между половыми и соматическими элементами гонады. В пользу такого вывода говорят и результаты исследования изоферментов глюкозофосфатизомеразы опухолей, образовавшихся при реагрегации половых и соматических элементов гонад, для которых свойствен спонтанный тератоканцерогенез (линия ХМ) и гонад мышей C57BL/6J, из которых тератокарциномы не возникают. Опухоли имели всегда изоферменты, характерные для мышей ХМ, даже если реагрегировали половые
48 Часть первая. Предзародышевое развитие клетки мышей C57BL/6J с соматическими элементами гонады мышей ХМ (см. табл. 5 из работы: Regenass et al., 1982). Таким образом, можно прийти к выводу, что тератокарциномы из трансплантированных половых валиков зародышей мышей определенных линий являются исключением из общего правила и должны быть отнесены к малигнизации зачатков гонад, т. е. процессу, в который вовлекаются как половые, так и соматические элементы зачатка. Эти случаи нельзя использовать как веский довод в пользу того, что первичные половые клетки служат источником полипотентных ЕС-клеток и могут непосредственно превращаться в соматические клетки, осуществляющие в дальнейшем различные типы цитодифференцировок. В равной степени нет оснований для такого вывода, если исходить из работы, в которой при трансплантации половых валиков от мутантных мышей, гомозиготных по аллелю Steel (символ SI), у которых нарушается миграция и пролиферация первичных половых клеток и возникает стерильность (см. раздел 2 гл. I), не было получено тератокарцином или они образовывались крайне редко (Stevens, 1967). Приведенные выше данные по развитию тератокарцином из реагрегированных клеток гонад разного генотипа позволяют считать, что при мутации Steel могло произойти такое изменение генотипа как соматических, так и половых клеток, при котором зачаток гонады утратил способность малигни- зироваться. Следует иметь в виду, что у гомозиготных по данной мутации мышей половые валики содержат более 1 % первичных половых клеток. Кроме того, мутация S1 не является автономной клеточной леталью и ее экспрессия определяется клеточным окружением (McLaren, 1981). Таким образом, есть все основания для того, чтобы повторить опыты по трансплантации зачатков гонад зародышей, гомозиготных по мутации Steel. При этом следует учитывать сведения о том, что трансплантация целых зародышей, несущих эту мутацию в гомозиготном состоянии, приводит к формированию тератокарциномы (Mintz et al., 1978). Решающие результаты можно ожидать при реагрегации мутантных половых клеток с нормальными соматическими элементами гонады (и наоборот) . Так как подобные опыты с мутацией Steel еще не проводились, есть все основания для весьма сдержанного отношения к гипотезе о происхождении тератокарцином семенника из первичных половых клеток (Stevens, 1967), так как имеющиеся фактические данные не могут служить серьезным основанием для такого вывода. П.4.3. СПОНТАННЫЕ ОВАРИАЛЬНЫЕ ТЕРАТОКАРЦИНОМЫ МЫШЕЙ ЛИНИИ LT/Sv Нередко одним из доводов образования из первичных половых клеток тератом и тератокарцином считают спонтанные опухоли яичников у мутантных мышей LT/Sv. Между тем это неудачный пример, так как он по сути не относится к данному вопросу. Подробный разбор генеза и свойств овариальных опухолей у мышей LT/Sv приведен в обзоре (Дыбан, Нониашвили, 19866, 1986в). Поэтому достаточно лишь обратить внимание на следующие существенные обстоятельства: у мышей линии LT/Sv речь идет о спонтанной активации яйцеклеток первого мейоти- ческого деления или находящихся на стадии метафазы второго мейотиче- ского деления. Эти яйцеклетки спонтанно вступают в партеногенетическое развитие не только после овуляции, но и находясь в фолликулах яичников. Последнее часто встречается у неполовозрелых или молодых самок. Как овули- ровавшие, так и находящиеся в фолликулах спонтанно активирующиеся яйцеклетки вступают в дробление, формируют морулы и бластоцисты, и, когда зародыши достигают стадии раннего яйцевого цилиндра, начинается дезорганизация партеногенетических зародышей. При этом партеногенетические зародыши
//. Отношение первичных половых клеток к стволовым клеткам 49 находящиеся в матке, погибают на начальных стадиях имплантации, а в яичнике партеногенетические зародыши выживают и из них формируется тератокарци- нома (Stevens, Varnum, 1974). Детальные исследования (П. А. Дыбан, 1979, 1982) показали, что у таких внутриовариальных партеногенетических.зародышей неупорядоченный рост начинается с районов первичной эктодермы и, вероятно, именно за счет этих клеток и возникают полипотентные ЕС-клетки. Помимо этого,из других частей зародыша происходит образование различных тканевых производных, как это имеет место и при возникновении тератомы из трансплантированного зародыша. Разница состоит лишь в том, что в случае овариальных тератом мышей LT/Sv зародыши образуются в яичниках из вступивших в спонтанный партеногенез яйцеклеток. Следовательно, овариальные опухоли у мышей LT/Sv служат примером образования тератокарцином из партеногенетических зародышей, т. е. из зародышей, развивавшихся без участия отцовского генома. Однако образование этих опухолей отнюдь не говорит о том, что тератокарциномы могут возникать из первичных половых клеток женского пола. II.5. ЛИНИЯ ПОЛОВЫХ КЛЕТОК КАК ОДИН ИЗ ПРИМЕРОВ СТАБИЛЬНОЙ ЭМБРИОНАЛЬНОЙ ЦИТОДИФФЕРЕНЦИРОВКИ Заканчивая рассмотрение вопроса о происхождении линии половых клеток у млекопитающих, можно сформулировать некоторые общие положения, которые хотя и не являются бесспорными, но подтверждаются рядом фактов и кажутся вполне логичными. У млекопитающих, т. е. наиболее высокоорганизованных животных, по-видимому, отсутствуют половые детерминанты и линия половых клеток выделяется на относительно поздних стадиях развития, когда имплантировавшиеся зародыши представляют собой 2—3-слойные зародышевые цилиндры. В это время в эпибласте (первичной эктодерме) возникает небольшой клеточный клон предшественников линии половых клеток. На этих же стадиях в эпибласте выделяются и клоны соматических клеток, из которых в последующем развиваются зачатки различных органов и тканей тела зародыша. Первичные половые клетки появляются у зародышей млекопитающих еще позже — во время второй фазы гаструляции, при формировании дефинитивной мезодермы. Это происходит при миграции клеток, входивших в состав эпибла- ста, через первичную полоску в то время, когда образуется аллантоис, т. е. незадолго до формирования первых сомитов. Вместе с тем, хотя у млекопитающих и нет половых детерминант, однако в раннем эмбриогенезе функционируют эпигенетические механизмы, которые определяют степень вероятности потомков первых бластомеров, обладающих тотипотентностью, войти в состав внезародышевых органов и тканей или попасть в состав тела зародыша, а также и механизмы, определяющие степень вероятности потомков первых бластомеров дать начало линии половых клеток. Первичные половые клетки млекопитающих с момента выделения жестко запрограммированы в направлении гаметогенеза, т. е. из этих клеток либо возникают гаметы, либо они погибают. Существует биологический запрет на иные модусы развития первичных половых клеток млекопитающих, и прежде всего на преобразование первичных половых клеток в соматические клетки, которые неминуемо должны приобрести не только полипотентность, но и свойства опухолевых клеток. По-видимому, при выделении линии половых клеток 4 А. П. Дыбан
50 Часть первая. Предзародышевое развитие создается какой-то механизм, эффективно препятствующий этому аномальному модусу развития — восстановлению полипотентности первичных половых клеток. Поэтому у млекопитающих тератокарциномы не возникают из первичных половых клеток ни в случаях, когда ранние зародыши были трансплантированы в эктопические места, ни в случаях, если яйцеклетки спонтанно созревают в фолликулах, активируются и вступают в партеногенетическое развитие, находясь в яичниках. Во всех этих случаях источником тератокарциномы служат полипотентные клетки эпибласта ранних зародышей либо клетки эпибласта более поздних зародышей, которые уже были запрограммированы для других путей дифферен- цировки. Однако, не будучи окончательно коммитированными, эти клетки эпибласта, попадая в аномальное окружение, «изменяют решение», т. е. под влиянием каких-то факторов (тестикула, почки, селезенки, яичника и других органов взрослого животного) вступают на иные пути развития,и в том числе образуют популяцию стволовых опухолевых клеток (ЕС-клеток), обладающих полипотентностью. Не исключено, что сходное явление происходит и при длительном культивировании in vitro ранних зародышей мышей (ВКМ бластоцист), когда формируются стабильные клоны полипотентных ЕК-клеток. Эти клетки также не имеют прямого отношения к возникновению линии половых клеток. По-видимому, в нормальном эмбриогенезе ЕК-клетки существуют короткое время, составляя незначительную долю клеточной популяции эпибласта. Логично допустить, что непродолжительное существование в эпибласте ЕК-клеток, которые также могут служить источником опухолевых клеток, является одним из проявлений процесса, обеспечивающего стабильность эмбрионального развития и предотвращающего преобразование зародыша в тератокарциному, т. е. относится к тому же явлению, что и биологический запрет на преобразования в зародыше первичных половых клеток в полипотентные опухолевые клетки. Эффективность действия гипотетического механизма (или механизмов) стабилизации эмбриональных дифференцировок (препятствующего возврату к полипотентности), одной из форм которого является создание устойчивой линии половых клеток, может изменяться как под влиянием генетических, так и внешних факторов. Устойчивость первичных половых клеток млекопитающих к отклонению от нормального пути зависит и от их пола. Так, мужские первичные половые клетки в случае мутации какого-то гена (или каких-то генов), вступая в аномальные взаимоотношения с мутантными соматическими элементами гонады, принимают участие в образовании тератокарциномы семенника, представляющую результат малигнизации зачатка гонады в целом. Зачаток гонады женского пола не малигнизируется и не дает начало тератокарциномам при трансплантации в эктопические места, даже если в геноме первичных половых и соматических клеток были те мутации, которые могут приводить к образованию тератокар- цином семенника. Остается неизвестным, обеспечивается ли невосприимчивость к тератокан- церогенезу женских первичных половых клеток механизмами, оперирующими на уровне генома этих клеток (например, двойной дозой генов Х-хромосом), либо на уровне соматических элементов зачатка гонады. Этот интригующий вопрос заслуживает специального исследования. Мак Ларен заканчивает блестяще написанную книгу, посвященную проблеме линии половых клеток у млекопитающих, фразой: «Мы еще не знаем отношений между первичными половыми клетками, полипотентными эмбрио- карциномными стволовыми клетками, клетками всего эпибласта или какой-то
//. Отношение первичных половых клеток к стволовым клеткам 51 определенной группы клеток эпибласта» (McLaren, 1981, с. 94). После публикации этой книги прошло лишь несколько лет, и уже достигнут определенный прогресс и в этой области. Однако решение поставленных вопросов зависит от дальнейшего усовершенствования методов выделения и культивирования in vitro первичных половых клеток млекопитающих и от результатов опытов, в которых при помощи различных методов будут непосредственно исследоваться свойства первичных половых клеток и изменения их потенций по ходу развития зародыша. Это направление является многообещающим не только для экспериментальной эмбриологии и генетики развития, но и для клеточной и генетической инженерии млекопитающих. Глава III ВЗАИМОДЕЙСТВИЯ СОМАТИЧЕСКИХ И ПОЛОВЫХ КЛЕТОК ПРИ ИНИЦИАЦИИ МЕЙОЗА И ДИФФЕРЕНЦИАЦИИ ГОНАДЫ В предыдущих главах рассмотрено происхождение и свойства первичных половых клеток и приведены сведения, в равной степени относящиеся как к ооге- незу, так и сперматогенезу. Решающим моментом, предопределяющим пути преобразования первичных половых клеток в ооциты или сперматоциты, является стадия онтогенеза, когда происходит инициация мейоза. В женских половых клетках мейоз инициируется на значительно более ранних стадиях онтогенеза, чем в мужских половых клетках. Если же мужские половые клетки вступают в мейоз столь же рано, как и женские клетки, то это может привести к инверсии пола, т. е. образованию ооцитов из первичных половых клеток, имевших XY набор гоносом. Рассмотрим факты, подтверждающие эту точку зрения. III. 1. ПОЛОВЫЕ КЛЕТКИ В ИНДИФФЕРЕНТНОЙ ЗАКЛАДКЕ ГОНАДЫ Хорошо известно, что у млекопитающих вначале возникает индифферентный зачаток половой системы, включающий в себя бипотенциальную закладку гонады, а также Вольфовые и Мюллеровые протоки. Под влиянием факторов, вырабатываемых зародышевой гонадой при ее дифференцировке в тестикул, происходит редукция Мюллеровых протоков и прогрессивное развитие производных Вольфовых протоков, т. е. дифференцируется мужская половая система. При развитии зачатка гонады в яичник редуцируются Вольфовые каналы, но развиваются производные Мюллеровых каналов, из которых формируются яйцевод и матка, т. е. женские внутренние половые органы. Таким образом, ключевым процессом развития половой системы является дифференциация зачатка половой железы — образование из этой закладки тестикула или яичника. Напомним, что зачатки гонады возникают у млекопитающих в виде утолщений (так называемых половых валиков) на вентральной стороне мезонеф- роса. Индифферентный зачаток гонады содержит первичные половые клетки, а также три типа соматических элементов: клетки целомического эпителия, мезенхимы и мезонефроса. Мезонефрос оказывает существенное влияние на пути дальнейшей дифференцировки как соматических элементов в зачатках гонады, так и половых клеток (Zamboni et al., 1980; Byskov, 1982). 4*
52 Часть первая. Предзародышевое развитие У зародышей обоего пола первичные половые клетки вначале беспорядочно располагаются среди соматических элементов, локализуясь, в основном в периферических частях зачатка гонады. Затем начинается гистологическая диф- ференцировка соматических элементов гонады, что дает возможность различить пол гонады. Существуют видовые особенности строения закладки яичника. У некоторых видов (мыши, крысы, человек) на ранних стадиях развития зачаток яичника представляет собой компактный орган из-за того, что внедряющиеся в зачаток клетки мезонефроса перемешиваются с половыми клетками и образуют слабо ограниченные скопления лишь в центре яичника. У этих млекопитающих зачатки яичника на начальных стадиях развития еще не способны синтезировать стероиды, а половые клетки рано вступают в мейоз. Таких млекопитающих называют «видами с незамедлительным мейозом» (Byskov, 1979, 1982). У других млекопитающих (овцы, свиньи, кролики, хорьки, лошади и др.) зачаток яичника очень рано начинает продуцировать стероиды, т. е. это происходит задолго до формирования фолликулов. У этих животных в зачатке яичника вначале формируются клеточные тяжи, в состав которых входят как соматические клетки, так и оогонии. Эти тяжи возникают вскоре после формирования половых валиков, и по гистологическому строению зачаток гонады женского и мужского пола становится весьма схожим. Единственным критерием, позволяющим различить пол зачатка гонады, является наличие в зачатке тестикула Лейдиговских клеток, что заметно только при гистологическом исследовании. У этих животных мейоз в женских половых клетках запаздывает по сравнению с началом гистологической дифференцировки соматических элементов гонады. В данном случае зачаток яичника интенсивно вырабатывает эстрогены в течение длительного периода, предшествующего фолликулогенезу и инициации мейоза в половых клетках. Этих животных называют видами с задержанным (запаздывающим — delayed) мейозом (Buskov, 1979, 1982; Byskov et al., 1985). У таких животных внедряющиеся в зачаток яичника клетки мезонефроса принимают решающее участие в формировании центральной части гонады, где они образуют структуры, представляющие собой истинную эндокринную железу (Mossman, Duke, 1973). Приведенные выше данные дают серьезное основание для того, чтобы внести поправку в распространенные представления, согласно которым только для развития мужской гонады свойственно образование тяжей эпителиальных клеток. У животных с отсроченным мейозом подобные структуры возникают и при развитии яичника, хотя из этих тяжей в дальнейшем образуются не семенные канальцы, а фолликулы. Первичными половыми клетками (гоноцитами) следует называть только половые клетки, располагающиеся вне зачатка гонады, либо те клетки, которые уже коллонизировали зачаток гонады, но находятся в нем до того времени, когда можно различить пол зачатка гонады, т. е. до дифференцировки соматических элементов гонады. Если исходить из этого принципа, то у зародышей мышей оогонии образуются на 11.5—12 сут развития. Оогонии отличаются от гоноцитов рядом цитологических признаков, в том числе характерной формой и структурой ядра, а также тем, что в оогониях одна из Х-хромосом генетически инактивирована, т. е. гетерохроматизирована (см. раздел 3, гл. I). Нелишне подчеркнуть, что оогенезом следует называть весь процесс развития женских половых клеток — от оогонии и до зрелой яйцеклетки. Именно в таком смысле этот термин используется в настоящей главе. Однако нередко оогенезом обозначают у млекопитающих лишь процесс пролиферации оогонии и их преобразование в ооциты (Peters, 1970). С этими терминологическими
///. Взаимодействие соматических и половых клеток 53 неточностями приходится считаться, так как именно из-за этого в зарубежной литературе укоренились представления, что у некоторых млекопитающих ооге- нез заканчивается во внутриутробном периоде жизни (крысы, мыши, морские свинки, коровы, овцы, свиньи, обезьяны, человек), у других животных ооге- нез проходит после рождения (кролики, хорьки, золотистые хомячки). Считают, что у некоторых млекопитающих (например, у кошек) оогенез начинается во время плодного периода и продолжается в постнатальном периоде: III. 2. ПРОЛИФЕРАЦИЯ ООГОНИЙ И ПРОСПЕРМАТОГОНИЙ Хронология этого процесса хорошо изучена у различных видов млекопитающих (см. обзоры: Peters, 1970; Дыбан, Баранов, 1977). В результате размножения оогоний у большинства млекопитающих создается конечный запас половых клеток, который обеспечивает оогенез на протяжении всей жизни. Исключением из этого правила являются немногие виды млекопитающих, например некоторые лемуры, у которых размножение оогоний продолжается у взрослых особей и регулируется гормонами, т. е. зависит от стадии полового цикла (Kumar, 1974). К этим животным не применим справедливый для других млекопитающих вывод о наличии в яичнике у взрослых животных запаса половых клеток, не способных пролиферировать (т. е. пула первичных ооцитов). Примечательно, что и у хомячков, у которых пролиферация оогоний прекращается через несколько дней после рождения, замечено влияние экзогенных стероидных гормонов на эти процессы (Arrau et al., 1983). Запас первичных ооцитов в яичнике не отражает темпы размножения и количество клеточных циклов оогоний, так как параллельно с размножением гибнет значительное количество оогоний. Последнее особенно четко заметно у тех животных, у которых инициация мейоза происходит относительно сихронно, т. е. в лептотену почти одновременно вступает преобладающее большинство половых клеток (например, у мышей и крыс). Среди оогоний нередко обнаруживаются двуядерные и многоядерные клетки, и некоторые оогоний, вступая в митоз, образуют полиплоидные метафазы. Такие патологические формы оогоний описаны и при исследованиях половых клеток, изолированных из зачатков гонад зародышей мыши 12.5—15.5 сут развития (De Felici, McLaren, 1983). Используя метод изоляции половых клеток, были проведены детальные цитологические исследования зачатков гонад зародышей крыс разных стадий развития (от 15 до 21 сут эмбриогенеза). Наши результаты показали, что и в оогенезе крыс часто возникают оогоний с несколькими ядрами, а также одноядерные гигантские оогоний, размеры которых в несколько раз превышают размеры остальных оогоний. Кроме того, нами были замечены и картины массовой гибели оогоний крыс. Таким образом, не исключено, что у млекопитающих линия половых клеток несет значительный груз мутаций, возникающих уже во время выделения первичных половых клеток и при их миграции к зачатку гонады, и именно оогоний с мутациями гибнут во время митоза, т. е. элиминируются в периоде пролиферации женских половых клеток. У зародышей мышей с 12.5 до 13.5 сут существенно изменяется морфология оогоний. Локомоторная активность оогоний прекращается, они соединяются межклеточными мостиками, что, по-видимому, происходит из-за неполной цито- томии в одном из клеточных циклов. Предполагают, что синцитиальная ассоциация оогоний способствует распространению каких-то сигналов, в результате которых группа клеток синхронно вступает в мейоз, т. е. преобразуется в ооциты (Eddy et al., 1981). l
54 Часть первая. Предзародышевое развитие Вместе с тем опубликованы сведения о том, что у мышей локомоторная активность сохраняется и в мейоцитах (вплоть до стадии пахитены) (McLaren, 1981). Непонятно, как согласовать эти наблюдения с данными о синцитиальных связях оогоний. Неизвестно, могут ли передвигаться оогоний и мейоциты в зачатках яичников у других млекопитающих животных и у человека. Вместе с тем показано, что мужские половые клетки теряют способность передвигаться уже на стадии гонии, т. е. сразу после того, как они попадают в состав зачатка семенника и располагаются в семенных канальцах (McLaren. 1981). III. 2. 1. ПРЕДМЕЙОТИЧЕСКИЕ ЦИКЛЫ ГОНИЙ У мышей и крыс на тех стадиях эмбриогенеза, когда в зачатке яичника происходит пролиферация оогоний, в зачатке семенника осуществляются митозы параллельной популяции клеток—просперматогоний. Эту генерацию прос- перматогоний называют просперматогониями-М, или обозначают буквами MRSG (от англ. Mitotic prospermatogonia). У мышей и у крыс генерационное время оогоний и просперматогоний-М совпадает, причем продолжительность фазы S также весьма близка. Оогоний и просперматогонии-М сходны и по тонкому строению, по интенсивности синтеза РНК, по наличию высокого содержания щелочной фосфатазы и некоторых других ферментов, причем чувствительность этих двух видов клеток к ионизирующей радиации и цитостатическим препаратом также совпадает (Hilscher et al., 1974; Hilscher, 1983). Однако дальнейшее развитие оогоний и просперматогоний-М резко различается. Показано, что на 14—16 сут развития зародышей крыс в закладке яичника и в закладке семенника происходит интенсивная пролиферация половых клеток, причем в яичнике пролиферируют оогоний, а в семеннике — параллельная клеточная популяция просперматогонии-М. Установлено, что продолжительность всех фаз клеточного цикла клеточных популяций мужских и женских гоний одинакова. На 18 сут обе популяции синхронизованных клеток располагаются в гонадах в форме скоплений, которые почти одновременно вступают в митоз. В зародышевом семеннике после этого митоза образуются так называемые Т-просперматогонии, которые входят в длительную фазу Gi, продолжающуюся 10 сут. На протяжении этого времени в зачатке семенника полностью затормаживается пролиферация просперматогоний. Только на 5 сут после рождения Т-просперматогонии вступают в фазу S, продолжающуюся 11.5 ч, и после короткой фазы G2 вновь начинают делиться. После нескольких последовательных митотических делений возникает дефинитивная популяция стволовых мужских половых клеток (сперматогонии Ао, А|), с которой собственно и начинается сперматогенез у половозрелых животных (Hilscher et al., 1974). Иная картина отмечается в женской гонаде зародышей крыс. Здесь на 17 сут эмбриогенеза, после завершения митоза оогоний, возникает популяция клеток, которая проходит фазу Gi, продолжающуюся 10 ч, а затем вступает в предмейо- тическую фазу синтеза ДНК. После фазы S, которая продолжается 12.5 ч и приходится на 18 сут внутриутробного развития, клетки вступают в профазу мейоза. Подобная картина отмечена и при сопоставлении поведения оогоний и просперматогоний в зачатках гонад женского и мужского пола у зародышей мышей и человека (Hilscher et al., 1974; Hilscher, 1983). Приведенные выше данные говорят о том, что поведение и свойства женских половых клеток резко изменяются, начиная с того митотического цикла, который предшествует мейозу. Однако, по-видимому, эта программа закладывается на более ранних стадиях эмбриогенеза, хотя и остается лабильной вплоть до
///. Взаимодействие соматических и половых клеток 55 инициации мейоза. Не исключено, что у мышей коммитирование женских половых клеток к раннему мейозу происходит на 11 сут эмбриогенеза, когда в зачатке гонады еще не произошла гистологическая дифференцировка, т. е. в нем находится популяция пролиферирующих гоноцитов (McLaren, 1983a, 1983b). Ш.З. МЕХАНИЗМЫ ПОЛОВОЙ ДИФФЕРЕНЦИРОВКИ ЗАЧАТКА ГОНАДЫ Преобразование оогоний в ооциты, т. е. инициация мейоза и дальнейшее развитие половых клеток по женскому пути, определяется не только генетической программой половых клеток, но в значительной степени зависит от действия на половые клетки окружающих соматических элементов. Для того чтобы обосновать это положение, целесообразно кратко разобрать основные сведения о механизмах половой дифференцировки зачатка гонад у млекопитающих. У млекопитающих генетический пол особей предопределяется при оплодотворении, т. е. детерминируется сочетанием гоносом в зиготе. У большинства млекопитающих XX и ХО зиготы развиваются как зародыши женского пола, a XY и XXY зиготы — как зародыши мужского пола. Вместе с тем развитие зародышей млекопитающих женского и мужского пола протекает совершенно одинаково вплоть до того периода, когда начинается дифференциация зачатка гонады по мужскому или женскому типу. Индифферентная закладка гонады у млекопитающих бипотенциальна, т. е. может становиться либо тестикулом, либо яичником, или превращаться в орган, часть которого представляет собой тестикул, а часть — яичник (так называемый овотестикул при гермафродитизме). III.3.1. ГЕНЕТИЧЕСКАЯ АКТИВНОСТЬ Y-ХРОМОСОМЫ И АУТОСОМНЫХ ЛОКУСОВ Многочисленные факты говорят о том,, что наличие в соматических клетках гонады Y-хромосомы является главной предпосылкой для развития зачатка - гонады в направлении мужской половой железы (Ohno, 1979; Stewart, 1983). Есть все основания считать, что генетическая функция Y-хромосомы сводится к экспрессии трех генов — H-Y локуса, локуса Td (детерминации развития тестикула) и локуса, контролирующего антигены клеточной поверхности (Good- fellow et al., 1983). Два из этих трех локусов непосредственно вовлечены в первичную детерминацию пола, т. е. индукцию развития тестикула из индифферентного зачатка гонады. Не исключено, что и третий локус Y-хромосомы принимает участие в этом процессе. Вместе с тем показано, что наличие Y-хромосомы, или тестикулдетермини- рующего локуса Y-хромосомы, недостаточно для полноценного развития гонады по мужскому типу (Lyon et al., 1981). Для этого необходимо также действие по крайней мере трех аутосомных локусов (Eicher, 1982). Один из этих локусов находится в хромосоме № 17 у мышей (Washburn, Eicher, 1983), а расположение остальных аутосомных локусов еще не выяснено (Eicher, 1982; Washburn, Eicher, 1983). Полагают, что роль Y-хромосомы в первичной детерминации пола зачатка гонады обусловлена тем, что генетический локус Y-хромосомы кодирует синтез органоспецифического антигена (или антигенов). Это вещество (или эти вещества) являются так называемым антигеном дифференциации, т. е. оно селективно действует на соматические элементы гонады и контролирует морфогене- тические процессы, протекающие в этом зачатке. Большинство авторов полагает, что фактором дифференциации зачатка гонады в тестикул является H-Y антиген.
56 Часть первая. Предзародышевое развитие III.3.1.1. H-Y антиген Роль H-Y антигена в развитии тестикула подробно освещена в ряде обзоров (Ohno, 1979; Stewart, 1983; Wolfe, Goodfellow, 1985) и в недавно вышедшей монографии (Wachtel, 1983). Вместе с тем некоторые факты не укладываются в эту концепцию (Wolfe, Goodfellow, РЭ85), и есть авторы, полагающие, что развитие тестикула определяется не H-Y антигеном, а каким-то иным фактором, синтез которого кодируется локусом Td, расположенным в Y-хромосоме вблизи локуса H-Y. Этот фактор обозначают буквами TDF или Td (от англ. слов testis determining factor) либо буквами SDF (от англ. serologicaly determined male antigen) (Simpson et al., 1984). H-Y антиген является минорным антигеном гистосовместимости, синтез которого контролируется Y-хромосомой. Если инбредным самкам трансплантировать кожу от инбредных самцов той же линии, то самки отторгают трансплантат, тогда как самцы не отторгают трансплантат кожи этих самок. Это отторжение трансплантата связано с наличием H-Y антигена в клетках самца. H-Y антигенный детерминант выявляется во всех клетках самца за исключением диплоидных половых клеток, его нет в соматических и половых клетках самки. Синтез H-Y антигена начинается у зародышей мышей на 8-клеточной стадии (Krco, Goldberg, 1976; Epstein, 1986) и продолжается на протяжении всего эмбриогенеза. H-Y антиген является той активной субстанцией, которая содержится в надосадочной жидкости из культуры соматических клеток зачатка тестикула и которая способна изменять ход развития соматических клеток яичника новорожденных крыс или мышей в направлении семенника. Полагают, что H-Y антиген действует избирательно через специфические рецепторы соматических клеток зачатка гонады. Под влиянием H-Y антигена клетки гранулезы не только образуют в культуре семенные канальцы, но в этих клетках появляются типичные для тестикула рецепторы хориального гонадо- тропина (Ohno et al., 1979). III.3.1.2. Органоспецифические антигены яичника Существуют две точки зрения о механизмах дифференциации зачатка гонады в яичник. Согласно одной из них зачаток гонады развивается как яичник, если в зародыше нет H-Y антигена (TDF или SDF антигенов). Согласно второй точке зрения развитие яичника не является результатом отсутствия H-Y антигена, а зависит от активного действия другого специфического фактора (антигена), вырабатываемого в зачатке женской гонады. Еще недавно превалировала первая точка зрения, однако в последнее время начали накапливаться данные, подтверждающие вторую гипотезу. Показано, что надосадочная жидкость культуры овариальных клеток предотвращает нормальные морфогенетические процессы соматических клеток зачатка тестикула, которые в этих условиях не формируют семенные канальцы. Высказано предположение, что овариальные соматические клетки выделяют в культуральную среду фактор, который препятствует действию H-Y антигена. Полагают, что фактор, вырабатываемый клетками яичника, связывается со специфическими H-Y рецепторами и блокирует действие H-Y антигена. Не исключено, что данный овариальный фактор может непосредственно связываться и с H-Y антигеном, обладая высоким сродством к нему (Zenezes et al., 1980). Используя антисыворотку, полученную при иммунизации изогенных самцов крыс тканями яичника зародышей и новорожденных крыс, показано, что эта антисыворотка реагирует только с ооцитами, тогда как ни мужские половые клетки, ни соматические клетки гонады не дают положительной реакции. Выска-
///. Взаимодействие соматических и половых клеток 57 зано предположение, что ооцитоспецифический антиген необходим для того, чтобы вокруг ооцитов формировались фолликулы, т. е. этот антиген вовлекается в клеточное распознавание и во взаимодействие между ооцитами и соматическими клетками зачатка яичника (Muller, 1981). Остается невыясненным, являются ли овариальный фактор надосадочной жидкости культуры соматических клеток яичника и ооцитоспецифический антиген одним и тем же или разными веществами. Недавно была описана (Washburn, Eicher, 1983) мутация у мышей (символ Tas), влияющая на дифференциацию зачатка гонады. Эта доминантная мутация захватывает часть локуса Т в аутосоме 17. При данной мутации гонады у мышей XY развиваются как яичник либо такие мыши становятся гермафродитами, т. е. имеют овотестикулы. Высказано предположение, что при мутации Tas захватывается критический этап при дифференцировке яичника. Полагают, что локус Tas функционирует как детерминант развития яичника, т. е. нормальные аллели этого локуса инициируют у XX индивидуумов развитие зачатка гонады в направлении яичника. Нормальный аллель этого гена не функционирует у XY индивидуумов. Однако при мутации данного локуса у индивидуумов XY возникают конкурентные взаимоотношения между антигеном, вырабатываемым Y-хромосомой, и антигеном, кодируемым локусом Tas аутосомы 17, и в результате у зародышей XY гонады дифференцируются либо как яичник, либо как овотестикул. Результат зависит от того, преобладает ли в зачатке гонады действие H-Y антигена или антигена, кодируемого локусом Tas в 17 аутосоме (Washburn, Eicher, 1983). Примечательно, что недавно в проксимальных районах аутосомы 17 у мышей найдены нуклеотидные последовательности ДНК, гибридизующиеся с тем же самым молекулярным зондом (Bkm из половых хромосом змей), что и район Y-хромосомы, содержащей Td локус или H-Y локус (Kiel-Metzger, Erickson, 1984). Значение этой находки еще требует расшифровки, однако данный факт наводит на мысль о неслучайном участии 17 хромосомы в детерминации пола гонады. III.3.2. КОЛИЧЕСТВЕННЫЕ СООТНОШЕНИЯ СОМАТИЧЕСКИХ КЛЕТОК МУЖСКОГО И ЖЕНСКОГО ПОЛА Установлено, что развитие зачатка гонады в направлении тестикула или яичника зависит и от количественного соотношения соматических клеток мужского и женского пола в этом зачатке. Этот вывод вытекает из исследований развития зачатка гонады у генетических химер, а также у мышей с некоторыми мутациями, либо мышей, у которых в ходе эмбрионального развития утрачивается Y-хромомсома. Рассмотрим эти данные. II1.3.2.1. Развитие зачатка гонад у генетических химер XX++XY Напомним, что при создании агрегационных или инъекционных химер объединяют два зародыша, т. е. две клеточные популяции разного генотипа. Агрега- ционные химеры могут представлять собой зародыши, состоящие из клеточных популяций, имеющих одинаковые наборы гоносом (например, XX и XX хромосомы или XY и XY хромосомы), а также особи, у которых находится как популяция XX, так и XY клеток, т. е. могут быть мозаиками по половым хромосомам. Так как эти опыты проводят, не определяя заранее генетический пол каждого из партнеров, частота возникновения мозаицизма по половым хромосомам должна быть близка к 50 %. Однако уже первые наблюдения показали, что среди генетических мозаиков преобладают фенотипические самцы (Mystkowska, Tarkowski, 1964, 1970; Tar-
58 Часть первая. Предзародышевое развитие kowski, 1970) и этот вывод был затем полностью подтвержден (McLaren, 1976, 1978). Сводные результаты исследований различных авторов фенотипического пола агрегационных мышиных химер XX-o-XY показывают (McLaren, 1983a), что среди 31 агрегационной химеры, имевшей как XX, так и XY соматические клетки, были 21 самец, 7 самок и 3 гермафродита. Таким образом, преобладающее большинство химер XX-^XY имели гонады, которые развивались в направлении мужского пола. Математический анализ установил, что в теле генетических химер распределение двух популяций клеток не носит нормальный биноминальный характер, т. е. кривая распределения сильно уплощена (Falconer, Avery, 1978). Исходя из таких математических моделей был сделан вывод, что наличие в зачатке гонады 30 % клеток с набором XY хромосом вполне достаточно для того, чтобы зачаток гонады развивался в тестикулах (McLaren, 1983a). Эти факты говорят о том, что наличие в зачатке гонады определенного количества соматических клеток мужского пола предотвращает развитие ова- риальной ткани из соматических клеток женского пола, хотя этих клеток может быть и больше, чем клеток мужского пола. В этих случаях клетки с XX хромосомами как бы «подчиняются» клеткам с XY хромосомами и XX соматические клетки принимают участие в развитии тестикулярной ткани (Tarkowski, 1970). Дифференциация химерных гонад в направлении тестикула возможна в том случае, когда клетки с набором XX или XY хромосом перемешаны между собой, т. е. в составе зачатка гонады нет значительных территорий, построенных из клеток одного какого-нибудь генотипа. Если в зачатке гонады химерных зародышей XYoXX сохраняются большие территории, занятые XX клетками, то в этих районах происходит гистогенез, присущий яичнику. В таких случаях у животных образуются гонады, состоящие как из ткани тестикула, так и из ткани яичника (так называемые овотестикулы). У животных-гермафродитов в овотестикул могут преобразовываться оба или только одна из закладок гонад, и тогда на противоположной стороне формируется нормальная половая железа (тестикул или яичник). Описаны случаи, когда на одной стороне развивался яичник, а на другой стороне мыши тестикул (Tarkowski, 1964, 1970). Следовательно, пути дифференциации закладки гонады зависят не только от количественного соотношения XX и XY соматических клеток, но и от того, занимает ли каждый из этих клеточных клонов значительные районы в зачатке гонад или эти клеточные клоны равномерно перемешаны между собою. III.3.2.2. Развитие гонад при мозаицизме гоносом (наборы XO/XY или XO/XY/XYY) Случаи мозаицизма по гоносомам в зачатках гонад зародышей мышей также говорят в пользу приведенного выше положения. Эти данные получены при изучении развития гонад у мышей BALB/c. У трех сублиний BALB/c отмечено аномальное соотношение полов в потомстве (самцы встречались в 38 % случаев) и зарегистрированы случаи спонтанного гермафродитизма (Whitten, 1975). Изучение половых желез у новорожденных мышей этой линии подтвердило, что сдвиг соотношения полов обусловлен гермафродитизмом, т. е. возникновением особей с овотестикулами либо с тестикулами и овотестикул а ми (Beamer et al., 1978). У некоторых животных на одной стороне были найдены нормальные семенники, а на другой стороне яичники либо овотестикулы (Whitten, 1975; Whitten et al., 1979). He было замечено различий между закладкой левой и правой гонады, хотя с правой стороны реже встречались нормальные гонады.
///. Взаимодействие соматических и половых клеток 59 Примечательно, что в некоторых случаях авторы нашли как в овариальной, так и в тестикулярной тканях клетки, находившиеся в профазе мейоза. Некоторые из мейотических фигур содержали так называемые половые пузырьки, что говорило о том, что в мейоз вступали половые клетки не только женского, но и мужского пола (Whitten et al., 1979). Были проведены детальные цитогенетические исследования печени гермафродитов, а также нормальных 15-суточных плодов мышей BALB/cwt. Обнаружено, что все гермафродиты и 7 исследованных самцов были хромосомными мозаиками, т. е. содержали XO/XY, XO/XY.Y или XO/XY/XYY клоны. Характерно, что у каждого мозаичного плода было больше ХО, чем XYY клеток (Beamer et al., 1978; Whitten et al., 1979). Возникновение в теле зародыша таких клонов клеток с разным набором гоносом обусловлено тем, что на начальных стадиях эмбриогенеза произошла утрата Y-хромосомы в некоторых бластоме- рах. По-видимому, нарушение сегрегации Y-хромосомы во время первых митоти- ческих делений бластомеров ранних зародышей обусловлено какой-то неполноценностью Y-хромосомы (Beamer et al., 1978; Whitten et al., 1979). Более детально этот вопрос не изучен и остается неясным, с какими именно особенностями Y-хромосомы связаны аномалии ее расхождения во время митоза. С этими мышами были проведены опыты, доказавшие, что у гермафродитов яичники сохраняют способность продуцировать нормальные яйцеклетки, а семенники — нормальные сперматозоиды. Суть этих опытов сводилась к следующему: у молодых мышей-гермафродитов производили лапаратомию и удаляли яичник. Яичник разрезали на две части и трансплантировали в сумку яичника овариоэктомированным самкам-реципиентам. У прооперированного гермафродита осталась мужская железа, и эти мыши превратились в нормальных самцов. У самок-реципиентов трансплантированные яичники приживались, и эти животные также оказались плодовитыми. При спаривании самца — бывшего гермафродита с самками-реципиентами было получено потомство. Таким образом, ооциты, развивавшиеся у самок-реципиентов в половой железе, взятой от гермафродита, были оплодотворены спермиями этого же животного (Whitten, 1975). Эти опыты являются наглядным доказательством возможности так называемого «самооплодотворения» («selfing») у млекопитающих. Примечательно, что во многих случаях ооциты, полученные от гермафродитов, были лишены Х-хромосомы, т. е. имели конституцию 39, ХО. Примечательные взаимоотношения были найдены между количеством овариальной ткани и ткани тестикулов зачатка гонад и процентом ХО клеток у мозаичных плодов. Если учитывать всех хромосомных мозаиков (XO/XY и XO/XY/XYY), то тогда ткани яичника образовывались в тех случаях, если индивидуум содержал не менее 24 % ХО клеток. Если же учитывать только результаты развития половой железы у гермафродитов, то тогда овариальная ткань возникала в зачатке гонады в случаях, если зачаток имел не менее 44 % ХО клеток (Eicher et al., 1980). Таким образом, овариальная ткань образуется не только из клеток XX, но и ХО клеток, причем в химерной гонаде может быть меньше ХО, чем XY клеток, однако если ХО клетки занимают большие районы, то эти территории гонады дифференцируются в направлении яичника. Следовательно, изучение гонад у мышей линии BALB/cwt хорошо согласуется с результатами, полученными в опытах с агрегационными генетическими химерами, хотя в случаях этих мышей речь идет о разном соотношении в гонадах клонов клеток XO/XY и (или) XO/XYY.
60 Часть первая. Предзародышевое развитие III.3.2.3. Развитие гонад при мутации Sex reversal Еще одним примером зависимости путей развития индифферентного зачатка гонады в направлении тестикула или яичника.от содержания в этом зачатке клеток, в которых активна Y-хромосома, является мутация Sex reversal (символ Sxr). Рассмотрим эти данные. У зародышей мышей с мутацией Sxr все части половой системы развиваются по мужскому типу. При этом в зачатке гонады образуется интерстициальная ткань и семенные канальцы, т. е. половая железа по гистологическому строению напоминает типичный семенник (Cattanach et al., 1971). Однако характер гаметогенеза при данной мутации зависит от набора гоносом половых клеток. Если они имеют две Х-хромосомы, то развитие останавливается на стадии пролиферирующих гоний. Однако если мутация Sxr имеет место у мышей с кариотипом ХО, то тогда происходит инверсия в мужские гаметы, т. е. в эмбриональном периоде гонии пролиферируют, а в постнатальном периоде вступают в мейоз, совершают оба деления созревания, причем формируются спермии, которые, однако, лишены подвижности и имеют другие аномалии (Cattanach et al., 1971). Применяя в качестве молекулярного зонда ДНК специфическую для гетерологической хромосомы одной из змей, было обнаружено, что эта проба (Bkm) гибридизуется с рестриктными фрагментами ДНК Y-хромосомы нормальных XY самцов мыши и с какими-то фрагментами ДНК XX Sxr самцов. Учитывая эту неожиданную находку и используя гибридизацию in situ, было подтверждено, что Bkm проба ДНК гибридизуется в нормальных метафазных пластинках с Y-хромосомой, а в XX Sxr метафазных пластинках — с одним концом Х-хромосомы (Singh, Johnes, 1982). Была сформулирована гипотеза о том, что у XY Sxr мышей локус Y-хромосомы, детерминирующий развитие тестикула, дуплицирован и этот лишний участок находится в составе дистального района Y-хромосомы. Во время мужского мейоза этот фрагмент Y-хромосомы транслоцируется на одну из хроматид Х-хромосомы из-за кросинговера между Y и X хромосомами (Burgoyne, 1982; Eicher, 1982). Цитогенетические исследования бендированных метафазных хромосом подтвердили наличие такого фрагмента в дистальном районе Y-хромосомы у XY самцов и в дистальном участке одной из Х-хромосом у XX Sxr самцов (Evans et al., 1982). Таким образом, XX Sxr мыши по сути близки к XXY мышам, так как у XX Sxr мышей в кариотипе находится наиболее важный генетический материал Y-хромосомы — тот локус Y-хромосомы, который детерминирует дифференци- ровку зачатка гонады в тестикул. Так как XX Sxr мыши фенотипически являются самцами, следовательно, несмотря на наличие двух Х-хромосом, присутствие в кариотипе дистального участка Y-хромосомы (с локусом H-Y или Td) вполне достаточно для того, чтобы произошла инверсия развития гонады — образовался тестикул. Примечательно, однако, что у таких мутантных мышей в составе семенных канальцев в пренатальном и начальном постнатальном периоде могут обнаруживаться женские половые клетки, соответствующие типичным ооцитам (McLaren, 1980, 1981). Таким образом, мутация Sxr по-разному сказывается на развитии самих половых клеток и на дифференциации соматических элементов гонады. Соматические элементы гонады могут при этой мутации формировать семенные канальцы, несмотря на наличие в клетках ХХ-хромосом, тогда как половые клетки XX могут и при Sxr мутации продолжать осуществлять программу оогенеза. Интересные результаты были получены при исследовании развития гонад
///. Взаимодействие соматических и половых клеток 61 у мышей, несущих мутацию Sxr и транслокацию Т/Х; 16/Н. При данной транслокации происходит избирательная инактивация именно той Х-хромосомы, в состав которой не входит часть аутосомы 16. Во время гаметогенеза происходит реактивация этой Х-хромосомы, и обе Х-хромосомы проявляют генетическую активность (Johnson, 1981). Эти опыты показали, что Т16Н/Х Sxr гонады являются мозаичными, т. е. содержат 2 прпуляции клеток. В одной популяции клеток Sxr локус в Х-хромосоме остается активным, а в другой — инактиви- руется. Соотношение этих клеточных популяций и определяет развитие зачатка гонады в направлении тестикула (когда преобладают клетки с активным Sxr ло- кусом в Х-хромосоме) или в направлении яичника (когда преобладают клетки с неактивным Sxr локусом в Х-хромосоме) или овотестикулы. Последнее имеет место в химерной гонаде, достаточно большие территории которой заняты и одной и другой популяцией клеток (McLaren, 1983b). Приведенные в предыдущих разделах данные позволяют сделать однозначный вывод о том, что пути развития бипотенциальной закладки гонады у зародышей млекопитающих определяются действием факторов, вырабатываемых соматическими элементами гонады, причем это зависит от наличия в кариотипе соматических клеток определенного набора гоносом либо того локуса Y-хромо- сомы, который кодирует синтез H-Y антигена, либо подобных антигенов, определяющих развитие соматических элементов гонады в тестикул. Вместе с тем предложена гипотеза, согласно которой может существовать вариант этого локуса в Y-хромосоме (обозначаемого как Sxr' локус), некодирующий синтез H-Y антигена, но индуцирующий развитие зачатка половой железы в тестикул (McLaren, 1984). Вполне логично допустить, что сходные механизмы предопределяют и развитие половых клеток по пути оогенеза или сперматогенеза. Существуют факты, позволяющие считать, что ранняя инициация мейоза определяет переход половых клеток на путь оогенеза, а торможение инициации мейоза — на путь сперматогенеза. Поэтому необходимо рассмотреть, от чего зависит ранняя инициация мейоза, присущая в норме женским половым клеткам, и определить, в какой мере фактические данные подтверждают или опровергают высказанные выше представления. III.4. ИНИЦИАЦИЯ МЕЙОЗА И НАБОР ГОНОСОМ В ПОЛОВЫХ КЛЕТКАХ В оогенез могут вступать клетки не только с ХХ-или ХО-набором, но известны случаи, когда мейоз инициируется на ранних стадиях онтогенеза, т. е. тогда же, как и при типичном оогенезе, и в половых клетках, имеющих и XY наборы гоносом. Эти наблюдения проведены на различных объектах — мышах—генетических химерах, XX-e-XY, на половых клетках, находящихся в эктопических местах вне зачатка гонады, а также при некоторых мутациях. Ш.4.1. ГЕНЕТИЧЕСКИЕ ХИМЕРЫ XX^>XY В разделе III. 3. рассмотрено развитие зачатка гонад у генетических химер и показано, что преобладающее большинство химер имеет гонады, развивающиеся как тестикулы. Изредка генетические химеры XXoXY развиваются как плодовитые самки, так как в мозаичных гонадах образуются большие территории соматических клеток XX. В этих гонадах осуществляется оогенез, причем в мейоз вступают не только XX клетки, но и XY половые клетки. В одном
62 Часть первая. Предзародышевое развитие случае в такой гонаде был найден ооцит на стадии диакинеза, т. е. в конце первой мейотической метафазы, и у этого ооцита цитогенетически были визуализированы Х- и Y-xf>OMOcoMbi (Evans et al., 1977). Таким образом, в данном случае мужская половая клетка рано вступила в мейоз и достигла стадии диакинеза, причем по морфологии эта клетка соответствовала типичному ооциту. Во второй работе исследовалось потомство B3 мыши) от генетической химеры ХХч>ХУ (Ford et al., 1975). У одного самца XXY были признаки, свидетельствовавшие о том, что Y-хромосома могла быть унаследована только от химерной самки. Авторы высказывают предположение, что в данном случае в мозаичной гонаде в мейоз вступила клетка, содержавшая XY-хромосомы, и эта клетка осуществила полноценный оогенез. Затем данная яйцеклетка (с набором XY) была оплодотворена спермием с Х-хромосомой. В химерных гонадах, развивающихся как мужская половая железа из-за того, что в гонаде преобладали XY соматические клетки, половые клетки могут рано вступать в мейоз несмотря на наличие в них XY набора. Это происходит в случаях, если половые клетки окружаются соматическими клетками с ХХ-хро- мосомами. Ранее предполагалось, что в таких химерных гонадах половые клетки, имеющие XY-хромосомы, не могут рано вступать в профазу мейоза. Этот вывод был сделан из-за того, что в мейоцитах, находившихся в химерных гонадах, не обнаруживался так называемый половой пузырек, а авторадиографические исследования не выявили тех паттернов включения Н3-тимидина в хромосомы мейоцитов, которые характеризуют пахитенные сперматоциты мыши (McLaren, Chandley et al., 1972). Однако недавно опубликована работа, на основании которой нужно пересмотреть этот вывод. Оказалось, что мейоциты с XY-хромосомами могут не образовывать полового пузырька (Hogg, McLaren, 1985). Дальнейшая судьба этих клеток неизвестна, по всей вероятности, они, находясь в составе семенных канальцев, погибают на тех или иных стадиях первого мейотического деления. Приведенные факты говорят о том, что ранняя инициация мейоза (во внутриутробном периоде жизни мышей) не зависит от набора гоносом, и, хотя в норме происходит у половых клеток с ХХ-хромосомами, однако начальные стадии оогенеза по крайней мере могут осуществляться и в половых клетках, имеющих XY гоносомы. Ш.4.2. ООГЕНЕЗ ПОЛОВЫХ КЛЕТОК, НЕСУЩИХ МУТАЦИЮ Sxr Такой путь развития половых клеток XX Sxr зависит как от соматического окружения, так и от состояния данного Sxr локуса Y-хромосомы. Если в мозаичных гонадах половые клетки находятся в окружении соматических элементов, развивающихся по женскому типу, и если данный локус Y-хромосомы инактиви- руется в ходе оогенеза, то при этом условии XX Sxr половые клетки преобразуются в полноценные ооциты, которые могут завершать оогенез. В противном случае половые клетки рано вступают в мейоз, но доходят в своем развитии лишь до конца профазы первого мейотического деления, вступают в диктио- тену, а затем погибают. Именно такие яйцеклетки были найдены в просветах семенных канальцев у мышей XX Sxr, у которых гонады развивались по мужскому типу (McLaren, 1980, 1981). Следовательно, и в данных случаях инициация мейоза не зависит от набора гоносом и оогенез может либо доходить до диктиотены (когда локус Y-хромосомы, детерминирующий развитие тестикула, активен), либо до конца (если этот локус инактивируется и половые клетки развиваются в окружении соматических элементов гонады, имеющих XX набор).
///. Взаимодействие соматических и половых клеток 63 Ш.4.3. ТРАНСПЛАНТАЦИИ ЗАЧАТКА СЕМЕННИКА В ЭКТОПИЧЕСКИЕ МЕСТА При трансплантации зачатка тестикулов зародышей мышей под капсулу почки взрослым животным было замечено, что в тех случаях, когда семенные канальцы разрушались, некоторые половые кле*тки преждевременно вступали в мейоз. Это происходило примерно тогда же, когда в мейоз вступали половые клетки в зачатках яичника (Ozdzenski, 1972). Эти наблюдения приводятся в пользу представления о том, что инициация мейоза не зависит от набора гоносом, а определяется другими факторами, и прежде всего состоянием соматических элементов гонады (Tarkowski 1970). III.4.4. ПОЛОВЫЕ КЛЕТКИ, РАЗВИВАЮЩИЕСЯ ВНЕ ГОНАД Во время миграции первичные половые клетки проходят через область мезонефроса и урогенетального валика. Большинство половых клеток попадает в зачатки гонады, однако некоторые половые клетки колонизируют прилегающие к гонаде зачатки надпочечников. Часть половых клеток остается в составе остатков мезонефроса или разбрасывается по различным другим производным урогенетального валика, включая и брыжжейку почки, хотя их нет в самой почке плода (McLaren, 1984). В закладке надпочечников у плодов мыши женского и мужского пола найдены половые клетки, находящиеся в профазе мейоза. Это отмечалось на тех стадиях развития, когда в зачатке гонады в мейоз вступают женские половые клетки. Электронно-микроскопические исследования доказали, что мейоциты надпочечников плодов осуществляют нормальную профазу первого мейотиче- ского деления и образуют типичные синаптонемальные комплексы (Upadhyay, Zamboni, 1982). Дальнейшие исследования установили, что на 10—14 сут после рождения у мышат как мужского, так и женского пола в надпочечниках находятся растущие ооциты, окруженные зоной пеллюцида, но без фолликулярных клеток (Zamboni, Upadhyay, 1983). В самое последнее время эти наблюдения были подтверждены (McLaren, 1984; Hogg, McLaren, 1985). Используя окраску на щелочную фосфатазу, было обнаружено значительное количество мейотических половых клеток в надпочечниках плодов мышей как мужского, так и женского пола. Примечательно, что в остатках мезонефроса в мейоз вступало мало половых клеток у самцов, но много половых клеток у плодов женского пола (McLaren, 1984). Цитогенетиче- ские исследования показали, что мейоциты в надпочечниках плодов мужского пола не имели половых пузырьков, т. е. морфология их ядер на стадии пахитены и диплотены соответствовала типичным мейоцитам женского пола (Hogg, McLaren, 1985). Вступая преждевременно в мейоз, мужские половые клетки изменяют характер поведения гоносом. Гоносомы не гетерохроматизируются и не изолируются от остальных хромосом, т. е. не образуют полового пузырька. Это, вероятно, говорит о продолжающейся генетической активности как Х-, так и Y-хромо- сомы в половых клетках, вступивших в мейоз в эмбриональном периоде онтогенеза. Известно, что наличие полового пузырька в мейоцитах служит морфологическим выражением изоляции и генетической инактивации комплекса XY хромосом в сперматогенезе, т. е. во время профазы мейоза и позже (Solari, 1974).
64 Часть первая. Предзародышевое развитие Ш.5. МЕХАНИЗМЫ ИНИЦИАЦИИ МЕЙОЗА В ЖЕНСКИХ ПОЛОВЫХ КЛЕТКАХ Уже давно было высказано предположение о наличии в зачатке гонады у зародышей мужского пола каких-то факторов, препятствующих инициации мейоза. Эта гипотеза впервые была сформулирована еще 15 лет тому назад следующим образом: «Как мужские, так и женские половые клетки генетически запрограммированы для мейоза, но они вступают в мейоз на разных стадиях онтогенеза. XY гаметы способны вступать в мейоз тогда же, как и XX гаметы. Однако при нормальном развитии зародышей мужского пола этот процесс предотвращается или угнетается какими-то факторами, которые исходят из соматических клеток зачатка гонады. Угнетение митотических делений гоний, которые наблюдаются в это время, можно расценивать как показатель того, что в закладке тестикула превалируют условия, неблагоприятные для инициации как митотической, так и мейотической профазы» (Tarkowski, 1970, с. 57). Эта гипотеза Тарковского полностью сохраняет свое значение, хотя за истекшее время были выдвинуты более сложные представления о факторах, регулирующих инициацию мейоза в половых клетках млекопитающих. В литературе последних лет превалирует мнение, согласно которому в яичнике плодов млекопитающих образуется вещество, индуцирующее мейоз (MIC — от англ. Meiosis inducing substance), а в тестикулах вещество (или вещества), предотвращающее или препятствующее инициации мейоза (Byskov, 1978). Была сделана попытка частичной очистки вещества, индуцирующего мейоз из зачатка яичника, хотя эта попытка и не удалась (Anderson et al., 1981). Так как природа этих регуляторов профазы мейоза остается совершенно неизвестной и не понятен их механизм действия, предлагается называть их не веществами, а факторами инициации или ингибирования мейоза, не предопределяя тем самым природу и способы их действия (McLaren, 1981, 1983b). Нет сомнения в том, что инициация мейоза и дальнейший путь развития половых клеток млекопитающих зависят от природы тех тканей, в которых находятся половые клетки. Разногласия существуют лишь в отношении того, оказывают ли соматические элементы ингибирующее или стимулирующее действие на мейоз. Согласно одной точки зрения, все половые клетки изначально обладают потенцией рано вступать в мейоз, т. е. осуществлять оогенез. Это свойство мужские половые клетки теряют под влиянием каких-то ингибирующих мейоз факторов, вырабатываемых в тестикулах (Tarkowski, 1970, 1982; McLaren, 1984). Полагают, что в зародышах мужского пола половые клетки взаимодействуют с предшественниками клеток Се-ртоли и при этом вырабатывается какой-то ингибитор (так называемое «вещество, предотвращающее мейоз» — meiosis preventing substance). Если семенные канальцы разрушаются либо предшественники клеток Сертоли утрачивают цитоплазматические контакты с половыми клетками, то эти половые клетки вступают в мейоз, несмотря на то что они имеют набор XY гоносом. Другая точка зрения исходит из того, что раннее вступление в мейоз является ответной реакцией половых клеток на какой-то сигнал, генерируемый мезонефросом. Предполагается, что фактор, инициирующий мейоз в женских половых клетках, вырабатывается клетками мезонефроса и затем диффундирует в зачаток гонады. Высказано предположение, что в самом зачатке гонады возникает градиент распределения этого гипотетического вещества (Byskov, 1978; Byskov et al., 1985). Думают, что и мужские половые клетки, способные реагировать на фактор
///. Взаимодействие соматических и половых клеток 65 инициации мейоза, т. е. в ответ на его действие могут вступать в профазу мейоза столь же рано, как и женские половые клетки. Однако мужские половые клетки, находясь в зачатке тестикула в составе первичных семенных канальцев, защищены от действия данного фактора и поэтому не вступают в мейоз тогда, когда вступают в мейоз женские половые клетки в яичнике (Byskov, 1978, 1979; Byskov et al., 1985). Так как половые клетки, не попавшие в зачаток гонады, также могут вступать в мейоз (Upadhyay, Zamboni, 1982), высказано предположение, что мей- озоиндуцирующий фактор может вырабатываться не только мезонефросом, но и его производными, в частности зачатком надпочечника. Одна ко если отделить зачаток гонады от мезонефроса на той стадии, когда в половых вал!111аххщ£_иелщчала.сь дифференцировка соматическихздемеыюв^— т. е. пoJLПШШ^ьJJШдeJ£Лj^тьJн^вoJмoжнo A0.5—11 сут), и культивировать поло- выё валики in vitro, то в з^атках~жШШо1ГгШаЩ~Т1Шювыё~клетки вступают в мейоз, а в зачатке мужской гонады не начинают мейотическую профазу. Таким образом, если мейозостимулирующий фактор и вырабатывается мезонефросом, то он уже находится в зачатке гонады до начала половой дифференцировки соматических элементов (McLaren, 1983a, 1983b). Подобные наблюдения были проведены и на половых валиках зародышей крыс, культивируемых in vitro с 12.5 сут развития (Stein, Anderson, 1981). В недавнем обзоре (McLaren, 1984) обстоятельно разобрана данная проблема, причем критически рассмотрены литературные источники и сделан вполне обоснованный вывод, что вопрос о наличии в зачатках гонад мейозоиндуцирую- щих и мейозоингибирующих факторов не может считаться решенным,и сформулированные гипотезы требуют весьма сдержанного отношения, так как одни факты подтверждают гипотезу стимуляции, а другие факты свидетельствуют в пользу гипотезы ингибирования мейоза, хотя некоторые факты не укладываются ни в одну, ни в другую гипотезу. Таким образом, проблема инициации мейотического цикла в оогенезе млекопитающих еще весьма далека от решения. Мейоз является универсальным процессом, присущим не только животным, но и растениям. Однако существующий уровень знаний не позволяет объяснить механизмы переключения митотических циклов на мейотический цикл. Этот кардинальный вопрос занимал умы многих поколений ученых, не решен он и поныне, хотя в последнее время достигнуты существенные успехи в изучении биохимических и молекулярно-биологических основ мейоза (см. обзоры: Богданов, 1975; Ляпунова, Богданов, 1975; Богданов, 1982). Приходится лишь ограничиться общими соображениями о том, что при выделении у зародышей млекопитающих линии половых клеток создается программа их дальнейшего развития, предусматривая и потенциальную возможность переключения митотических циклов в мейотический цикл. Иными словами, первичные половые клетки изначально обладают способностью именно к такому пути развития, одним из закономерных и неизбежных этапов которого является мейоз. Есть основания думать, что программа половых клеток закладывается не одномоментно, а в несколько приемов, т. е. дополняется и уточняется по ходу развития первичных половых клеток. Поэтому для осуществления мейоза первичные половые клетки нуждаются в каком-то дополнительном стимуле, причем они компетентны отвечать на это триггерное воздейстие только после того, как достигли определенного биологического возраста. Не исключено, что этот биологический возраст измеряется количеством митотических циклов или раундов репликации ДНК, причем отсчет начинается с того момента, когда в раннем зародыше выделяется клон первичных половых клеток (см. гл. I). Известно, что последний (предмейотический) раунд реплика- 5 А. П. Дыбан
66 Часть первая. Предзародышевое развитие ции ДНК является решающим, так как после этого клетки либо вступают в мейоз (оогонии), либо в них возникает длительная фаза торможения митотических циклов (просперматогонии). Так как мейоз контролируется генами, причем найдены мутации, при которых половые клетки не вступают в мейоз, а, продолжая митотические циклы, вскоре погибают (Голубовская, 1975; Ляпунова, Богданов, 1975; Baker et al., 1976; Богданов, 1982), есть известные основания полагать, что и у млекопитающих программирование линии половых клеток предусматривает активацию группы «генов инициации мейоза», действие которых в оогенезе начинается раньше, чем в сперматогенезе. Остается совершенно неизвестным, в каких хромосомах мыши локализованы такие «гены инициации мейоза», когда они экспрессируются и как регулируется активность этих генов. «Гены инициации мейоза», по-видимому, не локализованы в гоносомах, так как при инициации мейоза набор гоносом в половых клетках не играет решающей роли. Однако для нормального течения сперматогенеза серьезным препятствием является наличие двух Х-хромосом. Это обусловлено тем, что в нормальном оогенезе обе Х-хромосомы являются генетически активными, тогда как во время сперматогенеза Х-хромосома инактивирована. Если в клетках, вступивших в сперматогенез, одна Х-хромосома сохраняет генетическую активность либо если обе Х-хромосомы остаются генетически активными, то это неминуемо приводит к гибели таких сперматоцитов (McLaren, 1983a, 1983b). Есть прямые доводы в пользу того, что какие-то гены Y-хромосомы должны экспрессироваться в половых клетках мышей для того, чтобы они завершили сперматогенез. Так, например, при цитологическом исследовании тестикулов мышей XO/XY или овотестикулов гермафродитов XO/XY, у которых были найдены ХО клетки в костном мозге (от 47 до 80 %), не было обнаружено проли- ферирующих сперматогоний с набором ХО и не найдено клеток ХО среди сперматоцитов на стадии первой мейотической метафазы. Авторы приходят к выводу, что у мышей локус Sxr содержит ген, необходимый для сперматогенеза, причем этот ген располагается в дистальной части Y-хромосомы (Levy, Burgoyne, 1986). Таблица 8 Зависимость инициации мейоза в половых клетках от их локализации и набора гоносом (по: McLaren, 198oa, 1984; с дополнениями) Локализация половых клеток в зачатках Надпочечник Мезонефрос Яичник Семенник в семенных канальцах вне семенных канальцев Овотестикул Набор гоносом половые клетки XX XY XX XY XX ХО XY XY XY XX XY XY соматические элементы XX XY XX XY XX Хх/хо XY XX XY XX/XY XX XY Половые клетки в профазе мейоза у 15—16-суточных зародышей женского пола + + + + ± мужского пола + + + — + + + —
///. Взаимодействие соматических и половых клеток 67 Для сперматогенеза необходимо, чтобы мейоз начинался значительно позже, чем в оогенезе. Последнее связано с тем, что при сперматогенезе должна успеть сформироваться популяция дефинитивных стволовых клеток (сперматогоний Ао, Ai и т. д.), за счет митотической пролиферации которых обеспечивается образование огромного количества мужских гамет,.на много порядков превышающих количество первичных ооцитов, т. е. пула клеток, который служит запасом для оогенеза на протяжении всей жизни самки. Вероятно, именно поэтому существует биологический барьер, препятствующий тому, чтобы мужские гонии вступали в мейоз слишком рано, ибо иначе все они превратятся в мейоциты и популяция митотически делящихся стволовых клеток не сможет образоваться. У млекопитающих существует эффективный механизм элиминации аномальных мужских клеток, преждевременно вступивших в мейоз. Они либо превращаются в ооциты, либо погибают, причем последнее происходит чаще, чем первое. Если мужские половые клетки вступают в мейоз тогда же, как и женские половые клетки, то, как правило, такие клетки становятся женскими гаметами, способными или не способными завершать оогенез. Мужские гаметы, потерявшие Y-хромосому во время преждевременного мейоза, но сохранившие набор ХО, могут становиться полноценными яйцеклетками, если они развиваются в окружении соматических клеток женского пола (XX или ХО клеток). В гаметогенезе существует еще один механизм, благодаря которому инверсия мужских половых клеток происходит реже, чем это можно было ожидать на основании частоты преждевременной инициации мейоза в мужских половых клетках. Если мужские половые клетки (имея набор XY хромосом) вступают в мейоз тогда же, как и женские половые клетки, т. е. у мышей в пренатальном периоде онтогенеза, то поведение их гоносом в мейотической профазе изменяется. В таких клетках не образуется половой пузырек, т. е. обе гоносомы остаются активными не только во время зиготены, пахитены и диплотены, но, по- видимому, и на более поздних стадиях гаметогенеза. Это приводит к тому, что у мужских половых клеток нарушается баланс между генопродуктами аутосом и гоносом, что должно приводить к гибели этих клеток. В табл. 8 приведены сводные данные о возможных путях развития половых клеток с набором XX или XY гоносом. Эти данные следует принимать во внимание при работах, направленных на инверсию развития половых клеток, т. е. получение млекопитающих одного определенного пола. В принципе такие вмешательства в гаметогенез возможны, однако они наталкиваются на серьезные затруднения, преодоление которых зависит от более углубленного изучения ранних стадий гаметогенеза, и в том числе механизмов инициации мейоза в половых клетках. Глава IV , ПРОФАЗА ПЕРВОГО МЕЙОТИЧЕСКОГО ДЕЛЕНИЯ ООЦИТОВ В предыдущей главе рассмотрена одна из существенных особенностей оогенеза млекопитающих — инициация мейоза на значительно более ранней стадии развития организма, чем в сперматогенезе. После инициации мейоза в ооцитах осуществляются ранние стадии профазы (от лептотены до диплотены), затем мейоз блокируется и диплотенные ооциты 5*
68 Часть первая. П редзародышевое развитие переходят в состояние относительного покоя (стадия диктиотены), во время которой размеры ооцитов не увеличиваются, а их ядра обладают крайне низкой генетической активностью. Когда ооциты начинают расти, их ядра остаются на стадии диплотены, но хромосомы проявляют высокую транскрипционную активность. На заключительных стадиях роста ооцитов транскрипционная активность диплотенных хромосом снижается до минимального уровня, а в ядрах происходят изменения, связанные с приобретением компетентности к созреванию. Лишь после всех этих преобразований ооциты из профазы вступают в метафазу первого мейотического деления, что и является началом их созревания. Таким образом, во время профазы,.пер.вшх.дел£ни.я созревания происходят существенные изменениа.шк..хромое©много-.аппарата, так и цитоплазмы ооцитов, причем период роста ооцитов приходится на определенные моменты профазы. Целесообразно поэтому разделить этот период оогенеза на раннюю и позднюю профазу и предложить следующую классификацию. I. Ранняя профаза 1. Пролептотена и лептотена 2. Зиготена 3. Пахитена 4. Ранняя диплотена II. Поздняя профаза 1. Диктиотена (диффузная диплотена в примордиальных ооцитах) 2. Продвинутая диплотена (основной рост ооцитов) 3. Поздняя диплотена (прекращение роста ооцитов и формирование кариосферы). В основу этой классификации положены изменения мейотических хромосом во время профазы, однако одновременно с этим подчеркивается, что на различных стадиях профазы закономерно изменяется и цитоплазма ооцитов в связи с их ростом. Профаза первого мейотического деления ооцитов млекопитающих достаточно полно исследована при помощи различных методов и подробно описана в ряде работ (см. обзоры: Baker, 1972, 1982; Дыбан, Баранов, 1977; Курило, 1985), поэтому остановимся лишь на вопросах, по которым существуют противоречивые точки зрения. Одним из таких вопросов является так называемая прелептотена, т. е. изменения ядер в самом начале профазы. IV. 1. МОРФОЛОГИЯ ЯДЕР ООЦИТОВ ПРИ ИНИЦИАЦИИ МЕЙОЗА (ВО ВРЕМЯ ПРЕЛЕПТОТЕНЫ) Высказано предположение, что прежде чем вступить в профазу мейоза в ядрах ооцитов хромосомы сильно конденсируются, затем деконденсируются и лишь после этого ядра приобретают строение, присущее типичной лептотене. Эти представления недавно выдвинуты в отношении мейоцитов человека (Stahl, Luciani, 1971; Гапиенко, 1975; Курило, 1982), овцы (Mauleon et al., 1976), мыши (Hartung, Stahl, 1977). Пролептотенная конденсация и деконденсация хромосом описывается в мейозе у птиц и млекопитающих следующим образом: «Как правило, за тело- фазой последнего гониального митоза следует период, когда хроматин в сильной степени деконденсируется и в результате ядро приобретает организацию типичного интерфазного. Затем в ядре появляются хромоцентры, представляющие околоцентромерный гетерохроматин. Их число соответствует диплоидному числу хромосом. На следующем этапе хромосомы полностью конденсируются в компактные гетерохроматиновые массы. У млекопитающих конденсированные
IV. Профаза первого мейотического деления ооцитов 69 хромосомы в виде компактных хроматиновых блоков локализуются в основном под ядерной оболочкой и не контактируют друг с другом» (Гагинская, Калинина, 1982, с. 98). Такой же вывод сделан на основании изучения околоцентромерного С-гете- рохроматина в ооцитах человека: «После нескольких митотических делений оогоний они переходят в ооциты на стадии, прелептотенной конденсации хромосом. С помощью С-методики окрашивания гетерохроматина в каждой конденсированной и деконденсирующейся затем хромосоме прелептотенных ооцитов человека выявлен околоцентромерный гетерохроматин. Это свидетельствует о том, что каждая глыбка представляет собой отдельную интенсивно конденсированную хромосому» (Курило, 1985, с. 14). Однако окраска на С-гетерохроматин не дает оснований для такого вывода, хотя и позволяет подсчитывать количество митотических или мейотических хромосом. Необходимо применять иные методы исследования, которые дают возможность четко различать дегенерирующие оогоний и ооциты от нормальных половых клеток, вступающих в мейоз. Необходимо не забывать, что ряд авторов многократно описывали у различных млекопитающих пикнотические изменения ядер оогоний и ооцитов, причем конденсацию хромосом относили именно к дегенеративным изменениям ядер, т. е. расценивали как свидетельство гибели этих половых клеток (см.: Baker, 1972, 1982). Исследуя зачатки гонад крыс при помощи метода, позволяющего получать хорошие хромосомные препараты изолированных мейоцитов (Дыбан, 1983), было отмечено, что многие оогоний гибнут во время метафазы митотического деления, т. е. дегенерируют не завершив митоза. Изменения метафазных митотических хромосом на последовательных стадиях дегенерации оогоний крыс полностью соответствует картинам, описанным некоторыми авторами под видом так называемой прелептотенной конденсации хромосом в мейоцитах. На рис. 5 приведены последовательные стадии дегенерации митотически делившихся оогоний крыс. Подобные наблюдения на мышах описаны и в недавних работах (De Felici, McLaren, 1983), авторы которых также считают ядра с конденсированными хромосомами атретическими митозами (см.: McLaren, 1984). На хороших цитологических препаратах четко заметны последовательные изменения митотических метафазных хромосом по ходу дегенерации оогоний крыс — от начальной до полной конденсации хромосом и превращения каждой митотической хромосомы в хроматиновую глыбку, после чего ядро начинает плохо окрашиваться и распадается. Необходимо иметь в виду, что митотические хромосомы крыс характеризуются определенной морфологией и поэтому нетрудно проследить за преобразованиями индивидуальных хромосом во время их пикнотизации, т. е. по ходу дегенерации оогоний. Однако ни разу не были найдены картины, свидетельствующие о деконденсации пикнотизированных хромосом, представляющих собой компактные хроматиновые блоки. Примечательно, что и при распластывании ядер на поверхности мениска гипотонического раствора и последующего окрашивания таких препаратов серебром не было найдено картин, которые могли бы говорить о последовательной конденсации и деконденсации хромосом в ооцитах млекопитающих, вступающих в лептотену (Moses, 1977; Moses et al., 1982; Speed, 1982). Таким образом, есть все основания считать, что под видом так называемой прелептотенной конденсации и деконденсации хромосом некоторые авторы представляют произвольно подобранный ряд половых клеток, в который включают оогоний на последовательных стадиях дегенерации. Эти клетки ошибочно называют мейоцитами с различной степенью конденсации хромосом. К данному
70 Часть первая. Предзародышевое развитие ряду относят, кроме того, и лептотенные ооциты, в ядрах которых заметны тонкие хроматиновые нити. Однако мейоциты не образуются из гоний, в которых произошла конденсация митотических хромосом, ибо эти гонии погибают, не вступая в мейоз, и хромосомы в них не деконденсируются. Есть все основания считать, что инициация, мейозя в оонитах млекопитаю- щих начинается с ,хех^_же_щменений "ядер, которые давно...были описаны при инициации мейоза в самых различных объектах — с предмейотического синтеза ДНК, в результате которого ядра гоний приобретают 4с ДНК- Затем клетки вступают в фазу G2, во время которой ядра сохраняют типичную для интерфазных ядер морфологию. После этого половые клетки вступают в мейоз, т. е. начинается стадия лептотены. Инициация мейоза, по-видимому, не визуализируется в виде цикла конденсации—деконденсации хромосом. IV.2. РАННЯЯ ПРОФАЗА Поведение хромосом в ооцитах млекопитающих, осуществляющих лепто- тену, зиготену, пахитену и раннюю диплотену, не отличается от картин, многократно описанных для этих стадий профазы первого мейотического деления в самых разнообразных объектах. Вместе с тем применение новых методов анализа мейоцитов, т. е. расправление хромосом на поверхности выпуклого мениска гипотонического раствора, последующее окрашивание распластанных синаптонемных комплексов азотнокислым серебром и исследование тотальных препаратов мейоцитов при помощи светооптических или электронно-микроскопических методов, существенно изменило представления о морфологии и поведении хромосом в пахитене. Этот принципиально новый методический подход открыл широкие горизонты и для кариотипирования (на основании синаптонемных комплексов) мейоцитов растений и различных животных, включая и млекопитающих. Данные вопросы рассмотрены в обстоятельном обзоре (Богданов, 1985). Этот подход может найти и прикладное применение для изучения причин мужской и женской стерильности у млекопитающих (Тимофеева, Богданов, 1982). Пахитена у ооцитов млекопитающих отличается от пахитены у спермато- цитов тем, что в ооцитах хромосомы проявляют более высокую транскрипционную активность и имеют несколько иное строение, хотя в обоих случаях во время пахитены в хромосомах происходит коньюгация, синапсис и кроссинговер. На стадии поздней пахитены в ооцитах у мышей описаны картины десинапсиса, преимущественно в небольших бивалентах, по-видимому, в биваленте хромосом № 19. Остальные биваленты на этой стадии остаются коньюгированы. Не исключено, что эти картины свидетельствуют о предрасположении бивалентов небольших аутосом к асинапсису либо к преждевременному десинапсису, что может сказаться на сегрегации этих хромосом во время метафазы и анафазы. Для оогенеза млекопитающих характерна гибель значительного количества мейоцитов на стадии пахитены. Атретические пахитенные ооциты, заметные на гистологических срезах яичников плодов, называют Z-клетками. В последнее время данный вопрос детально исследован в оогенезе мышей с XX и ХО набором и показано, что на 19.5 сут в яичниках плодов мышей погибает значительное количество пахитенных ооцитов (Burgoyne, Baker, 1985). Предполагалось, что это обусловлено дефицитом дозы генов Х-хромосомы, так как нормальный оогенез требует активности обеих Х-хромосом (см. гл. III). Однако массовая гибель пахитенных ооцитов замечена не только у ХО самок, но и у мышей с инверсией Х-хромосомы (Jn (X)/X мышей) и, хотя и в меньшей степени, но и в оогенезе мышей с нормальным кариотипом (набором XX).
IV. Профаза первого мейотического деления ооцитов 71 Считается, что нарушения мужского мейоза у млекопитающих могут быть связаны с тем, что перестроенные аутосомы коньюгируют с X хромосомой и этим препятствуют ее инактивации или сами инактивируются (Forejt, 1982). Однако у ХО самок и ХО Sxr самцов (см. гл. III) нарушения гематогенеза затрагивают стадию пахитены, во время которой погибают многие мейоциты. У самок ХО те ооциты, которые пережили стадию пахитены, завершают оогенез, и из них образуются яйцеклетки, способные к нормальному оплодотворению и дальнейшему развитию. Авторы полагают, что выживаемость части ооцитов с набором ХО, т. е. непарной X хромосомой, связаны с негомологичным спариванием, т. е. образованием синаптонемального комплекса между плечами одной и той же X хромосомы, приобретающей во время пахитены вид дамской шпильки (Burgoyne, Baker, 1985). Известно, что транслокация аутосом сильнее сказывается на сперматогенезе, чем на оогенезе (Forejt, 1982). Однако недавно было установлено, что при реципрокных транслокациях некоторых аутосом нарушается и оогенез, причем ооциты погибают именно в пахитене (Burgoyne et al., 1985). Сформулирована гипотеза (Burgoyne, Baker, 1984), согласно которой существует механизм, избирательно элиминирующий мейоциты, в которых содержатся хромосомы, не коньюгировавшие во время пахитены, причем это происходит как в сперматогенезе, так и оогенезе млекопитающих. Полагают, что гибель мейоцитов, несущих неконьюгированные или неполностью коньюгированные пахитенные хромосомы, чаще проявляется в сперматогенезе, чем в оогенезе. Это, вероятно, обусловлено тем, что хотя и в сперматогенезе может происходить исправление ошибок коньюгации (о явлении синапти- ческой пригонки см.: Moses et al., 1982, а также Богданов, 1985), однако только в оогенезе существует длительный период блокады мейоза, что способствует более эффективной коррекции таких аномалий, т. е. нормализации функции хромосом ооцитов. Эта интересная гипотеза (Burgoyne, Baker, 1984) заслуживает экспериментальной проверки. На заключительной стадии ранней профазы (в конце пахитены и в ранней диплотене) в ооцитах млекопитающих описаны хромосомы, напоминающие ламповые щетки, в которых видна центральная осевая часть и мелкие боковые петли. Применяя электронную микроскопию и гистоавторадиографию с использованием Н3-уридина, было показано, что такие хромосомы включают метку и при этом визуализируются транскрипционные единицы, которые, однако, содержат небольшое количество РНК полимеразы (Bakken, McClanahan, 1978). Следовательно, во время поздней пахитены—ранней диплотены хромосомы в ооцитах мышей проявляют явную транскрипционную активность, которая, однако, ниже, чем на стадии продвинутой диплотены (см. раздел 3.2 этой главы). IV.3. ПОЗДНЯЯ ПРОФАЗА Основная генерация ооцитов мыши и многих других млекопитающих блокируется во время диплотены и в таком состоянии, т. е. на стадии так называемой диктиотены (диффузной диплотены), участвует в фолликулогенезе. IV.3.1. ДИКТИОТЕНА (ДИФФУЗНАЯ ДИПЛОТЕНА В ПРИМОРДИАЛЬНЫХ ООЦИТАХ) Стадия диктиотены характеризуется тем, что ядра ооцитов увеличиваются, их хромосомы деконденсируются, и на суховоздушных препаратах ядра приобретают более или менее гомогенный вид, напоминая интерфазные ядра сомати-
72 Часть первая. Предзародышевое развитие ческих клеток. На препаратах мейоцитов, распластанных на поверхности и окрашенных серебром, синаптонемальные комплексы и осевые элементы хромосом плохо различимы, хроматин приобретает гомогенную структуру, хотя в ядре и визуализируются крупные гранулярные ядрышки (Speed, 1982). У мышевидных грызунов хромосомы диктиотенных ооцитов очень сильно деспирализованы,и на светооптических препаратах хроматин ядер состоит из тонкой сети, заметной лишь при некоторых способах окраски (Baker, 1972). При электронно-микроскопическом исследовании диктиотенных ооцитов этих животных осевые комплексы диплотенных хромосом не выявляются (Habibi, Franchi, 1978). Однако у других видов млекопитающих ядра диктиотенных ооцитов содержат структуры, напоминающие типичные диплотенные хромосомы в ооцитах амфибий, что особенно четко заметно при электронно-микроскопическом исследовании ооцитов коров, человека и приматов. Такие хромосомы в диктиотенных ооцитах этих видов млекопитающих называют первичными ламповыми щетками. В ряде отечественных работ (Зыбина, 1971; Грищенко, 1972, 1984; Зыбина с соавторами, 1974; Кикнадзе, 1975; Зыбина, Грищенко, 1980) детально исследовались ядра в ооцитах различных видов млекопитающих. Эти работы показали, что и у мышевидных грызунов, преимущественно во время начала роста ооцитов, также можно визуализировать хромосомы, напоминающие хромосомы типа ламповых щеток (Зыбина, Грищенко, 1980; Грищенко, 1984). Однако эти наблюдения отнюдь не противоречат представлениям о существовании фазы диктио- тены в оогенезе млекопитающих. Следует лишь согласиться с тем, что диктио- тена — это одна из форм существования диплотенных мейоцитов, при которой мейотические хромосомы не проявляют высокой транскрипционной активности, но могут иметь разное строение. Для того чтобы подчеркнуть, что эта стадия относится к диплотене, ее называют как диктиотенной стадией мейотической профазы, так и стадией диффузной диплотены (Baker, 1982). Диктиотена предшествует периоду роста ооцитов, и в это время ооциты находятся в состоянии, которое условно можно назвать равновесным (или дремлющим) состоянием. Блокада мейоза в диплотене характерна для оогенеза многих животных, а не только млекопитающих. Однако стадия диктиотены типична для оогенеза млекопитающих, но не для оогенеза других позвоночных. У млекопитающих при переходе на стадию диктиотены в норме вокруг ооцита формируется слой фолликулярных клеток, и таким образом образуются примордиальные фолликулы. В составе примордиальных (первичных) фолликулов, содержащих один слой уплощенных фолликулярных клеток, ооциты длительно сохраняются в яичнике, составляя у большинства млекопитающих тот запас половых клеток, за счет которого осуществляется процесс оогенеза на протяжении всей жизни животного. Однако некоторые генерации ооцитов из короткой диплотены, минуя диктио- тену, непосредственно вступают в диакинез и в метафазу первого деления созревания. Эти картины наблюдаются в яичниках у мышей в возрасте 20—25 сут. (Baker, 1982). Следовательно, первые генерации созревающих ооцитов мышей происходят за счет клеток, у которых мейоз на стадии диплотены не блокировался. Продолжительность стадии диктиотены различна. У некоторых популяций ооцитов мышей эта стадия продолжается несколько месяцев, а у других популяций — полтора-два года. У человека стадия диктиотены может продолжаться от 14—15 до 45—50 лет. Обычно у самок репродуктивного возраста ооциты, находившиеся на стадии
IV. Профаза первого мейотического деления ооцитов 73 диктиотены различное (продолжительное или более короткое) время, не отличаются по своим свойствам, в том числе по способности завершать оогенез и оплодотворяться. Таким образом, транскрипционная активность хромосом диктиотенных ооцитов, вероятно, обеспечивает лишь выживаемость клеток и те низкие метаболические потребности, которые характерны для ооцитов, находящихся в приморди- альных фолликулах. Биологический смысл стадии диктиотены сводится к созданию такого равновесного состояния, в котором ооциты млекопитающих могут блокироваться и сохраняться длительное время, не теряя способности вступать в рост и созревание. Необходимо иметь в виду, что популяция диктиотенных ооцитов является изначально гетерогенной. Так, в яичниках плодов мыши ооциты, находящиеся в составе примордиальных фолликулов, варьируют в размере в 6 раз, а у 3— 4-суточных мышат размер диктиотенных ооцитов колеблется еще в более широких границах — они могут различаться размерами друг от друга в 64 раза (Burgoyne, Baker, 1985). Возможно, что такая гетерогенность ооцитов свидетельствует о том, что часть из них находится в периоде диктиотены, а другая непосредственно вступает в период роста, м^нуя фазу диктиотены. Причины перехода ооцита в состояние диктиотены, т. е. блокады мейоза на этой стадии, остаются невыясненными. Сформулирована гипотеза, объясняющая это ингибирующим влиянием на ооцит каких-то факторов, вырабатываемых фолликулярными клетками (Ohno et al., 1963; Ohno, Smith, 1964). Предполагается, что ассоциация негомологичных хромосом в ооцитах мышей и других млекопитающих происходит под влиянием фолликулярного эпителия на той стадии, когда диплотенные ооциты непосредственно окружаются фолликулярными клетками. В тех ооцитах, которые на данных стадиях не вступают в контакт с фолликулярными клетками, не происходит ассоциации негомологичных хромосом, и эти ооциты из профазы сразу же переходят в метафазу мейоза и затем либо погибают, либо дают первую генерацию неполноценных яйцеклеток (Ohno et al., 1963; Blandau, 1967). Хотя эта гипотеза и имеет привлекательные положения, однако ряд факторов противоречит ей. Так, при более совершенных методах исследования ассоциация негомологичных хромосом в профазе мейоза у ооцитов млекопитающих, как правило, не обнаруживается (Moses, 1977; Speed, 1982). Более существенно, что если культивировать яичники плодов или новорожденных мышей в средах без гонадо- тропных гормонов, то ооциты вступают в диплотену и затем переходят в стадию диктиотены. Однако при этом ооциты не окружаются фолликулярными клетками. Несмотря на отсутствие фолликулогенеза, осуществляется такая же программа развития, как в тех ооцитах, которые находятся в составе примордиальных фолликулов (Baker, Franchi, 1972). У мышей с мутацией Sex reversal (символ Sxr) ооциты могут находиться в составе семенных канальцев (см. разделы 3 и 4 гл. III). Такие ооциты не окружаются слоем фолликулярных клеток, однако в ооцитах мейоз затормаживается на стадии диктиотены (McLaren, 1980, 1981). Подобные же картины, т. е. переход в состояние диктиотены, отмечены в ооцитах, располагающихся вне гонад, в зачатке надпочечника (Upadhyay, Zamboni, 1982; Zamboni, Upadhyay, 1983), а также после облучения или гипофизэктомии молодых мышей. И в этих случаях фолликулы не формируются, однако ооциты, вступая в диплотену, затем блокируются, т. е. переходят на стадию диктиотены. Примечательно, что и эти ооциты сохраняют жизнеспособность, т. е. могут в дальнейшем вступать в период роста (Baker, 1982). Таким образом, хотя обычно диктиотена отмечается в ооцитах, окруженных фолликулярными клетками, однако переход в это состояние возможен и в слу-
74 Часть первая. Предзародышевое развитие чаях, когда ооциты не находятся в составе фолликулов. Вполне возможно, что блокада мейоза на стадии диктиотены обусловлена какими-то взаимодействиями ооцитов с соматическими элементами гонады, хотя образование фолликулов не обязательно для этого. Расшифровка этого загадочного вопроса остается задачей дальнейших исследований. IV.3.2. ПРОДВИНУТАЯ ДИПЛОТЕНА (ПЕРИОД ОСНОВНОГО РОСТА ООЦИТОВ) Когда ооциты выходят из состояния блокады (фазы диктиотены) и начинают расти, в это время изменяется морфология и функциональная активность диплотенных хромосом. Этот период называют продвинутой диплотеной (если исходить из структурно-функциональных особенностей хромосомного аппарата ооцитов) либо периодом основного роста ооцитов (если хотят подчеркнуть изменения размеров ооцитов в течение данного периода оогенеза). Сведения о морфологии растущих фолликулов, включая электронно-микроскопические данные, а также результаты сопоставления размеров ооцитов и диаметра фолликулов и их строения, приведены в ряде работ, причем эти вопросы детально исследованы в оогенезе различных млекопитающих (см. обзоры: Дыбан, Баранов, 1977; Peters, McNatty, 1980; Курило, 1982, 1985; Baker, 1982). Как правило, по мере увеличения размера ооцита увеличивается и размер фолликула и количество слоев клеток гранулезы в нем. Поэтому предложено разделять растущие фолликулы на стадии, исходя из их размеров и количества фолликулярных клеток в них. Наиболее распространенная классификация (Pedersen, 1970) основана на подсчете количества фолликулярных клеток. Разработана простая техника прижизненного получения изолированных ооцитов из яичников плодов, новорожденных, мышей старшего возраста (Мап- gia, Epstein, 1975; Eppig, 1976; Mangia, Canipari, 1977). Показано, что в примор- диальных фолликулах ооциты мышей имеют диаметр 12—15 мкм. Такие ооциты получают из яичников мышей в возрасте 1—3 сут после рождения. В фолликулах типа 2 и За (малые фолликулы) диаметр ооцитов мышей может достигать 20 мкм. В растущих фолликулах (тип 36 и 4) найдены ооциты диаметром 30— 60 мкм. Такие ооциты легко получить в большом количестве из яичников 5— 7-суточных мышат. Ооциты, достигшие максимального размера, т. е. завершившие рост и компетентные к спонтанному созреванию (см. раздел 2 гл. V), получают из яичников 4-недельных мышей. Эти ооциты имеют диаметр 75—100 мкм и находятся в антральных фолликулах. Диаметр таких ооцитов равен диаметру овулировавших яйцеклеток (Mangia, Epstein, 1975; Mangia, Canipari, 1977). Вместе с тем известны и случаи, когда размеры ооцитов и размеры фолликулов не коррелируют. Так, в фолликулах у препубертатных мышей ооциты имеют более крупные размеры, чем в соответствующих фолликулах у взрослых мышей (Mangia, Epstein, 1975; Sorensen, Wassarman, 1976; Mangia, Canipari, 1977). Замечено, что ооциты, достигшие максимальных размеров, могут быть найдены в составе фолликулов, размеры и количество клеток в которых не соответствует степени роста ооцита (Blandau, Odor, 1972). Популяция аномальных, однослойных фолликулов, в которых были ооциты, соответствующие по размерам зрелым яйцеклеткам, описана у мутантных мышей LT/Sv (Eppig, 1978; П. А. Дыбан, 1982). У мышей LT/Sv однослойные фолликулы на стадии За и 36 содержат крупные яйцеклетки, размеры которых превышали стадию развития фолликулов. Используя гистоавторадиографию после введения самкам Н3-тимидина,
IV. Профаза первого мейотического деления ооцитов 75 обнаружены различия в пролиферативной активности клеток гранулезы у му- тантных мышей LT/Sv. В тех фолликулах, в которых находились крупные ооциты, пролиферативная активность клеток гранулезы была резко заторможена. Однако в фолликулах с непролиферирующими клетками гранулезы встречались как ооциты диаметром в 10—20 мкм, так и крупные яйцеклетки E0—70 мкм) (П. А. Дыбан, 1982). IV.3.2.1. Механизмы регуляции роста ооцитов и роста фолликулов Механизмы инициации и регуляции роста ооцитов и роста фолликулов, в которых они находятся, изучены плохо, и многие аспекты этой проблемы остаются еще непонятными. Приведенные выше примеры показывают, что ооциты могут достигать максимального размера в фолликулах, состоящих из малого количества фолликулярных клеток. Следовательно, динамика и интенсивность роста ооцитов не определяется количеством и пролиферативной активностью клеток гранулезы. По-видимому, взаимодействие ооцитов с окружающими фолликулярными клетками является лишь одним из составных звеньев сложного процесса регуляции роста ооцита, зависящего от генетической программы, заложенной в самом ооците, и действия внешних сигналов. Более 90 % всех ооцитов в яичниках у половозрелых мышей, крыс, обезьян находится в составе примордиальных фолликулов, стенка которых состоит из одного слоя гранулезы. Большинство этих фолликулов никогда не вступает в период роста, и ооциты, находящиеся в этих фолликулах, подвергаются атрезии, т. е. гибнут, так и не начав расти. Только 10 % ооцитов в яичниках у половозрелых млекопитающих вступает в период роста и составляет пул растущих фолликулов, лишь незначительная часть которых доходит до конца периода роста. Показано, что начальные стадии роста фолликулов не зависят от уровня гонадотропных гормонов. Установлено, что после гипофизэктомии из яичника исчезают большие и средние фолликулы, но сохраняются фолликулы с четырьмя и меньшим количеством слоев клеток гранулезы (Baker, 1982; Bar-Ami, Tsafriri, 1986). Таким образом, выход из состояния покоя и рост фолликула от стадии 36 до стадии 56 не может непосредственно зависеть от стимулирующего действия на фолликулы гонадотропных гормонов гипофиза. Однако если инъецировать мышатам сразу после рождения антисыворотку к гонадотропным гормонам, то рост фолликулов резко затормаживается. Подобная же картина наблюдается и если культивировать яичники зародышей в среде без гонадотропных гормонов. В этих условиях в яичниках образуются фолликулы, которые состоят из одного слоя клеток гранулезы, и ооциты не вступают в дальнейшие фазы роста. Примечательно, что у нормальных плодов человека в яичниках находится большое количество фолликулов, достигших антральных стадий, в которых находятся крупные ооциты, тогда как у анэнцефаличных плодов человека, у которых нет гонадотропных гормонов гипофиза, в зачатках яичников не образуются крупные фолликулы (Edwards, 1980). Эти и ряд других факторов позволили сформулировать гипотезу, согласно которой для инициации роста как фолликулов, так и ооцитов необходим триг- герный стимул со стороны гипофиза, причем гонадотропины действуют на зачаток гонады значительно раньше, чем начинается рост ооцитов и фолликулов. Постулируется, что программирование паттернов роста ооцитов и фолликулов происходит еще в пренатальном или раннем постнатальном периоде под влиянием краткосрочного повышения уровня гонадотропных гормонов, которые действуют вначале на ооцит, а затем и на стенку фолликулов (Baker, 1982).
76 Часть первая. Предзародышевое развитие Кроме того, предполагается, что и у взрослых животных для того, чтобы ооциты вышли из состояния блокады (диктиотены), необходим еще один сигнал. Допускается, что сигнал генерируется самим ооцитом при реализации его генетической информации. При этом в ооците возникает какой-то мессенжер, влияющий на стенку фолликула. Эти фолликулы начинают расти и покидают пул примордиальных фолликулов (Baker, 1982). Не исключено, однако, что популяция фолликуловлзначально является гетерогенной, т. е. одни фолликулы запрограммированы на рост в более раннем, а другие в более позднем периоде онтогенеза (McLaren, 1981). Возможно, что те ооциты, которые первыми вступают в профазу мейоза, первыми вступают и в фазу роста. Данная гипотеза является дальнейшим развитием представлений о так называемом конвейере («production line»), сформулированных для объяснения причин повышения ошибок сегрегации мейотических хромосом при старении самок (Henderson, Edwards, 1968). Эти представления могут быть приложимы лишь к тем животным (например, коровы, обезьяны), у которых в яичнике длительное время (несколько месяцев) образуются различные популяции мейо- цитов, т. е. клетки вступают в мейоз асинхронно, с разрывом в недели и месяцы. У мышевидных грызунов разбросы во времени между первыми и последними генерациями женских половых клеток, вступающих в мейоз, составляют лишь несколько дней. Между тем и у этих млекопитающих на протяжении длительного времени A.5—2 г) в яичниках существует какая-то очередность выхода небольшой части фолликулов из пула примордиальных фолликулов, т. е. инициация их роста. Со статистической точки зрения весьма правдоподобно, что количество фолликулов, которые покидают пул примордиальных фолликулов (в каждый определенный отрезок времени), пропорционально количеству фолликулов, которые остаются в этом пуле (Faddy et al., 1976). Однако не выяснено, является ли этот процесс стохастическим. Показано, что отношение количества растущих фолликулов к общему количеству фолликулов возрастает по мере увеличения возраста самок, когда общий пул фолликулов в яичнике уменьшается. По-видимому, процессы роста фолликулов и роста ооцитов регулируются сложными взаимоотношениями между какими-то факторами, действующими как в самих фолликулах, так и между различными популяциями фолликулов. Установлено, что количество фолликулов в общем пуле примордиальных фолликулов у мышей каким-то образом определяет и количество растущих фолликулов. Однако при этом учитывается общий пул фолликулов, т. е. их количество в обоих яичниках (Baker et al., 1980). Непонятно, каким образом происходит обмен информацией между двумя яичниками и как количество фолликулов в одном яичнике влияет на количество растущих фолликулов в другом яичнике. Приходится думать о существовании программы, предусматривающей время выхода части фолликулов из общего пула примордиальных фолликулов. Этот процесс осуществляется согласно какому-то биологическому ритму и не контролируется непосредственно ни уровнем гонадотропных гормонов, ни уровнем половых стероидов, а каким-то иным образом. Хотя остается невыясненным, каким образом происходит селекция той популяции фолликулов, которая вступает в рост, однако есть известные основания считать, что те фолликулы, которые уже начали интенсивно расти, доминируют над другими фолликулами, угнетая их рост (Di Zarega et al., 1982). Высказано две гипотезы о возможном механизме этого явления. Полагают, что быстро растущие фолликулы уменьшают доступность гонадотропных гормонов гипофиза для других фолликулов и тем самым, по принципу обратной связи, влияют на секрецию гормонов гипофиза. Не исключено, что быстро растущие фолликулы вырабатывают не только эстрогены, но и ингибин и другие белки,
IV. Профаза первого мейотического деления ооцитов 77 которые угнетают продукцию ФСГ в гипофизе и, кроме того, снижают ответную реакцию фолликулов на действие гонадотропинов (Di Zarega et al., 1982). Вторая гипотеза не исключает возможности поступления в кровь ингибиторов ФСГ, но придает главное значение тем регуляторам, которые вырабатываются в фолликуле и локально действуют на уровне этого фолликула или целого яичника.,Эти регуляторы каким-то образом уменьшают количество растущих фолликулов, т. е. создают в яичнике-запрет на рост других фолликулов (Hammond, 1981). Опубликованы данные, свидетельствующие о наличии в фолликулярной жидкости в яичниках различных млекопитающих таких локально действующих ингибиторных белков (Di Zarega et al., 1982). Представления о том, что факторы, находящиеся в фолликулярной жидкости, могут оказывать действие как на уровне этого фолликула, так и на уровне целого яичника, подтверждены рядом опытов. Характерно, что эти свойства фолликулярной жидкости сохраняются и у гипофизэктомированных животных (Cahill et al., 1985). Ингибитор, обнаруживаемый в фолликулярной жидкости в яичниках у овец и человека, по- видимому, не является стероидом, но обладает способностью сильно угнетать фолликулогенез и реакцию фолликулов на экзогенные гонадотропины (Di Zarega et al., 1982). В недавнее время получены факты, свидетельствующие о том, что фолликулярная жидкость содержит и вещества, стимулирующие размножение клеток гранулезы (Cahill et al., 1985). Таким образом, существуют серьезные основания считать, что процесс роста фолликулов регулируется очень сложными и далеко не вполне понятными взаимодействиями между гормонами гипофиза, половыми стероидами и вырабатывающимися в самих фолликулах факторами, стимулирующими и угнетающими пролиферативную активность клеток гранулезы и, по-видимому, влияющими и на рост самих ооцитов. Кроме того, вероятно, существуют и сложные взаимоотношения между ростом самого ооцита и ростом фолликула в целом, причем не исключено, что именно со стороны ооцита возникает какой-то три- герный импульс для инициации роста фолликула. Нельзя исключить и иных взаимодействий, так как ряд фактов говорит в пользу того, что рост ооцитов инициируется какими-то влияниями со стороны клеток гранулезы. Все эти вопросы еще далеки от выяснения и заслуживают более углубленного анализа. IV. 3. 2. 2. Макромолекулярные синтезы в растущих ооцитах О продолжительности роста ооцитов млекопитающих можно судить по блестящей оболочке (zona pellucida), которая в основном образуется самим ооцитом, или по динамике пролиферации клеток гранулезы, так как рост ооцита обычно сопровождается увеличением количества фолликулярных клеток. Изучая пролиферативную активность клеток гранулезы, меченную Н3-тимидином, было показано, что рост фолликулов мыши от стадии покоя (примордиальных фолликулов) и до овуляции продолжается у взрослых животных 18—19 сут. Этот период длится несколько дольше у неполовозрелых мышей (Pedersen, 1970). Однако, используя в качестве метки Н3-ацетилглюкозамин и определяя наличия вокруг ооцита меченой блестящей оболочки, было показано, что у взрослых мышей рост ооцитов продолжается 35 сут (Oakberg, Tyrrell, 1975). Если учитывать изменение диаметра ооцита от начала и до завершения роста, то размеры ооцитов за это время увеличиваются примерно в 6.5—7 раз. Если же определить изменение объема клеток, следует прийти к выводу, что во время периода роста объем ооцита мышей увеличивается примерно в 300 раз (McLaren, 1981).
78 Часть первая. Предзародышевое развитие Хотя увеличение объема ооцита в основном обусловлено возрастанием количества цитоплазмы, однако и диаметр ядра по ходу роста ооцита увеличивается от 10 до 30 мкм. Таким образом, количество ядерного материала во время роста ооцита возрастает, т. е. соотношение между объемом ядра и объемом цитоплазмы изменяется меньше, чем этого можно было ожидать на основании увеличения объема ооцита. Принципиально важное значение имеет вопрос о том, в какой степени увеличение объема цитоплазмы во время роста ооцита обеспечивается генетической активностью ядра ооцита и в какой степени этот процесс зависит от поступления готовых макромолекул из фолликулярных клеток, т. е. из материнского организма. Существуют две точки зрения в отношении этого процесса. Согласно одной из них (Moor, Cran, 1980; McLaren, 1981), во время роста ооцит получает существенное количество белков и других макромолекул от фолликулярных клеток, По другой гипотезе синтез белков и иных составных частей цитоплазмы происходит за счет самого ооцита (Mangia, Canipari, 1977), т. е. обеспечивается генетической активностью его хромосомного аппарата, как это происходит и при росте соматических клеток. В пользу первой точки зрения свидетельствуют убедительные факты о метаболической кооперации ооцитов и клеток гранулезы (см. раздел 2, гл. V). Спорным, однако, остается вопрос о том, в какой степени метаболическая кооперация с фолликулярными клетками может обеспечить рост ооцита готовыми белками или другими макромолекулами, тем более что многие из таких макромолекул не могут проникать в ооцит из фолликулярных клеток через систему щелевых контактов. Существуют факты, которые говорят о том, что ооцит непосредственно синтезирует вещества, которые накапливаются в цитоплазме по мере его роста, в том числе и белки, образующиеся в нем. В пользу этих представлений говорят данные, полученные при изучении паттернов белкового синтеза в ооцитах различных млекопитающих при использовании меченых аминокислот в опытах in vivo и in vitro (Schultz et al., 1979). Был сделан вывод, что в оогенезе млекопитающих синтез белков обеспечивается высокой генетической активностью хромосом растущего ооцита, а поступление экзогенных полипептидов в цитоплазму ооцита не играет существенной роли в этом процессе (Mangia, Canipari, 1977). Высокая транскрипционная активность хромосомного аппарата растущего ооцита млекопитающих не может вызывать никаких сомнений. Этот вывод основан на многочисленных исследованиях ряда авторов, в том числе и на работах, выполненных у нас в стране (Зыбина, 1971; Зыбина и др., 1974, 1980, 1984; Зыбина, Грищенко, 1980). Ссылки на работы предыдущих лет, посвященные этому вопросу, приведены в обзоре Дыбана и Баранова A977). Показателями интенсивного транскрибирования генетической информации растущими ооцитами является усиленный синтез РНК, о чем можно судить по интенсивности включения радиоактивных предшественников, а также по наличию в ооцитах млекопитающих ядрышек, морфология которых типична для ядрышек, обладающих высокой активностью. Кроме того, в ядрах растущих ооцитов млекопитающих визуализированы и хромосомы, напоминающие ламповые щетки. Все эти факты хорошо согласуются между собой и свидетельствуют о том, что на стадии диктиотены транскрипционная активность хромосом очень низкая, в растущих ооцитах она усиливается и достигает максимума в хромосомах ооцитов, находящихся в преантральных фолликулах. В конце роста ооцита интенсивность синтеза РНК снижается до малозначимых величин. Динамика
IV. Профаза первого мейотического деления ооцитов 79 этих процессов в оогенезе ряда млекопитающих отражена в недавней работе (Курило, 1985). Биохимические исследования доказали (Bachvarova, 1981), что скорость транскрибирования гетерогенной РНК в периоде роста мышиных ооцитов примерно в 10 раз оыстрее, чем в соматических клетках мыши. Хотя эта транскрипция осуществляется в 40 раз медленнее, чем в хромосомах типа ламповых щеток в растущих ооцитах шпорцевой лягушки, однако этого вполне достаточно для обеспечения потребности растущих ооцитов мышей, имеющих небольшие размеры (Bachvarova et al., 1982). Основное количество РНК синтезируется в растущих ооцитах мышей за 1—3 нед до овуляции (Bachvarova, De Leon, 1980). Эти формы РНК обладают высокой стабильностью и сохраняются не только на протяжении всего периода роста и созревания, но и после оплодотворения ооцита (см. раздел 7, гл. VII). В цитоплазме растущего ооцита образуется существенный запас рибосом, но большинство из них не участвует в синтезе белков. В конце роста ооцит мыши содержит около 500 пикограмм РНК, включая 25 пикограмм мРНК. Этого количества РНК вполне достаточно для того, чтобы программировать все рибосомы оплодотворенного яйца (McLaren, 1981). Приведенные факты, однако, не противоречат гипотезе, согласно которой в растущий ооцит может поступать ряд веществ, в том числе и какие-то пептиды из материнского организма. По-видимому, в оогенезе млекопитающих имеют место оба явления, — как синтез белков в цитоплазме растущих ооцитов под контролем их генетического аппарата, так и обеспечение ооцита какими-то веществами за счет метаболической кооперации ооцитов с фолликулярными клетками. Эти вопросы нуждаются в дальнейшем изучении. IV.3.3. ПОЗДНЯЯ ДИПЛОТЕНА (ПРЕКРАЩЕНИЕ РОСТА ООЦИТОВ И ФОРМИРОВАНИЕ КАРИОСФЕРЫ) Противоречивые сведения существуют в отношении активности генома на заключительных стадиях роста, когда ооцит не увеличивается в размерах и находится в антральных фолликулах (стадии 7—8). По данным ряда авторов, в это время происходит быстрое снижение синтеза РНК, вплоть до полного его прекращения (Moore, Lintern-Moore, 1978). Этот вопрос подвергся повторному изучению. Была проведена инъекция Н 3-уридина непосредственно в изолированные антральные фолликулы (Was- sarman, Letourneau, 1976а), или Н 3-уридин инъецировали в сумку яичника (Rodman, Bachvarova, 1976). Показано, что включение радиоактивной метки в РНК ооцита происходит и тогда, когда предшественники РНК вводятся в антральные фолликулы, • содержащие ооциты, достигшие максимального размера. Сделан важный вывод, что синтез как информационной, так и рибосомальной РНК продолжается на всех стадиях роста мышиных ооцитов, включая и антральную стадию, непосредственно предшествующую разрушению зародышевого пузырька (Rodman, Bachvarova, 1976; Wassarman, Letourneau, 1976a, 1976b; Mangia, Canipari, 1977). Вместе с тем обнаружено, что активность РНК полимеразы резко снижается по мере увеличения размера ооцитов и в антральных фолликулах ооциты обладают очень низкой активностью РНК полимеразы (Moore, Lintern-Moore, 1978). Более того, установлено, что фолликулярная жидкость антральных фолликулов угнетает активность РНК полимеразы 2 (Moor et al., 1980). Следовательно, на заключительных стадиях роста резко снижается интенсивность экспрессии генов ооцита. Получены и другие данные, свидетельствующие в пользу того,
80 Часть первая. Предзародышевое развитие что в ядрах таких ооцитов должна прекращаться транскрипция генетической информации, так как на этих стадиях в ядре ооцита происходит формирование так называемой кариосферы. Кариосфера — комплексная ядерная структура, состоящая из хромосом, объединенных в клубок или общую хроматиновую массу, расположенную вокруг ядрышка ооцита. Эта структура в течение ряда лет исследуется в оогенезе беспозвоночных и позвоночных животных в коллективе, руководимом М. Н. Грузовой (Грузова, 1975; 1979; Парфенов и др, 1984). Появление кариосферы замечено также в ооцитах, находящихся в антраль- ных фолликулах у различных млекопитающих (Кикнадзе, 1975; Зыбина, 1975; Зыбина, Грищенко, 1980; Грищенко, 1984). Наблюдалось образование кариосферы и в ооцитах из антральных фолликулов человека на светооптическом уровне (Курило, 1980, 1985). Недавно было проведено изучение ультраструктуры ядра ооцитов человека на стадии их заключительного роста (Парфенов, и др., 1984). Этими авторами было показано, что кариосфера образуется в периоде, предшествующем овуляции, когда ооцит уже теряет связь с клетками гранулезы. Таким образом, формирование кариосферы происходит не только когда ооцит завершил рост, но и когда он приобретает компетентность к созреванию, т. е. прореагировал на какие-то сигналы, инициировавшие созревание. Процесс созревания ооцитов рассматривается в следующей главе. Глава V СОЗРЕВАНИЕ ООЦИТОВ МЛЕКОПИТАЮЩИХ Необходимо иметь в виду, что под созреванием ооцитов и сперматоцитов подразумевают не все те же самые процессы. Созреванием в сперматогенезе называют осуществление первого и второго мейотических делений, в результате чего из сперматоцитов образуются сперматиды. Если придерживаться этого смысла данного термина, то в оогенезе созревание начинается, когда оогонии преобразуются в ооциты и эти клетки вступают в мейоз, и заканчивается, когда яйцеклетка оплодотворяется, т. е. когда завершается второе мейотическое деление. Однако у млекопитающих (как и у всех других животных) под созреванием ооцитов понимают завершение первдг_о мейотического деления и переход на стадию метафазы второго мейотическото-деления. Нередко под созреванием ооцичов млекопитающих подразумевают лишь возобновление мейоза, и основным критерием созревания считают разрушение зародышевого пузырька (профазного ядра ооцита первого порядка). Так, например, в недавнем обзоре написано: «Возобновление мейоза в пред- овуляторных ооцитах включает разрушение зародышевого пузырька, выделение первого полярного тельца и переход ооцита в метафазу второго мейотического деления. Однако именно разрушение зародышевого пузырька является тем изменением, кoто2oe__£виJдeтельcтвyeт о возобновлении мейоза. Поэтому мы будем использоТзать~р~аз]эушение Мр^эдьТШ^втггюНгГузырька как основной критерий созревания ооцитов» (Tsafriri et al., 1982, с. 541). Такой подход может привести к серьезным ошибкам, так как разрушение зародышевого пузырька отнюдь не всегда означает, что ооциты вступили в нормальное созревание, и тем более не может служить доказательством того, что созревание будет полноценным. ^
V. Созревание ооцитов 81 Для того чтобы быть уверенным в полноценности созревания, необходимо ооциты оплодотворить, затем трансплантировать оплодотворенные яйцеклетки самкам-реципиентам и наблюдать за развитием трансплантированных зародышей. Преобладающее большинство авторов, изучавших созревание ооцитов млекопитающих, такой подход не использовали, ограничиваясь лишь констатацией завершения первого мейотического деления. Последнее не удивительно, так как оплодотворение ооцитов, созревавших вне материнского организма, удается отнюдь не всегда. Осуществить такие успешные опыты на ооцитах некоторых животных (например, ооцитах коров) крайне трудно, а на ооцитах других животных (например, ооцитах свиней) почти невозможно. Исследование созревания ооцитов млекопитающих представляет значительные трудности и из-за того, что ооциты, выделенные из фолликулов и помещенные в любую культуральную среду, в которой они выживают, автоматически завершают первое мейотическое деление. Поэтому приходится использовать различные приемы искусственного торможения созревания ооцитов in vitro, а затем изучать действие факторов, возобновляющих мейоз в этих условиях (см. раздел V. 2). Поэтому преимущественное значение необходимо придавать фактам, полученным при изучении созревания ооцитов млекопитающих в естественных условиях, т. е. в яичнике, и сопоставлять эти данные с результатами изучения созревания ооцитов in vitro. ' В такой последовательности и рассматривается созревание ооцитов млекопитающих в этой главе. V. 1. СОЗРЕВАНИЕ ООЦИТОВ В ОРГАНИЗМЕ У САМКИ У большинства млекопитающих ооциты возобновляют мейоз, находясь в крупных (антральных) фолликулах, причем это происходит незадолго до овуляции, т. е. в конце фолликулярной фазы эстрального цикла. У различных видов млекопитающих эстральные (овариальные) циклы существенно отличаются как по продолжительности, так и по частоте, причем у некоторых видов в течение года осуществляется один астральный цикл, приуроченный к определенному сезону. Кроме того, у одних млекопитающих овуляция происходит спонтанно, а у других индуцируется спариванием. У мышевидных грызунов эстральные циклы не только очень короткие (занимают 4— 6 сут), но в этих циклах по сути отсутствует лютеальная фаза, так как если не имело место спаривание, то желтые тела в яичниках развиваются плохо и функционируют короткое время, выделяя очень мало прогестерона. Этими особенностями мышевидные грызуны резко отличаются от многих других видов млекопитающих, в овариальных циклах которых существует продолжительная лютеальная фаза (коровы, овцы и др.). Поэтому для суждения о гормональных механизмах регуляции созревания ооцитов необходимо сопоставлять данные, полученные при изучении этих процессов у различных видов млекопитающих. Разбор сложной и многогранной проблемы гормональной регуляции репродуктивной функции млекопитающих, в том числе взаимодействия релизинг- факторов гипоталамуса, гонадотропных гормонов гипофиза и половых стероидов во время различных фаз овариального (экстрального) цикла, далеко выходит за рамки нашей задачи. Этой проблеме посвящены недавние обзоры, рассчитанные на начинающих исследователей, намеревающихся ознакомиться с современным состоянием этих вопросов (Baker, 1982; Baird, 1984; Karsch, 1984; Short, 1984), и обстоятельные сводки, рассчитанные на специалистов (Edwards, 1980; Peters, McNatty, 1980). 6 А. П. Дыбан
82 Часть первая. Предзародышевое развитие V. 1. 1. ГОРМОНАЛЬНЫЕ МЕХАНИЗМЫ ИНИЦИАЦИИ СОЗРЕВАНИЯ ООЦИТОВ В отличие от созревания ооцитов у амфибий, где в этом процессе ведущее место занимает прогестерон (см. обзор: Детлаф, 19776), у большинства млекопитающих созревание ооцитов происходит в конце фолликулярной фазы эстрального цикла, когда в организме доминируют эстрогены. Эстрогены накапливаются в фолликулярной жидкости и оказывают местное действие на фолликулы, повышая чувствительность их клеток к гонадотропным гормонам. Эстрогены способны поддерживать рост фолликулов на протяжении нескольких дней после гипофизэктомии, хотя затем для сохранения антальных фолликулов необходимы как эстрогены, так и гонадотропные гормоны гипофиза. Основное действие эстрогенов связано со стимуляцией пролиферативных процессов в клетках гранулезы. Кроме того, эстрогены индуцируют и образование в клетках гранулезы рецепторов к фолликулостимулирующему гормону гипофиза (ФСГ) и подавляют процессы лютеинизации, которые могут возникать при действии ФСГ, а также приводят к увеличению количества щелевых контактов между клетками гранулезы. По-видимому, эстрогены усиливают и скорость цитодифференцировки клеток гранулезы и после пролиферации этих клеток индуцируют образование в них рецепторов к лютеинизирующему гормону гипофиза (ЛГ). В низких дозах действие эстрогенов и ФСГ на незрелые клетки гранулезы однонаправленно, т. е. эстрогены и ФСГ являются синерги- стами. Эстрогены действуют на фолликул очень быстро, т. е. уже через несколько часов клетки гранулезы становятся более чувствительными к ФСГ. В высоких дозах эстрогены не только подавляют синтез андрогенов и прогестерона, но и снижают ответную реакцию стенки фолликулов на ЛГ. Именно такие эффекты наблюдаются в крупных фолликулах, имеющих полость, в которой фолликулярная жидкость содержит много эстрогенов, а клетки гранулезы достигли максимума созревания. ЛГ усиливает образование эстрогенов, возможно, из-за стимуляции синтеза андрогенов, служащих предшественниками эстрогенов. Взаимодействие между ФСГ и ЛГ приводит к стимуляции митозов в клетках гранулезы, что также усиливает синтез эстрогенов (эстра- диола 17р). Андрогены в свою очередь участвуют в регуляции процессов роста фолликулов. В фолликулах найдены рецепторы и к андрогенам. Показано, что андрогены усиливают связывание ЛГ с фолликулярными клетками, причем этот эффект проявляется сильнее, чем при действии на яичник одних эстрогенов. Совместно с ФСГ андрогены усиливают образование прогестерона клетками гранулезы, однако это происходит в крупных антральных фолликулах, которые до этого должны были подвергаться действию эстрогенов. Установлено, что и пролактин оказывает действие на фолликулы, принимая участие в регуляции их роста и влияя на выработку стероидов клетками гранулезы и клетками теки. Таким образом, рост фолликулов зависит от строго координированных взаимодействий между тремя гормонами гипофиза (ФСГ, ЛГ, пролактина) — эстрогенами, андрогенами и прогестероном. Многие из перечисленных гормонов находятся в фолликулярной жидкости, которая образуется клетками гранулезы, причем накопление этих веществ необходимо для определенных фаз роста фолликула и роста ооцита (Hillensjo et al., 1979). Многочисленные исследования, результаты которых суммированы в обстоятельной монографии (Edwards, 1980), твердо доказали, что рецепторы к гонадо- тропинам не только содержатся в клетках фолликула, но что их количество и распределение существенно изменяется в ходе роста фолликулов, включая и тот период, когда инициируется созревание ооцитов. Различное содержание
V. Созревание ооцитов 83 половых стероидов в фолликуле во время фолликулярной фазы астрального цикла определяется действием гонадотропных гормонов гипофиза. Это зависит от динамики связывания гонадотропинов со стенкой фолликула из-за различного количества рецепторов к этим гормонам в клетках гранулезы. Уровень циркулирующего в крови ФСГ повышается только на короткое время в самом начале роста фолликула, после чего количество ФСГ и ЛГ в крови сохраняется на более или менее постоянном уровне. Незадолго до овуляции происходит кратковременный, но резкий подъем уровня ЛГ, а также некоторое увеличение уровня ФСГ. Именно этот пик выделения в кровь ЛГ и является тем стимулом, который снимает блокаду мейоза, т. е. тригером, инициирующим созревание ооцитов млекопитающих (Dekel et al., 1979; Tsafriri et al., 1982). Остается невыясненным, происходит ли инициация созревания ооцитов из-за действия ЛГ непосредственно на ооцит, либо из-за того, что ЛГ, связываясь с рецепторами клеток гранулезы, вызывает в этих клетках каскад реакций, конечным результатом которых является передача ооциту каких-то сигналов, снимающих блокаду мейоза. Последнее положение более обосновано, хотя ЛГ найден в ооцитах овцы и обезьяны (Jagiello et al., 1975), а рецепторы к ФСГ обнаружены в плазмолемме ооцита (Oxberry, Greenwald, 1982). ЛГ может вызывать у свиней овуляцию без того, чтобы индуцировать возобновление мейоза, т. е. созревание ооцитов. Это происходит из-за того, что ЛГ не привел к достаточному увеличению содержания эстрогенов в фолликулярных клетках и в фолликулярной жидкости. Примечательно, что такие ооциты могут оплодотворяться (после искусственного осеменения), но не способны трансформировать головку спермия в мужской пронуклеус, т. е. являются неполноценными (Hunter et al., 1976, см. раздел V. 3. 3.). Эти опыты истолковывают как довод в пользу того, что возобновление мейоза и созревание ооцитов опосредуется при участии стероидных гормонов (в основном эстрогенов), уровень которых в фолликулярной жидкости возрастает под влиянием ЛГ. Высказано вполне логичное предположение, что не сам ЛГ, а половые стероиды (в первую очередь эстрогены) действуют на клетки кумулюса и вызывают созревание ооцитов, инициируя процесс, в который вовлекается циклическая АМФ и аденилциклаза, а также другие метаболиты (Baker, 1982). У крыс инициация созревания ооцита осуществляется в течение короткого отрезка времени A—2 ч), приуроченного к строго определенному моменту эстрального цикла, когда регистрируется пик выделения ЛГ в кровь. Непосредственный триггерный эффект реализуется еще быстрее, по-видимому, на протяжении нескольких минут. Так, электростимуляция гипоталамуса приводит к выделению гипофизом ЛГ, что индуцирует как созревание ооцитов, так и овуляцию. Доказано, что для полного выделения ЛГ из гипофиза требуется 60 мин, однако яйцеклетки инициируются к возобновлению мейоза через несколько минут после поступления ЛГ в кровь. Такие же данные получены и при использовании экзогенных препаратов ЛГ (Tsafriri et al., 1982; Lindner et al., 1983). Сказанное относится к действию ЛГ на фолликулы в яичнике. Если же изучать скорость возобновления мейоза in vitro, то придем к выводу, что для этого необходимо не менее чем 1.5—2 ч (Скоблина, 1982а, 19826; Lindner et al., 1983). Сформулирована гипотеза, согласно которой фолликулярные клетки генерируют сигналы, составляющие интегральную часть регуляторной системы созревания ооцитов. Предполагается, что эта регуляция осуществляется путем передач каких-то молекул от фолликулярных клеток в ооциты. Участниками этой регуляторной системы являются не только гонадотропные гормоны и 6*
g4 Часть первая. Предзародышевое развитие половые стероиды и не только система аденилатциклазы и циклической АМФ. Сказанное относится как к созреванию ооцитов амфибий, так и ооцитов млекопитающих (Cho et al., 1974; Masui, Clarke, 1979; Moor et al., 1981; Mailer, 1983). К числу этих регуляторов относятся и какие-то низкомолекулярные ингибиторы, сецернируемые клетками гранулезы. Именно эти ингибиторы, по-видимому, поддерживают ооциты в состоянии диплотены, т. е. предотвращают их преждевременное внутрифолликулярное созревание (Chang, 1955; Tsafriri, 1979). Для многих млекопитающих точно известна продолжительность созревания ооцитов в организме у самок. В норме овуляция совпадает во времени с окончанием с-озревания ооцитов, т. е. у большинства млекопитающих овулируют яйцеклетки на стадии метафазы второго деления созревания. У некоторых животных (например, у кроликов) спаривание индуцирует выделение ЛГ, поэтому овуляцию легко определять, учитывая момент спаривания. У других животных отсчет начинают от середины темного периода стадии проэструса или от момента введения самкам препаратов хорионического гонадотропина. В табл. 9 (по: Peters, McNatty, 1980) приведены временные параметры созревания ооцитов у различных млекопитающих. Продолжительность созревания ооцитов у различных видов млекопитающих занимает от 9—11 до 36—40 ч. В обзоре Скоблиной A982а) суммированы данные ряда авторов о продолжительности созревания ооцитов различных млекопитающих как в материнском организме, так и in vitro. Рассматривая эти сведения, можно прийти к ошибочному выводу, что продолжительность созревания ооцитов у одного и того же вида животных существенно колеблется и, например, у мышей занимает от 9 до 18 ч. Однако такие разбросы обусловлены в первую очередь различными способами подсчета продолжительности созревания ооцитов. Так, некоторые авторы учитывали, когда все ооциты достигли стадии метафазы второго деления созревания, а другие авторы определяли, когда 50 % ооцитов будут на этой стадии. Некоторые авторы применяли цитологические методы исследования, т. е. более точно определяли изменения хромосом ооцита, а другие авторы рассматривали ооциты под бинокулярной лупой, т. е. регистрировали только момент исчезновения зародышевого пузырька, и т. д. В действительности у различных линий лабораторных мышей продолжительность созревания ооцитов колеблется лишь в границах 1—3 ч и занимает 12— 14 ч. Таблица 9 Продолжительность созревания ооцитов в организме у разных видов млекопитающих (отсчет от пика ЛГ в крови и до момента овуляции) (Baker, 1982; по: Peters, McNatty, 1980; с изменениями) Виды Лабораторные мыши Хомячки Крысы Кролики Овцы Свиньи Коровы Обезьяны (макаки резусы). Человек Число овулировавших ' яйцеклеток 8—10 6—8 8—10 5-7 1—2 8—12 1 1 1 Продолжительность созревания ооцитов (ч) 12—14 9—11 12—15 9—12 25 40 40 24—36 28—36
V. Созревание ооцитов 85 V. 2. СПОНТАННОЕ СОЗРЕВАНИЕ ООЦИТОВ МЛЕКОПИТАЮЩИХ IN VITRO Еще 50 лет тому назад было замечено, что если выделить ооциты кроликов из фолликулов и поместить их в культуральную среду, то в ооцитах разрушаются зародышевые пузырьки, т. е. мейоз возобновляется и доходит до метафазы второго деления созревания (Pinkus, Enzmann, 1935). Возобновление мейоза в ооцитах in vitro названо «спонтанное созревание ооцитов». Пинкус и Энцман, изучая спонтанное созревание ооцитов кролика, высказали мысль, что «фолликулярные клетки снабжают яйцеклетку веществом или веществами, которые непосредственно ингибируют созревание» (Pinkus, Enzmann, 1935). Они считали, что после удаления ооцитов из фолликула прекращается действие на ооциты соматических клеток. Предполагалось, что фолликулярные клетки (т. е. клетки гранулезы) поддерживают блокаду мейоза, не только вырабатывая какие-то ингибиторы, но и препятствуя поступлению в ооцит веществ, без которых не может происходить созревание. За истекшие годы было описано спонтанное созревание ооцитов многих видов млекопитающих (см. обзоры: Donahue, 1972; Tsafriri, 1979; Скоблина, 1982а, 19826). Этой тематике посвящена обширная литература, которая, однако, пестрит противоречивыми сведениями. Складывается впечатление, что чем больше времени проходит от момента, когда была сформулирована первоначальная гипотеза о спонтанном созревании ооцитов млекопитающих, тем более запутанным становится эта проблема. Недаром один из ведущих исследователей, посвятивший много времени и сил изучению молекулярных механизмов созревания ооцитов млекопитающих in vitro, пишет: «Хотя данный обзор посвящен рассмотрению природы и функции химических сигналов, вовлекающихся в мейотическое созревание ооцитов и поддерживающих блокаду мейоза, однако приходится отдавать себе полный отчет в том, что эта литература переполнена противоречивыми п опровергающими друг друга сведениями. Невозможно сформулировать об >.ую гипотезу регуляции созревания ооцитов, которая была бы совместимой с результатами, полученными во многих лабораториях на ооцитах разных видов млекопитающих» (Eppig, Downs, 1984, p. 1). Приведенная фраза объективно отражает современное положение дел в этой проблеме, а обзоры (Скоблина, 1982а, 19826) наглядно показывают, как трудно обобщить результаты ряда работ по созреванию ооцитов млекопитающих. Опубликована работа, серьезно критикующая основную концепцию всех исследований, придающих физиологическое значение молекулярным процессам при созревании ооцитов млекопитающих in vitro (Biggers, Powers, 1979). Авторы приходят к выводу, что спонтанное созревание является артефактом, т. е. ответной реакцией ооцитов на стресс, из-за того, что ооциты попадают in vitro в неподходящие условия и теряют при этом ряд ионов и другие вещества. Если к культуральной среде добавляется фолликулярная жидкость или некоторые ее компоненты, то при этом культуральная среда становится менее вредной для ооцитов. Авторы, считают, что различные агенты, оказывающие in vitro положительное действие на созревание ооцитов, в том числе и добавление к среде ЛГ, проявляют этот эффект потому, что ооцит возвращается в условия, более или менее приближающиеся к тем, при которых происходит созревание ооцитов в яичниках (Biggers, Powers, 1979). Эта точка зрения не лишена логики и серьезных доводов, причем в последнее время получены новые факты в ее пользу. Так,при сканирующей электронной микроскопии обнаружено, что на поверхности плазматической мембраны изолированных ооцитов мышей сохраняются обрывки отростков фолликулярных
86 Часть первая. Предзародышевое развитие клеток (Eppig, Downs, 1984), т. е. ооциты, лишенные клеток гранулезы и кажущиеся полностью изолированными от влияния этих клеток, в действительности могут продолжать получать из отростков клеток гранулезы различные вещества (Downs, Eppig, 1984). Вместе с тем нельзя принять безоговорочно представления Биггерса и Пауерса (Biggers, Powers, 1979), так как это перечеркивает усилия многих авторов, занимающихся и продолжающих успешно заниматься изучением созревания ооцитов млекопитающих in vitro и получивших при этом интересные факты. Необходимо иметь в виду, что in vitro созревают не только изолированные ооциты млекопитающих, но и ооциты, выделенные из фолликулов вместе с клетками кумулюса, а также ооциты, находящиеся внутри фолликулов, извлеченных в интактн'ом виде из яичника. Следовательно, можно сравнивать между собой результаты использования этих трех разных систем и сопоставлять эти данные с теми фактами, которые получены при изучении созревания ооцитов млекопитающих в материнском организме. Такой подход позволяет избежать ошибок, особенно если, изучая созревание ооцитов in vitro, не пытаться решать вопросы, которые в принципе на этой системе решить нельзя. Если данные, полученные при изучении созревания ооцитов in vitro, совпадают с теми результатами, которые наблюдались при созревании ооцитов млекопитающих в естественных условиях, то эти факты необходимо принимать во внимание. Если же при созревании ооцитов in vitro наблюдаются картины, которые невозможно согласовать с данными, полученными при созревании ооцитов в организме у самки, то к этим сведениям необходимо относиться крайне осторожно и не придавать им доминирующего значения. Именно по такому принципу нами и излагается материал в этом разделе главы. V. 2. 1. КОМПЕТЕНТНОСТЬ К СПОНТАННОМУ СОЗРЕВАНИЮ ООЦИТОВ И ДЕЙСТВИЕ ГОНАДОТРОПНЫХ ГОРМОНОВ Хотя в норме мейоз возобновляется в ооцитах, которые находятся в крупных антральных фолликулах, подготавливающихся к овуляции, однако компетентность к спонтанному созреванию in vitro возникает у ооцитов раньше. Так, если выделить ооциты из преантральных фолликулов задолго до того, когда в норме ооциты должны были возобновить мейоз, то такие ооциты созревают in vitro. Если же извлечь ооциты из малых или средних фолликулов (стадии За— 56), то такие ооциты либо вообще не созревают in vitro, либо мейоз в них возобновляется, но вскоре блокируется и ооциты погибают (Baker, Neal, 1973; Baker, 1982). Эти факты, подтвержденные многократно на ооцитах разных видов млекопитающих, говорят о том, что компетентность к возобновлению мейоза возникает в ооцитах намного раньше, чем они возобновляют мейоз в естественных условиях, т. е. в яичнике. Если ооциты приобрели компетентность к созреванию, то они созревают in vitro в любой культуральной среде, к которой не нужно добавлять никаких гормонов, в том числе и гонадотропинов. В этом выводе нельзя сомневаться, так как он сделан на основании многолетних исследований различных авторов на ооцитах разных видов млекопитающих. Однако это не означает, что созревание ооцитов млекопитающих in vitro не зависит от гонадотропных гормонов гипофиза. На изолированных ооцитах, созревающих in vitro, нецелесообразно проверять роль гонадотропных гормонов, так как основной эффект этих гормонов обусловлен их влиянием на фолликулярные клетки. Так, если овцам вводить сывороточный гонадотропин (СЖК) на 10—12 сут
V. Созревание ооцитов 87 астрального цикла и через 40 ч извлечь из яичника крупные антральные фолликулы, прореагировавшие на гонадотропины, и культивировать целые фолликулы 9—18 ч, то при добавлении к культуральной среде Л Г гипофиза инициируется созревание ооцитов, т. е. возобновляется мейоз. Если не добавлять к среде ЛГ либо добавить ФСГ, то ооциты не созревают (Moor et al., 1981). Следовательно, при культивировании in vitro изолированных фолликулов ЛГ вызывает инициацию созревания ооцитов, так же как это имеет место и при созревании ооцитов в материнском организме. По-видимому, в этих опытах ЛГ подействовал in vitro на клетки гранулезы, а изменившиеся фолликулярные клетки инициировали мейоз в ооцитах, передав им какой-то сигнал, снявший блокаду мейоза. О зависимости компетенции к спонтанному созреванию ооцитов от действия гонадотропных гормонов говорят и данные, полученные при созревании in vitro ооцитов от животных разного возраста. Если удалить ооциты из преантральных фолликулов у половозрелых самок, то, как было сказано выше, такие ооциты всегда спонтанно созревают in vitro. Однако у мышей в возрасте 15 сут ооциты не способны созревать in vitro (Szybek, 1972; Sorensen, Wassarman, 1976). У хомяков компетентность к мейо- тическому созреванию in vitro приобретают ооциты, полученные от самок в возрасте не моложе 23 сут (Iwamatsu, Yanagimachi, 1975). Показано, что способность созревать in vitro ооцитов не только этих животных, но и свиней также коррелируется с возрастом животных, т. е. со степенью развития фолликулов (Tsafriri, 1979). Доказано, что большинство ооцитов, полученных от 15-суточных крыс, не возобновляют мейоз in vitro. У 20-суточных крыс в мейоз вступало 14 %, а у ооцитов от 26-суточных крыс мейоз возобновляло 67 % клеток. Способность спонтанно созревать in vitro прямо пропорциональна увеличению как диаметра самих ооцитов, так и размерам фолликула в целом и формированию в нем полости (Bar-Ami, Tsafriri, 1986). Не только у ооцитов крыс, но и у ооцитов мышей компетентные к возобновлению мейоза ооциты имели более крупный диаметр, чем некомпетентные ооциты (Sorensen, Wassarmar, 1976). У хомяков in vitro могут созревать только ооциты, достигшие 80-ти мкм в диаметре (Iwamatsu, Yanagimachi, 1975). Вместе с тем не только диаметр ооцитов определяет мейотическую компетенцию. Замечено, что у крыс компетентные к мейозу ооциты, полученные от самок в возрасте 26 сут, имели диаметр 60 мкм, тогда как не компетентные ооциты, полученные от самок в возрасте 20 сут, могли иметь больший диаметр — 76 мкм (Bar-Ami, Tsafriri, 1986). У хомяков антральные фолликулы формируются на 24—30 сут после рождения. Зыбина и Грищенко A980), однако, обнаружили компетентные к возобновлению мейоза ооциты у хомячков на несколько дней раньше, т. е. на 22—23 сут (Iwamatsu, Yanagimachi, 1975). Компетентность к возобновлению мейоза зависит от действия гонадотропинов на фолликулы в раннем возрасте. Высказано предположение, что для приобретения способности к возобновлению мейоза in vitro необходимо, чтобы ооциты подвергались на начальных стадиях своего роста действию ФСГ гипофиза и, вероятно, эстрогенов, причем это происходит еще до или вскоре после рождения животных. Так, у мышей краткосрочный, но существенный подъем уровня гонадотропинов происходит на 4 сут после рождения (Duallaart et al.. 1975) или даже до рождения (Stiff et al., 1974). Полагают, что однократное воздействие ФСГ и эстрогенами на этих ранних стадиях онтогенеза достаточно для программирования ооцитов — для того,
88 Часть первая. Предзародышевое развитие чтобы в дальнейшем ооциты, завершив рост, стали способными возобновлять мейоз, т. е. созревать in vitro (Bar-Ami, Tsafriri, 1986). Сформулирована гипотеза о том, что появление компетентности к спонтанному созреванию in vitro возникает как многоступенчатый процесс, т. е. вначале ооциты приобретают способность вступать в мейоз, а позже — способность завершать мейоз (Bar-Ami, Tsafriri, 1986). По-видимому, фолликулы длительно сохраняют какие-то последствия гона- дотропных гормонов, достаточные для роста ооцитов. Этим можно объяснить и данные о том (цит. по: Eppig, Downs, 1984), что через 17 нед после гипофизэкто- мии в яичниках у мышей сохраняются фолликулы, содержащие ооциты, способные спонтанно возобновлять мейоз in vitro. Вместе с тем есть авторы, полагающие, что компетентность к спонтанному созреванию ооцитов не зависит от гонадотропных гормонов гипофиза. Недавно опубликована работа, в которой цитируются результаты опытов на мышах гомозиготных по рецессивной мутации, при которой в гипоталамусе не вырабатывается релизинг-фактор гонадотропных гормонов. Эту мутацию называют Hypogonadal (символ hpg), и у таких мышей находят очень маленькие яичники и недоразвитую матку (Cattanach et al., 1977). Когда у мышей hpg/hpg в возрасте 21—24 сут изолировали ооциты (диаметром около 70 мкм) и культивировали их in vitro,то такое же количество мутантных и нормальных ооцитов проявляло компетенцию к мейотическому созреванию (Beamer, Eppig, цит. по: Eppig, Downs, 1984). Это наблюдалось при культивировании ооцитов в среде, лишенной гормонов. На основании этих данных авторы пришли к выводу, что гонадотропные гормоны не нужны для приобретения ооцитами компетентности к созреванию in vitro. Однако у мышей гомозиготных по мутации hpg не имеет места полное отсутствие гонадотропных гормонов. В действительности уровень ФСГ в крови у этих мышей достигает одной трети или одной четвертой уровня ФСГ в крови нормальных самок, а яичники мутантных мышей могут иметь фолликулы на начальных стадиях образования антрума (Cattanach et al., 1977). Таким образом, несмотря на то что ооциты способны спонтанно созревать in vitro, в средах без каких-либо гормонов, есть основания считать, что компетенция к спонтанному созреванию приобретается ооцитами из-за того, что на фолликулы, в которых они находились, действовали ФСГ и эстрогены, причем у некоторых млекопитающих это могло иметь место еще до или вскоре после рождения (Bar-Ami, Tsafriri, 1986). Следовательно, сама постановка вопроса о зависимости или независимости спонтанного созревания ооцитов in vitro от гонадотропных или других гормонов лишена биологического смысла. Примечательно, что добавление к культуральной среде гонадотропных гормонов, в том числе и ЛГ гипофиза, может в некоторых случаях улучшать оплодотворяемость ооцитов, созревавших in vitro. Это было отмечено в опытах с ооцитами крыс (Shalgi et al., 1979). Однако обработка ЛГ ооцитов крыс не улучшала их созревания. В данных опытах ооциты трансплатировались в ампулу яйцевода самок-реципиентов, где они оплодотворялись. В ампулярную часть яйцевода крыс в норме попадает очень мало спермиев. Под влиянием ЛГ происходило in vitro разрыхление клеток кумулюса, что и способствовало оплодотворению таких ооцитов в ампулярной части фаллопиевой трубы (Schro- eder, Eppig, 1984). Хотя твердо доказано, что ооциты мышевидных грызунов полноценно созревают и при полном отсутствии гормонов в культуральной среде, это отнюдь не означает, что и при созревании in vitro ооцитов других млекопитающих непременно должна иметь место такая же картина. Созревание ооцитов
V. Созревание ооцитов 89 тех животных (свиньи и коровы), у которых этот процесс занимает длительное время C0—40 ч), по-видимому, может существенно улучшаться при добавлении гонадотропных и других гормонов к культуральной среде. Неизвестно, однако, является ли данный эффект специфическим для гормонов либо зависит от неспецифического их действия. V.2.2. ФАКТОРЫ ТОРМОЖЕНИЯ И ФАКТОРЫ ИНИЦИАЦИИ СОЗРЕВАНИЯ ООЦИТОВ Механизмы созревания ооцитов млекопитающих in vitro далеки от выяснения, и по этим вопросам высказаны противоречивые точки зрения. Одни авторы полагают, что существуют факторы, тормозящие созревание ооцитов, причем когда эти факторы перестают действовать, ооциты возобновляют мейоз, т. е. созревают. Другие авторы считают, что созревание, т. е. снятие блокады мейоза, обусловливается действием каких-то стимуляторов (инициаторов или промоторов созревания). V.2.2.1. Ингибиторы созревания в фолликулярной жидкости Еще 50 лет тому назад Пинкус и Энцман (Pinkus, Enzmann, 1935), наблюдая за созреванием ооцитов кроликов, помещенных в культуральную среду, сформулировали гипотезу, согласно которой соматические клетки фолликула блокируют мейоз, вырабатывая какой-то ингибитор. В 1955 г. была осуществлена первая попытка продемонстрировать наличие в фолликулярной жидкости ингибиторов созревания ооцитов кролика (Chang, 1955). Для этого к культуральной среде добавляли фолликулярную жидкость из антральных фолликулов. При этом у ряда ооцитов сохранялся зародышевый пузырек, т. е. созревания не происходило. В дальнейшем было показано, что если культивировать ооциты свиней вместе с частью фолликулярной стенки, то созревание ооцитов предотвращается. Культивирование ооцитов с частью овариальной сумки либо тканями яичника (теки) не влияет на созревание, т. е. ооциты спонтанно возобновляют мейоз (Liebfried, First, 1980). Было также замечено, что совместное культивирование ооцитов с клетками гранулезы частично угнетает спонтанное созревание ооцитов (Sato, Ishibashi, 1977). На основании этих и других фактов была сформулирована гипотеза о том, что клетки гранулезы являются основным источником веществ, угнетающих созревание ооцитов. Гипотетические вещества в фолликулярной жидкости назвали ингибиторами созревания ооцитов и обозначили буквами OMI (от англ. слов oocyte maturation inhibitor). Исчерпывающие сведения по этим вопросам приведены в обзоре (Tsafriri et al., 1982), в котором составлена и подробная библиография работ по ингибиторам созревания ооцитов в фолликулярной жидкости различных млекопитающих. Однако существует серьезная критика всей концепции о факторе угнетения мейоза в фолликулярной жидкости (Biggers, Powers, 1979). Кроме того, ряд авторов не смогли обнаружить в фолликулярной жидкости ингибитор созревания ооцитов (Sato, Ishibashi, 1977; Liebfried, First, 1980; Racowsky, McGaughey, 1982). Химическая природа ингибитора созревания, если таковой и содержится в фолликулярной жидкости, остается совершенно загадочной. Одни авторы считают, что этот ингибитор является пептидом мол. весом 2000 (Tsafriri et al., 1982), а другие делают вывод, что это вещество представлено небольшими (мол. вес меньше 1000) гидрофобными молекулами и не относится к пептидам либо липидам (Downs, Eppig, 1984).
90 Часть первая. Предзародышевое развитие Непонятен и механизм действия ингибитора созревания ооцитов. Показано, что для выявления фактора фолликулярной жидкости, ингибирующего созревание ооцитов, необходимо культивировать ооциты вместе с клетками кумулюса. Изолированные ооциты крыс и свиней созревают и в среде, к которой добавлена фолликулярная жидкость, хотя в этих случаях возобновление мейоза наступает позже, чем в тех ооцитах, которые культивировались в среде без фолликулярной жидкости. Был сделан вывод, что мейозоугнетающий фактор фолликулярной жидкости действует на ооциты, окруженные интактными клетками кумулюса, т. е. генерирует какой-то сигнал, передающийся в ооцит через клетки гранулезы. Фильтрат фолликулярной жидкости угнетает спонтанное созревание изолированных ооцитов мыши, хотя это продолжается короткое время и заметно, если одновременно подавлять разрушение циклической АМФ; добавляя к среде форсколин (Eppig, Downs, 1984). Эти факты расценивают как доводы в пользу предположения о действии ингибитора созревания ооцитов, содержащегося в фолликулярной жидкости, через систему циклической АМФ-аденилатциклазы, причем считают, что в этом процессе важное значение имеет метаболическая кооперация ооцитов и фолликулярных клеток. Рассмотрим эти сведения. V.2.2.2. Независимость созревания ооцитов от прекращения метаболической кооперации с фолликулярными клетками Твердо доказано, что у млекопитающих отростки клеток фолликулярного эпителия проходят через зону пеллюцида и образуют на плазматической мембране ооцита щелевые контакты (Anderson, Albertini, 1976; Gilula et al., 1978). Щелевые контакты между фолликулярными клетками и плазматической мембраной ооцита описаны у мышевидных грызунов, овец, свиней и других видов млекопитающих. Ионы и небольшие молекулы могут поступать из фолликулярных клеток в ооциты через щелевые контакты (Gilula et al., 1978; Moor et al., 1980a), и это явление получило название «метаболического и ионного сопряжения клеток», или метаболической кооперации клеток (metabolic intracellular coupling). В пользу того, что щелевые контакты между фолликулярными клетками и ооцитом действительно играют существенную роль в передаче молекул, говорят не только электронно-микроскопические наблюдения (Anderson, Albertini, 1976). Было разработано две культуральные системы, позволявшие наблюдать переход молекул из фолликулярных клеток в ооциты (Eppig, 1977; Bachvarova et al., 1980). Возможно, что связь с клетками кумулюса необходима для передачи ооциту нуклеотидов (Schultz, 1985) или таких субстратов углеводного обмена, как пируват и оксалоацетат, без которых ооциты лишаются in vitro энергетических источников. Полагают, что такие связи с клетками кумулюса необходимы в первую очередь для увеличения дыхания ооцитов, которое сопровождает их созревание in vitro, но не для созревания самих ядер ооцитов (Magnusson, 1980). Ооциты используют щелевые контакты с клетками гранулезы для того, чтобы через эти связи поступали вещества, которые не могут метаболизиро- ваться в самом ооците (например, преобразовывать рибонуклеотиды в рибо- нуклеозид трифосфаты и др.). В результате такой метаболической сопряженности ооциты освобождаются от необходимости выполнять ряд «хаускипинг»- функций, получая метаболиты от фолликулярных клеток (Schultz, 1985). Полагают, что более 90 % веществ, поступающих из среды в ооциты, вначале захватываются и метаболизируются в фолликулярных клетках, а затем проходят через щелевые контакты и попадают в протоплазму ооцита.
V. Созревание ооцитов 91 Таким образом, фолликулы у млекопитающих являются структурами, которые могут служить классическим примером тесного взаимодействия гетеро- логических клеток, обладающих разными свойствами (Schultz, 1985). В литературе существуют представления, согласно которым клетки куму- люса передают ооцитам через щелевые контакты ингибиторы созревания, содержащиеся в фолликулярной жидкости, т. е. нарушение метаболической кооперации между клетками кумулюса и ооцитами приводит к тому, что ингибиторы мейоза перестают поступать в цитоплазму ооцита. Предполагается, что щелевые контакты разрушаются и именно таким образом ЛГ инициирует созревание ооцитов (Dekel, Beers, 1978; Gilula et al., 1978; Moor et al., 1980a; Lindner et al., 1983; Bar-Ami, Tsafriri, 1986). Эта гипотеза подробно рассматривается и обосновывается в обзоре Цафрири и др. (Tsafriri et al., 1982). Есть варианты данной гипотезы. Так, ряд авторов полагает, что циклическая АМФ передается из клеток кумулюса через щелевые контакты в ооциты и действует как ингибитор созревания (Dekel, Beers, 1978; Dekel et al., 1979; Moor et al., 1980; Lindner et al., 1983), другие авторы с этим не согласны (Eppig, Downs, 1984; Downs, Eppig, 1984). Ключевым положением всех этих гипотез является постулат, что триггер возобновления мейоза, т. е. созревания ооцита,— это прекращение метаболической кооперации ооцита с фолликулярными клетками, из-за чего в ооцит перестают поступать ингибиторы мейоза. Однако исследования последних лет говорят о том, что процессы межклет- точного сопряжения продолжаются и тогда, когда ооциты вступают в созревание. Вместе с тем ооциты могут и не возобновлять мейоз после того, когда нарушаются щелевые контакты с фолликулярными клетками. Так, было проведено исследование метаболической кооперации ооцитов и клеток грану- лезы при культивировании фолликулов овец в среде, к которой добавляли ФСГ или ЛГ либо ФСГ и ЛГ. В контроле к среде не добавляли гонадотропинов, и ооциты в этих условиях не согревали. При добавлении к среде ФСГ прекращалась метаболическая кооперация ооцитов и фолликулярных клеток, причем электронная микроскопия показала, что в этих случаях щелевые контакты дегенерировали, а биохимические исследования подтвердили, что холин не поступает из среды в ооциты, что доказывает прекращение переноса молекул из фолликулярных клеток в ооциты. Однако добавление к среде ФСГ не приводило к возобновлению мейоза, т. е. ооциты сохраняли интактные зародышевые пузырьки и в созревание на вступали. В противоположность этому добавление к культуральной среде ЛГ инициировало возобновление мейоза, т. е. созревание ооцитов, однако ЛГ не нарушал целостность и функциональную активность системы щелевых контактов и метаболическая кооперация ооцитов с фолликулярными клетками сохранялась после того, как ооциты вступили в созревание. Не было найдено и какой-либо корреляции между степенью сохранения межклеточных контактов, т. е. метаболической кооперацией ооцитов и фолликулярных клеток, а также характерными для созревания ооцитов изменениями профиля синтезируемых белков (Moor et al., 1981). Следовательно, возобновление мейоза не инициируется нарушением щелевых контактов между ооцитом и клетками гранулезы и нарушение метаболического сопряжения не может представлять собой стимул, в результате которого возобновляется мейоз. Сформулирована гипотеза, согласно которой созревание ооцитов происходит из-за изменения природы и интенсивности сигналов, поступающих в ооцит из клеток гранулезы. Изменения межклеточной системы передачи сигналов, т. е. нарушение щелевых контактов, являются вторичными и более поздними сдвигами по отношению к изменению природы самих сигналов (Moor et al.,
92 Часть первая. Предзародышевое развитие 1981; Eppig, Downs, 1984). По-видимому, сигналы, индуцированные ЛГ в фолликулярных клетках, быстро распространяются через щелевые контакты, которые существуют между клетками гранулезы и ооцитами, и инициируют в ооците возобновление мейоза. Процесс созревания ооцитов млекопитающих инициируется и регулируется гормонами, дивалентными катионами, циклическими нуклеотидами и другими веществами, которые действуют как на уровне ооцита, так и на уровне фолликулярных клеток. При этом клетки кумулюса и ооцит составляют единую, метаболически сопряженную систему, генерирующую и воспринимающую сигналы. Остается не выясненным, какие именно сигнальные молекулы вызывают те изменения ооцита, которые и знаменуют начало его созревания. Полагают, что существенное участие как в ингибировании, так и в возобновлении мейоза в ооцитах, т. е. в инициации их созревания, принимает система аденилатциклазы—циклической АМФ. Уже давно было показано, что если культивировать изолированные ооциты мышей или крыс в среде, содержащей производные циклической АМФ или ингибиторы фосфодиэстеразы, то спонтанное созревание ооцитов не происходит (Cho et al., 1974; Nekola, Moore-Smith, 1975; Magnuson, Hillensjo, 1977; Dekel, Beers, 1978). Однако если инъецировать эти производные циклической АМФ в полость фолликула или краткосрочно подействовать ими на фолликулы, поместив фолликулы в среду, содержащую данные вещества, то ооциты спонтанно созревают. Таким образом, циклическая АМФ, действуя на изолированные ооциты, подавляет спонтанное созревание, а действуя на ооциты, находящиеся внутри фолликулов, инициирует созревание, т. е. вызывает возобновление мейоза. Высказано предположение, что клетки кумулюса угнетают созревание ооцитов, передавая через щелевые контакты в ооцит циклическую АМФ (Dekel, Beers, 1978). При этом подразумевалось, что повышение содержания циклической АМФ в фолликулярных клетках приводит и к повышению содержания циклической АМФ в ооцитах. Однако измерение содержания циклической АМФ в ооцитах, окруженных клетками кумулюса, в которых было значительно увеличено содержание циклической АМФ (под влиянием ФСГ), не подтвердило этого предположения. Ооциты содержали в 50 раз меньше циклической АМФ, чем это ожидалось на основании предположения о выравнивании содержания циклической АМФ между фолликулярными клетками и ооцитами (Eppig, Downs, 1984). Примечательно, что условия опытов были такими, при которых сохранялись нормально функционирующие щелевые контакты между фолликулярными клетками и ооцитами (Schultz et al., 1983a, 1983b). Суммируя результаты собственных исследований и литературные данные, недавно были предложены две рабочие гипотезы, объясняющие как блокаду мейоза, так и возобновление созревания ооцитов млекопитающих. Обе эти гипотезы (Eppig, Downs, 1984) постулируют, что ооцит сам вырабатывает циклическую АМФ. Предполагается, что блокада мейоза зависит от процесса, в котором участвует циклическая АМФ и который осуществляется в клетках гранулезы. Допускается, что действие стероидных гормонов реализуется в самом ооците, причем и в этот эффект вовлекается циклическая АМФ. Авторы полагают, что гипотетический фактор, который ингибирует созревание, может поступать в ооцит двумя путями: либо через щелевые контакты между клетками гранулезы и ооцитами, либо путем прямого захвата ооцитом этого фактора, вырабатываемого клетками гранулезы, из фолликулярной жидкости. Механизмы инициации созревания ооцитов млекопитающих, таким образом, требуют дальнейшего изучения и остаются загадочными. Есть основание пола-
V. Созревание ооцитов 93 гать, что возобновление мейоза в ооцитах млекопитающих определяется реализацией генетической программы, причем это зависит от внешних факторов, т. е. действия каких-то веществ как на фолликулярные клетки, так и на ооциты. V.3. ИЗМЕНЕНИЯ ООЦИТОВ ВО ВРЕМЯ ИХ СОЗРЕВАНИЯ Эти вопросы значительно более полно исследованы при созревании ооцитов амфибий и рыб, чем ооцитов млекопитающих. Однако в последние годы положение изменилось, так как ооциты млекопитающих также начали изучаться самыми разнообразными, в том числе и молекулярно-биологическими, методами. В обстоятельных обзорах Т. А. Детлаф рассматривает те свойства яйца, в которых участвует только цитоплазма, свойства, в которых участвует кариоплазма зародышевого пузырька, разбирая молекулярные процессы при созревании ооцитов амфибий и осетровых рыб, критически оценивает сведения о различных факторах, которым приписывают значение в инициации и осуществлении различных процессов в созревающем ооците (Детлаф, 19776; Dettlaff, 1987). Из этих факторов одни носят чисто гипотетический характер, а другие более реальны, так как их уже выделили из ооцитов (например, фактор промоции мейоза). Многие из представлений, возникших при изучении созревания ооцитов амфибий и рыб, уже перенесены и на созревание ооцитов млекопитающих. В ряде случаев это было сделано по аналогии, т. е. без серьезного изучения данных вопросов на созревающих ооцитах различных видов млекопитающих. Последнее во многом связано с техническими трудностями работы с ооци- тами млекопитающих, имеющих небольшие размеры и плохо переносящих те вмешательства, которые не нарушают жизнеспособность крупных ооцитов амфибий в рыб. Так, на незрелых ооцитах амфибий уже давно были осуществлены успешные опыты по инъекции цитоплазмы, полученной от созревших ооцитов (Детлаф, 1966, 1967; Masui, Markert, 1971), и трансплантация в интакт- ные или энуклеированные ооциты ядер эмбриональных или различных дефинитивных соматических клеток (Детлаф, Никитина, Строева, 1965; Детлаф, 1966, 1967; Gurdon, 1974). Эти подходы к изучению созревания ооцитов млекопитающих стали применять лишь недавно, и полученные результаты еще носят ориентировочный характер и требуют подтверждения. Вместе с тем уже можно попытаться не только рассмотреть участие ядра и цитоплазмы в созревании ооцитов млекопитающих, но и есть основания для сопоставления этих данных с теми сведениями, которые были получены при созревании ооцитов амфибий и рыб. V.3.I. МОРФОЛОГИЧЕСКИЕ ПРЕОБРАЗОВАНИЯ СОЗРЕВАЮЩИХ ООЦИТОВ Во время созревания ооцитов млекопитающих завершается первое мейоти- ческое деление, а второе деление созревания доходит до метафазы. На стадии метафазы второго деления яйцеклетки млекопитающих, подобно яйцеклеткам большинства других животных, блокируются (Васецкий, 1977). Полное завершение мейоза происходит только после оплодотворения или искусственной активации яйцеклетки (см. гл. VI). Первым морфологическим признаком созревания является разрушение зародышевого пузырька, т. е. профазное ядро ооцита превращается в метафазу. После разрушения ядерной оболочки происходит конденсация диплотенных хромосом и визуализируются биваленты. Это совпадает во времени с образова-
94 Часть первая. Предзародышевое развитие нием веретена первого мейотического деления. Биваленты (тетрады) прикрепляются к веретену таким образом, что редукционная щель между гомологами располается по экватору веретена. Биваленты вместе с мейотическим веретеном двигаются к периферии ооцита, и оно поворачивается, занимая радиальное положение, но под определенным углом к плазматической мембране ооцита. Затем начинается расхождение гомологических хромосом (диад) к полюсам веретена таким образом, чтобы одна из гомологичных хромосом осталась в ооците, а другая попала в полярное тельце, т. е. у млекопитающих первое мейотическое деление является редукционным, а второе эквационным, во время которого расходятся сестринские хроматиды и деление хромосом (диад) проходит в плоскости эквационной щели (см.: Кикнадзе, Высоцкая, 1975; Васецкий, 1977). В первом делении созревания (как и во втором мейотическом делении) осуществляется асимметричный цитокинез. Это обусловливается тем, что так называемое контрактильное кольцо, благодаря которому происходит цитокинез (Schroeder, 1975), формируется не в центре, а ближе к одному из полюсов и под углом к центральной оси ооцита (Szollosi, 1970). Поэтому когда выделяется полярное тельце, его размеры значительно меньше размеров ооцита. Образование контрактильного кольца обусловлено упорядоченной организацией системы субкортикальных микрофиламентов, т. е. одного из элементов цитоскелета ооцита (см. ниже). V.3.1.1. Изменения плазматической мембраны и цитоскелета ооцитов. Особенности организации мейотического веретена При созревании ооцитов меняется состояние плазматической мембраны и по-иному организуется цитоскелет. Так, при помощи лектинов и других лигандов были изучены гликопротеиды клеточной поверхности созревающих ооцитов мышей и других млекопитающих. Обнаружено, что в области, соответствующей будущему месту образования полярного тельца, локально меняется плазматическая мембрана и возникают сдвиги в ее вязкости и текучести (Wolf, Ziomek, 1983). Эти изменения липидных и белковых компонентов плазматической мембраны созревающего ооцита схожи с теми, которые отмечаются при активации яйцеклеток мышей (см. гл. VI, а также: Wolf et al., 1981). При созревании ооцитов млекопитающих существенно меняется вся организация цитоскелета, причем это начинается с микрофиламентов в субкортикальном слое. Сходная картина наблюдается и при активации яйца, т. е. при завершении второго мейотического деления (см. гл, VI). Считают, что в обоих случаях система микрофиламентов-микротрубочек цитоскелета вовлечена в поддержание блока мейоза (на профазе первого или на метафазе второго деления созревания) и, следовательно, созревание ооцитов связано с комплексом сдвигов в цитоплазме, одним из важных компонентов которого является изменение цитоскелета (Masui et al., 1977). Высказывается предположение, что это осуществляется под влиянием сдвигов в содержании в созревающем ооците двувалентных катионов, циклических нуклеотидов и других эффекторных молекул, а также из-за изменения проницаемости плазматической мембраны и внутриклеточного рН (Masui et al., 1977; Zoz, 1983; Albertini, 1984). Полагают, что этот процесс начинается с микрофиламентов в субкортикальном слое ооцита и распространяется на весь цитоскелет. Все три компонента цитоскелета (микротрубочки, филаменты f-актина и промежуточные филаменты) образуют единую систему, благодаря которой в ооците происходит передвижение не только хромосом, но также лизосом и других органоидов. Созревание знаменуется тем, что лизосомы перемещаются и скапливаются
V. Созревание ооцитов 95 в районе цитоплазмы, непосредственно окружающем зародышевый пузырек, прилегая к ядерной оболочке. Лизосомы, вероятно, принимают непосредственное участие в растворении ядерной оболочки, т. е. в разрушении зародышевого пузырька (Ezzell, Czego, 1979; Albertini, 1984). Полагают, что микротрубочки участвуют в деформации зародышевого пузырька, отмечаемой при начале созревания, так как большое их количество обнаруживается снаружи во всех выпячиваниях, возникающих в оболочке зародышевого пузырька (Szollosi, 1973). Что касается организующих центров микротрубочек (Microtubule organizing centers — МТОС), то они заметны в цитоплазме ооцита еще до разрушения зародышевого пузырька. Однако после инициации созревания МТОС локализуются вблизи зародышевого пузырька, окружая его со всех сторон. Вначале МТОС имеют небольшой размер, а затем они увеличиваются и их количество возрастает. Когда оболочка зародышевого пузырька начинает распадаться на отдельные четырехугольные мембранные комплексы, МТОС располагаются на периферии остающейся кариоплазмы (Szollosi et al., 1972b). Затем в эту область проникают митохондрии и цитоплазматические гранулы (Szollosi et al., 1972а, 1972b), и к этому времени биваленты конденсируются и теряют связь с остатками ядерной оболочки. Остатки ядерной оболочки (мембранные комплексы) полностью исчезают, а из микротрубочек и МТОС формируется мейоти- ческое веретено первого деления созревания. Было проведено детальное исследование самосборки и строения мейоти- ческого веретена в первом и втором делениях созревания ооцитов мышей (Donahue, 1968; Szollosi, 1973; Sorensen, Wassarman, 1976). Установлено, что в обоих случаях веретено отличается от митотического веретена соматических клеток животных тем, что оно лишено центриолей и имеет «бочкообразную» форму, напоминая митотическое веретено растительных клеток. Вместо центриолей по полюсам мейотического веретена ооцитов располагаются МТОС, причем каждый полюс содержит 10 и больше МТОС, совокупность которых образует на полюсе как бы обруч, разорванный на ряд частей. Эта кольцевидная структура визуализируется на полюсах мейотического веретена и при светооптических исследованиях (рис. 6), однако строение этой своеобразной структуры мейотического веретена, заменяющей центриоли, можно исследовать только при помощи электронной микроскопии (Szollosi, 1972; Szollosi et al., 1980); она четко выявляется и при использовании флюоресцентных антител к перицентриолярному материалу (Calarco-Gillam e' al., 1983). Примечательно, что центриоли обнаруживаются в пахитенных ооцитах млекопитающих, но когда ооциты вступают в стадию диктиотены, центриоли исчезают (Szollosi, 1972). В это время и на последующих стадиях роста ооцитов (стадии продвинутой диплотены) обнаружить центриоли в ооцитах невозможно (Szollosi, 1973), т. е. они дезинтегрируются (Szollosi et al., 1972a; 1980). Любопытно, что в сперматогенезе млекопитающих во время обоих делений созревания у мейоцитов центриоли сохраняются и продолжают функционировать на полюсах мейотического веретена, их можно найти и в сперматидах. В зрелом спермин сохраняется только проксимальная центриоль, так как вторая центриоль разрушается во время поздних фаз спермиогенеза. У млекопитающих спермий привносит при оплодотворении центриоль в яйцо, однако эта центриоль не принимает никакого участия ни в функции мейотического веретена второго деления созревания, ни в последующих делениях дробления и бесследно исчезает (Szollosi, 1973). Характерно, что если гибриди- зовать ооциты мыши с бластомерами ранних зародышей, то центриоли бласто- меров, попадая в цитоплазму ооцитов, не интегрируются в мейотическое веретено и не принимают участия в первом и втором делениях созревания или в последующих делениях дробления (Szollosi et al., 1980).
96 Часть первая. Предзародышевое развитие Необходимо иметь в виду, что бластомеры в первых делениях дробления имеют митотическое веретено без центриолей, весьма сходное с мейотическим веретеном ооцитов, однако после третьего деления дробления в бластомерах образуется типичное митотическое веретено с центриолями (Szollosi, 1972; Calarco, McLaren, 1976). В приведенных выше опытах в одной из серий для гибридизации использовали бластомеры от 16-клеточных зародышей, заведомо имевшие центриоли (Szollosi et al., 1980). Таким образом, мейотическое веретено обладает такой структурой и свойствами, которые не позволяют интродуцировать в его состав центриоли от соматических клеток, с чем, по-видимому, связаны и невозможнось интеграции в состав мейотической метафазной пластинки митотических хромосом от бластомеров ранних зародышей (Balakier, 1978; Tarkowski, Balakier, 1980). Мейотическое веретено ооцитов млекопитающих характеризуется менее совершенной функциональной способностью, чем митотическое веретено соматических клеток, причем это относится и к веретену первых делений дробления. Во всех этих случаях отсутствие центриоль и наличие вместо них множественных МТОС на полюсах веретена может способствовать тому, что отдельные хромосомы вместе с МТОС, к которому прикрепляется группа микротрубочек, соединенная с кинетохором данной хромосомы, отделяется от веретена (Szollosi, 1973). Сегрегация такой хромосомы нарушается, и она либо остается в ооците, либо целиком переходит в полярное тельце. В случае первого деления созревания неправильное расхождение касается бивалента, а во втором делении созревания — целой хромосомы (диады). Нарушения сегрегации хромосом во время первого мейотического деления значительно чаще служит причиной образования анеуплоидных гамет у человека и млекопитающих животных, чем нарушения сегрегации хромосом во время второго деления созревания (Дыбан, Баранов, 1978, 1987; Chandley, 1984). Поэтому есть основания полагать, что мейотическое веретено первого деления созревания менее совершенно и более чувствительно к некоторым альтерирующим агентам. Недавно показано, что к таким агентам относится и этиловый спирт, который способен вызывать нерасхождение хромосом во время первого и второго мейотического деления ооцитов мышей (Kaufman, 1983b). Изменяется состояние мейотического веретена и при старении гамет (Дыбан, 1972, 1973а, 19736, 1974, 1977; Szollosi, 1973). Так как при созревании ооцитов млекопитающих in vitro частота нерасхождения хромосом выше, чем при созревании в материнском организме (Hansmann, 1983), есть все основания считать, что при созревании ооцитов in vitro чаще отклоняется от нормы, чем при созревании ооцитов в материнском организме. Логично допустить, что это могло быть связано с субоптимальными условиями культивирования, т. е. с колебаниями рН и состава среды и флюктуациями температуры. При исследовании мейоза у самых различных животных замечено, что мейотическое веретено обладает более высокой термочувствительностью по сравнению с другими компонентами клетки (Ротт, 1965; литературу см.: Васец- кий, 1977). При понижении температуры происходит разработка как митотического, так и мейотического веретена из-за деполимеризации тубулина — главного структурного белка микротрубочек (Petzelt, 1979; Raff, 1979). Известно, что как при понижении температуры, так и при гипертермии (Kaufman, 1983a, 1983b; Chandley, 1984) возникают аномалии расхождения хромосом в созревающих ооцитах мыши. Недавно этот вопрос был подвергнут повторному изучению в опытах на ооцитах овец, созревавших in vitro при разной температуре. Показано, что флюктуация температуры вызывала аномалии мейотического веретена и тем самым приводила к нарушениям расхождения хромосом и анеуплоидии у созревших ооцитов (Moor, Crosby, 1985).
V. Созревание ооцитов 97 Таким образом, нормальное состояние цитоскелета и в первую очередь мейотического веретена необходимо для нормальной сегрегации хромосом во время делений созревания. Приведенные выше факты следует учитывать при проведении опытов по созреванию ооцитов различных млекопитающих и человека in vitro, когда отклонения температуры от оптимума могут привести к аномалиям цитоскелета, и в том числе аномалиям мейотического веретена, что отрицательно скажется на способности ооцитов к оплодотворению и дальнейшему развитию. Используя принципиально новые методы исследования организации клеток, включающие сложный комплекс аппаратуры со специальной системой контрастирования телевизионного изображения, при помощи ЭВМ в сочетании с флуоресцентной микроскопией, выявляющей различные лиганды, в том числе и специфически связывающиеся с определенными структурными элементами цитоскелета, были продемонстрированы разительные изменения цитоплазмы и цитоскелета созревающих ооцитов млекопитающих (Albertini, 1984). Этот перспективный подход в сочетании с другими новыми методами позволит, по-видимому, в недалеком будущем приблизиться к углубленному пониманию механизмов и роли изменений цитоскелета в созревании ооцитов млекопитающих, тем более что данное направление исследований занимает ведущее место в современной цитологии (биологии клетки). V.3.I.2. Поведение хромосом Хронология преобразования профазного ядра (зародышевого пузырька) в метафазе хромосомы (биваленты) при созревании ооцитов описана у различных млекопитающих. Наиболее полно эти вопросы исследованы в ооцитах мышей, хотя в литературе можно найти сведения, касающиеся ооцитов других млекопитающих (Donahue, 1968, 1972; Baker, 1972; Thibault, 1972, 1977; Kaufman, 1983a). Вместе с тем, как это ни странно, но в литературе отсутствуют достаточно подробные сведения о морфологии хромосом при визуализации бивалентов, а также на стадии диакинеза в ооцитах млекопитающих. По-видимому, это связано с техническими трудностями получения высококачественных хромосомных препаратов из созревающих ооцитов млекопитающих. Поэтому были проведены цитогенетические исследования хромосом после разрушения зародышевого пузырька в яйцеклетках мышей и крыс и обращалось внимание на последовательные изменения морфологии бивалентов (Дыбан, не опубликовано). Замечено, что в ооцитах мышей на стадии визуализации некоторые из бивалентов имеют более интенсивную окраску, т. е. гетеропикно- тичны (рис. 7). Не исключено, что это касается бивалента Х-хромосом. Однако такую картину удается выявить не во всех препаратах, и требуются дальнейшие исследования для того, чтобы определить, в какой мере гетероцикличность (разная степень спирализации и гетерохроматизации) некоторых бивалентов присуща оогенезу как мышей, так и других млекопитающих. Этот вопрос заслуживает дальнейшего изучения, и пока еще невозможно объяснить биологический смысл таких различий в состоянии некоторых бивалентов в женском мейозе млекопитающих. Замечено, что среди бивалентов ооцитов мыши есть такие, у которых более рано начинается расхождение. Нередко в препаратах ооцитов встречаются и униваленты. Вполне логично допустить, что эти картины отражают преимущественную предрасположенность бивалентов определенных хромосом к нарушениям расхождения во время первого деления созревания. Однако данное предположение не нашло подтверждения в работах, в которых сопоставлялась частота унивалентов в метафазе I мейоза и частота 7 А. П. Дыбан
98 Часть первая. Предзародышевое развитие ануэплоидных (дисомичных или нуллисомичных) ооцитов на стадии метафазы второго деления созревания (Polani, Crolla, 1981). Данный вопрос требует дальнейшего изучения с использованием методов, исключающих возможность образования унивалентов по ходу приготовления препарата, т. е. возникновения артефактов. Получены факты, позволяющие думать, что во время первого деления созревания может происходить избирательное расхождение некоторых хромосом, которые либо остаются в ооците, либо переходят в полярное тельце. Так, уже давно было замечено, что при созревании ооцитов от ХО мышей Х-хромосома чаще, чем следовало ожидать, остается в созревшем ооците (Kaufman, 1972), т. е. унивалент Х-хромосомы предпочтительно сохраняется во время первого деления созревания в оопите, а не попадает в первое полярное тельце. При исследовании потомства от мышей с Робертсоновскими транслокациями [Rb A6.17) 7 Bnr] замечена неправильная сегрегация этих хромосом во время первого деления созревания' ооцитов, т. е. из тривалента метацентрик преимущественно попадал в состав первого полярного тельца (Рувинский и др., личное сообщение). Эти наблюдения совпадают с данными, полученными при изучении поведения в первом делении созревания тривалента, включающего другие аутосомы, вовлеченные в Робертсоновские транслокации (Gropp, Winking, 1981). Однако недавно опубликована работа, данные которой свидетельствуют об обратном — преимущественном сохранении в хромосомном наборе ооцитов мышей метацентрика (центрическое слияние хромосом 9 и 12) (Harris et al., 1986). Связано ли это с тем, что в данной работе исследовались дикие мыши, а в других работах лабораторные мыши, остается не выясненным. Не исключено, что биваленты по-разному прикрепляются кинетохорами к системе микротрубочек мейотического веретена первого деления созревания в ооцитах не только мышей, но и других млекопитающих. Возможно также, что силы притяжения между гомологами, входящими в состав бивалента, либо хромосомами, входящими в состав тривалента или тетравалента, могут превышать действие тех сил, которые направлены на разделение (расхождение) бивалентов в плоскости редукционной щели. Исследование сегрегации хромосом в первом мейотическом делении ооцитов, несущих Робертсоновские и другие транслокации, может приблизить понимание этих интересных механизмов, нарушение которых лежит в основе возникновения анэуплоидных гамет у млекопитающих и человека. Заслуживает внимания поведение хромосом, попавших в первое полярное тельце. У мышей эта группа хромосом, как правило, не формирует ядра, но и не составляет метафазную пластинку, а разбрасывается по цитоплазме полярного тельца. В ряде случаев эти хромосомы длительное время сохраняют нормальную морфологию, позволяющую подсчитывать их количество. Однако бывают и случаи, когда эти хромосомы в полярном тельце распадаются через несколько часов после его формирования. Свойства цитоплазмы первого полярного тельца близки к свойствам цитоплазмы ооцита, завершившего первое мейотическое деление, так как в полярном тельце хромосомы остаются блокированными на стадии метафазы. Следовательно, цитоплазма первого полярного тельца лишена факторов, необходимых для формирования интерфазного ядра. Кроме того, в цитоплазме первого полярного тельца нет факторов, необходимых для самосборки митотического веретена, и этим полярное тельце отличается от ооцита. Напомним, что оставшаяся в ооците группа хромосом (диад) быстро переходит из стадии анафазы и телофазы первого мейотического деления непосредственно в метафазу второго мейотического деления. Веретено второго мейотического деления располагается тенгенциально и хорошо визуализируется
V. Созревание ооцитов 99 в овулировавших яйцеклетках (рис. 6). На этой стадии яйцеклетки млекопитающих блокируются, т. е. завершение мейоза происходит только после оплодотворения или искусственной активации яйцеклеток (см. гл. VI). V.3.2. СИНТЕЗ БЕЛКОВ И СОЗРЕВАНИЕ ЦИТОПЛАЗМЫ ООЦИТА При созревании ооцитов речь должна идти не только о преобразованиях ядра (разрушении зародышевого пузырька и дальнейшем поведении метафаз- ных хромосом), но и об изменениях цитоплазмы, т. е. ее созревании. Последнее зависит от появления в цитоплазме ооцита ряда новых полипептидов и исчезновении некоторых предсуществовавших белков. Изменения белкового спектра цитоплазмы созревающих ооцитов млекопитающих обусловливаются как синтезом белков на готовых матрицах (трансляцией генетической информации ооцита), так и посттрансляционными изменениями белков цитоплазмы. Есть все основания считать, что во время созревания ооцита происходит репрограммирование его цитоплазмы и ядра, вовлекающее изменения спектра синтеза белков, фосфориляцию ряда белков и сдвиги в системе транспорта аминокислот (Moor, Smith, 1979; Moor, Osborn et al., 1981; Crosby et al., 1984; Cran, 1985). Существуют приемы, позволяющие разобщить созревание ядра и цитоплазмы ооцитов млекопитающих. Так, если добавить к культуральной среде аналоги циклической АМФ или ингибиторы фосфодиэстеразы, то в ооцитах сохраняются интактные зародышевые пузырьки, однако в цитоплазме появляются характерные полипептиды, такие же, как при нормальном созревании ооцитов. Поэтому высказано предположение, что созревание ядра и созревание цитоплазмы ооцитов — относительно независимые процессы, т. е. созревание цитоплазмы может происходить и без созревания ядра. Однако в нормальных условиях изменения ядерного аппарата ооцитов коррелируют с изменениями белкового спектра цитоплазмы (McGaughey, Van Blekom, 1977). Примечательно, что появляющиеся во время созревания ооцитов новые белки цитоплазмы напоминают собой те полипептиды, которые образуются при оплодотворении и на самых начальных стадиях дробления (Van Blerkom, 1983). Спектр полипептидов в цитоплазме созревающих ооцитов сильнее всего меняется на протяжении 15 ч, непосредственно предшествующих разрушению зародышевого пузырька. Эти белки, вероятно, синтезируются на матрицах РНК, поступивших в цитоплазму на более ранних стадиях роста ооцита, хотя у мышей существенное количество РНК мигрирует из ядра в цитоплазму ооцитов за один час до разрушения зародышевого пузырька (Rodman, Bachvarova, 1976; Wassarman, Letourneau, 1976a, 1976b; Wassarman et al., 1978). Некоторые белки, синтезирующиеся незадолго до разрушения зародышевого пузырька, ассоциируются с конденсирующимися хромосомами и в таком виде находятся в цитоплазме ооцита после разрушения его ядра (Wassarman, Letourneau, 1976b). Связанные с мейотическими хромосомами белки, по-видимому, являются одной из форм существования так называемого фактора промоции созревания ооцитов (MPF) (см. раздел 5.3.3.1). Поступление в цитоплазму ряда веществ из разрушающегося зародышевого пузырька, в том числе и определенных классов белков, отмечено при созревании ооцитов мышей (Schultz, Wassarman, 1977), ооцитов овец (Moor et al., 1981), кролика (Thibault, 1972) и свиней (Motlik, Fulka, 1976). Ооциты свиней являются удобным объектом для изучения этого вопроса. В отличие от созревающих ооцитов мыши и ряда других млекопитающих,
100 Часть первая. Предзародышевое развитие у которых зародышевый пузырек разрушается быстро, в ооцитах свиней зародышевый пузырек разрушается постепенно, на протяжении 20 ч. Поэтому созревание ооцита свиней может быть подразделено на 4 четкие подстадии (Motlik, Fulka, 1976). Используя методы цитоавторадиографии и культивирования ооци- тов в среде с различными радиоактивными предшественниками РНК и белков, были исследованы изменения морфологии и транскрипционной активности хроматина и синтез белков в созревающих ооцитах свиней. Н3-уридин включается не только в ядрышки и нуклеоплазму зародышевого пузырька, но интенсивная метка отмечается и в хромоцентрах и районах конденсированного хроматина. Изучение синтеза белков в яйцеклетках мышей (Wassarman, Letourneau, 1976b) показало, что синтезирующиеся в цитоплазме белки накапливаются в зародышевом пузырьке ооцитов и связываются с хромосомами. Эти белки обнаруживаются на хромосомах и на более поздних стадиях, когда мейоз возобновляется. Эти наблюдения были подтверждены (Motlik et al., 1978) в опытах на созревающих ооцитах свиней. Установлено, что меченые аминокислоты накапливаются в области ядрышка в зародышевых пузырьках ооцитов, что особенно четко заметно при созревании ооцитов in vitro в среде, к которой добавляли фолликулярную жидкость. Основные белки накапливаются в зародышевом пузырьке вплоть до стадии 4, когда в зародышевом пузырьке уже заметны волокнистые контуры бивалентов. По-видимому, главным белком, который накапливается в зародышевом пузырьке ооцитов свиней и кроликов во время их созревания, являются богатые лизином гистоны, а также гистоны, содержащие метионин (Motlik et al., 1978). Эти наблюдения совпадают с данными, полученными при исследовании синтеза белков в созревающих ооцитах мышей (Wassarman, Letourneau, 1976b). Есть известные основания полагать, хотя это предположение и нуждается в более веских доказательствах, что синтез новых белков не нужен для разрушения зародышевого пузырька и для конденсации хромосом в метафазе первого мейотического деления (Tesarik, 1986). Вместе с тем дефосфорилирование какого-то фосфопротеина, накопившегося в неактивной форме в ооцитах мыши, происходит в ответ на снижение содержания в ооците циклической АМФ при коммитировании к созреванию. Активная форма этого белка и инициирует разрушение оболочки зародышевого пузырька в ооцитах (Schultz et al., 1983a), т. е., по-видимому, и является так называемым фактором промоции созревания ооцитов (MPF) (см. V.3.3.1). V.4. ФАКТОРЫ ЦИТОПЛАЗМЫ, ОТВЕТСТВЕННЫЕ ЗА СОЗРЕВАНИЕ ООЦИТОВ МЛЕКОПИТАЮЩИХ Поиски цитоплазматических факторов, ответственных за различные процессы, осуществляющиеся при созревании ооцитов, давно занимали умы тех, кто исследовал оогенез амфибий и рыб. В последнее время эти вопросы находятся в центре внимания тех, кто исследует молекулярные механизмы оогенеза млекопитающих. Появились основания для того, чтобы расценивать некоторые из факторов, впервые обнаруженные при созревании ооцитов амфибий и рыб, как универсальные регуляторы не только мейотического и митотического цикла и у млекопитающих, но и как регуляторы митотического цикла любых эукарио- тических клеток. Таким образом, изучение свойств и механизмов действия некоторых факторов цитоплазмы созревающих ооцитов приобрело общебиологический характер. Раньше чем перейти к рассмотрению сведений о наличии данных факторов в созревающих ооцитах млекопитающих, необходимо остановиться на принци-
V. Созревание ооцитов 101 пиально важном вопросе, далеко выходящем за пределы чисто терминологических споров. Если исходить из представления, что каждое изменение свойства или строения созревающего ооцита обусловливается появлением (или исчезновением) в цитоплазме специфического фактора, то тогда таких гипотетических факторов должно существовать превеликое множество. Напомним, что при созревании возникают последовательные изменения плазматической мембраны, цитоске- лета, перемещаются органоиды, обводняется цитоплазма, растворяется оболочка зародышевого пузырька, конденсируются хромосомы, формируется мейотическое веретено и т. д. Каждый из названных процессов можно в свою очередь подразделить на несколько, и тогда количество гипотетических факторов, регулирующих или определяющих созревание ооцита, возрастет до бесконечности. Рассматривая эти вопросы, Т. А. Детлаф пишет: «Введение таких факторов вполне законный прием, так как это позволяет уточнить объекты исследования. После того, как будет выяснена их природа, слово „фактор" будет заменено названием конкретного вещества или веществ». Т. А. Детлаф предлагает определять «эти гипотетические факторы по конкретным признакам, структурным и функциональным, возникновение которых они, как предполагается, определяют» (Детлаф, 19776, с. 154). Однако если при созревании ооцитов амфибий и рыб есть известные основания думать о существовании ряда таких факторов (Детлаф, 19776), то при созревании ооцитов млекопитающих речь может идти лишь о так называемом факторе промоции созревания и факторе формирования мужского пронуклеуса. Не исключено, что это связано со слабой изученностью молекулярных механизмов созревания ооцитов млекопитающих или с техническими препятствиями, стоящими на пути любых попыток выделить из цитоплазмы этих клеток, обладающих значительно меньшими размерами, чем ооциты амфибий или рыб, индивидуальные факторы, которым можно было бы приписать участие в процессах, осуществляющихся при созревании ооцитов. V.4.I. ФАКТОР ПРОМОЦИИ СОЗРЕВАНИЯ (ДЕЗИНТЕГРАЦИИ ОБОЛОЧКИ ЗАРОДЫШЕВОГО ПУЗЫРЬКА) Уже давно при изучении молекулярных механизмов созревания ооцитов амфибий было введено понятие (Masui, Markert, 1971) о факторе цитоплазмы, инициирующим созревание, т. е. возобновление мейоза. Этот фактор назвали фактором промоции созревания и обозначили буквами MPF (от слов Maturation promoting factor). Этот фактор считают ответственным за разрушение оболочки зародышевого пузырька, и его предложено называть «фактором дезинтеграции оболочки зародышевого пузырька» (Детлаф, 19776). В дальнейшем пришли к выводу, что данный цитоплазматический фактор относится к универсальным инициаторам как мейотической, так и митотической фаз клеточного цикла, т. е. он вызывает переход из интерфазы в метафазу в клетках у самых различных животных, включая и млекопитающих (Masui, Clarke, 1979; Mailer, 1983; Satoh, 1985). Однако и в настоящее время его продолжают обозначать как MPF, по-видимому, из-за того, что источником получения этого фактора обычно служат созревающие ооциты амфибий. MPF посвящены многочисленные работы, выполненные на ооцитах амфибий, рыб (литературу предыдущих лет см.: Детлаф, 19776) и на других объектах. В последнее время опубликован ряд обстоятельных обзоров, обобщающих сведения о природе и действии MPF (Masui, Clarke, 1979; Kiskimoto et al., 1982; Mailer, 1983; Clarke, Masui, 1983, 1985; Ford, 1985; Satoh, 1985; Dettlaff, 1987). Этот фактор
102 Часть первая. Предзародышевое развитие удалось частично очистить, выделив его из ооцитов шпорцевой лягушки. Оказалось, что активность MPF связана с белком мол. весом около 100 кД (Wu, Gerhart, 1980). В недавнем обзоре Форда (Ford, 1985) подробно разбираются молекулярные механизмы образования и действия MPF как во время возобновления мейоза, так и по ходу первого и второго деления созревания ооцитов амфибий. Недавно была создана бесклеточная система, позволяющая изучать действие этого фактора на ядра соматических клеток in vitro. Если к экстракту из ранних зародышей шпорцевой лягушки, обработанных циклогексемидом, добавить ядра тимоцитов или клеток СНО, то эти ядра остаются на стадии интерфазы. Однако после добавления к данной системе MPF инициируется митоз, т. е. разрушается оболочка и происходит конденсация хромосом в изолированных ядрах соматических клеток млекопитающих (Miake-Lye, Kjrschner, 1985). Эти новые факты подтверждают сформулированную ранее гипотезу, согласно которой (Wassarman, Smith, 1978) MPF лишен видовой специфичности и вызывает растворение ядерной оболочки и конденсацию хромосом не только в ооци- тах, но и в соматических клетках. Была также сформулирована гипотеза, согласно которой MPF образуется и в созревающих ооцитах млекопитающих (Masui, Clarke, 1979; Clarke, Masui, 1983, 1985). Многие из положений этой гипотезы, если их применять к созреванию ооцитов млекопитающих, еще нуждаются в более веском подтверждении. Необходимо иметь в виду, что опыты по выделению из ооцитов млекопитающих MPF не проводились. Вместе с тем есть факты, позволяющие думать, что на определенных стадиях созревания ооцитов млекопитающих цитоплазма приобретает свойства, которые косвенно свидетельствуют о появлении в цитоплазме MPF. Существенный вклад в познание этих вопросов внес цикл исследований, выполненных в лаборатории А. К- Тарковского (Tarkowski, 1982). Получены данные, позволяющие считать, что MPF у млекопитающих может действовать как на интерфазные ядра соматических клеток, так и на зародышевый пузырек ооцитов, причем ядро ооцита способно реагировать на MPF задолго до начала созревания ооцита. Эти выводы сделаны на основании следующих опытов: в качестве тест-объектов были использованы ооциты из небольших фолликулов, полученных от 9—11-суточных мышат. Эти ооциты не могут созревать, если их изолировать и поместить в культуральную среду. Диаметр этих ооцитов не превышает 34—55 мкм. Если гибридизовать полностью созревшие ооциты мыши, у которых уже произошло разрушение зародышевого пузырька, с такими маленькими ооцитами, то через 2 ч после слияния в гетерокарионе возникают две группы хромосом, а через 3—5 ч одна общая группа мейотических хромосом (Balakier, 1978). Эти наблюдения на незрелых ооцитах мышей хорошо согласуются с результатами опытов на ооцитах амфибий и рыб, показавших, что цитоплазма созревающего ооцита вызывает дезинтеграцию ядерной оболочки не только в ооцитах, завершивших рост, но и в мелких ооцитах, находящихся на начальных стадиях роста (Никитина, 1974; Фельгенгауер, Чулицкая, 1977). Таким образом, и у млекопитающих ядро ооцита как в диктиотене, так и на стадии продвинутой диплотены, т. е. в начале роста, уже способно отвечать возобновлением мейоза на действие цитоплазмы. До определенной стадии оогенеза незрелой остается именно цитоплазма ооцита, так как в ней нет фактора (MPF), который может служить сигналом для снятия блока мейоза и инициации созревания ядра и ооцита в целом. Были проведены опыты, позволившие определить, участвуют ли в появлении MPF вещества, поступающие в цитоплазму ооцита из кариоплазмы зародыше-
V. Созревание ооцитов 103 вого пузырька. Крупные ооциты мыши, достигшие максимального размера и способные созревать in vitro, микрохирургически разделяли на две части — ядерный и безъядерный фрагменты. Оба сестринских фрагмента помещали в культуру и наблюдали за поведением зародышевого пузырька в ядерном фрагменте. Как только зародышевый пузырек в кариопласте разрушался, безъядерный сестринский фрагмент гибридизовали с интерфазными бластоме- рами 2-клеточных зародышей. Было обнаружено, что при слиянии бластомеров с цитопластом происходила преждевременная конденсация хромосом, однако это наблюдалось, если безъядерный сестринский фрагмент достиг того же возраста, что и ядерный фрагмент, в котором произошло разрушение зародышевого пузырька. На основании этих опытов был сделан вполне обоснованный вывод, что фактор, необходимый для созревания ядра ооцитов MPF, возникает в цитоплазме вне зависимости от разрушения зародышевого пузырька. MPF может образовываться и в безъядерном фрагменте ооцита, в который не поступали какие бы то ни было вещества из разрушающегося зародышевого пузырька (Balakier, Czolowska, 1977; Balakier, Tarkowski, 1980; Tarkowski, 1982). Для того чтобы определить, обладает ли цитоплазма зрелого ооцита мыши способностью разрушать оболочку интерфазных ядер соматических клеток, созревающие или созревшие ооциты мышей гибридизовали с бластомерами ранних зародышей мыши или с фолликулярными клетками. Установлено, что интерфазные ядра этих соматических клеток, попав в цитоплазму зрелых ооцитов мыши, изменяются, т. е. разрушается ядерная оболочка и хромосомы конденсируются (Balakier, 1978; Tarkowski, Balakier, 1980). Следовательно, при гибридизации интерфазных клеток со зрелым ооцитом мыши наблюдается тот же феномен преждевременной конденсации хромосом, что и при гибридизации митотических и интерфазных соматических клеток. Этот феномен многократно описывался при гибридизации соматических клеток, и считают, что он обусловливается действием цитоплазматических факторов, находящихся в митотически делящихся клетках. Эти факторы цитоплазмы разрушают в гетерокарионе оболочку интерфазного ядра и, конденсируя хромосомы, приводят к их визуализации (Рингерц, Сэвидж, 1979; Rao, 1982). Факторы цитоплазмы митотических клеток млекопитающих не только лишены видовой специфичности, но способны оказывать на ядро незрелых ооцитов амфибий такое же действие, как и MPF. Так, если инъецировать цито- плазматические факторы из митотических клеток млекопитающих в большие ооциты шпорцевой лягушки, то оболочка зародышевого пузырька разрушается и мейотические хромосомы конденсируются (Sunkara et al., 1979). В митотических клетках эти факторы прочно связаны с метафазными хромосомами, но их можно освободить при действии нуклеаз на хромосомы. Если ввести полученные таким образом вещества в ооциты шпорцевой лягушки, мейоз возобновляется, т. е. зародышевый пузырек разрушается так же, как после введения в ооцит MPF (Adlakha et al., 1982). Полагают, что MPF в ооцитах и белковые факторы инициации митоза в соматических клетках являются одним и тем же классом цитоплазматических белков, возникающих на опреденных фазах митотического цикла соматических клеток и на определенных стадиях созревания ооцитов (Wassarman, Smith, 1978; Masui, Clarke, 1979; Sunkara et al., 1979; Clarke, Masui, 1983, 1985). Таким образом, MPF должен быть отнесен к факторам, регулирующим клеточный цикл как в мейозе, так и в митотически делящихся соматических клетках. Разбор факторов, регулирующих митотический цикл соматических клеток млекопитающих и других животных, является самостоятельной темой и далеко выходит за рамки нашей задачи, тем более что этой сложной и многогранной проблеме посвящена обширная литература и она рассматривается
104 Часть первая. Предзародышевое развитие в монографиях, опубликованных у нас в стране (Епифанова, 1973; Ченцов, Поляков, 1974; Рингерц, Сэвидж, 1979; Бродский, Урываева, 1981; Зеленин, Кущ, Прудовский, 1982). Вместе с тем целесообразно обратить внимание на недавно сформулированную концепцию о центральной роли MPF в регуляции клеточного цикла. Тарковский считает, что появление MPF контролируется каким-то общим механизмом, присущим всем животным клеткам. Каким бы ни был внешний стимул, способный инициировать созревание ооцитов, первичным местом его действия является плазматическая мембрана. Изменения плазматической мембраны трансформируется в какие-то вторичные сигналы, вызывающие появление в цитоплазме ооцита млекопитающих MPF (Tarkowski, 1982). Так как MPF обнаружен не только в ооцитах амфибий и рыб, но и в культурах клеток млекопитающих и в cdc мутантах у дрожжей (Sunkara et al., 1979; Kishimoto et al., 1982), его теперь считают универсальным цитоплазматическим фактором, ответственным за инициацию митотической фазы клеточного цикла эукариотических клеток (Ford, 1985; Satoh, 1985). Полагают, что все события в клеточном цикле, касающиеся изменения ядерного аппарата, включая инициацию репликации ДНК и митоз, регулируются уровнем активности в цитоплазме MPF. Переход интерфазы в метафазу также зависит от уровня MPF в цитоплазме. Добавление или удаление MPF из цитоплазмы может управлять клеточным циклом в яйцах шпорцевой лягушки, т. е. разрушать или формировать ядерную оболочку, конденсировать либо деконденсировать хромосомы, подавлять или инициировать репликацию ДНК в ядрах или на экзогенных матрицах, т. е. плазмидах, интродуцированных в яйцо (Newport, Kirschner, 1984). Примечательно, что явление конденсации либо деконденсации хромосом обнаружено и в ооцитах мышей, причем эффект зависел от того, когда на ооциты подействовали ингибитором синтеза белков (Clarke, Masui, 1983). Высказано предположение, что активность MPF управляется автономным механизмом (так называемым осциллятором клеточного цикла) и, возможно, является составной частью этого механизма, создающего биоритмы клетки (Mitchison, 1984; Newport, Kirschner, 1984; Satoh, 1985). Эта концепция в основном носит теоретический характер, однако ряд ее положений доступен экспериментальной проверке. Кроме того, такие теоретические предпосылки кажутся весьма перспективными при планировании опытов, направленных на изучение роли MPF в создании ооцитов млекопитающих, в механизмах регуляции митотического цикла в раннем эмбриогенезе и в механизмах регуляции мейотического цикла на протяжении всех фаз оогенеза млекопитающих. V.4.3. ФАКТОР ФОРМИРОВАНИЯ МУЖСКОГО ПРОНУКЛЕУСА (РЕПРОГРАММИРОВАНИЯ ХРОМАТИНА) При созревании ооцитов кроликов in vitro было замечено, что ооциты могут оплодотворяться, но в ряде из них не формируется мужской пронуклеус. Эти факты послужили основой для гипотезы, согласно которой при нормальном созревании ооцитов в цитоплазме должен образоваться так называемый фактор формирования мужского пронуклеуса (Thibault, 1972, 1977; Thibault, Gerard, 1973). Было показано, что пока в ооцитах не разрушится зародышевый пузырек, протоплазма не способна трансформировать головку спермия в пронуклеус. Обычно в ооциты с интактным зародышевым пузырьком спермин не проникают. Однако в случаях, если единичные спермии пенетрируют ооцит с интактным
V. Созревание ооцитов 105 зародышевым пузырьком, то из головки спермия не формируется пронуклеус (Binor, Wolf, 1979). Спермин могут инкорпорироваться в незрелые ооциты хомячка (Usiu, Yanagimachi, 1976). Однако как в опытах на яйцеклетках мышей, так и в опытах на яйцеклетках хомячка замечено, что при наличии в ооцитах интактного зародышевого пузырька формирование из спермия про- нуклеуса не происходит (Usui, Yanagimachi, 1976). Проведены эксперименты, доказавшие, что способность созревшего ооцита трансформировать головку спермия в пронуклеус зависит от смешивания кариоплазмы зародышевого пузырька с цитоплазмой ооцита. Крупные ооциты мыши, достигшие максимальных размеров, но еще не вступившие в созревание, т. е. содержащие интактный зародышевый пузырек, были микрохирургически разрезаны на ядерные и безъядерные фрагменты. Операцию проводили на разных стадиях (когда в ооцитах был еще хорошо заметен зародышевый пузырек; когда зародышевый пузырек только что разрушился и на стадии метафазы I мейоза). Затем отдельно культивировали ядерные и безъядерные фрагменты. Когда в ядерных фрагментах хромосомы завершили первое мейоти- ческое деление, о чем судили по образованию первого полярного тельца, то бывшие ядерные и безъядерные фрагменты оплодотворялись in vitro и культивировались еще 6—12 ч. Проникшие в бывшие ядерные фрагменты головки спермиев всегда деконденсировались и трансформировались в пронуклеусы. Не было замечено разницы между тем, на какой стадии созревания из ооцитов были получены ядерные фрагменты. Вероятно, в ядерных фрагментах, в которых зародышевый пузырек разрушился после хирургической операции, произошли такие же изменения в цитоплазме, как в неоперированных ооцитах (достигших этого же возраста), у которых также разрушился зародышевый пузырек. Иные результаты наблюдались при оплодотворении безъядерных фрагментов. Если фрагменты цитоплазмы отделяли от ооцита, содержавшего зародышевый пузырек, то проникшие в такие фрагменты спермин никогда не трансформировались в пронуклеусы. Если же цитоплазматические фрагменты отделялись от ооцитов после разрушения зародышевого пузырька, то проникшие в цито- пласты спермии набухали и трансформировались в пронуклеусы (Tarkowski, 1980). Эти опыты доказали, что для того, чтобы в цитоплазме созревающего ооцита возникли факторы формирования мужского пронуклеуса,необходимо смешение кариоплазмы зародышевого пузырька с цитоплазмой ооцита (Balakier, Tarkowski, 1980). Однако полноценная трансформация головки спермия в пронуклеус происходит не только из-за того, что кариоплазма зародышевого пузырька смешивается с цитоплазмой, но и из-за активации созревшей яйцеклетки проникшим в нее спермием. Это доказано опытами, в которых ооциты мыши гибридизовали с клетками тимуса и фолликулярными клетками. Ядра соматических клеток, попавшие в цитоплазму зрелого ооцита мыши, трансформировались в крупные ядра, поразительно напоминающие типичные пронуклеусы. Однако это происходило с соматическими ядрами только после искусственной активации яйцеклетки (Czolowska et al., 1984). Следовательно, для проявления действия фактора формирования пронуклеуса необходимо, во-первых, смешивание кариоплазмы зародышевого пузырька с созревшей цитоплазмой ооцита и, во-вторых, активация яйцеклетки. Так как преобразование головки спермия в ядро (пронуклеус) является одним из ярких примеров активации и репрограммирования хроматина (Зеленин и др., 1974; Зеленин, 1979), фактор формирования мужского пронуклеуса можно расценивать как фактор, участвующий в сложном процессе репрограммирования хроматина. Репрограммирование хроматина пронуклеусов зависит от осуществления в них первого раунда репликации ДНК (Johnson et al., 1984).
106 Часть первая. Предэародышевое развитие Поэтому есть основание полагать, что фактор формирования пронуклеуса относится и к факторам инициации синтеза ДНК в пронуклеусах. В свете опытов на зародышах шпорцевой лягушки, показавших участие MPF в инициации синтеза ДНК и регуляции митотических циклов в дроблении (Newport, Kirchner, 1984; Satoh, 1985), можно допустить, что и у млекопитающих MPF принимает участие в этих процессах. Остается не выясненным, какое отношение имеет MPF к фактору формирования мужского пронуклеуса. Для того чтобы проявилось многогранное действие фактора формирования мужского пронуклеуса, необходимо преодоление блока мейоза на метафазе второго деления созревания, а это происходит только после естественной или искусственной активации яйцеклетки. Возможно, что активация приводит к исчезновению какого-то ингибитора из цитоплазмы яйцеклетки и при этом создаются условия для активации (либо образования) MPF, который и действует на пронуклеусы. Если это предположение справедливо, то тогда MPF и фактор формирования мужского пронуклеуса являются одним и тем же фактором цитоплазмы, хотя для возникновения эффекта, присущего так называемому фактору формирования мужского пронуклеуса, необходимо перемешивание кариоплазмы зародышевого пузырька с цитоплазмой ооцита и активация яйцеклетки (см. гл. VI).
Часть вторая РАННИЙ ЭМБРИОГЕНЕЗ МЛЕКОПИТАЮЩИХ Глава VI ОПЛОДОТВОРЕНИЕ И ИСКУССТВЕННАЯ АКТИВАЦИЯ ЯЙЦЕКЛЕТОК Эмбриональное развитие начинается после оплодотворения или искусственной активации яйцеклеток, и одноклеточная стадия занимает ключевое место в раннем эмбриогенезе. В это время осуществляются процессы, предопределяющие реализацию генетической программы развития, поэтому различные направленные вмешательства на одноклеточной стадии позволяют регулировать оплодотворение, модифицировать способы размножения и пути развития зародышей млекопитающих. Рассмотрим вначале строение и свойства овулировавших яйцеклеток и те изменения, которые характеризуют оплодотворение или искусственную активацию яйцеклеток, а затем остановимся на процессах, осуществляющихся на одноклеточной стадии с того момента, когда у зародыша образовались пронук- леусы, т. е. зигота представляет собой двуядерную клетку, вступающую в фазу G, первого клеточного цикла. Такое разделение носит условный характер, но представляет определенные удобства для изложения материала. Кроме того, с момента образования пронуклеусов зиготу можно сопоставлять с бластоме- рами более поздних зародышей по параметрам клеточных циклов. Поэтому хотя в оплодотворении общепринято выделять сингамию и кариогамию, рассматривая это как единый процесс, мы разбираем процессы сингамии в гл. VI, а кариогамии в гл. VII. VI. 1. СТРОЕНИЕ ОВУЛИРОВАВШЕЙ ЯЙЦЕКЛЕТКИ Размеры зрелых яйцеклеток. Хотя яйцеклетки млекопитающих значительно уступают по размерам яйцеклеткам других позвоночных, однако они крупнее большинства соматических клеток. Так, у сумчатых диаметр яйцеклеток составляет от 140 до 240 мк, у китов — 140 мк, у кроликов, овец, свиней и лошадей — 120—140 мк, у приматов от 110 до 140 мк, а у мышей, крыс и других грызунов — от 75 до 85 мк (Hartman, 1929; Austin, 1961). Размеры яйцеклеток не коррелируют с продолжительностью внутриутробного развития и темпами роста зародышей. Однако есть известные основания полагать, что более крупные яйцеклетки млекопитающих содержат больше веществ, необходимых для раннего эмбриогенеза, и в том числе больше макромолекул, обеспечивающих генетическую программу доимплантационного развития. Так, геном активируется на более ранних стадиях у зародышей мышей и крыс, чем у зародышей кроликов, овец и других видов млекопитающих, у которых яйцеклетки имеют крупные размеры. Общий план строения. Овулировавшие яйцеклетки млекопитающих окружены блестящей оболочкой (zona pellucida), вокруг которой фолликулярные клетки образуют лучистый венец (corona radiata), переходящий в яйценосный бугорок (cumulus oophorus). Блестящая оболочка не прилегает к плазматической мембране яйцеклетки, и между оолеммой и блестящей оболочкой обра-
I Qg Часть вторая. Ранний эмбриогенез млекопитающих зуется перивителлиновое пространство. Рассмотрим строение оболочек и организацию овулировавших яйцеклеток млекопитающих. Блестящая оболочка (zona pellucida). Представляет собой внеклеточный гликокальцекс, окружающий растущий ооцит, и начинает формироваться на тех стадиях оогенеза, когда примордиальные ооциты окружаются сплошным слоем кубических фолликулярных клеток. Образуется как клетками гранулезы, так и самим ооцитом. Отростки клеток гранулезы проходят через блестящую оболочку и образуют щелевые контакты с плазматической мембраной ооцита (см. раздел 2,гл. V). По мере роста ооцита толщина блестящей оболочки увеличивается и достигает максимума у зрелых, овулировавших яйцеклеток. Блестящая оболочка является сложным биохимическим и антигенным комплексом внеклеточных гликопротеинов, окружающим не только ооциты, но и доимплантационные зародыши. В последнее время блестящую оболочку расценивают как потенциальную иммуноконтрацептивную мишень, так как антитела против блестящей оболочки полностью угнетают плодовитость, предотвращая оплодотворение как in vitro, так и in vivo (Sacco, 1981; Dunbar, 1983). Для создания противозачаточных вакцин используют гликопротеины из блестящей оболочки яйцеклеток свиней. Поэтому химический состав блестящей оболочки яйцеклеток этих животных детально изучен и описаны четыре различных гетерогенных гликопротеина, которые обозначают буквами ZP (от англ. zona proteins) . Молекулярный вес ZP1 — 82 000, ZP2 — 61 000, ZP3 — 55 000 и ZP4 — 21 000. В яйцеклетках свиней преобладает ZP3, этот гликопротеин изолирован и очищен хроматографически, а при помощи электроэлюции его используют для получения противозачаточных вакцин (Sacco et al., 1986). У мышей блестящая оболочка состоит из трех сульфатированных гликопротеинов (ZP1, ZP2, ZP3), обладающих различным молекулярным весом и другими свойствами (Bleil, Wassarman, 1980). ZP3 имеет молекулярный вес 83 000 и является специфическим рецептом для спермиев. Изолированный ZP3 эффективно предотвращает связывание спермиев с блестящей оболочкой и таким образом угнетает оплодотворение у мышей (Bleil, Wassarman, 1980). Если иммунизировать мышей антисывороткой против блестящей оболочки, то при этом возникает бесплодие. Этот эффект обратим и обусловлен предотвращением связывания спермиев с блестящей оболочкой или ее непроницаемостью для спермиев (см. обзор: Sacco, 1981). Больше всего в составе блестящей оболочки яйцеклеток мышей содержится сульфатированного гликопротеина мол. весом 140 000 (ZP2). Этот гликопротеин также изменяется после оплодотворения и, вероятно, принимает участие в блокаде полиспермии (Bleil et al., 1981). Вместе с тем антитела к ZP2 не мешают прикреплению спермиев к блестящей оболочке, однако блокируют оплодотворение, делая невозможным пенетрацию блестящей оболочки спермиями (East et al., 1985); При сканирующей электронной микроскопии в блестящей оболочке яйцеклеток хомячков выявлено неодинаковое строение наружной и внутренней поверхности. Наружная поверхность гладкая, а внутренняя содержит многочисленные углубления и бугорки. Остается невыясненным, в какой мере эти особенности строения относятся к блестящей оболочке яйцеклеток других видов млекопитающих и каково физиологическое значение такой неоднородности внутренней поверхности блестящей оболочки. У свежеовулировавших яйцеклеток проницаемость блестящей оболочки снижена, т. е. через нее не проходят многие молекулы, в том числе и полипептиды. По мере увеличения постовуляторного возраста яйцеклеток проницаемость блестящей оболочки улучшается и некоторые полипептиды могут проходить через нее и попадать в перивителлиновое пространство. Описаны и вирусы, способные проходить через блестящую оболочку, что, по-видимому, обусловлено действием ферментов, вырабатываемых ими.
VI. Оплодотворение и искусственная активация яйцеклеток 109 Блестящая оболочка растворяется проназой, трипсином, химотрипсином и другими протеолитическими ферментами, и ее устойчивость к переваривающему действию этих ферментов существенно возрастает после оплодотворения, что, вероятно, обусловлено действием на блестящую оболочку содержимого кортикальных гранул, попавшему в перивителиновое пространство. Предполагают, что овопероксидаза кортикальных гранул модифицирует гликопротеин ZP-3 (Bleil, Wassarman, 1980) и, помимо этого, связываясь с остатками тирозина, модифицирует и гликопротеин ZP-2, что и приводит к затвердеванию блестящей оболочки (Bleil et al., 1981). Оплодотворение в присутствии цитохалазина В не изменяет растворимость блестящей оболочки проназой (Niemerko, 1985), что, по-видимому, обусловлено угнетающим действием цитохалазина на экзоцитоз, т. е. выделение кортикальных гранул. При искусственной активации растворимость блестящей оболочки трипсином или проназой ухудшается, но в меньшей степени, чем после оплодотворения яйцеклеток мышей (Mintz, Gearhart, 1973). Эти наблюдения были недавно подтверждены при активации яйцеклеток мыши тепловым шоком (Komar, Kujawa, 1985). Однако после активации этиловым спиртом кортикальная реакция осуществляется в яйцеклетках мыши более полноценно и устойчивость блестящей оболочки к действию а-химотрипсина резко возрастает и измеряется примерно такими же величинами, как после оплодотворения. Так, у неактиви- роваиных яйцеклеток блестящая оболочка растворялась химотрипсином за 0.5—2.5 мин, у искусственно активированных спиртом яйцеклеток — за 4 ч, а у оплодотворенных яиц — за 4.5 ч (Gulyas, Yuan, 1985). Основное значение блестящей оболочки сводится к участию в оплодотворении. Так как при помощи гликопротеина ZP3 спермии связываются с блестящей оболочкой, а после проникновения одного спермия в яйцеклетку блестящая оболочка теряет этот гликопротеин, она становится недоступной для других спермиев. Благодаря наличию видоспецифических рецепторов блестящая оболочка препятствует связыванию с нею чужеродных спермиев. У яйцеклеток с интактной блестящей оболочкой блокада полиспермии развивается через одну минуту после оплодотворения. После активации тепловым шоком спермии продолжают связываться с блестящей оболочкой и через 3 ч, хотя через 1.5 ч яйцеклетки теряют способность оплодотворяться. Таким образом, искусственная активация тепловым шоком не индуцирует эффективных изменений ZP3, а также не вызывает блокады полиспермии и на уровне оолеммы (Komar, Kujawa, 1985). Блестящая оболочка не исчезает после оплодотворения и сохраняется вокруг зародыша на протяжении всего доимплантационного периода (зародыши мышей, крыс, хомячков) .или в течение значительной части этого периода (зародыши кроликов, овец, свиней и др.). Благодаря блестящей оболочки бластомеры дробящегося зародыша располагаются компактно и упорядоченно, ориентируясь в ограниченном трехмерном пространстве, существующем внутри блестящей оболочки. Это имеет немаловажное значение для взаимодействий бластомеров и образования между ними максимального количества контактов, что способствует нормальной компактизации и поляризации бластомеров (см. раздел 5, гл. VIII). Если удалить блестящую оболочку, то дробление бластомеров будет продолжаться, однако во многих случаях они располагаются в виде цепочки и компактизация полностью нарушается либо резко запаздывает (Gulyas et al., 1984). Кроме того, блестящая оболочка мешает случайному слипанию соседних зародышей, т. е. предотвращает образование спонтанных агрегационных химер, а также прилипанию зародышей к клетках яйцевода или матки. Необходимо иметь в виду, что на начальных стадиях дробления, вплоть до стадии бласто-
по Часть вторая. Ранний эмбриогенез млекопитающих цисты (наружный слой которой представлен трофэктодермой), бластомеры обладают высокой адгезивностью. Если трансплантировать зародыш, лишенный блестящей оболочки, в яйцевод, то при этом неминуемо происходит адгезия бластомеров с эпителиальными клетками стенки яйцевода и зародыш гибнет (Modlinski, 1970). Поэтому при работе с ранними зародышами, у которых удалили блестящую оболочку, необходимо после микроманипуляции либо поместить их вновь в другую блестящую оболочку, либо культивировать до бластоцисты и лишь затем трансплантировать. Процедура переноса зародышей в пустые блестящие оболочки (от зародышей того же или иного вида животных) трудоемка и требует хорошего владения техникой микроманипуляции (Tarkowski, Rossant, 1976). Культивирование in vitro зародышей без блестящей оболочки удается не во всех случаях (например, при работе с зародышами кроликов или хомячков). Поэтому одной из актуальных задач, решение которой было бы весьма полезным для успешного развития работ по клеточной инженерии зародышей млекопитающих, является создание искусственной оболочки, которая обладала бы свойствами, сходными с блестящей оболочкой. Это остается целью будущих исследований. Лучистый венец и яйценосный бугорок (кумулюс). Снаружи от прозрачной оболочки яйцеклетки окружаются лучистым венцом, переходящим без резкой границы в яйценосный бугорок, состоящий из фолликулярных клеток и жела- тинообразной массы. Основное вещество кумулюса представлено гиалуроновой кислотой и некоторыми другими гликопротеинами, чувствительными к гиалуро- нидазе и протеазам (например,к проназе). Благодаря наличию кумулюса возрастает общая масса клеток и это, а также физические свойства гликопротеинового матрикса способствует захвату овули- ровавших яйцеклеток фимбриями фаллопиевой трубы, т. е. их поступлению в воронку яйцевода. Кроме того, кумулюс играет существенную роль в транспорте яйцеклеток по ампулярной части яйцевода и нужен для того, чтобы реснички эпителиальных клеток фаллопиевой трубы могли участвовать в перемещении яйцеклеток. Когда яйцеклетки достигают места оплодотворения, они обычно теряют значительную часть клеток кумулюса, причем это происходит под влиянием гиалуро- нидазы спермиев или в результате механического действия ресничек эпителия фаллопиевой трубы. Процесс утраты яйцеклетками кумулюса называется денудацией (от англ. denudation — обнажение). Денудация видоспецифична, т. е. у одних видов млекопитающих происходит раньше, чем у других, и это не коррелирует с тем временем, когда зародыши попадаюд- в матку (табл. 10). Кумулюс может сохраняться 10—16 ч и растворяется только после оплодотворения, а у яйцеклеток крыс и кроликов исчезает через 4—6 ч после овуляции, причем вне зависимости от оплодотворения. У яйцеклеток собак и котов кумулюс частично дезинтегрируется после пенетрации спермиями, но 1—2 слоя фолликулярных клеток остаются связанными с блестящей оболочкой на протяжении первых делений дробления. Биологический смысл этих различий требует выяснения. Полагают, что растворение кумулюса происходит под влиянием протеаз, содержащихся в самих фолликулярных клетках, а при оплодотворении этот процесс обусловливается действием гиалуронидазы и акрозина спермиев. Перивителлиновое пространство. В незрелых ооцитах млекопитающих оолемма прилегает к блестящей оболочке, т. е. перивителлиновое пространство не заметно. У овулировавших яйцеклеток его объем может быть незначительным. После оплодотворения это пространство существенно увеличивается. По-видимому, в него попадает не только содержимое кортикальных гранул,
VI. Оплодотворение и искусственная активация яйцеклеток 111 но и другие вещества, выделяемые яйцеклеткой. У зародышей хомячков в ходе дробления, особенно после 8-клеточной стадии, перивителлиновое пространство достигает максимума, т. е. зародыш окружается широкой зоной, заполненной жидкостью. У других млекопитающих такого явления не наблюдается (Дыбан и др., 1975). Организация яйцеклетки. В овулировавших яйцеклетках млекопитающих принято различать цитоплазму с ее наружным уплотненным слоем, носящим название оолеммы (плазматической мембраны), и ядерный аппарат. В цитоплазме яйцеклеток хорошо выражен эндоплазматический ретикулум, тельца Гольджи, есть много митохондрий, для которых свойственно упрощенное строение, и ряд включений (желточных, жировых, пигментных и др.). Количество этих включений является видоспецифическим признаком. Так, их много в яйцеклетках хищников, коров, свиней и относительно мало в яйцеклетках мышей и почти нет в яйцеклетках крыс. У разных линий мышей отмечаются колебания в количестве этих включений, и, например, их нет в яйцеклетках мышей линии JCR и очень много в яйцеклетках мышей линии C57BL или СВА. Эти обстоятельства приходится учитывать при микроинъекции клонированных фрагментов ДНК, так как если в яйцеклетках много желточных, жировых и пигментных включений, то эти включения полностью маскируют пронуклеусы, существенно затрудняя работу. Для цитоплазмы овулировавших яйцеклеток млекопитающих типично наличие большого количества кортикальных гранул, морфология которых хорошо изучена, однако их химический состав выяснен не полностью. Считается, что в кортикальных гранулах содержатся различные ферменты, в том числе и овопе- роксидаза, действие которой на блестящую оболочку резко изменяет свойства этой оболочки после оплодотворения. Для овулировавших яйцеклеток млекопитающих характерна своеобразная организация цитоскелета, что в свою очередь приводит к мозаичной организации плазматической мембраны (оолеммы), являющейся весьма динамичной структурой, в которой могут появляться и исчезать микроворсинки и меняться локализация рецепторов к ряду лигандов, в том числе к конковалину А (см. раздел 2 и 3 этой же гл.). Таблица 10 Потеря кумулюса (денудация) у овулировавших яйцеклеток и сроки, когда зародыши поступают из яйцевода в матку (по: Austin, 1982) Яйцеклетки млекопитающих Крыса Мышь Морская свинка Кролик Собака Хорек Кошка Лошадь Свинья Корова Коза Овца Обезьяна макака-резус павиан Человек Денудация яйцеклеток после овуляции (ч) 4—6 12 24 6—8—10 48 и дольше 20—40 48 и дольше 24 24 9—14 30 0—5 24 48 24? Поступление зародышей в матку сроки после овуляции (ч) 95—100 72 80—85 60 168—192 88—108 121 — 161 98 24—48 72 85—98 85—98 72 72 80 стадия развития 8—16 бластомеров 16—32 бластомера 8 бластомеров Морула 16—32 бластомера 16—32 » » Поздняя морула 16 бластомеров 4 бластомера 8—16 бластомеров 12 бластомеров 12 бластомеров 16 бластомеров ? Ранняя морула
112 Часть вторая. Ранний эмбриогенез млекопитающих У неактивированных яйцеклеток микротрубочки выявляются только в составе мейотического веретена. Хотя многочисленные организующие центры микротрубочек (МТОС) разбросаны по цитоплазме яйцеклетки, они не поли- меризуют тубулин, который остается в цитоплазме в форме свободных молекул (Маго et al., 1985). Микрофиламенты f-актина располагаются в субкортикальном слое неоднородно, так как область субкортикального слоя цитоплазмы, прилегающая к мейотическому веретену, значительно обогащена микрофила- ментами f-актина, образующими здесь густое скопление. Субкортикальный слой остальных районов яйцеклетки, соответствующий тем участкам, в которых плазматическая мембрана образует микроворсинки, обеднен микрофиламен- тами f-актина. В этих участках небольшое количество микрофиламентов входит в состав самих микроворсинок (Маго et al., 1984). Плазматическая мембрана этих районов имеет много рецепторов к конковалину А. Органоиды располагаются преимущественно в этих областях цитоплазмы. Описана мозаичная организация поверхности плазматической мембраны в неоплодотворенных яйцеклетках мышей (Johnson et al., 1975). Примерно от одной десятой до одной пятой общей поверхности яйцеклетки мыши представлено «лысым» районом, в котором нет микроворсинок. Плазматическая мембрана в данном районе лишена рецепторов к конковалину А. В субкортикальном районе данной области яйцеклетки располагается густая сеть микрофиламентов, а глубже находится мейотическое веретено метафазы II (Маго et al., 1984). У хомячков плазматическая мембрана, лишенная микроворсинок, составляет значительно меньший район, но также соответствует той области, где в цитоплазме располагается мейотическое веретено (Yanagimachi, 1978). Хромосомный аппарат. Лишь у немногих видов (собаки, лисицы) овулируют незрелые яйцеклетки во время поздней профазы первого мейотического деления, и в таких яйцеклетках хорошо заметно ядро (зародышевый пузырек). Эти яйцеклетки созревают после овуляции, т. е. уже после пенетрации яйцеклеток спермиями, однако деконденсация головки спермия осуществляется лишь после завершения первого мейотического деления (Yanagimachi, 1978, 1981). У преобладающего большинства видов млекопитающих овулируют яйцеклетки, заблокированные на метафазе второго мейотического деления. Хромосомный аппарат этих яйцеклеток представлен конденсированными мейотическими хромосомами, составляющими метафазную пластинку, расположенную в центре веретена. Мейотическое веретено метафазы II мейоза четко визуализируется в овулиро- вавших яйцеклетках мышей, крыс, хомячков при фазовоконтрастной микроскопии тотальных препаратов, окрашенных лакмоидом (рис. 6). У других животных (коровы, овцы, свиньи) выявить мейотическое веретено метафазы II и получить хорошие суховоздушные препараты метафазных хромосом значительно труднее, хотя организация хромосомного аппарата остается такой же, как в тех яйцеклетках, где эти структуры легко визуализируются. Мейотическое веретено метафазы II имеет такое же строение, как и в метафазе I мейоза (бочкообразную форму, отсутствие центриоль и прикрепление микротрубочек к скоплениям перицентриолярного.материала) (см. раздел 3.1, гл. V). Поэтому при старении яйцеклеток или под влиянием внешних агентов может нарушаться сегрегация хромосом из метафазы II, что приведет к анэуплоидии у зародышей. Необходимо иметь в виду, что хромосомный аппарат овулировавших яйцеклеток находится в относительно стабильном состоянии, т. е. может длительно сохраняться на метафазе II мейоза. Если незрелые яйцеклетки автоматически возобновляют мейоз (после их изоляции из фолликулов и перенесения в культу- ральную среду), то у овулировавших яйцеклеток блокада мейоза снимается лишь при оплодотворении либо после активирующего действия внешних аген-
VI. Оплодотворение и искусственная активация яйцеклеток 113 тов. Таким образом, блокада мейоза на метафазе II более устойчива, чем блокада на стадии зародышевого пузырька (профазы первого деления созревания). Причины этого явления рассматриваются в разделе, посвященном молекулярным механизмам активации яйцеклеток (см. раздел 3 этой же гл.). VI.2. ОСОБЕННОСТИ ОПЛОДОТВОРЕНИЯ У МЛЕКОПИТАЮЩИХ Оплодотворение млекопитающих интенсивно исследуется разными методами, на различных объектах и под разным углом зрения. Этой тематике посвящена огромная литература, в том числе ряд книг и обстоятельных обзоров, и объем информации по этим проблемам стремительно увеличивается. Так, в одном из обзоров (Yanagimachi, 1981) приведено 615 литературных источников, а в следующей работе этого же автора, опубликованной через 3 года (Yanagimachi, 1984), добавлено еще 227 источников, хотя оба эти обзора посвящены только цитологическим аспектам оплодотворения. Если же учитывать другие аспекты этой проблемы, то количество работ, опубликованных за последнее десятилетие, исчисляется несколькими тысячами. Повышенный интерес к данным проблемам не удивителен, так как познание механизмов оплодотворения и разработка эффективных методов управления этим процессом крайне важны для регуляции размножения млекопитающих, т. е. для практики животноводства, а также для преодоления бесплодия и планирования рождаемости у человека, т. е. для клинической медицины. Естественно, что в нашу задачу не может входить разбор этой литературы и в данном разделе приводятся лишь основные особенности, характерные для процесса оплодотворения у млекопитающих. Хотя в этом разделе главное внимание обращено на цитологические аспекты оплодотворения, однако целесообразно начать с краткого напоминания о некоторых важных физиологических особенностях оплодотворения млекопитающих. Количество спермиев в месте оплодотворения. Яйцеклетки млекопитающих оплодотворяются в ампулярной части фаллопиевой трубы, куда доходит небольшое количество спермиев, хотя при эякуляции в женский половой тракт попадает очень много спермиев (табл. 11). Предполагается, что при транспорте спермиев по женскому половому тракту происходит селекция, т. е. лишь наиболее жизнеспособные спермин достигают места оплодотворения. Однако селекция не касается генотипа и хромосомного набора спермиев, так как спермин, несущие мутантные гены или хромосомные аберрации, в том числе с нехваткой или избытком хромосом, имеют такую же, как правило, вероятность Таблица 11 Количество спермиев в эякуляте и в месте оплодотворения у разных видов млекопитающих (по: Baker, 1982) Вид Мышь Крыса Кролик Хорек Морская свинка Бык Баран Свинья Человек Количество спермиев в эякуляте (млн) 50 58 280 5 80 300 1000 8000 200 Место эякуляции Матка » Влагалище Матка Влагалище и матка Влагалище » Матка Влагалище Количество спермиев в ампуле фаллопиевой трубы Меньше 100 500 250—500 18—1600 25—50 Немного (?) 600—700 1000 200 8 А. П. Дыбан
114 Часть вторая. Ранний эмбриогенез млекопитающих принять участие в оплодотворении, как и спермин с нормальным кариотипом (Дыбан, Баранов, 1978, 1987). Продолжительность времени, в течение которого овулировавшие яйцеклетки способны оплодотворяться, различна у разных видов млекопитающих, однако обычно не превышает 24 ч (табл. 12). Если учесть, что и спермии, как правило, утрачивают оплодотворяющую способность, находясь в половом тракте самки примерно такое же время, это означает, что для оплодотворения необходима встреча гамет в определенный и непродолжительный период времени. Именно поэтому у большинства млекопитающих спаривание приурочено к той фазе эстрального цикла, которая непосредственно предшествует овуляции, причем спермий вступает в контакт с яйцеклеткой уже после того, как он подвергся изменениям, при которых приобретает оплодотворяющую способность. Последовательность изменений спермиев до и во время оплодотворения и индуцируемые изменения в активированной яйцеклетке представлены на схеме (рис. 8). Остановимся вкратце на этих процессах. 1. Созревание спермиев в придатке семенника. Если выделить спермии из семенных канальцев тестикула, то эти спермии неподвижны и плохо плавают. Оплодотворяющую способность спермии млекопитающих приобретают находясь в течение нескольких дней в канальцах придатка (эпидидимиса), перемещаясь пассивно от его краниальной к каудальной части. В это время спермии «дозревают» и приобретают способность к активным движениям, что, возможно, связано с накоплением циклической АМФ и изменениями молекулярной организации мембран. Предполагают, что во время дозревания спермии адсорбируют на своей поверхности гликопротеины, сецернируемые эпителиальными клетками канальцев придатка, что способствует связыванию спермиев с блестящей оболочкой яйцеклетки. Кроме того, во время дозревания возрастает стабилизация хроматина в головках спермиев из-за образования сильных дисульфидных связей между богатыми цистином протаминами, а также сульфгидрильных связей в метахондриальных мембранах и плазматических мембранах хвостовой части спермиев. Стабилизация головки и хвоста спермиев благоприятствует их активным движениям. 2. Капацитация спермиев. Для того чтобы спермии могли оплодотворить яйцеклетки, они должны подвергнуться процессу, который называется капаци- тацией, этот процесс присущ только млекопитающим. Капацитация может Таблица 12 Продолжительность сохранения способности к оплодотворению у овулировавших яйцеклеток млекопитающих (по: Austin, 1982) Кролик Морская Крыса Мышь Хом ячок Хорек Свинья Овца Корова Лошадь Обезьяна Человек Вид свинка (макака резус) Продолжительность (ч) 6—8 Не более 20 12—14 8—12 5 или 12 До 36 Свыше 20 15—24 22—24 Свыше 24 Вероятно, меньше 24 Не свыше 24
VI. Оплодотворение и искусственная активация яйцеклеток ] 15 1. Капитация 4. Гиперактивация 2. Акросомная реакция X Пентерация блестящей оболочки Слияние спермия и яйцеклетки Изменения плазматической мембраны головки спермия, помимо акросомной реакции 7. Инкорпорация головки спермия 10. Изменения свойств плазматической мемб- раны яйца 11. Блокада полиспермии на уровне плазматической мембраны 8. Разрушение оболочки ядра спермия 1 12. Активация цитоплазмы яйцеклетки 13, Экзоцитоз кортикальных гранул 14. Реакция блестящей оболочки 9. Деконденсация ядра спермия 16. Завершение мейоти- ческого деления 15. Образование отцовского пронуклеуса 17. Образование материнского пронуклеуса 18. Перестройка и активация системы цитоскелета 19. Объединение геномов 20. Первое деление дробления Рис. 8. Схема основных событий до и во время оплодотворения яйцеклеток млекопитающих (по: Yanagimachi, 1981, 1984). Последовательность событий обозначена цифрами, их взаимосвязь указана стрелками. Объяснения в тексте. происходить in vitro, если спермин будут находиться в подходящей культураль- ной среде при +37 °С несколько часов. В организме самки капацитация спермиев также занимает несколько часов и осуществляется при контакте спермиев с клетками фаллопиевой трубы, матки или с другими тканями и биологическими жидкостями. Во время капацитации происходят существенные изменения белковых компонентов клеточных поверхностей спермиев. Некоторые вещества, адсорбировавшиеся на плазматической мембране спермиев во время предшествующих стадий спермиогенеза, удаляются, а другие белки существенно модифицируются. Эти изменения клеточной поверхности головки спермия являются существенной предпосылкой для акросомной реакции. Кроме того, в результате капацитации возрастает двигательная активность, т. е. спермин «гиперактивируются», приобретая способность к максимально быстрому движению, что способствует их проникновению через кумулюс и блестящую оболочку. 3. Акросомная реакция. Когда полностью капацитированные гиперактивные спермин попадают в то место женского полового тракта, где происходит оплодотворение, и вступают в контакт с клетками кумулюса, в спермиях инициируется акросомная реакция. Некоторые вещества, находящиеся в составе кумулюса, могут индуцировать акросомную реакцию in vivo. Однако
116 Часть вторая. Ранний эмбриогенез млекопитающих акросомная реакция может осуществляться в условиях эксперимента без какого-либо участия кумулюса или факторов, содержащихся в нем. Полагают, что у капацитированных спермиев плазматические мембраны акросомы подвергаются нестабильным перестройкам и находятся в состоянии своеобразного «возбуждения» и поэтому разнообразные воздействия на мембраны могут запускать акросомную реакцию. Существенное значение в акросом- ной реакции играет Са+2-ионы в среде, а также другие внешние условия. Акросомная реакция в норме начинается, когда спермин вступают в контакт с кумулюсом, а при оплодотворении денудированной яйцеклетки, когда спермин связываются с поверхностью блестящей оболочки. Если акросомная реакция инициируется преждевременно, т. е. задолго до того, как спермий войдет в контакт с яйцеклеткой, то он теряет способность проникать через блестящую оболочку и прекращает двигаться. Морфологическим выражением акросомной реакции является слияние наружной акросомной мембраны и плазматической мембраны спермия в фронтальной половине головки спермия. Образующееся при этом пространство дает возможность освободиться растворимому содержимому акросомы, в состав которого входит по крайней мере 10—12 различных ферментов. Среди этих ферментов наиболее важное значение в оплодотворении играет гиалуронидаза и трипсиноподобный фермент, который называют акрозином. Полагают, что в спермиях находится про-акрозин, который активируется при акросомной реакции. Ферменты, благодаря которым спермин млекопитающих проходят через оболочки, окружающие яйцеклетку, суммарно называют лизинами (Д, Е), и наиболее вероятно, что главными их представителями служат гиалуронидаза и акрозин. Однако не исключено, что другие ферменты, а также вещества, лишенные ферментативной активности, могут являться лизинами, функционирующими независимо или синергически с гиалуронидазой и акрозином. Во время акросомной реакции плазматическая мембрана, покрывающая экваториальный сегмент или постакросомальную область головки, приобретает свойства, делающие возможным слияние этой части плазматической мембраны спермия с плазматической мембраной яйцеклетки. Возможно, что эти изменения мембран обусловливаются действием лизинов на экваториальной сегмент головки спермия. 4. Связывание спермиев с блестящей оболочкой яйцеклетки. Этот процесс является специфическим и важным компонентом оплодотворения и должен предшествовать пенетрации блестящей оболочки спермием. Полагают, что на мембране спермия есть рецепторы, благодаря которым спермий распознает специфический рецепторный белок блестящей оболочки яйцеклетки (гликопро- теид ZP3) и связывается с нею. Прикрепление спермиев к блестящей оболочке видеоспецифично, т. е. рецепторы спермиев распознают рецепторные белки блестящей оболочки яйцеклеток того вида, к которому они принадлежат. 5. Пенетрация спермиями блестящей оболочки. Спермий, прикрепившийся к блестящей оболочке, начинает проникать через нее. Обычно спермий проходит через эту оболочку под углом 45 °, причем путь движения может быть не прямым, а изогнутым. Спермий быстро проходят через блестящую оболочку, и, например, у хомячков это занимает лишь 5—10 мин. Проникновение спермиями через блестящую оболочку осуществляется благодаря совместному механическому действию спермия и переваривающему действию ферментов (вероятно, акрозина), связанных со внутренней акросомной мембраной. Эти ферменты локально растворяют тот небольшой участок оболочки, к которой прикрепился спермий, а активные движения хвоста спермия создают механические усилия и продвигают его через блестящую оболочку. Пройдя через блестящую оболочку, спермий попадает в перивителлиновое
VI. Оплодотворение и искусственная активация яйцеклеток 117 пространство. Если на уровне блестящей оболочки эффективно функционирует блок полиспермии, то в перивителлиновое пространство попадает 1 спер- мий; если блок полиспермии функционирует на уровне плазматической мембраны яйцеклетки, то в перивителлиновом пространстве можно найти много спермиев (например, при оплодотворении яйцеклеток кролика), хотя только один из них будет сливаться с яйцеклеткой. Если удалить блестящую оболочку, то при этом яйцеклетка сохраняет способность к оплодотворению, т. е. межвидовые барьеры исчезают и становится возможным гетерологическое оплодотворение. 6. Слияние спермия и яйцеклетки. У млекопитающих в отличие от других животных спермий сливается с плазматической мембраной яйцеклетки экваториальным постакросомальным районом головки. Плазматическая мембрана экваториального сегмента должна сохраниться интактной для того, чтобы спермий мог инкорпорироваться в яйцеклетку. Процесс слияния осуществляется при взаимодействии данного специализированного района мембраны спермия, покрывающего экваториальный сегмент головки, и микроворсинок плазматической мембраны яйцеклетки. Считают, что оолемма содержит систему рецепторов, взаимодействие которых с рецеп- торными молекулами мембраны экваториального сегмента головки спермия необходимо для слияния гамет. Существенное значение при этом играет молекулярная упорядоченность оолеммы и состояния ее липидных компонентов. Слияние спермия и яйцеклетки занимает несколько минут, а затем происходит инкорпорация в яйцеклетку постъядерных районов спермия. Мембраны спермия включаются в состав ооплазматической мембраны, и эти районы выявляются не только в плазматической мембране одноклеточного зародыша, но и в плазматических мембранах бластомеров вплоть до 8-клеточной стадии (Gabel et al., 1979; Grundersen, Shapiro, 1984). У млекопитающих внутренняя акросомная мембрана, покрывающая переднюю часть головки спермия, не сливается с оолеммой и инкорпорируется в яйцеклетку посредством процесса, напоминающего фагоцитоз. Возможно, что степень «текучести» внутренней акросомной мембраны этого района спермиев недостаточна для того, чтобы слиться с ооплазмой. У некоторых млекопитающих (например, китайских хомячков) хвост сперматозоида отделяется от головки и не попадает в цитоплазму яйцеклетки. У большинства млекопитающих хвост спермия инкорпорируется в яйцеклетку из-за слияния оолеммы и плазматической мембраны хвостовой части спермия. После инкорпорации в цитоплазму яйцеклетки аксиальные филаменты хвоста спермия дезинтегрируются, это происходит и с митохондриями спермия. Хотя спермий вносит в яйцеклетку одну центриоль, однако и эта структура разрушается и не принимает никакого участия в формировании митотического веретена. Вместе с тем показано, что наличие хвоста спермия в цитоплазме яйцеклетки влияет на дальнейшую судьбу этого района; полагают, что тот бластомер, который получает данный участок цитоплазмы яйца, быстрее вступает во второе деление дробления, чем сестринский бластомер (см. раздел 1, гл. VIII). 7. Изменение яйцеклетки в том районе, в который проник спермий. После слияния спермия с яйцеклеткой головка спермия быстро теряет оболочки и хроматин начинает деконденсироваться. В это время в данном участке яйцеклетки происходят изменения организации субкортикального слоя, захватывающие цитоскелет и приводящие к появлению так называемого бугорка (конуса) оплодотворения. Это обусловлено действием хроматина спермия, лишенного ядерной оболочки, на молекулы актина, которые переходят из
j I g Часть вторая. Ранний эмбриогенез млекопитающих растворимой формы (g-актин) в полимеризированную форму (f-актин), образуя скопление микрофилламентов в субкортикальном районе, граничащем с декон- десирующейся головкой спермия. Плазматическая мембрана яйцеклетки при этом выпячивается, образуя бугорок и теряя систему микроворсинок, напоминает тот «лысый» участок плазматической мембраны, который покрывает субкортикальный слой яйца, где располакается мейотическое веретено мета- фазы II (Maro et el., 1984, 1985, 1986). 8. Блокада полиспермного оплодотворения. В норме только один сперматозоид сливается с яйцеклеткой и участвует в развитии. При полиспермном оплодотворении возникают нарушения эмбриогенеза, причем гетероплоидные зародыши млекопитающих неминуемо погибают (Дыбан, Баранов, 1978, 1987). У млекопитающих вероятность полиспермного оплодотворения существенно снижается из-за того, что в то место фаллопиевой трубы, где происходит оплодотворение, попадает очень небольшое количество спермиев (табл. 11). При искусственном оплодотворении in vitro яйцеклетка окружается значительно большим количеством спермиев, и при этом частота полиспермного оплодотворения может возрастать. Однако основным механизмом, блокирующим полиспермию, являются либо изменения блестящей оболочки, либо изменения плазматической мембраны яйцеклетки или сочетанные изменения и блестящей оболочки и оолеммы. Оба эти процесса причинно связаны с кортикальной реакцией, т. е. с экзоцитозом содержимого кортикальных гранул в перивителлиновое пространство. Описаны существенные видовые особенности блокады полиспермии. Так, у яйцеклеток хомячков сразу же после пенетрации изменяется блестящая оболочка, которая становится непроницаемой для других спермиев, а плазматическая мембрана ооцита сохраняет способность сливаться с дополнительными спермиями, если они попадут в перивителлиновое пространство. Способность сливаться со спермиями сохраняется не только у одноклеточного зародыша, но и на протяжении первых делений дробления зародышей хомячков, вплоть до 4-клеточной стадии (Yanagimachi, 1984). Таким образом, у хомячков блокада полиспермии осуществляется на уровне блестящей оболочки, а не на уровне плазматической мембраны яйцеклетки. Иная картина отмечается в яйцеклетках кроликов, у которых блокада полиспермии на уровне блестящей оболочки практически отсутствует, но зато сразу же после пенетрации резко изменяются свойства плазматической мембраны яйцеклетки, которая становится эффективным барьером для других спермиев. Полагают, что это обусловлено изменениями молекулярной организации плазматической мембраны и потерей ею рецепторов для спермиев (Yanagimachi, 1981, 1984). Постулируется, что протеазы, высвобождающиеся при кортикальной реакции, действуют на гликопротеины плазматической мембраны таким образом, что она утрачивает сайты, связывающие спермин. Не исключено, что кортикальные гранулы маскируют поверхность оолеммы либо взаимодействуют с нею и образуют новую мембрану, обладающую мозаичностью и отличающуюся от мембраны неоплодотворенной яцеклетки. Несомненно, что после активации яйцеклетки перестраивается молекулярная организация плазматической мембраны яйцеклетки,и она приобретает свойства, в том числе отрицательные заряды на своей поверхности, которые препятствуют близкому контакту спермия с оолеммой, т. е. плазматическая мембрана яйцеклетки как бы «отталкивает» от себя спермин. Если при этом между спермиями и плазматической мембраной сохраняется расстояние больше чем 15 ангстрем, то этого вполне достаточно для предотвращения слияния дополнительных спермиев с плазматической мембраной яйцеклетки (Yanagimachi, 1978, 1981, 1984).
VI. Оплодотворение и искусственная активация яйцеклеток 119 Блок полиспермии на уровне блестящей оболочки осуществляется медленно, а блок на уровне плазматической мембраны значительно быстрее и эффективнее. Вероятно, в норме имеют место оба процесса, хотя если блокада на уровне блестящей оболочки эффективна, то блокада на уровне оолеммы может быть выражена слабо. Схематически эти этапы оплодотворения млекопитающих представлены на рис. 8. VI.3. АКТИВАЦИЯ ЯЙЦЕКЛЕТОК Овулировавшие яйцеклетки большинства видов млекопитающих заблокированы на метафазе II мейоза, и для того, чтобы мейоз завершился, необходима активация яйцеклеток, что происходит не только при оплодотворении, но и под влиянием действия различных внешних агентов. В этих случаях искусственно активированные яйцеклетки вступают в партеногенетическое развитие. Способность к активации яйцеклетки млекопитающих приобретают после завершения созревания. Хотя в экспериментальных условиях можно добиться того, что спермии проникнут в незрелую яйцеклетку (если лишить ее зоны пеллюцида либо если инъецировать спермии в цитоплазму), однако это не приведет к активации яйцеклеток. Остается неизученным, способны ли искусственно активироваться внешними агентами незрелые яйцеклетки млекопитающих либо яйцеклетки, находящиеся на более ранних стадиях (например, метафазе I), чем метафаза II. Этот вопрос настоятельно нуждается в изучении, так как это может способствовать получению новых разновидностей диплоидного мейотического партеногенеза и приблизить решение вопроса об амейотическом партеногенезе млекопитающих (см.: Дыбан, Нониашвили, 1986а, 19866). VI.3.1. СУБМИКРОСКОПИЧЕСКИЕ И МОЛЕКУЛЯРНЫЕ ИЗМЕНЕНИЯ ЯЙЦЕКЛЕТОК Последовательная цепь событий, регистрируемых на микроскопическом, субмикроскопическом и молекулярном уровне, одинакова при естественной и искусственной активации яйцеклеток млекопитающих (Graham, 1974; Kaufman, 1983а). Все изменения, возникающие после активации яйцеклеток, предложено разделить на первичные, вторичные и третичные (Whittingham, 1980). Первичный эффект активирующего стимула вне зависимости от того, возникает ли этот стимул под влиянием спермия или действия различных внешних агентов, реализуется на уровне плазматической мембраны яйцеклетки. Считают, что эти локальные изменения плазматической мембраны яйцеклетки сводятся к деполяризации, сдвигам в мембранных потенциалах и увеличению «текучести» мембраны. Установлено, что после активации происходит вытеснение ионов кальция из плазматической мембраны ооцита. Кальций является важным компонентом клеточной мембраны, и его вытеснение из мембраны существенно изменяет состояние оолеммы и, по-видимому, является пусковым моментом, т. е. триггером активации яйцеклетки. Показано, что инкубация в среде, лишенной Са2+ ионов, приводит к активации яйцеклеток мышей (Whittingham, Siracusa, 1978; Kaufman, 1983a, b), хомячков (Whittingham, Siracusa, 1978). Небольшое количество кальция @.1 моль/л) предотвращает активацию, а если ооциты мыши вначале находились в среде, содержащей большое количество кальция A.71 моль/л), то перенос их в среду без кальция не приводит к активации (Whittingham, Siracusa, 1978; Whit-
120 Часть вторая. Ранний эмбриогенез млекопитающих tingham et al., 1978). Это обусловлено стабилизацией плазматической мембраны средой, содержащей кальциевые ионы. По-видимому, многие, если не все, активирующие агенты, действуя на плазматическую мембрану, приводят к высвобождению кальциевых ионов из фосфолипидных комплексов оолеммы. Если стабилизировать мембрану (например, инкубировать ооциты в среде при температуре +17 °С или ниже), то даже такой сильный активирующий агент, как этиловый спирт, не активирует яйцеклетки мыши (Дыбан, Нониашвили, 1986а, 19866, 1986в; Нониашвили, Дыбан, 1985). Вне зависимости от того, каким является первичный активирующий стимул, действующий на плазматическую мембрану ооцита после локальных изменений оолеммы, резко возрастает содержание в цитоплазме яйцеклетки свободных Са2+ ионов. Это было показано в опытах на яйцеклетках мыши после оплодотворения или искусственной активации (Cuthbertson et al., 1981). В этих работах использовалась чувствительная методика регистрации содержания кальция в ооцитах, и выводы авторов не могут вызывать сомнение. С этими представлениями хорошо согласуются результаты инъекции кальция путем ионофореза (Fulton, Whittingham, 1978), показавшие, что эта процедура активирует ооциты мыши. Когда внутриклеточное содержание Са2+ ионов в цитоплазме ооцита, возрастает, то это является вторичным активирующим стимулом, который приводит к экзоцитозу кортикальных гранул. Остается невыясненным, каким образом ионы кальция индуцируют выделение кортикальных гранул, хотя причинная связь двух явлений не вызывает сомнения (Whittingham, 1980). Так как в это время в яйцеклетках изменяется рН, полагают, что это обусловлено не только повышением уровня свободных Са2+ ионов, но и что изменение натриевых и кальциевых ионных каналов плазматической мембраны играет существенную роль в событиях, совокупность которых относят ко вторичному активирующему стимулу. Если инкубировать ооциты мышей в среде с циклогексимидом или пуро- мицином, то при этом подавляется синтез белков и ооциты активируются. На основании этих опытов высказано предположение, что конечное звено активации сводится к угнетению синтеза белков, из-за чего из яйцеклетки исчезает так называемый цитостатический белок. Этот процесс предложено назвать третичным активирующим стимулом, непосредственно снимающим блокаду мейоза на метафазе II (Whittingham, 1980). Таким образом, постулируются три этапа активации яйцеклетки: мембранные эффекты и вытеснение Са2+ ионов из плазматической мембраны; увеличение внутриклеточного содержания свободных ионов Са2+ и, наконец, экзоцитоз кортикальных гранул и исчезновение из цитоплазмы цитостатического белкового фактора. Спермий активирует яйцеклетку путем инициации мембранных эффектов, после которых разыгрываются все остальные события в яйцеклетке. Искусственные активирующие агенты могут действовать не только на уровне плазматической мембраны. Так, при введении в яйцеклетку ионов кальция включается второй уровень активации, а при действии ингибиторов белков — второй и третий уровни. VI.3.2. МОЛЕКУЛЯРНЫЕ МЕХАНИЗМЫ ПРЕКРАЩЕНИЯ БЛОКАДЫ МЕЙОЗА В предыдущем разделе рассмотрена последовательная цепь событий после активации, завершающаяся возобновлением мейоза. Таким образом, центральным вопросом этой проблемы являются механизмы прекращения блокады мейоза, делающие возможным начало эмбрионального развития.
VI. Оплодотворение и искусственная активация яйцеклеток 121 В последнее время в биологии развития млекопитающих стали популярными гипотезы, сформулированные первоначально для объяснения механизмов прекращения блокады мейоза в ооцитах амфибий. Теперь эти гипотезы переносятся на яйцеклетки млекопитающих, причем это делается по аналогии, несмотря на отсутствие фактов, полученных при изучении яйцеклеток млекопитающих. Напомним основные положения гипотезы О механизмах остановки мейоза в яйцеклетках амфибий. Согласно гипотезы Масуи и Маркета (Masui, Маг- kert, 1971), цитоплазма ооцитов амфибий после разрушения зародышевого пузырька приобретает цитостатический белок или фактор (так называемый CSF, от англ. слов, cytostatic factor), который вызывает остановку мейоза на метафазе и поддерживает такое состояние до оплодотворения или искусственной активации. После активации яйцеклетки CSF инактивируется и мейоз возобновляется. Используя экстракты цитоплазмы яйцеклеток, авторы провели опыты, которые, по их мнению, доказывают существование такого цитостатиче- ского белка. Этот вывод основывался на наблюдениях, согласно которым инъекция цитоплазмы зрелых неактивированных яиц останавливает (на метафазе) дробление того бластомера, в который инъецировали данный экстракт (Masui, Markert, 1971; Masui, Clarke, 1979; Masui et al., 1980). В последнее время сформулирована гипотеза, в которой важное место в блокаде мейоза на метафазе II приписывается взаимодействию между уровнем в цитоплазме фактора промоции мейоза (MPF) и цитостатического белка (CSF). Предполагается, что MPF не только инициирует разрушение зародышевого пузырька в ооцитах, но и вызывает конденсацию хромосом как в мейозе, так и в митозе. Если уровень MPF высок, то мейотические хромосомы сохраняются в конденсированном состоянии, характерном для метафазы II овулировавших ооцитов млекопитающих. Этот высокий уровень MPF создается в цитоплазме ооцита из-за стабилизации данного фактора благодаря действию на него CSF, активно вырабатывающегося в цитоплазме овулиро- вавшей яйцеклетки (Masui et al., 1980; Gerhart et al., 1984; Mar'o et al., 1986). Полагают, что сразу же после оплодотворения или искусственной активации цитоплазма яйцеклетки теряет способность разрушать оболочку ядра и конденсировать хромосомы, причем полная утрата этих свойств отмечается через 30—60 мин после активации (Czolowska et al., 1984; Maro et. al., 1986). Считают, что изменение этих свойств цитоплазмы, т. е. утрата способности конденсировать хромосомы, возникает из-за поступления в цитоплазму ионов Са2+, которые разрушают цитостатический белок цитоплазмы ооцита, а из-за этого дестабилизируется MPF и прекращается его действие (Newport, Kirschner, 1984). Хотя эта гипотеза звучит весьма привлекательно, основные ее положения носят чисто умозрительней характер, причем наиболее уязвимым является предположение о наличии в цитоплазме яйцеклеток цитостатического белка. В двух обзорах (Детлаф, 19776; Детлаф, 1987) исчерпывающе разобрана обширная и весьма противоречивая литература, касающаяся изменений свойств цитоплазмы при созревании ооцитов амфибий и рыб, и большое внимание уделено критическому анализу гипотезы о цитостатическом белковом факторе цитоплазмы ооцитов. В обзорах приведены веские данные, ставящие под сомнение реальное существование такого цитостатического фактора цитоплазмы как универсального ингибитора мейоза у разных видов амфибий и рыб. Так, например, воспроизвести опыты Масуи и Маркерта на других видах, т. е. на яйцах осетра и яйцах севрюги, не удалось, т. е. в этих яйцеклетках не обнаружен цитостатический белковый фактор (Детлаф, 19776). В отдельной серии опытов Фельгенгауэр и Чулицкая A977) инъецировали цитоплазму из созревающих и зрелых ооцитов лягушки (Rana temporaria) в один из двух
] 22 Часть вторая. Ранний эмбриогенез млекопитающих бластомеров зародышей этого же вида и не наблюдали цитостатического действия ни в одном из 536 случаев. Недавно Рябова (Ryabova, 1983) исследовала цитостатический эффект цитоплазмы зрелых неактивированных яйцеклеток и дробящихся зародышей хвостатых и бесхвостых амфибий и рыб (Rana temporaria, Henopus laevis и Acipenser stellatus). В этой работе были подтверждены данные Е. В. Чулицкой и П. Е. Фельгенгауэр и, кроме того, показано, что цитосатические свойства цитоплазма приобретает в результате действия EGTA (этилен гликоль тетрауксусной кислоты) — того реактива, которым обрабатывают цитоплазму, чтобы получить по методу Масуи и Маркерта цитостатический белок. В этой работе обнаружено, что цитоплазма, смешанная с EGTA, вызывает аномалии дробления, но отнюдь не остановку деления на метафазе. Следовательно, гипотеза о существовании цитостатического белка в цитоплазме ооцитов амфибий и рыб, заблокированных на метафазе II мейоза, не может считаться доказанной и нельзя безоговорочно переносить эти представления на оогенез млекопитающих. Между тем в гипотезе Витингема (Whittingham, 1980) считается само собой разумеющимся, что белок, обладающий цитостатический действием, вырабатывается в ооцитах мышей и при угнетении его синтеза ингибиторами белка или повышенным уровнем свободных ионов кальция происходит снятие блока мейоза. Подчеркнем, что никаких попыток выделить CSF из ооцитов млекопитающих не было, а попытки микроинъекции цитоплазмы от овулировавших яйцеклеток в бластомеры ранних зародышей мышей не привели к определенным результатам, хотя остановки дробления и не наблюдалось (Tarkowski, 1982 и личное сообщение). Не могут служить строгим доказательством существования CSF в яйцеклетках мышей и опыты с пуромицином и циклогексимидом. Хотя при инкубации яйцеклеток в среде с этими ингибиторами яйцеклетки активируются, однако и циклогексимид и пуромицин могут вызывать неспецифические эффекты, изменяя состояние плазматической мембраны ооцитов, как это делают другие активирующие агенты. Во-вторых, эти ингибиторы синтеза белка могут угнетать ряд процессов, осуществляющихся в цитоплазме яйцеклетки при участии' иных белковых молекул, а не CSF. Недавно получены факты, позволяющие допускать существование MPF, а возможно и активности цитостатического фактора в цитоплазме через 4—6 ч после оплодотворения яйцеклетки мыши (Maro et al., 1986). Остается, однако, неизвестным, обусловлено ли столь продолжительное сохранение обоих факторов тем, что в этих опытах использовался ингибитор, деполимеризирующий микротрубочки (нокодазол), либо с какими-нибудь другими обстоятельствами. Как правило, вскоре после активации яйцеклетки мышей теряют способность деконденсировать хроматин головки спермия (Witkowska, 1981), и если допустить, что данные свойства цитоплазмы также зависят от активности MPF, более логично думать, что данный фактор исчезает из цитоплазмы или переходит в цитоплазме яйцеклетки в неактивное состояние, а затем вновь активируется, проявляя свой эффект во время перехода профазы в метафазу первого деления дробления. Для того чтобы доказать реальное существование в цитоплазме овулировавших яйцеклеток млекопитающих белковых факторов, регулирующих мейоз, необходимо выделить эти вещества и изучить их действие на других системах. Эти опыты на яйцеклетках млекопитающих наталкиваются на серьезные технические трудности и не были приведены. Таким образом, еще невозможно ответить на вопрос, каковы конкретные молекулярные механизмы блокады мейоза на метафазе II в овулировавших яйцеклетках млекопитающих и каковы механизмы снятия этой блокады, хотя
VI. Оплодотворение и искусственная активация яйцеклеток 123 очевидно, что в этом процессе принимают участие белки цитоплазмы ооцита, свойства которых изменяются после активации, причем это, по-видимому, происходит из-за увеличения уровня ионов Са2+ в цитоплазме активированного ооцита. VI.4. ЗАВЕРШЕНИЕ ВТОРОГО МЕЙОТИЧЕСКОГО ДЕЛЕНИЯ Как после проникновения в яйцеклетку 'спермия, так и при искусственной активации яйцеклетки к партогенезу хромосомы яйцеклетки, находившиеся в составе метафазы II мейоза, расходятся на две группы, одна из которых должна перейти в состав полярного тельца, а вторая — остаться в яйце и образовать женский пронуклеус. Целесообразно раздельно рассмотреть процесс расхождения хромосом и особенности цитотомии, в результате которой выделяется второе полярное тельце. VI.4.1. РАСХОЖДЕНИЕ МЕЙОТИЧЕСКИХ ХРОМОСОМ (АНАФАЗА И ТЕЛОФАЗА ВТОРОГО ДЕЛЕНИЯ СОЗРЕВАНИЯ) Расхождение хромосом из второй метафазы является автоматическим процессом, запрограммированным на предшествующих стадиях оогенеза и осуществляющимся вне зависимости от отцовского хромосомного набора, который находится в это время в генетически инертном состоянии в головке спермия. Мейотические хромосомы ооцита осуществляют нормальное расхождение и после активации ооцита к партеногенетическому развитию, т. е. без какого- либо участия спермия. При партеногенетическом развитии можно исследовать состояние мейоти- ческого веретена и поведение хромосом через несколько минут после действия активирующего агента. Эта модель была использована в нашей лаборатории для детального изучения расхождения мейотических хромосом и их морфологии во время ранней и поздней анафазы, ранней и поздней телофазы второго деления созревания ооцитов мышей (Нониашвили, 1986). Последовательные изменения хромосомного аппарата яйцеклеток мыши после искусственной активации этиловым спиртом приведены в табл. 13. При составлении этой таблицы учитывались только случаи, когда после активации происходило выделение второго полярного тельца, т. е. образовывались однородные гаплоидные партеногенетические зародыши. Это было сделано потому, что процессы, осуществляющиеся при данном типе партеногенеза, полностью соответствуют преобразованиям хромосомного аппарата (материнского набора хромосом) яйцеклетки после ее оплодотворения. Напомним, что мейотическое веретено метафазы II имеет такое же строение, как и мейотическое веретено метафазы I (см. раздел 3, гл. V). Это веретено лишено центриоль, обладает бочкообразной формой и располагается в тангенциальном положении недалеко от краевой зоны яйцеклетки (рис. 6, фото 1, 2, 3). У мыши в метафазе II находятся 20 хромосом (диад), причем на хороших суховоздушных препаратах, окрашенных по Романовскому—Гимза, видно, что каждая из хромосом состоит из двух хроматид с четкими центромерными участками (рис. 9). Эти районы содержат у мышей блоки С-гетерохроматина. Через 15—20 мин после действия активирующего агента каждая хромосома разделяется на хроматиды, однако на этом сроке они еще располагаются рядом и пластинка состоит из 40 хроматид (рис. 9, фото 2). Эти преобразования относятся к самому началу анафазы, и на протяжении ближайших 10—15 мин, т. е. через 30 мин после действия активирующего агента, хроматиды расхо-
124 Часть вторая. Ранний эмбриогенез млекопитающих дятся на 2 группы. Расхождение хроматид происходит асинхронно, т. е. некоторые из диад могут сохраняться тогда, когда большинство уже разделились на две хроматиды, образовавшие две раздельные группы (рис. 9, фото 3). К 60-й мин после действия активирующего агента расхождение всех хроматид завершается, и в яйцеклетке видно две группы хроматид, одна из которых несколько плотнее упакована, чем другая (рис. 9, фото 4). Примечательно, что и на этой стадии хроматиды сохраняют такую же извилистую форму и толщину, как и в метафазе II. От 60 до 90 мин осуществляется телофаза. Во время телофазы хромосомы вначале деконденсируются, и в каждой хроматиде хорошо заметен центромер- ный район. На препаратах высокого качества нетрудно посчитать количество хроматид в ранней телофазе. Это особенно наглядно, когда обе группы телофазных хромосом попадают в общее поле зрения микроскопа и можно сравнить состояние хроматид в обеих группах (рис. 9, фото 5). Частичная Таблица 13 Последовательные стадии завершения второго мейотического деления после искусственной активации яйцеклеток мыши этиловым спиртом (по: Нониашвили, 1986) Стадия Метафаза II мейоза Анафаза II мейоза а) ранняя анафаза б) поздняя анафаза Телофаза II мейоза а) ранняя телофаза б) поздняя телофаза Начало от момента активации (мин) Неактивированная овули- ровавшая яйцеклетка 27—30 60 70—90 90—100 Характеристика Мейотическое веретено метафазы II располагается в тангенциальной плос- скости недалеко от краевой зоны цитоплазмы Начинается расхождение хроматид и их движение к полюсам. Хроматиды (полудиады) образуют одну общую группу, расположенную в средней части веретена Закончилось расхождение хроматид. Образовалось 2 группы хроматид, расположенных на существенном расстоянии друг от друга. Хроматиды тонкие, извилистые, со светлыми, центромер- ными участками Каждая из хромосомных групп достигла полюса веретена. Происходит деконденсация хроматид и визуализация светлых центромерных районов. Можно подсчитать количество хроматид (полудиад) в каждой группе. Происходит поворот мейотического веретена в радиальное положение и начинает образовываться контрактильное кольцо Происходит конденсация обоих групп хромосом и их преобразование в хро- матиновые массы. Осуществляется отделение второго направительного тельца
VI. Оплодотворение и искусственная активация яйцеклеток \ 25 деконденсация ранних телофазных хромосом, вероятно, обусловлена действием цитоплазматических факторов, принимающих участие в деконденсации головки спермия, так как оба события по времени полностью совпадают. По-видимому, краткосрочная реакция женского набора хромосом на данный фактор цитоплазмы связана с особенностью структуры хромосом на этой стадии развития активированной яйцеклетки. При внимательном изучении хромосомных наборов в ранней телофазе заметна ассоциация ряда негомологичных хроматид центромерными районами (показано стрелкой на рис. 9, фото 5). Возможно, что данное явление лежит в основе центромерной ассоциации негомологичных хромосом, наблюдаемой в метафазах ранних зародышей мышей (Дыбан, 1979). Через 90—100 мин после активации ранняя телофаза преобразуется в позднюю телофазу (рис. 9, фото 6), для которых характерна компактизация, т. е. конденсация хромосом и их преобразование в плотные хроматиновые массы. На этой стадии можно заметить аномалии расхождения, т. е. запаздывание перемещения некоторых хроматид, остающихся вне двух основных групп (показано стрелкой на рис. 9, фото 6). В результате нарушения сегрегации один из хромосомных наборов содержит меньше, чем в норме, хромосом, т. е. становится гипогаплоидным. Если этот набор останется в составе яйцеклетки, то при этом должна возникать моносомия, т. е. утрата у зародыша одной из материнских хромосом. Если аномальный набор хромосом перейдет в состав второго полярного тельца, то это не отразится на кариотипе зародыша (Kaufman, 1972, 1983b). VI.4.2. ФОРМИРОВАНИЕ ВТОРОГО ПОЛЯРНОГО ТЕЛЬЦА Выделение второго полярного тельца является завершающей фазой мейоза и может происходить как при оплодотворении, так и после искусственной активации яйцеклетки. В обоих случаях борозда деления проходит таким образом, что в состав полярного тельца попадает около 1 % цитоплазмы, т. е. в яйце сохраняется преобладающее количество цитоплазмы и все вещества, необходимые для раннего эмбриогенеза. В некоторых случаях при искусственной активации яйцеклетка разделяется на равные (либо примерно одинаковые) части и такой вариант партеногенетического развития называют незамедлительным дроблением, так как обе клетки напоминают первые два бласто- мера, хотя одна из них является аналогом полярного тельца. Данные примеры говорят о том, что размеры второго полярного тельца зависят от расположения борозды (так называемого контрактильного кольца), что в свою очередь определяется локализацией мейотического веретена, т. е. его расположением под разным углом в радиальной или тангенциальной плоскости. В последние годы получены интересные факты и сформулировано стройное представление о механизмах асимметрической цитотомии при завершении деления созревания, т. е. выделении второго полярного тельца в яйцеклетках мыши (Маго et al., 1984, 1985, 1986). Эта гипотеза исходит из того, что в овулировавшей яйцеклетке существуют два различных по своей организации района плазматической мембраны и соответственно два различных района в субкортикальном слое. Один домейн яйцеклетки имеет небольшой размер, он соответствует той области цитоплазмы, в которой располагается мейотическое веретено. Субкортикальный слой здесь богат микрофиламентами f-актина, а плазматическая мембрана лишена микроворсинок и не имеет рецепторов к конковалину А. Второй домейн представляет основную часть яйцеклетки. Субкортикальный район здесь беден микрофиламентами f-актина, а поверхность ооцита содержит много микроворсинок и богата рецепторами к лигандам,
126 Часть вторая. Ранний эмбриогенез млекопитающих в том числе к конковалину A (Johnson et al., 1975; Eager et al., 1976; Maro et al., 1984; Van Blerkorn, Bell, 1986). Спермий пенетрирует яйцеклетку в любом другом районе, кроме той области, в которой плазматическая мембрана не имеет микроворсинок (Johnson et al., 1975), т. е. спермий не попадает в тот домейн, в котором находится мейотиче- ское веретено метафазы II мейоза. Обогащение этого домейна микрофила- ментами актина происходит под влиянием мейотических хромосом, способных индуцировать вблизи себя полимеризацию актина, т. е. превращение G-актина в микрофиламенты f-актина. Это свойство присуще не только мейотическим метафазным хромосомам, но и хроматину спермия, утратившему свою оболочку. Это доказано прямыми наблюдениями при инкубации овулировавших ооцитов мышей в среде с нокодазолом (колхициноподобным препаратом), деполимеризирующим тубулин микротрубочек, из-за чего происходит разборка мейотического веретена и разделение метафазной пластинки на несколько отдельных групп хромосом. Если после действия нокодазола перенести яйцеклетку в нормальную среду, то происходит самосборка микротрубочек, которые, однако, образуют не одно, а несколько мейотических веретен в соответствии с количеством групп мейотических хромосом. При этом каждая группа мейотических хромосом, располагаясь под субкортикальным слоем, индуцирует в этом районе образование микрофиламентов актина (Maro et al., 1986). Показано, что в первые 20—30 мин после слияния головки спермия с ооци- том, когда разрушается ядерная мембрана головки спермия, хроматин так влияет на систему микрофиламентов, что в этом месте образуется конус оплодотворения (Sato, Blandau, 1979). Изучение цитоскелета яйцеклетки позволило сделать вывод, что это происходит из-за того, что деконденсировав- шаяся и утратившая ядерную оболочку головка спермия индуцирует образование такого же субкортикального домейна, богатого микрофиламентами актина, как вблизи мейотического веретена метафазы II (Maro et al., 1984). Таким образом, как конденсированные мейотические хромосомы, так и хроматин головки спермия, утративший ядерную оболочку, влияют на цитоскелет и индуцируют формирование в яйцеклетке районов, богатых микрофиламентами и бедных микроворсинками. Общий ход изменений цитоскелета, обусловленный действием хромосом ооцита, представляет собой следующую цепь событий. Еще в конце созревания ооцита, непосредственно перед разрушением зародышевого пузырька, хромосомы приобретают способность полимеризовать актин и индуцировать в своем ближайшем окружении образование f-микрофила- ментов (Van Blerkorn, Bell, 1986). Когда зародышевый пузырек разрушается и профаза переходит в метафазу, перицентриолярный материал (т. е. МТОС — Microtubule organizing centers), который ранее был связан с оболочкой зародышевого пузырька, распределяется по цитоплазме ооцита, составляя в ней несколько локальных скоплений (Maro et al., 1985). В это время хромосомы полимеризируют тубулин, что приводит к образованию микротрубочек мейотического веретена, полюса которого сосредоточивают группы МТОС (Maro et al., 1986). Затем мейотическое веретено двигается к периферии клетки в результате процесса, в котором участвуют микрофиламенты. Последнее обусловливается действием хроматина на сеть микрофиламентов (Van Blerkorn, Bell, 1986). Когда мейотическое веретено достигает периферических районов ооцита, мейотические хромосомы индуцируют образование в цитоплазме участка, обогащенного микрофиламентами актина, причем поверхность плазматической мембраны теряет микроворсинки (Maro et al., 1984; Van Blerkorn, Bell, 1986). После активации, когда мейоз возобновляется и метафаза переходит в анафазу, под влиянием мейотических хромосом в домейне, богатом
VI. Оплодотворение и искусственная активация яйцеклеток 127 актиновыми микрофиламентами, формируется контрактильное кольцо (Маго et al., 1984). Контрактильное кольцо представляет собой непродолжительно существующую структуру, обусловливающую цитотомию животных клеток (Schroeder, 1975). Эта структура состоит из сгущения актиновых микрофиламентов и чувствительна к действию цитохалазина В, который ее деполимеризует (Schroeder, 1975). Контрактильное кольцо описано в яйцеклетках и дробящихся зародышах млекопитающих (Szollosi, 1970; Gulyas, 1975). Показано, что под влиянием цитохалазина В, если он действует достаточно долго, контрактильное кольцо разрушается и не восстанавливается. Именно поэтому цито- халазин В предотвращает отделение второго полярного тельца (Balakier, Tarkowski, 1976) и подавляет цитотомию первых бластомеров (Tarkowski et al., 1977). Контрактильное кольцо может восстанавливаться после действия низких концентраций цитохалазина или недостаточно продолжительной инкубации в среде с цитохалазином. В этих случаях цитотомия осуществляется после завершения кариотомии. Последнее может служить причиной аномальных форм незамедлительного дробления, т. е. образования двух и больше фрагментов разной величины при искусственной активации яйцеклеток мыши (Дыбан, Нониашвили, 1986а). Для того чтобы образовалось второе полярное тельце нормального размера, необходима определенная локализация контрактильного кольца, которое начинает образовываться в том месте, где в субкортикальном слое яйцеклетки находится мейотическая пластинка, т. е. посредине веретена. Этой частью мейотическое веретено метафазы II прикрепляется к субплазмолемному слою плазматической мембраны при помощи скопления микрофиламентов. Из-за этого через 1—2 ч после активации плазматическая мембрана в области экватора веретена образует впячивание, представляющее собой место прикрепления веретена к плазматической мембране и начало формирования контрактильного кольца. Этой бороздой богатая микрофиламентами субкортикальная область разделяется на два плеча, состоящие из актиновых волоконец. Так как веретено остается прикрепленным к плазматической мембране, одно из плечей актиновых микрофиламентов, сокращаясь и уменьшаясь в размерах, вызывает поворот веретена из тангенциального в радиальное положение. Этот поворот связан с действием сокращающихся микрофиламентов актина и с тем, что для образования борозды деления доступна лишь небольшая область плазматической мембраны, т. е. контрактильное кольцо локализуется по границе областей богатой и обедененной микрофиламентами. В результате происходит асимметричная цитотомия, т. е. отделяется второе полярное тельце небольшого размера (Маго et al., 1984, 1986). Эти преобразования представлены на рис. 10. Поворот веретена и локализация контрактильного кольца в краевой части цитоплазмы активированной яйцеклетки показан на микрофотографиях. На этих фотографиях заметно, что контрактильное кольцо может проходить как в плоскости так называемых срединных тел (mid body), так и не в этой плоскости, т. е. данная структура не служит его ориентиром (рис. 10, фото 2, 3).
128 Часть вторая. Ранний эмбриогенез млекопитающих Глава VII ОДНОКЛЕТОЧНЫЙ ЗАРОДЫШ НА СТАДИИ ПРОНУКЛЕУСОВ После завершения второго мейотического деления материнский набор хромосом преобразуется в ядро, которое называется женским пронуклеусом, а головка спермия — в ядро, носящее название мужского пронуклеуса. Про- нуклеусы представляют собой ядра, тонкое строение и организация хроматина в которых отличается от ядер соматических клеток не только дефинитивных тканей, но и клеток зародыша. К особенностям пронуклеусов относятся их более крупные размеры, малая плотность, плохая окрашиваемость ядерными красителями и наличие своеобразных структур, лишь отдаленно напоминающих ядрышки (так называемые проядрышки). VII. 1. ФОРМИРОВАНИЕ ПРОНУКЛЕУСОВ В искусственно активированной яйцеклетке мыши пронуклеусы начинают формироваться через 1.5—2 ч, а через 3—4 ч они хорошо заметны даже при исследовании яйцеклеток под бинокулярной лупой. Появление пронуклеусов служит надежным критерием искусственной активации яйцеклеток, и по количеству пронуклеусов можно отобрать разные типы партеногенетических зародышей. После оплодотворения пронуклеусы формируются примерно в такие же сроки, т. е. они описаны в яйцеклетках мыши через 4 ч после пенетрации спермиями (Howlett, Bolton, 1985). У различных линий мышей скорость формирования пронуклеусов может быть не одинаковой, и это создает затруднение в датировании развития одноклеточного зародыша. Начальные стадии трансформации головки спермия в мужской пронуклеус отличаются от начальных стадий формирования женского пронуклеуса. Рассмотрим поэтому образование мужского пронуклеуса, а затем остановимся на формировании женского пронуклеуса. VII. 1.1. НАЧАЛЬНЫЕ СТАДИИ ФОРМИРОВАНИЯ МУЖСКОГО ПРОНУКЛЕУСА Формирование мужского пронуклеуса слагается из разрушения оболочки ядра спермия, набухания и диспергирования хроматина, а затем образования вокруг хроматина новой ядерной оболочки. Как только головка спермия попадает в цитоплазму яйцеклетки, оболочка, покрывающая ядро спермия, начинает растворяться и хроматин спермия вступает в прямой контакт с цитоплазмой ооцита. После этого происходит набухание головки спермия, т. е. деконденсация его хроматина. Высказано предположение, что цитоплазма яйцеклетки содержит какой-то фактор, необходимый для декон- денсации головки спермия, причем этот фактор не является идентичным фактору цитоплазмы, контролирующему формирование пронуклеусов (Yanagi- machi, 1978, 1981). Этот вывод основан на наблюдениях, согласно которым головки спермиев не могут превращаться в пронуклеусы, но могут набухать и деконденсироваться, если спермин инкорпорируются в цитоплазму незрелых яйцеклеток хомячков, содержащих зародышевые пузырьки (Usui, Yanagimachi, 1976). Эти авторы считают, что фактор деконденсации головки спермия (SNDF — от англ. sperm nucleus-decondensing factor) начинает образовываться незадолго
VII. Одноклеточный зародыш на стадии пронуклеусов 129 до разрушения зародышевого пузырька, его количество возрастает после разрушения зародышевого пузырька и достигает максимума незадолго до овуляции. В незрелых яйцеклетках крысы этот фактор отсутствует, так как после микроинъекции спермиев в такие яйцеклетки головки спермиев не деконденсируются. Количество SNDF в созревшей яйцеклетке хомячка достаточно для того, чтобы деконденсировать 56 головок спермиев (Yanagimachi, 1981). В яйцеклетке свиньи количество SNDF более ограниченно и вызывает деконденсацию не более чем 20 головок спермиев (Hunter et al.. 1976). SNDF не обладает видовой специфичностью, и если спермии одного вида млекопитающих попадают в яйцеклетку другого вида, то головки спермиев деконденсируются (Uehara, Yanagimachi, 1976; Yanagimachi, 1978, 1981; Tha- dani, 1980). Высказано предположение (Usui, Yanagimachi, 1976), что SNDF синтезируется в цитоплазме яйцеклетки, затем поступает в зародышевый пузырек, где он накапливается и выделяется в цитоплазму после разрушения зародышевого пузырька. Количество свободного SNDF в цитоплазме незрелых яйцеклеток, имеющих зародышевый пузырек, никогда не достигает высокого уровня в яйцеклетках хомячка, однако это не относится к яйцеклеткам собак. Показано, что цитоплазма незрелой яйцеклетки собаки может деконденсировать головки спермиев, хотя в яйцеклетке содержится интактный зародышевый пузырек. Остается неизвестным, какое отношение имеет SNDF к фактору промоции мейоза (MPF) или фактору формирования пронуклеусов. Вполне возможно, что все эти факторы цитоплазмы отражают однотипные изменения ее свойств, т. е. способность преобразовывать интерфазное ядро в метафазу, разрушая оболочку ядра, конденсируя профазные хромосомы и преобразуя их в метафаз- ные хромосомы. Если это предположение справедливо, то тогда различия между SNDF и фактором промоции мейоза не качественные, а лишь количественные, отражающие разный уровень MPF в цитоплазме незрелых и зрелых ооцитов и активированных яйцеклеток. Деконденсация головки спермия млекопитающих изучена недостаточно, особенно с точки зрения молекулярных процессов, осуществляющихся в это время в хроматине. Полагают, что яйцеклетка содержит факторы, благодаря которым она способна разрывать дисульфидные связи в хроматине спермия. Считают, что в процессе деконденсации хроматина вовлекаются восстановленная форма глютатиона и некоторые SH-зависимые ферменты. Кроме того, находящиеся в хроматине спермия акрозиноподобные протеиназы также участвуют в деконденсации хроматина головки спермия. Когда оболочка головки спермия разрушается и хроматин спермия деконден- сируется, то в это время он подвергается каким-то изменениям, необходимым для того, чтобы из хроматина формировался пронуклеус. При этом изменяется белковый состав, т. е. хроматин спермия теряет протамины и приобретает основные белки, относящиеся к гистонам. Не исключено, что эти преобразования представляют собой начало репрограммирования хроматина, которое завершается лишь при синтезе ДНК в пронуклеусах (см. раздел 3 этой главы). По-видимому, этот процесс является началом реактивации хроматина, так как, находясь в конденсированном состоянии в головке спермия, хроматин генетически инертен. Полагают, что структурная модификация конденсированного хроматина необходима для последующей активации отцовских генов, осуществляющейся под влиянием цитоплазмы яйцеклетки (Gurdon, 1977). После деконденсации хроматина вокруг него начинает образовываться оболочка, и головка спермия превращается в мужской пронуклеус. Ядерная оболочка мужского пронуклеуса образуется заново из компонентов, содержав- 9 А. П. Дыбан
130 Часть вторая. Ранний эмбриогенез млекопитающих шихся в цитоплазме яйцеклетки, т. е. мужской пронуклеус имеет смешанное происхождение, — его хроматин происходит от спермия, а оболочка от яйцеклетки. VII. 1.2. ФОРМИРОВАНИЕ ПОЛНОЦЕННЫХ ПРОНУКЛЕУСОВ Описанные выше начальные стадии образования мужского пронуклеуса могут отмечаться, если яйцеклетка неполноценна, что нередко встречается при созревании ооцитов in vitro. Для полноценного формирования как мужского, так и женского пронуклеусов, необходимо наличие в цитоплазме яйцеклетки каких-то дополнительных факторов, причем эти свойства цитоплазма ооцита приобретает после разрушения зародышевого пузырька и перемешивания кариоплазмы с цитоплазмой (см. раздел 4,гл. V). Полагают, что существенную роль в данном процессе играет так называемый фактор формирования мужского пронуклеуса (см. раздел,4 гл. VI). Остается невыясненной связь фактора, деконденсирующего головку спермия, и фактора формирования пронуклеусов. Предполагается, что для действия SNDF яйцеклетки не должны активироваться (Uehara, Yanagimachi, 1976; Yanagimachi, 1978), тогда как фактор формирования пронуклеусов появляется в цитоплазме только после активации яйцеклеток (Tarkowski, 1982). Однако это предположение нуждается в фактических подтверждениях. В равной степени необходимы специальные опыты для того, чтобы определить степень зависимости формирования отцовского и материнского пронуклеусов от этих цитоплаз- матических факторов яйца. Некоторые данные говорят о том, что формирование отцовского пронуклеуса в большей степени зависит от наличия в цитоплазме ооцита этих факторов. Материнский пронуклеус формируется и в тех неполноценно созревших ооцитах, в которых нарушено формирование отцовского пронуклеуса. В нашей лаборатории было детально изучено формирование как отцовского, так и материнского пронуклеусов и описана хронология этих процессов. Весь период от проникновения спермия в яйцеклетку и до профазы первого деления был подразделен на ряд стадий, каждая из которых охарактеризована по морфологическим особенностям пронуклеусов, учитывая также количество и состояние проядрышек (Хожай, 1981; Дыбан и др., 1975). Таким образом, были внесены существенные дополнения в предложенную ранее классификацию стадий развития зиготы мыши (Kaufman, 1983a), причем наша классификация Таблица 14 Изменения пронуклеусов во время их формирования (от 2 до 6—8 и после активации яйцеклетки мыши этиловым спиртом in vitro) (по: Нониашвили, 1986) Стадия Характеристика пронуклеусов 1. Начало формирования пронуклеуса 2. Завершение формирования пронуклеуса 3. Стадия зрелого пронуклеуса Уплотнение хроматина, его преобразование в пронуклеус. Формирование оболочки пронуклеуса. Ранние пронуклеусы содержат по одному большому проядрышку, окруженному небольшим слоем нуклеоплазмы. Увеличение объема пронуклеуса (ов). В каждом прону- клеусе содержится по одному большому либо по 2—6 мелких проядрышек (вторичные проядрышки). В хроматине пронуклеусов преобладает гранулярный компонент. I. У гаплоидных партеногенов происходит миграция пронуклеуса к центру яйцеклетки. II. У диплоидных партеногенов наряду с перемещением пронуклеусов к центру происходит их сближение, но при этом они не сливаются. В пронуклеусах хорошо заметны гранулярный и фибриллярный компоненты.
VII. Одноклеточный зародыш на стадии пронуклеусов 131 более удобна для изучения хронологии последовательных изменений ядерного аппарата зиготы. На основании детального анализа искусственно активированных яйцеклеток мыши было предложено выделить 3 стадии развития пронуклеусов: начало формирования, завершение формирования и стадию зрелых пронуклеусов (Нониашвили, 1986) (табл. 14; рис. 10, рис. 11). VII. 2. ОСОБЕННОСТИ СТРУКТУРНОЙ ОРГАНИЗАЦИИ ПРОНУКЛЕУСОВ В нашей лаборатории были детально исследованы пронуклеусы на разных стадиях развития зигот мыши в сопоставлении с ядрами 2-, 4-бластомерных зародышей и ядрах в клетках бластоцист. При этом были использованы ряд флюорохромов, в том числе акридиноранж и краситель 33258 Hoechst, а также люминесцентный вариант реакции Фёльгина для выявления ДНК- Напомним, что у мышей флуорохром Hoechst 33258 четко выявляет околоцентромерный гетерохроматин, состоящий из сателлитной ДНК, т. е. позволяет определить локализацию в интерфазных ядрах центромерных районов хромосом, что косвенно может свидетельствовать о наличии или отсутствии ассоциаций хромосом между собой (Gropp, Winking, 1981). Проведенные в нашей лаборатории исследования (Паткин, 1980а, 19806) обнаружили существенные различия в структурной организации пронуклеусов по сравнению с ядрами поздних 2-клеточных, а особенно 4-клеточных зародышей. Основной особенностью пронуклеусов является наличие рыхло расположенных хроматиновых фибрилл, которые, конденсируясь, составляют также проядрышки. Проядрышки отличаются от истинных ядрышек тем, что они дают положительную реакцию на ДНК, но не проявляют метахромазии при окраске акридиновым оранжевым и краской Гимза. Структурные и цитохимические особенности проядрышек, по-видимому, объясняются либо отсутствием, либо очень низкой степенью синтеза рРНК в пронуклеусах (Moore et ai., 1978; Piko, Clegg, 1982), о чем говорят и результаты электронно-микроскопических исследований. В проядрышках отсутствует гранулярный компонент, и они являются структурами, обладающими высокой электронной плотностью, т. е. в них не заметны более тонкие структурные элементы и зачастую они кажутся на электронограммах гомогенными плотными тельцами (Zamboni, 1972; Са- larco, McLaren, 1976). Паткин показал A980а, 19806), что вплоть до первого деления дробления в пронуклеусах не выявляется околоцентромерный С-гетерохроматин или другие гетерохроматизированные районы. Не исключено, что это связано с низкой степенью конденсации хроматина в пронуклеусах зигот мыши, из-за чего плотность пронуклеусов ниже плотности цитоплазмы (Abramczuk, Sawicki, 1974). Возможно, что это облегчает перемещение пронуклеусов при кариогамии, т. е. на заключительных стадиях профазы первого мейотического деления. Из сказанного вытекает, что проядрышки, т. е. крупные своеобразные структуры, присутствие которых характерно для пронуклеусов не только мышей, но и одноклеточных зародышей других млекопитающих (Austin, 1961; Дыбан и др., 1975), не являются морфологическим выражением транскрипционной активности хромосом на этих начальных стадиях развития. Природа и функция проядрышек остаются загадочными. Предполагается, что проядрышки играют существенную роль в становлении упорядоченной структурной организации хромосом в пронуклеусах (Дыбан, 1987). Возможно 9»
132 Часть вторая. Ранний эмбриогенез млекопитающих также, что в проядрышках происходит накопление каких-то белков, которые при этом секвестрируются, т. е. извлекаются из цитоплазмы одноклеточного зародыша и, находясь внутри пронуклеуса в виде проядрышек, временно инактивируются. Развивая это представление, можно допустить, что одним из таких белковых факторов является MPF, который, попадая в проядрышки, тем самым перестает действовать как фактор дезинтеграции оболочки ядра. Прежде чем пронуклеусы вступят в профазу, а затем-в метафазу MPF покидает проядрышки и, попадая в цитоплазму, активируется, что и приводит к инициации митоза. Эта гипотеза доступна экспериментальной проверке. VII. 3. ПЕРВЫЙ РАУНД РЕПЛИКАЦИИ ДНК И РЕПРОГРАММИРОВАНИЕ ХРОМАТИНА ПРОНУКЛЕУСОВ В разделе VII. 1.1 приведены сведения о начальных преобразованиях головки спермия, в которой под влиянием цитоплазмы яйцеклетки происходит деконденсация хроматина. Это расценивают как начало реактивации хроматина и его репрограммирования (Gurdon, 1977). Однако главные события осуществляются позже, после формирования пронуклеусов, причем они протекают не только в мужском, но и в женском пронуклеусе. Оба пронуклеуса после завершения формирования содержат гаплоидный набор ДНК, а в митотическое деление зигота вступает с тетраплоидным количеством ДНК- Это происходит потому, что в каждом пронуклеусе вначале осуществляется репликация ДНК, а затем они вступают в митоз. Таким образом, на начальной стадии одноклеточные зародыши содержат два гаплоидных, а затем два диплоидных пронуклеуса. При оплодотворении всех видов животных отмечается один раунд репликации ДНК в пронуклеусах прежде, чем наступит первое деление дробления. Однако для млекопитающих характерны определенные особенности этого процесса. В опытах на низших позвоночных установлено, что цитоплазма яйцеклетки способна инициировать синтез ДНК только после созревания, когда в нее попадает кариоплазма зародышевого пузырька (Детлаф, 1977а, 19776). Эти вопросы подробно разобраны в обзорах Детлаф (Детлаф, 1977а, 19776; Детлаф, 1987). Известно, что при трансплантации соматических ядер в зрелые яйцеклетки амфибий ядра, не обладавшие способностью синтезировать ДНК, приобретают эту способность (Gurdon, 1974, 1977). Индукция синтеза ДНК цитоплазмой яйцеклетки в соматических ядрах расценивают как репрограммирование генома в ответ на специфические сигналы, существующие в активированной яйцеклетке, которые способны индуцировать синтез ДНК в ядрах (Gurdon, 1974, 1977). Инициация синтеза ДНК в пронуклеусах действительно может считаться началом репрограммирования генома, что в особой степени относится к мужскому пронуклеусу, возникшему из головки спермия, являющейся генетически инертной и не обладавшей ни способностью к синтезу ДНК, ни какими-либо другими признаками матричной активности (Зеленин и др., 1974). Однако репрограммирование хроматина у млекопитающих не может быть сведено только к инициации синтеза ДНК в мужском пронуклеусе. Для этого необходима коренная перестройка хроматина, т. е. его реорганизация, обеспечивающая возможность стадиоспецифической и органоспецифической экспрессии генов. Рассмотрим оба эти аспекта репрограммирования хроматина пронуклеусов.
VII. Одноклеточный зародыш на стадии пронуклеусов 133 VII.3.1. ПЕРВЫЙ РАУНД СИНТЕЗА ДНК Синтезу ДНК в одноклеточных зародышах мышей посвящены ряд работ, выполненных разными методами (Luthardt, Donahue, 1973; Abramczuk, Sawicki, 1975; Krishna, Generoso, 1977; Domon, 1983; Hewlett, Bolton, 1985). Результаты этих работ не однозначны, причем определить продолжительность всех фаз этого клеточного цикла удалось не всем авторам, так как, во-первых, трудно точно датировать возраст зародышей и, во-вторых, из-за большого количества эндогенного пула предшественников ДНК в цитоплазме яйцеклетки и плохой проницаемости при применении гистоавторадиографии приходилось длительно инкубировать яйцеклетки в среде с Н -тимидином. Поэтому по одним данным репликация ДНК в пронуклеусах начинается через 7—8 ч после оплодотворения, а по другим — позже или раньше. Продолжительность фазы S по одним данным составляет 3.5—4 ч (Luthardt, Donahue, 1973; Abramczuk, Sawicki, 1975; Molls et al., 1983), а по другим — всего 1.7 ч (Domon, 1983) (табл. 15). Для преодоления этих затруднений была использована чувствительная методика измерения количества ДНК при помощи фотометрии, а также очень точное датирование оплодотворения яйцеклеток in vitro. Отсчет производился от момента осеменения ооцитов in vitro и до того момента, когда при прижизненном исследовании было замечено разделение зародыша на два бластомера, что служило вполне надежной точкой отсчета окончания первого клеточного цикла. Работа проведена на одноклеточных зародышах мышей-гибридов (C57BL/10X Таблица 15 Структура первого клеточного цикла у зародышей мышей Линия мышей CF—1 Swiss albino ICR/Ha C3HXC57BL HS B6D2X1CR C57BL/6X X DBA/2 HS u NMRl C57BLXCBA C57BLXCBA , T (ч точка отсчета Начало формирования пронуклеусов ? ? Спаривание ? Выделение второго полярного тельца » » ? Осеменение in vitro Выделение второго полярного тельца ) жительность 10 14—15 11 . 20—22 13—14 П пе G, Нет 4.5 6 9 4 родолжительность фаз звого клеточного цикла (ч) S От 4 до 9—10 3.5—4 5 7—8 4 2.5 1.7 4 5 6—7 4—6 Ог 3—5 4 3.5 5—6 М 1 3 2—3 G2 + M 8 6.8 8 5 4.5—5 Автор Luthardt, Donahue, 1973 Abramczuk, Sawicki, 1975 Mukherjee, 1976 Krishna, Generoso, 1977 Streffer et al., 1980 Domon, 1983 Domon, 1983 Molls et al., 1983 Howlett, Bolton, 1985 Самошкина и др., 1987
134 Часть вторая. Ранний эмбриогенез млекопитающих X СВА). Установлено, что синтез ДНК начинается в пронуклеусах на 11 ч после осеменения in vitro и продолжается до 17—18 ч, т. е. фаза S длится 6—7 ч (Howlett, Bolton, 1985). В нашей лаборатории был применен принципиально иной метод гистоавто- радиографического исследования синтеза ДНК в пронуклеусах оплодотворенных яйцеклеток мышей. Для этого проводились микроинъекции Н3-тимидина непосредственно в цитоплазму яйцеклетки, которая фиксировалась сразу же после инъекции. Этот метод позволил точно определить начало синтеза ДНК в женском и мужском пронуклеусах и измерить продолжительсть фазы S в первом клеточном цикле (Самошкина и др., 1987) (рис. 12). Установлено, что процесс репликации ДНК осуществляется в пронуклеусах своеобразно, т. е. когда оба пронуклеуса еще имеют одинаковые размеры, интенсивно метятся как женский, так и мужской пронуклеусы. Несколько позже, когда пронуклеусы мигрируют к центру зиготы и размер мужского пронуклеуса становится существенно больше женского, меченый тимидин более интенсизно включается в женский пронуклеус. Эта картина сохраняется при сближении пронуклеусов, когда в основном метится ДНК, граничащая с проядрышками либо входящая в их состав. В конце фазы S снижается интенсивность включения радиоактивной метки в обоих пронуклеусах, но сохраняется интенсивная метка над вторичными проядрышками. Наши исследования показали, что продолжительность первого цикла репликации ДНК может быть у одних зародышей 3.5—4 ч, а у других 6—7 ч (рис. 12). Остается невыясненным, зависят ли различия в продолжительности фазы S от того, что некоторые зародыши обладают пониженными темпами развития, свидетельствующими об их неполноценности, либо с другими причинами. На основании исследования репликации ДНК в пронуклеусах зародышей амфибий и рыб был сделан вывод, что на одноклеточной стадии скорость репликации ДНК достигает максимума, что связано с максимально высокой скоростью образования репликационных вилок и весьма эффективной функцией ДНК полимеразы (Костомарова, Князева, 1983). Это положение неприменимо к одноклеточным зародышам мышей и других млекопитающих. Даже если учитывать только тех зародышей, у которых фаза S в пронуклеусах продолжается короткое время C.5—4 ч), то и в этих случаях скорость репликации ДНК в пронуклеусах примерно равна скорости репликации ДНК в ядрах соматических клеток. Необходимо не забывать, что в каждом пронуклеусе содержится гаплоидное количество ДНК, и если оно преобразуется в диплоидный набор за 3.5—4 ч, то при такой скорости репликации ДНК преобразование диплоидных ядер в тетраплоидные должно занять 7—8 ч, т. е. столько же, как в ядрах более поздних зародышей и в ядрах дефинитивных клеток. Кроме того, эта скорость значительно ниже той, с которой происходит репликация ДНК в ядрах зародышей мышей на стадии гаструлы (позднего яйцевого цилиндра). У таких зародышей в первичной эктодерме найдена так называемая пролиферативная зона, клетки в которой интенсивно размножаются, причем продолжительность клеточных циклов укорочена до 3—4 ч (Snow, 1976, 1977, 1981). Следовательно, на этой стадии развития зародышей мышей скорость репликации ДНК в ядрах первичной эктодермы значительно выше, чем в пронуклеусах у одноклеточных зародышей. Более детально репликация ДНК в пронуклеусах зародышей мышей не исследовалась, и динамика синтеза ДНК в индивидуальных хромосомах или их отдельных сегментах не изучалась. О синтезе ДНК в пронуклеусах одноклеточных зародышей других млекопитающих получены фрагментарные сведения. Все эти вопросы представляют существенный интерес и настоятельно нуждаются в более подробном изучении.
Возраст зародышей Рис. 12. Структура первого клеточного цикла и продолжительность фазы синтеза ДНК у одноклеточных зародышей мышей (по: Самошкина и др., 1987). Объяснения в тексте.
136 Часть вторая. Ранний эмбриогенез млекопитающих VII. 3.2. РЕПРОГРАММИРОВАНИЕ ХРОМАТИНА ПРОНУКЛЕУСОВ Представления о репрограммировании хроматина пронуклеусов основаны на фактах, полученных при интродукции чужеродных клонированных генов в геном одноклеточных зародышей мышей (см. раздел 2,гл. X) и на результатах действия ингибиторов синтеза ДНК во время первого и последующих клеточных циклов у ранних зародышей мышей. Необходимо иметь в виду, что на 2-клеточ- ной стадии у зародышей мышей одновременно транслируются как материнские мРНК, так и мРНК зародышей, причем в это время гены зародыша активируются и начинает реализоваться генетическая программа, закодированная в геноме зародыша (см. раздел 3, гл. VIII). Было показано, что вмешательство на одноклеточной стадии, при котором подавляется цитотомия (воздействие цитохалазином В), не влияет на реализацию генетической программы развития. Не изменяется эта программа и после удаления одного из пронуклеусов, т. е. у гиногенетических и андрогенетических гаплоидов, а также у гаплоидных партеногенов. Во всех этих случаях во время дробления синтезируются все стадиоспецифические белки. Если культивировать зиготу мыши в среде с цитохализином В, то при этом ингибируется не только цитотомия, но и кариокинез, т. е. в зародыше остаются два обособленных ядра, каждое из которых соответствует материнскому или отцовскому пронук- леусу. Если культивирование в среде с цитохалазином В продолжалось долго, то в каждом из этих ядер осуществляются два и больше раундов репликации ДНК. При этом генетическая программа развития не меняется, т. е. своевременно экспрессируются гены и появляются новые белки, специфические для дробления (Petzold et al., 1983; Bolton et al., 1984). Иная картина наблюдается при подавлении синтеза ДНК в пронуклеусах. Были проведены опыты, в которых одноклеточные зародыши помещались в среду с ингибитором ДНК полимеразы I препаратом афидиколином. При этом первый раунд репликации ДНК в пронуклеусах не происходил, т. е. они оставались гаплоидными. Это не помешало цитотомии и разделению зиготы на два бластомера. Однако у 2-клеточных зародышей не происходила стадиоспецифи- ческая экспрессия генов и не отмечалась характерная для этой стадии динамика разрушения материнской мРНК, т. е. нарушилась вся генетическая программа раннего развития (Johnson et al., 1984; Maro et al., 1986). Таким образом, после угнетения синтеза ДНК в пронуклеусах нарушалась временная программа развития, запускаемая процессом оплодотворения. Это позволяет предполагать, что во время первого раунда репликации ДНК происходит репрограммирование хроматина пронуклеусов, причем создаются структурные предпосылки, делающие возможным стадиоспецифическую регуляцию экспрессии генов в последующем развитии (Johnson et al., 1984). В пользу этого представления говорят и результаты интродукции в мужской пронуклеус зиготы мышей клонированных фрагментов ДНК ретровируса Мо- лони (Jahner et al., 1982) либо клонированных индивидуальных генов млекопитающих и человека (см. раздел 2,гл. X). Есть известные основания полагать, что только те чужеродные гены, которые интегрируются в районы хроматина, доступные для сигналов, обеспечивающих стадиоспецифическую регуляцию природных генов, будут подвергаться такой регуляции (Дыбан, Городецкий, 1985, 1986). Пока еще остается неизвестным, к чему сводится репрограммирование хроматина пронуклеусов, осуществляющееся во время первого раунда репликации ДНК. Возможно, что при этом создается упорядоченная организация хроматина
VII. Одноклеточный зародыш на Стадии пронуклеусов 137 либо какое-то упорядоченное расположение хромосом, либо иные изменения структуры и свойств хромосом, которые необходимы для того, чтобы гены, находящиеся в эухроматиновых районах, стали доступными для сигналов, в ответ на которые должна происходить их транскрипция. Эти вопросы настоятельно нуждаются в изучении, что остается задачей будущих исследователей. VII.4. ОБЪЕДИНЕНИЕ РОДИТЕЛЬСКИХ НАБОРОВ ХРОМОСОМ В СИСТЕМУ ЕДИНОГО КЛЕТОЧНОГО ЯДРА По ходу репликации ДНК пронуклеусы увеличиваются в размерах, и при этом становятся заметными различия между отцовским и материнским пронуклеусами. У мышей и у крыс мужской пронуклеус всегда отстает от женского, но имеет при этом более крупные размеры, так как степень гетерохромати- зации хроматина в этом пронуклеусе выражена меньше, чем в женском (Austin, 1961; Donahue, 1972). Остается невыясненным, существуют ли такие различия между мужским и женским пронуклеусом в зиготах других видов млекопитающих, однако полагают, что у человека оба пронуклеуса имеют одинаковые размеры (Edwards, 1980). Эти вопросы изучены плохо, хотя есть основание считать, что общим признаком не только зигот млекопитающих, но и других животных является гетероцикличность родительских наборов хромосом, что должно неминуемо отражаться и на размерах мужского и женского пронуклеусов и на состоянии их хроматина. Завершив фазу S, зиготы мышей непосредственно вступают в профазу мейоза, т. е. на одноклеточной стадии фаза G2 отсутствует. Для млекопитающих характерно такое взаиморасположение профазных хромосом в пронуклеусах, при котором они ассоциируются с проядрышками, причем это четко заметно не только в профазе, но сохраняется и в прометафазе в каждом родительском наборе хромосом (Дыбан и др., 1975; Хожай, 1981; Дыбан, Нониашвили 19866, 1986в). Объединение родительских наборов хромосом в систему единого клеточного ядра осуществляется лишь во время метафазы, т. е. после разрушения оболочек пронуклеусов и сближения хромосомных наборов, формирующих при этом единую метафазную пластинку. Данный процесс является завершением кариогамии и может быть отнесен к окончанию оплодотворения, т. е. объединению родительских геномов. Рассмотрим эти процессы. VII. 4.1. ГЕТЕРОЦИКЛИЧНОСТЬ ХРОМОСОМНЫХ НАБОРОВ Гетероцикличность родительских хромосом описана в.раннем эмбриогенезе насекомых и рыб, и сформулированы положения об универсальности этого явления для онтогенеза всех животных (Прокофьева-Бельговская, 1947, 1964, 1971, 1981). В нашей лаборатории было детально исследовано состояние хромосом в одноклеточных зародышах мышей, причем в этой работе использовались как зиготы, у которых речь могла идти о гетероцикличности родительских наборов хромосом, так и искусственно активированные яйцеклетки. В этих яйцеклетках сохранялись оба набора хромосом, так как под влиянием цитохалазина Д подавлялось выделение второго полярного тельца (рис. 11). Следовательно, в этих наблюдениях речь должна была идти о состоянии сестринских хромосомных наборов, один из которых является аналогом хромосомного набора полярного тельца, а второй — аналогом материнского хромосомного набора зиготы. Рассмотрим полученные результаты.
138 Часть вторая. Ранний эмбриогенез млекопитающих VII. 4.1.1. Гетероцикличность отцовского и материнского наборов Ряд авторов описывал более сильную спирализацию материнского набора хромосом в зиготах мышей (Donahue, 1968, 1972; Паткин, 1980а, 19806; Kaufman, 1983а) и в зиготах крыс (Удалова, 1969; Чеботарь, 1976). Однако для полной характеристики особенностей спирализации родительских наборов хромосом в раннем эмбриогенезе млекопитающих необходима идентификация гомологов и измерение длины членов гомологичных пар хромосом у одноклеточных зародышей и зародышей более поздних стадий развития. Оба эти вопроса в эмбриогенезе млекопитающих не изучались. Поэтому нами было проведено исследование родительских наборов хромосом во время первых двух делений дробления зародышей мышей (Дыбан, Сорокин, 1983; Сорокин, 1984). Для дифференциальной окраски использовали препараты метафазных хромосом, приготовленные без применения колхицина, избегая влияние этого препарата на спирализацию хромосом. Это позволило точно измерить длину обоих гомологов в пяти парах хромосом. Получено 17 дифференциально окрашенных метафазных пластинок, качество которых было достаточно хорошим для того, чтобы проводить кариотипирование. Обнаружены четкие различия в длине гомологов, причем длинные гомологи всегда происходили из более крупного, т. е. мужского, а короткие — из женского пронуклеуса. Была измерена длина обоих гомологов в пяти первых парах аутосом и показано, что отцовские гомологи длиннее материнских в 1.2 раза и эти различия статистически вполне достоверны (Дыбан, Сорокин, 1983; Сорокин, 1984). Необходимо подчеркнуть, что несмотря на различия в длине каждой пары хромосом, характер расположения бендов и интербендов был одинаковым в отцовских и материнских гомологах и полностью совпадал со стандартным рисунком дифференциальной окрашиваемости хромосом мышей. Не исключено, однако, что при применении более высокоразрешающих методов бендирования прометафазных хромосом удалось бы выявить различия в их дифференциальной окрашиваемости. Этот интересный вопрос нуждается в специальном исследовании, хотя трудно надеяться, что дифференциальная активность хромосомных локусов в эмбриогенезе может отразиться на строении хромосом, т. е. на локализации бендов и интербендов. Таким образом, проведенные нами исследования подтвердили, что на одноклеточной стадии родительские наборы хромосом гетероцикличны, причем отцовский набор спирализован меньше, чем набор материнских хромосом. Вполне логично было предположить, что это могло обусловливаться двумя обстоятельствами: во-первых, гетероцикличность родительских наборов в зиготе могла быть связана с различным исходным состоянием хроматина. Напомним, что в момент оплодотворения отцовский генетический материал представляет собой максимально конденсированный хроматин головки епермия, а материнский — мейотические хромосомы метафазы П. Во-вторых, гетероцикличность родительских наборов могла обусловливаться различным воздействием яйцеклетки на пронуклеусы из-за того, что они располагались в разных зонах цитоплазмы. Для проверки этого предположения нами были проведены детальные исследования преобразования пронуклеусов в партеногенетических зародышах, т. е. на объектах, у которых оба хромосомных набора имеют одинаковое происхождение и идентичное исходное состояние.
VI/. Одноклеточный зародыш на стадии пронуклеусов 139 VII. 4.1.2. Гетероцикличность сестринских хромосомных наборов Эти опыты проведены на диплоидизированных цитохалазином В или Д одноклеточных партеногенетических зародышей мышей. Цитохалазин подавляет выделение второго полярного тельца, и у зародышей остается два пронук- леуса, причем оба они образуются из материнских хромосом. Один из этих пронуклеусов содержит хромосомы, которые должны были отойти в ядро полярного тельца, а другой пронуклеус — хромосомы, которые должны были остаться в яйце и образовать женский пронуклеус. Следовательно, оба пронук- леуса партеногенетического зародыша имеют одинаковое происхождение и формируются за счет продуктов сегрегации (полудиад) одной общей мейотиче- ской метафазы II (рис. 11). Были проведены цитологические исследования как тотальных препаратов одноклеточных партеногенетических зародышей мышей, окрашенных лакмои- дом, так и суховоздушных препаратов, приготовленных по методу, хорошо сохраняющему структуру профазных и метафазных хромосом ранних зародышей млекопитающих (Dyban, 1983). Эти опыты показали (Дыбан, Нониашвили, 1986в; Нониашвили, 1986), что в преобладающем большинстве диплоидизированных партеногенетических зародышей четко заметны асинхронные преобразования пронуклеусов. Один из пронуклеусов обычно несколько крупнее другого, причем это обнаруживается как в интерфазе, так и во время профазы. Один из пронуклеусов проходит цикл преобразования хромосом быстрее другого, раньше вступая в профазу и метафазу. Именно в этом пронуклеусе хромосомы несколько более спирализованы, чем в другом пронуклеусе (рис. И, 13). Во время прометафазы можно найти такие случаи, когда оба набора хромосом сближаются, но еще не объединились в одну общую пластинку. В этом случае четко видно, что хромосомы одного набора более короткие и сильнее спирализованы, чем хромосомы второго набора (рис. 13). Данная картина убедительно свидетельствует о том, что цикл преобразования хромосом асинхронен, т. е. сестринские хромосомные наборы гетероцикличны. Требуются дальнейшие исследования, в том числе измерение длины гомологичных хромосом для того, чтобы определить, сохраняется ли эта гетероцикличность и во время метафазы первого деления дробления, Таким образом, не только зигота, но и диплоидизированный партено- генетический одноклеточный зародыш представляют собой дикарион, т. е. клетку, содержащую относительно независимые друг от друга ядра (пронук- леусы), цикл преобразования хромосом в которых асинхронен. Эти факты позволяют думать о том, что гетероцикличность хромосомных наборов в одноклеточном зародыше не определяется только различным происхождением родительских наборов, но в большей степени зависит от компартмен- тализации цитоплазмы яйцеклетки. Можно допустить, что в цитоплазме яйцеклетки есть зоны, обогащенные и обедненные факторами, влияющими на преобразования хромосом в пронуклеусах. Вполне возможно, что это явление каким-то образом связано с образованием в цитоплазме так называемого «фактора мужского пронуклеуса», необходимого для полноценного преобразования головки спермия в пронуклеус. Известно, что этот фактор образуется в яйцеклетке в ограниченном количестве и сохраняется непродолжительное время, т. е. исчезает после активации и быстро истощается, если в яйцо проникает несколько спермиев. Показано, что при полисперм- ном оплодотворении головка первого из проникших в яйцо мыши спермиев преобразуется в более крупный пронуклеус (Witkowska, 1981) (см. также раздел 1 этой главы). Поэтому можно допустить, что с действием этих факторов цитоплазмы связаны различия в размерах мужского и женского пронуклеусов
140 Часть вторая. Ранний эмбриогенез млекопитающих и гетероцикличность не только материнского и отцовского хромосомных наборов, но и разная степень спирализации сестринских хроматидных наборов в партеногенетическом зародыше. Вполне вероятно, что этим фактором является тот же самый фактор, который вызывает разрушение зародышевого пузырька и конденсацию хромосом, т. е. МРТ. Не исключено, однако, что эти свойства цитоплазмы зависят не только от концентрации в данном районе MPF, но и от других факторов цитоплазмы, влияющих на состояние ядра и инициирующих в пронуклеусах синтез ДНК либо переход из интерфазы в профазу и метафазу мейоза. Гипотеза о компартментализации цитоплазмы яйцеклетки, т. е. градиенте распределения в ней веществ, регулирующих преобразования пронуклеусов и поведение их хромосом (Дыбан, 1987), постулирует, что хромосомные наборы лишь реагируют на появление и исчезновение из цитоплазмы яйца ряда факторов, т. е. на изменение свойств цитоплазмы. В зависимости от того, в каком районе цитоплазмы находится пронуклеус, он подвергается действию различной концентрации ряда цитоплазматических факторов, и поэтому про- нуклеусы не могут преобразовываться одинаково. Если в клетке находятся два женских пронуклеуса, то тот из них, который попадет в район, содержащий больше этих цитоплазматических факторов, начнет раньше преобразования, которые раньше приведут к переходу профазы в прометафазу. В этом случае хромосомы будут более спирализованными, чем в другом пронуклеусе. Если речь идет об оплодотворенной яйцеклетке, то запаздывание трансформации мужского набора хромосом, помимо этих обстоятельств, обусловливаются также необходимостью дополнительных преобразований (потеря оболочки, деконден- сация хроматина головки спермия и его диспергирование, формирование оболочки пронуклеуса), из-за чего мужской пронуклеус образуется несколько позже, чем женский. Это накладывает отпечаток и на переход в профазу и метафазу, т. е. мужской пронуклеус получает меньше веществ из цитоплазмы, чем женский пронуклеус, и из-за этого его хромосомы меньше спирализованы, чем женский набор хромосом. VII.5. ТРАНСКРИПЦИОННАЯ АКТИВНОСТЬ ХРОМОСОМ НА ОДНОКЛЕТОЧНОЙ СТАДИИ В профазу и метафазу первого деления гомологи вступают в разном состоянии, отцовские гомологи менее спирализованы, чем материнские. Однако оба комплекса хромосом не проявляют признаков предшествовавшей транскрипционной активности. Этот вывод вытекает из результатов исследований активности ядрышкоорганизующих районов (ЯОР) в метафазных хромосомах одноклеточных зародышей мышей. Напомним, что ЯОР окрашиваются серебром в том случае, если они были транскрипционно активны в предшествующей интерфазе (Howell, 1982). Эти исследования показали (Паткин, Сорокин, 1983; Сорокин, 1984), что в первой метафазе ЯОР не выявляются ни в отцовских, ни в материнских хромосомах, что говорит об отсутствии транскрипции кластеров рибосомальных цистронов в пронуклеусах. Этот вывод согласуется с наблюдениями других авторов, также не выявивших ЯОР в метафазных хромосомах зиготы мыши (Hansmann et al., 1978). Следовательно, в пронуклеусах не происходит транскрипции генов и ядерный аппарат на этой стадии не может контролировать те изменения спектра белкового синтеза, которые отмечаются во время первого клеточного цикла (см. раздел 7 этой главы). В оплодотворенной яйцеклетке родительские
VII. Одноклеточный зародыш на стадии пронуклеусов 141 хромосомные наборы представляют собой лишь системы, реагирующие на динамические изменения цитоплазмы яйца, т. е. на запрограммированную заранее динамическую программу образования и исчезновения из цитоплазмы ряда факторов, определяющих поведение хромосом. Как спермий, так и яйцеклетка могут иметь аномальные хромосомные наборы (гипо- и гипергаплоидию, различные структурные хромосомные аберрации и другие), но это не влияет ни на формирование пронуклеусов, ни на вступление в метафазу первого деления дробления. Последнее происходит и при гетероло- гичном оплодотворении яйцеклеток млекопитающих (например, оплодотворения яйцеклеток хомячка спермиями человека, см.: Yanagimachi, 1984). Таким образом, первый клеточный цикл не зависит от генетической активности хромосом спермия или хромосом яйцеклетки и нуждается только в образовании функционирующего митотического аппарата и в преобразованиях цито- скелета, нужных для формирования контрактильного цитоплазматического кольца, благодаря которому происходит цитотомия, т. е. разделение зиготы на два бластомера. Примечательно, что после полной энуклеации яйцеклетки мыши в ней не только продолжается трансляция генетической информации, но может осуществляться деление. Так, показано, что после энуклеации неоплодотворенной или оплодотворенной яйцеклетки мыши в цитопласте продолжается не менее чем на протяжении двух дней синтез белков на материнских мРНК (Petzold et al., 1980). При разделении оплодотворенных или искусственно активированных яйцеклеток мыши на ядерные и безъядерные части в цитопластах отмечается автономная кортикальная активность, осуществляющаяся согласно так называемым «цитоплазматическим биологическим часам». Это приводит первоначально к возникновению множественных борозд дробления, т. е. неполной фрагментации, но после вторичного слияния этих фрагментов в ряде случаев цитопласт делится на две части, напоминающие первые два бластомера (Waksmundzka et al., 1984). Авторы приходят к заключению, что ядро, воздействуя на цитоплазму яйца, подавляет преждевременную и излишне сильную кортикальную активность цитоплазмы, способствуя также правильной организации системы микрофиламентов и возникновению одной борозды дробления. Высказано интересное предположение, что хотя в яйцах млекопитающих сохраняются автономные биологические часы (ритмы), присущие цитоплазме яиц беспозвоночных и низших позвоночных, однако у млекопитающих автономная кортикальная активность цитоплазмы яйца не совпадает по времени с ядерными преобразованиями, после которых происходит цитогенез. Это авторы связывают с удлинением клеточных циклов во время дробления яиц млекопитающих и появлением уже в первом клеточном цикле продолжительной фазы Gi (Waksmundzka et al., 1984). Таким образом, уже на одноклеточной стадии упорядоченное дробление возможно только при взаимодействии ядра и цитоплазмы. Однако эта роль ядра не связана с реализацией его генетической информации, а должна рассматриваться как функция, которую ядро выполняет в качестве клеточного органоида. Приведенные выше данные- не означают, что на одноклеточной стадии не происходит существенных изменений структуры и функции ядра, сказывающихся на дальнейшем развитии зародыша. Зигота содержит мужской и женский пронуклеусы. Вполне правомочны поэтому вопросы: в какой мере независимы друг от друга мужской и женский пронуклеусы, могут ли пронуклеусы обмениваться информационными молекулами через цитоплазму и взаимодействовать друг с другом? Нужно ли для такого взаимодействия объединение родительских наборов хромосом в систему единого ядра таким образом, чтобы гомологи контактировали друг с другом? Является ли физический контакт гомологов
142 Часть вторая. Ранний эмбриогенез млекопитающих решающим процессом, благодаря которому на одноклеточной стадии нивелируется так называемый «хромосомный импринтинг»? Постановка этих вопросов важна для понимания особенностей одноклеточного зародыша и обсуждения гипотез, связывающих гибель партеногенетиче- ских, гиногенетических и андрогенетических зародышей мышей с неравнозначностью, т. е. комплементарностью отцовского и материнского хромосомных наборов из-за различий в импринтинге хромосом в сперматогенезе и оогенезе, что делает невозможным экспрессию некоторых отцовских (или материнских) аллелей (см.: McGrath, Solter, 1986; Surani et al., 1986). На эти вопросы нет определенных ответов, однако уже получены факты, касающиеся взаиморасположения хромосом в метафазе первого и последующих делений дробления, рассмотрение которых имеет непосредственное отношение к поставленным выше вопросам. VII. 6. ВЗАИМОРАСПОЛОЖЕНИЕ ГОМОЛОГИЧНЫХ ХРОМОСОМ В МЕТАФАЗЕ ПЕРВОГО ДЕЛЕНИЯ Одноклеточный зародыш представляет собой двуядерную клетку, так как в нем находятся два пронуклеуса; циклы преобразования хромосом асинхронны и независимы друг от друга. Высказана гипотеза, что при объединении родительских наборов хромосом в единую систему создается та структурно-функциональная организация ядра, в том числе и новое взаиморасположение хромосом, которая сохраняется в интерфазных соматических ядрах на протяжении всего онтогенеза, изменяясь лишь в мейозе (Ashley, Pocock, 1981). Так как расположение хромосом в метафазной пластинке в известной степени должно отражать упорядоченность и взаиморасположение хромосом в интерфазном ядре, и наоборот, есть все основания ожидать найти эту картину и в метафазе первого деления дробления. В нашей лаборатории при фазовоконтрастной микроскопии тотальных препаратов зигот мыши, окрашенных лакмоидом, было замечено упорядоченное расположение хромосом в метафазной пластинке, при котором короткие и длинные хромосомы располагаются попарно, соприкасаясь по всей длине. Это же заметно и при люминесцентной микроскопии зигот мыши, окрашенных флюоро- хромом Хёхст 33258 (Паткин, 1980а, 19806). Эти картины натолкнули на мысль о физическом контакте гомологов в метафазе первого деления, отражающем межхромосомные взаимодействия уже на этой стадии и определяющем близкое расположение гомологов в интерфазных ядрах после первого деления дробления, т. е. с 2-клеточной стадии. Однако детальный анализ взаиморасположения гомологов в метафазах первого деления дробления зародышей мышей при использовании методов бендирования хромосом не подтвердил этого предположения. Было показано, что не только во время прометафазы, но и во время метафазы хромосомы родительских наборов располагаются обособленно, т. е. гомологи не контактируют друг с другом (Дыбан, Сорокин, 1983; Сорокин, 1984). Установлено, что родительские наборы хромосом располагаются почти не смешиваясь. Из 17 метафаз в 13 была выявлена более или менее сильно выраженная обособленность расположения длинных и коротких гомологичных хромосом. При этом на метафазных пластинках, имевших Y-хромосому, она всегда находилась в группе более длинных хромосом. На четырех остальных метафазных пластинках не удалось выявить обособленного расположения гомологичных хромосом отцовского и материнского происхождения, возможно, из-за перемешивания хромосом при приготовлении препаратов.
VII. Одноклеточный зародыш на стадии пронуклеусов 143 Однако вывод о том, что родительские наборы хромосом в метафазе располагаются обособленными группами, нельзя считать окончательным. В нашей работе был применен метод приготовления суховоздушных препаратов, при котором хромосомы неизбежно разбрасываются по предметному стеклу, т. е. расположение хромосом может изменяться сильнее, чем в тотальных препаратах зигот, окрашенных лакмоидом, на которых видно попарное расположение длинных и коротких хромосом. Необходимо полностью исключить и возможность того, что в данной работе были преимущественно отобраны те зародыши, хромосомы которых лучше подходили для бендирования, т, е. поздние прометафазы и ранние метафазы. Если родительские наборы хромосом остаются в метафазе первого деления в виде двух обособленных гаплоидных групп, нужно искать какой-то механизм, обеспечивающий строго упорядоченное расхождение гомологов в анафазе. Кроме того, если только в ядрах 2-клеточног0 зародыша родительские наборы хромосом перестают быть обособленными, нужно искать и объяснение, каким образом в обоих ядрах возникает строго одинаковая, а не различная организация. Иначе у зародышей должны были бы возникнуть два клона клеток с разной организацией интерфазных ядер. Этого не наблюдается среди ядер бластомеров 4- или 8-клеточных зародышей. Таким образом, одни наблюдения нашей лаборатории говорят за ш, что в метафазе первого деления родительские наборы хромосом располагаются обособленными группами, а другие в пользу упорядоченного расположения и контакта гомологов между собой. • В метафазах второго деления дробления (т. е. при переходе с 2- на 4-клеточ- ную стадию) в отдельных случаях зарегистрировано близлежание гомологичных отцовских и материнских хромосом (Сорокин, 1984). Однако при спаривании мышей с самцами, у которых радиоактивная метка была введена в ДНК спермиев, обнаружено, что в ядрах 2- и 4-бластомерных зародышей радиоактивная метка локализуется в определенных районах интерфазных ядер, а это больше согласуется с представлениями о том, что и на этих сроках отцовские хромосомы занимают в ядре отдельные районы (Keneklis, Odarchenko, 1974). По-видимому, лишь на 4- или 8-клеточной стадиях у зародышей мышей возникает структурно-функциональная организация интерфазных ядер, приближающаяся к дефинитивной организации ядер и включающая неслучайное расположение (близлежание) гомологичных хромосом. Именно такая организация интерфазных ядер может объяснить случаи рекомбинации между гомологичными хромосомами, описанные и у мышей (Griineberg, 1966; Vogel, Motulsky, 1979). Следовательно, вопрос о взаиморасположении гомологичных хромосом в первых делениях дробления зародышей мышей и других млекопитающих требует дальнейшего изучения с использованием современных методов. Пока еще невозможно определить морфологический эквивалент нивелирования «импринтинга» хромосом, имевшего место в гаметогенезе, и неизвестно, к какой стадии развития зародыша приурочен этот процесс. VII.7. МОЛЕКУЛЯРНО-БИОЛОГИЧЕСКАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА ОДНОКЛЕТОЧНОГО ЗАРОДЫША Суммируя приведенные выше сведения, можно прийти к заключению, что на одноклеточной стадии происходит становление хромосомного аппарата и той структурно-функциональной организации ядра, которая присуща клеткам более позднего зародыша, хотя последний процесс заканчивается не на этой,
144 Часть вторая. Ранний эмбриогенез млекопитающих а продолжается на последующей стадии. Все события, происходящие с хромосомами в зиготе, начиная от расхождения материнских мейотических хромосом при выделении полярного тельца и преобразования головки спермин в про- нуклеус и заканчивая всеми дальнейшими изменениями пронуклеусов вплоть до образования двух комплексов профазных и прометафазных хромосом, их сближением и объединением в одну общую метафазу первого деления, а также сам процесс деления зиготы на две клетки, находится под контролем цитоплазмы яйцеклетки, т. е. макромолекул, которые образовались в оогенезе или возникли после оплодотворения. Так как геном одноклеточного зародыша транскрипционно неактивен, нет оснований предполагать, что изменения спектра белков в оплодотворенной яйцеклетке обусловлены экспрессией генов зародыша. Следовательно, остается допустить, что на этой стадии регуляция осуществляется на посттранскрипционном и посттрансляционном уровнях. Данное предположение подтверждается рядом убедительных фактов. Напомним, что яйцеклетка мышей содержит значительный запас различных форм РНК (тРНК, рРНК и рибосомальных белков), которые образовались еще во время оогенеза (McLaren, 1981). Яйцеклетки имеют значительное количество поли А РНК, составляющей примерно 23—25 пикограмм, что соответствует 7—8 % общего содержания РНК (Bachvarova, De Leon, 1980; Piko, Clegg, 1982). После энуклеации либо химической блокады транскрипционной активности хроматина не возникают какие-либо изменения в спектре синтезируемых в одноклеточном зародыше белков (Braude, 1979; Petzoldt et al., 1980; Flach et al., 1981; Van Blerkom, 1983). Поэтому есть все основания для вывода, что спектр поли пептидов регулируется в одноклеточном зародыше на посттранскрипционном уровне, используя материнские компоненты цитоплазмы (Johnson et al., 1984). У некоторых животных (например, морских ежей) после оплодотворения скорость синтеза белков возрастает в 30—50 раз, а паттерны белкового синтеза изменяются из-за избирательной активации мРНК и изменений стабильности полипептидов. У других животных скорость синтеза белков увеличивается лишь в 2—4 раза, но появляются новые классы белков. У мышей после оплодотворения яйцеклеток отмечается умеренное возрастание синтеза белков, и хотя профиль полипептидов в общем изменяется мало, некоторые сдвиги в паттернах белкового синтеза выявляются довольно четко. В недавней работе были сопоставлены морфологические изменения на протяжении одноклеточной стадии развития зародышей мышей с изменениями в спектре синтезируемых полипептидов, причем точно регистрировалось время пенетрации яйцеклеток спермиями, а также начало первого деления дробления (Howlett, Bolton, 1985). Авторы пришли к выводу, что среди полипептидов, появляющихся в первые часы после оплодотворения, есть полипептиды, синтез которых не зависит от оплодотворения, полипептиды, синтез которых ускоряется при оплодотворении, и, наконец, есть класс полипептидов, начало синтеза которых зависит от оплодотворения. Это позволило сформулировать представления о том, что на одноклеточной стадии функционируют две программы: программа ооцита, которая запускается конечными событиями при созревании ооцитов, и программа оплодотворения, которая инициируется в яйцеклетке при ее пенетрации спермием и накладывается на программу ооцита. При реализации программы ооцита, которая осуществляется вне зависимости от оплодотворения или активации, в ооците накапливаются белки и другие компоненты, необходимые для завершения оогенеза и для того, чтобы при оплодотворении произошла трансформация женского набора хромосом и головки
VII. Одноклеточный зародыш на стадии пронуклеусов 145 спермия в пронуклеусы. Многие из полипептидов, синтезируемые в оогенезе, особенно во время созревания яйцеклетки, продолжают синтезироваться в ову- лировавшей яйцеклетке, причем их количество возрастает по мере увеличения возраста яйцеклетки, т. е. при ее «перезревании». По-видимому, эти белки каким-то образом влияют на устойчивость яйцеклетки к действию внешних агентов и на ее способность искусственно активироваться. Этот вывод вытекает из результатов работы (Дыбан, Нониашвили, 1986г), в которой было замечено изменение теплоустойчивости яйцеклеток мышей. Свежеовулировавшие яйцеклетки обладали низкой теплоустойчивостью и при краткосрочном нагревании до +39.5 °С не активировались, а погибали. По мере увеличения постовулятор- ного возраста резистентность яйцеклеток тепловому шоку увеличивалась и возрастала их способность активироваться этим и другими агентами (см.: Дыбан, Нониашвили, 198бг). Кроме того, накопление этих полипептидов, вероятно, необходимо для того, чтобы цитоплазма яйцеклетки могла деконденсировать головку спермия, и для того, чтобы из нее формировался мужской пронуклеус. Не исключено, что эти белки принимают участие и в преобразованиях цитоскелета, вовлекающихся в асимметрическую цитотомию, из-за которой образуется второе полярное тельце, а также в передвижениях пронуклеусов по цитоплазме зиготы от периферических районов к ее центру. Эти предположения нуждаются в фактических доказательствах, хотя ряд данных говорят в их пользу. Программа оплодотворения инициируется при пенетрации яйцеклетки спермием, и она накладывается на программу ооцита. Поэтому ряд полипептидов появляется как в оплодотворенных яйцеклетках, так и в перезревающих, не активированных яйцеклетках. Некоторые полипептиды непосредственно зависят от оплодотворения, т. е. паттерны их синтеза резко изменяются именно из-за оплодотворения. Считают, что эти полипептиды непосредственно вовлекаются в инициацию эмбрионального развития, запуская биологические часы первого клеточного цикла. Возможно, что эти полипептиды инициируют синтез ДНК в пронуклеусах, а также принимают участие в реорганизации хроматина и активации транскрипции генов зародыша (Bolton et al., 1984). Когда после пенетрации спермием яйцеклетки пускается в ход программа оплодотворения и появляются эти классы полипептидов, то при этом создаются условия, которые прекращают работу программы ооцита. Это происходит не на одноклеточной стадии, а позже (во второй половине 2-клеточной стадии, см. раздел 3, гл. VIII), однако инициируется в момент оплодотворения. Приведенные выше соображения (Howlett, Bolton, 1985) основаны на изучении изменения профиля синтеза трех, классов полипептидов в одноклеточном зародыше (с молекулярным весом 45 кД, 35 кД, 30 кД). Первый из этих полипептидов является примербм работы только программы ооцита, т. е. его синтез сохраняется лишь на протяжении первых двух часов после оплодотворения. Два другие класса полипептидов синтезируются как в оогенезе, так и в одноклеточном зародыше, хотя интенсивность их синтеза на протяжении одноклеточной стадии существенно изменяется. Авторы сопоставляют морфологические преобразования на различных фазах первого клеточного цикла и изменения профиля синтеза этих трех' классов полипептидов. Один класс полипептидов не зависит от оплодотворения, другой класс полипептидов синтезируется более ускоренно после оплодотворения, хотя эти белки синтезировались и ранее в неактивированной яйцеклетке. Синтез третьего класса полипептидов зависит от оплодотворения и появляется только после активации яйцеклетки. Полагают, что эндогенная программа ооцита принимает участие в регуляции тех функций, которые необходимы для сохранения жизнеспособности яйцеклетки, а эндогенная программа, запускаемая в яйцеклетке при ее оплодотворении или актива- 10 А. П. Дыбан
J 46 Часть вторая. Ранний эмбриогенез млекопитающих ции, обеспечивает начало эмбриогенеза. Таким образом, овулировавшую яйцеклетку млекопитающих можно расценивать как заранее запрограммированную, высокоспециализированную клетку, которая готова к запуску посттранскрипционного механизма, контролирующего развитие вплоть до начала 2-клеточной стадии (Howlett, Bolton, 1985). Эта гипотеза кажется весьма привлекательной в связи с тем, что она доступна экспериментальной проверке и может быть положена в основу дальнейших исследований начального эмбриогенеза млекопитающих. Глава VIII ДРОБЛЕНИЕ После завершения первого цикла начинается дробление, т. е. разделение зиготы на бластомеры. Для дробления зародышей млекопитающих характерен ряд особенностей, наиболее четко проявляющихся при формировании морулы и образовании бластоцисты. Рассмотрим основные особенности дробления зародышей млекопитающих, а затем остановимся на каждом из клеточных циклов, обращая внимание на основные процессы, осуществляющиеся на данных стадиях развития. VIII.1. ТИП ДРОБЛЕНИЯ ЯЙЦЕКЛЕТОК И РОЛЬ ООПЛАЗМАТИЧЕСКОЙ СЕГРЕГАЦИИ В НАЧАЛЬНОМ РАЗВИТИИ МЛЕКОПИТАЮЩИХ Яйцеклетки млекопитающих относятся к изолецитальному типу, они содержат мало желточных включений, равномерно распределенных по цитоплазме, и осуществляют полное (голобластическое) дробление. Яйцеклетки млекопитающих делятся на бластомеры, размеры которых в ходе каждого деления дробления уменьшаются. Для млекопитающих характерно и суммарное уменьшение объема всех бластомеров. Так, в ходе дробления объем зародыша мыши уменьшается на 25%, зародыша коровы — на 20%, а зародыша овцы — на 40 % (McLaren, 1982). Таким образом, при дроблении бластомеры утрачивают какие-то вещества и эти потери не компенсируются синтезом новых белков. Остается невыясненным, связано ли это с изменением степени обводнения цитоплазмы либо с расходом желточных, липидных и других включений. В яйцеклетках многих видов животных отмечается стабильная дифференциация цитоплазмы, т. е. в яйцеклетках заметны районы, отличающиеся по количеству желточных и пигментных включений, распределению органоидов и др. При дроблении одни бластометры получают цитоплазму от одних, а другие от других зон яйца, т. е. в результате ооплазматической сегрегации ядра бластометров попадают в окружение цитоплазмы, обладающей различными свойствами, и в том числе различными морфогенетическими факторами, действие которых на ядра являются основным пусковым механизмом цито- дифференцировки в начальном эмбриогенезе животных (Gurdon, 1974; Davidson, 1976). Приложимы ли эти представления к дроблению яйцеклеток млекопитающих? Уже давно исходя из цитохимических исследований была сформулирована
VIII. Дробление 147 гипотеза о полярной и билатеральной дифференцировке цитоплазмы ооцитов крыс, возникающей еще в периоде их роста и созревания, причем в зрелой яйцеклетке крысы была описана базофильная (дорсальная) и вакуолизирован- ная (вентральная) зоны и высказано предположение, что из бластомеров, получивших цитоплазму базофильной зоны яйца, развивается эмбриобласт (внутренняя клеточная масса), а из бластомеров, получивших цитоплазму вакуолизированной зоны яйцеклетки, — трофобласт (Dalcq, 1957; Mulnard, 1967; см. также: Пожидаев, 1960, 1967). Эта гипотеза не подтвердилась, так как, во-первых, все бластомеры вплоть до поздней морулы сохраняют полипотентность и могут образовывать как трофобласт, так и эмбриобласт и, во-вторых, оказалось, что модусы развития бластомеров зависят от их расположения в моруле (Tarkowski, Wroblewska, 1967; Tarkowski, 1970), а отнюдь не от цитоплазмы, унаследованной от яйцеклетки. Те бластомеры, которые будут располагаться в наружных слоях морулы, образуют трофэктодерму, а из находящихся внутри бластомеров возникает внутренняя клеточная масса. Эта гипотеза (Tarkowski, 1970) получила название «снаружи — внутри», так как если изменить месторасположение бластомеров, изменится и путь их развития, т. е. из бывших «наружных» бластомеров образуется эмбриобласт, а из бывших «внутренних» бластомеров — трофэктодерма. Однако несмотря на то, что организация раннего зародыша лабильна и характеризуется высокой регуляторной способностью, а бластомеры ранних зародышей сохраняют полипотентность, тем не менее и у млекопитающих проявляются последствия ооплазматической сегрегации, хотя не в столь заметной форме, как при дроблении зародышей других видов. Оценивая возникновение позиционной информации в'доимплантационном зародыше мыши, было обращено внимание на асимметриченность ооцита, асимметричность при оплодотворении и асимметричность при дроблении. Не- оплодотворенные ооциты во время заключительных фаз внутрифолликулярного созревания становятся морфологически поляризованными (Nicosia et al., 1977). После овуляции в яйцеклетке мейотическое веретено метафазы II располагается эксцентрично в одном из полюсов, вытесняя клеточные органеллы (особенно кортикальные гранулы) из этого полюса (Nicosia et al., 1977). Плазматическая мембрана, покрывающая этот полюс ооцита, лишена микроворсинок (Eager et al., 1976) и содержит мало рецепторов к конковалину А (Johnson et al., 1975). Таким образом, овулировавшая яйцеклетка мышей и других млекопитающих имеет асимметричную организацию (см. разделы 1, 4, гл. VI). Однако когда происходит выделение второго полярного тельца, борозда проходит на границе гладкой области и области, богатой микроворсинками (Eager et al., 1976). В результате яйцеклетка теряет плазматическую мембрану, лишенную микроворсинок, т. е. оплодотворенная в яйце клетка перестает быть асимметричной. При оплодотворении спермий может сливаться с плазматической мембраной яйцеклетки в любом ее месте, если этот район содержит большое количество микроворсинок. При слиянии спермия с яйцеклеткой вскоре этот район теряет микроворсинки и образует выпячивание (так называемый конус оплодотворения). Механизм этого процесса рассмотрен в разделе 2 гл. VI. В этом районе в плазматической мембране яйцеклетки сохраняются компоненты плазматической мембраны спермия, причем они не диффундируют по плазматической мембране, а остаются в виде локализованного участка (Gabel et al., 1979). Измерение способности свободной диффузии как липидов, так и гликопро- теинов плазматической мембраны оплодотворенной яйцеклетки мыши показало, что в месте проникновения спермия мембрана менее мобильна. Мембрана ю*
148 Часть вторая. Ранний эмбриогенез млекопитающих восстанавливает «текучесть» через 12—15 ч после оплодотворения и на протяжении последующих дроблений, однако мембранные компоненты спермия выявляются как локальный очаг в плазматических мембранах бластомеров (Gabel et al., 1979). Таким образом, есть основание думать, что возникшая при оплодотворении асимметричность плазматической мембраны, обусловленная ее изменениями в месте проникновения спермия, отражается не только на первом, но и на последующих делениях (см. ниже). Первая борозда дробления меридиональна и симметрична и делит зиготу на два бластомера, имеющие одинаковые размеры. Однако первые бластомеры не состоят из идентичной цитоплазмы и, по-видимому, содержат разное количество каких-то морфогенетических факторов. В пользу этой гипотезы свидетельствует ряд фактов. Так, во второе деление дробления один из первых бластомеров всегда вступает раньше, чем другой бластомер. Эти различия закономерны, они отмечены при дроблении зародышей мышей разного генотипа, и хотя эти колебания составляют минуты B0—60 мин), однако они сказываются на потомках бластомеров (Graham, Lehtonen, 1979). Описаны и другие признаки различий первых бластомеров зародышей мышей. Эти бластомеры имеют неодинаковый сухой вес, особенно во время интерфазы (Abramczuk, Sawicki, 1974). Синтез рибосомальной РНК в ядрышках первых двух бластомеров происходит в разное время, и есть сведения о том, что продолжительность фазы синтеза ДНК в ядрах первых бластомеров не одинакова (Luthardt, Donahue, 1973). Как указывалось выше, мембранные антигены спермия выявляются в плазматической мембране яйца, однако эти компоненты мембран спермия заметны в форме дискретной полоски не в каждом, а лишь в одном из первых двух бластомеров. Мембранные компоненты спермия сохраняются в плазматической мембране у потомков данного бластомера вплоть до 8-клеточной стадии (Gabel et al., 1979). Было проведено изучение мобильности цитоплазмы в одноклеточном зародыше мыши от момента оплодотворения и до первого деления дробления, используя для этого микроинъекцию коллоидных частиц золота. Обнаружено, что цитоплазма перемещалась только в центральных районах зиготы, где частицы золота дислоцировались центрипетально. Цитоплазма полярных областей была маломобильна. Если ввести частицы золота в одну половину зиготы, то во время цитокинеза они не пересекают вертикальную ось, что говорит о пассивном перераспределении цитоплазматических территорий яйца между первыми бластомерами. Следовательно, каждый из первых двух бластомеров содержал цитоплазму зиготы, которая не смешивалась в цитокинезе, хотя в яйцеклетке найдены более мобильные центральные районы и немобильные полярные области (Karasiewicz, Modlinski, 1985). Эти данные дают основание думать, что неравномерная сегрегация каких-то,цитоплазматических факторов зиготы обусловливает более раннее деление одного из первых двух бластомеров зародышей мышей (Spindle, 1982). Предполагается также, что первым вступает в деление (второе деление дробления) тот бластомер, в плазматической мембране которого находятся антигены, а в цитоплазме — хвост спермия (Bennett, 1982). У зародышей кроликов также замечена асинхронность второго деления, т. е. в это деление бластомеры вступают с разрывом на 15—30 мин (Gulyas, 1975). Таким образом, асинхронность второго деления дробления характерна не только для зародышей мышей, но и зародышей кроликов. Остается невыясненным, в какой степени это явление присуще дроблению других видов млекопитающих.
VIII. Дробление 149 Плоскость второго деления дробления у зародышей мышей проходит перпендикулярно первой плоскости, располагаясь экваториально (т. е. в горизонтальном положении). Прижизненные наблюдения показали, что плоскость второго деления у зародышей мышей поворачивается по отношению к полярной оси (Graham, Deussen, 1978). Еще более четко этот вопрос плоскостей дробления отмечается у зародышей кролика. Первая борозда дробления проходит в меридиональной плоскости через анимальный и вегетативный полюса и разделяет зиготу на два бластомера. В том бластомере, который первым вступает во второе деление, плоскость дробления перпендикулярна полярной оси, а плоскость деления второго бластомера не только перпендикулярна полярной оси, но и располагается под углом к плоскости деления первого бластомера. На 4-клеточной стадии бластомеры располагаются крест-накрест. Это распределение бластомеров является следствием поворота полярной оси на 90° в одной половине (гемисфере) яйца, из-за чего плоскость третьего деления в одной половине перпендикулярна плоскости третьего деления в другой половине яйца. На основании этих наблюдений сделан вывод, что у млекопитающих осуществляется своеобразный тип дробления, отличающийся от радиального, спирального или билатерального типов дробления яйцеклеток других животных. Этот тип дробления, присущий яйцеклеткам млекопитающих, предложено назвать ротативным (чередующимся или вращающимся — от англ. rotational) (Gulyas, 1975). Необходимы дальнейшие исследования с использованием прижизненной цайтраферной микрокиносъемки дробящихся яйцеклеток различных видов млекопитающих для того, чтобы определить, сколь обоснованно это предложение. Наиболее трудным в этих исследованиях является определение анималь- ного и вегетативного полюсов яйца, так как хотя полярные тельца и служат четким ориентиром, однако существуют сведения о том, что они могут передвигаться по перивителлиновому пространству во время первых делений дробления (Mulnard, 1967). Этот вопрос нуждается в специальном изучении при использовании более современных методов культивирования яйцеклеток in vitro. Для дробления млекопитающих характерно не только чередование плоскостей дробления и асинхронность деления первых и последующих бластомеров, но и значительно большая продолжи