Studies in Analytical Chemistry 5

Quantitative Analysis
of Steroids

S. Gorog

Head of Department, Chemical Works G. Richter Ltd.,
Honorary Professor of Pharmacy, Semmelweis University
Medical School, Budapest, Hungary

Akademiai Ki ado, Budapest 1983
Ш. ГЁРЁГ

КОЛИЧЕСТВЕННЫЙ

АНАЛИЗ
СТЕРОИДОВ

Перевод с английского
канд. хим. наук Е. Н. Дороховой
и канд. хим. наук Г. В. Прохоровой

под редакцией
чл.-корр. АН СССР, проф. И. В. Торгова
и д-ра хим. наук, проф. В. Г. Березкина

МОСКВА «МИР» 1985
ББК 24.4
Г37

УДК 543:547.92

Гёрёг Ш.

Г37 Количественный анализ стероидов: Пер. с англ.— М.:
Мир, 1985.— 504 с., ил.

Книга из серии изданий по аналитической органической химии, написан-
ная известным венгерским ученым, крупным специалистом в этой области, по-
священа анализу стероидов — соединений, играющих важную роль в процессах,
протекающих в живом мире. Эта область химии имеет существенное значение
для развития фармацевтической химии и фармацевтической промышленности,
для быстрой диагностики ряда заболеваний и при их лечении.

Для специалистов в области химии природных соединений, для фармацев-
тов и медиков.

Г

1804000000-485

041(01)-85

92-85, ч. 1

ББК 24.4

543

Редакция литературы по химии

© Akademiai Kiado, Budapest 1983

© перевод на русский язык, «Мир», 1985
Стероиды — обширный класс органических соединений, зна-
чение которых в биохимии, медицине, фармацевтической про-
мышленности и ряде других областей особенно возросло за по-
следние десятилетия. Этому в немалой степени способствовали
успехи аналитической химии. «Наука движется толчками, в за-
висимости от успехов, делаемых методикой,— отмечал великий
русский ученый И. П. Павлов,— с каждым шагом методики
вперед мы как бы поднимаемся ступенью выше, с которой от-
крывается нам более широкий горизонт с невидимыми раньше
предметами».

Специалист по биохимическому анализу или по анализу ле-
карственных препаратов, как правило, должен давать одновре-
менно ответ на два вопроса, а именно: присутствует ли данное
соединение в анализируемой пробе и в какой концентрации.
Следовательно, аналитикам предстояло решить очень трудные
задачи, поскольку стероиды одни из самых сложных по строе-
нию (а иногда и лабильных) соединений, обладающие значи-
тельной реакционной активностью, а также близкими физиче-
скими и химическими свойствами у многих представителей
этого класса. Трудность заключалась не только в разработке
метода определения сложных соединений в сложных по со-
ставу объектах, но и в том, что концентрации этих соединений
зачастую чрезвычайно низки. Таким образом, ясно, что коли-
чественный анализ стероидов в разнообразных объектах —
чрезвычайно сложная и практически важная область, имеющая
свои особенности. Ей посвящена обширнейшая литература:
только в данной книге библиография превышает 2,5 тыс. на-
именований, а это далеко не все, что опубликовано в мире.

Необходимо отметить, что в анализе стероидов находят при-
менение самые различные аналитические методы: хроматогра-
фические (включая газовую, жидкостную, колоночную и тон-
кослойную хроматографию), спектральные, электрохимические,
иммунохимические и традиционные (весовые и титриметриче-
ские). Из всего нами сказанного вытекает, что перед автором
книги проф. Ш. Гёрёгом — известным венгерским ученым в об-
ласти аналитической и физической химии биологически актив-
ных соединений — стояла на редкость сложная задача, и при-
ятно признать, что он вполне с ней справился, творчески обоб-
щив огромный опыт, накопленный сотнями исследователей.
Отметим, что монография Ш. Гёрёга является одной из
первых в мировой литературе, где с единых позиций рассмот-
рены все аспекты количественного анализа стероидов. Книгу
отличает критический характер изложения: автор не только
систематизирует известный материал, но (и это, по-видимому,
главное) и критически его оценивает и творчески обобщает.
Вообще монография написана по хорошо продуманному плану,
а ее отдельные разделы содержат четкие рекомендации по
преимущественному применению того или иного метода в за-
висимости от объекта исследований и задачи определения. Она
содержит многочисленные таблицы, которые служат удобным
справочным материалом.

Рассматривая перспективы развития аналитической химии
стероидов, нам хотелось бы подчеркнуть важную роль гибрид-
ных методов, в которых первыми выступают методы разделе-
ния, в особенности хроматографические. Особый интерес пред-
ставляет использование высокоэффективной хроматографии на
кварцевых колонках с привитыми неподвижными жидкими фа-
зами, а также применение тонкослойной хроматографии, в том
числе метода с принудительным потоком подвижной фазы под
давлением и цилиндрической хроматографии на стержнях с по-
следующим сканированием полученных хроматограмм пла-
менно-ионизационным детектором.

Книга профессора Гёрёга, по нашему мнению, несомненно
будет стимулировать дальнейшее развитие количественных ме-
тодов анализа стероидов в наиболее перспективных направ-
лениях.

И. В. Торгов

В. Г. Березкин
ПРЕДИСЛОВИЕ К РУССКОМУ ИЗДАНИЮ

С большой радостью я воспринял предложение издательства
«Мир» о переводе на русский язык моей книги «Количествен-
ный анализ стероидов», которое я рассматриваю как большую
честь для себя. Приятно сознавать, что теперь мой труд найдет
путь к тысячам советских специалистов, занимающихся дан-
ным предметом. Я надеюсь, что книга будет полезна моим
новым читателям в их работе в биохимических, клинических,
фармацевтических и заводских лабораториях в разных уголках
Советского Союза.

В моей монографии проанализирована литература вплоть
до 1982 г., и поэтому читатель может получить достаточно пол-
ное представление о современном состоянии этой стремительно
развивающейся области.

Мне хотелось бы выразить искреннюю благодарность кан-
дидатам хим. наук Е. Н. Дороховой и Г. В. Прохоровой за
квалифицированный перевод книги на русский язык; я очень
признателен также глубокоуважаемому профессору И. В. Тор-
гову и моему коллеге и другу профессору В. Г. Березкину за
тщательную работу по редактированию рукописи.

Будапешт, июль 1984	Ш. Гёрёг
Пять лет спустя после выхода в свет нашей книги «Анализ
стероидных гормональных препаратов» (S. Gorog, Gy. Szasz,
Akademiai Kiado, Budapest—Elsevier, Amsterdam, 1978) я напи-
сал еще одну книгу об анализе стероидов. Она охватывает бо-
лее широкий круг вопросов, нежели предыдущая, которая была
почти целиком посвящена фармацевтическим аспектам анали-
тической химии стероидных гормонов.

Помимо гормонов в настоящей книге рассматривается оп-
ределение других важных групп стероидов (стеринов, витами-
нов D, желчных кислот, сердечных гликозидов, сапогенинов
и др.), но главная ее особенность заключается в том, что в ней
нашли отражение проблемы биоклинического анализа. Следует
отметить, что в книге обсуждаются только вопросы количест-
венного определения, а задачи, связанные с идентификацией и
установлением структуры, исключены.

Работая над первой книгой, я понял, что различные аспекты
анализа стероидов более взаимосвязаны, чем я раньше пред-
полагал, и выделение только области анализа лекарственных
препаратов во многих случаях представляется искусственным.
Некоторые рецензенты первой книги, оказывается, придержива-
лись того же мнения, упрекая нас в пренебрежении стандарт-
ными биоклиническими методами. Это была одна из причин,
побудивших меня написать новую книгу, в которую пришлось
внести существенные изменения в связи с тем, что в настоя-
щее время еще нет издания, в котором была бы сделана по-
пытка обобщить все методы и сформулировать задачи как био-
клинического, так и серийного анализа продукции фармацевти-
ческой промышленности, выпускающей стероиды. Своей книгой
я пытался заполнить этот пробел, однако подробное рассмот-
рение столь обширной области в одной книге, конечно, невоз-
можно, поэтому она не претендует на большее, нежели обзор
современного состояния аналитической химии стероидов. Более
детальное обсуждение читатель может найти в специальных
монографиях и примерно в 2500 ссылках на литературу. Более
подробно содержание книги обсуждается в разд. 1.3.

Предполагается, что читатель этой книги знаком с осно-
вами химии стероидов и принципами методов, используемых
для их анализа. Поэтому химия стероидов различных классов
обсуждается лишь кратко в начале каждой главы и излага-
ются только существенные особенности используемых анали-
тических методов, если они упоминаются впервые (главным
образом в гл. 2).

Материал книги расположен в соответствии с основными
классами стероидов: отдельные главы посвящены анализу по-
ловых гормонов, кортикостероидов, стеринов, витаминов D,
желчных кислот, сердечных гликозидов, сапогенинов и разных
других стероидов. Так же построена каждая глава: в первом
разделе кратко излагаются основы химии рассматриваемых
групп стероидов, во втором — даются подробные указания
к применению спектроскопических, хроматографических и дру-
гих методов, а в третьем разделе излагаются основные про-
блемы, возникающие при анализе тех же групп стероидов, и
пути их решения при помощи методов, описанных во втором.
Такое расположение материала облегчает пользование книгой
тем читателям, которые в большей степени интересуются ме-
тодами, а не проблемами анализа, и наоборот. Такой порядок
изложения, несомненно, приводит к повторам, однако я ста-
рался свести этот недостаток к минимуму.

Я надеюсь, что книга будет полезна читателям, занимаю-
щимся определениями стероидов в биологических, клинических,
промышленных и фармацевтических объектах.

Будапешт, сентябрь 1982	Ш. Гёрёг
I

ВВЕДЕНИЕ

1.1.	ПРОБЛЕМЫ И ТЕНДЕНЦИИ РАЗВИТИЯ

СОВРЕМЕННОЙ АНАЛИТИЧЕСКОЙ ХИМИИ СТЕРОИДОВ

В настоящее время можно выделить три направления раз-
вития аналитической химии стероидов:

а)	определение стероидов в биологических (клинических)
объектах;

б)	анализ лекарственных препаратов и промежуточных про-
дуктов их производства (контроль продукции фармацевтиче-
ской промышленности);

в)	теоретические и практические аспекты структурной химии
стероидов.

В классический период развития аналитической химии сте-
роидов (около 30 лет назад или даже несколько раньше) эти
направления не были разграничены столь четко, как сейчас:
часто в них использовались одни и те же или сходные методы.
С тех пор каждое направление развивалось разными путями,
и в настоящее время в большинстве случаев их можно рас-
сматривать как самостоятельные области со своими пробле-
мами и методами. Даже если во всех трех областях использу-
ется один и тот же метод, подход к нему до некоторой степени
отличается. Это можно проиллюстрировать на примере метода
газовой хроматографии. Главным направлением в развитии био-
клинического анализа было внедрение высокочувствительных
(детектор электронного захвата, ДЭЗ) методов с высокой раз-
решающей способностью, позволяющих разделить и определить
(с. помощью капиллярных колонок) 20—30 стероидов. В серий-
ном фармацевтическом анализе стероидов обычно используются
пламенно-ионизационный детектор и насадочные колонки, од-
нако если здесь основное внимание обращается на правиль-
ность и воспроизводимость метода, то при установлении струк-
туры компонентов сложной смеси стероидов методом газовой
хроматографии хроматографирование лишь предшествует непо-
средственному масс-спектрометрическому исследованию.

Далее сделана попытка выделить и обсудить основные тен-
денции в современном анализе стероидов.

Существенно возросли требования к избирательности ме-
тодов. С этой позиции рассмотрены многие используемые
раньше стандартные методы, и селективность их признана не-
достаточно высокой. Далее, можно утверждать, что возможно-
сти повышения избирательности за счет новых химических ре-
акций, селективных с классической точки зрения, почти исчер-
паны. Однако чрезвычайно высокая избирательность фермента-
тивных реакций и реакций связывания белка (особенно им-
мунных) открыла новые перспективы повышения селективно-
сти анализа.

Другой путь повышения избирательности заключается в ши-
роком использовании хроматографических методов. С введе-
нием высокоэффективной жидкостной хроматографии значение
классической газовой хроматографии несколько снизилось, но
это компенсировалось широким распространением высокоиз-
бирательных и чувствительных методов капиллярной хромато-
графии и разнообразных методов, основанных на сочетании
газовой хроматографии и масс-спектрометрии (ГХ—МС). Пока
пути повышения селективности хроматографических методов не
будут переведены с эмпирической на теоретическую основу,
установление соотношения между структурой стероидов и их
подвижностью при хроматографии останется важной задачей
аналитических исследований. Это справедливо не только для
газовой хроматографии и высокоэффективной жидкостной
хроматографии (ВЭЖХ), но также для колоночной и тонко-
слойной хроматографии, применение которых перед количест-
венным определением может значительно повысить избиратель-
ность ВЭЖХ.

Упомянув о сочетании аналитических методов, мы тем са-
мым затронули другой важный вопрос, касающийся времени и
оборудования, необходимых для работы разными методами.
При определении микрокомпонентов в сложных биологических
объектах очень часто приходится пользоваться чрезвычайно
длительными и трудоемкими методиками, включающими много-
кратное разделение методами колоночной и (или) тонкослой-
ной хроматографии или несколько стадий очистки. Однако ос-
новная тенденция направлена на сокращение времени подго-
товки пробы путем применения по возможности селективных
методов. В качестве примера можно упомянуть о развитии
тех радиоиммунных методов анализа, в которых благодаря
повышенной избирательности антисывороток удалось исключить
предварительное хроматографирование. Одним из главных на-
правлений в серийном анализе стероидов является автоматиза-
ция сложных аналитических процессов с тем, чтобы удовлет-
ворить постоянно растущую потребность в увеличении числа
анализов в клинических условиях и в расшифровке формул
стероидов. Для достижения более высокой избирательности и
повышения надежности обычно приходится прибегать к усло-
жнению и удорожанию методов. Поэтому здесь следует соблю-
дать известный компромисс, характер которого определяется
поставленной задачей. Например, при серийных определениях
стероидов в моче или плазме во многих случаях после одной
экстракции растворителем (или часто даже минуя эту про-
цедуру) можно применять быстрые методы, дающие ценные
данные для диагностики, дажё если известно, что эти данные
завышены из-за недостаточной специфичности метода. Однако,
если требуется знать точное содержание стероидов, следует
провести более сложную подготовку пробы.

Другое важное требование, которое следует принимать во
внимание при разработке избирательных методик анализа сте-
роидов,— это чувствительность метода. При контроле продук-
тов фармацевтической промышленности требования к чувстви-
тельности определения стероидов, как правило, не очень вы-
соки: можно пользоваться даже наименее чувствительными
спектрофотометрическими и колориметрическими методами.
В некоторых случаях (например, при определении эстрогенов
в противозачаточных таблетках, фторкортикоидов в мазях, сле-
довых количеств примесей в выпускаемых промышленностью
стероидах и т. д.) нужны более чувствительные методы —
флуориметрия, газовая хроматография, высокоэффективная
жидкостная хроматография и т. п., но следует заметить, что
даже для таких целей достаточно чувствительности пламенно-
ионизационного детектора.

Что же касается биоклинического анализа, то для решения
большинства задач, и особенно для определения метаболитов
в моче, когда в анализируемой пробе содержатся микрограм-
мовые или даже нанограммовые количества стероидов, доста-
точно указанной выше чувствительности. Однако во многих слу-
чаях, и в первую очередь при определении активности гормо-
нов в крови, где в сравнительно небольшом объеме пробы со-
держатся пикограммовые количества стероидов, необходимы
более чувствительные методы, например радиоиммуноанализ, га-
зовая хроматография с детектором электронного захвата или
масс-фрагментография.

1.2.	ЛИТЕРАТУРА ПО АНАЛИТИЧЕСКОЙ ХИМИИ

СТЕРОИДОВ

Синтетической органической химии, теоретическим, биохи-
мическим и другим аспектам химии стероидов посвящено боль-
шое число книг, знакомство с которыми очень полезно даже
для тех, кто интересуется только анализом стероидов. Клас-
сический труд «Стероиды» М. Физер и Л. Физера [6] до сих
пор остается источником фундаментальных представлений о хи-
мии стероидов. Из других книг по химии стероидов, охваты-
вающих основные реакции стероидов и, кроме того, представ-
ляющих аналитический интерес, в первую очередь можно реко-
мендовать «Реакции стероидов» и «Органические реакции в хи-
мии стероидов» под редакцией соответственно Дьераши [4]
и Фрида и Эдвардса [7], а также «Механизмы реакций сте-
роидов» Кирка и Хартшорна [13], в которой рассматриваются
теоретические аспекты, и серию «Терпеноиды и стероиды» под
редакцией Овертона [15], посвященную современному разви-
тию химии стероидов.

Среди большого числа книг по биохимии и фармакологии
фундаментальное значение имеют «Биохимия стероидов» Хефт-
манна [9] и «Биохимия и фармакология стероидов» Бриггса
и Бразертона [2].

Много книг посвящено аналитической химии стероидов. «Фи-
зические свойства стероидных гормонов» под редакцией Энгеля
[5] и «Хроматография стероидов» Нейера [14] являются важ-
ными классическими литературными источниками, а «Колори-
метрический и флуориметрический анализ стероидов» Бартоша
и Пезе [1] и «Хроматография стероидов» Хефтманна [11] ох-
ватывают литературу по соответствующим областям вплоть до
1976 г. Монографии «Анализ стероидных гормонов» под ре-
дакцией Карстенсена [3], «Современные методы анализа сте-
роидов» под редакцией Хефтманна [10] и «Успехи аналитиче-
ской химии стероидов» под редакцией Гёрёга [8а] посвящены
избранным разделам структурной химии и биомедицинскому
анализу стероидов.

Единственными монографиями, цель которых дать общую
картину состояния биоклинического и фармацевтического ана-
лиза стероидов, до сих пор остаются соответственно класси-
ческая книга «Анализ стероидных гормонов» под редакцией
Джэйла [12] и недавно опубликованный «Анализ стероидных
гормональных препаратов» Гёрёга и Шаца [8].

В дополнение к этим представляющим общий интерес рабо-
там во введениях к отдельным главам и разделам настоящей
книги приведены ссылки на несколько трудов и отдельных глав
из книг, посвященных более узким областям аналитической
методологии или анализу отдельных групп стероидов.

Ниже обсуждается информация, полученная из различных
научных журналов. Обзор литературы по анализу стероидов —
нелегкое дело по нескольким причинам. К ним относятся, во-
первых, большое число публикаций, так как в последние годы
ежегодно выходит около 300—400 статей, посвященных непо-
средственно анализу стероидов, и примерно такое же количе-
ство работ, не относящихся к анализу стероидов, но содержа-
щих важную информацию по аналитической мётодологии и
результатам, и, во-вторых, то, что подавляющее большинство
статей опубликовано не в аналитических журналах, а разбро-
сано по многочисленным другим журналам.
Время от времени в основных аналитических журналах
(Analytical Chemistry, The Analyst, Analytica Chimica Acta, Zeit-
schrift fur analytische Chemie и Analytical Letters) публикуются
статьи общего характера. В качестве важнейшего литератур-
ного источника по фармацевтическому анализу стероидов мо-
жно указать журнал Journal of Pharmaceutical Sciences, по-
лезную информацию можно также получить в перечисленных
выше журналах и в Journal of the Association of Official Ana-
lytical Chemists, Chemical and Pharmaceutical Bulletin (Токио),
Annales Pharmaceutiques Francaises, Die Pharmazie и др.

Очень важное значение имеет журнал Journal of Chromato-
graphy, в котором публикуются статьи по всем вопросам ана-
лиза стероидов с использованием хроматографических методов.
Ценную информацию можно получить также в журналах Jour-
nal of Chromatographic Sciences и Chromatographia.

Наиболее ценная информация по биохимическому анализу
стероидов публикуется в журналах Steroids, Journal of Steroid
Biochemistry, Analytical Biochemistry, Biochemical Journal и
Journal of Biological Chemistry. Эндокринологические и клиниче-
ские аспекты анализа стероидов рассматриваются в основном
в журналах Journal of Endocrinology, Acta Endocrinologica,
Clinical Chemistry, Clinica Chimica Acta и др. Аналитические
статьи, посвященные отдельным группам стероидов, можно
найти в специальных журналах, например Lipids и Journal of
Lipid Research, которые публикуют работы по стеринам, желч-
ным кислотам и т. п.

1.3.	СОДЕРЖАНИЕ КНИГИ

Цель этой книги — дать обзор методов количественного оп-
ределения стероидов, обратив особое внимание на достижения
последнего десятилетия. Поэтому в книге не рассматриваются
вопросы, связанные с установлением структуры стероидов, а. ме-
тоды, используемые главным образом для определения струк-
туры, например ИК-спектроскопия и ЯМР, а также масс-спек?
трометрия, обсуждаются только в аспекте аналитического при-
менения. Хроматография также рассматривается только с точки
зрения применения в количественном анализе, при этом обра-
щается внимание на те методы, которые позволяют непосредст-
венно получить результаты: газовую хроматографию, высоко-
эффективную жидкостную хроматографию и тонкослойную ден-
ситометрию. Очень кратко обсуждаются теоретические и прак-
тические аспекты хроматографических методов разделения
(связь удерживания при хроматографировании со структурой
и составом растворителя, методы качественного детектирова-
ния): колоночная и тонкослойная хроматография рассматри-
ваются как подготовительные этапы для последующего количе-
ственного анализа.

Основной упор делается на обзор методов количественного
определения всех важных групп стероидов. Из аналитических
методов — классических, спектроскопических, хроматографи-
ческих и радиоаналитических — обсуждаются только те, кото-
рые имеют наибольшее значение; биологические и некоторые
слишком специальные биохимические методы исключены.

Из практических задач выделены две основные: определение
стероидов в биологических объектах и анализ продукции фар-
мацевтической промышленности. Последнему вопросу в книге
уделяется более пристальное внимание, чем в имеющейся лите-
ратуре, поскольку автор обладает гораздо большим личным
опытом в области анализа лекарственных веществ.

Большинство работ, которые легли в основу книги, опубли-
кованы в последние десять, лет. За исключением нескольких ме-
тодов, имеющих особое значение, более старые методы упоми-
наются лишь кратко, в основном в таблицах. Вследствие этого
большинство ранних публикаций было исключено и в основу
отбора положен принцип приводить лишь те работы, в которых
описаны усовершенствованные методики, все еще находящие
применение, или (в ряде исключительных случаев) работы, ко-
торые послужили важными вехами в развитии аналитической
химии стероидов.

Еще труднее было отобрать публикации из числа вышедших
в последние десять лет, поскольку объем книги не позволяет
полностью включить литературу даже этого периода. Особенно
трудно б^>1ло сделать выбор в тех случаях, когда за короткий
отрезок времени по какой-либо одной проблеме было опублико-
вано большое число зачастую очень сходных методик. Несмотря
на все старания автора отобрать наиболее важные и современ-
ные работы, полностью избежать субъективности ему, по-види-
мому, не удалось.

Рамки настоящей книги позволили лишь только наметить
возможности применения различных аналитических методов для
определения стероидов, а также дать лишь общий подход к ре-
шению основных задач анализа стероидов; таким образом, ее
нельзя рассматривать в качестве лабораторного руководства.
В ней не приводятся аналитические методики, за исключением
кратких описаний в ограниченном числе случаев, которые, мо-
жно надеяться, помогут читателю получить общую картину воз-
можностей различных методов. Во всех случаях, когда необхо-
димо воспроизвести цитируемые методики, следует обращаться
к оригинальным работам.
ЛИТЕРАТУРА

1.	Bartos J., Pesez M. Colorimetric and Fluorimetric Analysis of Steroids.
Academic Press, London, New York, San Francisco, 1976.

2.	Briggs M. H„ Brotherton V. Steroid Biochemistry and Pharmacology. Aca-
demic Press, London, New York, 1970.

3.	Carstensen H. (Editor Steroid Hormone Analysis. Marcel Dekker, New
York, 1967.

4.	Djerassi C. (Editor). Steroid Reactions. Holden-Day, San-Francisco, 1963.

5.	Engel L. L. (Editor). Physical Properties of the Steroid Hormones. Per-
gamon Press, Oxford, London, New York, Paris, 1963.

6.	Физер Л., Физер M. Стероиды.— М.: Мир, 1964.

7.	Fried J., Edwards J. A. (Editors). Organic Reactions in Steroid Chemistry.
Van Nostrand Reinhold, New York, 1972.

8.	Gorog S,, Szasz Gy, Analysis of Steroid Hormone Drugs. Akademiai
Kiado, Budapest, Elsevier, Amsterdam, 1978.

8a. Gorog S. (Editor). Advances in Steroid Analysis. Akademiai Kiado, Buda-
pest, Elsevier, Amsterdam, 1982.

9.	Heftmann E. Steroid Biochemistry. Academic Press, New York, London,
1970.

10.	Heftmann E. (Editor). Modern Methods of Steroid Analysis, Academic
Press, New York, London, 1973.

11.	Heftmann E, Chromatography of Steroids. Elsevier, Amsterdam, Oxford,
New York, 1976.

12.	Jayle M. F. (Editor). Analyse des Steroids Hormonaux. Masson, Paris,
1962.

13.	Kirk D. N„ Hartshorn M. P. Steroid Reaction Mechanisms. Elsevier, Am-
sterdam, London, New York, 1968.

14.	Neher R. Steroid Chromatography. Elsevier, Amsterdam, 2nd Edition,
1964.

15.	Overton К. H. (Editor). Terpenoids and steroids. The Chemical Society,
London, 1971.
2

ПОЛОВЫЕ ГОРМОНЫ И РОДСТВЕННЫЕ
СОЕДИНЕНИЯ

2.1.	ОСНОВЫ ХИМИИ ПОЛОВЫХ ГОРМОНОВ

В этой главе рассматривается анализ половых гормонов,
выделяемых семенниками (андрогены), яичниками (эстрогены)
и желтым телом (Corpus luteum) (гестогены), а также продук-
тов их метаболизма, синтетических стероидных производных и
их аналогов. Кроме того, в ней содержатся сведения по анализу
анаболических стероидов, родственных андрогенам, и некото-
рых синтетических производных, не являющихся половыми гор-
монами, но по структуре очень близких к половым гормонам
(т. е. спиронолактоны).

Эти стероиды можно охарактеризовать по их скелету: андро-
становому (андрогены и некоторые анаболические средства),
эстрановому (эстрогены, содержащие ароматическое кольцо А,
синтетические прогестогены и анаболические средства, 19-нор-
стероиды) или прегнановому (гестогены). Кольца А и В могут
•быть в ^ас-сочленении (5|3-стероиды) или транс-сочленении
(5а-стероиды) однако, как правило, такой вид изомерии не
осуществляется, так как у большинства производных в положе-
нии А4 или А5 имеется двойная связь. В молекулах природных
гормонов кольца В и С, а также С и D находятся в транс-со-
членении.

Наиболее характерными заместителями являются кето-
группы в положении 3 (насыщенные или чаще 4-ен-З-кетогруппы,
а иногда 1,4- или 4,6-диен-З-кетогруппы), 17- и 20-оксигруппы
(свободные или этерифицированные), оксигруппы при С-3, С-11
и С-17, метильные группы при С-6 и С-17, этильная группа при
С-17, двойные связи (А1, А4, А5), ароматическое кольцо А
и т. д.

Стероидные гормоны образуются в организме млекопитаю-
щих в результате ряда ферментативных реакций, в которых ис-
ходным веществом является холестерин. Этот процесс с ука-
занием некоторых основных промежуточных соединений изобра-
жен уравнениями (2.1).

Активные гормоны метаболируются путем насыщения А4-
двойной связи, гидроксилирования, восстановления 3- и 20-кето-
групп, окисления 17-оксигрупп и образования по оксигруппам
водорастворимых конъюгатов, в основном сульфатов и глюку-
ронидов, и в меньшей степени фосфатов.

2 Заказ № 182
Главным андрогенным гормоном является тестостерон,
а его активным метаболитом — 4,5-насыщенное производное,
т. е. 5а-дигидротестостерон. Важные промежуточные продукты
дезактивации — андростерон, эпиандростерон и этиохоланолон —
вместе с дегидроэпиандростероном относятся к 11-дезокси-17-
кетостероидам.

За— ОН—5аН

ЗУ?—ОН—5аН

За—ОН—5£Н

андростерон
эпиандростерон
этиохоланолон

o=s=^o
I
он

сульфат дегидроэпиандростерона

Во избежание быстрой дезактивации путем окисления
17-оксигруппы тестостерон в медицине используется либо
в форме эфира, либо в форме 17а-метильного производного.
В связи с разнообразным применением в медицине следует упо-
мянуть об их влиянии на нарушенное функционирование семен-
ников и раковые образования молочной железы. Они также об-
ладают анаболическим действием, но для медицинских целей
получены синтетические стероиды с высоким соотношением ана-
болической и андрогенной активностей. Некоторые из них, на-
пример метандриол и метандиенон, близки по структуре к при-
родным андрогенам, а другие, например эфиры нандролона,
норэтандролон, этилэстренол и т. п., являются 19-норстероидами.
Главным процессом метаболизма основных эстрогенов
(17£-эстрадиола и эстрона) является гидроксилирование,
обычно по С-16; при этом образуются конъюгаты эстриола
(главным образом эстриол- 16а-глюкуронид), которые в боль-
ших количествах содержатся в моче беременных. Эстрон и
эстрадиол, особенно эфиры последнего, 3-бензоатный, 17-про-
пионатный, 3,17-дипропионатный и т. п., используются при ле-
чении нарушений, связанных с пониженным выделением эстро-
генов яичниками (нарушение менструального цикла, расстрой-
ства менопаузы) и во многих других случаях. Стоит упомянуть,
что смесь конъюгатов стероидов, полученная из мочи жеребых
кобыл, которая помимо перечисленных выше эстрогенов содер-
жит производные с ненасыщенной связью в кольце В, напри-
мер эквилин (7-дегидроэстрон) и эквиленин (6,8-бисдегидро-
эстрон), до сих пор находит применение в терапии.

Из синтетических производных наибольшее значение имеют
17-этинилпроизводные (этинилэстрадиол и его 3-метиловый
эфир местранол), которые используются в основном в качестве
эстрогенных составляющих противозачаточных таблеток.

Основными метаболитами прогестерона и 17а-оксипрогесте-
рона являются 5|3-прегнан-3а,20а-диол и 5(3-прегнан-3а,17а,
20а-триол соответственно, которые выводятся из организма
главным образом в виде 3-глюкуронидов.

Из природных прогестогенов в терапии до сих пор широко
используется прогестерон, тогда как 17а-оксипрогестерон вы-
теснен его эфирами; в основном они применяются при лечении
нарушений менструального цикла и других гинекологических
заболеваний, а также при сохранении беременности.
Из многочисленных синтетических гестогенов некоторые
близки по структуре к прогестерону (ацетат медроксипрогесте-
рона, ацетат мегестрола, ацетат хлормадинона), другие более
или менее отличаются от него (этистерон, димэтистерон, аллил-
эстренол и т. п.).

Другую важную группу синтетических гестогенов составляют
17а-этинил-17-окси-19-норстероиды, которые используют в каче-
стве гестогенных компонентов противозачаточных таблеток.

I .
СНз

R=CHj, J -норэтистерон

R—СНз, Л5(®-норэтинодрел

R=CzH5, Л - норгестрел

R=CHj, 3~ дезоксо, Л-линоэстренол

диацетат зтинодиола
Подавляющее большинство стероидных гормонов, используе-
мых в медицине и ветеринарной практике, являются синтети-
ческими продуктами, не встречающимися в природе; даже при-
родные стероиды обычно синтезируются фармацевтической про-
мышленностью. Исходными веществами для промышленного
синтеза (или точнее полусинтеза) половых гормонов обычно
служат диосгенин или другие сапогенины (см. с. 468), которые
превращают в гормоны путем химических реакций, а также си-
тостерин или другие стерины (см. с. 281), которые превращают
в ключевое соединение 4-андростен-3,17-дион путем микробио-
логического окисления. Следует заметить, что все важные сте-
роидные гормоны также получены синтетически, а некоторые
методики синтеза служат для получения эстрогенов и 19-нор-
стероидов в промышленном масштабе.

2.2.	МЕТОДЫ АНАЛИЗА ПОЛОВЫХ ГОРМОНОВ [302а]

2.2.1.	МЕТОДЫ УФ-СПЕКТРОФОТОМЕТРИИ,
ОСНОВАННЫЕ НА СОБСТВЕННОМ ПОГЛОЩЕНИИ*

Сведения об ультрафиолетовых спектрах стероидных гормо-
нов собраны в нескольких книгах, атласах спектров и обзор-
ных статьях. Наиболее важные из них опубликованы Дорфма-
ном [199], Дужа и др. [203] и Нойдертом и Рёпке [586]. По во-
просам применения УФ-спектрофотометрии в количественном
анализе можно обращаться к монографии Гёрёга и Шаца [312].

Наиболее характерными стероидными гормонами, которые
обладают собственным поглощением, используемым в количест-
венном анализе, являются а,р-ненасыщенные кетоны, сопряжен-
ные диены и соединения, содержащие фенольное кольцо А,

а,Ненасыщенные кетоны

Наиболее часто встречающиеся сопряженные кетогруппы —
это Д4-3-кето- и Д1’4-3-кетогруппы с максимумом поглощения
в этанольной среде соответственно при 240 и 244 нм и моляр-
ным коэффициентом поглощения примерно 17 000. На рис. 2.1
представлены два характерных спектра поглощения, а также
спектр менее важного Д4’6-3-кетопроизводного.

Как показано на рис. 2.1, спектры Д4-3-кето- и Д1>4-3-кето-
стероидов имеют большое сходство; единственное существенное
их отличие состоит в наличии плеча в спектре последнего в об-

* В этом разделе будут обсуждаться также кортикостероиды, поскольку
они обладают теми же хромофорными группами, что и большинство андро-
генов и прогестинов (Л4- или А1’4-3-кетогруппа).
ласти 266 нм. Это позволяет проводить их одновременное опре-
деление в соизмеримых количествах в бинарных смесях мето-
дом отношений оптических плотностей [404, 676]. Менее слож-
ный случай представляет одновременное определение Д4-3-кето-
и Д4’6-3-кетостероидов по их поглощению при 238 и 280 нм.
При больших длинах волн можно определять следовые коли-

Рис. 2.1. УФ-Спектры нена-
сыщенных 3-кетостероидов
в метаноле.

1 — содержащих Д4-3-кето-
группу (метилтестостерон:
17а-метил - 17-окси-4-андро-
стен-3-он); 2 — содержащих
Д1>4-3-кетогруппу (метанди-
енон: 17а-метил-17-окси-1,4-
андростадиен-3-он); 3— со-
держащих Д4’6-3-кетогруппу
(ацетат мегестрола: ацетат
6-метил- 17а-окси-4,6-прегна-
диен-3,20-диона).

чества продуктов разложения типа Д4’6-3-кетосоединений в спи-
ронолактонах [509].

Помимо простых случаев анализа промышленных кетосте-
роидов в массе продукта непосредственное спектрофотометриче-
ское измерение возможно только при анализе некоторых не
слишком сложных лекарственных дозированных форм (см. раз-
личные фармакопеи), проб воздуха [200] и т. п. Однако, как
правило, спектрофотометрическое определение осложняется ме-
шающим влиянием сопутствующих компонентов или основы об-
разца. В таких случаях следует пользоваться методами измере-
ния при разных длинах волн, избирательной экстракцией, хро-
матографическими методами разделения или, возможно, мето-
дом с применением борогидрида натрия.

Измерение при разных длинах волн и расчет результатов
с помощью ортогональных функций были использованы Амером
и сотр. [29] для определения гидрокортизона и преднизолона
в различных лекарственных препаратах в присутствии неоми-
цина, фенилэфрина и т. п., а Михайлова и сотр. [553] применили
метод отношения оптических плотностей для определения кето-
стероидов в реакционных смесях.
Что касается экстрационных методов, то заслуживает упо-
минания интересная методика, предложенная Ивашкивом [405],
для контроля процесса 16а-гидроксилирования 9-фторгидрокор-
тизона микробиологическим методом. Раствор (из ферментера)
экстрагируют этилацетатом, затем проводят реэкстракцию
3 %-ным водным раствором тетрабората натрия. При этом
16а, 17а-диол в виде боратного комплекса переходит в водный
слой, в котором его можно определить по полосе поглощения
ненасыщенной кетогруппы.

Спектрофотометрические методы имеют еще большее значе-
ние после проведения предварительного хроматографического
разделения. Спектрофотометрия в УФ-области — идеальный спо-
соб контроля за выходом конъюгатов кетостероидов при элюи-
ровании и для их определения после разделения на хроматогра-
фической колонке [108, 109, 246, 319, 320]. Реже спектрофото-
метрические методы определения применяются после разделе-
ния методом тонкослойной хроматографии и элюирования
пятна; в этих случаях обычно проводят колориметрическое из-
мерение.

Для определения А4- и А14-3-кетостероидов в растворах при
ферментации [300], масляных препаратах для инъекций, мазях
[295] и низкодозированных. таблетках [302] Гёрёг предложил
дифференциальный спектрофотометрический метод, основанный
на восстановлении этих производных борогидридами щелочных
металлов до соответствующих спектрально неактивных 3-окси-
лроизводных.

МеВН,

(2.2)

Me=Li, Na,К

Если в кювету сравнения поместить раствор восстановлен-
ного А4-3-кетостероида (1 мг кетостероида и 0,1 г борогидрида
натрия растворяют в 10 мл метанола и через 15 мин разбав-
ляют метанолом до 100 мл), а в рабочую кювету — раствор не-
восстановленного соединения с той же концентрацией, то раз-
ность оптических плотностей при 240 нм отвечает содержанию
ненасыщенного кетона. Конечно, этот метод дает приемлемые
результаты, только если сопутствующие компоненты и неизвест-
ные примеси, дающие фоновое излучение, не реагируют с боро-
гидридом натрия и, следовательно, дифференциальный спектр
•смеси при длинах волн выше 230 нм идентичен истинному спек-
тру чистого кетостероида. Это иллюстрируется рис. 2.2, на ко-
тором представлены спектры метанольного экстракта масляного
препарата для инъекций, содержащего прогестерон и бензоат
эстрадиола; кривая 1 — это суммарный спектр двух стероидов,
бензилового спирта (в качестве стабилизирующего агента) и
небольшого количества масла, соэкстрагирующегося с исследуе-
мыми компонентами. Кривая 2 представляет дифференциальный
спектр, почти идентичный спектру прогестерона, что указывает
на устранение влияния поглощения всех других компонентов.

Рис. 2.2. УФ-Спектры мета-
нольных экстрактов масляных
препаратов для инъекций, со-
держащих прогестерон и бен-
зоат эстрадиола [295].

1 — спектр, полученный сразу
после экстракции; 2 — диффе-
ренциальный спектр (раствора
невосстановленного соединения
относительно восстановленного
борогидридом натрия); 3 —
спектр раствора восстановлен-
ного соединения.

Применив этот метод для определения халцинонида (21-
хлор-9-фтор-4-прегнан-11а, 16а, 17-триол-3,20-дион-16,17-ацетонид)
в мазях, Киршбаум [459] обнаружил, что восстановление
протекает полностью только при использовании свежего боро-
гидрида натрия. Это объясняется ингибирующим действием
метабората натрия (продукта разложения борогидрида натрия),
но его можно устранить, вводя в реакционную смесь пропилен-
гликоль, который связывает метаборат натрия в комплекс; в ре-
зультате достоверность определения увеличивается.

Д1’4-3-Кетоны в описанных условиях восстанавливаются очень
медленно. При определении преднизолона в мазях Гёрёг [295]
предложил длительное кипячение с щелочным этанольным рас-
твором борогидрида натрия. Для этих целей более удобной
оказалась модифицированная методика, описанная Хафезом и
сотр. [144]. Авторы заменили в реакционной смеси метанол
тетрагидрофураном и борогидрид натрия борогидридом лития и
обнаружили, что в этих условиях даже А(1’4)-3-кетостероиды
восстанавливаются за 10 мин при комнатной температуре. Кода
и Тималло [160] использовали этот вариант борогидридного
метода для определения ацетонида флуоцинолона в кожных
мазях.

Спектрально неактивные в этой области А5<10)-3-кетоны спек-
трофотометрически можно определять, измеряя поглощение
соответствующего А4-3-кетона, поскольку первые можно легко
перевести в последний путем кислотного или щелочного ката-
лиза [реакция (2.3)]. Определение норэтинодрела обычно про-
водят после выдерживания реакционной смеси в течение 1 ч
[764] или кипячения в течение 5 мин [61] с 0,5 М соляной кис-
лотой. Гёрёг [296, 302] обнаружил, что каталитическое действие
гидроксид-иона в этой реакции примерно в 300 раз эффектив-
нее, чем иона водорода. Поэтому при комнатной температуре
даже при 0,01 М концентрации гидроксида натрия в течение 1 ч
происходит количественное превращение, что позволяет прово-
дить избирательное определение норэтинодрела в отдельных
противозачаточных таблетках методом дифференциальной спек-
трофотометрии [302].

3,5-Диены

Как видно из рис. 2.3, незамещенные 3-алкоксипроизводные
(енольная форма простых эфиров) и 3-ацилоксипроизводные
(енольная форма сложных эфиров) обладают высоким свето-
поглощением.

енольная форма
простого эфира
Поскольку все они являются производными А4-3-кетонов
[реакция (2.4)], а последние в свою очередь — продуктами раз-
ложения енольных простых и сложных эфиров, А4-3-кетоны мо-
гут оказаться потенциальными примесями. Это осложняет опре-
деление енольных форм эфиров, потому что все эти соединения
имеют весьма схожие спектры (см. рис. 2.1 и 2.2). Пеннер и

Рис. 2.3. УФ-Спектры 3,5-диенов
в метаноле.

1	— незамещенные 3,5-диены (аце-
тат 17а-этинил-3,5-эстрадиен-17-ола);

2	— простые эфиры енола (ацетат
17а-этинил-3-циклопентилокси-3,5-эст-
радиен-17-ола (ацетат хингестанола);

3	— сложные эфиры енола (диацетат
17а-этинил-3,5-эстрадиен-3,17-диола).

сотр. [621] решили проблему селективного определения 3,5-дие-
нового енольного простого эфира (ацетат хингестанола) в при-
сутствии продукта его разложения типа А4-3-кетона путем из-
бирательного восстановления последнего борогидридом натрия
перед спектрофотометрическим измерением. Как видно из реак-
ции (2.4), А4-3-окси-, а также ацилоксипроизводные можно пре-
вратить в 3,5-диены путем катализируемого кислотами удале-
ния воды или карбоновых кислот, и, следовательно, по погло-
щению образующихся 3,5-диенов можно определить эти спек-
трально-неактивные производные. Используя соляную кислоту
в качестве катализатора, можно определить диацетат этиноди-
ола [304, 783е] даже в отдельных таблетках [302].

Из 3-а-эпимеров вода удаляется примерно в пять раз быст-
рее, чем из ЗР-эпимеров. На этом основан дифференциальный
кинетический метод Чизера и Гёрёга [171].

Фенольное кольцо А

На рис. 2.4 представлены четыре характеристических спек-
тра эстрогенов, содержащих фенольное кольцо А (в форме сво-
бодного фенола, фенолят-иона, простого эфира и сложного
эфира). Эти спектры очень характеристичны, но из-за несколько
низкой интенсивности поглощения к использованию УФ-спек-

трофотометрии для количественных определений нужно подхо-
дить с большой осторожностью, поскольку возможности непо-
средственного измерения без предварительного разделения или

Л, нм

Рис. 2.4. УФ-Спектры стероидов,
содержащих фенольное кольцо А
[(растворитель — смесь метанола
с водой (4 : 1)].

/ — этинилэстрадиол; 2 — этинил-
эстрадиол в 0,2 М NaOH; 3— эти-
нилэстрадиол-3-метиловый эфир
(местранол);	4 — дипропионат

эстрадиола.

введения поправки на поглоще-
ние фона очень ограниченны.

Приведем один из многочис-
ленных примеров, когда УФ-спек-
трофотометрию использовали для
количественного определения по-
сле хроматографического разде-
ления. Так, Шрёдер и др. [697]
проводили разделение эстрона,
эстрадиола, эквилина и эквиле-
нина на пластинке, покрытой си-
ликагелем, после кислотного ги-
дролиза их сульфатов и экстрак-
ции свободного фенола хлоро-
формом. Первые три соединения
экстрагируют 1 %-ным водным
раствором гидроксида натрия и

измеряют поглощение их ионных
форм при 296 нм, а присутствую-
щий в низких концентрациях
эквиленин экстрагируют мета-
нолом и измеряют его погло-
щение при 231 нм, когда чувстви-
тельность измерения намного
выше.

В некоторых методиках, пред-
ложенных для определения эст-

рогенов, проблемы, связанные с поглощением фона, были ре-

шены с привлечением химических или математических методов.
В большинстве из них описывается определение малых коли-
честв эстрогенов в присутствии больших количеств кетосте-
роидов, когда малоинтенсивные полосы кетостероидов, обуслов-
ленные п—л*-переходами, мешают определению. Для анализа
противозачаточных таблеток, в которых соотношение кетостеро-
идов и эстрогенов не очень велико, достаточно использовать
один из вариантов метода базисной линии, как это сделали
Кий [447] и Шрофф и Гродски [718]. В последней работе ав-
торы повысили избирательность измерения, применив селектив-
ную экстракцию эстрогенов метилциклогексаном. Бруннер и
Кунц [108, 109] описали метод определения местранола в раз-
личных смесях, сочетающий разделение колоночной хромато-
графией и УФ-спектрофотометрическое измерение с поправкой
на поглощение холостого раствора.

При определении примесей эстрогенов в 19-норстероидах
отношение кетостероид/эстроген обычно составляет от 100 до
10 000. Столь малые количества эстрогенов нельзя определить
даже с помощью метода базисной линии, поскольку поглощение
фона больше поглощения определяемых компонентов. Для ре-
шения этой проблемы Легран и др. [494] восстанавливали кето-
группу кетостероидов борогидридом калия в щелочном рас-
творе метанола, что привело к почти полному устранению по-
глощения фона. Остаточное поглощение фона можно легко
учесть, используя метод базисной линии. Этот метод позволяет
определить до 0,01 % эстрогенов в 19-норстероидах. По сути
дела тот же метод использован в работе Бестоу [61] и рекомен-
дован Британской фармакопеей [101в] для определения местра-
нола в противозачаточных таблетках. Гёрёг и Чизер [303] упро-
стили этот метод, заменив борогидрид калия борогидридом нат-
рия и исключив гидроксид натрия, что позволило сократить
время реакции с 6,5—18 ч до 15 мин.

Наличие батохромных и гиперхромных сдвигов в спектрах
чистых эстрогенов в щелочной среде (около 0,2 М гидроксида
натрия; см. рис. 2.4) открывает новые возможности для их се-
лективного определения. Селективность и чувствительность из-
мерения поглощения щелочных растворов эстрогенов относи-
тельно раствора холостого опыта увеличиваются по сравнению
с селективностью и чувствительностью измерения поглощения
нейтрального раствора, на чем в фармакологии основано не-
сколько методик определения стероидов [256, 464, 697].

Избирательность измерения можно увеличить еще больше,
поместив в кювету сравнения раствор исследуемого материала
в недиссоциированной форме с такой же концентрацией. В этом
варианте дифференциального спектрофотометрического метода
устраняется мешающее влияние поглощающих неионизирован-
ных веществ. Метод, рекомендуемый фармакопеей XX США
[7836] для определения валерата эстрадиола в масляных пре-
паратах для инъекций в отсутствие кетостероидов, можно ис-
пользовать для анализа препаратов для инъекций с высоким
содержанием стероида (выше 10 мг/мл) [412], если в кювету
сравнения помещать кислый (0,02 М), а в рабочую кювету —
сильнощелочной (0,6 М) раствор. Гёрёг [301] повысил избира-
тельность этого метода, используя раствор с pH 9 (боратный
буфер) в качестве раствора сравнения (фенольная оксигруппа
еще не ионизирована), создавая в растворе пробы 0,2 М кон-
центрацию щелочи и предварительно восстанавливая кетосте-
роиды борогидридом натрия. В этом варианте удалось полно-
стью устранить мешающее влияние примесей, поглощение
которых изменяется как в интервалах pH 2—9, так и при кон-
центрации щелочи 0,2—0,6 М; окисление Д4-3-кетонов кислоро-
дом воздуха в щелочной среде также не оказывает мешающего
влияния. Измерение разности оптических плотностей при 300 нм
позволяет проводить количественный анализ низкодозирован-
ных препаратов для инъекций даже в присутствии больших ко-
личеств кетостероидов.

При помощи дифференциального спектрофотометрического
метода, проводимого в щелочной среде, можно определять сво-
бодные эстрогены и их сложные эфиры (последние в щелоч-
ной среде быстро гидролизуются). Простые эфиры, конечно, не
вступают в реакцию, но их фенольные производные реакционно-
способны, что позволяет селективно определять их примеси.

I
СНз

(2.5)

Как видно из уравнения (2.5), в метанольной среде в при-
сутствии соляной кислоты 10Р-окси-4-ен-3-кетоны (примеси
19-нор-4-ен-3-кетонов) можно количественно перевести в соот-
ветствующее фенольное производное простого эфира. С по-
мощью этой реакции и вышеупомянутого спектрофотометриче-
ского метода определения стероидов фенольного типа Гёрёг
и сотр. [314] определили следовые количества таких веществ.

2.2.2.	УФ-СПЕКТРОФОТОМЕТРИЧЕСКИЕ
И КОЛОРИМЕТРИЧЕСКИЕ МЕТОДЫ,
ОСНОВАННЫЕ НА ХИМИЧЕСКИХ РЕАКЦИЯХ

Этим методам анализа стероидных гормонов посвящено не-
сколько сотен статей. В ранний период развития химии стерои-
дов (до распространения хроматографических методов, особенно
газовой хроматографии) они (вместе с флуориметрией) были
единственными достаточно чувствительными и селективными
методами определения стероидов. С введением в аналитическую
химию стероидов более селективных и чувствительных газохро-
матографических, радиоаналитических и других методов значе-
ние колориметрических методов несколько упало, но они до сих
пор главенствуют в фармацевтическом анализе стероидов и со-
храняют до некоторой степени свое значение в биоклиническом
анализе.

Наиболее полный современный обзор этой области дан
в прекрасной монографии Бартоша и Пезе [60]. Применение
колориметрического метода в фармацевтике кратко изложено
в монографии Гёрёга и Шаца [312а]; кроме того, ему посвя-
щены отдельные главы во многих монографиях по фармацевти-
ческому анализу или анализу стероидов, из которых следует
упомянуть обзор Какача и Вейделека [438].

Большинство статей по применению колориметрических ме-
тодов анализа половых гормонов посвящено определению со-
единений, содержащих кетогруппы или фенольное кольцо А.

Определение кетостероидов

Некоторые (амины, гидразины и производные гидразидов)
из реагентов, используемых для колориметрического определе-
ния кетостероидов, содержат —NH2-rpynny, реагирующую
с карбонильной группой с образованием продуктов конденса-
ции типа =C=N—.

Другая часть колориметрических методов основана на реак-
циях активной метиленовой группы, расположенной рядом с ке-
тогруппой, с реагентами типа ароматических ди- и трини-
тропроизводных (диэтилоксалата, 2,6-ди-трет-бутил-п-крезола
и т. п.).

Имеется еще несколько реагентов, используемых в других
(иногда не совсем ясных) реакциях.

Наиболее важные методы приведены в табл. 2.1.

Подробное обсуждение всех методов, перечисленных
в табл. 2.1, вышло бы за рамки этой книги. Поэтому здесь бу-
дут обсуждаться только два важнейших метода: метод с ис-
пользованием гидразида изоникотиновой кислоты (ГИН) и ме-
тод Циммермана (с использованием 1,3-динитробензола).

При обработке ненасыщенных кетостероидов с помощью
ГИН Эрколи и др. [223] наблюдали возникновение желтой
окраски, которую Умбергер [782] использовал в аналитических
целях. Этот метод основан на реакции конденсации между ке-
тогруппой и гидразидной группой реагента (0,05 %) в мета-
ноле, содержащем 0,007 М соляной кислоты.

(2.6)
Таблица 2.1. Фотометрические методы определения кетостероидов

Автор	Год	Другие источники	Объект	Реагент	Положение кетогруппы	Максимум поглоще- ния, нм	Молярный коэффициент поглощения
Пезе и Бартош	1963	[394, 395]	Стандарты	Реагенты на  СО-группу  Оксалат /г-диме-	Ненасыщенная	420—450	6 500—8 000
[625]  Шульц и др. [701]	1964	[783е]	Лекарственные	тиламиноанилина  4-Аминоантипирин	3-кетогруппа  Д4-3-Кетогруппа	354—376	8 500—15 000
Кимура и др. [455]	1967	[592, 627]	препараты  Стандарты	4-Нитрофенилгид-	Д1>4-3-Кетогруппа Д4’б-3-Кетогруппа  3-Кетогруппа,	379—394  384—392  520	37 600
Мак-Кинли и Дев-	1957	[193, 195,	Лекарственные	разин, диметил- формамид, NaOH 2,4-Динитрофе-	Д4-3-кетогруппа, Д4>б-3-кетогруппа Насыщенные и не-	540  570 370—410	44 500  57 300  22000—50 000
лин [541]  Вудсон [839]	1971	333, 370, 383а, 623, 658] [288, 807]	препараты  Таблетки	нилгидразин  2,4-Динитрофе-	насыщенные кето- группы  Д1>4-3-Кетогруппа,	480	51600
Умбергер [782]	1955	См. ниже	Лекарственные	нилгидразин, NaOH  Гидразид изони-	11-, 20-кетогруппы  Д4-3-Кетогруппа	380—405	12 000—16 000
Толбот и др. [756]	1955	[116, 255,	препараты  Биологические	котиновой кисло- ты, НС1 Тиосемикарбазид	Д4-3-Кетогруппа,	299—325	34 000—39 000
Стенлейк и Уиль-	1957	751]  [543]	объекты  Таблетки	Реактив Т Жи-	Д1)4-3-кетогруппа, 17-, 20-кетогруппы Д4-3-Кетогруппа	269—274  282—283	25 000—28 000  23 600
ямс [744]  Коэн и Калужнер	1957	[760]	Моча	рара  Реагенты на груп- пу СНз—С = 0 3,5-Динитробен-	17-Кетогруппа	550	7 500
[162]				зойная кислота, кон			

Заказ № 182

Автор	Год	Другие источники	Объект	Реагент	Положение кетогруппы	Максимум поглоще- ния, мм	Молярный коэффициент поглощения
Пезе и Бартош [626]	1964		Стандарты	1,3,5-Тринитро- бензол, NaOH	Насыщенные и не- насыщенные кето- группы	475	7 000—14 000
Шульц и Диас [699]	1964	[60а]	Таблетки	Пикриновая кис- лота, NaOH	Д4>6-3-Кетогруппа	490—497	9700 (ацетат хлормади- нона)
Смит и др. [738]	1970	[551, 715]	Таблетки	Тетразолиевый синий	Д4-3-Кетогруппа	530	6 000—8 000
Шульц и др. [700]	1964	[41, 59, 702]	Лекарственные препараты	2,6-Ди- трет- бутил- п-крезол, N(CH3)4OH	Д4-3-Кетогруппа	620 (проге- стерон)  485 (аце- тат кор- тизона) 289—324	9400  8200
Гёрёг [298]	1970	[299]	Лекарственные препараты	Диэтилоксалат, трет-бутилат нат- рия	Д4-3-Кетогруппа, 17-, 20-кетогруппа		5 000—15 000
Абельсон и Бонди [2]	1956	[170, 492, 550]	Биологические объекты	трет-Бутилат калия, кислород воздуха	Д4-3-Кетогрунпа	385	5 000—10 000
Фейми и др. [228, 229]	1974  1976		Масляные рас- творы для инъек- ций	Пикриновая кис- лота, H2SO4	Д4-3-Кетогруппа (тестостерон и его эфиры)	640	21 200—  22 000
Пезе и Бартош [628]	1964		Стандарты	Тиамин, НС1	Д5<10)-3-Кетогруппа	600	36 000—  40 000
Максимум поглощения протонированной желтой формы про-
дукта конденсации Д4-3-кетостероидов лежит около 380 нм
(е~ 11 000—12000). При комнатной температуре реакция закан-
чивается через 20 мин. Более низкой реакционной способностью
обладают Д^-З-кетоны. По методике Рида и Уолтерса [657] не-
обходимо нагревание в течение 1 ч при 50 °C. Как сообщали
Кавина и др. [137], другая возможность заключается в исполь-
зовании более концентрированного реагента (0,8 %-ный ГИН
примерно в 0,1 М соляной кислоте) при комнатной температуре
и продолжительности реакции 2—3 ч. Максимум поглощения
Д4’6-3-кетонов и Д1’4-3-кетонов находится между 405 и 415 нм,
молярный коэффициент поглощения равен 16 500—18 500. Раз-
личие в реакционной способности Д4-3-кето- и Д'^-З-кетостерои-
дов позволяет проводить обнаружение и даже полуколичествен-
ное определение [632] первых в присутствии последних.

Преимущество метода с использованием ГИН заключается
в том, что окраска мало зависит от замены растворителя. Вве-
дение этанола [479, 480, 782] или еще лучше хлороформа [1016,
782, 845, 846, 849] в реакционную смесь позволяет без затруд-
нений анализировать масляные препараты для инъекций без
предварительной экстракции. Лишь в случае низкодозированных
препаратов для инъекций рекомендуется хроматографическое
отделение кетостероидов от масла на колонке, заполненной фло-
рисилом [782].

Помимо анализа различных препаратов для инъекций метод
с использованием ГИН был с успехом применен By [845, 846]
для определения прогестинов в противозачаточных таблетках.
Недавно [849] описана методика анализа отдельной таблетки,
согласно которой для отделения прогестина от основы таблетки
целесообразно хроматографирование на микроколонке; таким
образом можно свести к минимуму объем элюента (хлоро-
форма), что позволяет определить в одной таблетке до 0,35 мг
норэтистерона.

Метод с использованием ГИН легко поддается автоматиза-
ции; эта возможность была реализована для анализа таблеток ’
[40, 219а, 677, 768] и препаратов для инъекций [768].

ГИН-Метод в настоящее время является самым распростра-
ненным стандартным методом определения кетостероидов в го-
товых лекарственных формах. Помимо анализа готовых лекар-
ственных форм он применяется и для анализа стероидов в массе
фабричного продукта [783к]. Для решения более сложных за-
дач (разделение и количественная оценка содержания компо-
нентов в смесях или получение достоверных данных в присутст-
вии продуктов разложения) его часто применяют в сочетании
с бумажной [664], колоночной [318, 319, 320] и тонкослойной
[78, 79, 138, 139] хроматографией и элюированием пятна.
Хотя ГИН-метод находит применение главным образом
в фармакологии, Мацуи и Такахаши [530] использовали его
для определения кетостероидов в биологических объектах,
а именно для контроля за ферментативным превращением те-
стостерона и его конъюгатов в соответствующие 4,5-дигидропро-
изводные, не реагирующие с ГИН.

В то время как главной областью применения ГИН-метода
является фармацевтический анализ, другой метод, выбранный
для подробного обсуждения — реакция Циммермана,— в на-
стоящее время используется почти исключительно в клиниче-
ском анализе для определения 17-кетостероидов в моче.

17-Кетостероид реагирует по своей активной метиленовой
группе при С-16. Образующийся на первой стадии реакции бес-
цветный промежуточный продукт дегидрируется под действием
1,3-динитробензола в окрашенный мезомерный анион, изобра-
женный на схеме (2.7) [259, 457].

Необходимым условием протекания реакции является удоб-
ное стерическое расположение кетогруппы по соседству с мети-
леновой группой. Так, например, 3-кетостероиды (в том числе
А4-3-кетостероиды) и 21-незамещенные 20-кетостероиды дают
положительную реакцию, тогда как А1’4-3-кетостероиды (не
имеющие активной метиленовой группы) и стерически экрани-
рованные 6-, 7-, 11- и 12-кетостероиды не вступают в нее.

Из огромного количества статей, опубликованных после по-
явления методики Циммермана [865] в 1935 г., подавляющее
большинство посвящено выбору оптимальных условий реакции
для определения 17-кетостероидов. Всестороннее обсуждение
результатов работ, начиная с раннего периода, имеется в моно-
графиях Циммермана [866], Джэйла [417] и Какача и Вейде-
3*
лека [437]. В, настоящей книге обсуждаются лишь наиболее
важные результаты и некоторые новые тенденции.

Основные цели оптимизации условий заключаются в стаби-
лизации интенсивности окраски и характера спектра и в повы-
шении чувствительности и правильности метода.

Максимум поглощения дегидроэпиандростерона в различ-
ных реакционных условиях находится около 520 нм. Молярный
коэффициент поглощения в первоначальной методике (реакция
в этаноле в смеси с 1,3-динитробензолом и водным раствором
гидроксида калия) составляет около 15 000. Введение пиридина
в реакционную смесь [60а, 640, 831] повышает его до 21 000.
Во многих случаях, даже в современных автоматических мето-
дах, приходится использовать условия, при которых чувстви-
тельность гораздо ниже.

Основные трудности связаны с тем, что для полного проте-
кания реакции (2.7) необходима сильнощелочная среда, а в та-
ких условиях окраска недостаточно устойчива. Было предпри-
нято несколько попыток решить эту задачу, в частности исполь-
зуя органические основания типа гидроксида бензилтриметил-
аммония [60а, 154] или соответствующего метоксипроизводного
[89] вместо гидроксида калия или экстракцией окрашенного
продукта реакции органическими растворителями типа эфира,
хлороформа и т. п. [120, 169].

По-видимому, наиболее существенным практическим усовер-
шенствованием реакции Циммермана за последнее время было
предложенное Эпштейном [222] и использованное другими ав-
торами [214, 240, 241, 242, 481, 823] введение водных раство-
ров. (Интересно отметить, что довольно долго бытовало убеж-
дение, что даже небольшие количества воды оказывают небла-
гоприятное воздействие на развитие окраски. Например,
Кэллоу и др. [121], методика которых длительное время была
стандартной, предписывали абсолютный этанол в качестве
реакционной среды, а это привело к проблемам, связанным
с устойчивостью щелочного реагента, добавление которого часто
вызывало опалесценцию раствора.) По методике с использова-
нием водных растворов для приготовления реагента из 1,3-ди-
нитробензола в качестве растворителя берут 5 %-ный водный
раствор детергента гиамина 1622 (хлорид диизобутилфенокси-
этоксиэтилдиметилбензиламмония). Как только раствор, со-
держащий пробу, и этот реагент сильно подщелачивают 10 М
водным раствором гидроксида калия, быстро развивается окра-
ска по реакции Циммермана и продукт сразу же осаждается
из раствора совместно с большей частью избытка реагента,
вследствие чего удается избежать его разложения. Реакция
протекает 15 мин при комнатной температуре, после чего можно
проводить измерения. Для этого мутный раствор разбавляют
таким же объемом 2,5%-ного раствора гиамина 1622 с целью
солюбилизации осадка или проводят экстракцию окрашенного
продукта эфиром из сильнощелочного раствора.

Существенным недостатком всех вариантов метода Циммер-
мана является заметное поглощение холостой пробы и появле-
ние фона в спектре, обусловленные присутствием посторонних
компонентов. Частично их влияние можно уменьшить, исполь-
зуя особо чистые реагенты и растворители (это не необходимо
при проведении водного варианта метода). При анализе биоло-
гических объектов помимо фона в спектре следует еще учиты-
вать поглощение матрицы. Поэтому часто прибегают к алгеб-
раическим поправкам. Наиболее известна поправка Аллена, для
получения которой измеряют оптическую плотность в макси-
муме и при двух других длинах волн, а затем по уравнению
(2.8) вычисляют исправленную оптическую плотность для ис-
следуемого и холостого растворов:

Лнспр = Дх Л + д + Лл-д	(28)

где X — длина волны в максимуме поглощения, а Л обычно со-
ставляет 60 нм. Фелдкамп и др. [243] тщательно исследовали
обоснованность введения такой поправки и пришли к выводу, что
ею можно успешно пользоваться, только если спектры стандарт-
ного раствора и пробы различаются не очень сильно.

Наконец, остается упомянуть, что оба варианта метода Цим-
мермана, водный и неводный, могут быть автоматизированы
[214, 481, 565, 566, 650, 861].

Фенольное кольцо А

В табл. 2.2 приведены некоторые из многочисленных мето-
дов колориметрического определения эстрогенов, основанных
на реакциях фенольного кольца А.

Эти прямые более или менее стехиометрические, но в основ-
ном не очень чувствительные методы имеют ограниченное при-
менение, и их практическое значение обычно исчерпывается
анализом лекарственных препаратов.

Гораздо большее значение как в фармацевтике, так и в био-
медицине имеют нестехиометрические, но очень чувствительные
методики, основанные на реакциях с реагентами, содержащими
большие количества сильных кислот, в основном серной кис-
лоты.

Самый простой реагент — это сама серная кислота. Она ис-
пользуется главным образом для идентификации стероидных
гормонов (и не только эстрогенов, но и стероидов других
классов). Это очень важный способ их качественного анализа,
Таблица 2.2. Фотометрические методы определения фенольного кольца А эстрогенов *

Автор	Год	Другие источники	Объект	Реагент	Максимум поглощения, нм	8, область подчинения закону Бера	Механизм реакции
Урбани и др. [784]	1968	[785, 786]	Лекарственные препараты	Диазотированный 4-ами- но-6-хлор-лгбензолди- сульфонамид	500	8 050	Азосочетание
Элдеви и др. [219]	1975		Таблетки	Диазотированный 5-хлор-2,4-динитроани- лин	450	11300	Азосочетание
Белал и Элненау [69]	1977		Таблетки	Диазотированный сульфатиазол	450	5—50 мкг/мл	Азосочетание
Ширзат и Шах [714]	1976		Таблетки	Диазотированный 3-нитроанилин	450	0—20 мкг/мл	Азосочетание
Мерле и Тендер [574]	1976		Эстрадиол в мас- се продукта	Диазотированная суль- фаниловая кислота	—	—	Азосочетание (механизм спор- ный)
Йи и Джексон [856]	1976		Общее содержа- ние эстрогенов в моче	З-Метил-2-бензотиазоли- нонгидразон — Се (IV)	530	11 200	Окислительное сочетание по С-4
Рао и др. [653а]	1979		Таблетки	Диазотированная фенил- гидразин-4-сульфокис- лота	347	1—10 мкг/мл	Азосочетание

Автор	Год	Другие источники 1		Объект1	Реагент	Максимум поглощения, нм	8, область подчинения закону Бера	Механизм реакции
Хассан и Заки [349]	1976		Содержание эст- рогенов в массе продукта	16 М HNO3	385—430	10—50  мкг/мл	Нитрование аро- матического коль- ца
Корани и др. [476]	1977		Таблетки	Na3[Co(NO2)6]	366(СНС13)  436 (водн. NaOH)	10—60  мкг/мл	Нитрование аро- матического коль- ца
Сьёстром и Ни- кёнен [730]	1957	[368]	Лекарственные препараты	Молибдовольфрамо- фосфат	760	2200	Восстановление реагента до сине- го комплекса
Бейнс [58]	1950		Эквилин, эквиле- нин в масляных растворах для инъекций	Хлоримид 2,6-дибромхи- нона	530	Эквилин: 4900/эквиле- нин: 12 000	Образование индо- фенолового краси- теля
Хюттенраух и Кейнер [396]	1965	[485]	Местранол	SbCl3/AcOH	570	4—14 мкг/мл	—
Бекер и Эхингер [65]	1963	[66]	Таблетки	A1C13/CH3NO2	540	0—20 мкг/мл	—

* За исключением методов с использованием реагентов, содержащих сильные кислоты.
поскольку он часто позволяет обнаруживать большие различия
между близкими по структуре стероидами, УФ-спектры которых
в этаноле практически не отличаются. Обсуждение связи между
спектром и структурой выходит за рамки настоящей книги, по-

Рис. 2.5. Спектры активных ком-
понентов противозачаточных таб-
леток в смеси серной кислоты и
этанола в соотношении 65 :35 (по
объему) [752].

1 — этинилэстрадиол (2 мкг/мл);
2 — норгестрел (10 мкг/мл); 3—
экстракт из таблеток.

этому здесь перечислены лишь
основные литературные источ-
ники [72, 734, 735, 737, 860].

С точки зрения количествен-
ного анализа гораздо более
важны методы, в которых ис-
пользуется разбавленная серная
кислота; в качестве разбавителей
обычно применяется этанол или
метанол. Главная область приме-
нения этих реагентов — фарма-
цевтика, поскольку их высокая
чувствительность позволяет про-
водить анализ низкодозирован-
ных таблеток, содержание эти-
нилэстрадиола и местранола
в которых нельзя определять ме-
нее чувствительными УФ-спек-
трофотометрическими методами.
Серная кислота в сочетании
с этанолом была использована
рядом авторов для указанной
выше цели [272, 367, 715, 747,

752], а также при контроле фер-
ментации [564]. На рис. 2.5 пред-
ставлены спектры этинилэстра-
диола и норгестрела в смеси
серная кислота—этанол в соот-
ношении 65:35 (по объему),

взятые из статьи Шабо [752]. Спектры снимали через 20 мин
после начала реакции при комнатной температуре; по утвер-
ждению автора, они сохраняются неизменными в течение не-
скольких часов. Очевидно, различия между спектрами делают
возможным одновременное определение обоих стероидов, что
было использовано при анализе отдельных противозачаточных
таблеток. Интересно отметить, что данные Шабо [752] и Хас-
сана и др. [348] относительно устойчивости окраски находятся

в противоречии с мнением авторов, которые утверждают, что
окраска, полученная с помощью реагента серная кислота — эта-
нол, неустойчива. Вероятно, устойчивость окраски сильно зави-
сит от чистоты этанола и серной кислоты, используемых в ана-

лизе.
Для автоматического определения этинилэстрадиола в таб-
летках Бейер [74] предложил использовать смесь серной кис-
лоты и этанола в соотношении 9 : 1 (по объему).

Вероятно, наиболее широко распространенным реагентом
для определения этинилэстрадиола и местранола в таблетках
является смесь серная кислота—метанол в соотношении 7 : 3
(по объему), предложенная Цилифонисом, Хафезом и др. [143,
780]. Этот реагент, принятый среди прочих [164, 317, 763, 847,
848] фармакопеей США [783г], обеспечивает устойчивую и очень
интенсивную окраску для двух упомянутых выше соединений
(^макс = 540 нм, е =34 000) с необычайно высокой избиратель-
ностью. Эстрон, эстрадиол и т. п., не содержащие 17-этиниль-
ной группы, не дают такой окраски, что указывает на необходи-
мость наличия в молекуле стероида одновременно фенольного
кольца А и 17-этинил-17-оксигруппы. В первоначальном вари-
анте методики окраска проявлялась в процессе экстракции
эстрогенов и самого реагента из их раствора в петролейном
эфире. В современном варианте этого метода By [847, 848] и
Грэхем [317] предложили определять этинилэстрадиол [847]
и местранол [317, 848] в противозачаточных таблетках после
отделения эстрогенов от гестогенных компонентов и мешающих
наполнителей методом распределительной хроматографии на
колонке; окраска появлялась при экстракции непосредственно
из элюатов.

Несмотря на удовлетворительные чувствительность и селек-
тивность реакции с участием реагентов, содержащих разбавлен-
ную этанолом или метанолом серную кислоту, и на простоту
методики, в биомедицине гораздо чаще применяются более дли-
тельные двухстадийные реакции, обладающие еще большей чув-
ствительностью и селективностью, с участием реагентов, содер-
жащих серную кислоту, воду и добавки. Одно время эти реак-
ции лежали в основе стандартных методик фармацевтического
анализа. На первой стадии этих методик, основанных на клас-
сической методике Кобера [470], эстроген нагревают примерно
с 65 %-ной (по объему) серной кислотой, содержащей немного
фенола, до образования желтого продукта Р-макс~450 —
500 нм). На второй стадии смесь разбавляют водой до 40—
50 %-ной концентрации серной кислоты и снова нагревают. При
этом окраска переходит в розовую (лМакс~505 — 555 нм). Для
разных эстрогенов молярный коэффициент поглощения состав-
ляет от 40 000 до 50 000.

Со времени выхода статьи Кобера появилось большое число
публикаций по оптимизации условий этой реакции, применению
таких методик в различных областях анализа стероидов и ме-
ханизму реакций. Монографии Какача и Вейделека [437, 438] и
Бартоша и Пезе [60] можно рекомендовать в качестве литера-
турных источников. В настоящей книге приведены ссылки
только на те статьи, в которых описаны наиболее существенные
видоизменения первоначальной методики и приведены способы,
до сих пор остающиеся стандартными.

Вместо самого фенола на первой стадии реакции были опро-
бованы и его производные. Из них в настоящее время повсе-
местно применяется гидрохинон, а методики Болда [63], Брауна
[106, 107] и Нокке [594], в которых рекомендуется этот реагент,
считаются стандартными. Состав реагента Брауна зависит от
определяемого эстрогена. Он содержит 2 г гидрохинона на
100 мл разбавленной серной кислоты, 66 %-ной (по объему)
для эстрона, 60 %-ной для |3-эстрадиола и 76 %-ной для эст-
риола. Определяемый эстроген обрабатывают 3 мл соответст-
вующего реагента при 100 °C в течение 20 мин, охлаждают,
разбавляют водой (0,5 мл в случае эстрона, 0,2 мл в случае
Р-эстрадиола и 1 мл для эстриола) и нагревают еще 10 мин.
По уравнению Аллена [28], вычисляют исправленную оптиче-
скую плотность [см. уравнение (2.8)]. Длины волн соответст-
венно равны 480, 513 и 546 нм.

По существу такая же методика предложена Нокке [594],
только концентрации и время реакции несколько изменены. По-
мимо очень широкого применения в биомедицине эти методы
использовались для определения эстрогенов в лекарственных
препаратах [224, 461, 570, 719].

Другим важным вариантом метода Кобера является мето-
дика Хенни [327], предложившего реагент, состоящий из серной
кислоты, воды, фенола и сульфата железа(III). Присутствие
иона железа(III) в реакционной смеси повышает скорость
развития окраски, стабилизирует окраску и, следовательно,
улучшает достоверность метода. Кроме чисто фармацевтиче-
ского применения [95, 739] путем изменения условий реакции
можно решать чрезвычайно сложные задачи. К последним от-
носятся селективное определение а-эстрадиола в присутствии
больших количеств р-эстрадиола [327, 328], селективное опре-
деление эквилина [783в] и др.

Важная область применения описанного выше варианта ре-
акции Кобера — это анализ конъюгатов эстрогенов и приготов-
ленных из них лекарственных препаратов. По методу, рекомен-
дуемому фармакопеей XX США [783в], привлечение экстрак-
ции и хроматографии и использование обоих реагентов Кобера
позволяют определять натриевые соли сульфата эстрона и
сульфата эквилина и общее содержание связанных эстрогенов.
Грэхем [316], Карол и др. [131] и Кариньян и Лодж [129] опуб-
ликовали новые варианты этой методики, для того чтобы упро-
стить процесс и повысить достоверность. Разработанные ими
методики, более, пожалуй, пригодные в лабораторных условиях,
подробно здесь не обсуждаются, поскольку недавно опублико-
вано несколько простых газохроматографических и ВЭЖХ-ме-
тодов, позволяющих избирательно определять все компоненты
(см. разд. 2.2.11 и 2.2.12).

Большинство работников клинических лабораторий, опреде-
ляющих эстрогены в моче и т. п. колориметрическим методом,
пользуются реакцией Кобера в варианте Иттриха. Главное от-
личие первоначальной методики Иттриха [400], в основе кото-
рой лежит метод Брауна [106, 107], состоит в том, что вместо
второго нагревания окрашенный продукт экстрагируют хлоро-
формом, содержащим 2 % n-нитрофенола, что существенно по-
вышает избирательность метода и стабилизирует окраску.
(Другим важным преимуществом экстракции является возмож-
ность проведения очень чувствительных флуориметрических из-
мерений; это будет обсуждаться в следующем разделе.)

Во втором варианте метода Иттриха [401] хлороформ заме-
нен 1,1,2,2-тетрабромэтаном, обладающим, как оказалось, бо-
лее высокой экстракционной способностью. Ниже дано краткое
его описание.

К пробе, содержащей до 10 мкг эстрогена, добавляют 1 мл
65 %-ной (по объему) серной кислоты с 2 % гидрохинона п
оставляют на 40 мин при 100 °C. После охлаждения смесь раз-
бавляют 1,5 мл воды, снова охлаждают и затем экстрагируют
2 мл тетрабромэтана, содержащего 1 % (по объему) этанола и
2 % (масса/объем) n-нитрофенола. Измеряют оптические плот-
ности при 510, 543 и 576 нм и вычисляют исправленную опти-
ческую плотность по уравнению Аллена [см. уравнение (2.8)].
Молярный коэффициент поглощения близок к полученному по
методике Кобера—Брауна.

Ватанабе и др. [822] сообщили о любопытном побочном яв-
лении, наблюдавшемся ими при использовании этого метода.
В моче беременных было обнаружено чрезвычайно низкое со-
держание эстриола, если больные принимали гидрохлортиа-
зид. Причина заключалась в том, что образующийся при приеме
этого лекарственного препарата формальдегид взаимодействует
с фенольным кольцом А, образуя сополимер.

Другой вариант метода Иттриха, также используемый в на-
стоящее время, предложил Бредшоу [97]. Он заменил воду на
стадии разбавления 2 М водным раствором трихлоруксусной
кислоты и тем самым улучшил экстракцию хлороформом (без
добавления n-нитрофенола) окрашенного продукта. Экстракцию
можно проводить также тетрахлоридом углерода [11].

Оба варианта метода Кобера (методики Брауна и Иттриха)
используются в полуавтоматических или полностью автоматизи-
рованных установках во многих лабораториях в основном для
определения общего содержания эстрогенов в моче [64, 680].
Выяснение механизма реакции Кобера и других реакций,
в которых эстрогены обрабатываются концентрированными
минеральными кислотами, являлось и является до настоящего
времени предметом многих исследований. Даже простое пере-
числение статей, посвященных этому вопросу, вышло бы за
рамки книги. На основании классических [92, 436] и современ-
ных [423, 454, 558—560, 607] исследований можно утверждать,
что сильные кислоты дают окрашенные продукты с теми эстро-
генами, которые кроме фенольного кольца А содержат кисло-
родную функциональную группу при Ci7. Основная роль кис-
лоты заключается в дегидратации молекулы с образованием
двойной связи (связей), которая мигрирует к фенольному
кольцу А. В ходе этого процесса метильная группа при Ci3 миг-
рирует в положение Сп, и, кроме того, происходит сульфиро-
вание фенольного кольца А (при С2). Окраска образующихся
продуктов может возникать вследствие протонирования в силь-
нокислой среде, что приводит к образованию ионов карбония,
способных к резонансу.

Вторая стадия реакции Кобера носит окислительно-восста-
новительный характер [63, 106, 594]; в результате удлинения
л-электронной системы в спектре окрашенного комплекса наб-
людается батохромный сдвиг.

Другие классы стероидов

В табл. 2.3 приведены основные характеристики нескольких
колориметрических методов, в основе которых лежит взаимо-
действие не с кетогруппой и фенольным кольцом А, а с другими
функциональными группами.

Следует заметить, что реагенты, содержащие концентриро-
ванную серную кислоту, которые в предыдущем разделе этой
главы рассматривались как реагенты на фенолсодержащие сте-
роиды, нашли широкое применение также для анализа не со-
держащих фенол стероидов. В настоящее время эти методы все
еще используются для определения производных, для которых
не найдено более селективных реакций.

Типичными примерами служат прегнандиол и прегнантриол.
Для определения прегнандиола Клоппер и др. [465] предложили
реагент, содержащий 0,1 % (масса/объем) сульфита натрия
	Механизм реакции		Расщепление	i NH2OH; окисление	до HNO2; азосо-	четание	Избирательная	экстракция комп-	лекса	Комплексообразо- вание	Комплексообразо-	ванне, экстракция	и измерение из- бытка Ag в виде	дитизоната	
ffl о st	вdag Лномве кинэниыгоп  Ч1ЭВ1Г9О ‘3		9000—  10 000				|			15—200 мкг/мл	т	мкг/мл			
s о ex Ф  c c	Максимум поглотце-	ния, нм	550				1			1  310—350 или 700—725	472				
функциональных гр?	Образец		Стандарты				Моча			Биологические объекты	Лекарственные	препараты			
хкие методы определения некоторых <	Реагенты		H2SO4, 12, сульфа-	ниловая кислота, N-1-нафтилэтилен-		диамин	Метиленовый си-	НИИ, СНС13		Си+пиридин	AgNO3, дитизон/  СНС13				
	Функциональная группа		3- и 20-Кетоксим-	ная			Сульфогруппы	стероидов		Сульфогруппы стероидов	17а-Этинильная				
S	Год		1974				1974			1974	1974				1979
Таблица 2.3. Фото!	Автор		Форист и Джуди  Г2571				Герц и др. [283]			Мэриан и Матко- вич [524]	Риц и др. [660,	661]			Эльсейд и Алиок [219а]
Продолжение табл. 2.3

Механизм реакции	,	'о' ГТ	। ГТ  a х5	аГГ	® 5гг  CQ а •	_	® ®	Ф ГТ	S3 s О  о а 5	5	° S	о>	я u о  |	^ОЙ	Sg^  §Й5	I	М	SS  х	Й	к а g	« a	s	«	а  g'g 2	a	*§*	2 g	8*	5	О	s  £ ° 5	a	я	3SSi	a ®	5	£2	03  ? о	O’	a s	n и	а о  S2 ф T ь	o>	2- л a  Л s ф S	Jr1	°- X	)2 о	\o о  R a — a	(T)	О co со	О cl	< о a
udag Лномве кинэнныгоп qjLOEITQO ‘з	ss	s§	§	is	if  CDO	ООО	o	О CM CM ф  o-H	cm	00 ~T a  —	os
Максимум поглоще- ния, нм	s  T*	о	Q	О	*?  О	О	CO  CM	in	Ю	LQ  CM Ю
Образец	, § о	6  g Я s § c	'<  s a § 3 о	=g  - а о	a о  S°lggs	g	Is	g  g g g Й	Л	O «	CL  а т 2	®	G- *t*	®  q.2 5 2	. a	d	e=( я	ci  2 § 2Л	«	go.	5	s?  о e-	g	о  О о & a a sr	О	U
Реагенты	co  S3	six	Q	5  2*	Ie	o+	U	2 -  1ё	ня  § £	Ha-	« “	ь	-.о  £ £	gti	a a. .	9E T?  >-» a	a ®	e4	K.2C	mT	®  tQ <	a §<	~	go	§	g	2:  fL -	т?5 ®	4,	>>  oj а ь	.д x	a	О	*=» Z	*т*	2  ex. а сз	*2. t;	s	s-<	a I	th.  E-. о. E?	co a	a	U	a T	Z	>	clLi-
Функциональная группа	Ja	a  ' K	a	a	a	a  t: e«	®	s	a	a  T §	a	cu	a  § a	§	g,	§  я а	я,	Э*	cd	®  £ S	«	s	g	a  g.	1	1  £ i	5	?	5	g	5  — 5	U	<	X	О	u
Год	Th	о	LC	OO	Ю  г-	CO	О	Ю	LQ  О	О	О	О	О  Т—«	’—•	*—•
Автор	.3	s	S’  О-	о	О.	§	“  и	*	Ь	&  S	Ю	"	®	S  s	s	=	s	Н  а	S	а	си  g L01	а	з СМ	0-00	и  £ю	ф см	so	ою	а  гт£т	ГСН2,	G£L tQ
в концентрированной серной кислоте (Амакс = 430). Та же длина
волны использована Гофманом [373], который экстрагировал
прегнандиол концентрированной серной кислотой непосредст-
венно из тонкого слоя хроматографических пластинок при ана-
лизе проб мочи. Для той же цели Илька и др. [397] и Вольф-
рум [837] применили реагент, состоящий из серной кислоты,
фосфорной кислоты и ванилина (измерения при длине волны
около 530 нм). В серной кислоте максимальное поглощение
прегнантриола и прегнандиола находятся почти при одной и
той же длине волны, поэтому их селективное определение воз-
можно только после разделения на колонках, заполненных фло-
рисилом или оксидом алюминия [233], или методом тонкослой-
ной хроматографии [115, 188].

Из методов, предложенных для определения дегидроэпианд-
ростерона в биологических образцах, можно упомянуть метод
Эртеля и Айк-Неса [602] с применением реагента, состоящего
из серной кислоты и этанола (^макс:=405 нм), а для определе-
ния тестостерона используется довольно селективный метод,
основанный на образовании синей окраски под действием раз-
личных реагентов, содержащих серную кислоту и ионы метал-
лов, например железа(III) и церия(IV) [325, 682].

Реагент, содержащий этанол и серную кислоту, применяется
также для определения метандиенона [741] и этистерона [462]
в лекарственных препаратах. Для определения метандриола
(17а-метил-5-андростен-Зр, 17-диол) в лекарственных препаратах
рекомендована концентрированная серная кислота (21Макс = 415нм)
или смесь серной и уксусной кислот (%макс = 495 нм) [518].

2.2.3.	ФЛУОРИМЕТРИЯ

Флуориметрический анализ стероидных гормонов тесно свя-
зан с колориметрическим анализом: во многих случаях, так же
как и в колориметрическом анализе, для возникновения флуо-
ресценции, пригодной для аналитических целей, необходима об-
работка проб. Преимуществом флуориметрии является гораздо
большая чувствительность. Наиболее распространены флуори-
метрические методы с использованием сильнокислых реагентов,
но описаны также методы, основанные на собственной флуорес-
ценции или на возникновении ее при действии других флуоро-
генных реагентов.

Методы, основанные

на собственной флуоресценции

Из различных классов стероидных гормонов собственной
флуоресценцией обладают лишь эстрогены, в состав которых
входит фенольное кольцо А. Максимум возбуждающего излу-
чения как у эстрогенов, так и их простых 3-эфиров находится
около 284 нм, а максимум спектра испускания лежит в обла-
сти 310—327 нм. Интенсивность этого флуоресцентного излуче-
ния в УФ-области гораздо ниже интенсивности флуоресценции
под действием кислот в видимой области: хотя имеется сооб-
щение о том, что нижний предел обнаружения эстрадиола до-
стигает 0,01 мкг/мл [98], но он в 100—1000 раз выше, чем это
необходимо для количественных определений. (Интересно отме-
тить, что относительная интенсивность флуоресценции эстрона
по крайней мере в десять раз ниже, чем у 17-оксипроизводных,
вследствие исчезновения 17-кетогруппы.)

Недостатки этого метода вытекают из относительно низкой
интенсивности флуоресценции и малых длин волн возбуждения
и испускания. При сравнительно высокой концентрации пробы
часто возникает флуоресцирующий фон, а сопутствующие веще-
ства, поглощающие УФ-излучение, могут вызвать тушение флуо-
ресценции. С другой стороны, преимуществом метода является
его необычайная простота, а все трудности, связанные с исполь-
зованием сильнокислых реагентов, можно устранить.

Джеймс успешно применил этот метод для определения ме-
странола в противозачаточных таблетках [411] и валерата эст-
радиола в масляных препаратах для инъекций [412]. Прогесто-
гены не мешают в первом случае (за исключением ацетата
хлормадинона с максимумом поглощения при 284 нм), но в по-
следнем случае необходимо хроматографическое отделение ак-
тивного начала на колонке. При анализе таблеток на содержа-
ние этинилэстрадиола методом, рекомендованным британской
фармакопеей 1980 [101в], влияние флуоресцирующего фона
устраняют путем измерения разности между флуоресценцией
нейтральных и щелочных экстрактов из таблеток, так как в ще-
лочной среде происходит тушение флуоресценции.

Кроме перечисленных выше и других [202, 435, 665] приме-
ров применения собственной флуоресценции в фармацевтике
можно еще привести работу Брамхолла и Бриттена [98] по оп-
ределению эстрогенов в моче. Это определение можно прово-
дить после ферментативного гидролиза, экстракции эфиром и
промывания экстракта раствором карбоната натрия с pH 10,5.
Если эстрадиол и эстрон проэкстрагировать из гидролизата
смесью бензола и петролейного эфира (1:1), измерение флуо-
ресценции последующего эфирного экстракта будет характери-
зовать содержание эстриола.

Методы, основанные на флуоресценции,
вызванной кислотами

Появление окраски при взаимодействии стероидов с силь-
ными кислотами обычно сопровождается флуоресценцией, и это
явление начиная с тридцатых годов используется для качествен-
ного и количественного анализа. Обзор результатов раннего пе-
риода и корреляций между флуоресценцией и структурой был
сделан Голдцихером [286].

Флуоресценция под действием кислот применяется в основ-
ном для определения эстрогенов. Хотя помимо реагентов, со-
держащих серную кислоту, успешно используются и другие
реагенты (фосфорная,соляная, муравьиная кислоты и др.), с по-
мощью которых во многих случаях удается добиться порази-
тельно селективных определений (например, Боскотт [92] опре-
делил а-эстрадиол в присутствии большого избытка р-эстра-
диола при помощи 90 %-ной муравьиной кислоты в качестве
флуорогенного реагента), в настоящее время почти исключи-
тельно применяются реагенты типа реагента Кобера, содержа-
щие серную кислоту (см. разд. 2.2.2), для определения эстро-
генов в жидкостях организма и смеси серной кислоты со спир-
том для фармацевтического анализа.

Разработанный Иттрихом [400, 401] вариант метода Ко-
бера—Брауна [106, 107] с применением реагента, состоящего
из серной кислоты и гидрохинона, и экстракции флуоресцирую-
щих продуктов наиболее удобен для определения общего со-
держания эстрогенов в моче. Вся методика легко поддается
автоматизации, и в последние несколько лет фактически только
такие методы и публикуются.

Например, Фрай и др. [267] предложили автоматический ва-
риант метода Хёнеля и Джонса [329], в котором рекомендуется
использовать в качестве флуорогенного реагента 63 %-ную (по
объему) серную кислоту [содержащую 2 % (масса/объем) гид-
рохинона] и в качестве экстрагента (после разбавления реак-
ционной смеси водой) 0,9 М раствор трихлоруксусной кислоты
в дихлорэтане. Длины волн возбуждения и излучения состав-
ляли 520 и 550 нм соответственно. Гутт-Кусьё и др. [289а] опре-
деляли общее содержание эстрогенов в сыворотке крови бере-
менных в непрерывном анализаторе после ферментативного
гидролиза и ионообменной очистки, используя раствор нитро-
фенола в хлороформе для экстракции флуоресцирующих ве-
ществ. Глюкоза и, по всей вероятности, другие альдегиды, при-
сутствующие в моче, мешают определению. Их влияние можно
уменьшить разбавлением проб перед анализом или устранить
полностью либо путем разделения методом ионообменной коло-
ночной хроматографии, либо путем восстановления альдегидной
группы борогидридом натрия. Эта стадия включена в большин-
ство методик, разработанных другими исследователями, для
автоматического определения эстрогенов в моче [64, 124, 330,
393, 568, 573, 745]. Различие между описанными выше и неко-
торыми другими не упомянутыми здесь методиками заключа-
ется главным образом в способе предварительной обработки

4 Заказ № 182
пробы и составе экстрагента. Конечно, эти методы позволяют
определить лишь общее содержание эстрогенов, но если экс-
трагировать эстрон и эстрадиол из водного раствора смесью
гексана и бензола (1:1), то можно селективно определить
оставшийся эстриол. Этот прием использован, например, в ра-
ботах Миклоши и сотр. [554] и Мессери с сотр. [545а] при опре-
делении эстриола в сыворотке крови и моче беременных. Вы-
сокая чувствительность метода Иттриха позволяет определять
до 3-10~10 г эстриола, и, следовательно, весь анализ можно вы-
полнить всего лишь из 0,2 мл сыворотки.

Кинетика образования флуоресцирующих продуктов типа
реагентов Кобера из различных эстрогенов исследована Фау-
лером и др. [260г] с целью разработки непрерывного кинетиче-
ского метода их определения в моче беременных.

Наиболее уязвимой стадией автоматических методов Кобера—
Иттриха является разделение фаз. Чтобы исключить ее, Левер
и сотр. [498], Литтл и сотр. [506], Хэммонд и сотр. [336] и Дар-
хэм [201] при автоматическом определении эстрогенов в моче
использовали целиком водную систему, исключив вообще ор-
ганический растворитель (даже стандартный раствор эстриола
вводят в реакционную смесь в виде натриевой соли в 0,1 М гид-
роксиде натрия). Пробу нагревали с реагентом, состоящим из
серной кислоты, гидрохинона и сульфата железа (II); при по-
следующем разбавлении раствора водным реагентом, содержа-
щим хлоральгидрат и трихлоруксусную кислоту, возникала
флуоресценция.

Благодаря высокой чувствительности метода, основанного
на флуоресценции в кислой среде, его обычно с успехом приме-
няют для определения эстрогенов в низкодозированных лекар-
ственных формах, в основном этинилэстрадиола и местрадиола
в противозачаточных таблетках. Высокая чувствительность иг-
рает особенно важную роль при анализе отдельных таблеток,
причем в большинстве случаев определение автоматизировано.
Для анализа таблеток на содержание эфиров эстрогена Вебер
и сотр. [824] в качестве флуорогенного реагента предложили
концентрированную серную кислоту, а для определения этинил-
эстрадиола Миллер и Дьюджид [555] и Хираи с сотр. [371а]
рекомендуют смесь серной кислоты и этанола (7:3), Хоури
и Кали [453] — 90 %-ную серную кислоту, фармакопея
XX США — смесь серной кислоты и воды (3:1), а Джеймс
[413] — реагент Либермана—Бурхарда (см. разд. 4.2.1). Неко-
торые авторы определяли местранол с помощью смеси серной
кислоты и метанола, например, Комер и др. [164] использовали
смесь (7 : 3), а Темплтон и др. [763] и Мариани и Мариани-Ви-
кари [525] — смесь (1:1). Смесь серной и уксусной кислот
(3:1) применяли Пастор и др. [614], а об использовании
реагента Кобера для этой цели сообщали Шрофф и Гутман
1719].

Методом флуоресценции в кислой среде можно также опре-
делить различные неэстрогенные половые гормоны. Из много-
численных работ, касающихся этого вопроса, следует упомянуть
четыре.

Тишлер и др. [774] определяли метандиенон в таблетках по
флуоресценции (возбуждение при 280 нм, испускание при
345 нм), возникающей при обработке 2 мл метанольного эк-
стракта из одной таблетки, содержащей 0,2 мг активного ве-
щества, 5 мл концентрированной соляной кислоты при 100 °C
в течение 20 мин. Как было установлено [773], механизм воз-
никновения флуоресценции в этом случае аналогичен механизму
возникновения флуоресценции при реакции метилтестосгерона
с 80 %-ной фосфорной кислотой и трихлоруксусной кислотой,
описанной Ньяу [593].

Эти методы не обладают высокой чувствительностью. Од-
нако, для того чтобы добиться необычайно высокой чувстви-
тельности определения прогестерона, надо, следуя рекоменда-
циям Таучстоуна и Муравека [775], перед обработкой серной
кислотой нагреть его с 2 М метанольным раствором гидроксида
калия с целью превращения в 6-кетопроизводное [492].

Флуориметрия играет важную роль при определении мета-
болитов спиронолактона. В организме спиронолактон распа-
дается с отщеплением тиоуксусной кислоты и частичным рас-
крытием лактонного кольца.

Одновременное определение обоих метаболитов — важная за-
дача [746а]. Она была решена с помощью метода флуориметрии
4*
ЭСС

Автоматический
пробоотборник

На промыва-
। ние пробы

Вода	□ мл/мин д 'АО
Воздух	—

Буфер (рню)

Дихлорэтан

Юч

Промыва- 1
ние	-~

пробы	ь

	
	
	Электрон- ный интег- ратор

г^ШОг-

ОСС

и^-

0^1

S-2^-
Г-, 0,32

На определение канреноевой

I кислоты

•фс

65°/о h2sq4

Сброс

Самописец Флуориметр

436/525 нм

дес

Воздух
~ Сброс

~д~70

0,32

0Д7

Q

ш



а
о

□ Стандартные шланги

[xj Красные кислотоустойчивые шланги
(Bed Acidfleac)

ЭСС	ОСС	,

гутп_ П __/77тт>_ И Проба

WJJyl “Шт I 1 н. на ~

Дихлорэтан

О мл/мин

□ После определения канренона

jig.”....	*7

Сброс

	
	
	Электрон- ный интег- ратор

Самописец

ДСС

Флуориметр
436/525 нм

	I			и  воздух	г
	65% H2S04	F	

1,85

3F=

I Воздух
Сброс

g|^58.

Г1232

Сброс

&
о

0,70

0,32

0,47

Фс

6

□ Стандартные шланги	□

0 Красные кислотоустойчивые шланги	О

(Reef Acidflex)

Рис. 2.6. Схема непрерывного автоматического определения канренона (а)
и канреноевой кислоты (б) [585].

ОСС — одинарная смесительная спираль; ДСС — двойная смесительная спи-
раль; ЭСС — экстракционная смесительная спираль; ФС — фазовые сепара-
торы; I, II, III — стеклянные соединители.

в сернокислой среде [280, 683, 684]. Недавно Нойберт и
Кох [585] описали автоматизированный вариант этого метода.
Канренон экстрагируют из пробы сыворотки при pH 9 дихлор-
этаном, обрабатывают 65 %-ной серной кислотой, а сернокис-
лотный слой подают в проточную кювету флуориметра. Канре-
ноевую кислоту, остающуюся в водной фазе после экстракции
дихлорэтаном, определяют аналогичным образом, превращая:
ее в канренон в присутствии соляной кислоты в качестве ката-
лизатора. Весь процесс автоматизирован, как показано на
рис. 2.6.

Определение стероидов другими
флуориметрическими методами

При обработке спиртовыми растворами гидроксида натрия
А4-3-кетоны сильно флуоресцируют как в растворах, так и на
хроматограммах [1, 3]; это легло в основу метода их чувстви-
тельного определения и избирательного обнаружения. Чрезвы-
чайно чувствительный вариант такого метода описан Капланом
и др. [441], проводившими реакцию на поверхности шариков из
гидроксида лития и измерявшими флуоресценцию с помощью
вращающегося держателя шариков.

Дансилирование дансилхлоридом открывает прекрасную воз-
можность получения флуоресцирующего производного по фе-
нольной оксигруппе эстрогена.
Реакцию дансилирования можно проводить в различных
растворителях, например в ацетонитриле или ацетоне, в при-
сутствии водного раствора гидроксида натрия или карбоната
натрия. Дансилированные производные можно экстрагировать
гексаном, диэтиловым эфиром и т. п. Флуоресценцию измеряют
пли непосредственно в хлороформном растворе (возбуждение
при 346—366 нм, испускание при 502—525 нм), или проводят
разделение экстракта методом тонкослойной хроматографии и
измеряют флуоресценцию индивидуальных эстрогенов после
элюирования пятна. При анализе готовых лекарственных форм
Фишман [251] использовал прямой метод, а в методиках Эрля
и Фогта [601], Эртеля и Пензеса [603], Бежей и Боша [76] и
Двира и Чейена [206] предусмотрена стадия разделения мето-
дом тонкослойной хроматографии. Эти методы очень чувстви-
тельны, поскольку позволяют легко определять субмикрограм-
мовые количества эстрогенов. Еще выше чувствительность
определений, основанных на применении производных 1-этокси-
4- (дихлор-гажж-триазинил) нафталина [152].

Пезе и Бартош [627] сообщили о флуориметрическом вари-
анте колориметрического метода определения кетостероидов
с использованием щелочного 2,6-ди-трет-бутил-/г-крезола (см.
разд. 2.2.2); в той же статье описано определение Д5(10)-3-кето-
стероидов по тушению ими флуоресценции пиронина.

Хорикава и др. [380] предложили новый метод определения
Д4-3-кетостероидов, основанный на флуоресценции (возбужде-
ние при 380 нм, испускание при 495 нм), возникающей при об-
работке изоникотиноилгидразона кетостероида хлоридом алю-
миния.

Определение стероидов (дигидротестостерона и эстрадиола)
флуоресцентно-иммунными методами описано в работе Экеке и
Эксли [218]. В этом методе, который представляет собой не-
радиоактивный вариант радиоиммуного метода (разд. 2.2.13),
вместо радиоактивной метки используется флуоресцентная метка
(4-метилумбеллиферон-З-уксусная кислота) и определение про-
водится флуориметрически после разделения свободного и свя-
занного в флуоресцирующий комплекс стероида методом двой-
ных антител.

2.2.4.	ИНФРАКРАСНАЯ СПЕКТРОФОТОМЕТРИЯ

В классический период развития химии стероидов инфра-
красная спектроскопия была наиболее мощным средством уста-
новления структуры стероидных соединений и даже в наши дни
остается одним из наиболее важных методов в этой области.
Почти все публикации, касающиеся теоретических и практиче-
ских аспектов синтетической химии стероидов, содержат ценные
ИК-спектроскопические данные. В атласах спектров и исчерпы-
вающих монографиях по ИК-спектроскопии приводится масса
сведений о стероидах, однако здесь будут обсуждаться лишь те
из них, которые представляют особый интерес для рассматри-
ваемых классов стероидов [136, 196, 418, 663].

Наряду с применением ИК-спектроскопии для идентифика-
ции стероидов и установления их структуры этот метод имеет
важное значение для распознавания полиморфных модифика-
ций, часю встречающихся у стероидных гормонов [484, 544г
645].

По сравнению с этими областями ИК-спектрофотометрия
как метод количественного анализа стероидов имеет меньшее
значение. Тем не менее по этому вопросу опубликовано боль-
шое количество статей, начиная с раннего периода развития
анализа стероидов [132, 611] и до последнего времени [148].

Большим преимуществом . ИК-спектрофотометрии по сравне-
нию с УФ-спектрофотометрией является то, что спектры даже
в наименьшей степени замещенных производных относительно
богаты характерными полосами поглощения, что позволяет
анализировать даже сложные смеси стероидов без какого-либо
предварительного разделения. Однако метод ИК-спектрофото-
метрии имеет и определенные недостатки. Чувствительность его
чрезвычайно мала: значения молярных коэффициентов погло-
щения полос, наиболее часто используемых в количественном
анализе стероидов, составляют всего 50—300. Кроме того, из-за
отсутствия полностью прозрачных растворителей толщина кю-
веты должна быть гораздо меньше, чем при УФ-спектрофото-
метрических измерениях (обычно она не превышает 0,5 мм).
Это значит, что концентрация измеряемого раствора в большин-
стве случаев должна составлять несколько процентов. При таких
высоких концентрациях часто происходят внутримолекулярные
взаимодействия, и поэтому всегда следует тщательно проверять
подчиняемость закону Бера.

Другая трудность заключается в том, что оптические плот-
ности, на определении которых основаны количественные изме-
рения, нельзя измерить непосредственно; их можно оценить по
спектрам, используя метод базисной линии. Поэтому методы
ИК-спектрофотометрии характеризуются меньшей правильно-
стью и более низкой воспроизводимостью, чем методы УФ-спек-
трофотометрии.

Хотя спектры твердых веществ, полученные методами ИК-
спектрофотометрии на таблетках из бромида калия [351, 352,
674] и тонких поверхностных пленках [362], а также методом
инфракрасной отражательной спектроскопии [75], нашли приме-
нение в количественном анализе, в большинстве случаев реко-
мендуется использовать спектры растворов.
Таблица 2.4. Определение некоторых стероидов в лекарственных препаратах методом ЙК-спектроскопий

Автор	Год	Стероид	Волновое число, см~*	Функциональная группа		Максимальная концентрация градуировоч- ного графика, мг/мл	Растворитель	Толщина слоя, мм
Хаттен и др. [148]	1976	Ацетат хлормадинона	1732	v(C=O) на я)	(сложноэфир-	10	СНС13	0,5
		Димэтистерон	1658	v(C = O) па)	(Д4-3-кетогруп-	5	СНС13	0,5
		Диацетат этинодиола	1735	v(C = O) ная)	(сложноэфир-	6	СНС13	0,5
		Ацетат мегестрола	1650	v(C=O) группа)	(Д4’6-3-кето-	5	СНС13	0,5
		Норэтистерон	1660	v(C=O) группа)	(Д4-3-кето-	5	СНС13	0,5
		Ацетат норэтистерона	1663	v(C = O) па)	(Д4-3-кетогруп-	8	СНС13	0,5
		Норэтинодрел	1715	v(C = O)	(3-кетогруппа)	7	СНС13	0,5
		rf-Норгестрол	1662	v(C = O) па)	(Д4-3-кетогруп-	5	СНС13	0,5
Белломонте [70]	1971	Линоэстренол	ИЗО	v(C—О)	(17-ОН)	60	СС14	0,5

Автор	Год	Стероид	<и  2 .  gg_  Й с 1	Функциональная группа	Максимальная концентрация градуировоч- ного графика, мг/мл	Растворитель	Толщина слоя, мм
Сильвестри [726]	1971	Метандиенон	1660	v(C=O) (Д1»4-3-кето- группа)	14	Клофибрейт	0,5
Павельчик, Мар- цинек и др. [523, 620]	1973	Метилтестостерон	1662	v(C = O) (Д4-3-кетогруп- па)	25	СНСз	0,2
	1976	Прогестерон	1662	v(C = O) (Д4-3-кето- группа)	25	СНС13	0,2
		Местранол	1502  3308	Ароматическое кольцо А v(C—Н) ~ (17-этиниль- ная)	50  50	СНС13  СНС13	0,2  0,2
Ито, Амакасу [399]	1957	Бензоат эстрадиола	1748	v(C = O) (сложноэфир- ная)	2	CS2	1
			1064	v(C—О) (17-ОН)	2	CS2	1
		Этистерон	1667	v(C = O) (Д4-3-кетогруп- па)	2	СНС13	1
			3333	v(C—Н) (17-этиниль- ная)	2	СНС13	5
Фармакопея  XX США	1980	Параметазон	1656	v(C = O) (Д1>4-3-кето- группа)	3	CHCI3	1
Наиболее употребительным растворителем является хлоро-
форм, однако описано также применение тетрахлорида угле-
рода и дисульфида углерода. В ближней инфракрасной обла-
сти можно использовать и другие растворители, например пири-
дин. В частности, Кабасакальян и др. [434] применяли этот
растворитель при определении числа гидроксильных групп в мо-
лекуле стероида по интенсивности полосы колебания О—Н. Что
касается этой полосы, особого внимания заслуживает работа
Бирмингема и др. [80], в которой сообщается об исследовании
области частот О—Н для качественного и количественного
анализа; авторы работали на ИК-спектрофотометре с кварцевой
оптикой с более высокой разрешающей способностью, чем
у обычных ИК-спектрофотометров.

Однако чаще всего используются не колебания v(O—Н),
а колебания v(C=O) (кетоны и сложные эфиры), v(C—О)
(спирты и сложные эфиры), ароматического кольца и др. Не-
смотря на многочисленные сообщения об успешном применении
ИК-спектрофотометрии для количественного анализа смесей
стероидов и главным образом лекарственных препаратов [70,
148, 399, 523, 618, 620, 678, 726], перечисленные выше трудности
не позволяют рекомендовать этот метод в качестве стан-
дартного ни в одной из областей аналитической химии сте-
роидов.

В табл. 2.4 приведены примеры практического использова-
ния ИК-спектрофотометрии для количественного анализа раз-
личных лекарственных форм.

2.2.5.	ЯМР-СПЕКТРОСКОПИЯ

ЯМР-Спектроскопия служит в основном для установления
структуры соединений, однако в литературе имеются сведения
об использовании метода в количественном анализе органиче-
ских веществ [445]. Это относится и к химии стероидов: наряду
с широким применением ЯМР-спектроскопии для решения
структурных задач [77, 135, 371, 376], ее иногда используют
и в аналитических целях.

ЯМР-Спектроскопия обладает исключительно высокой изби-
рательностью, но очень низкой чувствительностью, поэтому для
выполнения определений требуется по меньшей мере несколько
миллиграммов вещества. Этот недостаток, конечно, не позво-
ляет использовать его в количественном биоклиническом ана-
лизе, но не исключает его применения в фармацевтическом ана-
лизе стероидов.

Например, Авдович и др. [44] определяли содержание ме-
странола в массе фабричного продукта, регистрируя его спектр
в дейтеропиридине (дифенилуксусная кислота применялась,
в качестве внутреннего стандарта) и измеряя интенсивность ли-
нии протонов метокси- (3,67 м. д.) и этинильной (3,20 м. д.)
групп. Та или другая из этих групп отсутствует в потенци-
альных примесях местранола (эстроне и этинилэстрадиоле),
поэтому метод достаточно селективен. Те же авторы [45] пред-
ложили определять Д]’4-3-кетостероиды в лекарственных препа-
ратах по линии С-1 протона.

Описанные выше и аналогичные им методики можно рас-
сматривать в качестве оригинального практического приложе-
ния ЯМР-спектроскопии в довольно узкой области анализа
стероидов. ЯМ^Р-Спектроскопия никогда не заменит существую-
щие стандартные методы, однако в отдельных случаях уникаль-
ная селективность этого метода облегчает решение гораздо
более сложных задач. В качестве примера можно привести ме-
тодику одновременного определения изомеров эстрадиол-3-мети-
лового эфира, предложенную Хойером и сотр. [384]. При гидри-
ровании тем или иным способом 3-метокси-1,3,5(10),8,9-эстра-
тетраен-17р-ола(1) по Д8-двойной связи продукт реакции может
содержать небольшие количества исходного вещества, три изо-
мера метилового эфира эстрадиола [«природного» 3-метокси-
8(ЗН,9аН-1,3,5( 10) -эстратриен-17Р-ола (II), 3-метокси-8аН,9аН-
1,3,5 (10) -эстратриен/17р-ола (III) и 3-метокси-8рН,9рН-1,3,5-
(10)-эстратриен-17р-ола(1У) ] и З-метокси-1,3,5(10),6,8(9)-
эстрапентаен-17Р-ола(V). На химический сдвиг ангулярной 13-
метильной группы влияет наличие протонов в положениях 8 и
9, а также их конфигурация; следовательно, возможно одно-
временное определение этих соединений.

Как видно из табл. 2.5, химические сдвиги 13-метильных
групп соединений I, II, III + IV и V в дейтеробензоле в качестве
Таблица 2.5. Химические сдвиги 13-метильной группы в спектрах продуктов
восстановления 3-метокси -1,3,5 (10) ,8 (9) -эстратетраен-17р-ола
в различных растворителях [384]

Растворитель	6, м. д. *				
	I	п	ш	IV	V
CDCI3	0,78	0,77	0,85	0,85	0,69
c5d5n	0,99	0,95	1,05	1,04	0,88
CeDj	0,78	0,71	0,81	0,81	0,66

Обозначения I—V см. в тексте.
растворителя достаточно хорошо разрешены (спектры сняты на
приборе, работающем на частоте 100 МГц); следовательно, их
можно избирательно определить по соответствующей интеграль-
ной интенсивности. Что касается соединений III и IV, то можно
определить лишь их сумму, но сами изомеры можно разделить
методами газовой хроматографии.

1.2.6. ПОЛЯРОГРАФИЯ

Об использовании полярографии для определения стероид-
ных гормонов сообщалось еще в конце 1930 г. [9, 217, 836]. Впо-
следствии появились публикации, посвященные описанию оп-
тимальных условий определения различных классов стероидов
и применению полярографии для определения стероидов в био-
логических жидкостях и лекарственных препаратах. Отличный
обзор достижений за первые 15 лет можно найти в моногра-
фиях Бржезины и Зумана [100], а также Кольтгофа и Лингейна
[474]. Позднее полярографический метод был вытеснен из био-
химического анализа более чувствительными методами, но он
до сих пор остается еще довольно важным в фармацевтическом
анализе.

Из функциональных групп, наиболее часто встречающихся
в стероидных гормонах, только кетогруппа способна непосредст-
венно восстанавливаться на капающем ртутном электроде. Изо-
лированные кетогруппы восстанавливаются при слишком боль-
ших отрицательных потенциалах, чтобы их волны можно было
использовать для количественного определения: потенциалы по-
луволн лежат в интервале от —2,28 до —2,76 В [432]. Хотя
стероидные кетоны под действием реактива Т Жирара (хлорид
бетаингидразида) легко превращаются в соответствующие гид-
разоны, образующие четырехэлектронные волны с Е1/г от —1,3
до —1,4 В [99, 217], этот метод, по-видимому, больше не при-
меняется. Вероятно, единственный класс кетостероидов, для
которого полярография используется до сих пор, это а,|3-нена-
сыщенные 3-кетостероиды. В основном благодаря работам Ка-
басакальяна и сотр. [430—433] и других авторов [517, 869]
были решены теоретические и практические вопросы восстанов-
ления ненасыщенных кетостероидов на капающем ртутном
электроде, и полярографический метод нашел широкое приме-
нение.

Судя по трем приведенным ниже примерам, взятым из ра-
боты Хрди [385], потенциалы полуволн 3-кетогруппы зависят
от положения двойной связи.
Е1/1=-1,06 В

Разность потенциалов полуволн, например Д4-3-кетонов и
Л^-З-кетонов, достаточна велика, что позволяет проводить их
раздельное определение [430].

Более поздние данные по зависимости потенциалов полуволн
ют структурных особенностей, в том числе дальних взаимодей-
ствий и стерических затруднений, суммированы в работе Зу-
мана [868].

Полярографическое восстановление ненасыщенных 3-кето-
групп протекает с участием одного электрона и приводит к об-
разованию пинакона [431, 517].

(2.П)

При использовании классической полярографии для количе-
ственного определения наиболее надежные результаты полу-
чены в основном в смесях (1:1) воды и органического раство-
рителя (метанол, этанол и т. д.), забуференных до pH 5—6
[192, 385, 430, 431, 869], но описано применение фонов с более
высокими значениями pH, что способствует увеличению селек-
тивности методов [271, 385, 869].

Большим достоинством полярографических методов при ана-
лизе лекарственных препаратов является то, что твердый
наполнитель обычно не мешает определению (так же как и
силикагель при разделении анализируемых стероидов методом
ТСХ [331]), поэтому анализ можно выполнять в суспензии, что
облегчает подготовку пробы. Однако классические методы, опти-
мальный рабочий интервал концентраций которых составляет
10-3—5- 10-3 М, недостаточно чувствительны для анализа низ-
кодозированных препаратов, и правильность оценки высот по-
лярографических волн неудовлетворительна.

Избежать этих недостатков при анализе кетостероидов по-
могло введение новых полярографических методов: полярогра-

Потенциал отн. Ag/AgCl, В

Рис. 2.7. Дифференциальная импульсная
полярограмма 40 %-ного метанольного
раствора, содержащего 20 мкг/мл нор-
этистерона, на фоне 0,04 М бромида
тетраметиламмония [608].

фии в неводных апротонных растворителях [838], переменното-
ковой полярографии [742, 838] и метода полярографии по вто-
рой гармонике [354].

Один из современных полярографических методов, диффе-
ренциальная импульсная полярография, в 10—100 раз чувстви-
тельнее классических методов, и оценку высоты полярографи-
ческих пиков в дифференциальной импульсной полярографии
можно провести гораздо точнее, чем полярографических волн.
На рис. 2.7 представлены типичная дифференциальная импульс-
ная и классическая полярограммы, а в табл. 2.6 приведены све-
дения о некоторых дифференциальных импульсных полярогра-
фических методах.

Помимо ненасыщенных кетостероидов полярографически
можно также определять эстрогены, если превратить их фе-
нольное кольцо А в легко восстанавливаемое нитрозопроизвод-
ное [366, 696]. Однако вряд ли этот метод найдет широкое при-
менение.

Другим любопытным примером полярографического ана-
лиза, основанного на предварительной дериватизации; служит
определение линоэстренола, описанное Ван Беннекомом и сотр.
[788]. Как следует из уравнения 2.12, полярографически неак-
тивный линоэстренол под действием 60—80 %-ной (по объему)

	«в .  '	*=( <я						
	Н >5 CQ S £ S Е-  с Е  S 2 < s		О о	о о	LO CM	о LO	S
aS О Я из  Я	Концентрация анализируе- мого раствора	1 МГ/100 МЛ	W с-01—S-0I	5—40 мг/  100 мл	1,4 мг/100 мл	W €-01  —е-01 • 9	£ со  О J о
ipafax методом дифференц	Растворитель/рН	0,04 М ЩСНз)4Вгв сме- си Н2О—СН3ОН (6 : 4)	0,1 М N(C2H5)4Br в сме- си Н2О — диметилфор- мамид (6 : 4) (pH 10,6)	Те же, что в [23]	Этанол—фосфатный бу- фер (pH 5,6) 1 : 4	Этанол—фосфатный бу- фер (pH 6) 1:1 или  1 :2	Этанол—фосфатный бу- фер (pH 6) 1 : 2
яие андрогенов и гестогенов в лекарственных преш эй полярографии	Препарат	Таблетки (анализ от- дельной таблетки)	В массе продукта	Таблетки, масляные пре- параты для инъекций	Таблетки	Растворы для инъекций	Таблетки
	Стероид	j	Норэтистерон	Прогестерон, 17а-окси- прогестерон, ацетат мед- роксипрогестерона, дид- рогестерон, норэтистерон	Те же, что в [23] +аце- тат хлормадинона	Норэтандролон, флуок- симестерон	Прогестерон, ацетат медроксипрогестерона, тестостерон и его эфиры	Норэтистерон (ацетат), диметистерон, норге- стрел
Ф я Ч О Ф Я  5 ф >> О- Я с §							
	Год	1977	1977	1977	1978	1976	1977
О я							
Таблица 2.6.	Автор	Офейм [608]	d  Я я я,—, t? СО < см	d  я  и я  яю о CM	Он я Н  я  я ।—1 я о  «22.	d  я  я ф  н о?  я ХГ  rrzL	d  я  я  ф  но  я ю
серной кислоты превращается в полярографически активное
Д16-20-кетопроизводное, которое можно полярографировать в ре-
жиме дифференциальной импульсной полярографии после раз-
бавления метанолом до концентрации около 1 мг/100 мл; по-
тенциал пика находится при —0,66 В.

Следует отметить, что, согласно данным Зумана [868], на
потенциал полуволны кетогруппы могут существенно влиять га-
логены в соседнем с ней положении, причем восстановительное
отщепление самих галогенов может служить основой количе-
ственных определений [23, 354].

Совсем недавно Хейнеман и сотр. [358, 359] предложили
вольтамперометрический иммунный метод определения эстри-
ола. Он основан на том же принципе, что и радиоиммунный ме-
тод анализа, но вместо радиоактивной используется электроак-
тивная метка. При определении эстриола меткой служит
эстриол-4-меркуриацетат; определение основано на конкурент-
ном равновесии между ним и немеченным эстриолом за актив-
ные центры на антителах, связывающих эстриол. Преимущество
этого метода состоит в том, что не нужно разделять соедине-
ние-метку в свободном и связанном состояниях, так как потен-
циал полуволны связанного соединения лежит в более отрица-
тельной области, чем потенциал полуволны свободного соеди-
нения.

2.2.7.	ТИТРИМЕТРИЧЕСКИЕ МЕТОДЫ

Молекулы стероидных гормонов и промежуточных продук-
тов их производства, как правило, не содержат функциональ-
ных групп, которые можно было бы использовать для титри-
метрического определения. Все же титрование в неводных сре-
дах позволяет определять практически все функциональные
группы в стероидах, однако относительно большой размер
пробы, требуемой для анализа, исключает его из числа мето-
дов биоклинического анализа, а в большинстве случаев и фар-
мацевтического анализа. Основное применение титриметрия на-
ходит при определении содержания стероидных гормонов
Таблица 2.7. Некоторые титриметрические методы определения стероидных гормонов

Метод обнаружения конечной точки	«Я	,	»Я  Я	о	Я К	К	к  „	Я	я S	sS	П	Я	Я  s	s	з	*В	£  g ggs IM я	я	g	3	2	I	s	3 °	£	я	О	§ о	2  g	g’S°g§	g	я о я  &	£о	§	•&	§§	о  со	СО Я	2	~ ffi Е £	о	h СХН	Ям	S  Я	Я	я	® 3 § я ®	£2	я о о	os	я  CQ	CQO	Н	^ЛЯНЕ	<	HSE	Ню	Н
Титрант	м s Е	,х §  >т*	§ 5	О'	® t“'у и ss  «м-1	я о	J*	«	<d я  S	?е	f	£| 5^:i ?| g	§<О	X  2	fflZ	Е	pg|	2  я я	я	S О я я | О к | Ою	®О о ся	я  о	-jSSS—W-Wq«oXSL«-  o'	о о	о □ d U o'do UdO U dt^dO- u G d
Реагент а	Br2/AcOH + KI Формиат гидро- ксиламмония Салицилат гидро- ксиламмония NH2OH-HC1 + + NH(C2H5)2
Среда	п	gs	s	§	У	d  О	30	£	н	И	U  £	<£	-	«	1	ж  м	О	s	е;	я  ГС	л	о	<=(	X	О  я	п -	Л	2	Я	о	о	М  0?	’в*	оз	ffl	S<	ГС  .Я	Н	I	0)	tJ-i  »	Z О	„	1	„	§	>>	1	<	-г  ьС Е	ГС	Н	СО	Н  —	.г’о	п Й	Й	о	।	о	d	Ou-  (J	о о	^О	О	SS	i	я	<  Ж ы>ы> ЕЕ Е	»	О Е«  и ЕЖ ООО	Ч ьоСП ы OZ
Функциональная группа	я	Я	,  g S а)	,	. я	л  S	о| я"?	о	я	о  Я Я л	о	О«о	«  ЯКгчмЯсЗЛ	05	Я	Я	Я  S §"йчЕ g 5	X л s <=(а °  Я	Я о О 2 О	с	ЯГ	ЯГ	►—।	। Я  »Я sS |7? Cl, S И И	И	'—'	5 Й Я 5  О	О £ S О О	Q-	Я	Я £	(2 С к  S	g	g  ю ю ® S -*"5/ кЗ »3	Q 03 Разросся ,г? о  <1	со я сояОя^о Оя
Год	•—<	ООО	СО	Ю	СО см о	о  8	58	8	8	58	Sfefe	§  v—(	w—( w—(	w—(	w—(	1—*	»—<	»—*	»—<	»—<	»—<
а о  03  5 Заказ №	К	i i	г ।	Я  о	,	CD	co	. л  £	s 		я«	«ч	Ю	.	i C  H	_ oEo	£ d. Sx & E£  ^gSLs	о	я	a	«  г. г.	г. я cl 2	я	00 § ex	f9 ® r-.  1	CD	to	£	S J2-	2	!<b> -DVD	<Dr—,	Ю	03  m м c. Q-^	M	cl 5 S2 l-'t	5 ГгГ я-,3? 03	£2 9^	exfe  a £ :o >0 2;	>3	«CD	g	3	J=>	=CJ 2 Д	®Ь;	О  HeUhSS	CT	H	□	bd я	<	EL	H El Д	ST ri	H	cxZL  > 182
Продолжение табл. 2.7

Метод обнаружения конечной точки	’S	।  к я О ’«	АЗ	«В  а а	а	я	g	a	sS  Си Си	СХ	±	Си	S  н н а 2	3	о О а Й  О О	a	sX	Л	а	®	Ч	Я	а	’Я  g g	’Я	аз	-	°	о	к Ч	а 3  ОО з	5'5 gj-	S § я 2 ®а  я а	и	о	а	а	о	a	я	сх^х	ч	о  я а	о	л	н	У	а	g-»s	£	н	л	£  а в	ч	но	а	о	х	з	ч	эа	о	ч	но  оо	о	о	ч	2	s	о	£	а	§	s	о	о	ч  нн вяао	® сх	£ ® о ®	5 2  о о о з си а	си ex Sr	н й « са а  ее eSixie	S 8 se t^-e-
Титрант	XX	о	<л	H	Z	о  О О	- a	®  ►55 У z	N сп	н У У  ZZ X	.	.XX  ...ан	®	•	•  a a a	xz1	a a  —<O	CM	CM	CM  ннг-ч	Qo	co	CD	О	-7  o' о	о	o' <1	о	о	о	о"	о
Реагент а	►Ь . а а ч< ч ч ан а £ cq	я осп^	X  а	О ч х>	о  । 1	1* О	3 ° я^'о'	1	а	I  Il	§	£ ®« н g	1	z	1  »-А	<£	СЗ а СЗ Я  5	<L	Си . g Си g	я  0	2	а + ® а ®  «	£	Я •“ аЯ о.	"  Z	X	Со. Pts Г	о
Среда	LO  «Й	XX	S  о ''з	с:	о  О СХ	ео	СХ	СХ	г-  Z >>	о	К	п	У  ьв«-	z	9,	Q	§  >1 <	«  а ч	сз  S- ? «ч ч	чч	е’?:  5 св О о о	-?	о	о	2^.  а о 1-у ах	м	а	а	а	а  S4	а	св	У	а	л	Ч	Sa  а 5 ьл н	н	X	н	н	о	2 к  СМв	СП	О	СП	СП	X	СП ИО	
Функциональная группа	a g	^33	Л  ® а л	со Ч Ч	Q  а	а	5г	_	~	а	а	°  я	2	g	о	о	д  ® ®	®	я	§	о 'з'	®	®	а	о  2 2	g	*&	а	а ч	>*’“1	о	о	а	§	g  ®® ® 2^2«&°	= чо  К ЕЗ	ЕЗ	2	_ Ч	О w	О	О	ю	® О СО  аа	а	®^ясх§_	3	2^	2о-О  аа а	к 5 ? ЙгМ ®	® о"  аа	а	о	F а	£ $	„	о	gag  СПСП	СП	О	&СМ	§СП^	CU	CU	в	^оО
Год	со о	оз	сп	см	r-J^SP  8S	8	S	S	fefefc	о §  Т—< т—, Т—< т—f	V—1	’—1
Автор	а	4 &  о				 С С  г——1	g	г—1	Q«	a a S?	{—}	{—|  со©	а	ч		 °2	*—1	*—1  оз оо § оз	so®	ОО  см о> >± см	а	сз и. сз  •&e.2Ssrg.	Sto SooSS’g *«*«  eue£

а Используется обратное титрование.

б После гидропиролитического отщепления фтора.
в массе продукта, а также в промежуточных продуктах их про-
изводства, но даже и здесь титриметрия играет гораздо мень-
шую роль, чем при анализе других лекарственных препаратов.

В табл. 2.7 перечислены некоторые титриметрические ме-
тоды определения стероидных гормонов и промежуточных про-
дуктов их производства.

Из методов, приведенных в табл. 2.7, особое значение имеет
определение этинильной группы [101в, 293, 732]. Этот метод,
основанный на титровании стандартным раствором гидроксида
натрия азотной кислоты, выделяющейся при реакции этинил-
стероидов с нитратом серебра, является стандартным и реко-
мендуется фармакопеями разных стран для определения эти-
нилстероидов в массе продукта.

(2.13)

Заслуживает упоминания также метод Гёрёга и сотр. [310],
предназначенный для определения аллилэстренола. Он основан
на титровании уксусной кислоты, образующейся при реакции
метанола и ацетата ртути(II) по двойной связи стероида; этот
метод достаточно селективен при определении изолированных
Д4- и 17-аллильных двойных связей, причем другие двойные
связи не мешают анализу.
2.2.8.	ГРАВИМЕТРИЧЕСКИЕ МЕТОДЫ

В классический период развития аналитической химии сте-
роидных гормонов гравиметрические методы принадлежали
к стандартным методам. Значение их, конечно, постепенно
уменьшалось в связи с трудоемкостью и необходимостью боль-
шого количества вещества для анализа. Однако благодаря вы-
сокой достоверности они до сих пор находят применение, в ос-
новном для определения прогестерона и сложных эфиров тесто-
стерона в лекарственных формах [632а]. Подробное обсужде-
ние классических методов можно найти в обзоре Фориста
и Джонсона [256] и монографиях Гёрёга и Шаца [3126].

В основе определения прогестерона обычно лежит реакция
с динитрофенилгидразином в кислой среде, приводящая к обра-
зованию 3,20-бисфенилгидразона, малорастворимого в смеси эта-
нола с водой [161, 463, 538].

Для надежного определения сложных эфиров тестостерона
(главным образом в масляных растворах) служит реакция об-
разования семикарбазона по 3-кетогруппе под действием аце-
тата семикарбазида в смеси метанола с водой [520].

2.2.9.	КОЛОНОЧНАЯ ХРОМАТОГРАФИЯ

Хотя колоночную хроматографию нельзя рассматривать как
прямой метод количественного анализа стероидов (высокоэф-
фективная жидкостная колоночная хроматография подробно
разбирается в разд. 2.2.12), она кратко обсуждается в этой
книге не только потому, что является надежным орудием в ру-
ках органиков и биохимиков, но и потому, что ее значение как
метода отделения, фракционирования, разделения и очистки
стероидов перед последующей стадией аналитического опреде-
ления нисколько не уменьшилось. Более того, в результате усо-
вершенствования техники набивки колонок возможности коло-
ночной хроматографии в настоящее время гораздо шире, чем
в классический период развития химии и анализа стероидов.

Из монографий, содержащих важные сведения по этому во-
просу, можно указать книгу Нейера [583], в которой обобщены
классические методы, а наиболее исчерпывающий обзор совре-
менных методов можно найти в книгах Хефтманна [355, 808]
и в главе, написанной Прохазкой для монографии, изданной
Дейлем, Мачеком и Янаком [646].

В этой главе колоночная хроматография неоднократно упо-
миналась как важная стадия сложных аналитических определе-
ний половых гормонов, предшествующая измерению методами
спектрофотометрии [108, 109, 246], колориметрии [317, 782, 783,
847—849], флуориметрии [412, 855], газовой хроматографии [6,
16, 21, 46, 48, 68, 73, 90, 96, 213, 264, 275, 291, 357, 410, 482,
488, 552, 567, 596, 668, 670, 691, 770, 771] или высокоэффектив-
ной жидкостной хроматографии [671], радиоиммунными [67,
182, 326, 612, 638, 654, 687, 813] и другими радиоактивными
[186, 187, 230, 250, 490, 529], ферментативными [14, 344], масс-
спектрометрическими методами [731] и т. д.

В большинстве упомянутых публикаций колоночная хрома-
тография использована для определения стероидов в сложных
биологических объектах, но она широко применяется и для раз-
деления стероидов в лекарственных препаратах [108, 109, 246,
317, 412, 668, 782, 783в, 847—849].

Поскольку стероиды — это соединения средней полярности,
для их разделения применяется широкий круг адсорбентов
и систем растворителей.

Все адсорбенты, предложенные в классический период раз-
вития хроматографии стероидов, такие, как силикагель [90, 275,
357], кизельгур [57а, 825], оксид алюминия [21, 187, 357, 410,
612, 681, 771] и силикат магния (флорисил [233, 482, 670, 782] ),
используются и до сих пор. Чтобы добиться разделения род-
ственных стероидов или выделения всех стероидов из сложных
смесей, адсорбенты часто пропитывают солями серебра. На-
пример, Пеннер и сотр. [621] для выделения хингестанола
и продуктов его разложения из сезамового масла в качестве
адсорбента использовали флорисил, обработанный аммиачным
раствором нитрата серебра, и в качестве элюента этанольный
раствор хлорида аммония.

Ионообменная хроматография пригодна не только для раз-
деления кислых стероидов, как, например, эстрогенов [6] и их
производных [529, 567, 855], она широко применяется для выде-
ления (или, как часто говорят, экстракции) нейтральных сте-
роидов из биологических проб [48, 213, 291, 596, 691]. Для этих
целей почти всегда используется стиролдивинилбензольная
смола амберлит XAD-2. Например, Эггер и др. [213] выделяли
стероиды, содержащиеся в моче, непосредственно после их фер-
ментативного гидролиза на колонке размером 600x20 мм, за-
полненной XAD-2 и промытой 5%-ным водным раствором хло-
рида натрия. Стероиды вымывали из колонки метанолом;
полученный раствор пригоден для установления профиля кон-
центраций стероидов методом капиллярной газовой хромато-
графии.

Наиболее важным моментом в развитии колоночной хрома-
тографии стероидов в последнее десятилетие следует считать
введение гель-проникающей хроматографии, которая сейчас
чаще всего применяется при подготовке биологических проб
для количественного анализа методами газовой хроматографии,
радиоиммунными методами и др. Первоначально использовали
(а часто используют и сейчас) полидекстрановые гели, напри-
мер сефадекс G-25 [357, 770] и G-10 [329а], но впоследствии
было найдено, что путем уменьшения их полярности, например

Рис. 2.8. Разделение эстрогенов методом гель-хроматографии на колонке раз-
мером 30 смХ1 см, заполненной 4 г сефадекса LH-20, элюированием смесью
циклогексан—хлороформ—метанол (8:1:1) [505].

7— эстрон; 2 — эстрадиол; 8—16-кетоэстрадиол; 4—16-эпиэстриол; 5 —
эстриол; 6—1,3,5(10)-эстратриен-3,6а,17|3-триол;	7 — 6-кетоэстриол; 8 —

1,3,5 (10)-эстратриен-3,15а, 16а, 17£-тетраол.	*

связывая свободные оксигруппы сефадекса G-25 с образованием
оксипропилпроизводных, можно добиться лучших результатов.
Для разделения и очистки стероидов разной полярности чаще
всего применяют сефадекс LH-20 [16, 68, 96, 182, 246, 279а, 285,
326, 3386, 552, 596, 638, 654, 687, 770, 832а].

Сефадекс LH-20 особенно удобен при разделении стероидов
с близкой полярностью. На рис. 2.8 приведен характерный при-
мер — кривая элюирования восьми эстрогенов, взятая из статьи
Лисбоа и Страсснера [505].

Для разделения менее полярных стероидов в последние годы
все шире и шире используются оксиалкоксипропилпроизводные
сефадекса LH-20 (липидекс) [14, 48, 230, 731, 813, 854].
На рис. 2.9 показано разделение стероидов на короткой ко-
лонке, заполненной липидексом.
В отдельных случаях с особой целью были получены специ-
альные производные сефадекса LH-20. Аксельсон и Сьявалл
[46, 48] описали избирательную сорбцию слабоосновных меток-
симов стероидов на сульфоэтил-ЬН-20 и разделение стероидов
на нейтральную и фенольную фракции на триэтиламиноокси-
пропилоксилалкил-сефадексе LH-20.

Андростендион В
Прогестерон В
20р-Дигидропрогеаперон В
Дегидроэпиандростерон
Диг идротестостерон
Тестостерон
17а - Оксипрогестерон
17а-Оксипрегненолон
Эстрон

Эстрадиол~17р
Кортизол

' И) ' ' b ' ' 20'4 25 ' ’ 30

объем элюирования, мл

35

Г''-’"1 ' г

0	5

Рис. 2.9. Разделение стерои-
дов на небольшой колонке
(8 см X 0,4 см) с липидек-
сом [230].

к----------------------------Яч--------

Гексан'.хлороформ 90:10	80:20 50:50 40:60

Столь же общеупотребительным является диэтиламиноэтиль-
ное производное сефадекса (DEAE-сефадекс) для разделения
кислых стероидов [91, 575, 854].

Недавно группой исследователей под руководством Адлерк-
ройца [260а, 2606, 260в, 415а] показана возможность комбини-
рованного использования нейтральной и ионообменной колонок,
заполненных сефадексом. При установлении профиля концен-
трации стероидов, содержащихся в моче (в основном эстроге-
нов), они применяли сефадекс G-25 для разделения стероидов
и сефадекс LH-20, а также ОН~- и ОАс~-формы DEAE-сефа-
декса А-25 в качестве анионообменника для очистки и фракцио-
нирования стероидов; кроме того, описано применение колонки
с липидексом 5000 для очистки триметилсилилированных сте-
роидов перед их количественным определением методом газо-
жидкостной хроматографии.

Наиболее важными причинами необычайно быстрого распро-
странения и высокой популярности в аналитической химии сте-
роидов колонок, заполненных сефадексом, являются низкие
и воспроизводимые значения холостых опытов, хорошая воспро-
изводимость объемов элюирования и высокий процент выделе-
ния [230].

Распределительная жидкость-жидкостная хроматография
использовалась уже в ранний период развития хроматографии
стероидов и все еще применяется в настоящее время, особенно
в фармацевтике. В качестве неподвижной фазы на носителях
диатомитах (в основном целите 545) служат различные поляр-
ные растворители, как, например, вода, водный раствор гидро-
ксида натрия, формамид, этиленгликоль, ацетонитрил и т. п.,
а подвижной фазы — несмешивающиеся с ними неполярные
растворители [36, 67, 108, 109, 249, 250, 264, 318—320, 668, 847,
849]. В качестве примера можно упомянуть колонку, заполнен-
ную целитом и с ацетонитрилом в качестве подвижной фазы,
описанную Грэхемом и др. [319, 320]. Получены параметры
удерживания 44 стероидов при элюировании н-гептаном и хло-
роформом [319]; эту систему успешно применяли для решения
различных задач разделения, в том числе разделения эфиров
тестостерона и свободного тестостерона [320] с последующим
количественным анализом элюатов методами УФ-спектрофото-
метрии или колориметрии. К одному из последних достижений
в распределительной колоночной хроматографии стероидов от-
носится разработка химически связанной обращенной фазы
с группами Cis(Sep-Pak) (Хейккинен и др. [357а]) для экстрак-
ции эстрогенов мочи и (Шеклтон и др. [710а]) извлечения
других стероидов. Из специальных хроматографических методов
отметим гель-фильтрацию для определения свободных прогесте-
рона, тестостерона и эстрадиола в плазме [249, 322]. Введение
многоколоночных и многодетекторных систем [809, 810], ав-
томатизация и применение ЭВМ [111, 475] значительно повы-
сили роль колоночной хроматографии в анализе многочислен-
ных многокомпонентных смесей стероидов.

2.2.10.	ТОНКОСЛОЙНАЯ ХРОМАТОГРАФИЯ

Прежде чем обсуждать применение тонкослойной хромато-
графии (ТСХ) в количественном анализе половых стероидов,
следует сказать несколько слов о бумажной хроматографии.
В пятидесятых годах этот метод произвел переворот в анализе
стероидов. Фактически были решены все задачи разделения
и идентификации и многие задачи количественного определе-
ния, что нашло отражение в нескольких прекрасных обзорах;
здесь даны ссылки лишь на наиболее важные из них [117, 198,
582, 583]. Несмотря на большие достижения в начале шестиде-
сятых годов бумажную хроматографию из анализа стероидов
начала вытеснять ТСХ (в основном благодаря универсальности
и большой скорости выполнения), и в настоящее время бумаж-
ная хроматография используется лишь в отдельных лаборато-
риях, главным образом для разделения наиболее полярных сте-
роидов. Например, методом бумажной хроматографии до сих
пор довольно часто анализируют конъюгаты стероидов; в этой
[533, 534, 694] и других областях [134, 496] и сейчас иногда по-
являются публикации*. Несмотря на все сказанное, ниже бу-
дет обсуждаться лишь метод ТСХ как наиболее употреби-
тельный.

Громадное число книг, глав монографий, обзоров и фунда-
ментальных статей посвящено теории и практике ТСХ стероид-
ных гормонов. Из них следует выделить монографии Хефт-
манна [355], Лисбоа [502, 503] и Нейера [583, 584].

Проблемы разделения
и обнаружения

Для разделения стероидов половых гормонов наиболее ши-
роко применяются слои силикагеля в сочетании с различными
системами растворителей. В табл. 2.8, взятой из статьи Хары
и Мибе [342], приведены значения hRF 36 применяемых в фар-
мацевтике, в основном синтетических, стероидных гормонов
(среди них семь кортикостероидов) для 11 различных хромато-
графических систем.

Хроматография на силикагеле с использованием систем рас-
творителей, подобных приведенным в табл. 2.8, пригодна для
разделения на 'индивидуальные компоненты таких групп сте-
роидов, как, например, производные андростана [451], эстрана
[754], оксимов и лактамов [729] и т. п. Для решения более
сложных задач часто рекомендуют другие хроматографические
системы. Например, Сиу [386, 387] разделял эстрогены на слое
полиамида, Тиншерт и Трагер [772] описали разделение андро-
стерона, эпиандростерона и дегидроэпиандростерона на целлю-
лозе, пропитанной 1,2-пропандиолом; трудно разделяемые пары
конских эстрогенов типа а- и |3-дигидроэквилинов и т. п. были
разделены Кариньяном и др. [126, 128] методом распредели-
тельной хроматографии на пластинах с носителями (силика-
гель— гидроксид натрия или кизельгур — гидроксид натрия),
пропитанными формамидом (в качестве неподвижной фазы);
в качестве подвижной фазы предложены смеси хлороформ—
трихлорэтилен (4:1) и ксилол—диэтиламин (200:1).

Стероиды, адсорбирующиеся на поверхности полярного ад-
сорбента, например силикагеля, чувствительны к кислороду воз-
духа. Это приводит к осложнениям, особенно при разделении
и последующем определении следов эстрогенов. В таких слу-
чаях используют слои, пропитанные аскорбиновой кислотой.
Поскольку многие методы проявления непригодны в присутст-
вии аскорбиновой кислоты, положение пятен определяют при

* Здесь следует упомянуть, что в ряде случаев полезен метод электро-
фореза на бумаге; так, например, Гельбке и др. [274] разделили 2- и 4-окси-
эстрогены в виде их боратных комплексов при помощи высоковольтного
электрофореза на бумаге.
Таблица 2.8. Разделение стероидов, используемых в фармацевтике, методом ТСХ (значения hRF) [342]

Стероид	Растворитель										
	Силикагель									Оксид алюминия	
	1	2	3	4	5	6	7	8	9	10	н
3-ОН- 17р-Валероилокси-Э-1,3,5 (10) - триен  3-Метокси-17|3-ОН-17-Этин-Э-1,3,5- (10) -триен  3-ОН-Э-1,3,5 (10) -триен-17-он З-Бензоилокси- 170-ОН-Э-1,3,5(10) - триен  3,17Р-Ди-ОН-17-Этин-Э-1,3,5(10)- триен  3,17р-Ди-ОН-Э-1,3,5 (10) -триен  3,16а,17|3-Три-ОН-Э-1,3,5(10) -триен 17|3-Ацетокси-4-С1-А-4-ен-3-он 17|3-Ацетокси-А-4-ен-3-он 17|3-Энантокси-А-4-ен-3-он 17|3-Пропионилокси-А-4-ен-3-он  17₽-ОН-17-ЕЬЭ-4-ен  170-Фенилпропионилокси-Э-4-ен-3-он 17|3- (2-Фурилпропионилокси) -Э-4-ен- 3-он  17р-ОН-17<Ме-5а-А-3-он  17р-ОН-5а-А-3-он  17р-ОН-17-Этин-А-4-ен-3-он 17р-ОН-17-ЕЬЭ-4-ен-3-он	75  71  66  62  68  59  21  71  64  74  67  74  69  69  60  59  53  53	77  72  67  61  68  59  16  68  62  67  61  66  68  68  57  53  55  46	77  76  67  59  72  55  7  72  59  70  69  73  63  63  56  56  50  35	70  66  60 56  51  39  5 72 68 64 64 64 58 58  56 53 52 52	64  61  58 56  51  42  8 69 66 69 66 60 62 62  55 50 53 52	60  52  39 46  26  17  8 55 53 68 66 68 57 57  46 46 39 27	53  57  32  44  22  18  3  66  50  67  57  66  56  56  40  35  32  29		52  57  31  49  18  19  18  58  45  52  49  71  52  52  43  41  25  31	61  60  51 53  40  41  6 67 59 67 64 61 60 60  50 46 51 48	60  64  50 63  28  43  9 68 65 68 67 76 74 74  59 56 60 52

		Растворитель										
	Стероид	Силикагель									Оксид алюминия	
		1	2	3	4	5	6	7	8	9	10	н
17Р-ОН-2-ОН-метилен- 17-Ме-5а-а-		43	54	13	46	34	46	29		33	54	2
А-З-он												
17	З-ОН-А-4-ен-З-он	45	41	32	36	41	22	25		20	47	43
17	3-ОН- 17-Ме-Э-4-ен-3-он	51	39	38	35	47	26	29		22	50	51
17	З-ОН-Э-4-ен-З-он	41	36	39	34	36	21	28		14	39	49
17	3-ОН-17-Ме-А-1,4-диен-3-он	40	.50	31	27	36	15	26		15	23	39
14а-ОН-А-4-ен-3,17-дион		34	31	12	20	32	9 -	14		7	12	34
бр, 17р-Ди-ОН-А-4-ен-3-он		29	25	17	13	18	6	9		5	7	16
14а, 17р-Ди-ОН-А-4-ен-3-он		18	16	7	9	9	5	6		3	5	14
Р-4-ен-3,20-дион		62	59	58	61	60	59	66		39	60	70
17а-ОН-21-Ацетокси-Р-4-ен-З,11,20-		67	63	68	67	63	61	67		44	61	72
трион												
11р,17а-Ди-ОН-21-ацетокси-Р-4-ен-		49	41	23	19	44	18	22	43	12	33	58
3,20-дион												
17а,21-Ди-ОН-Р-4-ен-3,11,20-трион		33	22	8	8	17	13	7	19	11	6	19
17а,21 - Д и-ОН-Р-1,4-диен-3,11,20-		35	19	14	5	15	3	5	16	7	3	17
трион												
Пр, 17а, 21-Три-ОН-Р-4-ен-3,20-дион		27	18	8	4	10	5	3	11	6	3	10
11р,17а,21-Три-ОН-бр-Ме-Р-1,4-		26	17	7	2	9	4	2	11	2	1	9
диен-3,20-дион												
ПР, 17а, 21-Три-ОН-Р-1,4-диен-3,20-		24	15	6	2	9	3	2	11	1	1	9
дион												

Обозначения. 1: гексан—этилацетат (2:8); 2: бензол—этилацетат (3:7); 3: эфир; 4: бензол—ацетон (4:1); 5: хлороформ—ацетон (3:1);
6: бензол—метанол (9: 1); 7: хлороформ—метанол (97:3); 8: хлороформ—уксусная кислота (3: 1); 9: петролейный эфир (т. кип. 100—120 °C) —
бензол—уксусная кислота—вода (67:33:85:15); 10: бензол—ацетон (4: 1); 11: бензол—метанол (9:1).

А — андростан, Э — эстран, Р — прегнан, С1 — хлор, ОН — окси, Me — метил, Et — этил, Этин — этинил.
помощи радиоактивных добавок [572] или путем опрыскивания
пластинки реагентом, разрушающим аскорбиновую кислоту,
например серной кислотой или перйодатом натрия [276].

Метод ТСХ, обычно используемый для разделения родствен-
ных веществ, с успехом применяется и для разделения трудно
разделяемых пар стероидов. Например, Эгерт [211] предложил
методику многократного элюирования.

Используя обычные ТСХ системы [оксид алюминия или си-
ликагель и смеси петролейный эфир—диэтиловый эфир (6:4),
толуол—этил ацетат (9:1), бензол—этанол (98:2) и т. n.J
и проводя последовательно от 2 до 10 элюирований, можно
успешно разделять пары изомеров, например 5а- и 5|3-прегнан-
3,20-дионы, 5а-прегнан-3а,20а-диол и его 20р-изомер и т. д.'
Для тех же целей ряд авторов, в том числе Лисбоа и Гофман
[504а] и Кавина с сотр. [140], рекомендовали использовать во-
сходящую и двумерную хроматографию соответственно.

Особого упоминания заслуживает работа Хары [339], по-
скольку в ней обсуждается взаимосвязь между подвижностями
веществ при хроматографировании методами ВЭЖХ и ТСХ;
при решении конкретных задач эта корреляция помогает подо-
брать систему для хроматографирования методом ВЭЖХ путем
ее предварительного исследования методом ТСХ. Изучение по-
ведения разных стероидов на силикагелевых пластинках и ко-
лонках с разными бинарными смесями растворителей позволило
вывести следующую зависимость между значением RF (в ТСХ)
и коэффициентом емкости k' (в ВЭЖХ):

const • х/?р = , \ -	(2.15}

г k' +1	v '

Найдено, что при данных условиях константа приближается
к 1,5.

Для проявления пятен стероидов на пластинках в ТСХ пред-
ложено большое число различных проявителей. Наиболее
употребительны серная кислота (разбавленная до той или иной
степени водой или спиртами, иногда в сочетании с альдегидами,
например, ванилином), фосфорная кислота, соляная кислота,
хлорид сурьмы(III) и пары иода. Сведения о чувствительности
и избирательности этих реагентов можно найти в приведенных
выше монографиях. Для решения специальных задач иногда
рекомендуются другие реагенты, например хлорид цинка в ме-
таноле [527], гистохимические реагенты [787], молибдованадо-
фосфорная кислота [705], хлорид олова (II)—монохлоруксусная
кислота—хлороформ [473], молибдофосфорная кислота (в те-
сте на беременность, основанном на обнаружении прегнандиола
в моче [248]), хлорамин Т—серная кислота [55а] и т. д.
Количественный анализ
методом элюирования пятна

Стероиды, элюированные из ТСХ-пластинок, можно количе-
ственно определить методами колориметрии, флуориметрии, га-
зовой хроматографии, масс-спектрометрии, радиохимии и др.
Многие из методов, обсуждаемых в соответствующих разделах
этой главы, включают разделение или стадию (часто, стадии)
очистки методом ТСХ в процессе подготовки пробы для после-
дующего количественного анализа.

Хотя количественная тонкослойная хроматография требует
особого мастерства и опыта и является довольно трудоемким
и длительным процессом, она повышает селективность после-
дующего количественного метода определения столь значи-
тельно, что стадия ТСХ в настоящее время составляет неотъем-
лемую часть некоторых сложных методик анализа стероидов.

Основные проблемы заключаются в следующем: а) опреде-
ление положения пятен для последующего вымывания; б) све-
дение к минимуму потерь, связанных с необратимой адсорб-
цией или разрушением в процессе хроматографирования или
элюирования; в) оценка полноты выделения на заключитель-
ных стадиях.

Первое систематическое изучение возможности применения
ТСХ для количественного анализа стероидных гормонов было
проведено Мэтьюсом и др. [531] уже в 1962 г. С тех пор в этой
области проводятся и публикуются серьезные исследования
как теоретического, так и практического характера, обзор ко-
торых дан в монографиях, перечисленных во введении к этому
разделу, а также в других книгах.

При анализе биохимических образцов положение пятен
чаще всего устанавливают при помощи радиоактивных меток,
используя авторадиографию или прямое сканирование. Важное
преимущество этого метода состоит в том, что он позволяет од-
новременно оценивать полноту выделения стероидов. Для обна-
ружения пятен при анализе стероидов, поглощающих УФ-излу-
чение, обычно применяют другой прием, который основан на по-
явлении темных пятен при облучении УФ-светом (254 нм) пла-
стинки, покрытой тонким флуоресцирующим слоем. Некоторые
методы обнаружения пятен связаны с применением либо нераз-
рушающих стероиды реагентов, например паров иода, либо
разрушающих реагентов, либо более заметных красителей, на-
носимых на край пластинки. Для извлечения стероидов из со-
скобленных с пластинок зон предложены самые разные раство-
рители и их смеси, причем выбор диктуется полярностью иссле-
дуемых стероидов.
Из множества примеров применения метода элюирования
пятна в аналитической химии стероидов упомянем лишь неко-
торые наиболее характерные (в дополнение к разобранным
в других разделах этой главы).

Уол и сотр. [821] определяли ацетат тренболона (ацетат
17|3-окси-4,9,11-эстратриен-З-она) и этинилэстрадиол в корме
для свиней, разделяя экстракт методом ТСХ с последующим
элюированием компонентов хлороформом, газохроматографиче-
ским разделением и количественным определением. Тренболон
и его ацетат определяли также Эрле и др. [600] после хрома-
тографирования на силикагеле с помощью системы хлороформ—
этилацетат (2:1). Положение пятен определяли визуально
в УФ-свете при 366 нм после выдерживания пластинки в парах
концентрированной соляной кислоты. Возникающую при этом
флуоресценцию можно использовать для полуколичественного
определения нанограммовых количеств. Для количественного
определения пятна элюируют эфиром, выпаривают досуха и об-
рабатывают 50 %-ной фосфорной кислотой в метаноле. Флуо-
ресценцию измеряют при 498 нм (возбуждение при 365 нм).

Для определения прегнандиола и прегнантриола в моче
Бабьюк и сотр. [50] предложили следующую методику. После
ферментативного гидролиза и экстракции хлороформом пробу
мочи помещают на пластинку, покрытую силикагелем, устанав-
ливают положение соответствующих зон, опрыскивая край по-
лоски смесью серной кислоты с этанолом, и экстрагируют пятна
смесью хлороформа с этанолом (17:3). После выпаривания
экстрактов индивидуальные стероиды определяют либо колори-
метрически с серной кислотой (длина волны 425 и 435 нм соот-
ветственно), либо методом газовой хроматографии в виде их
триметилсилиловых эфиров.

Особого упоминания заслуживает комбинированный ТСХ —
фотометрический метод Хакла [332] определения дегидроэпи-
андростерона в моче, поскольку в этом случае образование про-
изводных (реакция 17-кетогруппы с 2,4-динитрофенилгидрази-
ном) проводится до хроматографирования. Образующиеся гид-
разоны хорошо разделяются на силикагелевой пластинке смесью
хлороформа с ацетоном (95:5), и после экстракции метанолом
динитрофенилгидразон дегидроэпиандростерона можно непо-
средственно определить спектрофотометрически.

Тонкослойную хроматографию применяют также при разде-
лении следов примесей в лекарственных веществах для после-
дующего масс-спектрометрического анализа; это было сделано
Лоджем и Тофтом [510] при установлении профиля концентра-
ций примесей в норэтистероне и его ацетате.
Количественные методы in situ

Если требования к точности определения позволяют исполь-
зовать полуколичественные методы, интенсивность пятен часто
оценивают визуально путем сравнения со стандартными пят-
нами или рассчитывают концентрацию компонента по мини-
мальному объему раствора сравнения, которым нужно обрабо-
тать слой для получения заметного пятна [126].

Гораздо более важной задачей является количественное
определение стероидов в тонких слоях in situ. Попытки созда-
ния денситометрических методов, не требующих элюирования
пятен, предпринимались с первых шагов применения ТСХ
в анализе стероидов. Денситометры старых конструкций не
обеспечивали требуемой чувствительности и достаточной вос-
производимости, поэтому денситометрия тонких слоев не могла
в то время конкурировать с другими количественными хромато-
графическими методами (ТСХ с элюированием пятна, газовой
хроматографией).

Значительные успехи в совершенствовании аппаратуры в по-
следние несколько лет отразились и на развитии денситометри-
ческих методов; наиболее существенными достижениями сле-
дует считать следующие:

а)	повышение чувствительности почти на два порядка
(в случае высокоэффективной тонкослойной хроматографии
(ВЭТСХ) почти на три порядка);

б)	вследствие этого для анализа достаточно очень неболь-
ших количеств веществ, благодаря чему легко получить линей-
ные градуировочные графики в нанограммовой области;

в)	стероиды, поглощающие свет в УФ-области, можно опре-
делить прямым сканированием на УФ-спектроденситометре без
предварительной дериватизации или проявления. Как было по-
казано Ярком и сотр. [415] и Уортманом и сотр. [841], опти-
мальная концентрация даже сравнительно слабо поглощающих
УФ-излучение эстрогенов составляет около 100 нг при измере-
нии при 280 нм;

г)	возможность использования спектров отражения пятен
[24, 742а]. Это ставит тонкослойную спектроденситометрию
в один ряд с газовой хроматографией (с пламенно-ионизацион-
ным детектированием) и высокоэффективной жидкостной
хроматографией. Большим достоинством этого метода является
высокая скорость сканирования, вследствие чего на одном ден-
ситометре можно успеть количественно оценить хромато-
граммы, получаемые одновременно несколькими сотрудниками.

Благодаря перечисленным выше достоинствам денситомет-
рия хроматограмм все шире применяется в анализе стероидов,
главным образом в фармацевтике, и до некоторой степени
в биологии. В будущем можно ожидать расширения области
применения этого метода, в основном в сочетании со сканирова-
нием в УФ-области без дериватизации.

Правда, сейчас в основе большинства используемых на
практике методов лежат химические реакции. В одной группе
методов после разделения стероидов предусматривается опрыс-
кивание подходящими реагентами; при этом образуются флуо-
ресцирующие или окрашенные производные. Например, Амин
и др. [31] испытывали устойчивость энантата дегидроэпиандро-
стерона, измеряя отражение при 550 нм, после опрыскивания
пластинки 5 %-ной серной кислотой в метаноле и нагревания
при 120°С в течение 10 мин. Путем опрыскивания реагентом,
состоящим из серной кислоты и метанола, можно определить
этинилэстрадиол в противозачаточных таблетках [32] либо по
отражению при 530 нм, либо по флуоресценции (возбуждение
при 365 нм, испускание при 560 нм). Возбуждение светом с той
же длиной волны вызывает флуоресценцию гестогенного ком-
понента пилюль (D-норгестрел) при 485 нм. Аналогичным обра-
зом проводят одновременное определение спиронолактона
и канренона [798]. Альберс и Лисбоа [24] обнаружили, что
вместо опрыскивания серной кислотой лучше пропитывать пла-
стинку гидросульфатом аммония. Для денситометрического
определения оксистероидов в лекарственных формах Винтер-
штейгер [835а] успешно применял реагент, состоящий из нафто-
хинона, сульфокислоты и хлорной кислоты. Проведение измере-
ния при 420 нм позволяет определить такие малые количества
эстриола, как 30 нг. Для денситометрического определения раз-
личных стероидных гормонов Трубников [778а] использовал
в качестве опрыскивающего реагента молибдофосфорную ки-
слоту.

Сегура и Готто [707] предложили метод обнаружения и ко-
личественного определения некоторых органических соединений
(в том числе стероидов) по флуоресценции, вызываемой нагре-
ванием пластинок в течение нескольких часов при 120—130°
в атмосфере аммиака, образующегося in situ при разложении
карбоната аммония. Хотя механизм реакции не выяснен, метод
Сегуры и Готто оказался очень ценным, так как воспроизводи-
мость методик с использованием газообразного реагента выше,
чем методик, в которых рекомендуются обычные опрыскиваю-
щие реагенты. Леви и Рейсфельд [499] существенно повысили
чувствительность этого метода, предложив измерять непосред-
ственно флуоресценцию пятна без сканирования. Линейный гра-
дуировочный график получается в 5—250 нг интервале содер-
жания тестостерона (возбуждение при 405 нм, испускание при
470 нм). Аналогичные результаты получены Сегурой и Наварро
[707а], использовавшими для получения высокоустойчивых
флуорофоров соли цирконила.

Другой любопытный метод возбуждения флуоресценции на
пластинках заключается в получении триметилсилильных про-
изводных (см. разд. 2.2.11), разделении их на пластинке, по-
крытой оксидом алюминия, и превращении в флуорофоры на-
греванием до 170—180°С. Как показали Хук [390] и Эгг с сотр.
[212] при определении тестостерона в моче и прогестерона
в плазме крови, таким путем можно обнаружить около 10 нг
4-ен-З-кетостероидов.

В приведенных примерах флуоресценцию вызывают на пла-
стинке, но разделяют не исходные стероиды, а их производные,
полученные до нанесения на пластинку. К достоинствам этих
и некоторых других обсуждаемых ниже методов относится то,
что в них исключено возникновение ошибок, связанных с не-
равномерным распределением опрыскивающего реагента. Сле-
дует, однако, заметить, что один из основных источников оши-
бок, заключающийся в изменении толщины слоя вдоль пла-
стинки, остается прежним.

Другие методы, включающие разделение предварительно
полученных производных, основаны на классической реакции
кетостероидов с 2,4-динитрофенилгидразоном [466, 776] с по-
следующим измерением ослабления излучения при 370 нм,
а также на дансилировании этинилэстрадиола и измерении
флуоресценции продукта. На основе этих реакций Каммерль
и Мучлер [440] разработали унифицированный тест для табле-
ток с низким содержанием стероидов.

Кроме того, метод дансилирования применяли для опреде-
ления эстриола в лекарственных формах [184] и эстрогенов
в моче [815].

Вызывает интерес метод определения эстрогенов, разра-
ботанный Вейссом с сотр. [827, 828, 830]. Он основан на реак-
ции азосочетания фенольного кольца А (см. разд. 2.2.2) с ре-
агентом прочный темно-синий /?. Поскольку для протекания
реакции необходимо наличие свободной фенольной оксигруппы,
этот метод применим для прямого определения свободного
эстриола [830] или метаболитов, например его 16-глюкуронида
[828], в моче. Одна из употребительных хроматографических
систем для разделения азокрасителей состоит из силикагеля
и смеси хлороформ—метанол—муравьиная кислота (100 : 25 : 2 :
: 1,5). Сканирование хроматограмм при 520 нм позволяет опре-
делить эстриол и его соединения в количествах порядка 10 нг.
Эстриол-З-сульфат перед азосочетанием предварительно гидро-
лизуют [827]. Этот метод был использован Уортбергом и др.
[840] для определения остаточного эстрогена в мясе.

6 Заказ № 182
2.2.11.	ГАЗОВАЯ ХРОМАТОГРАФИЯ

Первые статьи, посвященные систематическому применению
газовой хроматографии в анализе стероидов, опубликованы
в 1960 г. [792, 796]. В «героический период» газовой хромато-
графии в аналитической химии стероидов, который продол-
жался примерно 3—4 года, были решены почти все теоретиче-
ские и практические проблемы в этой области (в основном бла-
годаря пионерским работам Е. Хорнинга, У. Ван-ден-Хойвеля,
X. Вотица и других). Без преувеличения можно утверждать, что
примерно 80 % всего, что мы сейчас знаем о газовой хромато-
графии стероидов на насадочных колонках, было уже известно
в 1964 г. Благодаря этим достижениям газовая хроматография
быстро заняла место стандартного метода в биоклиническом
анализе, а также (в меньшей степени) в фармацевтическом
анализе стероидов.

Стремительное развитие газохроматографических методов
анализа стероидов и полученные с их помощью ценные резуль-
таты нашли отражение в большом количестве специальных мо-
нографий [216, 321, 501, 639, 695, 842] и обширных главах, по-
священных этому вопросу, в книгах общего характера [157,
312в, 355, 467, 583]. Число публикаций так велико (гораздо
больше тысячи), что в рамках этой книги безнадежно пытаться
рассмотреть все (даже очень важные) работы. Поэтому здесь
будут лишь кратко даны фундаментальные сведения по газовой
хроматографии, причем упор будет сделан на освещение тех
областей, где в последние годы были достигнуты значительные
успехи (использование капиллярных колонок, новые методы
дериватизации и новые практические приложения). Многочис-
ленные работы по корреляции между структурой и временем
удерживания стероидов не будут даже упомянуты.

Насадочные колонки

Как следует из литературы, в газовой хроматографии сте-
роидов почти всегда применяется стеклянная аппаратура. Лю-
бопытно отметить все же, что иногда появляются статьи, в ко-
торых сообщается об успешном использовании металлических
колонок [153, 273].

Как можно видеть из публикаций, новых твердых носителей
практически не предлагается. Носитель должен быть, по воз-
можности инертным, тогда можно избежать разложения и необ-
ратимой адсорбции стероидов. В анализе стероидов исполь-
зуются исключительно белые диатомитовые земли, которые
промывают кислотами и затем силанизируют (диметилдихлор-
силаном); в настоящее время они вполне доступны, и боль-
шинство хроматографистов отдают предпочтение именно им (ис-
пользуют в основном газохром Q, а также хромосорб G или W,
анахром Q и т. д.). Ромэн и сотр. [667] обнаружили, что многие
выпускаемые промышленностью промытые кислотой и силани-
зированные диатомиты (фирмы не указывались) при определе-
нии этерифицированных эстрогенов не обеспечивают хорошего
разделения и способны к значительной необратимой адсорб-
ции. Поэтому для решения сложных задач рекомендуется ис-
пользовать прокаленный диатомит без промывки его кисло-
тами, но просеянный и повторно силанизированный или про-
мытый кислотами и затем силанизированный.

Сказанное в предыдущем абзаце справедливо и в отношении
неподвижных фаз, т. е., за небольшим исключением, для ана-
лиза стероидов используются те же фазы, что и двадцать лет
назад, когда газовая хроматография стероидов только начала
развиваться. Наибольшее применение нашли силоксаны. Почти
половина всех работ посвящена использованию неполярных ди-
метилсилоксанов (в основном SE-30, а также OV-1 и 101). Эти
фазы пригодны для разделения стероидов по молекулярным
массам или по различному строению (разделение простран-
ственных изомеров); разделение, однако, бывает неудовлетво-
рительным, если различия в размере или строении молекул не-
значительны, как, например, у окси- и кетосоединений, у насы-
щенных и ненасыщенных стероидов и т. д. Это иллюстрируется
табл. 2.9; данные взяты из статей Ван-ден-Хойвеля и Хорнинга
[793] и Намбары с сотр. [581].

Предварительным триметилсилилированием можно значи-
тельно повысить способность к разделению плохо разделяемых
эпимеров 3-оксипроизводных. Например, времена удерживания
андростерона и его Зр-оксиэпимера на колонке, заполненной
смесью SE-30 и адипината тетраметилбутандиола, при 228°С
равны 5,04 и 5,2 мин соответственно, а времена удерживания
триметилсилильных (ТМС) производных тех же эпимеров при
205°С — соответственно 6,7 и 8,9 мин [637].

Большим достоинством ранее упоминавшихся диметилсилок-
санов являются их высокая термическая устойчивость и как
следствие незначительные потери жидкой фазы из колонки
даже при такой высокой температуре, как 300°С. На колонках,
заполненных OV-17, у которого метильные группы частично за-
мещены фенильными, можно получить несколько более высо-
кую избирательность при той же термической устойчивости,
поэтому их часто используют в анализе стероидов. Из всех не-
подвижных фаз на основе силоксанов наиболее высокой изби-
рательностью обладают фазы, состоящие из метилтрифторпро-
пильного (QF-1,	OV-210), метилфенилцианпропильного
Таблица 2.9. Газохроматографическое разделение стероидов
на неселективной стационарной фазе SE-30 а

Номер	Стероид	Относительное время удержи- вания
1	50-Андростан- 17-он	0,18
2	5р-Андростан-3,17-дион	0,39
3	4-Андростен-3,17-дион	0,48
4	17р-Окси-4-андростен-З-он (тестостерон)	0,49
5	4-Андростен-3,11,17-трион	0,57
6	5р-Андростан-Зр,17р-диол	0,38
7	5р-Андростан-За, 17р-диол	0,37
8	Зр-Окси-5р-андростан- 17-он	0,37
9	За-Окси-5р-андростан- 17-он	0,36
10	17а-Метил-5-андростен-Зр, 17р-диол (метандриол)	0,41
11	5-Андростен-Зр, 17р-диол	0,37
12	Зр-Окси-5-андростен-17-он	0,36
13	4-Эстрен-3,17-дион	0,37
14	З-Окси-1,3,5 (10) -эстратриен- 17-он (эстрон)	0,46
15	1,3,5 (10) -Эстратриен-3,17р-диол (эстрадиол)	0,48
16	З-Окси-1,3,5 (10) 6,8-эстрапентаен-17-он (экви- ленин)	0,61
17	5р-Прегнан-3,20-дион (А/В-цис)	0,60
18	5а-Прегнан-3,20-дион (А/В-транс)	0,66
19	4-Прегнен-3,20-дион (прогестерон)	0,78
20	Зр-Окси-5-андростен- 17-он (дегидроэпиандросте- рон) (C/D-транс)	0,414
21	Зр-Окси-13а,5-андростен-17-он (CfD-цис)	0,348

а Времена удерживания измерены относительно холестана. Для соединений 1—19:
колонка (180 смХ4 мм) заполнена 1 %-ным SE-30, нанесенным на газохром Р (100—
120 меш) при 21 ГС; время удерживания холестана 13,5 мин [793]. Для соединений 20—21:
колонка (300 смХЗ мм) заполнена 1,5 %-ным SE-30, нанесенным на хромосорб W (60—
80 меш) при 240°С; время удерживания холестана 19,8 мин [581].
(OV-225) и метил-Р-цианэтильного (ХЕ-60, AN-600) производ-
ных; в этих случаях термическая устойчивость до некоторой

степени принесена в жертву,

так как перечисленные ра-
нее неподвижные фазы
нельзя использовать при
температуре выше 250—
275°С. Что касается непод-
вижных фаз типа OV, то
наиболее употребительной
является OV-225, а в тех
случаях, когда требуется
разделить оксисоединения и
соответствующие кетоны
(кетоны элюируются с боль-
шими временами удержива-
ния), очень популярна QF-1.
Применяются также поли-
эфирные фазы (в основном
неопентилгликольсукци н а т,
НПГС), главным образом
при разделении насыщенных
и ненасыщенных (например,
5,6-дигидро- и А5-) произ-
водных. Из всех неподвиж-
ных фаз, используемых в ана-
лизе стероидов, термическая
устойчивость этих весьма из-
бирательных фаз наихудшая.

Смеси упомянутых выше
неподвижных фаз, находив-
шие широкое применение

Рис. 2.10. Газохроматографическое раз-
деление тестостерона, эстрадиола и их.
эфиров после триметилсилилирования на.
колонке размером 1 мХЗ,2 мм из нержа-
веющей стали, заполненной 2 %-ным:
дексилом 400, нанесенным на анахром?
ABS (90—100 меш) [температура: испа-
рение при 260°С, колонка программиру-
ется на 250—320°С (5°С/мин)] [273].

в ранний период развития
газохроматограф ического
анализа стероидов, в настоя-
щее время встречаются лишь
изредка; например, Томсова
и др. [774а] разделили 24

1 — эстрадиол (10 мкг); 2 — тестостерон
(8,2 мкг); 3 — пропионат тестостерона
(8 мкг); 4 — изокапронат тестостерона
(16,2 мкг); 5 — бензоат эстрадиола
(0,4 мкг); 6 — фенилпропионат эстради-
ола (1,6 мкг); 7 — фенилпропионат те-
стостерона (16 мкг).

стероидных метаболита на

колонке, содержащей 9 частей OV-1 (1 %) и 1 часть OV-225
(3 % ) на носителе газохром Q.

Из неподвижных фаз, не относящихся к силоксанам или по-
лиэфирам, возрастающее значение в анализе стероидов приоб-
ретают сополимеры на основе карборана и метилсилоксана
типа дексила [300, 400, 410]. Эти сополимеры несколько более
полярны, чем метилсилоксаны, обладают чрезвычайно высокой
термической устойчивостью и могут быть использованы для раз-
деления наименее летучих стероидов с большими молекуляр-
ными массами. На рис. 2.10 из статьи Газдага и др. [273] пред-
ставлены результаты разделения тестостерона, эстрадиола
и пяти их эфиров (последние входят в состав масляных раство-
ров для инъекций).

Кирк и Шоу [458] рекомендуют жидкие кристаллы эфира
холестерина в качестве неподвижных фаз для разделения эпи-
меров стероидов. Позже Цилински и др. [864] предложили но-
вые нематические жидкие кристаллы (М,Ы-бис(/г-метоксибен-
зилиден)-а,а'-би-п-толуидин] с необычно высокой разрешающей
способностью, на которых можно, например, разделить четыре
эпимера За/р-окси-5а/|3-андростан-17-она за 15 мин при 230°С
(см. также разд. 4.2.7 и рис. 4.4).

Капиллярные колонки

В начале семидесятых годов было предложено использовать
капиллярные колонки (открытые трубчатые колонки) в газо-
хроматографическом анализе стероидов [25, 323, 597, 598, 804,
818, 819]. Разделяющая способность этих колонок гораздо выше,
чем насадочных колонок: если число теоретических тарелок для
насадочных колонок, обычно используемых в анализе стерои-
дов, колеблется между 2000 и 4000, то для капиллярных коло-
нок легко получить значения 50 000—100 000 и даже выше.
В отличие от хроматографии на насадочных колонках в капил-
лярной хроматографии за одно хроматографирование можно
разделить и количественно определить до 20—30 стероидов,
поэтому этот метод чрезвычайно полезен при оценке профиля
концентраций стероидов в моче и крови. Высокая эффектив-
ность капиллярных колонок позволяет упростить подготовку
проб, так как в этом случае нет необходимости в тщательной
предварительной очистке, как при работе с насадочными колон-
ками. Однако при использовании этого метода в повседневной
работе в любой лаборатории возникают серьезные трудности,
связанные с подготовкой подходящих стеклянных капилляров,
травлением и силилированием их стенок для получения инерт-
ных поверхностей [47], на которых даже при длительной работе
при высоких температурах сохранялся бы равномерный слой
неподвижной фазы, а также проблемы, связанные с введением
пробы, детектированием и т. п. Для ознакомления с различ-
ными приемами, используемыми при решении этих задач, сле-
дует обратиться к работам, упомянутым ранее.

За последние несколько лет был опубликован ряд статей,
посвященных применению капиллярной колоночной хроматогра-
фии в клиническом и биохимическом анализе стероидов. Основ-
ные результаты некоторых работ приведены в табл. 2.10.

Детектор		ПИД, мс		ПИД, мс	ПИД			ПИД		ПИД, ДЭЗ N-Селектив- ный детек- тор  ПИД				ПИД	О  3	
Внутренний стандарт		1		Бутират холесте- рина	। ЗР-Окси-5Р-андро- 1 стан-17-он; (5а-		андростан-ЗР,17Р- диол,5р-холестан- За-ол	1			1		8 со  к  СЗ  о  К  8 ю	17а-диол, бутират	холестерина 5а-андростан-ЗР, 1бр,17(3-триол — ТМС и т. п.		
Произ- водное		тмс	МО-ТМС	МО-ТМС	ТМС			МО-ТМС		МО-ТМС МО-ГФБ		МО-ТМС		О - -  У < U5H		
Образец		Профиль концент- раций стероидов в моче  1		Профиль концент- раций стероидов	в моче Профиль концент- раций стероидов в моче			Профиль концент- раций стероидов		в моче  Профиль концент- раций стероидов	в плазме	Профиль концент- раций стероидов		в моче  Профиль концент- раций стероидов	в моче	।  3-Кетостероиды	в плазме
Температура и скорость нагревания		s	S	о  В*	к  с	К	S  « и I и S	о  ® о -~~.о ~'^'О  О о ЩО О to со сч сч			150—190°С, 32°С/мин		190—280°С, 1°С/мин	О о О сч сч		180—255°С (програм.)		170—260°С	и S л О о to сч"	220—250°С	260°С	
Непод- вижная фаза		OV-101		SE-30/ силанокс 101а  OV-101				SE-30/	гифло су- персел а SE-30			OV-101		OV-101  OV-225	SE-30	
3 ®  aj Я  S °	9*1 а-  £ 2 н s s о 3  я ЕС S	0,3		0,3	0,25			0,4		0,26		0,25		ю сч сч сч  оо	0,34	
« S я $	длина, м	20		09	50			30—50		сч		о сч		ю —< сч сч	о сч	
Год		1970		Ю £ о о	1974			1976		1976		1976		1976	1976	
Автор		Вёлмин [818]		Пфаффенбер- гер и др. [629—631] Бейли и др.				Дилдер и др.	[177]	Новотный и др. [596]		Шеклтон и Хо-	нор [710]	Берту и др. [73]	Аксельсон и Сьёвалл [46]	
Продолжение табл. 2.10

Автор	Год	Размеры колонки		Непод- вижная фаза	Температура и скорость нагрева- ния	Образец	Произ- водное	Внутренний стандарт	Детектор
		длина, м	внутр, диа- метр, мм						
Эдмондс и Брукс [209]	1976	50	0,5	OV-1/си- ланокс а	230—240°С	Искусственная смесь	тмс	—	мс
Матьесен и Стейб [532]	1977	15		OV-101 и т. п.	250°С	Искусственная смесь	—	—	ПИД, мс
Людвиг и др. [513]	1977	20	0,3	SE-30	120—300°С, 2°С/мин	Профиль концент- раций стероидов в плазме	тмс	—	ПИД, мс
Фэнтл и Грей [232]	1977	20	0,3	OV-101	Разные про- граммы	Профиль концент- раций стероидов в моче	тмс	Бутират холесте- рина	ПИД
Холсбер и Кнорр [377]	1977	30		OV-101	200—240°С, ГС/мин	17-Оксипрегнено- лон в моче	мо-тмс	Андростендиол	ПИД, мс
Эггер и др. [213]	1978	25	0,3	SE-30	6 мин при 150°С, 2°С/мин до 300°С, 15 мин при 300°С	Профиль концент- раций стероидов в моче	тмс- енол, тмс- простой эфир	С-20,22,24,32	ПИД, мс
Дюрбек и др. [204]	1978	40		SE-54	30—200°С, быстрое нагре- вание; 200— 260°С, 2,5°С/мин	Метаболиты ме- тандиенона в моче	ТМС		ПИД, мс

Автор	Год	Р азмеры колонки		Непод- вижная фаза	Температура и скорость нагревания	Образец	Произ-  водное	Внутренний стандарт	Детектор
		длина, м	внутр, диа- метр, мм						
Лойниссен и др. [497]	1978	30	0,25	SE-30	250°С	Профиль концент- раций стероидов в моче	МО-ТМС	С-24, С-32	ПИД, мс
Людвиг-Кён и др. [514, 515]	1978  1979	24		SE-30	150—300°С, 2°С/мин	Профиль концент- раций стероидов в плазме	тмс, мо-тмс	—	ПИД, мс
Тэйлор и др. [762]	1979	20		OV-101	—	Профиль концент- раций стероидов в моче	мо-тмс	Андростандиол, бутират холесте- рина	ПИД, мс
Ярвенпёё и др. [4156]	1980	25	—	OV-101	—	Метаболиты эст- рогена	тмс, ацетони- ды цис- гликолей	—	мс
Мадани и Чам- баз [519а]	1981	25	0,25	Химичес- ки свя- занные полиси - локсаны	180—300°С, 2°С/мин	Профиль концент- раций стероидов в моче	МО-ТМС	Бутират холесте- рина	ПИД
Пфейфер и Спителлер [631а]	1981	25	0,3	OV-101	150—300°С, 2°С/мин	Профиль концент- раций стероидов в моче	МО-ТМС тмс- енол	Эйкозанол—гекса- декандиол; эпи- этиохоланолон	ПИД, мс

a SCOT (support-coated open tubular columns) — капиллярная колонка co стенками, покрытыми пористым носителем.
БХ

J_____________|____________I . I_____________________L_

40	50	60	70	80

Время, мин

Рис. 2.11. Профиль концентраций метаболитов стероидов, содержащихся
в моче взрослого самца, установленный методом капиллярной газовой хрома-
тографии (метоксим—триметилсилиловые эфиры). Параметры колонки и усло-
вия хроматографирования см. в табл. 2.10 [630].

Ан — андростерон

Эт — этиохоланолон

ДГЭА — дегидроэпиандростерон
11-ОАн— 1 lp-оксиандростерон
11-ОЭт — 11р-оксиэтиохоланолон

ПД — прегнандиол

ПТ — прегнантриол

АТ — андростентриол

ТГК — тетрагидрокортизон

ТД К — тетрагидро-11 -дегидрокор-
тикостерон

ТГС — тетрагидрокортикостерон

<х-ТГКС — алло-тетрагидрокортико-
стерон

ТТЛ — тетрагидрокортизол

а-ТГЛ — алло-тетрагидрокортизол

Ко — кортолон

р-Ко — р-кортолон

Кор — кортол

БХ — бутират холестерина

За-окси-5а-андростан-17-он
За-окси-5р-андростан- 17-он

Зр-окси-5-андростен- 17-он

За, 11 р-диокси-5а-андростан-17-он
За, 11 р-диокси-5р-андростан- 17-он
5р-прегнан-3а,20а-диол
5р-прегнан-3а,17а,20а-триол
5-андростен-Зр, 16а, 17р-триол
За, 17а,21-триокси-5р-прегнан-11,20-
дион

За,21-диокси-5Р-прегнан-11,20-дион

За,11р,21-триокси-5р-прегнан-20-он
За, 11 р,21 -триокси-5а-прегнан-20-он

За, 11 р, 17а,21 -тетраокси-5р-прегнан-
20-он

За, 11 р, 17а,21 -тетраокси-5а-прегнан-
20-он

За, 17а,20а,21 -тетраокси-5р-прегнан-
11-он

За, 17а,20р,21 -тетраокси-5р-прегнан-
11-он

За, 11 р, 17а,20а,21 -пентаокси-5р-пре-
гнан

(внутренний стандарт)
Данные табл. 2.10 показывают, что предпочтение отдается
в основном неполярным неподвижным фазам и что дериватиза-
ция стероидов (главным образом триметилсилилирование и ме-
токситриметилсилилирование) и программирование темпера-
туры практически неизбежны. На рис. 2.11 представлена ти-
пичная хроматограмма, заимствованная из статьи Пфаффенбер-
гера и Хорнинга [630].

Детекторы

В большинстве статей, опубликованных в первые годы раз-
вития газохроматографического анализа стероидов, сообщалось
об использовании аргонового ионизационного детектора. Затем
этот детектор был вытеснен пламенно-ионизационным детекто-
ром (ПИД), который в настоящее время является наиболее ши-
роко распространенным в анализе стероидов. К достоинствам
ПИД относятся линейная зависимость отклика от концентрации
в широком диапазоне концентраций и высокая чувствитель-
ность, дающая возможность определять нанограммовые количе-
ства вещества. ПИД — это универсальный детектор, и все сте-
роиды дают сходные отклики. Однако оценить процентное со-
держание отдельных стероидов по нормированным площадям
пиков на хроматограмме многокомпонентной смеси можно лишь
в первом приближении. Для получения более точных результа-
тов следует построить градуировочные графики для каждого
компонента, учитывая различия в относительных мольных

Таблица 2.11. Значения относительных мольных чувствительностей
ПИД (rFM)a [210]

 Стероид	с«	°п	rFM
Эстрон	18	2	0,278
Эстрадиол	18	2	0,274
4а-Андростен-3,17-дион	19	2	0,352
5а-Андростан	19	0	0,381
Прогестерон	21	2	0,425
5а-Прегнан	21	0	0,502
Метиловый эфир литохолевой кис- лоты	25	3	0,652
5а-Холестан-3-он	27	1	0,828
5а-Холестан	28	0	0,868
ЗР-Бутокси-5-а-холестан (внутренний стандарт)	31	1	1,0006

а tFm=0,0571(Сп — 0,499-Оп) — 0,697, где Сп и Оп— число атомов углерода и кис-
лорода в каждой молекуле.

б Относительное значение, принятое за исходное.
чувствительностях. Эта проблема тщательно исследована Эд-
вардсом [210]. Было установлено, что мольная чувствительность
пропорциональна числу атомов углерода в молекуле стероида;
при этом следует иметь в виду, что два атома кислорода почти
уничтожают сигнал от одного атома углерода. Атомы водорода,
серы и хлора не влияют на сигнал. Более подробные сведения
приведены в табл. 2.11.

Что касается селективных пламенно-ионизационных детекто-
ров, то, с помощью чувствительного на азот детектора можно
обнаруживать оксимные производные [748, 749], а детектор,
чувствительный на фосфор, можно рекомендовать для детекти-
рования диметилфосфиновых [407, 408, 816] и диметилтиофос-
финовых эфиров стероидов по оксигруппам [407, 409, 817].

Гораздо более широкое применение находят детекторы элек-
тронного захвата (ДЭЗ). Современные модели этого детектора
с 63N в качестве источника радиоактивного излучения можно
использовать при температурах вплоть до 350°С, что позволяет
анализировать даже малолетучие стероиды. Благодаря чрезвы-
чайно высокой чувствительности (возможно определение пико-
граммовых количеств веществ) ДЭЗ применяются главным об-
разом в тех случаях, когда чувствительности ПИД не хватает
для решения поставленной задачи. Однако в отличие от ПИД
они не являются универсальными, так как высокой чувстви-
тельности можно добиться только для стероидов, содержащих
специфические группы или системы связей. Хотя способность
некоторых стероидных соединений (в основном ненасыщенных
кетонов) к захвату электронов довольно велика и их можно
определить без предварительной дериватизации [611, 656, 709,
807а], в большинстве случаев для обеспечения удовлетворитель-
ной чувствительности при использовании ДЭЗ в молекулу вво-
дят галогенсодержащие группы. Исчерпывающие сведения
о чувствительности к электронному захвату различных произ-
водных 17а-ацетоксипрогестерона содержатся в обзоре Коши
[477]. Наиболее высокая относительная чувствительность ха-
рактерна для хлорпроизводных (хлорацетатов [491, 552, 797])
и хлорметилсилиловых эфиров [208, 226], однако чаще все-таки
применяют производные перфторкарбоновой кислоты [96, 155,
179, 235, 238, 794 и др.] из-за их превосходных хроматографиче-
ских характеристик. Наличие нескольких атомов фтора в мо-
лекуле позволяет также достигнуть высокой чувствительности.

Если ПИД находят применение и в фармацевтическом,
и в биоклиническом анализе стероидов, ДЭЗ используется ис-
ключительно в последней области [96, 235, 238, 482, 552, 580,
596, 750 и др.].

При хроматографировании меченых стероидов часто нужно
измерять отношения количества меченого стероида к его об-
щему содержанию для каждого пика. В этих случаях элюент
перед введением в ПИД разделяют на потоки, причем большую
часть направляют в детектор радиоактивности. Поскольку из-
мерение радиоактивности затруднительно проводить при высо-
кой температуре элюента в колонке, сначала «ловят» индиви-
дуальные пики в жидкостных ловушках [166, 589], на микроко-
лонках [589] или тонкослойных пластинках [183]. Непрерывный
контроль возможен только в том случае, если выходящие из ко-
лонок стероиды сжигаются; при этом 14С и 3Н превращаются
в диоксид углерода и молекулярный водород соответственно
[166, 504, 693, 727, 867].

Следует упомянуть, что при помощи детектора постоянной
скорости рекомбинации можно обнаружить до 50 пг трифтор-
ацетата тестостерона [88].

Во многих случаях в качестве детектора используется масс-
спектрометр. Если требуется идентифицировать неизвестные сте-
роиды в биологических объектах, то газовую хроматограмму
обычно регистрируют по общему ионному току, а сканирование
идет по индивидуальным пикам масс-спектрограммы. Однако
здесь эти методы обсуждаться не будут, так как применению
масс-спектрометрии для количественного анализа сложных сме-
сей стероидов посвящен разд. 2.2.15.

Проблемы дериватизации

В большинстве случаев стероиды хроматографируют в виде
подходящих производных. Преимущества этого метода заклю-
чаются в следующем:

а)	Путем дериватизации можно повысить термическую ус-
тойчивость стероидов. Чувствительность к нагреванию, являю-
щаяся основной проблемой при анализе кортикостероидов, бу-
дет рассматриваться в разд. 3.2.10; половые гормоны и их про-
межуточные продукты обычно достаточно устойчивы, чтобы их
можно было хроматографировать при 200—250°С. Некоторые
производные, склонные к разложению, можно хроматографиро-
вать, используя эмалированный испаритель-дозатор или, что
еще лучше, вводя пробу непосредственно в колонку. Кроме
того, твердый носитель должен быть достаточно инертным и со-
держать не менее 1 % неподвижной фазы (третичные оксипро-
изводные и т. п.). Конечно, есть ряд соединений, которые раз-
рушаются даже при тщательном соблюдении этих условий
(спиронолактон, диацетат этиндиола и др.).

б)	Дериватизация позволяет значительно снизить необрати-
мую адсорбцию. Это очень важный момент даже при хромато-
графировании половых гормонов. Как показано в предыдущем
разделе, подавляющее большинство половых гормонов можно
хроматографировать без предварительной дериватизации, щ
как правило, в фармацевтическом анализе ее не проводят (см.
табл. 2.13), однако в биоклиническом анализе перед хромато-
графированием почти всегда предварительно получают произ-
водные тех же стероидов *. Необходимость дериватизации вы-
звана тем, что при фармацевтическом анализе в хроматограф
вводят «макропробы», составляющие несколько микрограммов,
тогда как в биомедицине размер пробы гораздо меньше — в ин-
тервале нанограммовых или пикограммовых количеств. В этом
интервале концентраций необратимая адсорбция стероидов
с полярными группами (окси-, кетогруппы) на активных цент-
рах колонки приводит к серьезным относительным потерям
(пики могут полностью исчезнуть). Эту проблему можно разре-
шить, уменьшив полярность стероидов при помощи подходящей
реакции дериватизации.

в)	Дериватизация во многих случаях позволяет увеличить
летучесть стероида и, следовательно, уменьшить его время удер-
живания. Это не является общим правилом, но им можно ру-
ководствоваться главным образом при хроматографировании
неполярных производных полярных стероидов на полярных не-
подвижных фазах. На неполярных силоксановых фазах разде-
ление контролируется в основном молекулярной массой, по-
этому большинство производных с более высокой молекулярной
массой элюируется позже, чем исходные стероиды. Это иллю-
стрируется данными табл. 2.12, где приведены относительные
времена удерживания недериватизованного, ацетилированного,
триметилсилилированного и трифтор ацетилированного 5а-анд-
ростан-3р,17р-диола на трех неподвижных фазах с возрастаю-
щей полярностью; данные взяты из работы Хартмана и Во-
тица [346].

* Из этого правила, конечно, есть исключения. Сангви и 'сотр. [685]
наряду с другими авторами определяли стероиды в моче без предваритель-
ной дериватизации, а Фейер и др. оценивали содержание лекарственных
препаратов и метаболитов, например метандиенона [239], синтетических ге-
стогенов [236] и альдадиена (метаболит спиронолактона [237]) в моче.
Таблица 2.12. Сравнение характеристик удерживания производных
5а-андростан-3|3,17|3-диола на различных неподвижных фазах
[346] а

Неподвижная фаза	Недериватизо- ванное соединение	Ацетильное производное	Tрифтор ацети ль - ное производное	ТМС-эфир
SE-30 (3 %)	1,00	1,69	0,61	1,17
ХЕ-60 (3 %)	1,00	1,17	—	0,35
NGS (3 %)  (неопентилгликоль- сукцинат)	1,00	0,90	0,17	0,18

а Времена удерживания производных отнесены ко времени удерживания недерива-
тизованного соединения.

Закономерности, вытекающие из данных табл. 2.12, нельзя
считать общими: если трифторацетаты действительно элюи-
руются первыми на всех неподвижных фазах, ацетаты элюиру-
ются раньше исходных оксистероидов только на большинстве
полярных неподвижных фаз, а последовательность элюирования
свободных оксистероидов и их триметилсилиловых эфиров на
неполярных фазах, пожалуй, трудно предсказать.

г) В некоторых случаях путем подходящей дериватизации
можно улучшить разрешающую способность хроматографиче-
ской системы. Иногда для этого необходимо повысить селек-
тивность реакции. Например, оксистероиды и соответствующие
кетоны плохо разделяются на неполярных неподвижных фазах.
При обработке их смесей, например силилирующим агентом,
оксипроизводное реагирует избирательно, и, следовательно, его
можно легко отделить. В других случаях образование производ-
ных позволяет улучшить разделение пар эпимеров стероидных
спиртов. Например, силилированные производные эпимеров
разделяются лучше, чем исходные эпимеры.

д) Ранее уже указывалось, а ниже будет обсуждаться по-
дробнее, что после получения подходящих производных можно
использовать ДЭЗ или ряд других селективных детекторов, что
позволяет заметно повысить избирательность и чувствительность
измерения.

Выбор производного

Обычно в газовой хроматографии стероидов получают про-
изводные по оксигруппам. Особенно широко используется три-
метилсилилирование, являющееся наиболее важной реакцией де-
риватизации в газовой хроматографии стероидов [636, 791].
Для улучшения газохроматографических свойств стероидов ре-
акция силилирования впервые была предложена Луукайненом
и сотр. [519] еще в 1961 г., и с тех пор ее применению посвя-
щаются многочисленные публикации [5, 6, 10, 16, 17, 21, 39, 46,
48, 54, 68, 73, 85, 90, 153, 177, 179, 183, 209, 213, 232, 244, 264,
275, 284, 291, 345, 357, 377, 410, 443, 448, 486, 504, 513, 536, 540,
549, 563, 579, 580, 629, 630, 633, 643, 667, 670, 691, 693, 710, 770,
771, 778, 793, 864].

Ниже приведены формулы наиболее распространенных си-
лилирующих агентов:

СН3	СНз

I	I

НзС-Si-NH-Si-CHj

СНз СНз

СНз
I
НзС—Si - Cl

СНз

СНз

НзС—Si —СНз

О СНз

I I

НзС-C=N — Si —СНз

СНз

2 ексаметилдисилазан
(ГМД,С)

Триметилхлорсилан бис(триметилсилил) ацетамид
(тмхс)	(БОА)

СНз
I
НзС—Si—СНз

О	СНз

I	I

FjC-C=N-Si—СНз

. t	СНз

бис (триметилсилил) -
шрифт ораи. лгпатид
(БСТФА)

О СНз

II /

F3C—C-N-Si-СНз

СНз СНз

М-мегпил-М-триметил-
силилтрифторацегпамид
(МСТФАУ

СНз
I
НзС-Si—N
I

/С2Н5

хс2н5

СНз

^риметилсилилдиэтиламин
(тмсдэа)

СНз

НзС-Si -N
I \_
СНз -----------

триметилсилилимидазоп
(ТМСИМ)

Все эти агенты образуют триметилсилильные производные.
Побочные продукты реакций являются более летучими соедине-
ниями, чем стероиды, и, следовательно, не мешают анализу.
Существуют многочисленные варианты практического примене-
ния силилирующих агентов. Для решения конкретной задачи
аналитик имеет возможность выбрать оптимальные условия
проведения реакции: использовать один реагент или комбина-
цию реагентов, варьировать растворители или вообще обойтись
без них, подобрать необходимую температуру (от комнатной до
150°С) и время (от нескольких минут вплоть до выдерживания
в течение ночи). В качестве первого реагента для силилирова-
ния оксигрупп стероидов была предложена смесь ГМДС
и ТМХС в тетрагидрофуране [519]. Этот агент часто исполь-
зуют и сейчас [10, 21, 580], если для силилирования нужных
оксигрупп нет стерических затруднений. Типичная методика
приведена в работе Адлеркройца [10]. Пробу растворяют в 1 мл
свежеперегнанного пиридина, добавляют 100 мкл ГМДС
и 10 мкл ТМХС и оставляют смесь в закрытом сосуде на ночь.
Пиридин удаляют выпариванием в токе азота при 45°С. После
удаления нерастворимого хлорида аммония, образующегося из
ГМДС в процессе реакции, проводят газохроматографическое
определение, используя в качестве растворителя н-гексан.

Для силилирования наименее реакционноспособных окси-
групп (lip-ОН и 17а-ОН в производных прегнана) необходимы
более жесткие условия. В этих случаях наиболее часто исполь-
зуются БСА, БСТФА, ТМСИМ [39, 135, 209, 273, 291, 536, 778],
являющиеся очень активными агентами, особенно в сочетании
с небольшими количествами ТМХС.

Газдаг и др. [273] обрабатывали эстрогены, растворенные
в 1 мл ацетонитрила, 1 мл смеси БСТФА и пиридина (1:1) при
комнатной температуре в течение 15 мин, и проводили газо-
хроматографическое определение непосредственно в этом рас-
творе. Готелли и др. [291] при силилировании эстриола с по-
мощью БСА в качестве растворителя использовали диметил-
формамид при 70°С. Кюльпман и Бройер [488] применяли
МСТФА для силилирования 17-кетостероидов и прегнандиола,
содержащихся в моче; Людвиг-Кён и др. с помощью этого ре-
агента устанавливали профили концентраций стероидов плазмы
крови [514, 515].

Можно привести несколько примеров использования комби-
наций БСА или БСТФА с ТМХС [54, 284, 549, 670]. Для уста-
новления профиля концентраций стероидов в моче Менье [549]
наряду с другими использовал реагент Чамбаза и Хорнинга
[146], являющийся смесью ТМСИМ, БСА и ТМХС. При 80°С
реакция протекает за ночь.

Если вместо смеси ТМХС и ГМДС использовать триметил -
бромсилан, то силилируются даже менее реакционноспособные
оксигруппы. Более того, происходит енолизация кетогрупп с об-
разованием триметилсилиловых эфиров енольных форм. Такая
же побочная реакция имеет место и при силилировании окси-
групп кетостероидов наиболее реакционноспособными силили-
рующими агентами. В этом кроется одна из причин превраще-
ния кетогрупй в метоксимные перед силилированием (см. после-
дующую часть этого раздела). Как показали Чамбаз и др.

7 Заказ № 182
[145], используя МСТФА и ацетат калия, можно количественно
получить триметилсилиловые эфиры енольной формы. Это луч-
ший способ одновременной дериватизации по окси- и кетогруп-
пам: Эггер и др. [213] использовали его для силилирования
стероидов, содержащихся в моче, перед их разделением мето-
дом капиллярной газовой хроматографии. Если пробу нагре-
вать в запаянном капилляре со смесью МСТФА и пиридина
(1 : 1) в присутствии нескольких кристаллов безводного ацетата
натрия при 60°С в течение 24 ч, то все окси- и кетогруппы, за
исключением lip-ОН- и 11-кетогруппы, реагируют количе-
ственно.

Тот же принцип использовали Донике и Циммерман [19ба]
для получения производных по 3-кетогруппе тестостерона
и превращения их в триметилсилиловый, триэтилсилиловый
и трет-бутилдиметилсилиловый эфиры енольной формы.

Помимо триметилсилильных производных в особых случаях
используются также и другие силиловые эфиры. Миязаки и др.
[563] определяли число оксигрупп в молекуле стероида, сравни-
вая результаты хромато-масс-спектрометрического сканирова-
ния триметилсилилированных, диметилсилилированных и диме-
тил-^-пропилсилилированных производных. Одной из причин
поиска новых силильных производных является стремление улуч-
шить параметры удерживания и фрагментационные характери-
стики для масс-спектрального анализа. Гарвей [345] проводит
сравнение характеристик четырнадцати замещенных силиловых
эфиров. Ценными свойствами обладают трет-бутилдиметилси-
лиловые эфиры, синтезированные с помощью трет-бутилдиме-
тилсилилимидазола (предложен Келли и Тейлором [449] и вве-
ден в практику Блэром и Филлипоу [86], Куильямом и сотр.
[648] и Симарком и сотр. [706]); эти соединения в 104 раз ус-
тойчивее к гидролизу, чем триметилсилильные производные.
Наличие чрезвычайно интенсивного пика (М — 57)+ в их масс-
спектрах позволило существенно повысить чувствительность
масс-фрагментографического определения.

К недостаткам дериватизации в трет-бутилдиметилсилиль-
ные производные следует отнести невозможность силилирова-
ния стерически затрудненных оксигрупп. Легче образуются
аллилдиметилсилильные производные [634], но в процессе их по-
лучения появляются побочные продукты — производные аллил-
силоксана [85].

Последовательно замещая один из атомов водорода силили-
рующего агента на атом галогена, можно легко получить гало-
генметилдиметилсилильные производные [208]. Хотя триметил-
силиловые эфиры остаются соединениями с наиболее благо-
приятными хроматографическими параметрами, галогензаме-
щенные производные имеют особые преимущества. Хлорметил-
диметилсилильные производные играют исключительно важную
роль в хромато-масс-спектрометрических (ХМС) исследованиях
[104, 147]. Введение атома галогена в силильную группу позво-
ляет весьма сильно повысить чувствительность и количественно
определять стероиды, используя ДЭЗ. Наиболее высокой чув-
ствительности удается добиться с иодметилдиметилсилильным
производным, которое успешно использовали Сайме и Томас
[750] для определения дегидроэпиандростерона в плазме.
Исключительно ценные с точки зрения детектирования элек-
тронного захвата и возможности привлечения масс-спектромет-
рии свойства проявляют пентафторфенилдиметилсилильные
производные [571], а также кетальные производные, которые
получают при взаимодействии оксигрупп стероида с трифтор-
трихлорацетоном или тетрафтор дихлор ацетоном и метилирова-
нии промежуточного гемикеталя диазометаном [686]. Достоин-
ством предложенных Гарвеем [345а] диметоксиметилсилиловых
простых эфиров является их устойчивость к гидролизу.

Новую реакцию дериватизации по аксиальным оксигруппам
предложили Деннин и Шуллер [179]. Она начинается с образо-
вания пропенилового эфира (из ацетона через гемикеталь), за-
тем эфир ацилируют с помощью гептафтормасляного ангидрида.
Активность электронного захвата у этих производных на один-
два порядка выше, чем у гептафторбутиратов, но процесс со-
провождается побочными реакциями.

Одним из методов дериватизации служит метилирование
фенольных оксигрупп. Адлеркройц и сотр. [13, 410, 770, 771]
используют обычно этот метод для ^получения производных эст-
радиола и эстриола. З-Метиловые эфиры, полученные при по-
мощи диметилсульфата, можно очистить на колонке, триметил-
силилировать спиртовые оксигруппы и разделить полученные со-
единения методом газовой хроматографии. Милнер и Табер [557]
предложили быстрый метод метилирования эстриола непосред-
ственно в колонке при помощи гидроксида тетраметиламмония.
Другим методом метилирования является метилирование с фазо-
вым переносом ионной пары. Дэлей и сотр. [175], описавшие
этот метод, предлагают встряхивать щелочной раствор эстро-
генов с раствором метилиодида и гидроксида тетрагексиламмо-
ния в дихлорметане в течение 10 мин. При этом происходит ме-
тилирование фенольных оксигрупп, а также 17-оксигрупп эст-
риола, которые могут быть обнаружены в органической фазе.

Метилирование всех оксигрупп (в том числе глюкуронидной
части конъюгатов) проводят метилиодидом в присутствии карба-
ниона метилсульфинилметида [см. уравнение (2.18)]. Этот ме-
тод использован Томпсоном и др. [766, 767] для определения
глюкуронидов эстрогенов.

+	НзС—S—CH2Na

+ СН31

(2.18)

При реакции вицинальных цис-дяолов с ацетоном образуются
ацетониды, которые можно хроматографировать. Адлеркройц
с сотр. [19] и Яковицкий с сотр. [410] применяли эту реакцию
для разделения и определения эстриола, эпиэстриола и 16-эпи-
эстриола.
Интересным методом дериватизации Зр-оксигруппы является
ее ферментативное превращение в 3-кетогруппу. Этот прием
широко используется в анализе стеринов (см. разд. 4.2.9), но,
как было найдено Смитом и др. [733], кроме ранее используе-
мой холестериноксидазы лучше использовать Зр-оксистероид-
оксидазу, получаемую из Brevibacterium sterolicum\ этот фер-
мент пригоден для быстрой трансформации и других Зр-окси-
стероидов.

Одной из первых реакций дериватизации в газовой хромато-
графии стероидов [843] было ацетилирование оксигрупп. Бла-
годаря простоте ГХ иногда используют и в настоящее время
[94, 235, 448, 567, 643]. В качестве реагента обычно применяется
смесь уксусного ангидрида и пиридина, но имеются сведения
также об использовании ацетилхлорида [94]. Кроме того, ацети-
лирование имеет важное значение для предварительной очистки
соединений, которые сами не ацетилируются; примером служит
удаление примесей при определении прогестерона в крови, опи-
санное Фехером и др. [238].

Из всех методов дериватизации оксигрупп стероидов наи-
большее значение имеют методы с использованием галоген-
замещенных карбоновых кислот. С самого начала в газовой
хроматографии стероидов нашли применение трифторацетаты,
отличавшиеся высокой летучестью [73, 88, 794]. Их используют
при решении сложных задач; так, например, Эрсон и сотр.
[215] описали хроматографирование глюкуронида андростерона
в виде тристрифторацетильного производного метилового
эфира. Обычно эти производные определяют при помощи ДЭЗ.
Предел обнаружения может быть существенно снижен путем
увеличения числа атомов фтора в карбоновой кислоте, поэтому
нашли применение такие производные, как пентафторпропио-
наты [96], гептафторбутираты [73, 156, 180, 191, 235, 238, 535,
659], гексадекафторнонаноаты и эйкозафторундеканоаты [460,
468]. Из эфиров, содержащих атомы галогенов, используются
монохлорацетаты [491, 552, 797] и хлордифторацетаты [180,
637]. Трифторацетаты элюируются со всех неподвижных фаз
раньше исходных оксисоединений и соответствующих кетонов,
но в случае других производных ситуация не столь ясна и ско-
рость элюирования сильно зависит от типа неподвижной
фазы.

Из перечисленных выше производных предпочтение обычно
отдают гептафторбутиратам (ГФБ). Преимуществом этих про-
изводных перед ранее применявшимися триметилсилиловыми
эфирами является более высокая устойчивость к атмосферной
влаге. Реакцию этерификации обычно проводят при 20—70°С
в избытке гептафтормасляного ангидрида, разбавленного
каким-либо растворителем, например бензолом и тетрагидрофу-
раном; рекомендованы также гептафторбутирилхлорид [637]
и N-гептафторбутирилимидазол [382]; кроме того, описано га-
зофазное гептафторбутирилирование эстрогенов, адсорбирован-
ных на сетках из нержавеющей стали, парами гептафтормасля-
ного ангидрида [659].

В обычных экспериментальных условиях кетогруппы обра-
зуют гептафторбутираты енольных форм (по крайней мере ча-
стично). Как и в случае триметилсилиловых енольных эфиров,
этого можно избежать, если предварительно защитить кето-
группы, превратив их в метоксимы. Метоксимы гептафторбу-
тиратов успешно применяются для установления профиля кон-
центраций стероидов, хотя и не столь широко, как метоксимы
триметилсилильных производных [535]. Другая возможность
заключается в количественном ацилировании енольной формы.
Такой прием особенно удобен в случае Д4-3-кетостероидов, так
как он позволяет защитить эту группировку и в то же время
использовать ДЭЗ для детектирования соединений, вообще не
содержащих спиртовых оксигрупп, например прогестерона
[238]. Единственный недостаток этой реакции — одновремен-
ное образование двух продуктов: 3-гептафторбутирильного про-
изводного 2,4-диена и 3,5-диена; их можно легко разделить на
различных неподвижных фазах. Дево и Хорнинг, первыми опи-
савшие эту реакцию [191], сообщали, что 2,4- и 3,5-диены элю-
ируются с временами удерживания 26,8 и 29,7 мин соответст-
венно (1 % SE-30, 205°С). В присутствии катализатора основ-
ного характера (пиридина) 2,4-диен становится главным про-
дуктом реакции, тогда как в отсутствие его преобладает
3,5-диен.

Дериватизации кетогрупп половых гормонов не придают та-
кого большого значения, как дериватизации оксигрупп, по-
скольку кетогруппы обычно не влияют на термическую устой-
чивость стероидов, а необратимая адсорбция в этом случае не
столь сильна, как при наличии оксигрупп. Поэтому в фарма-
цевтическом анализе стероидов дериватизации кетогрупп не
проводится. Этот прием часто применяют в биоклиническом
анализе в сочетании с силилированием или ацилированием по
оксигруппам с тем, чтобы защитить кетогруппы от действия
силилирующих и ацилирующих агентов и улучшить параметры
хроматографирования. При газохроматографическом анализе
кортикостероидов дериватизации 20-кетогруппы практически
неизбежна (см. разд. 3.2.6), поэтому при установлении про-
филя концентрации стероидов при совместном присутствии по-
ловых гормонов и кортикостероидов почти всегда проводится за-
щита кетогрупп [46, 177, 377, 596, 629, 630, 710, 818].
Как видно из уравнения (2.19), реакции дериватизации ке-
тогрупп стероидов заключаются в конденсации с производными
гидроксиламина.

В качестве R в молекуле реагента могут быть метильная
[метоксимные (МО) производные] [21, 46, 48, 90, 177, 213,
377, 504, 540, 596, 629, 630, 693, 710, 818], бутильная, изоамиль-
ная [55], триметилсилильная [103], бензильная [189, 190],
пентафторфенильная [478, 499а, 580, 825а] или 2-хлорэтильная
[579] группы. Производные с двумя последними группировками
обладают способностью к электронному захвату и могут быть
определены при помощи ДЭЗ. Неблагоприятная особенность
у образовавшихся О-замещенных оксимов 4-ен-З-кетонов со-
стоит в том, что образуются их син- и анти-изомеры, которые
разделяются на различных стационарных фазах [383]. Другое
осложнение состоит в том, что при использовании колонок со
старой насадкой или при наличии в исследуемом растворе сле-
дов соляной кислоты оксимы подвергаются перегруппировке
Бекмана с образованием нитрилов [765].

Из многочисленных производных гидроксиламина, похоже,
используются только метоксимы, в основном в форме двойного
метоксим-триметилсилильного (МО-ТМС) производного. Мето-
дика Пфаффенбергера и Хорнинга [629, 630] заключается
в превращении всех кетогрупп стероидов, содержащихся в моче
(за исключением нереакционноспособной 11-кетогруппы), в ме-
токсимные производные с последующим триметилсилилирова-
нием всех оксигрупп и хроматографированием на капиллярных
колонках после соответствующей обработки пробы, включаю-
щей ферментативный гидролиз соединений и стадии экстрак-
ции. Выпаренный экстракт растворяют в 100 мкл 10 %-ного
(масса/объем) гидрохлорида метоксиамина в пиридине: После
15 мин выдерживания при 70°С раствор выпаривают досуха
в токе азота. Добавляют 100 мкл N-триметилсилилимидазола

2

I__I____I----1

0 2	4 6

Время, мин

Рис. 2.12. Газохроматографиче-
ское разделение продуктов вос-
становления ацетата норэтисте-
рона после обработки соляной
кислотой [см. уравнение (2.20)]
на колонке 4 % UCCW-982 при
температуре 220 °C [311].

1 — 17а-этинил-3,5-эстрадиен-
17-ол (побочный продукт, обра-
зующийся при обработке соля-
ной кислотой); 2 — ацетат 17а-
этинил-3,5-эсТрадиен-17-ола;

3—17-ацетат 17а-этинилэст-
ран-Зр, 17-диола.

и нагревают раствор при 100°С в течение 2 ч. Полученный рас-
твор можно использовать непосредственно для газохромато-
графического определения. Такая хроматограмма представлена
на рис. 2.11.

Из других методов с дериватизацией следует упомянуть •
предложенную Намбарой [578] методику отделения А5-3-окси-
стероидов от их насыщенных аналогов путем превращения пер-
вых в 5,6-эпоксиды под действием ж-хлорнадбензойной кислоты
с последующим триметилсилилированием. Тот же прием ис-
пользован для селективной дериватизации эквилина [669, 717].
Особенно трудной задачей является отделение А4-3-оксистерои-
дов от их насыщенных аналогов, так как первые разрушаются
в условиях газохроматографирования [236, 842а]. Гёрёг и др.
[311] решили задачу одновременного определения этих соеди-
нений в продуктах восстановления 4-ен-З-кетостероидов, пре-
вращая А4-3-оксипроизводные в 3,5-диены путем селективной
дегидратации, катализируемой кислотами [реакция (2.20)]. Как
видно из рис. 2.12, 3,5-диен легко отделяется от нереакцион-
носпособного насыщенного производного.

(2.20)

Превращение на колонке неустойчивых 3-метокси-2,5(10)-
диенов в устойчивые 3-метокси-3,5-диены описано Гёрёгом и
Лауко [309].

Наконец, следует упомянуть статьи Адхикари и Харкнесса
[7, 8] и Менгера с сотр. [542]. В первой из них предлагается
хроматографировать стероиды после удаления всех функцио-
нальных групп, во второй — пиролитическое газохроматогра-
фирование стероидов.

Подготовка проб для количественного анализа

При контроле чистоты стероидов в массе фабричного про-
дукта пробу, растворенную в подходящем растворителе, сразу
вводят в газовый хроматограф. При анализе лекарственных
дозированных форм для получения исследуемого раствора
обычно достаточно простой экстракции. Подготовка же рас-
твора при анализе биологических образцов требует гораздо
больших затрат времени и труда, чем само хроматографиро-
вание. Хотя задача газохроматографического разделения глю-
куронидов была решена путем получения и хроматографиро-
вания триметилсилильного производного метилового эфира
глюкуронида [406, 789], его ацетильного [185] или трифтораце-
тильного производного [215], а также перметилированного ме-
тилового эфира глюкуронида [767], эти конъюгаты в большин-
стве случаев подвергаются ферментативному гидролизу (реже
разложению под действием кислот или растворителей [497]).
Последующая обработка может включать несколько экстрак-
ций и разделение или очистку методами тонкослойной и (или)
колоночной хроматографии до, а иногда после реакции дерива-
тизации. Число стадий очистки можно существенно сократить,
если использовать капиллярную колоночную газовую хромато-
графию. Некоторые особенности методов ТСХ и колоночной
хроматографии разбираются в разд. 2.2.9 и 2.2.10, а комбини-
рованные методы — в разд. 2.2.3.

Что касается собственно количественных определений, то
в предыдущей части этой главы уже кратко обсуждались фак-
торы, влияющие на количественную оценку газовых хромато-
грамм стероидов. Для детального ознакомления с этими во-
просами можно обратиться к общеизвестным монографиям,
упомянутым на с. 82. В последние годы при анализе смесей
с небольшим числом компонентов общепринятым становится
использование в качестве внутренних стандартов соединений,
близких по структуре к стероидам. Для установления хрома-
тографического профиля концентраций нескольких компонентов
часто применяют два внутренних стандарта; один — с малым
временем удерживания, который вымывается до стероида,
а другой — с большим временем удерживания, выходящий
после последнего пика стероида.

Практическое применение

Газовая хроматография, особенно в сочетании с масс-спект-
рометрией [194, 487], широко используется для контроля чи-
стоты стероидных гормонов в массе продукта и для анализа
полученных из них лекарственных препаратов. В последнем
случае газовая хроматография иногда включается в фарма-
копеи. В табл. 2.13 приведены некоторые методы анализа ле-
карственных препаратов, содержащих половые гормоны.

Газовая хроматография является идеальным инструментом
для надежного анализа препаратов стероидных гормонов, как
показали Хафез и сотр. [143] для хинэстрола, Амин и сотр.
[33] для миболерона (7а, 17а-диметил- 19-нортестостерон),
Ишихара и Сугимото [ 398] для сульфата дегидроэпиандро-
стерона и Роман и сотр. [668] для эфиров эстрадиола.

Еще более важную роль играет газовая хроматография при
определении половых гормонов в биологических объектах.
Даже простое перечисление громадного числа статей в этой
области вывело бы нас за рамки книги. Большая часть работ
относится к определению стероидов в моче [5, 6, 10, 16, 17, 21,
39, 54, 58а, 68, 94, 153, 177, 213, 232, 236, 237, 239, 244, 275, 284,
357, 377, 443, 448, 486, 549, 557, 567, 629, 630, 633, 643, 648, 670,
685, 710, 767, 770, 778, 790] и в крови [16, 17, 46, 48, 88, 90,
235, 238, 409, 443, 513, 580, 596, 691, 750, 817], но имеются
также сведения об определении стероидов в фекалиях [743а]
и различных тканях [291, 410, 482, 504, 552, 589, 642, 693, 835].

Во многих случаях определяют общий профиль концентра-
ций стероидов, тогда как в других случаях интерес представ-
ляют отдельные фракции, например эстрогены [5, 6, 13, 17, 175,
410, 419, 422, 670, 766, 790], 17-кетостероиды [21, 153, 488, 685]
и т. д. Несколько статей посвящено определению отдельных
стероидов, например эстриола [94, 284, 291, 357, 643, 767, 770,
771], прегнандиола и триола [94, 486, 488, 633], прогестерона
[86, 238, 835], дегидроэпиандростерона [235, 536, 580, 589, 691,
750], лекарственных препаратов и их метаболитов [236, 237,
443, 552, 648, 675, 876] и т. д.

В качестве отдельных нетипичных примеров можно упомя-
нуть определение эстрадиола в пище животных [96] и (как
курьез) определение метилтестостерона и метандриола в воз-
духе фармацевтических производств [225], а также определение
местранола и этинилэстрадиола в листьях, почве и воде [606].

2.2.12.	ВЫСОКОЭФФЕКТИВНАЯ ЖИДКОСТНАЯ ХРОМАТОГРАФИЯ

Когда в начале 70-х годов высокоэффективная жидкост-
ная хроматография (ВЭЖХ) была введена в анализ стероидов
[364, 389, 725], газохроматографический анализ уже имел де-
сятилетнюю историю и сотни публикаций, а многие методики
вошли в повседневную практику в биомедицине и фармацев-
тике. Несмотря на это, ВЭЖХ быстро завоевала популярность
и сейчас является одним из самых ценных аналитических ме-
тодов разделения и количественного определения стероидов.

ГЖХ и ВЭЖХ имеют много общего (оба метода характе-
ризуются высокой разрешающей способностью и многосторон-
ними возможностями для количественных определений), оба
метода нашли широкое практическое применение для анализа
стероидов, и если в некоторых областях предпочтение отдается
ВЭЖХ, тогда как в других ГЖХ сохранила свои позиции, то
причину следует искать в достоинствах и недостатках ВЭЖХ.

Можно отметить следующие преимущества ВЭЖХ пе-
ред ГЖХ:

а)	ВЭЖХ обычно проводят при температуре окружающей
среды, поэтому она применима во всех областях химии стерои-
дов, даже когда из-за низкой летучести и термической неустой-
чивости некоторых стероидов (конъюгатов, сердечных глико-
зидов, кортикостероидов и т. п.) газовую хроматографию нельзя
использовать вообще или только после длительных и трудоем-
ких операций дериватизации.

б)	Хотя ВЭЖХ обладает обычно более низкой разрешаю-
щей способностью, чем ГЖХ (особенно в ее капиллярном
Таблица 2.13. Примеры газохроматографических методов определения
стероидных гормональных препаратов

Автор	Год	Активный ингредиент	Лекарственная форма		Неподвижная фаза	Температура колонки, °C	Производное	Внутренний стандарт	Относи- тельное стандарт- ное откло- нение, ± %
Тэлмедж и др. [757]	1965	Этинилэстрадиол	Таблетки, масля-		SE-30 + эпон  1001	240	Ацетильное	Эстрон	1
			ные препараты для инъекций					5а-Холестан, прогесте-	
					SE-30				
Франс и Нокс [261]	1966	Этинилэстрадиол,	Таблетки			223	—		—
		ацетат мегестрола			SE-30	260	ТМС	рон	8,6
Боутон и др. [95]	1966	Этинилэстрадиол	Таблетки					Эстрон	
Шульц [698]	1965	Местранол	Таблетки		QF-1	221	—	—	2
Шрофф и Гродски [718]	1967	Местранол	Таблетки		ХЕ-60	195	—	Эстрон	1,2
Темплтон и др. [763]	1968	Местранол	Таблетки		W-98	205	—	5а-Холестан	0,63
Хафез и др. [143]	1968	Хинэстрол	Таблетки		OV-17 или SE-30	253	—	я-Доктриаконтан	1,6
Бруши и др. [110]	1966	Метилтестостерон	Таблетки		SE-30	250	—	Ацетат тестостерона	2,6
Шрофф и Хьютман [720]	1968	Ацетат анагестона	Таблетки		DEGS	215			Местранол	—
Лодж [508]	1970	Норэтистерон	Таблетки		QF-1	200	—	Ацетат прегнанолона	—
Моретти и др. [570]	1969	Эфиры эстрадиола	Масляные препа- раты для инъек-		SE-30	190	тмс	5а-Холестан	1,19
Кавина и др. [141]	1970	Андрогены, гесто-	ции  Масляные препа-		JXR или OF-1	250	тмс	5а-Холестан-3-ол	1,14
		гены, эстрогены	раты для инъек-						
Амормино и др. [34, 35]	1968	Эфиры тестосте-	ции  Масляные препа-		SE-30	200—265	—	5а-Андростан	—
		рона	раты для инъек- ций  Мазь			(програм.)			
Карханис и Анфинсен	1970	Эстрон			OV-1	254	—	Эквилин	1,1
[444]  Шредер и др. [717]	1972	Лошадиные эстро-	Таблетки		UCCW-982	230—260	Гидролиз,	—	4,1—6,8
		гены					эпоксидирова-		
		в виде сульфатов			OV-1	230—250	ние		1,01 а
Хольх [314]	1972	Пропионат тесто-	Масляные препа-				—	Прогестерон	
		стерона	раты для инъек-						
Местрис и др. [547]	1972	Эфиры тестосте-	ций  Масляные препа-		SE-30	250	Переэтерифи-	5а-Холестан, тестосте-	1,0—3,5
		рона	раты для инъек-				кация	рон	
Местрис и др. [546, 859]	1972	Эфиры тестосте-	ции  Таблетки, масля-		SE-30	220 или 250	ТМС	5а-Холестан, тестосте-	—
		рона, прогестерон, бензоат эстра-	ные препараты			или 175—240	(в некоторых	рон	
			для инъекций,			(програм.)	случаях)		
		диола, этинилэст- радиол и т. д.	мыльца			250 или 260	ТМС (в случае		
Юзеф и Местрис [859а]	1973	Прогестерон, те-	Масляные препа-		SE-30			Холестанон, пропионат	Около 2
		стостерон, энан-	раты для инъек-					тестостерона и т. п.	
		таты эстрадиола	ций; свечи		DEGS, OV-17	235—250	эстрогенов)		0,6—6,2
Роман и др. [669]	1975	Эстрогены в виде	Таблетки				Гидролиз,	Ацетат холестерина	
		сульфатов				(програм.)	эпоксидирова-		
							ние, ТМС		

а Доверительная вероятность 95 %.
Автор	Год	Активный ингредиент	Лекарственная форма	
Бишара и др. [81]	1975	Циклопентиловый эфир этинил- эстриола-3	Таблетки	
Джонсон и др. [421]	1975	Эстрогены в виде сульфатов	Таблетки, препа- раты для инъек- ций Ветеринарные мази	
Мэджин [521]	1975	Станозолол		
Ф. XX США [783а]	1980	Циклопентилпро- пионат эстрадиола	Масляные препа- раты для инъек- ций	
Ф. XX США [783к]	1980	Циклопентилпро- пионат тестосте- рона	Масляные препа- раты для инъек- ции	
NF XIV [7646]	1975	Оксандролон	Таблетки	
Б. Ф. 1973	1973	Этилэстренол	Таблетки	
Аддендум [102а, 1026]	1975	Станолон	Таблетки	
Мак-Эрлейн и др. [540]	1977	Конъюгаты эстро- генов	Таблетки, препа- раты для инъек- ций	
Семенов и Попов [708]	1977	Деканоат нандро- лона	Масляные препа- раты для инъек- ций	
Моретти и др. [569]	1977	Местранол, нор- этистерон	Таблетки	
Газдаг и др. [273]	1977	Эфиры тестосте- рона и эстрадиола	Масляные препа- раты для инъек- ций	
Риц и Валаш [662]	1978	Линоэстренол	Таблетки	
Павельчик и Опилевич [619]	1978	Прогестерон, те- стостерон, метил- тестостерон и др.	Различные лекар- ственные формы	
Кариньян и др. [127]	1978	Экуол в конъюга- тах эстрогенов	Таблетки	
Гёрёг и др. [310]	1979	Аллилэстренол	Таблетки	
Кариньян и Лодж [129а]	1979	Норэтандролон	Таблетки	

варианте), большая универсальность ВЭЖХ позволяет подобрать
хроматографические системы для разделения любых стероидов,
включая некоторые трудные для газовой хроматографии пары
(эпимеры, производные с разной степенью ненасыщенности
и т. д.).

в)	Ее гораздо легче использовать для препаративного раз-
деления стероидов [56, 2726, 281, 282, 343]. ВЭЖХ также
применима при разделении и идентификации метаболитов
[397а].
Половые гормоны и родственные соединения 111

Продолжение табл. 2.13

	Неподвижная фаза	Температура колонки, °C	Производное	Внутренний стандарт	Относи- тельное стандарт- ное откло- нение, ± %
	UCW-98	225	ТМС	н-Тетратриаконтан	0,8
	DEGS	195	Гидролиз, ТМС	Тестостерон	—
	SE-30	300	—	Метиландростанолон	0,33
	Фторсиликон	220	ТМС	Гептилат холестерина	—
	Фторсиликон	260	—	Каприлат холестерина	—
	OV-1	250	—	н-Октакозан		
	OV-17	200	—	Арахидиловый спирт	—
	OV-17	230	—	Тестостерон	—
	OV-225	225	Ферментатив- ный гидролиз, МО-ТМС	Этинилэстрадиол	0,4
	SE-30	230	—	Пропионат тестостерона	2,4
	ХЕ-60	220	—	Пропионат тестостерона	0,44—2,06
	Дексил-400	250—320 (програм.)	тмс	Местранол	0,97—1,55
	OV-1  SE-30	212 230—290 (програм.)	—	З-Этиохоланолон Аминофеназон	1,1 1,43—5,0
	OV-225	225	тмс	Этинилэстрадиол	—
	OV-101	220	—	Дегидроэпиандростерон	1,5
	OV-17	260		Диэтилстильбэстрол	1,4

Основными недостатками ВЭЖХ являются следующие:

а)	Минимальное количество даже интенсивно поглощающих
в УФ-области стероидов (4-ен-З-кетоны и т. п.), которое можно
определить с достаточной точностью, составляет около 5 нг
[688]. Это означает, что чувствительность определения с ис-
пользованием УФ-детектора примерно равна чувствительности
определения с помощью пламенно-ионизационного детектора
в газохроматографическом методе; чувствительности же, кото-
рую обеспечивает детектор электронного захвата, достигнуть не
удается. Поэтому ВЭЖХ нельзя применять для решения тех
биомедицинских задач, где такая чувствительность абсолютно
необходима.

б)	Для слабопоглощающих в УФ-области веществ прихо-
дится проводить детектирование в коротковолновой области;
это налагает ограничения на выбор элюента, вынуждает поль-
зоваться детектором с очень высоким коэффициентом прелом-
ления или даже синтезировать производные.

в)	Несколько более высокая стоимость аппаратуры и реак-
тивов.

Как следует из сказанного выше, ВЭЖХ предоставляет
уникальные возможности для разделения и количественного
определения конъюгатов и некоторых чувствительных к нагре-
ванию производных половых гормонов и родственных им сте-
роидов, например диацетата этинодиола [306], спиронолактона
[176] и т. п. В некоторых статьях ВЭЖХ рекомендуется для
определения других групп половых гормонов, причем этот ме-
тод рассматривается как один из возможных, а в ряде слу-
чаев— предпочтительных. Например, прогестерон в масляных
препаратах для инъекций можно без труда определить как
методом ВЭЖХ [123, 456], так и методом ГЖХ [546, 619,
859].

Почти во всех фундаментальных монографиях, посвящен-
ных ВЭЖХ, приводятся примеры из области стероидов; наибо-
лее исчерпывающие сведения можно найти в книге Хефт-
манна [355].

Хроматографические системы

В методе ВЭЖХ с самого начала использовали твердые но-
сители с нанесенной жидкой неподвижной фазой, например, ди-
оксид кремния марки зипакс, покрытый р,р'-диоксидипропио-
нитрилом (подвижной фазой служат гептан или смеси гептана
с тетрагидрофураном), диатомиты (анахром АВ), полимеры
(CTFE-2300) и диоксид кремния марки зипакс, покрытый жид-
кой ионообменной смолой амберлит LA-I или тридеканонитри-
лом [252] (элюентом служит вода [725]) и т. п. Теория раз-
деления стероидов с помощью подобных жидкость-жидкостных
распределительных систем разработана довольно основательно,
и носители, покрытые на 20—60 % неподвижными фазами типа
р,р'-диоксидипропионитрила, карбовакса 400 [814] и форма-
мида [221], обладают высокой покрывающей способностью, од-
нако в настоящее время почти исключительно используются
адсорбционные носители или системы с обращенной химически
связанной неподвижной фазой.
Некоторые адсорбционно-хроматографические методы с при-
менением кремнезема в качестве носителя перечислены
в табл. 2.14.

1

Рис. 2.13. Адсорбционное
хроматографическое раз-
деление ацетата тестосте-
рона (/), 1,4-прегнадиен-
3,20-диона (2) и тестосте-
рона (5) ВЭЖХ на ко-
лонке (15 см X 4,6 мм),
заполненной лихросорбом
SI-60, элюентом изоок-
тан—дихлорметан—2-про-
панол—вода (80: 10 : 10 :
:0,25); УФ-детектор на
236 нм [287].

На рис. 2.13, заимствованном из статьи Джоннета и Рокка
]287], представлены результаты разделения трех производных
методом адсорбционной хроматографии; в статье подчеркива-
ется важность добавления к растворителю определенного коли-
чества воды.

Распределительная хроматография с химически связанными
неподвижными фазами и непосредственное элюирование исполь-
зуются редко. Можно привести единичный пример из статьи
Камерони и сотр. [123], которые использовали колонки, запол-
ненные амино-SIL-X-I и циано-SIL-X-I, и смесь гексана и 2-про-
панола (9:1) для разделения и количественного определения
прогестерона в масляных препаратах для инъекций. Рус
[672] предложил колонку, заполненную пермафазой ЕТН, и
смеси гептана и 2-пропанола для разделения эстрогенов

8 Заказ № 182
Таблица 2.14. Адсорбционные методы ВЭЖХ разделения несвязанных половых
гормонов на различных колонках с носителями на основе
диоксида кремния

Автор	Год	Разделяемые соединения	Объект
Хьютман и	1975	Син- и бшп/-оксимы 17-	В массе лекарственного
Шрофф [391]	1975	ацетата норэтистерона	вещества
Баттерфильд и др.		Метандростенолон	В массе лекарственного
[П9]		и родственные соедине- ния	вещества
Джоннет и Рокка [287]	1976	Тестостерон и его аце- таты, 1,4-прегнадиен-З, 20-дион	Смесь стандартов
Уильямсон [833]	1976	Канренон	Готовые лекарственные формы  Биологические объекты
Сатьясваруп и др. [688]	1977	Андрогены	
Хара и Хайаши [341]	1977	43 стероида	Стандарты
Долфин и Пер- гэйнд [197]	1977	Эстрогены	Моча
Хара и др. [340]	1978	Моно- и бифункциональ- ные стероиды	Стандарты
Хара и Накахата г ад Qi	1978	Различные стероиды	Искусственные смеси
Рус [673]	1978	Эстрогены	Готовые лекарственные формы
Хьюгс и др. [392]	1978	Местранол и примеси в нем	В массе лекарственного вещества
Хорикава и др. [381]	1979	4-Ен-З-кетостероиды	Смеси стандартов
Нойрат и др. [587]	1979	Канренон	Сыворотка, моча
Шейх и др. [711]	1979	Тестостерон и метабо- литы	Инкубационные смеси in vitro
Делёф и др. [174]	1979	Канренон	Плазма
Роман и др. [668]	1979	Син- и акп/-дифенило- ксигидразоны энантата тестостерона	Равновесные смеси
Хантер и др. [393а]	1979	Андрогены	Стандарты
Лин и др. [500а]	1980	Продукты восстановле- ния прогестерона	Стандарты
Кавасаки и др. [445а]	1980	Кетостероиды	Моча, сыворотка
Носитель	Элюент	Детектирование	Дериватиза- ция
Пеллосил	Не приводится	УФ, 254 нм	—
Лихросорб SI-60	3 %-ный раствор ди- хлорэтана и 15 %-ный раствор 2-пропанола в гексане	УФ, 254 нм	—
Партисил-5, лих- росорб SI-60	Изооктан—CH2CI2— пропанол—Н2О	УФ, 236 нм	—
Сил-Х	4 %-ный раствор пропа- нола в гексане	УФ, 254 нм	—
Порасил	CHCI3 — изооктан (6 : 4)	УФ, РИ	—
Корасил II	Смеси гексана и.этил- ацетата	УФ, 254 нм, РИ	—
Партисил-5	5 %-ный раствор эта- нола в гексане	УФ, 280 нм	—
Вакогель LC-10h	Различные бинарные системы	РИ	—
Вакогели разных марок	Смеси гексана и этил- ацетата	УФ, 254 нм	—
Лихросорб SI-60	20 %-ный раствор геп- тана В CHCI3	Флуоресценция	+
Порасил	0,2 %-ный раствор мета- нола в СН2С12	УФ	—
Зорбакссил Хитачигель ЗОН (полимер)	1,4 %-ный раствор воды, 2,4 %-ный раствор эта- нола в СН2С12; гексан— метанол (5: 95)	УФ + флуоресцен- ция	+
Лихросорб SI-100	Хлороформ—гексан (1:1 или 11:9)	УФ, 283 нм	—
Партисил-10	Г ексан—тетрагидрофу- ран—2-пропанол (16:3: 1)	УФ, 254 нм	
Лихросорб SI-100	Г ексан—н-пропанол— уксусная кислота (81 : 18: 1)	УФ, 283 нм	
Зорбакссил	Пентан—эфир—концент- рированный аммиак (50:50: 1)	УФ, 254 нм	—
Партисил-5	СН2С12—ацетонитрил— 2-пропанол (89,5 : 10 : 0,5)	УФ, 254 нм	
Партисил-5	0,25 %-ный раствор эта- нола в СН2С12 или гек- сан—метанол—этанол (96 : 3 : 1)	УФ, РИ	
Хитачигель 3042	СН2С12—этанол—Н2О (400 : 1 : 2) и т. п.	Флуоресценция	
в недериватизированной и в дериватизированной формах. Бат-
терфильд и сотр. [118] разделяли эстрогены лошади на такой
же колонке, используя 2 %-ный раствор тетрагидрофурана в гек-
сане в качестве элюента.

Гораздо чаще при анализе половых гормонов используют
обращенные химически связанные неподвижные фазы, эти си-

Рис. 2.14. Разделение стероидов методом ВЭЖХ с обращенной фазой [588].
1 — 17а-окси-20а-дигидропрогестерон; 2 — тестостерон; 3 — андростерон; 4 —
17а-оксипрогестерон; 5 — 20а-дигидропрогестерон; 6 — прогестерон.

Колонки: а — зорбакс ODS (25 смХ4 мм); б — нуклеосил 5Ci8; в — гиперсил
ODS. Элюент смесь ацетонитрила (32—100 %) с водой; соотношение меняется
по экспоненциальному зокону. УФ-детектор на 240 нм, температура 45°С.

стемы можно считать самыми распространенными в ВЭЖХ для
такого рода определений. В табл. 2.15 приведены сведения
о важнейших методах, а на рис. 2.14 — типичные хромато-
граммы, заимствованные из статьи Найса и О’Хары [588],
иллюстрирующие важность выбора оптимальных систем.

Как уже упоминалось, в анализе стероидных половых гор-
монов ВЭЖХ применяется главным образом для разделения и
количественного определения их конъюгатов (глюкуронидов,
сульфатов, фосфатов), поскольку эти производные нельзя раз-
делять методом газовой хроматографии.

Данные табл. 2.16 показывают, что вещества кислотного ха-
рактера можно разделить на разного рода ионообменных ко-
лонках или методом хроматографии ионных пар; кроме того, х
успешно используется также распределительная хроматография
с обращенной фазой.

На рис. 2.15, взятом из статьи Ван-дер-Вала и Хубера
[801], приведен уникальный пример применения анионообмен-
ной колонки, заполненной целлюлозой, в ВЭЖХ стероидов.

Рис. 2.15. Разделение конъюгатов
стероидов методами ВЭЖХ на ионо-
обменной колонке.

1 — глюкуронид тестостерона; 2 —
глюкуронид эстрона; 3 — сульфат те-
стостерона; 4 — 3-сульфат эстриола:
5 —- сульфат эстрона; 6 — 3-сульфат
17а-эстрадиола; 7 — 3-сульфат Па-
дигидроэквилина; 8 — сульфат экви-
ленина; 9 — 3-сульфат Па-дигидро-
эквиленина.

Колонка размером 10 см\4 мм,
заполненная смесью целлюлозы
ECTEOLA В-300 и диатомита (5: 1);
элюент 0,025 М перхлорат-4-0,01 М
фосфат в воде (pH 6,8), УФ-детек-
тор на 220 нм, температура 70°С.

Время, мин

В большинстве случаев изократическое элюирование позво-
ляет получить удовлетворительные результаты при ВЭЖХ по-
ловых гормонов. Градиентное элюирование и составные ко-
лонки [220, 731а] используются сравнительно редко.

Детекторы

Большинство половых стероидных гормонов обладает доста-
точно интенсивным поглощением в УФ-области, что позволяет
проводить их определение с помощью УФ-детекторов. Как
видно из данных табл. 2.14—2.16, соединения с 4-ен-З-кето- или
1,4-диен-З-кетогруппировками можно определять с довольно вы-
сокой чувствительностью по поглощению при 240 нм. Поскольку
поглощение при 254 нм (т. е. не в максимуме полосы) все же
достаточно высокое, широко используется УФ-детектор с ртут-
ной лампой, дающей единичную длину волны. Эта длина волны
не подходит для контроля содержания эстрогенов: их погло-
щение детектируется либо в длинноволновой области по мало-
интенсивной полосе при 280 нм, либо в коротковолновой обла-
сти по интенсивной полосе в интервале 210—220 нм.
Таблица 2.15. Разделение несвязанных половых гормонов методами ВЭЖХ
с обращенной фазой с использованием химически связанных
неподвижных фаз

Автор	Год	Разделяемые соединения	Объект
Фитцпатрик и Сиггиа [254]	1973	Оксистероиды	Смесь стандартов
Лефосс и др. [489]	1976	Андростерон, эпиандро- стерон; дегидроэпианд- ростерон, этиохоланолон	Смесь стандартов
Карч и др. [442]	1976	Андрогены, прогесто- гены	Смесь стандартов
Керавис и др.  [450]  Черне и Капи- тане [779]	1977	Эстрогены, андрогены	Смесь стандартов
	1977	Эстрогены	Смесь стандартов
Сатьясваруп и др. FARRl	1977	Эстрогены	Смесь стандартов
Хара и Хайяши [341]	1977	43 стероида	Стандарты
Фархи и Мондер [234]	1978	Карбоксильные произ- водные	Смесь стандартов
Гёрёг и др. [306, 311]	1978  1979	Диацетаты и 17-моно- ацетаты а- и р-этино- диола	В массе продукта
Бэйли и Бриттен Г5Ч1	1973	Ацетат хлормадинона	Таблетки
Хьютман и  Шрофф [391]	1975	Оксим ацетата норэти- стерона	Таблетки
Гёрёг и Хереньи [307]	1977	Этинилэстрадиол, диа- цетат этинодиола	Таблетки
Хелбо и Томсен [361]	1978	Норэтистерон, местра- нол	Таблетки
Бэгон и Хэммонд [52]	1978	Этинилэстрадиол	Таблетки
Дас Гупта и Ге- накар [176]	1978	Спиронолактон	Таблетки
Кинг и др. [456]	1974	Прогестерон	Масляные препараты для инъекций
Юнге и Брауэр [428]	1979	16а- и p-эпимеры 9-F- 11 Р-окси- 16-метил-1,4- андростадиен-3,17-диона	Продукты разложения фосфата дексаметазона в лекарственных дозиро- ванных формах
О’Харе и др. [604]	1976	Андрогены, прогесто- гены, кортикостероиды	Культура монослоя те- стикул и надпочечников
Шмидт и др. [692]	1978	Эстрогены	Моча
Носитель	Элюент	Детектирование	Дери- вати- зация
Пермафаз ODS	Смеси СНзОН и НгО	УФ, 230, 254 нм	+
Микропак СН	Смеси СНзОН и Н2О	РИ	—
SI-100-C18	Смеси СНзОН и Н2О	РИ, УФ, 254 нм	—
ц-Бондапак Cie	Смеси СНзОН и Н2О	РИ	—
ц-Бондапак Ci8	СНзОН—Н2О (1:1) с 2 % AgNO3	УФ, 280 нм	—
ц-Бондапак Ci8	Н2О—ацетонитрил (3 : 2)	РИ, УФ	—
ц-Бондапак Cj8	Смеси СНзОН—Н2О и ацетонитрил—Н2О	РИ, УФ, 254 нм	—
Зорбакс ODS	Смеси СНзОН и Н2О	УФ, 254 нм	+
ц-Бондапак Ci8	СНзОН—Н2О (4:1)	УФ, 210 нм	—
Пермафаз ODS	СНзОН—Н2О (28:72)	УФ, 254 нм	—
Пермафаз ODS	СН3ОН-Н2О (1:1)	УФ, 254 нм	—
ц-Бондапак Ci8	СНзОН—Н2О	УФ, 280 нм  220 нм	—
Лихросорб RP-8	СНзОН—фосфатный буфер (pH 7) (3 : 1)	УФ, 280 нм	—
Сферисорб S 5-ODS	Смеси СНзОН и Н2О	УФ, 212 нм	—
ц-Бондапак CN	С2Н5ОН—Н2О (4:6)	УФ, 254 нм	—
Пермафаз ODS	2-Пропанол—Н2О (18:82)	УФ, 254 нм	—
ц-Бондапак Ci8	СНзОН—Н2О (1:1)	УФ, 240 нм	—
ц-Бондапак Ci8	Ацетонитрил—Н2О, СНзОН—Н2О, градиент- ное элюирование диок- сан—Н2О	УФ или жидкост- ная сцинтилляция	—
С]8	СНзОН—Н2О (6:4), уксусная кислота, pH 3,9	Флуоресценция	+
Автор	Год	Разделяемые соединения	Объект
Готе ли и др. [290]	1978	Эстриол	Моча
Дюрбек и др. [205, 265, 266]	1978	Анаболические стероиды и их метаболиты	Моча
Холдер и др. [375]	1979	Тренболон и его ацетат	Корма для животных; моча
Хаттори и др. [350]	1979	Дексаметазон	Мазь
Кокран и др. [159]	1979	Тестостерон	Биологические объекты
Кокран и др. [158]	1979	14 стероидов семенни- ков	Семенники
Кариньян и Лодж [129а]	1979	Норэтандролон	Таблетка
Кариньян и др. [129в]	1980	Эфиры эстрадиола	Масляные препараты для инъекций
Кариньян и др. [129г]	1980	Эфиры тестостерона	Масляные препараты для инъекций
Цилифонис и Ха- фез [780а]	1980	Хинэстрол	Таблетка
Глюк и Шек [2796]	1980	Этинилэстрадиол и нор- этистерон	Капсулы
Рус [673а]	1980	Эстрогены	Лекарственные препа- раты
Маури и Сиггиа [573а]	1980	Эстрогены	Моча
Кариньян и др. [129а]	1981	Тестолактон и примеси	Лекарственные препа- раты
Продолжение табл. 2.15

	Носитель	Элюент	Детектирование	Дери- вати- зация
	ц-Бондапак Cie	Ацетонитрил—фосфат- ный буфер (pH 4,4) (22:78)	УФ	—
	Нуклеозил-CN Нуклеозил-Cie	Градиентное элюирова- ние СНзОН—Н2О	УФ, 254 нм	—
	ц-Бондапак Cie	СН3ОН-Н2О (3:1)	УФ, 345 нм	—
	ц-Бондапак Cie	СНзОН—Н2О	УФ, 254 нм	—
	ц-Бондапак Ci8	Ацетонитрил—Н2О (4:6)	УФ, 240 нм	—
	ц-Бондапак Ci8  или партисил 10 ODS	СНзОН—Н2О (7:3) или ацетонитрил—Н2О (4:6)	Жидкостной сцин- тилляционный	—
	RP-18	СНзОН—Н2О (70:30)	УФ, 240 нм	—
	RP-8	Ацетонитрил—Н2О (70 : 30)	УФ, 280 нм	—
	RP-8	СНзОН—тетрагидрофу- ран—Н2О (57: 11 : 32)	УФ	—
	Зорбакс ODS	Ацетонитрил—Н2О (8:2)	УФ, 281 нм	—
	Сферисорб ODS	Ацетонитрил—тетрагид- рофуран—Н2О	УФ, 280 нм	—
	ц-Бондапак Ci8 и т. п.	Ацетонитрил—Н2О (32:68) или (70:30)	УФ, 254 нм	—
	Связанный пирролидон на SI-60	СНзОН—Н2О (1:1)	УФ, 280 нм	—
	RP-8	СНзОН—Н2О	УФ	—
Таблица 2.16. Разделение конъюгатов стероидов методом ВЭЖХ

Автор		Год	Разделяемые соединения	Объект		
Ван-дер-Вал и бер [800]	Ху-	1974	* Глюкурониды эстроге- нов	Смесь	стандартов	
Ван-дер-Вал и бер [802]	Ху-	1977	Глюкурониды, сульфа- ты и фосфаты эстроге- нов	Смесь	стандартов; моча	
Ван-дер-Вал и бер [801]	Ху-	1977	Глюкурониды и сульфа- ты стероидов	Смесь	стандартов	
Ван-дер-Вал и Хубер [803]		1978	Глюкурониды, сульфаты и фосфаты стероидов	Смесь	стандартов	
Ван-дер-Вал [799]		1977	Профиль концентраций конъюгатов эстрогенов	Моча		
Фрэнсон и др. [262]		1976	Сульфаты эстрогенов	Смесь	стандартов	
Германсон [365]		1978	Глюкурониды эстроге- нов	Смесь	стандартов	
Керавис и др. [450]		1977	Сульфаты и глюкуро- ниды эстрогенов	Смесь	стандартов	
Мюсе и др. [576]		1978	Сульфаты и глюкуро- ниды эстрогенов	Плазма		
Хедли и др. [353]		1979	Метаболиты 17|3-эстра- диола	Ткани		
Диксон и др. [189а]		1979	Сульфаты, глюкурониды эстрогенов	Моча		
Носитель	Элюент	Детектирование	Дери- вати- зация
Анионообменная целлю- лоза	Ацетатный буфер (pH 4,5—5); 0,05— 0,5 М NaCl	УФ	—
Анионообменная целлю- лоза	Фосфатный буфер (pH 6,8—8,5), 0,01— 0,25 М NaClO4	УФ, флуоресцен- ция	+
Анионообменная целлю- лоза с диатомитами	Фосфатный буфер (pH 6,8—8,5), 0,01— 0,25 М NaClO4	УФ	—
Ci, Cis силикагели и т. п.	Буферные смеси вода— спирты, вода—ацетонит- рил	УФ	—
Анионообменная целлю- лоза с диатомитами (5:1)	Буферированные фос- фатами растворы NaClO4 (pH 5—8)	Флуоресценция	+
Лихросфер SI-100 с на- несенным водным бро- мидом аммония	СН2С12—пентанол или  СНС13—бутанол	УФ, 254 нм	—
Лихросорб RP-2 или RP-18 с нанесенным пентанолом	Растворители для ион- парной хроматографии	УФ, 254 нм	—
ц-Бондапак Ci8	Различные смеси воды и метанола	РИ	—
Партисил SAX, ионооб- менник	0,1 М NaCl (pH 4,5)	УФ, 254 нм, радиоактивность	—
Лихросорб Ci	10—100 %-ный раствор СНзОН в 0,01 М водном ацетате аммония	Радиоактивность	—
Гиперсил ODS	Растворитель для ион- парной хроматографии	УФ	—
Стероиды, содержащие изолированные хромофоры в моле-
куле (кетогруппы, двойные связи и т. п.), можно определять

Врем я, мин

Рис. 2.16. Разделение
эпимеров диацетатов а-
и р-этинодиола методом
ВЭЖХ на колонке раз-
мером 30 смх4 мм с р-
бондапаком Cie при элю-
ировании смесью мета-
нол—вода (4:1); УФ-
детектор на 210 нм.

по поглощению в коротковолновой обла-
сти, но с ограниченной чувствитель-
ностью. В качестве примера на рис. 2.16
приведены результаты разделения и оп-
ределения диацетатов а- и р-этинодиола,
полученные Гёрёгом и Хереньи [306].

Реже используется малочувствитель-
ный рефрактометрический детектор (РФ).
Его применение ограничивается теми
случаями, когда детектирование в УФ-
области невозможно из-за отсутствия
соответствующих хромофоров или когда
имеется достаточное количество пробы,
а в задачу входит лишь получение об-
щего отклика от всех стероидов (отклики
от разных стероидов почти одинаковы).

Эстрогены можно детектировать при
помощи электрохимического детектора,
используя анодное окисление фенольного
кольца А [261а, 3716, 713а]. Для кате-
холэстрогенов можно достигнуть предела
обнаружения, равного 1 нг [7136, 713г].

Хотя возможность возбуждения неко-
торых эстрогенов в длинноволновой об-
ласти позволяет детектировать их (с по-
мощью флуориметрических детекторов)
без дериватизации [105а, 761а], в боль-
шинстве случаев применение этих детек-
торов связано с необходимостью получе-
ния производных (дериватизацией), по-
этому эти методы будут обсуждаться,

в следующем разделе.

Методы дериватизации

Целью дериватизации в газохроматографическом анализе
стероидных гормонов является (среди прочих) улучшение раз-
деления, тогда как единственная цель дериватизации в высо-
коэффективной жидкостной хроматографии заключается во
введении хромофоров или люминофоров в молекулу этих со-
единений; тем самым повышаются селективность обнаружения
и особенно чувствительность количественного определения.
Хотя этому вопросу посвящено огромное число работ, можно
утверждать, что дериватизации в ВЭЖХ имеет гораздо мень-
шее значение, чем в газохроматографическом анализе стероид-
ных гормонов.

В большинстве случаев дериватизацию проводят перед вве-
дением в колонку, т. е. дериватизации подвергается разделяе-
мая смесь и фактически разделяют производные [253, 254, 364,
671, 673, 692]. Однако описана также дериватизация разделен-
ных компонентов, которую проводят в элюате после выхода
его из колонки перед флуориметрическим детектированием
[381, 382].

Первой для разделения и количественного определения ме-
тодом ВЭЖХ была использована классическая колориметриче-
ская реакция получения производных кетостероидов — их
2,4-динитрофенилгидразонов (работа Генри и сотр. [364]).
Затем Фитцпатрик и др. [253] применили этот метод для опре-
деления андростерона и родственных веществ, а Рус [671] —
для определения конъюгатов и этерифицированных эстрогенов
в лекарственных формах. Хотя при анализе хроматограмм
с помощью одноволнового УФ-детектора (при 254 нм) сущест-
венно повышается чувствительность [364], измерение в более
длинноволновой области селективнее (например, при 365 нм
[671]). Повышение чувствительности позволяет снизить предел
обнаружения до 1 нг. Разделение динитрофенилпроизводных
проходит почти так же, как и разделение исходных стероидов,
что характерно и для других производных, описанных в этом
разделе. Используя /г-нитрофенилгидразин в качестве реагента
для дериватизации и электрохимический детектор, Шимада
и др. [71 Зв] добились еще более высокой чувствительности
(200 пг).

На распределительных хроматографических колонках [253,
364, 671] для динитрофенилгидразонов индивидуальных стерои-
дов (в том числе 4-ен-З-кетостероидов) получены хромато-
граммы с единичными симметричными пиками. Однако при ис-
пользовании для разделения адсорбционных хроматографиче-
ских колонок и различных элюентов эти пики расщепляются на
два, соответствующие син- и анти-изомерам динитрофенилгид-
разонов 4-ен-З-кетонов [308]. На рис. 2.17 это явление иллю-
стрируется на примере соответствующих производных прогесте-
рона *.

Кавасаки и др. [445а] описали дериватизацию кетостерои-
дов дансилгидразином для их флуориметрического обнаружения
(возбуждение при 350 нм, испускание при 505 нм).

* Недавно Роман и др. [666] описали разделение син- и анти-изомеров
дифенилоксиацетилгидразона тестостеронэнантата.
Другой функциональной группой, удобной для дериватиза-
ции в методе ВЭЖХ, является оксигруппа. Фитцпатрик и Сиг-
гиа [254] предложили метод бензо-

Рис. 2.17. Разделение син- и
анти-изомеров бис(динитрофе-
нилгидразонов) прогестерона
методом ВЭЖХ на колонке
с партисилом PXS-10 при элю-

ировании смесью циклогексан—
дихлорметан (2 : 3); УФ-детек-
тор на 254 нм [308].

илирования бензоилхлоридом в пи-
ридине с последующим разделением
бензоатов стероидов экстракцией
эфиром после разрушения из-
бытка реагента. Благодаря интен-
сивной полосе поглощения при
230 нм чувствительность обнаруже-
ния этих бензоатов, а также их раз-
деление достаточно удовлетвори-
тельные. Например, за 12 мин
можно разделить прегненолон и ал-
лопрегнанолон в виде их бензоатов
на колонках с обращенной фазой
(пермафаза ODS) путем вымыва-
ния смесью метанола и воды (2: 1).
Несмотря на эти достоинства, бен-
зоилирование, по-видимому, не по-
лучит широкого распространения
в ВЭЖХ стероидных гормонов. То
же справедливо и в отношении дру-
гих возможных способов деривати-
зации при проведении ВЭЖХ сте-
роидных гормонов, таких, как обра-
зование 2,6-динитрофенилгидразона
пирувоилового эфира или п-иодбен-
золсульфонилового эфира [671]. Од-
нако следует заметить, что п-нитро-
бензоилирование, также упоминае-
мое в статье Фитцпатрика и Сиггиа
[254], оказалось чрезвычайно по-
лезным в ВЭЖХ сердечных глико-
зидов (см. разд. 7.2.7).

Росс [673, 673в] и Шмидт с сотр.
[692] почти одновременно опубли-

ковали метод определения эстроге-
нов с использованием ВЭЖХ, осно-
ванный на образовании дансилпро-
изводных (см. разд. 2.2.10) и отли-

чающийся высокими селективностью и чувствительностью. Дан-
силхлорид в ацетоне в присутствии водного карбоната натрия
легко дансилирует фенольную группу эстрогенов, причем данси-
лированные эстрогены можно вводить в хроматограф после экст-
ракции [673] их из реакционной смеси или без экстракции
[692]. Разделение дансилированных эстрогенов и отделение их
от других недансилированных стероидов проходят одинаково
эффективно как на силикагеле [673], так и на распределитель-
ных колонках с обращенной фазой [692]. Даже при расши-
фровке хроматограммы с помощью УФ-детектора при 350 нм
чувствительность обнаружения гораздо выше, чем для исходных
стероидов, а использование флуоресцентных детекторов (возбу-
ждение при 350 нм, испускание при 540 нм) позволяет снизить
предел обнаружения до 10 пг. Благодаря реакции дансилирова-
ния этот метод можно использовать для решения сложных
задач анализа эстрогенов: для определения эстрогенов в лекар-
ственных формах, например этинилэстрадиола в противозача-
точных таблетках [673], и обнаружения эстриола в моче бере-
менных [692].

Недавно Гото и сотр. [288а] предложили очень реакционно-
способный и высокочувствительный дериватизационный агент
(4-диметиламино-1 -нафтоилнитрил), позволяющий с помощью
флуоресцентного детектора обнаруживать до 200 пг оксисте-
роидов.

Фархи и Мондер [234] описали метод определения насы-
щенных 21-оевых кислот (метаболитов кортикостероидов) и
других карбоновых кислот стероидов с помощью УФ-детектора,
настроенного на 254 нм, после превращения . этих кислот
в n-бромфенациловые эфиры; последние интенсивно поглощают
свет при этой длине волны, и их легко разделить на распреде-
лительной колонке с обращенной фазой.

но*

соон

п-йромфенациловый эфир
кортоловой кислоты
Помимо рассмотренных методов предварительной деривати-
зации для ВЭЖХ стероидных гормонов предложены также два
метода дериватизации после пропускания через колонку. Ван-
дер-Вал и Хубер [799, 802] использовали реакцию Кобера [470]

Элюат
из колонки

Насос.

Г”

Тройник

.Воздух
Реагент
Кобера

Г

Реакцион^.

ный	16

сосуд	мл

--1 Кран

—т-

Уксусная
'кислота

Сброс
после
барботера

Л мл сброса-}----------1-

!______I

Флуориметр

Рис. 2.18. Схема детектора с газовым сегментным проточным реакторам для
установления профиля концентраций конъюгатов эстрогена [799, 802].

в варианте Скрамовски—Хаберле [728] (см. разд. 2.2.2)
для установления профиля концентрации конъюгатов эстроге-
нов в моче беременных женщин. Высокая чувствительность
флуориметрического детектирования позволяет, минуя какое-
либо предварительное концентрирование, количественно опреде-
лять минимальные содержания компонентов, что невозможно
при УФ-детектировании, основанном на собственном поглоще-
нии. Несмотря на ряд сложностей [смешивание элюента после
выхода из колонки с реагентом Кобера, содержащим 85 % (по
объему) серной кислоты, проведение реакции при 130°С, раз-
бавление смеси уксусной кислотой, использование газового
(сегментного) проточного реактора во избежание размывания
пика и т. д.], были получены хорошие результаты. Схема после-
колоночного реактора и детектора приведена на рис. 2.18.

Конъюгаты разделяли на колонке, заполненной анионЬрб-
менной целлюлозой, а для детектирования использовали флу-
ориметр (возбуждение при 535 нм, испускание при 561 нм).
Хорикава и сотр. [381] применяли в качестве послеколо-
ночного метода дериватизации свой ранее опубликованный
флуориметрический метод [380] (см. разд. 2.2.3), основанный
на реакции А4-3-кетостероидов с гидразидом изоникотиновой
кислоты и образовании комплекса между получающимся гид-
разоном и хлоридом алюминия. Чувствительность флуоримет-
рического обнаружения в этом случае не превышает чувстви-
тельности УФ-детектирования, но дериватизация приводит
к повышению селективности, что может пригодиться при ана-
лизе сложных биологических объектов.

Хотя цель дериватизации при проведении высокоэффектив-
ной жидкостной хроматографии состоит почти исключительно
в повышении чувствительности обнаружения, стоит упомянуть
о работе Руса и Медвика [6736], где 17-кетогруппу эстроге-
нов восстанавливали борогидридом натрия до хроматографи-
рования с целью улучшить их разделение.

Практическое применение

В последнее десятилетие было предложено много разнообраз-
ных хроматографических систем, с помощью которых сейчас
можно решить практически все задачи разделения и количе-
ственного определения. Вероятно, в этом причина относительно
небольшого числа публикаций, посвященных применению ВЭЖХ
для контроля за чистотой лекарственных препаратов в массе
фабричного продукта. Такие исследования проводятся в ряде
лабораторий, но опубликовано очень мало результатов. Однако
даже эти разрозненные сведения дают представления о важно-
сти метода при установлении профиля концентраций примесей
в стероидных лекарственных препаратах, например в метанд-
ростенолоне [119], местраноле [392] и т. п. Помимо достоинств,
о которых упоминалось во введении к этой главе, особое пре-
имущество метода ВЭЖХ заключается в возможности скани-
ровать хроматограммы при различных длинах волн на УФ-де-
текторе с перестраиваемой длиной волны и делать важные за-
ключения о структуре отдельных примесей по изменению пло-
щади индивидуальных пиков. Особенно полезен метод ВЭЖХ
для разделения и количественного определения изомерных пар
[356]. В качестве наиболее важных примеров можно назвать
разделение смесей A/В цис-транс-эппмеров [356], определение
примеси За-изомера в диацетате Зр-этинодиола [306], распо-
знавание позиционных изомеров (определение примеси норэти-
стерона в норэтинодреле и наоборот [308]), определение при-
меси 7р-тиоацетильного эпимера в спиронолактоне [308] и раз-
деление син- и анти-изомеров [308, 391, 616а, 666].

9 Заказ № 182
Возрастающая роль метода ВЭЖХ в количественном ана-
лизе готовых лекарственных форм нашла отражение в росте
числа методик, рекомендуемых в фармакопеях (например, для
определения 21 стероида в массе продукта и 31 стероида в виде
готовых лекарственных форм в фармакопее XX США [783] ).

Что касается применения в биомедицине, то ряд задач, в ос-
новном касающихся анализа стероидов, содержащихся в моче,
уже решен. Разработка методов дериватизации и привлечение
чувствительных, главным образом флуоресцентных, детекторов,
конечно, приведет к возрастанию роли ВЭЖХ в тех областях
биомедицинского анализа, где чувствительность этого метода
пока недостаточна.

Наконец, следует заметить, что в последние несколько лет
возросла роль высокоэффективной жидкостной хроматографии
как метода предварительного разделения. Например, Герман-
сон [365а] описал газохроматографическое определение глю-
куронидов стероидов после разделения ВЭЖХ. Шёнёсхофер
и др. [696а] сообщили об использовании ВЭЖХ для предва-
рительной очистки при радиоиммунном определении прегнено-
лона и 17-оксипрегненолона.

2.2.13.	РАДИОИММУННЫЙ

И ДРУГИЕ РАДИОИЗОТОПНЫЕ МЕТОДЫ АНАЛИЗА

Методы с использованием стероидов, меченных радиоизото-
пами, находят широкое применение для определения стероид-
ных гормонов в биологических объектах. Такое положение
существовало уже 20—25 лет назад, но недавно роль радиоизо-
топных методов возросла благодаря развитию и быстрому
распространению методов связывания белка (в основном радио-
иммунных). Это привело одновременно к снижению роли «клас-
сических» радиоизотопных методов. Поэтому огромный мате-
риал, опубликованный по этим вопросам, будет обсуждаться
очень кратко и больше внимания будет уделено современным
методам.

Метод радиоактивных индикаторов

Контроль за полнотой разделения и экстракции — область,
в которой метод с использованием меченых стероидов до сих
пор остается незаменимым. Из многочисленных работ, посвя-
щенных этому вопросу, здесь будет представлено лишь не-
сколько типичных примеров. Фейркло и др. [230] исследовали
разделение стероидов на колонках, заполненных липидексом.
Степень разделения контролировалась по радиоактивности
фракций с помощью жидкостного сцинтилляционного счетчика.
Стероидами, применяемыми в этих исследованиях, были
[ 1 а,2а-3Н] -прогестерон, [4-14С] -тестостерон, [4- 14С] -дегидроэпи-
андростерон, [6,7-3Н]-эстрон и т. п., а радиоактивность коле-
балась в интервале 10—58 Ки/ммоль.

Хороший пример применения радиоизотопов для исследова-
ния метаболизма приведен в статье Матсуи и др. [529].
Авторы изучали продукты обмена тестостерона и 17-сульфата
тестостерона, выделяющиеся с желчью у крысы, с помощью
4-14С- и 7-3Н-производных соответственно. Гидроксилированные
и конъюгированные продукты обмена разделяли методом коло-
ночной хроматографии на сефадексе LH-20 и амберлите XAD-2.
После сольволиза полученных конъюгатов свободные стероиды
разделяли методом ТСХ; продукты обмена определяли при по-
мощи автосканирующего устройства и измеряли активность на
жидкостном сцинтилляционном счетчике после элюирования из
соскобленных пятен. Если стероид, который необходимо опреде-
лить в сложных биологических образцах, имеется в меченой
форме, его нужно добавить к экстракту, чтобы затем обнару-
жить фракцию, содержащую искомый стероид, и количественно
определить его каким-либо аналитическим методом.

При анализе сложных биологических объектов в несколько
стадий экстракции и колоночной или тонкослойной хроматогра-
фии необходимо контролировать полноту выделения на каждой
стадии и для всего разделения в целом как в процессе разра-
ботки методики, так и при серийных определениях. Легче всего
это сделать, добавляя к пробе меченое производное определяе-
мого стероида и прослеживая его путь через все стадии раз-
деления. При помощи поправочного коэффициента, получен-
ного тем же способом, можно учесть потери в процессе отде-
ления и очистки. Например, Лауд и сотр. [490] определили
За,17а,20а-триокси-5р-прегнан-11-он в моче методами газовой
хроматографии и двойного изотопного разбавления. Анали-
тическому измерению предшествовали стадии ферментатив-
ного гидролиза, экстракции эфиром, промывания экстрактов
0,1 М раствором гидроксида натрия и водой, хроматографи-
рования на колонке и две стадии очистки методом бумажной
хроматографии. Предварительно необходимо синтезировать ме-
ченные тритием производные стероидов (восстановлением три-
тированным борогидридом натрия соответствующих 20-кетопро-
изводных с последующим разделением эпимеров методом
колоночной хроматографии). Добавляя это производное в ка-
честве радиоактивного индикатора к пробе до экстракции, мо-
жно установить положение стероида на хроматограммах и вне-
сти поправку на потери в процессе работы.
Метод двойного изотопного разбавления

Это один из наиболее эффективных методов определения
стероидов в биологических объектах. Самое большое достоин-
ство его — высокая специфичность. Однако чувствительность
этого метода гораздо ниже чувствительности вытеснивших его
методов, которые будут обсуждаться ниже. Недостаточно вы-
сокая чувствительность, а также длительность и трудоемкость
операций значительно снижают значение метода двойного изо-
топного разбавления, в связи с чем новые публикации появля-
ются нечасто.

Принцип этого метода заключается в следующем. Если тре-
буется определить стероиды А, Б и В, то к пробе добавляют
меченые А, Б и В (или смесь разделяют на фракции методами
тонкослойной или колоночной хроматографии и добавляют ин-
дивидуальные радиоактивные индикаторы к соответствующим
фракциям). Затем пробу или фракции обрабатывают меченым
реагентом, который вводит в молекулу (молекулы) вторую ра-
диоактивную метку. После хроматографического разделения де-
риватизированных стероидов в соответствующих фракциях под-
считывают радиоактивные сигналы от обоих видов меток и по
соотношению двух радиоактивностей рассчитывают концентра-
цию каждого стероида (при помощи соотношений, полученных
на стандартных образцах).

В исчерпывающем обзоре Фишман [250] рассмотрел при-
менение метода двойного изотопного разбавления для опреде-
ления эстрогенов в моче. В большинстве опубликованных ме-
тодик в качестве радиоактивных индикаторов рекомендуются
тритированные эстрогены, а в качестве реакции дериватиза-
ции — ацетилирование 14С-уксусным ангидридом. Аналогичная
методика предложена для определения За,17а,20а-триокси-
5р-прегнан-11-она в моче [490]. Тритированное производное (см.
выше) добавляют к экстракту и проводят реакцию ацетилирова-
ния во фракции, полученной при разделении на колонке или на
бумаге, с помощью 14С-уксусного ангидрида; раствор после
ацетилирования очищают методом ТСХ. Зону, содержащую
соответствующую фракцию, помечают при помощи красителя,
элюируют стероид и определяют соотношение 3Н/14С на жидко*
стном сцинтилляционном счетчике.

Метод конкурирующего связывания белка

Методы, основанные на конкуренции между мечеными и не-
мечеными молекулами стероида за активные центры белка, бо-
лее чувствительны и менее трудоемки, чем «классические» ра-
диоизотопные методы, и в то же время достаточно специфичны.
Особенно высокими специфичностью и чувствительностью отли-
чаются те методы, в которых связывание белка происходит не
в результате простой адсорбции, а в результате взаимодействия
антитело—антиген. Этим (радиоиммунным) методам обычно
отдается предпочтение перед методами конкурирующего связы-
вания белка во всех случаях, когда удается получить доста-
точно селективную антисыворотку. Поэтому метод конкурирую-
щего связывания белка имеет первостепенное значение в тех
ситуациях, когда неприменимы радиоиммунные методы, т. е.
при анализе витаминов D и их гидроксилированных метаболи-
тов. Вот почему более подробно этот метод обсуждается
в разд. 5.2.10, а здесь приведены лишь отдельные примеры его
использования, которые можно рассматривать как дополни-
тельные методы определения (помимо радиоиммунных).

Хорган и Райли [379] описали метод определения тестосте-
рона в плазме, в котором в качестве источника белка исполь-
зуется сыворотка крови женщин на поздней стадии беремен-
ности. Для контроля за полнотой разделения на колонке с об-
ращенной фазой (целит 545, покрытый 1,2-этандиолом)
использовали тритированный тестостерон, он же служил для
конкуренции с тестостероном пробы плазмы, а также со стан-
дартным тестостероном при построении градуировочной кривой
(зависимость соотношения связанной и свободной радиоактив-
ности от концентрации тестостерона). При pH 7,4 равновесие
устанавливается в течение ночи; свободный и связанный тесто-
стерон разделяли центрифугированием после осаждения ком-
плекса белка сульфатом аммония. Радиоактивность измеряли
в надосадочной жидкости на сцинтилляционном счетчике.

Аналогичную методику предложили Дессиприс и др. [186,
187]. Ее особенностью является то, что для проверки полноты
выделения на стадиях экстракции и хроматографической очи-
стки к раствору добавляли тритированный эпитестостерон; его
поведение в процессе определения, в том числе и при хромато-
графировании на оксиде алюминия, аналогично поведению те-
стостерона, но способность к связыванию белка, используемого
в методе, ничтожна, поэтому он не мешает конкуренции между
тестостероном и тритированным тестостероном.

По методике Юлеша и др. [429], тестостерон в сыворотке
крови определяют после экстракции, двух разделений методом
ТСХ и хроматографирования на флорисиле; в качестве связы-
вающего белка использована сыворотка крови женщин на позд-
ней стадии беременности. Свободный 3Н-тестостерон в отличие
от связанного адсорбируется на флорисиле.
Сравнение метода конкурирующего связывания белка и ра-
диоиммунного метода при определении прогестерона в плазме,
проведенное в работах [62, 820], позволило сделать заключе-
ние, что оба метода одинаково эффективны. Заслуживает упо-
минания работа Батры [62], разделившего свободный и свя-
занный белком тестостерон путем адсорбции первого на рота-
ционном фильтре дискового типа из нитрата целлюлозы и
определения несвязанного меченого тестостерона в фильтрате.
Вайхенберг с сотр. [820] обнаружили, что надежные достоверные
результаты в обоих методах можно получить только в том
случае, если перед измерением активности провести разделе-
ние методом ТСХ.

Аналогичные методики предложены для определения субна-
нограммовых количеств других стероидных гормонов: этинил-
эстрадиола [806], 17-оксипрогестерона [758] и т. п.

Радиоиммунный метод

Радиоиммунный анализ (РИА) тесно связан с методом кон-
курирующего связывания белка и может считаться его вариан-
том. В этом методе определение основано на взаимодействии
стероид—белок, являющемся взаимодействием типа антиген—
антитело, что приводит к значительному улучшению селектив-
ности. Сами стероиды не иммуногенны и способны вырабаты-
вать антисыворотку, содержащую специфические антитела,
только если связаны ковалентной связью с крупной молекулой
белка. Эти антитела способны более или менее избирательно
связывать стероид из комплекса с белком, использованного
для иммунизации животных, в организме которых вырабаты-
вается антисыворотка. Конкуренция между определяемым сте-
роидом и его меченым аналогом и лежит в основе определения.
Теоретические и практические основы этого метода были раз-
работаны более десяти лет назад, но в повседневном клиниче-
ском и биохимическом анализе РИА начал широко применяться
только в последние пять лет благодаря тому, что несколько
предприятий изготовили коммерчески доступные меченые сте-
роиды и антисыворотки, освободив тем самым аналитиков от
очень сложной, длительной и трудоемкой работы по получе-
нию их в лабораторных условиях, которую им приходилось
проделывать в начале развития этого метода.

Важность методов РИА стероидов нашло отражение в том,
что, несмотря на короткий срок, прошедший с начала распрост-
ранения этого метода на химию стероидов, уже опубликованы
монографии, посвященные этому вопросу [122, 324, 418а],
а в общих монографиях имеются специальные главы, как, на-
пример, в книге под редакцией Пастернака [613]. Из несколь-
ких обзорных статей упомянем лишь самую последнюю, на-
писанную Праттом [644], в которой приведено не менее 266
ссылок на статьи, посвященные методам РИА стероидов.

Далее рассмотрим главные особенности метода в последо-
вательности, отвечающей основным стадиям анализа.

а)	Получение антисыворотки, содержащей специфические
антитела. Хотя в настоящее время их в большом ассортименте
изготовляет промышленность, а теоретические аспекты этой
проблемы выходят за рамки данной книги, все же этот вопрос
следует кратко обсудить, поскольку дальнейшее развитие ме-
тода, т. е. повышение его специфичности, тесно связано с этой
стадией [71, 227].

Первый шаг в получении антисыворотки состоит в подго-
товке иммуногенного комплекса стероид—белок, для чего надо
синтезировать производные стероидов, которые подвергаются
ковалентному связыванию с белком. В большинстве случаев
в качестве мостиков используют бифункциональную молекулу.
В случае 3- или 17-оксигрупп обычно получают гемисукцинаты
[483, 713], а 3-, 17- или 20-кетоны превращают в О-карбокси-
метоксимы [57, 67, 151, 167, 168, 335, 338, 414, 687, 689, 716,
769, 813]. Эстрогены с фенольной группой можно перевести
в З-О-карбоксиметиловые эфиры [654] и т. п. Более высокой
избирательности можно добиться, если присоединить мостико-
вую молекулу к углеродному атому скелета, не содержащего
первоначально никакой функциональной группы (О-карбокси-
метоксимы 6- или 7-кетопроизводных 4-ен-З-кетонов или эстро-
генов [37, 182, 263, 335, 654, 858], 11-сукциноилоксипроизвод-
ные тестостерона и прогестерона [67, 335, 493, 538, 704] или
О-карбоксиметиловые эфиры, например в положении 19 [655]).

конъюгат эстрадиол-17-1 емисукцината с БСА
конъюгат тестостерон-З-О-карбоксиметоксима с БСА

Для эстрогенов недавно открыты новые возможности, заклю-
чающиеся в связывании их с белком через 6-сукцинилоксимо-
стик [581в], образовании метиленового мостика при С-2 или
С-4 путем реакции Манниха с формальдегидом [581а, б, 599а],
а также в использовании других реакций, например диазосоче-
тания или нитрования ароматического кольца [581а, б, 599а].

Свободные карбоксильные группы этих производных соче-
тают с аминогруппой белка-носителя [в большинстве случаев
с Е-аминогруппой лизина в бычьем сывороточном альбумине
(БСА)] стандартными методами химии пептидов.

Полученный таким образом комплекс стероид—белок вводят
(вместе с различными адъювантами) в организм подходящих
животных (чаще всего кроликов) для получения антисыво-
ротки, содержащей специфические антитела. Специфичность
какой-либо антисыворотки можно охарактеризовать данными
о перекрестном взаимодействии с родственными соединениями.
Например, если антисыворотка для определения тестостерона
выработана при помощи З-О-карбоксиметоксима, перекрестное
взаимодействие с эпитестостероном составляет 0,3 %, а для 5а-
дигидротестостерона эта величина достигает 65 % [369], однако
если для иммунизации применить бр-карбоксиметиловое про-
изводное тестостерона, то последнюю величину можно понизить
до 0,8 % [781]*.

б)	Получение меченых стероидов. В настоящее время выпу-
скается большое число меченых стероидов, пригодных непо-

* Татеиши и др. [761а] показали, что перекрестное взаимодействие анти-
сыворотки можно уменьшить, если ввести в организм мышей перекрестно
взаимодействующий стероид, связанный с сополимером D-глутаминовой ки-
слоты или D-лизина, чтобы ингибировать образование перекрестно взаимо-
действующих антител перед иммунизацией специфическим стероидом, свя-
занным белком.
средственно для радиоиммунных определений, в основном сте-
роиды, меченные тритием, большое достоинство которых со-
стоит в том, что одно и то же производное можно использо-
вать и для контроля за полнотой отделения стероида, и для
радиоиммунного определения. Кроме того, возможно использо-
вание 1251-меченых производных [122, 207, 335, 414, 439, 500,
590, 704, 813]. Дериватизации играет первостепенную роль
в области анализа сердечных гликозидов, поэтому она будет
рассмотрена в разд. 7.2.8. Достоинства и возможности этой
реакции для РИА прогестерона обсуждаются Алленом и Ред-
шоу [27].

Следует заметить, что один из самых современных методов
в аналитической химии стероидов, иммуноферментный анализ,
тесно связан с радиоиммунным анализом, но только стероиды
мечены ферментами. Однако этот метод будет рассмотрен
в разделе, посвященном ферментным методам (разд. 2.2.14),
поскольку в нем используется радиоактивность.

в)	Подготовка пробы к анализу. Если в анализируемом об-
разце определяется небольшое число стероидов, то растворен-
ную пробу можно исследовать методом РИА без предваритель-
ного разделения, как, например, при определении эстриол-16а-
глюкуронида в моче беременных [495], прогестерона в плазме
кобыл [528] и т. п. Однако гораздо более типична ситуация,
когда пробу нужно по крайней мере депротеинизировать мета-
нолом или этанолом или экстрагировать эфиром или другим
растворителем *.

Наиболее важный вопрос при подготовке проб для РИА со-
стоит в том, нужна ли или не нужна стадия хроматографиро-
вания. На этот вопрос нельзя дать однозначного ответа. В се-
рийном клиническом анализе, где важную роль играют продол-
жительность анализа и возможность автоматизации, стадию
хроматографирования по возможности опускают. Это тесно свя-
зано со специфичностью антисыворотки. Если антисыворотка
достаточно специфична, проблем не возникает, но в присутст-
вии стероидов или других веществ, способных до некоторой
степени к перекрестному взаимодействию, исключить хрома-
тографирование можно только в ущерб специфичности метода.
Поэтому стадия тонкослойной или колоночной хроматографии
часто предшествует РИА (даже во многих недавно опублико-
ванных методиках), но общая тенденция — это разработка ме-
тодов без стадии хроматографирования.

* В некоторых случаях для очистки пробы целесообразно использовать
жидкость-жидкостное распределение; например, при определении тестосте-
рона в плазме предложена система, состоящая из смеси пиклогексана и
20 %-кого водного раствора этанола (2:1) [424].
В сомнительных случаях следует провести и хроматографи-
ческий, и нехроматографический варианты анализа, чтобы про-
верить правильность определения, как это сделали Канлуан и
сотр. [440а] при определении левовращающего норгестрела
в плазме. Ими было показано, что при прямом анализе экст-
рактов петролейным или диэтиловым эфиром результаты на
18 и 37 % выше действительных значений, полученных после
хроматографирования.

г)	Инкубирование анализируемой пробы с антисывороткой
и меченым стероидом в буферной среде. Равновесие между
меченым и немеченым стероидами на поверхности антитела
устанавливается в буферном растворе (pH обычно между 7 и
8,5) при температуре от 4 до 37°С. В последнем случае рав-
новесие достигается через 1 ч, тогда как при 4°С необходим
несколько более длительный инкубационный период. Наиболее
оптимальными являются следующие условия: выдерживание
в течение ночи при 4°С или 1—2 ч при 37°С *. Поскольку кон-
станта устойчивости комплекса стероид—белок зависит от тем-
пературы, то, конечно, и чувствительность метода изменяется
с изменением температуры. Это создает сложные проблемы,
особенно в случае иодированных производных, константы
устойчивости которых для меченого и немеченого стероидов
различаются. Детальное обсуждение этой проблемы можно
найти в статьях Коллинза и др. [163] и Хэммонда и др. [335].

Другой важный момент состоит в том, что при анализе со-
вершенно необходимо пользоваться инертными поверхностями.
На рис. 2.19, взятом из статьи Фенимора и др. [245], пред-
ставлена типичная кривая, полученная при анализе прогесте-
рона (зависимость процента связанного меченого стероида от
количества добавленного стероида) с использованием стеклян-
ной посуды, дезактивированной классическим способом сили-
лирования в жидкой фазе или парами гексаметилдисилазана
в газовой фазе. Характер другой кривой, полученной с исполь-
зованием необработанной посуды, показывает, что измерение
распределения радиоактивности не применимо в аналитических
целях вследствие конкуренции между стеклом и антителом за
меченый и немеченый прогестерон.

д)	Отделение комплекса стероид—антитело от свободного
стероида и измерение радиоактивности. Построение стандарт-
ной кривой зависимости процента меченого стероида, связан-
ного с антителом, от концентрации немеченого стероида и опре-
деление неизвестной концентрации стероида основано на рас-
пределении радиоактивного стероида между антителом и жид-

* Поскольку скорость взаимодействия с белком зависит от вида молекул,
использование неравновесных методов существенно снижает специфичность
определения («первым пришел, первым прореагировал»).
кой фазой. Поэтому перед измерением необходимо разделить
свободный и связанный стероиды.

Чаще всего для разделения в реакционную смесь добавляют
древесный уголь, покрытый декстраном. Он связывает свобод-
ный стероид, который можно удалить из смеси центрифугиро-

[245].

1 — стеклянная посуда, силилированная растворителем; 2 — стеклянная по-
суда, силилированная паровой фазой; 3 — несилилированная посуда.

ванием, а в надосадочной жидкости, содержащей связанный
с антителом стероид, можно измерить радиоактивность на
жидкостном сцинтилляционном счетчике, если меткой служил
тритий, и на счетчике гамма-излучения, если в качестве радио-
активного индикатора был использован стероид, меченный 1251.
Обычно отношение декстрана к древесному углю составляет
1 : 10. Происхождение древесного угля не имеет значения
(было испытано 8 разных сортов [363]). Если покрытый дек-
страном древесный уголь достаточно быстро смешать с раство-
ром при низкой температуре, то ни один из этих факторов су-
щественно не повлияет на равновесие между стероидом, свя-
занным с антителом, и свободным стероидом.

Следует заметить, что иногда для связывания свободного
стероида применяются другие адсорбенты, например амберлит
или флорисил при определении тестостерона в сыворотке [832]
и древесный уголь, покрытый флорисилом, при определении
эстрадиола, прогестерона и тестостерона в плазме [403].
Для разделения свободного и связанного стероидов разра-
ботаны и другие методы; некоторые из них иногда использу-
ются и сейчас, но ни один из этих методов не может сравниться
с методом, основанным на применении древесного угля, по-
крытого декстраном.

Другой принцип положен в основу метода, в котором белки,
в том числе связанные со стероидом, осаждаются неорганиче-
скими солями. В этом случае в надосадочной жидкости, в ко-
торой измеряется радиоактивность, содержатся свободные сте-
роиды. Например, Меткалф [548] определял сульфат дегидро-
эпиандростерона после гидролиза, экстракции выделившегося
дегидроэпиандростерона хлороформом и выпаривания раствори-
теля, стандартным методом РИА, используя имеющуюся в про-
даже антисыворотку и дегидроэпиандростерон, меченый три-
тием. Белок осаждается при добавлении сульфата аммония,
а в надосадочной жидкости измеряют свободный стероид сцин-
тилляционным методом. При определении тестостерона в плазме
[38] и прогестерона [690] для осаждения комплекса сте-
роид—антитело успешно применяли полиэтиленгликоль.

Для осаждения комплекса стероид—антитело есть и другой
прием — метод двойных антител. Например, при определении
тестостерона и 5&-дигидротестостерона использовали кроличьи
антитела. Эти антитела (содержащие связанную с ними фрак-
цию стероидов) осаждали вторым антителом, выделенным из
организма коз, иммунизированных глобулином кроликов [507].

Особого внимания заслуживают твердофазные методы РИА,
поскольку роль их в ближайшем будущем, вероятно, возрастет.
В этих методах антитело связывают полимерами или даже
стенками пробирки, используемой в анализе, и в надосадочной
жидкости можно сразу измерять радиоактивность. В качестве
примера можно упомянуть метод Лейтинена и Адлеркройца
[495], предложенный для определения эстриол-16а-глюкуро-
нида в моче и плазме беременных. В этом методе антисыво-
ротку получали из организма овец, иммунизируя их комплек-
сом эстриол-1 ба-глюкуронид—тироглобулин (полученным ко-
валентным связыванием карбоксильной группы глюкуроновой
кислоты с тироглобулином). Соответствующая фракция полу-
ченной таким способом антисыворотки была иммобилизована
на CNBr-активированной сефарозе. Образовавшуюся суспен-
зию выдерживали до установления равновесия с пробами раз-
бавленной мочи или плазмы, содержащими тритированный сте-
роид, и после центрифугирования в надосадочной жидкости из-
меряли активность несвязанной фракции.

В табл. 2.17 приведены некоторые практические примеры
применения метода РИА для определения половых гормонов
в жидкостях организма.
Таблица 2.17. Определение половых гормонов радиоиммунным методом

Метод разделения связанной и несвязан- ной фракций	К	к к  «	-	S S  X	д	яд  ДО	ОО  д	S	S3  »д	s	S 2  О	СО	со со  СП  Я „	Н	НН  _	5»	со	со со  *=*£’©’	-е- -е-  2 д	£	£	£  4 Ч « *	е1ые4е(е( е1 Е( ц Е( Ч Ц >, >,  El Е[ S от О Е1ППЕ1Е1 Е1ПЕ1Е[Е1Е[ОО
Метка	ю  \ д « s дасдаск ддддддгд  СО	сч	СО	со со СО СО СО	СО	СО	СО	СО	СО	СО	сч	со  СО
Хроматогра- фия	к СО Д Д я со  1 1 1 1 1 1 111 1 1 1 н 1 |я 1  ®	Ч I X  з	е£* р
Объект	К (О д со	со	со	со	’Д  WWW	X	s  f-Ч	f-Ч	f-*	Он  о	О	О со ез со	О	оз Ф  CU	Оч	Л-SSS	CL-	S	п д  о	Cd	о	Д	О Я	00	со	00	СО	О	СО	00	Д £	д	СО	СО  д	д	д	я	д я	со	со	со	я	д	я	со	а®	о	я	я  д о д о до с-Е-с-о до Е-	о 5  О £ О 5 О^ЕСС SoSCCaXSS
Стероид	-	со	S  Д	« х	'	я  °	2 &	и	®	т«  &	0-0	Д	2	Я	х	2  5	и с £	о	§  о	оо	н	s	о	2й	Д  Н	S <Т>	я	о	О	ф  <и	m 3 я	я о я =	g	®  ко	§	о	о 5 ° » »	°	«о	а.	=	о	о.  5 ° S	Я.	§	я « °- ° °	£	« g>	&	о	Я	я  g&g g 5	о Я g g & §	я  § Н и	о	га	«>;яоо	я	н 2 5	я	£	§	о	я  IgE	Si	Е	Ёяй2£	У	Soxg	S	о	*	я	о  g'bo	О	CD	2 (П и О	о 03	О-	£	О  £ ° а	л	сх	д е;О s s	9 Я"	£ д	°	о	<	о с§  СП д С С С	од <&< X Н - СП -
Год	ь-	ь-	00	00	ь.00000000	QOQOQOOOQOb^b-QO  о	о	оз	оз	оз 03 03 03 03	ОЗОЗОЗОЗОЗОЗОЗОЗ  V—I	1	т—1	»—Ч	V—Н	Г—1	V—1	t	»—(	t	т—1	т—1	т—1	т—1	t
о. о  CQ	.о?	.	-	°  zz1 о со		•	d. н s				 h  х а 'О 52^^ >—1.		 ScL^co	,	, о х о-  «я d	.£4 «	6. § Ь “ 4 я  й g 4 s ЕТ ® 44iSr_« я 4	d < S S  § S »	S «	x | S  r—» н-t f-t £Z CJ H	Л l“"’ О r—i W r—< К C u—j	»—* ‘“ъ r— \Q r—i  S £> § oo о S2^’s^°£-=h’7 о-ю s oo . «	5 SJ д 00  ф co о m x	я й а о я о S г:Юн-г Ит о	° £2 нГ  x£2S2°u g 2 о ex	ю ян С Х21Я Ll
Продолжение табл. 2.17

Автор	Год	Стероид	Объект	Хроматогра- фия	Метка	Метод разделения связанной и несвязан- ной фракций
Лидтке и др. [500]	1978	Эстриол	Сыворотка	—	125 J	Полиоксиэтилен- гликоль
Фотерби и др. [260]  Абриу и др. [326]	1979	Норэтистерон	Плазма	—	3Н	ДДУ
	1978	5а-Андростан-За, 17£ - и Зр,17р-диолы	Сыворотка	Сефадекс LH-20	Зн	ДДУ
Боарер и Хаттер- сли [87]	1978	Прогестерон, эстрадиол	Плазма	—	Зн	Диск из древес- ного угля и агар-
Вииникка [813]	1978	13-Этил-11-метилен-18, 19-динор-17а-прегн-4-ен- 20-ин-17-ол	Сыворотка	Липидекс 5000	125 J	al apa  ДДУ
Лангер и др. [493]	1978	Прогестерон	Плазма	—	Зн	ДДУ
Яноскова и др. [414]	1978	Тестостерон	Сыворотка	—	125]	Метод двойных антител
Дворак и др. [207]  Керр и др. [452]	1978	Тестостерон	Плазма	—	3Н, ,231	ДДУ
	1977	Эстриол-1 ба-глюкуро- нид	Плазма	—	3Н	ДДУ
Фингерова [247]	1978	Эстриол-1 ба-глюкуро- нид	Моча	—	Зн	ДДУ
Карлстром и Сколдефорс [130]	1977	Эстрон	Сыворотка	—	Зн	ДДУ
Фрейман и др.	1977	Эстрадиол	Плазма	—	Зн	ДДУ
Ден и др. [182]	1977	Эстетрол	Плазма	Сефадекс LH-20	Зн	ДДУ
Сато и Осава [687] Корпешо и ‘др. [168]	1977	Этиохоланолон	Сыворотка	Сефадекс LH-20	Зн	ДДУ
	1977	Тестостерон и три его продукта восстановления	Плазма	ТСХ	3Н	ДДУ
Лейтинен и Ад- леркройц [495]	1977	Эстриол-16-глюкуронид	Моча, плазма	—	Зн	Иммобилизован- ные антитела

Автор	Год	Стероид	Объект	Хроматография	Метка	Метод разделения связанной и несвязан- ной фракций
Матьё и др. [528]	1977	Прогестерон	Плазма	—	Зн	ДДУ
Пирк [638]	1977	Андрост-5-ен-Зр, 17р-диол	Плазма	ТСХ	Зн	ДДУ
Хопкинсон и др. [378]	1977	5а-Андростан-Зр, 17р-диол	Плазма	Сефадекс LH-20	Зн	ДДУ
Танемори и др. [759]  Шелдон и Коп- пенгер [712]	1977	20р-Оксипрегн-4-ен-3-он	Сыворотка	Сефадекс LH-20	Зн	Сульфат аммония
	1977	Тестостерон	Сыворотка	—	Зн	ДДУ
Паркер и др. [612]	1977	Андрост-4-ен-3,17-дион	Сыворотка	Оксид алюминия	Зн	ДДУ
Пу и др. [647]	1978	Конъюгаты тестостерона и дигидротестостерона	Сыворотка	ТСХ	Зн	ДДУ
Иттрих [403а]	1978	Эстрадиол, тестостерон, прогестерон	Плазма	—	Зн	Древесный уголь на силикагеле или флорисиле
Джавад и др. [416]	1979	Эстриол	Моча	—	125 J	Метод двойных антител
Тресгер и Тамм [707]  Нумазава и др. [599а]	1979	Глюкуронид тестосте-	Моча, плазма	—	Зн	Оксиапатит
	1979	рона  Эстриол-16- и 17-глюку- ронид	Плазма	—	Зн	Иммобилизован- ные антитела
Намбара и др. [581в]	1980	Сульфат эстрона	—	—	Зн	Сульфат аммо- ния
Канлуан и др. [440а]	1981	Лево-норгестрел	Плазма	Целит	Зн	ДДУ

ДДУ—декстран, нанесенный на древесный уголь.
Помимо хроматографических разделений, проводимых в не-
которых случаях для улучшения избирательности метода, с той
же целью иногда проводят химические реакции. Например,
Хэмпл и сотр. [337, 338] определяли анаболические стероиды
в плазме или моче, обрабатывая экстракт смесью уксусного
ангидрида с пиридином для переведения тестостерона и дигид-
ротестостерона в 17-ацетильные производные, что исключает их
перекрестное взаимодействие с используемой антисывороткой.
Чаще конъюгаты переводят в исходные стероиды до РИА. По-
скольку для прямого определения глюкуронидов [452, 495, 844]
существуют достаточно специфичные антисыворотки, выраба-
тываемые в организме иммунизированных животных против
комплекса конъюгат—белок, то сульфаты обычно анализируют
так же, как свободные стероиды, после их сольволиза [43, 151,
548, 647, 713]. Если пробу проэкстрагировать до и после реак-
ции, то свободный и конъюгированный стероиды можно опре-
делить одновременно. Если для определения глюкуронида нет
специфической антисыворотки, то можно применить описан-
ный выше принцип (ферментативный анализ с использованием
глюкуронидазы), как это, например, было сделано Деном и
сотр. [182] при радиоиммунном определении свободного и свя-
занного эстетрола в плазме или Карлстромом и сотр. [130]
при определении общего содержания эстрона в сыворотке крови
человека. Стоит упомянуть, что различная растворимость сво-
бодных стероидов и их сульфатов, а также способность послед-
них к сольволизу используются для последующего разделения
нейтральной фракции путем обработки ее смесью хлорсульфо-
новой кислоты с пиридином; образующиеся сульфаты отделя-
ются от оксистероидов [483].

Чувствительность РИА стероидов зависит от многих фак-
торов (сродства антитела к определяемому стероиду, неспе-
цифического связывания, создающего фон, температуры инку-
бационного периода, природы и специфичности радиоактивной
метки). Рассмотрение теоретических аспектов этих проблем
вышло бы далеко за рамки настоящей книги. Что касается
практического аспекта, то можно утверждать, что в большин-
стве достаточно хороших аналитических методов для определе-
ния требуется лишь несколько десятых миллилитра пробы или
даже меньше. Открываемый минимум при таком объеме со-
ставляет от 1 до 50 пг, а градуировочный график обычно ли-
неен в области 10—1000 пг.

Воспроизводимость радиоиммунных методов обычно удовлет-
воряет требованиям серийного клинического анализа: относи-
тельное стандартное отклонение составляет от 5 до 15 %. Что
касается правильности, то во многих цитируемых здесь статьях
сообщается о хорошем совпадении результатов РИА и других
методов (главным образом методов конкурирующего связыва-
ния белка, двойного изотопного разбавления, флуориметрии и
газовой хроматографии). Эти вопросы подробно разбираются
Холлом [334] и Чеканом [142].

При публикации современных методик стало общепринятым
приводить результаты обработки данных с помощью вычисли-
тельной техники. Автоматизация всей методики, включающей
длительный инкубационный период и центрифугирование, не
простая задача, чем объясняется очень ограниченное число
сведений, имеющихся в литературе по этому вопросу. Хэммонд,
Вико и др. [335, 812] приспособили клинический автоматиче-
ский анализатор системы «Олли 3000» для автоматизации опе-
рации добавления антисыворотки, индикатора и древесного
угля, обработанного декстраном, после инкубационного периода
и для отбора соответствующей аликвотной части из надосадоч-
ной жидкости для измерения радиоактивности. Система позво-
ляет подготовить для измерения 96 проб за 3 ч.

2.2.14.	ФЕРМЕНТАТИВНЫЕ МЕТОДЫ

Ферментативные реакции широко используются в анализе
половых гормонов. Значительная часть сложных аналитических
методов определения их в биологических объектах включает по
крайней мере одну стадию с участием ферментов—фермента-
тивный гидролиз конъюгатов под действием полученных из
сока улитки Helix pomatia или чистых p-глюкуронидазы и арил-
сульфатазы. Более подробно эти вопросы обсуждаются
в разд. 2.3.3. Помимо этих общеупотребительных реакций, цель
которых подготовить пробу для определения свободных сте-
роидов, известно большое число методов, в которых в резуль-
тате ферментативной реакции получаются хромофоры или флу-
орофоры, служащие для конечного аналитического измерения.

Колориметрические
и флуориметрические методы

Почти все методы, включающие колориметрические или
флуориметрические измерения, основаны на ферментативных
реакциях с участием стероидов, содержащих окси- или кето-
группы,— ферментативном окислении оксигрупп или восстанов-
лении кетогрупп. Хотя эти методы обладают более высокой
избирательностью, чем классические колориметрические и флу-
ориметрические методы, они не играют такой же важной роли
в анализе половых гормонов, как при определении холестерина
и желчных кислот. Поэтому более подробно реакции, включен-
ные в эту книгу, обсуждаются в разд. 4.2.9 и 6.2.7.

Ю Заказ № 182
В табл. 2.18 приведены некоторые из этих методов (допол-
ненные методами газовой хроматографии и методами, сочетаю-
щими бумажную хроматографию и радиоанализ).

Из методов, приведенных в табл. 2.18, особого внимания
заслуживают методы [14, 344, 591], основанные на циклической
ферментной системе [616]. В этих методах ферментативная
окислительно-восстановительная реакция сочетается с другой

Глюконолактон-6 -
фосфат

Глюкоза-6-фосфат

(КГ3 М)

Глюкоза-6-фосфат-дегидрогеназа

Эстрадиол-дегидрогеназа (эстрон-эстрадиол - трансгидрогенава)

Рис. 2.20. Схема реакций циклической ферментной системы при определении
эстрона и эстрадиола в моче и плазме [591].

ферментативной окислительно-восстановительной реакцией, об-
разуя циклическую ферментную систему, так что концентрация
хромофора или флуорофора зависит не только от концентрации
определяемого стероида, но и от времени реакции. При опти-
мальных экспериментальных условиях можно добиться значи-
тельного выигрыша в чувствительности (более чем в 104 раз) и
определять пикограммовые количества. Чувствительность фер-
ментативных реакций в этом методе сравнима с чувствитель-
ностью радиоиммунных методов анализа. На рис. 2.20, заим-
ствованном из статьи Николаса и сотр. [591], представлена ци-
клическая ферментная система, используемая для определения
суммарного содержания эстрона и эстрадиола в плазме и моче.

Если нужно определить только эстрадиол, можно восполь-
зоваться той же реакцией, но блокировать эстрон реакцией
с гидразином.

Новым интересным приемом в области ферментативного
анализа стероидов является сочетание этого метода с тонко-
слойной хроматографией, предложенное Ямагучи и др. [853а—
853в]. Ферментативную реакцию проводили на пластинке, а для
количественного определения использовали денситометрическое
сканирование. Таким путем были определены За-оксистероиды;
опрыскивание проводилось реагентом, содержащим За-оксисте-
Таблица 2.18. Некоторые ферментативные методы определения половых гормонов

Метод определения	_	Л	Л	, О	К	S  6ч	§«	§«	5.	е  (-> 00	е) К К	г> Я К	Г)	К	Л К Я	К  2 « я	кУ^яУ^нЗГ	2 о S к  с о о.	2У	22я^	й	S 2 2	”,  м	(J	Н	о	О	Р	2 Я Н	Г?  ° о	с	Я О	ко	S я	н	я к о	Е  §1	§	§53	§53	я§5	§	«§5	I  И	1	Св	Св	|||	J	Св	t  §Л	§.3	а-g®	“|5	S	si®	&s  о	О®	О Я	О	® S	Е	й	О	Я	3	К Я  К Q	У	erf	*5	СЗ	м S	О	с!	К1	Я  So	t? Д Л	к	д Он	к 5 Ь	Я	Q	д	Он	2 о  ок	о X	5 п	5	S а)	>>к sd	к	2	S	н	X  х S xS eS-& в°«&	ин	ио
Реакция	,	1	6	,	,  CD	CD	'	Я	CD	CD  К	*&>	03	1	1	Я	EJ	Д ЕЦ.  1 ®Я	Н	р	О Я-1	о	И  о	“г 3	о	_	н	н н	t(	о	0 2;  *	§§	Sip	SSss	х	йх  ¥	s^s	2& а 4 Я °	55 S$  9	CSS оХ	до	яоя	со.	9 g-  со	Я S <	2^¥	00	Я?	00 О  <d	я о п о 2	д о	к 2 2	Т	о  я	К	д	£	К	Я.	О ®	О С	Я	Я tf	Я	£  я	о	к	S	я	й	Ко	Ко-	Я	К2>	я	И  <D	К	S	У	CD	О	Л	*Т<	сЗ *Т<	о ,.  3	S?«	3S	нв£	ge®	3	5®	3  2 к	s Т	о	2	о	У с м.	у к S	2 я	2	2	к  ® §	<	§	2.	5	в	о	£<	о£<£	| §	| S	|§  О °	4	к	к	О	о	CQ	н X	со О X н	Он	Ок	Он
Фермент	2	2 s	<=<8	«Й, g S	5  S	S *6	S	н га	Ч	Я	о	5  о	о л	2	п я	2	о	2	2  Q.	Q-, Я	Я. Я	1 У	К 2й	Он	5- Я	S Я  ф	О К	^Х 00	»ТИ И	{-н О	(1)	5 М	У 00  и	Н 4-	я К	Чн О	§ <	н	к Л	СЗ  rj	О'	о- я	О&	s я	о	Р4 я	2 «  р СЗ	, ССЗ C3J н О	1 1=Х	,О	,	Но  мни	ни СО	СО о Н	СО. К	СО. К	!Т*	я	О о	Н и  Ил	СЗ СЗ	О	ОН	ь» О	•±* СО (Т) о	<$О  О ‘Ч О < 1д &	СЧ2	Я	О я . Он	Ок  । К	' к к со. tX	.Г •Ч	-СО. оо	। t=( СО. £(	' tx  со. о со. о о ь- к	8 i=X	со-о ccs	со. к ь- к	8 к  00 К	00 К К ’-н U	оок	оо СМ н	ООО —'О	со С.
Стероид	.	'	.  - о	2	но	2  я ex	&	он	я  О &	S	Я	°	!	*=Х  Я«к	я	О	-	у	6	я	5  У 5	S	я<2	о	Он	F	2  н о	я	t=t	я	2	ст*	н	к  ЛК®	4	яООи	§	О	о.  2 S <^>	о	з	си	я	®	сп	н  &о ок	У	-	<!	я  Jj. О.	К Р1 к	X	Н	К	нгч	я	S  Я & § 2 я	я	й О	о	Хдо	Я  Ssa£a.	£•	feg	&•	°® £•	&  я fe н Л"	«	io-	S §	«ago	£  CD < q EJ q CD	<! c	CDon	оо о CD	К
Год	CO	CO	Tf	ООО	ю	оо	О	!>  b-	b-	bw	r^QO	b-	r>	b-	b-  O>	O>	O>	03 03	Оз	03	03	03  г—Ц	l-M	гч	г—Ч i-M	I-ч	r4	w-H	’I“M
Автор	VO1	Он	Я  <£>	^X	co1	Э  Oh	я	00	.	Я  Си	о.	tx	я -	_	Он	я  <	«	„	я2®	-  SS	«я1-'У	О.Я	я  к	о к	S	^Х  я	я	о	О. о	Л?	«2	S  я	к	к	к к	'В	я	я	к  и 				и ,			к 1—1	ОК	Я 				н	О (_,	н ,		  Я см	я со	Он^	Он	ЛЮ	Я	К -4	Я ,-н  S Ю	S Ю	СЗ "t1	X СЗ	003	S	Но>	S ю  1Х22л	Х£2. СХ	XJ£1	О	Е12,	1X21
роид—оксидазу, диафоразу, НАД и хлорид 2-п-иодфенил-З-п-
нитрофенил-5-фенилтетразолия. Образующийся из последнего
соединения формазан сканировали денситометрически при
500 нм [8536, 853в]. Аналогично определяли 30-оксистероиды
при помощи 30-оксистероид—оксидазы; колориметрическим ре-
агентом служила смесь 4-аминоантипирин—фенол (см. с. 307)
[853а].

Радиоферментные методы

Ниже кратко обсуждаются два характерных примера фер-
ментативных методов с использованием радиоизотопов.

Пол и Аксельрод [617] определяли катехолэстрогены
(2-оксиэстрон и 2-оксиэстрадиол) в тканях. Экстракты подвер-
гали ферментативному О-метилированию; ферментом служила
катехол-О-метилтрансфераза, а донором меченого метила 3H-S-
аденозилметионин. Образующееся монометильное производное
можно выделить из смеси методом тонкослойной хроматогра-
фии и после извлечения из зоны количественно измерить на
сцинтилляционном счетчике. Ферментативная реакция чрезвы-
чайно селективна, что позволяет проводить определение даже
в присутствии родственных веществ, например эстрона и эстра-
диола.

Де Греве и сотр. [178] гидроксилировали 16-тритированный
прогестерон или прегненолон по С-16, отгоняли 16а-гидрокси-
лазу из инкубационной смеси и измеряли активность ШяО на
жидкостном сцинтилляционном счетчике, определяя таким об-
разом и активность 16а-гидроксилазы.

Иммуноферментный анализ

Иммуноферментный метод анализа является одной из раз-
новидностей метода конкурирующего связывания белка и тесно
связан с радиоиммунным анализом. Он рассматривается здесь,
а не в разд. 2.2.13, потому что в нем не используются радио-
изотопы (в этом его главное достоинство), а определение осно-
вано на ферментативной реакции.

Основное отличие этого метода от РИА состоит в том, что
для выработки антисыворотки получают комплекс стероид—
белок, связанный ковалентной связью, и конкуренция за актив-
ные центры антител происходит между комплексом , белок—
определяемый стероид и комплексом фермент—стероид; в ре-
зультате при изменении концентрации стероида меняется актив-
ность фермента, что можно количественно измерить при по-
мощи какой-либо подходящей ферментативной реакции.
Применению этого метода в аналитической химии стероидов
посвящено множество публикаций, например для определения
эстрадиола [4, 599], эстриола [472, 561, 609], общего содержа-
ния эстрогенов [93, 338а], тестостерона [93, 3836, 651—653,
761, 857] и прогестерона [425—427] в плазме и сыворотке.
Чаще всего рекомендуется пероксидаза хрена [93, 425—427,
599, 651, 652, 653, 857], но описано также применение fJ-D-ra-
лактозидазы [4, 3836], глюкоамилазы [761] и щелочной фосфа-
тазы [561]. Для связывания стероидов с ферментами исполь-
зуются те же реакции, что и для образования комплексов бе-
лок—стероид в радиоиммунном анализе, т. е. сочетание по-
средством О-карбоксиметоксима 6-кетопроизводных эстрогенов
и такого же производного Д4-3-кетостероидов по С-3, или соеди-
нение через гемисукцинат (в качестве мостика) с 11а-оксипро-
изводным последних стероидов. Конъюгаты обычно очищают
диализом и хроматографированием на сефадексе G-25.

Эти комплексы служат иммуногенами при выработке анти-
сыворотки в организме животных. Большинство методов, ис-
пользуемых в анализе стероидных гормонов, связано с образо-
ванием гетерогенных систем *, т. е. ферментативную активность
определяют после отделения комплекса стероид—фермент (ос-
тающегося в растворе) от комплекса стероид—фермент—анти-
тело. В большинстве случаев антитела иммобилизуют, связывая
их ковалентной связью с CNBr-активированной сефарозой [4,
425—427, 857], целлюлозой [425—427, 651, 652, 663] или частич-
ками и-акриламинового стекла [599], которые затем отделяют
центрифугированием и измеряют активность фермента в надоса-
дочной жидкости или осадке. Джойс и сотр. [427] установили,
что гораздо большей чувствительности можно добиться, исполь-
зуя микрокристаллическую целлюлозу, а не сефарозу. Еще одним
приемом иммобилизации является связывание антител стенками
полистирольной пробирки [93]. Возможны и другие варианты,
основанные на отделении комплекса антиген—антитело мето-
дом двойных антител [561, 761] или на использовании полиэти-
ленгликоля [609].

В методе конкурирующего связывания белка можно исполь-
зовать тот же комплекс фермент—стероид, что и при выра-
ботке антисыворотки (гомологичные системы), или другой ком-
плекс (гетерологичные системы). Преимущество первых — бо-
лее высокая избирательность, тогда как вторые обеспечивают
лучшую чувствительность [93].

После разделения фаз измеряют активность фермента, ко-
торая пропорциональна концентрации стероида; при этом

* Методы ELISA (ферментный иммуносорбентный анализ со связанным
ферментом).
широкое применение нашли спектрофотометрические и флуори-
метрические методы. В методах с использованием пероксидазы
различные органические восстановители подвергают фермента-
тивному окислению пероксидом водорода с образованием хро-
мофоров или флуорофоров, концентрация которых пропорцио-
нальна концентрации фермента (катализатора). Такими систе-
мами являются 5-аминосалициловая кислота и пероксид
водорода (спектрофотометрирование при 490 нм) [651—653],
о-фенилендиамин и пероксид водорода (492 нм) [93, 425—427]
и 4-окси-З-метоксифенилуксусная кислота и пероксид водорода
(флуориметрический контроль при 420 нм, возбуждение при
390 нм) [599]. При использовании p-D-галактозидазы измеряют
поглощение о-нитрофенола, образующегося при ферментатив-
ной реакции из о-нитрофенил-р-Э-галактозида, при 405 нм
в щелочной среде [4, 3836]. Реакции с использованием глюко-
амилазы можно контролировать флуориметрически по глюкозе,
образующейся из амилозы А [761]. На поглощении при 500 нм
хинониминового красителя, образующегося из 4-аминоантипи-
рина, пероксида водорода и фенола в присутствии пероксидазы
(фенол получается из фенилфосфата при действии щелочной
фосфатазы), основаны методы определения последней [561].

В качестве примера широко используемых гетерогенных ме-
тодов на рис. 2.21 приведена схема методов определения про-
гестерона в плазме, разработанного Джойсом и сотр. [426].

Кроме рассмотренных до сих пор гетерогенных систем Йорде
и сотр. [857] предложили системы другого типа с использова-
нием комплекса антитело—фермент и иммобилизованного анти-
гена. Тестостерон 3-о-карбоксиметоксим связывается с CNBr-
активированной сефарозой через желатиновый мостик. Связы-
вание антитела с этим иммобилизованным антигеном конку-
рентно ингибируется определяемым тестостероном. Комплекс
связанного антигена с антителом метят с помощью пероксидазы
на двух последующих стадиях. Определение основано на изме-
рении активности связанной пероксидазы (о-дианизидин и пе-
роксид водорода, 400 нм), которая обратно пропорциональна
концентрации тестостерона в пробе.

Коэн и сотр. [471, 472] предложили гомогенный метод опре-
деления эстриола, основанный на циклической ферментной си-
стеме; эстриол участвует в образовании соединения, в котором
он посредством 6-карбоксиметоксима ковалентно связан с нико-
тинамид-6- (2-аминоэтиламино) пуриндинуклеотидом (эстриол—
АЭНАД):

1.	Эстриол—АЭНАД + этанол «лкогольдегидрогеназа^
(2.22)
—>эстриол—АЭНАДН + Н+ + уксусный альдегид

2.	Эстриол—АЭНАДН + оксалилацетат малатде£-д£2Г.-.—

—>эстриол—АЭНАД + малат
Рис. 2.21. Схема определения прогестерона в плазме методом иммунофер-
ментного анализа по Джойсу и др. [426].

После проведенного цикла количество малата измеряют пу-
тем флуориметрирования НАДФН, образующейся в следующей
индикаторной реакции:

малат+НАДФ+ малилФеРмент ? пируват+СО2+НАДФН+Н+ (2.23)

Образование малата специфически ингибируется антисыво-
роткой к эстриолу, а это ингибирующее действие подавляется
определяемым эстриолом в конкурирующей реакции за антисы-
воротку между эстриол—АЭНАД и свободным эстриолом. Боль-
шим достоинством этого и аналогичных гомогенных методов яв-
ляется исключение операции разделения фаз.

Если сравнивать иммуноферментный метод анализа стероид-
ных гормонов и метод РИА, то можно сказать, что как по спе-
цифичности, так и по чувствительности в оптимальных вариан-
тах (порядка 10 пг в одной пробирке) оба метода равноценны.
Хотя продолжительность анализа этим методом несколько
больше, его роль в ближайшем будущем несомненно возрастет,
особенно в лабораториях, где недоступно сравнительно дорогое
оборудование, необходимое для РИА [805].

2.2.15.	МАСС-СПЕКТРОМЕТРИЯ И РОДСТВЕННЫЕ МЕТОДЫ

Общие вопросы

Масс-спектрометрия — один из важнейших методов иденти-
фикации стероидов и установления их структуры. Даже поверх-
ностный обзор огромного материала по фрагментированию сте-
роидов и взаимосвязи спектров и структуры вышел бы далеко
за рамки этой книги, поэтому здесь будут указаны лишь наи-
более важные работы, посвященные этому вопросу [105, 112—
114, 795, 863].

Особенно эффективна масс-спектрометрия в сочетании с га-
зовой хроматографией (хромато-масс-спектрометрия, ХМС), по-
скольку высокая разрешающая способность газовой хромато-
графии (особенно капиллярной газовой хроматографии) и вы-
сокая селективность масс-спектрометрии создают уникальные
возможности для качественного и количественного анализа
сложных биологических объектов. Очень часто (помимо обыч-
ного количественного анализа при помощи ПИД и ДЭЗ) газо-
вые хроматограммы сканируют по общему ионному току,
причем масс-спектрометр служит очень чувствительным газо-
хроматографическим детектором. Скоростные сканирующие уст-
ройства в современных масс-спектрометрах позволяют одновре-
менно регистрировать масс-спектры индивидуальных пиков.
Примерами тому могут служить многие практические приложе-
ния газовой хроматографии, описанные в разд. 2.2.11.

В большинстве случаев стероиды в биологических объектах
перед газохроматографическим анализом дериватизируют,
даже если газовый хроматограф объединен с масс-спектромет-
ром; так же поступают и при прямом масс-спектрометрическом
анализе. Как уже указывалось в разд. 2.2.11, чаще всего для
дериватизации используют реакции триметилсилилирования,
ацетилирования или гептафторбутирилирования оксигрупп
и образования метоксимов кетогрупп. Фрагментационные ха-
рактеристики этих производных тщательно изучены [605, 795].

Приемы дериватизации в масс-спектрометрии и ХМС не-
сколько отличаются от методов дериватизации в газовой хрома-
тографии, где целями ее являются повышение летучести и тер-
мической устойчивости, улучшение разделения и возможность
использования специфических и чувствительных детекторов.
100-1

117

80-

60-

40-

20-

'|X Ч*1“г+

50

100

150	200

100-1

75

80-

60-

^40-
£

В

777

103

159

145

20-

100	150	200

50

100-1

101

х 80-

g 60-

§40-
£ -
°20-

129

185

243

50

100

150	200

100-1

80-

101

171

60-

40-

20-

129

С".

—Si —сн3

СН5

М-15	М

449	Ц61

250	300	350	400

СНз СН3

—Si — С—СН,

I I 3

СН3

Г 38.0

-30,4

-22,8

-15,2

-7,62

4 50	500	550

М-57
491

600

г-12,0

-9,62

-7,21

5

283

359

250	300	350	400	450

500	550

283

-4,81

-2,40

600



CD

О

сн5
с-сн3
сн3.

М-57
543

г-9,45

-7,56

-567

-3,78

385

-1,89

250	300	350	400	450

500	550

600

&

QJ

283

/СНх
с-СН

хсн3-

М-43

529

р993

-7,95

-5,96

-3,97



385

-1,99

50	100	150	200	250	300	350	400	450	500	550 600

т/е

Рис. 2.22. Масс-спектры бис (триалкилсилиловых) эфиров 5р-прегнан-За,20а-
диола [649].
Увеличение летучести имеет огромное значение и в рассмат-
риваемом методе. Вспомним, например, что в персилилирован-
ной форме можно исследовать такие полярные производные,
как глюкурониды эстрадиола [743] и тестостерона [420] (по-
следние распадаются на фрагменты путем химической иониза-
ции при действии паров пиридина). Заслуживает внимания но-
вая точка зрения, согласно которой получение производных
с большой молекулярной массой невыгодно, особенно если ис-
пользуется масс-спектрометр с узким интервалом масс. Произ-
водные, дающие богатые линиями спектры, используются для
установления структуры исходных стероидов, но для целей ко-
личественного анализа более пригодны производные, дающие
молекулярные ионы с высокой интенсивностью сигнала, или
близкие к ним фрагменты, как это будет показано ниже. На-
пример, как уже упоминалось (на с. 100), если одну из метиль-
ных групп в триметилсилилированных производных заменить
трет-бутильной или изопропильной группой, фрагментация про-
ходит гораздо менее интенсивно и получаются богатые линиями
ионы (М-трет-Ви) + или (М-изо-Рг)+ [86, 247а, 272а, 449, 564а,
635, 635а, 648, 649, 706]. Это иллюстрируется рис. 2.22, взятым
из статьи Куильяма и Вестмора [649]. Следует заметить, что
многообещающие свойства этих новых производных еще не на-
шли применения в количественном анализе: в примерах из
табл. 2.9 силилирование проведено при помощи триметилси-
лильной группы.

Специальные проблемы дериватизации стероидов для ХМС
рассмотрены в обзоре Брукса и др. [102а].

Масс-фрагментография [10а, 16а]

Масс-спектрометрия может быть использована непосред-
ственно для количественного анализа. Снедден и Паркер [740]
описали определение эстрона, эстрадиола, эстриола и прогесте-
рона в тканях яичников человека путем введения высушенных
тканей непосредственно в масс-спектрометр и измерения пиков
их молекулярных ионов при разрешении 10 000. Градуировоч-
ный график (нижняя граница 1 нг) можно построить, вводя
пробы плазмы мужчины с известным содержанием перечислен-
ных выше женских гормонов.

Однако в большинстве случаев количественное масс-спектро-
метрическое определение стероидных гормонов в биологических
объектах проводят методом масс-фрагментографии (табл. 2.19).

Биологические объекты в этом специальном варианте метода
ХМС обрабатываются так же, как и в других количественных
методах (проводят стадии гидролиза, экстракции и хромато-
графической очистки). Перед введением полученного раствора
в газовый хроматограф стероиды обычно дериватизируют. Для
анализа используют не газовую хроматограмму (общий ионный
ток), а характерный и достаточно интенсивный пик иона в масс-
спектре анализируемого производного. Обычно это пик молеку-
лярного иона. Если анализ газовой хроматограммы основан на
этом единственном ионе, то в качестве внутреннего стандарта
для количественного определения можно использовать только
соединения с таким же отношением т/е. Ими могут быть эпи-
меры [537, 556] или другие изомеры [181] определяемых соеди-
нений при условии, что они хорошо разделяются на газохрома-
тографической колонке.

При использовании приборов с многоканальным ионным де-
тектором (МИД), позволяющим одновременно регистрировать
по крайней мере два пика, открываются гораздо более широкие
возможности для выбора внутренних стандартов. Это обычно
дейтерированные (иногда тритированные*) или ^-производ-
ные определяемых стероидов, так что отношение т/е для них
на 2—8 единиц больше, чем у природных стероидов. В этом
случае хроматографические пики определяемых стероидов и ме-
ченных изотопом внутренних стандартов разделяются плохо или
не разделяются совсем, но избирательность здесь обеспечи-
вается благодаря раздельной регистрации пиков. Иллюстра-
цией этому служит рис. 2.23, на котором приведены спектры
гептафторбутирильного производного прогестерона, [4-14С]-проге-
стерона и очищенного экстракта сыворотки с добавленным
внутренним стандартом, полученные Бъёркемом и сотр. [82] при
помощи МИД.

Концентрацию прогестерона в пробе рассчитывают по отно-
шению высот пиков на развертке при т/е, равном 510 и 512,
при помощи стандартной кривой. На рис. 2.24, заимствованном
из той же статьи, можно видеть стандартную кривую. Неболь-
шой фон на кривой 1 вызван вкладом меченого прогестерона
при регистрации спектра при т/е = 510, а отклонение от ли-
нейности объясняется вкладом немеченого прогестерона
в спектр, записанный при т/е = 512. Кривая 2 представляет со-
бой скорректированный градуировочный график.

Введение метки 14С и гептафторбутирилирование (в случае
кортикостероидов образование МО-ТМС-производных) было
также использовано Сикманом [721] в масс-фрагментографиче-
ском анализе различных стероидных гормонов.

Избирательность методов с МИД можно повысить, исполь-
зуя в качестве внутреннего стандарта изотоп (Бъёркем вводил
[4-14С] -прогестерон, содержащий 5% немеченого прогестерона),

* Недавно Шультен и др. [697а] предложили определять тритий в ме-
ченых стероидах методом полевой десорбционной масс-спектрометрии.
Таблица 2.19. Масс-фрагментографические методы определения половых
гормонов в биологических объектах

Автор	Год	Определяемое соединение	Объект	
Адлеркройц и др. [15, 18, 19, 22]	1973—1976	11 эстрогенов	Желчные кислоты, моча, плазма, фе- калии	
Адлеркройц и др. [20]	1974	Эстриол	Плазма	
Уилсон и др. [834]	1977	Эстрадиол	Плазма	
Миязаки и др. [562]	1977	Эстрон, эстрадиол, эстриол	Стандарты	
Сикман и др. [742]	1978	Эстрадиол	Сыворотка крови	
Бъёркем и др. [83]	1975	Эстриол	Моча	
Кнаппен и др. [469]	1979	Эстрадиол	Плазма	
Заменчик и др. [862]	1978	Эстрадиол	Сыворотка	
Сикман и др. [723]	1978	Этинилэстр адиол	Плазма	
Штурм и Штёлер [746]	1976	8 стероидов	Яичники	
Бъёркем и др. [82]	1975	Прогестерон	Сыворотка крови	
Винклер и др. [835]	1977	Прогестерон	Ткани	
Деннин и др. [181]	1974	Прогестерон, тестостерон	Плазма	
Адлеркройц, Мартин и др. [12, 526]	1973  1977	Ацетат мегестрола	Плазма	
Кук [165]	1974	Норэтистерон	Плазма	
Вестергаард и др. [811]	1975	Тестостерон	Плазма	
Баба и др. [49, 49а, 7136]	1979  1980	Тестостерон	Плазма, моча	
Бъёркем и др. [84]	1975	Тестостерон	Сыворотка крови	
Сикман и др. [722]	1976	Тестостерон, 5а- дигидротестосте-	Плазма	
Миллингтон и др. [556]	1975	С19-стероиды	Ткани	
Мэйнард и др. [537]	1977	Дегидроэпиандро- стерон, 5-андро- стен-3,17-диол	Ткани	
Гаскелл и др. [272а]	1980	Тестостерон, де- гидроэпиандро-	Слюна	
Филлипоу и Фриц [635а]	1980	L1CpUn  Ацетат медрокси- прогестерона	Плазма	
	Производное	Неподвижная фаза для ГЖХ	Внутренний стандарт (ВС)	Обнаруженные ионы (в среднем), mje
	тмс	QF-1, SE-30	[2Нэ]-ТМС-производные	342 (М) эстрон  351 (М) ВС и т. д.
	3,16,17-ТМС	QF-1	[2Н27]-ТМС-эстриол	504 (М)
	3,17-ТМС	OV-17	Дегидроэквиленин, [2,4-2Н2]-эстрадиол	416 (М); 412 (М) ВС, 418 (М)/ВС
	50—50%  ТМС-[2Н9]-ТМС	OV-101	Интенсивная метка дуб- летов	Молекулярные ионы
	ГФБ	OV-1	[4-14С]-эстрадиол и т. п.	664 (М); 666 (М) ВС
	3,16,17-ТМС	SE-30	[2,4-2Н2]-эстриол	504 (М); 506 (М) ВС
	3,17-ГФБ	OV-1	[2,4,6,6,7,15,16,17-2Н8]-  эстрадиол	664 (М); 672 (М) ВС
	3,17-ТМС	OV-1	[2,4,16,16-2Н4]-эстрадиол	416 (М); 420 (М) ВС
	3-ГФБ	OV-101 (ка- пиллярная)	[6,7-3Н2]-этинилэстрадиол	474 (М-18), 478 (М-18) ВС
	ТМС	Дексил-300	Внешние стандарты	Молекулярные ионы и т. п.
	3-ГФБ	SE-30	[4-14С]-Прогестерон	510 (М); 512 (М) ВС
	—	Дексил-300	14С-Прогестерон	315 (М+1); 317(М+1) ВС
	3-ГФБ, 17-ГФБ- ацетонид	SE-30	4-Этил-4-андростен-3,17- дион; 4-метил-19-норте-	510 (М) прогест.-ВС;  526 (М) тестост.-ВС
	Метоксим	OV-210	ciociepoH  Ацетат медроксипроге- стерона	310 (М); 312 (М) ВС
	Меток- сим—ТМС	OV-17	[20,21-13С2-7-2Н]-Норэти-  стерон	274 (М—15); 287 (М—15) ВС
	3,17-ТФА	OV-1	2Нз-Тестостерон	480 (М); 486 (М) ВС
	3,17-ТФА	OV-1	2Нз-Тестостерон, тесто-	480 (М); 486 (М) ВС
	3,17-ТМС	SE-30	ClcpUH  [4-14С]-Тестостерон	504 (М); 506 (М) ВС
	3,17-ГФБ	Дексил 300	[ 1,2-3Н2]-Тестостерон, [4-14С]-5а-Дигидроте-  иг г* т* о	680 (М); 684 (М) ВС  681 (М); 683 (М) ВС
	ТМС	OV-17	с 1 ис 1срин Эпимеры	Молекулярные ионы и т. п.
	ТМС	OV-17	За-ОН-5-Андростен- 17-он, 5а-андростан- За, 17а-диол	360 (М), DEA-BC  434 (М); 436 (М) ВС
	/прг/и-Бутил- диметилсилиль- ное + МО	OV-1,  OV-17, Поли S179	Эпитестостерон	(М-С4Н9) и т. п.
	Енол-ТФА	OV-101	Ацетат [2Н3]-медрокси- прогестерона	482 (М); 485 (М) ВС
Рис. 2.23. Запись отклика МИД на содержание гептафторбутиратов енольной:
формы прогестерона [82].

а — гептафторбутирилокси-3,5-прегнадиен-20-он; б — то же производное [4- 14С]-
прогестерона; в — очищенный экстракт сыворотки после добавления [4-14С]-
прогестерона и гептафторбутирилирования. Количества введенных стандартов
около 1,8 нг. Колонка размером 2 ммХ2 м с 1,5 % SE-30 при температуре
230 °C; энергия электрона 20 эВ.
улучшая разрешающую способность прибора и выбирая внут-
ренний стандарт, масса которого отличается от массы неме-

ченого соединения более
Адлеркройц и сотр. [12,
пердейтерированных три-
метилсилильных групп»
увеличивая тем самым
молекулярную массу на
9, 18 и 27 единиц соответ-
ственно.

Чувствительность масс-
фрагментограф и ч е с к и х
методов настолько вы-
сока, что позволяет легко
измерить несколько нано-
граммов свободных гор-
монов. Более того, во
многих случаях область
определяемых количеств
можно снизить до пико-
граммовых, следователь-
но, для определения
обычно хватает 1 мл
крови. Благодаря необы-
чайно высокой селектив-

чем на две единицы. Так, например,
15, 19, 20, 22] вводили метку в виде

Число нмолей прогестерона в 1л сыворотки

Рис. 2.24. Стандартные кривые масс-фраг-
ментографического определения прогесте-
рона в сыворотке крови [82].

ности масс-фрагментогра-
фия считается наиболее
эффективным и надеж-

ным методом определения
низких концентраций сте-
роидов в биологических
образцах. Хотя высокая

1 — нескорректированная кривая; 2 — скор-
ректированная кривая. Экспериментальные
условия см. в табл. 2.19.

стоимость аппаратуры не позволяет внедрить этот метод в прак-
тику серийного анализа, во многих лабораториях масс-фрагмен-
тометрию часто используют как арбитражный метод проверки
достоверного серийного (в основном РИА) метода [49, 82—84,
526, 537, 834, 835, 862].

Другой важной областью применения раздельной регистра-
ции пиков и ионов методом ХМС является измерение скоро-
стей выделения и метаболизма стероидов после введения в ор-
ганизм дейтерированных стероидов. В качестве примера при-
ведем работу Джонсона и сотр. [419а], вводивших в организм
7,7-2Н2-прегненолон и измерявших его гидрированные метабо-
литы в моче после ферментативного гидролиза, очистки мето-
дом ТСХ и превращения в пентафторпропионильное произ-

водное.
2.2.16.	ДРУГИЕ МЕТОДЫ

Для идентификации и характеристики стероидов широкое
распространение получил метод измерения вращения плоскости
поляризации света. Изучение дисперсии оптического вращения
(ДОВ) и регистрация спектров кругового дихроизма (КД) яв-
ляются ценными методами установления их структуры. Изме-
рение вращения плоскости поляризации в максимуме кривых
Коттона (или вблизи них) используется для количественного
определения некоторых стероидов. Хассан [347] описал опреде-
ление нескольких половых гормонов и анализ их смесей (тесто-
стерон—эстрон, тестостерон—прогестерон и т. п.). При анализе
этих смесей вращение плоскости поляризации измеряли при
двух подходящих длинах волн и рассчитывали обе концентра-
ции при помощи системы уравнений.

В ряде статей Гергели и сотр. [277—279] сообщали об ис-
пользовании метода ДОВ для решения различных аналитиче-
ских задач, например прямого определения ряда стероидных
гормонов в масляных препаратах для инъекций [277], определе-
ния до 0,1 % примеси эстрона в этинил эстрадиоле [278] и опре-
деления эстрона методом дифференциальной спектрополяримет-
рии, основанном на восстановлении 17-кетогрупп борогидридом
натрия, и измерении уменьшения вращения плоскости поляри-
зации [279]. Что касается аналитического применения спектро-
скопии КД, то необходимо упомянуть о работе Потапова и сотр.
[641], которые проанализировали бинарные смеси 17а-ацетокси-
6-метилен-4-прегнен-3,20-диона и 17а-ацетокси-6-метил-4,6-пре-
гнадиен-3,20-диона.

Вей и Альмирец [826] применяли спин-иммунный анализ для
определения субмикрограммовых количеств прогестерона.
В этом методе, тесно связанным с методом РИА, вместо радио-
метки используется ЭПР-активная спин-метка.

Наконец, в качестве любопытных примеров можно привести
статью Лю-Йен-Бауэра и Вайнфорднера [516], в которой сооб-.
щается об обнаружении стероидов по фосфоресценции, и статью
Амера и сотр. [30], в которой описано определение этинил-
эстрадиола путем комплексообразования с кобальтинитритом
натрия и измерения количества непрореагировавшего реагента
методом атомно-абсорбционной спектроскопии.
2.3. ЗАДАЧИ АНАЛИТИЧЕСКОЙ ХИМИИ
ПОЛОВЫХ ГОРМОНОВ

2.3.1.	КОНТРОЛЬ ЧИСТОТЫ ГОРМОНОВ

Традиционный путь оценки чистоты стероидных гормонов
в массе фабричного продукта заключается в определении ак-
тивного компонента титриметрическим, гравиметрическим,
спектрофотометрическим или каким-либо другим методом
и в установлении профиля концентраций примесей независимым
хроматографическим методом (обычно методом тонкослойной
хроматографии) и измерении некоторых физико-химических
констант, например температуры плавления, вращения плоско-
сти поляризации света и т. п. В последнее время благодаря
применению современных хроматографических методов, коли-
чественной тонкослойной хроматографии, газовой хроматогра-
фии и особенно высокоэффективной жидкостной хроматографии
стало возможным оценивать профиль концентрации примесей
и содержание активного компонента одним и тем же методом.

Несмотря на большую достоверность результатов, гравимет-
рия из-за длительности и трудоемкости операций не исполь-
зуется больше для анализа лекарственных препаратов, приме-
нение титриметрии также ограничено практически одной функ-
циональной группой — определением этинилстероидов методом
аргенто-ацидиметрического титрования [101а, 293, 732].

Чаще всего для количественного анализа стероидных гормо-
нов в массе продукта используется УФ-спектрофотометрия, что
нашло отражение в фармакопеях разных стран. Большинство
андрогенных, анаболических и гестогенных гормонов представ-
ляют собой ненасыщенные 3-кетопроизводные с интенсивными
полосами поглощения при 240 нм, что широко используется для
их количественного определения. Селективность этих методов,
как правило, невысока, поскольку большинство загрязнений об-
ладает той же системой связей с той же полосой поглощения.
Для повышения надежности метода часто привлекают количе-
ственную тонкослойную хроматографию с элюированием пятна,
анализируя пробу и стандартный образец параллельно на од-
ной и той же пластинке.

Характеристическая полоса поглощения эстрогенов около
280 нм также часто используется для количественного опреде-
ления, однако из-за низкой интенсивности этой полосы следует
проявлять еще большую осторожность в отношении надежности
результатов. Например, при определении примесей эстрогенов
в кетостероидах кетогруппы последних следует предварительна
восстановить борогидридом натрия [61, 303, 494].

И Заказ № 182
Колориметрические методы, применяемые в фармацевтиче-
ском анализе стероидов, главным образом для анализа готовых
лекарственных форм, иногда также используют для анализа
гормонов в массе фабричного продукта (ГИН-метод для нена-
сыщенных кетостероидов, разные варианты методик с исполь-
зованием более или менее концентрированных минеральных
кислот в качестве реагентов на эстрогены и другие стероиды
и т. п.). Поскольку селективность колориметрических методов
обычно не намного выше, чем у простых УФ-спектрофотометри-
ческих методов, а затраты времени (как и число источников
ошибок) гораздо больше, значение этих методов для анализа
гормонов в массе фабричного продукта по меньшей мере со-
мнительно.

Самым популярным методом оценки числа примесей и их со-
держания является тонкослойная хроматография. На одну пла-
стинку, как правило, наносят 50—250 мкг пробы. Содержание
отдельных примесей обычно не позволяет проводить элюирова-
ние пятна с последующим колориметрическим или другим ме-
тодом детектирования для их прямого определения. Обычно про-
водят полуколичественное определение путем визуального
сравнения пятен от примесей с пятнами от стандартных ве-
ществ. Следует заметить, что возможности количественного ме-
тода ТСХ in situ в этой области не используются.

Газовая хроматография — полезный метод как количествен-
ного определения гормонов в массе фабричного продукта, так
и для оценки их чистоты. В первом случае необходимо подо-
брать подходящий внутренний стандарт, тогда как во втором
(включая метод ХМС) основное внимание нужно обратить на
решение вопроса, указывает ли маленький пик на хромато-
грамме на наличие примеси или он относится к продукту раз-
ложения соединения или (в случае предварительной деривати-
зации) к побочному продукту реакции дериватизации.

Идеальным методом анализа гормонов в массе фабричного
продукта оказалась высокоэффективная жидкостная хромато-
графия. Если имеется подходящий внутренний стандарт, анализ
может быть выполнен с высокой селективностью. Выбрав по
крайней мере две хроматографические системы (желательно
адсорбционную и распределительную колонки с подходящими
элюентами), можно установить профиль концентраций приме-
сей [119, 311, 392]. Кроме того, изменения высоты пика при из-
менении длины волны сканирования могут дать полезную ин-
формацию для решения вопроса о структуре примесе-й; можно
также использовать соответствующие фракции элюата для по-
следующей расшифровки спектроскопических данных о струк-
туре.
2.3.2.	ОПРЕДЕЛЕНИЕ ПОЛОВЫХ ГОРМОНОВ

В ГОТОВЫХ ЛЕКАРСТВЕННЫХ ФОРМАХ [3026, 3126]

В терапии половые гормоны используются практически во
всех лекарственных формах — таблетках, масляных, водносус-
пендированных или эмульсионных препаратах для инъекций,
капсулах, мазях и т. д. Содержание активного ингредиента
обычно составляет несколько миллиграммов в таблетке или не-
сколько миллилитров в жидкой форме, но эстрогены часто со-
держатся в таблетках в микрограммовых количествах. Очень
часто используются комбинации (в основном гестоген—эстро-
ген или андроген—эстроген).

Обычно экстракцию активного вещества из таблетки про-
водят этанолом или метанолом или реже другими растворите-
лями. Для низкодозированных форм полярных стероидов (на-
пример, эстрогенов со свободной 3-оксигруппой) экстракция та-
кого типа часто оказывается неудовлетворительной. В таких
случаях рекомендуется растворить растворимую часть основы
таблетки в воде и экстрагировать стероиды хлороформом или
другими растворителями, несмешивающимися с водой. В пре-
дельном случае можно с помощью ферментативного гидролиза
растворить даже крахмал таблетки [525].

Масляные препараты для инъекций в некоторых случаях
можно анализировать сразу после разбавления их хлороформом
или другими растворителями. Однако по большей части сте-
роиды следует отделить от основной массы масла. Это чаще
всего достигается экстракцией из масляного раствора метано-
лом или водным раствором этанола после разбавления алифа-
тическим углеводородом. Для экстракции свободных эстрогенов
также используют водные растворы гидроксида натрия.

В большинстве случаев полученные таким путем экстракты
можно сразу использовать для количественного определения.
Однако довольно часто избирательность количественного ана-
литического метода недостаточна и, следовательно, в методику
приходится вводить дополнительные стадии колоночной (жела-
тельно распределительной [108, 109, 317, 319, 320, 783в, 847—
849]) или тонкослойной хроматографии.

Что касается аналитических методов, то, очевидно, наиболее
распространены спектрофотометрия и колориметрия. Андроген-
ные и гестагенные гормоны с 4-ен-З-кетогруппой определяют
в таблетке по их поглощению в максимуме при 240 нм. При
очень низком содержании стероида в таблетках или анализе
масляных препаратов для инъекций определению мешает по-
глощение фона. Его влияние можно устранить, используя метод
с применением борогидрида натрия [144, 295, 302, 459].
При УФ-спектрофотометрическом анализе препаратов эстро-
гена возникают более серьезные проблемы в связи с низкой ин-
тенсивностью полос поглощения при 280 нм и малым содержа-
нием активного вещества. Однако эти проблемы решаются
методами хроматографического разделения [108, 109, 697], се-
лективной экстракции [718], различными математическими ме-
тодами [61, 101а, 303, 447, 494, 718] , уменьшением фона путем
восстановления сопутствующих кетостероидов борогидридом
натрия [101в, 296, 303, 491] и (при определении эстрогенов со
свободными фенольными оксигруппами) при помощи диффе-
ренциального спектрофотометрического метода, основанного на
измерении поглощения стероидов в щелочной и нейтральной
средах [301, 412, 7836]. Тем не менее можно утверждать, что
УФ-спектрофотометрия в анализе эстрогенных препаратов не
имеет столь важного значения, как в анализе 4-ен-З-кетосте-
роидов.

Гораздо более широкое применение для анализа всех видов
препаратов стероидных гормонов находит колориметрия, осно-
ванная на проведении подходящей химической реакции. 4-Ен-
3-кето- и 1,4-диен-4-кетостероиды чаще всего определяют мето-
дом с использованием гидразида изоникотиновой кислоты. Уни-
версальность этого метода (его можно использовать и в спир-
товой, и в хлороформной среде) позволяет применять его для
анализа различных препаратов, в том числе масляных препара-
тов, даже в присутствии эстрогенов [78, 79, 1016, 137—139, 219а,
479, 480, 677, 768, 782, 845, 846, 849].

Для определения эстрогенов в лекарственных готовых фор-
мах чаще всего используют реагенты с высокой концентрацией
серной кислоты. Из этих реагентов Кобера наиболее употреби-
тельна смесь серная кислота—метанол, предложенная Цилифо-
нисом и Хафезом [143, 144, 317, 763, 780, 783г, 847, 848]. В ка-
честве примера кратко изложим методику By [847], предназна-
ченную для определения этинилэстрадиола в противозачаточ-
ных таблетках. В этом случае (поскольку хромогенная реакция
недостаточно селективна) необходимо отделение этинилэстра-
диола от гестогенного компонента на хроматографической ко-
лонке. Разделение проводят на колонке (250x25 мм), содер-
жащей (начиная со дна) прокладку из стеклянной ваты, 5 г
безводного сульфата натрия, смесь 3 г целита и 3 мл 10 %-ного
раствора гидроксида натрия. Сверху помещают часть измель-
ченной таблетки, содержащей около 40 мкг этинилэстрадиола,
растертой с 3 мл хлороформа и 2 мл воды и смешанной с 4,5 г
целита. Затем гестогенный компонент и другие мешающие ве-
щества элюируют из колонки, промывая ее 25 мл изооктана
и 55 мл смеси хлороформа и изооктана (1:9). Этинилэстра-
диол, остающийся в щелочном слое — ловушке, элюируют из
колонки 50 мл хлороформа, а затем 25 мл изооктана. Смесь
энергично встряхивают в делительной воронке емкостью 250 мл
с 10 мл реагента серная кислота—метанол в соотношении 7:3
(по объему) в течение 4 мин. Измеряют поглощение нижнего
слоя при 537 нм относительно реагента, рассчитывают содер-
жание этинилэстрадиола, пользуясь данными по поглощению
стандарта, проведенного параллельно через все стадии опре-
деления.

Ценным методом анализа стероидных гормональных препа-
ратов является также флуориметрия. Этим методом в основном
анализируют препараты с низкой дозировкой эстрогена, чтобы
использовать главное его достоинство — высокую чувствитель-
ность. Хотя можно измерять и собственную флуоресценцию
[101а, 202, 411, 412, 435, 665], в большинстве методов исполь-
зуются реагенты с высокой концентрацией сильной кислоты, осо-
бенно при анализе противозачаточных пилюль, содержащих
этинилэстрадиол или местранол [413, 453, 525, 555, 614, 719, 763,
783ж, 824].

Одной из причин сохранившейся до сих пор популярности
колориметрии и флуориметрии в анализе стероидных гормо-
нальных препаратов является возможность автоматизации. Это
очень важно, так как контроль партий низкодозированных таб-
леток с примерно одинаковым содержанием стероида вручную
чрезвычайно трудоемкий процесс.

На рис. 2.25, взятом из статьи Ангермана и сотр. [40], пред-
ставлена схема анализа таблеток с содержанием 250 мкг норге-
стрела и 50 мкг этинилэстрадиола в одной таблетке с использо-
ванием автоанализатора фирмы «Текникон». Отдельная
таблетка измельчается и экстрагируется на установке «Солйд-
преп»; поток, содержащий этанольный экстракт таблеток, не-
прерывно фильтруется и разделяется на два потока. В одном
потоке (рис. 2.25, а) определяют этинилэстрадиол флуоримет-
рически после смешивания с 94 %-ной серной кислотой, а в дру-
гом определяют норгестрел методом с использованием ГИН.
За 1 ч этим методом можно определить оба компонента в 15 от-
дельных таблетках.

Некоторые таблетки, содержащие андрогены или гестогены
с Д4-3-кетогруппами, анализировали методом дифференциаль-
ной импульсной полярографии [125, 149, 150, 608, 850]. Досто-
инством этого не очень распространенного метода является то,
что нет необходимости в предварительном удалении основы
таблетки из исследуемого раствора.

Хотя при помощи рассмотренных методов можно проанали-
зировать практически все формы стероидных гормональных пре-
паратов, они имеют один общий недостаток: определение ве-
дется по самой устойчивой части молекулы (4-ен-З-кетогруппе,
Дозирующий насос

Ь —

«2

0,056 в я

------Воздух

, 0.073 Проба.подаваемая -
насосом 1

_ ГИН

К насосу 1 <-
Сброс

Ох л а ж- (
дение

10 —

77

72-----

73

14

15

0,1 ю
о,по

0,056

•Охлаждающая вода

Из колориметра



Колориметр Самописец
(светофильтр 420 нм)

Фильтр

Сброс

Дозирующий
насос

7

•2

10

>12

14

3	/о, 710

77

73

Долидпреп

0,110

Спирт для,Долидпрепа‘
Проба

°’0°65 Воздух
Воздух
0,090

-------°,0^° - 94%-НОЯ H2S04

0,090

0,056

0,030

Из флуориметра

4

6

5

— 7
8 —

9

।

Термостат

^К насосу I

а

Флуориметр Самописец
(546/580 нм)

Рис. 2.25. Схема непрерывного определения норгестрела и этинилэстрадиола
в отдельной таблетке с использованием автоанализатора [40].

а — экстракция таблетки и флуориметрическое определение этинилэстрадиола;
б — колориметрическое определение норгестрела с помощью ГИН. Цифрами
на схеме обозначены места пересечения шлангов.
ароматическому кольцу Л); следовательно, в большинстве слу-
чаев, эти методы непригодны при оценке устойчивости препа-
ратов.

В таких случаях следует повысить избирательность колори-
метрического или флуориметрического методов путем предвари-
тельного разделения методами тонкослойной хроматографии
или, что более предпочтительно, газовой или высокоэффектив-
ной жидкостной хроматографии. Многие практические примеры
применения этих методов анализа стероидных гормональных
готовых лекарственных форм можно найти в табл. 2.13—2.15.

Еще одним преимуществом газовой и высокоэффективной
жидкостной хроматографий является возможность проведения
разделения и количественного определения нескольких компо-
нентов в сложных препаратах за один-единственный хромато-
графический цикл (см., например, рис. 2.10).

2.3.3.	ОПРЕДЕЛЕНИЕ ПОЛОВЫХ ГОРМОНОВ

И ИХ МЕТАБОЛИТОВ В БИОЛОГИЧЕСКИХ ОБЪЕКТАХ

Общие вопросы

Определение стероидных гормонов и конъюгатов в биологи-
ческих объектах — несомненно наиболее тщательно изученная
область анализа стероидов. Это объясняется важностью знания
концентраций индивидуальных стероидов в различных биоло-
гических объектах при изучении их биосинтеза и метаболизма,
а также непрерывно возрастающим вниманием к изменениям
концентраций определенных стероидов или профиля концентра-
ции стероидов вследствие заболеваний или других нарушений
в организме. Благодаря огромному значению этих данных для
диагностики анализ стероидных гормонов в биологических объ-
ектах стал одним из самых распространенных клинических се-
рийных тестов.

Чаще всего на содержание стероидов исследуются моча
и плазма или сыворотка крови, но имеется много сведений и об
анализе других объектов, например тканей, фекалий, амниоти-
ческих жидкостей и т. п.

Подавляющее большинство стероидов в моче и их значи-
тельная часть в крови находятся в виде конъюгатов, поэтому
возможны различные подходы к задаче их обнаружения:

а)	определение только свободного стероида;

б)	определение стероида в свободном и связанном состоя-
нии по отдельности после соответствующего разделения;

в)	определение суммарного содержания свободной и связан-
ной форм стероида после переведения последнего в свободный
стероид.
Решение сложных проблем (а) и (б) стало возможным
только благодаря введению изощренных методов разделения
(в основном хроматографических). В общем можно утверждать,
что если в фармацевтическом анализе стероидов большая часть
работы приходится на само количественное определение, то
в биоклиническом анализе стероидов основное время и труд
уходят на процессы разделения и очистки.

Экстракция

В этом разделе термин «экстракция» используется в класси-
ческом смысле, поскольку обсуждаться будет только экстрак-
ция растворителями; выделение стероидов из растворов мето-
дами колоночной хроматографии, главным образом на смоле
марки XAD, часто трактуемое в литературе как экстракция,
будут обсуждаться в следующем разделе.

Большинство аналитических методов определения стероид-
ных гормонов в биологических объектах включает по крайней
мере одну стадию экстракции. Эта стадия проводится либо не-
посредственно с депротеинизированной пробой, либо чаще всего
после расщепления конъюгатов. Обычно для экстракции сте-
роидов с последующим анализом методами ГЖХ, ВЭЖХ, МС,
РИА и др. используют диэтиловый эфир [20, 54, 57, 90, 197,
236, 237, 239, 338, 469, 591, 604, 617, 685, 750].

Если цель анализа заключается в определении нейтральных
стероидов, эфирные экстракты часто промывают 0,1—2,5 М вод-
ным раствором гидроксида натрия для удаления мешающих
веществ кислотного характера.

Если же цель анализа — определение эстрогенов, их экстра-
гируют из эфирного раствора. Например, при определении
эстриола в моче эфирный раствор обрабатывают 1 М раствором
гидроксида натрия, pH экстракта понижают при помощи гидро-
карбоната натрия и экстрагируют эстриол толуолом для после-
дующего газохроматографического определения [557].

Используются также и другие органические растворители:,
дихлорметан [88, 266, 589, 629, 723, 724], хлороформ [567, 790],
дихлорэтан [778], трихлорэтилен [153], толуол [486], этилаце-
тат [68, 94, 264, 275, 713] и смеси растворителей, например
этил ацетат—гексан—этанол (7:2:1) [5, 6], диэтиловый эфир—
хлороформ (4:1) [653] и т. п.

Конъюгаты экстрагируют более полярными растворителями
или смесями растворителей либо уменьшают их растворимость
в водной фазе, добавляя большие количества солей типа суль-
фата аммония [615].

Следует заметить, что многие методики включают более од-
ной стадии экстракции. Например, после выпаривания досуха
эфирного экстракта остаток часто распределяют между 70 % -
ным метанолом и гексаном [750] или между этанолом и петро-
лейным эфиром [90] с тем, чтобы отделить холестерин и другие
липиды, переходящие в углеводородную фазу, от более поляр-
ных стероидов, остающихся в спиртовой фазе.

Хроматографическое разделение
и очистка экстрактов

Избирательность количественного измерения на заключи-
тельной стадии анализа часто недостаточно высока для селек-
тивного определения малых количеств стероидов в биологиче-
ских образцах с использованием только стадий экстракции.
В таких случаях в методики включают стадии разделения
и очистки методами колоночной и(или) тонкослойной хрома-
тографии.

Почти все методы колоночной хроматографии, описанные
в разд. 2.2.9, широко применяются для анализа биологических
объектов (за исключением распределительной жидкостной
хроматографии, которая в настоящее время используется в ос-
новном в фармацевтике). Для прямого вмделения стероидов
(«экстракции») из разбавленных биологических жидкостей ча-
сто применяют колонку, заполненную амберлитом XAD-2; для
этой же цели используется кизельгур [825]. Для очистки экс-
трактов обычно служат колонки с силикагелем и оксидом алю-
миния, а для фракционирования стероидов в основном исполь-
зуются различные сефадексы (главным образом LH-20). Сле-
дует заметить, что колоночная хроматография имеет значение
для разделения и очистки не только природных стероидов, но
и их производных. Например, Адлеркройц и Шауман [21] перед
стадиями силилирования и газохроматографического количест-
венного определения проводили очистку стероидов на колонке,
заполненной оксидом алюминия, после их превращения в мето-
ксимы. Бауман и Нони [96] очищали пентафторпропионат эст-
радиола перед газохроматографическим анализом на колонке,
заполненной силикагелем.

При подготовке проб для определения стероидных гормонов
в биологических объектах по меньшей мере такую же важную
роль, как и колоночная хроматография, играет тонкослойная
хроматография. Ее часто используют для удаления примесей
из пробы и фракционирования на индивидуальные соединения
или зоны, пригодные для последующего анализа. Эта стадия
часто сочетается с разделением на хроматографической ко-
лонке, как это показано на следующем примере, включающем
три стадии хроматографирования в тонком слое: две — для
очистки свободных стероидов и третья — для очистки их моно-
хлорацетатов. Микан [552] описал газохроматографический ме-
тод определения насыщенных метаболитов прогестерона в мы-
шечной оболочке матки человека. После экстракции и разделе-
ния на «свободную» и «сульфатную» фракции путем другой,
жидкость-жидкостной, экстракции сульфатную фракцию очи-
щают на колонке, заполненной LH-20 [хлороформ—метанол
(1:1) с добавкой 0,1 ммоля хлорида натрия]. После отщепле-
ния сульфогрупп полученные свободные стероиды хроматогра-
фируют на пластинке, покрытой силикагелем, используя смесь
хлороформ—ацетон (9:1) для отделения монооксипрегнановой
фракции (Rf 0,52—0,57). При дальнейшем хроматографиро-
вании этой фракции [гексан—этилацетат (3:1)] с тремя обна-
руживающими агентами происходит разделение эпимеров
З-оксипрегнан-20-она. Окончательную очистку фракций перед
анализом проводят после перевода в монохлорацетаты.

В приведенном выше примере, и вообще в большинстве слу-
чаев, когда анализу предшествуют стадии экстракции и хрома-
тографирования, необходимо контролировать полноту разделе-
ния на этих стадиях, используя меченые стероиды в качестве
радиоактивных индикаторов.

Расщепление конъюгатов

Если целью анализа не является определение индивидуаль-
ных конъюгатов (и при этом имеется достаточно избиратель-
ный метод, обычно ВЭЖХ), конъюгаты следует перевести в сво-
бодные стероиды отщеплением сульфогруппы или глюкуронид-
ной группировки. Это обязательный этап анализа стероидов,
содержащихся в моче, но его часто включают и в схемы ана-
лиза проб сыворотки или плазмы крови.

В зависимости от поставленной задачи расщепление можно
проводить непосредственно в разбавленной пробе или после
экстракции растворителем. Очень часто после разделения на ко-
лонке или в тонком слое конъюгаты подвергают гидролизу.
В этих случаях можно получить количественные результаты
для индивидуальных конъюгатов, или по крайней мере для их
фракций, не прибегая к селективным методам определения.

В настоящее время из различных способов расщепления
конъюгатов стероидов чаще всего используют ферментативный
гидролиз. Ферментами в этих реакциях служат арилсульфатаза
для расщепления 3-сульфатов эстрогенов, стероидная сульфа-
таза для 3-сульфатов других стероидов и p-глюкуронидаза для
глюкуронидов различных стероидов. Наиболее подходящим ис-
точником всех трех ферментов является сок улитки Helix ро-
matia. Полученные из нее очищенные экстракты чаще всего
используют при анализе стероидов в моче [6, 21, 54, 486].
Обычно гидролиз проводят при pH 4,5—5,0 (ацетатный буфер),
температуре около 37°С и времени реакции 12—48 ч. Другой
широко используемой комбинацией ферментов для гидролиза
стероидов, содержащихся в моче [213, 629, 685, 856] и плазме
[596, 691], служит глюсулаза (смесь арилсульфатазы и Р-глю-
куронидазы) при аналогичных условиях. Если сульфаты отсут-
ствуют, отделены или селективно разложены, часто используют
одну р-глюкуронидазу [68, 90, 488, 542].

Основной причиной вытеснения классических методов рас-
щепления (включающих использование концентрированных ми-
неральных кислот при повышенной температуре) ферментатив-
ными методами является разложение в жестких условиях мно-
гих стероидов. Сейчас классические методы используют только
для расщепления конъюгатов эстрогенов, которые достаточно
устойчивы, чтобы сохранить свою структуру при такой обра-
ботке [767, 848]*. Например, Милнер и Табер [557] в начале
определения эстриола в моче беременных разбавляют 1—2 мл
пробы до 6 мл водой, добавляют 0,9 мл концентрированной со-
ляной кислоты и нагревают раствор в автоклаве в течение
15 мин при 0,105 МПа. Вейс [829] показал, что даже в этих
случаях правильность анализа можно улучшить, если разбавить
пробу мочи водой (1 :50) и очистить ее на сефадексе или оса-
дить конъюгаты добавлением сульфата аммония с тем, чтобы по-
низить концентрацию компонентов мочи, мешающих определе-
нию в сильнокислой среде. Хроматографическая очистка пробы
полезна также при ферментативном анализе, так как при этом
можно удалить ферменты-ингибиторы [315, 615].

Следует заметить, что в некоторых случаях для полного
гидролиза требуются гораздо более мягкие условия. Например,
сульфат дегидроэпиандростерона полностью гидролизуется при
кипячении в течение 4 ч в ацетатном буферном водном рас-
творе (pH 4,5) [548]. Более распространенным приемом рас-
щепления сульфатов является сольволиз в этилацетатных рас-
творах [43, 68, 488, 713 и т. д.]. В этом растворителе, являю-
щемся хорошим экстрагентом для сульфатов стероидов, послед-
ние подвергаются сольволитическому разложению (при 45°С
в течение'15 ч [650]), ускоряемому при введении в раствор сле-
довых количеств минеральных кислот. Например, в методе ра-
диоиммунного определения дегидроэпиандростерона и прегне-
нолона, предложенном Асо и сотр. [43], разбавленную плазму,
из которой предварительно удалены свободные стероиды экс-
тракцией эфиром, смешивают с насыщенным раствором хло-
рида натрия и дважды экстрагируют этилацетатом порциями по

* Результаты сравнительного изучения ферментативного и кислотного ги-
дролиза конъюгатов эстрогенов опубликованы Кариньяном и Лоджем [1296].
6 мл. При добавлении к экстракту 1 капли концентрированной
соляной кислоты сольволиз при комнатной температуре прохо-
дит за 1 ч.

Сочетание ферментативных и сольволитических методов
разложения с хроматографическими разделениями позволяет
решать сложные задачи. В качестве примера приведем метод
газохроматографического определения Кюльпмана и Бройера
[488], которые предварительно разделяли нейтральные сте-
роиды, содержащиеся в моче, в виде глюкуронидов и сульфа-
тов на колонке, заполненной амберлитом XAD-2, а затем пер-
вые подвергали ферментативному гидролизу (при помощи глю-
куронидазы), а вторые разлагали сольволитически в этилацетате.

Спектроскопические методы
количественного анализа

В анализе биологических объектов методы, основанные на
поглощении в УФ- и ИК-областях, а также на флуоресценции,
не играют заметной роли. До сих пор находят применение коло-
риметрия и флуориметрия (хотя их значение существенно
уменьшилось в связи с возрастанием роли хроматографических
и радиоаналитических методов), так как эти методы не тре-
буют дорогого оборудования, могут быть использованы даже
в плохо оснащенных лабораториях и из всех инструменталь-
ных методов их легче всего автоматизировать. Поэтому боль-
шинство методов колориметрического и флуориметрического
определения стероидных гормонов в биологических объектах
(главным образом в моче), о которых сообщалось в печати,
являются автоматическими или по крайней мере полуавтомати-
ческими. В последних вручную проводятся операции фермента-
тивного, гидролитического или сольволитического расщепления
и экстракция.

В основном эти методы используются в двух областях — для
определения 17-кетостероидов и эстрогенов в моче.

Для колориметрического определения 17-кетостероидов
в моче применяются водные [214, 240—242, 481, 823] и невод-
ные [214, 565, 566, 650, 861] варианты метода Циммермана
с использованием 1,3-динитробензола.

Общее содержание эстрогенов и эстриола обычно опреде-
ляют колориметрически или даже чаще флуориметрически ме-
тодом Кобера или Иттриха—Кобера в различных вариантах.
В ряде методик конъюгаты эстрогенов предварительно гидро-
лизуют (обычно гидролиз катализируется кислотами), но во мно-
гих случаях сразу действуют сильнокислотными реагентами,
как, например, в методике полуавтоматического флуориметри-
ческого определения общего содержания эстрогенов в моче бе-
ременных, предложенной Фраем и сотр. [267]. Авторы подо-
брали оптимальный состав реагента (см. разд. 2.2.2) таким об-
разом, чтобы максимальная флуоресценция приходилась на
эстриол-16а-глюкуронид, являющийся основным эстрогенным
компонентом мочи беременных. При полной автоматизации ме-
тодики можно проанализировать от 20 [336] до 30 [267] проб
в 1 ч.

При сочетании колориметрических или флуориметрических
измерений с ферментативными реакциями чувствительность
и избирательность этих методов определения половых гормонов
в биологических объектах повышаются (см. табл. 2.18).

Хроматографические методы количественного анализа

Из всех хроматографических методов анализа стероидных
гормонов в биологических объектах наиболее широко несом-
ненно используется газовая хроматография, и ее значение не
уменьшилось при введении высокоэффективной жидкостной
хроматографии. Это находит отражение в большом числе не-
давно опубликованных статей (см. с. 106—107).

Основное преимущество газохроматографических методов
по сравнению со спектроскопическими состоит в более высокой
чувствительности. Так, например, при помощи детектора элек-
тронного захвата можно определять пикограммовые количества
стероидов не только в моче, но и в сыворотке. Другим важным
преимуществом этих методов является возможность определе-
ния не только отдельных стероидов или суммарного содержа-
ния группы стероидов, но также одновременного определения
родственных стероидов и (особенно с использованием капилляр-
ных колонок) установления профиля концентраций стероидов
в разных биологических объектах (см. табл. 2.10).

Поэтому газовая хроматография в настоящее время яв-
ляется незаменимым средством при биохимических исследова-
ниях стероидов и в серийных клинических анализах. Следует,
однако, заметить, что, несмотря на большую разрешающую спо-
собность газохроматографических колонок, в целом газохро.ма-
тографическому анализу биологических образцов предшествует
по меньшей мере столь же длительная подготовительная ра-
бота, как и в спектроскопических методах, т. е. расщепление
конъюгатов, экстракция и очень часто разделение на колонке
или в тонком слое. Эти стадии и стадию дериватизации, кото-
рую приходится проводить в большинстве случаев (часто при
этом требуются такие стадии, как выпаривание досуха), очень
трудно автоматизировать, поэтому автоматизация сложных га-
зохроматографических методов обычно ограничивается лишь
заключительной стадией газохроматографического определения
при помощи различных автоанализаторов. Даже в этих случаях
скорость анализа не превышает 1—3 проб в 1 ч из-за довольно
большой длительности анализа, которая колеблется от 20 до
60 мин в зависимости от количества определяемых компо-
нентов.

Большое преимущество газовой хроматографии перед лю-
бым другим методом состоит в том, что ее легко комбинировать
с масс-спектрометрией. Это важно не только с точки зрения
возможности непосредственной идентификации пиков на хрома-
тограммах сложных биологических смесей, но также и с точки
зрения требований количественного анализа, поскольку масс-
фрагментографию можно считать наиболее чувствительным
и селективным методом анализа стероидов.

Достоинства и недостатки высокоэффективной жидкостной
хроматографии в сравнении с газовой хроматографией обсу-
ждаются в разд. 2.2.12. Можно утверждать, что в области ана-
лиза половых гормонов ВЭЖХ несомненно предпочтительнее
только для тех конъюгатов, которые трудно анализировать га-
зохроматографически (см. табл. 2.16). В ряде других областей,
где чувствительность не столь важна (анализ стероидов
в моче), преимущества и недостатки газовой хроматографии
и высокоэффективной жидкостной хроматографии компенси-
руются, и в ближайшем будущем можно ожидать возрастания
роли ВЭЖХ в этих областях.

Следует также ожидать расширения применения тонкослой-
ной денситометрии; сейчас ее использование в анализе поло-
вых гормонов в биологических объектах, похоже, ограничи-
вается лишь несколькими примерами [24, 212, 390, 827, 828, 830,
840, 853 (а—в)].

Радиоаналитические количественные методы

Если спектроскопические методы определения стероидных
гормонов в биологических объектах не обладают высокими из-
бирательностью и чувствительностью, но позволяют выполнять
анализ сотен образцов в день, то газовая хроматография, яв-
ляясь высокоизбирательным и чувствительным методом (осо-
бенно в сочетании с масс-спектрометрией), дает по крайней мере
на порядок меньше анализов в день. Образовавшаяся брешь за-
полнена современными радиоаналитическими методами, в ос-
новном радиоиммунными, поскольку чувствительность их доста-
точно высока, чтобы решать сложные задачи; селективность же
метода РИА также высока, если использовать достаточно спе-
цифическую антисыворотку. В то же время по числу анализи-
руемых проб в день радиоаналитические методы сравнимы со
спектроскопическими. С этой точки зрения несомненно перспек-
тивны нехроматографические поддающиеся автоматизации
твердофазные методы.

Поскольку единственной областью применения РИА стероид-
ных гормонов является определение их в биоклинических объ-
ектах, все, сказанное в разд. 2.2.13 о практическом использова-
нии метода, и примеры, приведенные в табл. 2.17, относятся
также к предмету этого раздела.

Некоторые схемы сложных
аналитических методик

Как уже неоднократно отмечалось в этой главе, способ под-
готовки пробы для определения стероидных гормонов в биоло-
гических объектах существенно зависит от поставленной задачи.
Начав со случаев, когда пробу мочи или плазмы можно анали-
зировать без какой-либо предварительной обработки (в основ-
ном методами РИА), и продолжив рассмотрение некоторых ме-
тодов газовой хроматографии, высокоэффективной жидкостной
хроматографии и других методов, в которых подготовка пробы
ограничивается одной стадией экстракции, можно перейти к об-
суждению сложных подготовительных операций, включающих
стадии экстракции в сочетании с хроматографическими ста-
диями, которые могут занять несколько дней.

Теперь приведем схемы четырех сложных методик с колори-
метрическим, флуориметрическим, газохроматографическим
и масс-фрагментографическим окончаниями.

Первым опишем полуавтоматический колориметрический
метод Рейдмакера и сотр. [650] для определения суммарного
содержания в моче 11-дезокси-17-кетостероидов (дегидроэпиан-
дростерона, андростерона, этиохоланолона) с использованием
реакции Циммермана (см. 35—37) на стадии количественного
определения (рис. 2.26).

В качестве второго примера приведем метод флуориметри-
ческого определения общего содержания эстриола в плазме бе-
ременных (10—25 мкг/100 мл), описанный Миклоши и сотр.
[554] (рис. 2.27). В этом случае для количественной оценки ис-
пользован флуориметрический вариант метода Кобера—Итт-
риха (см. с. 49).

Следующий пример (Тикканен и Адлеркройц [770]) также
относится к определению эстриола, на этот раз в моче беремен-
ных, но целью анализа является определение содержания каж-
дого из четырех основных конъюгатов. На заключительной ста-
дии проводится газохроматографическое измерение всех конъю-
гатов в виде производных эстриола, метилированных по фе-
нольной оксигруппе и силилированных по 16- и 17-оксигруппам,
поэтому перед ферментативным расщеплением и дериватиза-
цией конъюгаты следует разделить хроматографически
(рис. 2.28).

В последнем примере, взятом из статьи Адлеркройца и др.
[19], демонстрируется решение действительно очень трудной

Рис. 2.26. Схема определения 11-дезокси-17-кетостероидов в моче по методу
Рейдмакера и сотр. [650].

задачи одновременного определения одиннадцати эстрогенов
(в том числе минорных компонентов) в плазме, моче и желчи
методом масс-фрагментографии (рис. 2.29).

Наряду с несколькими экстракционными, хроматографиче-
скими и ферментативными стадиями эта сложная методика
включает две химические реакции, необходимые для разделе-
ния фракций эстрогенов. О селективном образовании ацетони-
дов из 16,17-цис-диолов уже упоминалось на с. 100, а разделение
эстрогенов при помощи реактива Т Жирара является примером

Рис. 2.27. Схема определения общего содержания эстриола в плазме бере-
менных по методу Миклоши и сотр. [554].

использования классического метода Кароля и Ротандаро [113]
(селективное взаимодействие 17-кетоэстрогенов с реактивом
Т Жирара с образованием водорастворимых триметилглицил-
гидразонов, из которых после отделения от 17-оксиэстрогенов
кетостероиды легко выделить снова).

12 Заказ № 182
Рис. 2.28. Схема определения индивидуальных конъюгатов эстриолов в моче
беременных, взятая из статьи Тикканена и Адлеркройца [770].

Эз — эстриол; С — сульфат; Гл — глюкуронид.
16 - Кетоэстрадиол-Г/р
15а~Оксиэстрон

Рис. 2.29. Схема определения 11 эстрогенов в биологических жидкостях, взя-
тая из статьи Адлеркройца и сотр. [19].
2.3.4.	ОПРЕДЕЛЕНИЕ ПОЛОВЫХ ГОРМОНОВ

И АНАБОЛИЧЕСКИХ АГЕНТОВ В ПИЩЕВЫХ ПРОДУКТАХ

Некоторые эстрогенные, гестогенные и анаболические сте-
роиды широко используются в приготовлении корма для скота
в качестве регуляторов роста и стимуляторов увеличения при-
веса, поэтому определение этих стероидов в корме для живот-
ных и их остатков в тканях животных и молоке является важ-
ной задачей. Поскольку в большинстве случаев содержание сте-
роидов в различных образцах находится на уровне нескольких
частей на миллиард, во внимание принимаются только самые
чувствительные методы, и для успешного анализа часто необ-
ходимы предварительные операции экстракции и очистки. Об-
зор работ в этой области сделан Райаном [679].

Для анализа мяса и мясных продуктов пробы готовят так
же, как для анализа тканей человека и подопытных животных.
Используют длительное экстрагирование в аппарате Сокслета
дихлорметаном или хлороформом, а также другими раствори-
телями— этилацетатом, этанолом и т. п.— с последующей очи-
сткой методами колоночной или тонкослойной хроматографии,
как это описано в предыдущем разделе.

Из-за низкого содержания компонентов и большого числа
анализируемых проб для серийных анализов могут быть ис-
пользованы только очень чувствительные и недорогие методы.
Так, метод Кобера в варианте Иттриха с флуориметрическим
измерением на конечной стадии с успехом применялся для
определения эстрогенов в молоке после гидролиза, экстракции
растворителями и очистки на колонке с оксидом алюминия [402].
ТСХ-флуориметрический метод определения тренболона и его
ацетатов (анаболические стероиды) описан на с. 78 [600].

Широко применяется и радиоиммунный анализ, например
при определении ацетата тренболона в тканях [360, 372].

Из многочисленных примеров использования газовой хро-
матографии (например, [96, 375, 821]) на рис. 2.30 [482] при-
ведена в качестве типичной схема определения ацетата ме-
ленгестрола (ацетат 17-окси-6-метил-16-метилен-4,6-прегнадиен-
3,20-диона) в тканях быка.

Наконец, следует упомянуть статью Холдера и сотр. [375].
Авторы сравнивали результаты определения тренболона и его
ацетатов в корме для скота методом газовой хроматографии
в виде пентафторпропионатов с использованием ДЭЗ и методом
высокоэффективной жидкостной хроматографии (ВЭЖХ). Ска-
нирование хроматограмм в максимуме поглощения стероидов
в длинноволновой области (345 нм) является довольно избира-
тельным и чувствительным приемом, позволяющим проводить
Рис. 2.30. Схема определения ацетата меленгестрола в тканях и жире быка
по методу Кржемински и сотр. [482].

определение с пределом обнаружения до 0,5 млн-1. Чувстви-
тельность газохроматографического метода оказалась выше, но
серьезные осложнения, связанные с наличием фона, не позво-
лили полностью использовать это преимущество, даже если
подвергнуть бензольные растворы дополнительной экстракции
и хроматографированию на колонке, заполненной силикагелем.
Поэтому метод ВЭЖХ с соответствующей предварительной ста-
дией очистки является предпочтительным.
ЛИТЕРАТУРА

1.	Abelson D., Bondy P. К. Arch. Biochem. Biophys., 1955, v. 57, p. 208.

2.	Abelson D., Bondy P. K. Anal. Chem., 1956, v. 28, p. 1922.

3.	Abelson D., Bondy P. K. J. Chromat., 1961, v. 5, p. 332.

4.	Abuknesha R., Exley D. In Pal S. B. (Editor). Enzyme Labelled Im-
munoassay of Hormones and Drugs. De Gruyter, Berlin, New York, 1978,
p. 139.

5.	Adessi G. L., Eichenberger D., Tran Quang Nhuan, Jayle M. F. Clin.
Chim. Acta, 1974, v. 55, p. 323.

6.	Adessi G. L., Eichenberger D., Tran Quang Nhuan, Jayle N. F. Steroids,
1975, v. 25, p. 553.

7.	Adhikary P. M., Harkness R. A., Biochem. J., 1967, v. 105, p. 40P.

8.	Adhikary P. M., Harkness R. A. Anal. Chem., 1969, v. 41, p. 470.

9.	Adkins A., Cox F. W. J. Am. Chem. Soc., 1938, v. 60, p. 1151.

10.	Adlercreutz H. In Breuer H., Hamel D., Kriiskemper H. L. (Editors).
Methods of Hormone Analysis. Georg Thieme Verlag, Stuttgart, 1975.

10a. Adlercreutz H. In Quayle A. (Editor). Advances in Mass Spectrometry.
Vol. 8, Heyden, London, 1980, pp. 1165—1179.

11.	Adlercreutz H., Diczfalusy E., Engstrom L. J. Endocrinol., 1960, v. 66,
p. 80.

12.	Adlercreutz H., Ervast H. S. Acta Endocrinol. (Suppl.), 1973, v. 177,
p. 32.

13.	Adlercreutz H., Ervast H. S., Tenhunen A., Tikkanen M. J. Acta Endo-
crinol., 1973, v. 73, p. 543.

14.	Adlercreutz H., Harkonen M. Proc. Internat. Congr. Clinical Chemistry,
Mexico, 1978.

15.	Adlercreutz H.t Hunneman D. H. J. Steroid Biochem., 1973, v. 4, p. 233.

16.	Adlercreutz H., Janne O., Laatikainen T., Lindstrom B., Luukkainen T.,
Vihko R. Bull. Swiss Acad. Med. Sci., 1969, v. 24, p. 328.

16a. Adlercreutz H., Jdrvenpaa P. In Klopper A., Lerner L., Van der Mo-
len J. H., Sciarra F. (Editors). Research on Steroids, Vol. 8, Academic
Press, London, New York, San Francisco, 1979, pp. 109—118.

166.	Adlercreutz H., Harkonen M. J. Steroid Biochem., 1980, v. 13, p. 507.

17.	Adlercreutz H., Luukkainen T. Z. Klin. Chem. Klin. Biochem., 1971, v. 9,
p. 421.

18.	Adlercreutz H., Martin F. Acta Endocrinol., 1976, v. 83, p. 410.

19.	Adlercreutz H., Martin F., Wahlroos O, Soini E. J. Steroid Biochem.,
1975, v. 6, p. 247.

20.	Adlercreutz H., Nylander P.f Hunneman D. H. Biomed. Mass Spectrom.,
1974, v. 1, p. 332.

21.	Adlercreutz H., Schauman К. O. In Breuer H., Hamel D., Kriiskem- •
per H. L. (Editors). Methods of Hormone Analysis. Georg Thieme Ver-
lag, Stuttgart, 1975.

22.	Adlercreutz H., Tikkanen M. J., Hunneman D. H. J. Steroid Biochem.,
1974, v. 5, p. 211.

23.	Alary J., Cantin D., Coeur A. Bull. Soc. Chim. Franc., 1977, p. 649.

24.	Albers H. K., Lisboa В. P. In Frigerio A., Renoz L. (Editors). Recent
Developments in Chromatography and Electrophoresis, Elsevier, Amster-
dam. Vol. IX, 1979, p. 255.

25.	Alexander G., Rutten G. A. F. M. Chromatographia, 1973, v. 6, p. 231.
'26. Allen L, Geddes E. T. J. Pharm. Pharmacol., 1957, v. 40, p. 990.

27.	Allen R. M., Redshaw M. R. Steroids, 1978, v. 32, p. 467.

28.	Allen IT M. J. Clin. Endocrinol., 1950, v. 10, p. 71.

29.	Amer M. M., Hassan S. M., Kheir A. B., Mostafa A. A. Pharmazie, 1978,
v. 33, p. 344.
30.	Amer М. М., Walash М. L, Haroun I. A., Ashour F. М. J. Pharm. Belg.r
1978, v. 33, р. 297.

31.	Amin М., Seeger A., Prezewowsky К., Fuchs Р. Pharm. Acta Helv., 1974r
v. 49, p. 117.

32.	Amin M., Hassenbach M. Analyst, 1979, v. 104, p. 407.

33.	Amin M. I., Koshy К. T., Bryan J. T. J. Pharm. Sci., 1976, v. 65, p. 1777.

34.	Amormino V., Bellomonte G., Carelli G., Cingolani E. Ahn. 1st. Sup..
Sanita, 1968, v. 4, p. 108.

35.	Amormino V., Bellomonte G., Cingolani E. Ann. 1st. Sup. Sanita, 1968r
v. 4, p. 65.

36.	Anderson D. C., Hopper B. R., Lasley B. L., Yen S. S. C. Steroids, 1976,.
v. 28, p. 179.

37.	Anderson D. W., Goebbelsmann U. Clin. Chem., 1976, v. 22, p. 611.

38.	Anderson P. H., Fukushima K., Schiller H. S. Clin. Chem., 1975, v. 21 r
p. 708.

39.	Anderson R. A., Defaye G., Madani C., Chambaz E. M., Brooks C. J. W.
J. Chromat., 1974, v. 99, p. 485.

40.	Angermann B., Sonderdruck Nr. 952, Technicon Symposium, 1971.

41.	Ansari S., Khan R. A. J. Pharm. Pharmacol., 1960, v. 12, p. 122.

42.	Aringer L., Eneroth P., Gustafsson J. A. Steroids, 1971, v. 17, p. 377.

43.	Aso T., Aedo A. R., Cekan S. Z. J. Steroid Biochem., 1977, v. 8, p. 1105.

44.	Avdovich H. W., Bowron M., Lodge B. A. J. Pharm. Sci., 1970, v. 59,
p. 1821.

45.	Avdovich H. W., Hanbury P., Lodge B. A. J. Pharm. Sci., 1970, v. 59,.
p. 1164.

46.	Axelson M., Sjovall J. J. Chromat., 1976, v. 126, p. 705.

47.	Axelson M. J. Steroid Biochem., 1977, v. 8, p. 693.

48.	Axelson M., Sjovall J. J. Steroid Biochem., 1977, v. 8, p. 683.

49.	Baba S., Shinohara Y., Kasuya Y. J. Chromat., 1979, v. 162, p. 529.

49a. Baba S., Shinohara Y., Kasuya Y. J. Clin. Endocrin. Metab., 1980, v. 50,.
p. 889.

50.	Babjuk J., Starka L., Tuckova M., Jirkalova V. Ergeb. Exp. Med., 1975,.
v. 20, p. 74.

51.	Baggett B., Engel L.	L., Fielding L. L. J.	Biol.	Chem., 1955, v.	87, p. 213.

52.	Bagon	K. R., Hammond E. W. Analyst,	1978,	v. 103, p. 156.

53.	Bailey F., Brittain P. N. J. Chromat., 1973, v. 83, p. 431.

54.	Bailey	E., Fenoughty	M., Chapman J. R.	J. Chromat., 1974, v.	96, p. 33.

55.	Baillie	T. A., Brooks	C. J. W., Horning	E. C.	Anal. Letters,	1972, v. 5,

p. 351.

55a. Bajaj K. L., Ahuja K. L. J. Chromat., 1979, v. 172, p. 417.

56.	Baker D. R., Henry R. A., Williams R. C., Hudson D. R. J. Chromat.,,
1973, v. 83, p. 233.

57.	Ball P., Emons G., Haupt O., Hoppen H. O., Knuppen R. Steroids, 1978,
v. 31, p. 249.

57a. Bamberg E., Mostl E., El Din Hassan N., Stokl W., Choi H. S. Clin.
Chim. Acta, 1980, v. 108, p. 479.

58.	Banes D. J. Am. Pharm. Ass., Sci. Ed., 1950, v. 39, p. 37.

58a. Barron J. L., Maxwell J., Millar R. P. S. Afr. Med. J., 1979, v. 56, p. 761.

59.	Bartos J. Ann. Pharm. Franc., 1959, v. 17, p. 141.

60.	Bartos J., Pesez M. Colorimetric and Fluorimetric Analysis of Steroids.
Academic Press, London, New York, San Francisco, (a), 1976, p. 21.

61.	Bastow R. A. J. Pharm. Pharmacol., 1967, v. 19, p. 41.

62.	Batra S. J. Steroid. Biochem., 1976, v. 7, p. 131.

63.	Bauld W. S. Biochem. J., 1954, v. 56, p. 426.

64.	Beastall G. H., McVeigh S. Clin. Chim. Acta, 1976, v. 70, p. 343.

65.	Becker A., Ehringer F. Z. Anal. Chem., 1963, v. 198, p. 162.

66.	Becker A., Kathriner A. Z. Anal. Chem., 1961, v. 183, p. 356.
67.	Bedolla-Tovar N., Rahman S. A., Cekan S. Z., Diczfalusy E. J. Steroid.
Biochem., 1978, v. 9, p. 561.

68.	Begue R. J., Brun J. M., Moriniere M., Padieu P. J. Steroid. Biochem.,
1977, v. 8, p. 737.

*69. Belal S., Elnenaey E. A. Pharmazie, 1977, v. 32, p. 125.

70.	Bellomonte G. Ann. 1st. Super. Sanita, 1971, v. 7, p. 102.

71.	Bermudez J. A., Coronado V., Mijares A. J. Steroid. Biochem., 1975, v. 6,
p. 283.

72.	Bernstein S., Lenhard R. H. J. Org. Chern., 1954, v. 19, p. 1269.

73.	Berthou F., Picart D., Bardou L., Floch H. H. J. Chromat., 1976, v. 118,
p. 135.

74.	Beyer W. F. J. Pharm. Sci., 1968, v. 57, p. 1415.

75.	Beyermann K, Roder E. Z. Anal. Chern., 1968, v. 230, p. 347.

76.	Bezelj M., Bosch M. W. Z. Klin. Chern. Klin. Biochem., 1975, v. 13, p. 381.

77.	Bhacca N. S., Williams D. H. Applications of NMR Spectroscopy in Or-
ganic Chemistry. Holden-Day, San Francisco, 1964.

78.	Bican-Fister T. J. Chromat., 1966, v. 22, p. 465.

79.	Bican-Fister T. J. Pharm. Sci., 1968, v. 57, p. 169.

£0. Birmingham M. K, Traikov H., Ward P. J. Steroids, 1963, v. 1, p. 463.

81. Bishara R. FL, Rutherford B. S., Dinner A. J. Pharm. Sci., 1975, v. 64,
p. 1210.

82.	Bjorkhem L, Blomstrand R., Lantto 0. Clin. Chim. Acta, 1975, v. 65,
p. 343.

83.	Bjorkhem L, Blomstrand R., Svensson L., Tietz F., Carlstrom К Clin.
Chim. Acta, 1975, v. 62, p. 385.

S4.	Bjorkhem L, Lantto	0.,	Svensson L. Clin. Chim.	Acta,	1975,	v.	60,	p.	59.

85.	Blair I. A., Phillipou	G.	J. Chromat. Sci., 1977, v.	15, p.	478.

86.	Blair I. A., Phillipou	G.	J. Chromat. Sci., 1978, v.	16, p.	201.

87.	Boar er C. D. FL, Hatter sley J. J. P. Med. Lab.	Sci., 1978,	v.	35,	p.	379.

88.	Bogdarin Y. A. Probl. Endokrinol., 1978, v. 24, p. 48.

89.	Bongiovanni A. M., Eberlein W. R., Thomas P. Z. J. Clin. Endocrinol
Metal., 1957, v. 17, p. 331.

90.	Bongiovanni A. M., Parks J. S., Ranke M., Kirkland R., Vaidya V., Te-
rore A. J. Steroid. Biochem., 1974, v. 5, p. 467.

SI.	Boreham D. R., Vose C. W., Palmer R. F., Brooks C. J. W„ Balasubra-
manian V. J. Chromat, 1978, v. 153, p. 63.

92. Boscott R. J. Nature, 1949, v. 164, p. 140.

S3.	Bosch A. M. G., Van Hell H., Brands J., Schuurs A. H. W. M. In PalS.B.
(Editor). Enzyme Labelled Immunoassay of Hormones and Drugs.
De Gruyter, Berlin, New York, 1978, p. 175.

S4.	Bottema J. &, Beiderock W. J. Clin. Chim. Acta, 1976, v. 68, p. 199.

S5.	Boughton 0. D., Bryant R., Ludwig W. J., Timma D. L. J. Pharm. Sci.,
1966, v. 55, p. 951.

S6.	Bowman M. C., Nony C. R. J. Chromat. Sci., 1977, v. 15, p. 160.

97. Bradshaw L. Nature, 1961, v. 190, p. 809.

S8.	Bramhall J., Britten A. Z. Clin. Chim. Acta, 1976, v. 68, p. 203.

99.	Brezina M., Volke J., Volkova V. Coll. Czech. Chern. Comm., 1954, v. 19,
p. 894.

100.	Brezina M., Zuman P. Die Polarographie in der Medizin, Biochemie und
Pharmazie. Akademische Verlagsgesellschaft, Leipzig, 1956, pp. 399—414.

101.	British Pharmacopoeia 1980, HM Stationary Office, London, a) V. I,
p. 310, б) V. II, p. 641, в) V. II, p. 768.

102.	British Pharmacopoeia 1973. Addendum 1975, HM Stationary Office, Lon-
don, a) p. 18, 6) p. 39.

102a. Brooks C. J. W., Cole W. J., McIntyre H. B., Smith A. G. Lipids, 1980,
v. 15, p. 745.

103.	Brooks C. J. W., Harvey D. J. Steroids, 1970, v. 15, p. 283.
104.	Brooks С. J. W., Middletich В. S. Anal. Letters, 1972, v. 5, р. 611.

105.	Brooks С. J. W., Middletich В. S. In Heftmann E. (Editor). Modern Me-
thods of Steroid Analysis, Academic Press, New York, London, 1973,
pp. 140—188.

105a. Brooks M. A., Dixon R. J. Chromat., 1980, v. 182, p. 387.

106.	Brown J. B. J. Endocrinol., 1952, v. 8, p. 196.

107.	Brown J. B. Biochem. J., 1955, v. 60, p. 185.

108.	Brunner Ch. A. J. Ass. Off. Anal. Chern., 1971, v. 54, p. 590.

109.	Brunner Ch. A., Kunze F. M. J. Ass. Off. Anal. Chern., 1970, v. 53, p. 234.

110.	Brushi F. Bull. Chim. Farm., 1966, v. 105, p. 237.

111.	Buckle J. W., Jack P. M. B., Nathanielsz P. W. J. Physiol., 1974, p. 242,
p. 56 P.

112.	Budzikiewicz H. In Waller R. G. (Editor), Biochemical Applications of
Mass Spectrometry, Wiley-Interscience, New York, London, Sydney, To-
ronto, 1972, pp. 251—290.

113.	Budzikiewicz H., Djerassi C., Williams D. H. Structure Elucidation of
Natural Products by Mass Spectrometry. V. II, Holden-Day, San Fran-
cisco, 1964.

114.	Budzikiewicz H., Djerassi C., Williams D. H. Mass Spectrometry of Or-
ganic Compounds, Holden Day, San Francisco, 1967.

115.	Bunter B., Sliwinski A. Endocrinol., 1975, v. 66, p. 24.

116.	Bush I. E. Fed. Proc., 1953, v. 12, p. 186.

117.	Bush I. E. The Chromatography of Steroids. Pergamon Press, Oxford,
1961.

118.	Butterfield A. G., Lodge B. A., Pound N. J. J. Chromat. Sci., 1973, v. 11,
p. 401.

119.	Butterfield A. G., Lodge B. A., Pound N. J., Sears R. W. J. Pharm. Sci.,
1975, v. 64, p. 441.

120.	Cahen R. I., Salter W. T. J. Biol. Chern., 1944, v. 152, p. 489.

121.	Callow N. H., Callow R. K-, Emmens C. W. Biochem. J., 1938, v. 32,
p. 1312.

122.	Cameron E. H. D., Hillier S. G., Griffiths K. (Editors). Steroid Immu-
noassay. Alpha Omega Publ., Cardiff, 1975.

123.	Cameroni R., Gamberini G., Ferioli V., Barnabei M. T., Cop pi G. Far-
maco, Ed. Pr., 1978, v. 33, p. 291.

124.	Campbell D. G., Gardner G. Clin. Chim. Acta, 1971, v. 32, p. 153.

125.	Cantin D., Alary J., Coeur A. J. Pharm. Belg., 1977, v. 32, p. 255.

126.	Carignan G., Lanouette M., Lodge B. A. J. Chromat., 1977, v. 135, p. 523.

127.	Carignan G., Curran N. M., Lodge B. A., McErlane К. M. Can. J. Pharm.
Sci., 1978, v. 13, p. 73.

128.	Carignan G., Lanouette M., Lodge B. A. Can. J. Pharm. Sci., 1977, v. 12,
p. 106.

129.	Carignan G., Lodge B. A. Can. J. Pharm. Sci., 1976, v. 11, p. 76.

129a	. Carignan G., Lodge B. A. J. Chromat., 1979, v. 179, p. 184.

1296.	Carignan G., Lodge B. A. J. Pharm. Sci., 1980, v. 69, p. 1453.

129b. Carignan G., Lodge B. A., Skakum W. Can. J. Pharm. Sci., 1980, v. 15,
p. 10.

129r. Carignan G., Lodge B. A., Skakum W. J. Pharm. Sci., 1980, v. 69, p. 1214.
129д. Carignan G., Lodge B. A., Skakum W. J. Chromat., 1981, v. 206, p. 174.
130. Carlstrom C., Skoldefors H. J. Steroid. Biochem., 1977, v. 8, p. 1127.

131.	Carol J., Kunze F. M., Banes D., Graham J. H. J. Pharm. Sci., 1961,
v. 50, p. 550.

132.	Carol J., Molitor J. C., Haenni E. 0. J. Am. Pharm. Ass., Sci. Ed., 1948,
v. 37, p. 173.

133.	Carol J., Rotondaro F. A. J. Am. Pharm. Ass., Sci. Ed., 1946, v. 35, p. 176.

134.	Carstensen H., Backstroem T. J. Steroid. Biochem., 1976, v. 7, p. 145.
135.	Caspi Е., Scrimshaw G. F. In Carstensen H. (Editor), Steroid Hormone
Analysis. Marcel Dekker, New York, 1967, pp. 55—92.

136.	Caspi E., Wittstruck Th. In Carstensen H. (Editor). Steroid Hormone
Analysis. Marcel Dekker, New York, 1967, pp. 93—133.

137.	Cavina G., Cingolani E., Amormino V., Giraldez H. Farmaco Ed. Pr.,
1962, v. 17, p. 393.

138.	Cavina G., Cingolani E., Giraldez H. Farmaco Ed. Pr., 1962, v. 17, p. 49.

139.	Cavina G., Moretti G. J. Chromat., 1966, v. 22, p. 41.

140.	Cavina G., Moretti G., Petrella M. J. Chromat., 1975, v. 103, p. 368.

141.	Cavina G., Moretti G., Siniscalchi P. J. Chromat., 1970, v.'47, p. 186.

142.	Cekan S. Z. J. Steroid Biochem., 1979, v. 11, p. 135.

143.	Chafetz L., Boudjouk M. G., Tsilifonis D. C., Foo Song Hom. J. Pharm.
Sci., 1968, v. 57, p. 1000.

144.	Chafetz L., Tsilifonis D. C., Riedl J. M. J. Pharm. Sci., 1972, v. 61,
p. 148.

145.	Chambaz E. M., Defaye G.t Madani C. Anal. Chern., 1973, v. 45, p. 1090.

146.	Chambaz E. M., Horning E. C. Anal. Letters, 1968, v. 1, p. 201.

147.	Chapman J. R., Bailey E. Anal. Chern., 1973, v. 45, p. 1636.

148.	Chatten L. G., Triggs E. J., Glowach S. J. J. Pharm. Belg., 1976, v. 31,
p. 63.

149.	Chatten L. G., Yadav R. N., Madan D. R. Pharm. Acta Helv., 1976, v. 51,
p. 381.

150.	Chatten L. G., Yadav R. N., Binnington S., Moskalyk R. E. Analyst, 1977,
v. 102, p. 323.

151.	Chattoraj S. C., Fanous A. S., Cecchini D., Lowe E. W. Steroids, 1978,
v. 31, p. 375.

152.	Chayen R., Gould S.t Harell A., Stead С. V. Anal. Biochem., 1971, v. 39,
p. 533.

153.	Chevins R., Launay J. M., Julien R., Dreux C. Clin. Chim. Acta, 1974,
v. 55, p. 333.

154.	Chissel J. F. J. Pharm. Pharmacol., 1964, v. 16, p. 490.

155.	Clark S. J., Wotiz H. H. Steroids, 1963, v. 2, p. 56. .

156.	Clark S. J., Wotiz H. H. Steroids, 1963, v. 2, p. 535.

157.	Clark S. J., Wotiz H. H. In Heftmann E. (Editor). Modern Methods of
Steroid Analysis. Academic Press, New York, London, 1973, pp. 72—102.

158.	Cochran R. C., Ewing L. L. J. Chromat., 1979, v. 173, p. 175.

159.	Cochran R. C., Darney R. J., Ewing L. L. J. Chromat., 1979, v. 173, p. 349.

160.	Coda L., Timallo L. Bull. Chim. Farm., 1976, v. 115, p. 515.

161.	Cohen H, Bates R. W. J. Am. Pharm. Ass., Sci. Ed., 1951, v. 40, p. 35.

162.	Cohen S., Raluszyner A. Anal. Chern., 1957, v. 29, p. 161.

163.	Collins W. P., Hennam J. F., Tyler J. P. P., Barnard G. J. R. In Paster-
nak C. A. (Editor). Radioimmunoassay in Clinical Biochemistry. Heyden
and Sun, London, New York, Rheine, 1975, p. 153.

164.	Comer J. P., Hartsaw P., Stevenson С. E. J. Pharm. Sci., 1968, v. 57,
p. 147.

165.	Cook С. E., Odiorne T. J., Dickey M. C., Twine M.	E.,	Pellizzari E. D.,

Wall M. E., Bressler R. Life Sci., 1974, v. 15, p. 1621.

166.	Cooke B. A. Anal. Biochem., 1969, v. 32, p. 198.

167.	Corker C. S., Davidson D. W. J. Steroid Biochem., 1978,	v.	9,	p. 373.

168.	Corpechot C., Eychenne B., Robel P. Steroids, 1977,	v.	29,	p.	503.

169.	Crepy O., Jayle M. F. Ann. Biol. Clin., 1953, v. 11, p. 233.

170.	Cross J. M., Eisen H., Redersha R. G. Anal. Chern., 1952, v. 24, p. 1049.

171.	Csizer Ё., Gorog S. Anal. Chim. Acta, 1976, v. 86, p. 217.

172.	Csizer Ё., Gorog S., Szen T. Microchim. Acta, 1970, p. 996.

173.	Csizer Ё., Gorog S., Gyenes I. Acta Chim. Hung., 1972, v. 73, p. 175.

174.	Dahldf C. G., Lundborg P., Persson B. A., Regardh C. G. Drug Metab.
Disp., 1979, v. 7, p. 103.
175.	Daley J. D., Rosenfeld J. М., Young Lai E. V. Steroids, 1976, v. 27,
p. 481.

176.	Das Gupta V., Ghenakar A. G. J. Pharm. Sci., 1978, v. 67, p. 889.

177.	Deelder R. S., Ratnaekers J. J. M., Van den Berg J. H. M., Wetzels M. L.
J. Chromat., 1976, v. 119, p. 99.

178.	De Graeve J., Kremers P., Gielen J. E. Eur. J. Biochem., 1977, v. 74,
p. 561.

179.	Dehennin L., Scholler R. J. Chromat., 1975, v. Ill, p. 238.

180.	Dehennin L., Reiffsteck A., Scholler R. J. Chromat. Sci., 1972, v. 10,
p. 224.

181.	Dehennin L., Reiffsteck A., Scholler R. J. Steroid Biochem., 1974, v. 5,
p. 81.

182.	Den K., Matsumoto H., Masuda T., Okado T., Yoshida T., Tagaki S.,
Kokubu T., Kambegawa A. Horumon To Rinsho, 1977, v. 25, p. 465.

183.	Derks H. J. G. M., Muskiet F. A. J., Drayer N. M. Anal. Biochem., 1976,
v. 73, p. 391.

184.	Dertinger	G.,	Scholz H. Dt. Apoth. Ztg., 1973, v. 113, p. 1735.

185.	Des fosses	B.,	Condom R.,	Emiliozzi R. J. Chromat., 1968, v. 38,	p.	290.

186.	Dessypris	A.,	Adlercreutz	H., J. Steroid Biochem., 1972, v. 3, p.	19.

187.	Dessypris	A.,	Reponen A.,	Karonen S. L., Adlercreutz H. J. Steroid.	Bio-

chem., 1972, v. 3, p. 943.

187a. De Soto Perera M. A., Curran D. J. Anal. Chim. Acta, 1980, v. 119,
p. 263.

188.	Detter F.. Kingmuller V. Clin. Chim. Acta, 1967, v. 15, p. 581.

189.	Devaux P. G., Horning M. G., Hill R. M., Horning E. C. Anal. Biochem.,
1971, v. 41, p. 70.

189a. Dixon P. F., Lukha P., Scott N. R. Proc. Anal. Div. Chern. Soc., 1979,
v. 16, p. 302.

190.	Devaux P. G., Horning M. G., Horning E. C. Anal. Letters, 1971, v. 4,
p. 151.

191.	Devaux P. G., Horning E. C. Anal. Letters, 1969, v. 2, p. 637.

192.	Deys H. P., Pinxerten J. A. C. Pharm. Weekblad, 1958, v. 93, p. 760.

193.	Diding E. Svensk Farm. Tidskr., 1952, v. 56, p. 3.

194.	Diding E., Sandstrom H., Ostelius J., Karlen B. Acta Pharm. Suec., 1976,
v. 13, p. 55.

195.	Djerassi C., Ryan E. J. Am. Chern. Soc., 1949, v. 71, p. 1000.

196.	Dobriner K-, Katzellenbogen E. R., Jones R. N. Infrared Absorption
Spectra of Steroids. V. I. Wiley-Interscience, New York, 1953.

197.	Dolphin R. J., Pergande P. J. J. Chromat., 1977, v. 143, p. 267.

198.	Dominguez О. V. Paper Chromatography. In Carstensen H. (Editor). Ste-
roid Hormone Analysis. Marcel Dekker, New York, 1967, pp. 135—318.

198a. Donike M., Zimmermann J. J. Chromat., 1980, v. 202, p. 483.

199.	Dorfman L. Chern. Rev., 1953, v. 53, p. 47.

200.	Дозорова И. И., Чистотинова Л. Т., Либерман Е. В. Хим. фарм. ж., 1977,
т. II, с. 129.

201.	Durham В. Н. Med. Lab. Sci., 1978, v. 35, p. 321.

202.	Dusinsky G., Radejova E. Farm. Obz., 1977, v. 46, p. 225.

203.	Dusza J. P., Heller M., Bernstein S. In Engel L. L. (Editor). Physical
Properties of Steroid Hormones. Pergamon Press, Oxford, London, New
York, Paris, 1963, pp. 69—287.

204.	Dilrbeck H. W., Bilker I., Scheulen S., Telin B. In Schomburg G., Rohr-
schneider L. (Editors). Chromatography, Elsevier, Amsterdam, 1978,
p. 143.

205.	Durbeck H. W., Frischkorn C. G. B., Frischkorn H. E. Deutsche Z. Sport-
med., 1978, v. 29, p. 97.

206.	Dvir R., Chayen R. J. Chromat., 1969, v. 45, p. 76.
207.	Dvorak Р., Hampl R., Lukesova S., Kozak I., Chropova M., Starka I.
Radiochem., Radioanal. Lett., 1978, v. 34, p. 295.

208.	Eaborn C., Holder C. A., Walton D. R. M., Thomas B. S. J. Chem. Soc.,
1969, p. 2502.

209.	Edmonds C. G., Brooks C. J. W. J. Chromat., 1976, v. 116, p. 173.

210.	Edwards R. W. H. J. Chromat., 1978, v. 153, p. 1.

211.	Egert D. J. Chromat., 1977, v. 135, p. 481.

212.	Egg D., Loewit K, Rumpl E. Endokrinologie, 1975, v. 65, p. 7.

213.	Egger H. J., Reiner J., Spiteller G. J. Chromat. Biomed. Appl., 1978,
v. 145, p. 359.

214.	Egloff M., Degrelle H., Jayle M. F. Clin. Chim. Acta, 1975, v. 59, p. 147.

215.	Ehrsson H., Walle T., Wikstrom S. J. Chromat., 1974, v. 101, p. 206.

216.	Eik-Nes К В., Horning E. C. Gas Phase Chromatography of Steroids.
Springer Verlag, Berlin, 1968.

217.	Eisenbrand J., Picher H. Z. Physiol. Chem., 1939, v. 260, p. 83.

218.	Ekeke G. I., Exley D. In Pal S. B. (Editor), Enzyme Labelled Immu-
noassay of Hormones and Drugs. De Gruyter. Berlin, New York, 1978,
p. 195.

219.	Eldawy M. A., Tawfik A. S., Elshabouri S. R. J. Pharm. Sci., 1975, v. 64,
p. 1221.

219a. Elsayed M. A., Alioke O. A. Acta Pharm. Yugoslav., 1979, v. 29, p. 145.

220.	Engelhardt H. Z. Anal. Chem., 1975, v. 277, p. 267.

221.	Engelhardt H., Asshauer J., Neue U., Weigand N. Anal. Chem., 1974,
v. 46, p. 336.

222.	Epstein E. Clin. Chim. Acta, 1962, v. 7, p. 735.

223.	Ercoli A., De Ciuseppe L., De Ruggieri P. Farm. Sci. e Tec. (Pavia),
1952, v. 7, p. 170.

224.	Ercoli A., Vitali R., Gardi R. Steroids, 1964, v. 3, p. 479.

225.	Ермакова В. К, Дозорова И. И., Шашкина Л. Ф. Хим. фарм. ж., 1977,
т. II, с. 132.

226.	Exley D., Dutton A. Steroids, 1969, v. 14, р. 575.

227.	Exley D. In Pasternak C. A. (Editor). Radioimmunoassay in Clinical
Biochemistry. Heyden and Son, London, New York, Rheine, 1975, p. 141.

228.	Fahmy E., Yassa D. A., Wahba N. Analyst, 1974, v. 99, p. 759.

229.	Fahmy E., Yassa D. A., Wahba N. Analyst, 1976, v. 101, p. 616.

230.	Fairclough R. J., Rabjohns M. A., Peterson A. J. J. Chromat., 1977, v. 133,
p. 412.

231.	Fales H. M., Luukkainen T. Anal. Chem., 1965, v. 37, p. 955.

232.	Fantl V., Gray С. H. Clin. Chim. Acta, 1977, v. 79, p. 237.

233.	Faredin I., Toth I. Acta Med. Acad. Sci. Hung., 1964, v. 20, p. 193.

234.	Farhi R. L., Monder C. Anal. Biochem., 1978, v. 90, p. 58.

235.	Feher T., Bodrogi L., Feher K. G., Poteczin Ё. Chromatographia, 1977,
v. 10, p. 86.

236.	Feher T., Bodrogi L. Acta Pharm. Hung., 1976, v. 46, p. 73.

.237.	Feher	T.,	Bodrogi L., Vdradi A. J. Chromat., 1976, v. 123, p.	460.

238.	Feher	T.,	Feher	K. G., Bodrogi L. J. Chromat., 1975, v. Ill,	p. 125.

239.	Feher	T.,	Sdrfy	E. Acta Pharm. Hung., 1974, v. 44, p. 168.

240.	Feldkamp	C. S.,	Epstein E., Thibert R. J., Zak B. Clin. Chem.,	1975,	v. 21,

p. 1023.

241.	Feldkamp C. S., Epstein E., Thibert R. J., Zak B. Microchem. J., 1976,
v. 21, p. 45.

:242	. Feldkamp C. S., Epstein E., Thibert R. J., Zak B. Mikrochem. J., 1975,
v. 20, p. 523.

243.	Feldkamp C. S., Watkins R. E., Thibert R. J., Epstein E., Zak B. Mikro-
chem. J., 1977, v. 22, p. 201.

244.	Feis J. P., Dehennin L., Scholler R. J. Steroid Biochem., 1975, v. 6,
p. 1201.
245.	Fenimore D. С., Davis С. М., Whitford J. Н., Harrington С. A. Anal.
Chem., 1976, v. 48, рТ’5289.

246.	Fernandez A. A., Noceda V. Т. J. Pharm. Sci., 1969, v. 58, p. 740.

247.	Fingerova	H. Radiochem. Radioanal. Lett.,	1978, v.	34,	p.	261.

247a.	Finlay E.	M. H., Gaskell S. J. Clin. Chem.,	1981, v.	27,	p.	1165.

248.	Fischer P.	Schweiz. Apoth. Ztg., 1973, v. Ill,	p. 703.

249.	Fisher R.	A., Anderson D. C., Burke C. W.	Steroids,	1974,	v. 24, p. 809.

250.	Fishmann J. In Feftmann E. (Editor). Modern Methods of Steroid Ana-
lysis. Academic Press, New York, London, 1973, pp. 399—417.

251.	Fishman S. J.	Pharm. Sci., 1975, v. 64, p. 674.

252.	Fitzpatrick F.	A. Clin. Chem., 1973, v. 19, p. 1293.

253.	Fitzpatrick F.	A., Siggia S., Dingman J. Anal. Chem.,	1972, v. 44, p. 2211.

254.	Fitzpatrick F.	A., Siggia S. Anal. Chem., 1973, v. 45,	p.	2310.

255.	Forist A. A. Anal. Chem., 1959, v. 31, p. 913.

256.	Forist A. A., Johnson J. L. Steroids. In Higuchi T., Brochmann-Hanssen E.
(Editors). Pharmaceutical Analysis. Interscience. New York, London, 1961,
pp. 69—136.

257.	Forist A. A., Judy R. W. Anal. Letters, 1974, v. 7, p. 419.

258.	Forist A. A., Theal S. J. Pharm. Sci., 1958, v. 47, p. 520.

259.	Foster R., Mackie R. К Tetrahedron, 1963, v. 19, p. 691.

260.	Fotherby K-> Warren R. J., Shrimanker K, Siekmann L., Siekmann A.,
Breuer H. J. Steroid Biochem., 1979, v. 10, p. 121.

260a. Fotsis T., Adlercreutz H., Jarvenpaa P., Setchell K. D. R., Axelson M.,
Sjovall J, J. Steroid Biochem., 1981, v. 14, p. 457.

2606. Fotsis T„ Jarvenpaa P., Adlercreutz H., J. Clin. Endocrin. Metab., 1980,
v. 51, p. 148.

260b. Fotsis T., Jarvenpaa P., Adlercreutz H. Steroid Biochem., 1980, v. 12,
p. 503.

260r. Fowler R. T., Lever M., Munster D. J., Brown J. D. Clin. Chim. Acta,
1980, v. 103, p. 175.

261.	France J. T., Knox B. S. J. Gas. Chromat., 1966, v. 4, p. 1973.

261a. Frank J. Chimia, 1981, v. 35, p. 24.

262.	Fransson B., Wahlund K- G., Johansson I. M., Schill G. J. Chromat.,
1976, v. 125, p. 327.

263.	Freymann E., Hubl W., Buchner M., Bellee H. Zentralbl. GynaekoL, 1977,
v. 99, p. 321.

264.	Friedrich E., Siekmann L., Schindler A. E. Clin. Chim. Acta, 1974, v. 56,
p. 127.

265.	Frischkorn C.	G. B., Diirbeck H.	W. Z. Anal. Chem., 1978, v.	290, p. 160.

266.	Frischkorn C.	G. B., Frischkorn	H. E. J. Chromat., 1978, v.	151, p. 331.

267.	Frye R., Fong	P. F., Johnson G.	F., Rock R. C. Clin. Chem.,	1977, v. 23,

p. 1819.

268.	Gajewska M.,	Giewartowska M.	Farm. Polska, 1971, v. 27, p.	163.

269.	Gajewska M.,	Lugowska E., Tomaszewska E. Chem. Anal.	(Warsaw),

1975, v. 20, p. 615.

270.	Gajewska M., Plosso H. Farm. Polska, 1971, v. 27, p. 41.

271.	Сап1ё5 P., Juhdsz J. P. Ann. Pharm. Franc., 1966, v. 24, p. 687.

272.	Garatt D. C. The Quantitative Analysis of Drugs. Chapman and Hall,
London, 1964, p. 583.

272a. Gaskell S. J., Pike A. W., Griffiths К Steroids, 1980, v. 36, p. 219.

2726.	Gasparrini F., Cacchi S., Caglioti L., Misiti D., Giovannoli M. J. Chro-
mat., 1980, v. 194, p. 239.

273.	Gazdag M., Szepesi G., Nyiredy Sz. Z. Anal. Chem., 1977, v. 288, p. 281.

274.	Gelbke H. P., Loffler H., Knuppen R. Acta Endocrinol., 1976, v. 82,
p. 36.

275.	Gelbke H. P., Knuppen R. J. Steroid Biochem., 1974, v. 5, p. 1.

276.	Gelbke H. P., Stubenrauch G. J. Chromat., 1976, v. 120, p. 239.
277.	Gergely A., Szasz Gy., Nagy J. Magy. Kem. Foly., 1976, v. 82, p. 363.

278.	Gergely A., Szasz Gy., Spdnyik I. Acta Pharm. Hung., 1976, v. 46, p. 254.

279.	Gergely A., Szasz Gy. Magy. Kem. Foly., 1978, v. 84, p. 141.

279a. Gips H., Korte K., Meinecke B., Bailer P. J. Chromat., 1980, v. 193,
p. 322.

2796. Gluck J. A. P., Shek E. J. Chromat. Sci., 1980, v. 18, p. 631.

280.	Gochman N., Gantt C. L. J. Pharmacol. Exp. Ther., 1962, v. 135, p. 312.

281.	Godbille E., Devaux P. J. Chromat. Sci., 1974, v. 12, p. 564.

282.	Godbille E., Devaux P. J. Chromat., 1976, v. 122, p. 317.

283.	Goertz G. R., Crepy О. C., Judas О. E., Longchampt J. E., Jayle M. F.
Clin. Chim. Acta, 1974, v. 51, p. 277.

284.	Gold M., Mathew G. Clin. Biochem., 1977, v. 10, p. 191.

285.	Golder W. A., Sippet W. G. J. Chromat., 1976, v. 123, p. 293.

286.	Goldzieher J. W. Fluorescence Spectra. In Engel L. L. (Editor). Physical
Properties of Steroid Hormones. Pergamon, Oxford, London, New York,
Paris, 1963, pp. 288—320.

287.	Gonnet C., Rocca J. L. J. Chromat., 1976, v. 120, p. 419.

288.	Gornall A. G., MacDonald M. P. J. Biol. Chern., 1953, v. 201, p. 279.

288a. Goto J., Komatsu S., Goto N., Nambara T. Chern. Pharm. Bull., 1981,
v. 29, p. 899.

289.	Goutte-Coussieu C., Habrioux G., Eichenberger D., Jayle M. F. Clin.
Chern., 1979, v. 25, p. 230.

289a. Goutte-Coussieu C., Sanchez D., Adessi G., Jayle M. F. Clin. Chern., 1980,
v. 26, p. 190.

290.	Gotelli G. R., Wall J. H., Kabra P. M., Marton L. J. Clin. Chern., 1978,
v. 24, p. 2132.

291.	Gotelli G. R., Kabra P. M., Marton L. J. Clin. Chern., 1977, v. 23, p. 165»

292.	Gorog S.	Acta Chim. Hung.,	1966, v.	47,	p. 1.

293.	Gorog S.	Acta Chim. Hung.,	1966, v.	47,	p. 7.

294.	Gorog S.	Acta Chim. Hung.,	1967, v.	51,	p. 221.

295.	Gorog S.	J. Pharm. Sci., 1968, v. 57,	p. 1737.

296.	Gorog S.	Acta Chim. Hung.,	1969, v.	61,	p. 341.

297.	Gorog S. J. Pharm. Pharmacol., 1969, v. 21, p. 468.

298.	Gorog S. Anal. Chern., 1970, v. 42, p. 560.

299.	Gorog S. Analyst, 1971, v. 96, p. 437.

300.	Gorog S. Steroids, 1968, v. 11, p. 93.

301.	Gorog S. Analyst, 1976, v. 101, p. 512.

302.	Gorog S. Zbl. Pharm., 1977, v. 116, p. 259.

302a. Gorog S. CRC Crit. Rev. Anal. Chern., 1980, v. 9, p. 333.

3026. Gorog S. Z. Anal. Chern., 1981, v. 309, p. 97.

303.	Gorog S., Csizer Ё. Acta Chim. Hung., 1970, v. 65, p. 41.

304.	Gorog S., Csizer Ё. Z. Anal. Chern., 1971, v. 254, p. 119.

305.	Gorog S., Foldes V. Acta Chim. Hung., 1966, v. 48, p. 249.

306.	Gorog S., Herenyi B. J. Chromat., 1978, v. 152, p. 240.

307.	Gorog S., Herenyi B. Abstr. Papers. ISM Conference. Davos, 1977, p. 142.

308.	Gorog S., Herenyi В. Неопубликованные результаты.

309.	Gorog S., Lauko A. J. Chromat., 1976, v. 118, p. 411.

310.	Gorog S., Lauko A., Sziklay Zs. Analyst, 1978, v. 104, p. 196.

311.	Gorog S., Lauko A., Herenyi B., Czira G., Csizer Ё., Tuba Z. Acta Chim.
Hung., 1979, v. 100, p. 377.

312.	Gorog S., Szdcz Gy. Analysis of Steroid Hormone Drugs. Akademiai
Kiado, Budapest, Elsevier, Amsterdam, 1978: a) pp. 181—194; 6) pp. 274—
394; в) pp. 137—172.

313.	Gorog S., Tomcsdnyi L. Acta Chim. Hung., 1966, v. 47, p. 121.

314.	Gorog S., Toth E., Torley J. Chern. Anal. (Warsaw), 1972, v. 17, p. 263.

315.	Graef V., Fuchs M. Z. Klin. Chern. Klin. Biochem., 1975, v. 13, p. 163.

316.	Graham J. H. J. Pharm. Sci., 1965, v. 54, p. 1665.
317.	Graham	J. Н. J.	Ass. Off.	Anal.	Chem., 1975,	v.	58,	p.	202.

318.	Graham	J. H. J.	Ass. Off.	Anal.	Chem., 1977,	v.	60,	p.	338.

319.	Graham	R. E., Kenner С.	T. J.	Pharm. Sci.,	1973,	v.	62, p. 1845.

320.	Graham	R. E.,	Biehl E.	R.t Kenner С. T.	J.	Pharm. Sci., 1979, v. 68,

p. 871.

321.	Grant J. K. (Editor). The Gas-Liquid Chromatography of Steroids. Cam-
bridge University Press, 1967.

322.	Greenstein B. D., Puig-Duran E., Franklin M. Steroids, 1977, v. 30, p. 331.

323.	Grob K.f Grob J. J. Chromat. Sci., 1969, v. 7, p. 584.

324.	Gupta D. (Editor). Radioimmunoassay of Steroid Hormones. Verlag Che-
mie, Weinheim, 1975.

325.	Gupta D., McCafferty E. Steroids, 1966, v. 8, p. 451.

326.	Habrioux G., Desfosses B., Condom R., Faure B., Jayle M. F. Steroids,
1978, v. 32, p. 61.

327.	Haenni E. O. J. Am. Pharm. Ass., Sci. Ed., 1950, v. 39, p. 544.

328.	Haenni E. 0., Carol J., Banes D. J. Am. Pharm. Ass., Sci. Ed., 1953, v. 42,
p. 162.

329.	Hdhnel R., Jones H. Clin. Chim. Acta, 1967, v. 16, p. 185.

329a. Haigh W. G., Hofman L. F., Barron E. J. Clin. Chem., 1980, v. 26,
p. 309.

330.	Hainsworth I. R., Hall P. E. Clin. Chim. Acta, 1971, v. 35, p. 201.

331.	Hakl J. J. J. Electroanaol. Chem., 1966, v. 11, p. 31.

332.	Hakl J. J. Chromat., 1977, v. 143, p. 317.

333.	Hakl J. J. Chromat., Biomed. Appl., 1977, v. 1, p. 317.

334.	Hall P. E. J. Steroid Biochem., 1979, v. 11, p. 113.

335.	Hammond G. L., Viinikka L., Vihko R. Clin. Chem., 1977, v. 23, p. 1250.

336.	Hammond J. E., Phillips J. C., Savory J. Clin. Chem., 1978, v. 24, p. 631.

337.	Hampl R., Picha J., Chundela B., Stranska I., Starka L. Radiochem. Radio-
anal. Lett., 1978, v. 34, p. 301.

338.	Hampl R., Picha J., Chundela B., Starka L. J. Clin. Chem. Clin. Biochem.,
1978, v. 16, p. 279.

338a. Hannak D., Gotze M. A., Kattermann R. Z. Anal. Chem., 1980, v. 301,
p. 131.

3386. Hanukoglu F, Jef coate C. R. J. Chromat., 1980, v. 190, p. 256.

339.	Hara S. J. Chromat., 1977, v. 137, p. 41.

340.	Hara S., Fujii Y., Hirasawa M., Miyamoto S. J. Chromat., 1978, v. 149,
p. 143.

341.	Hara S., Hayashi S. J. Chromat., 1977, v. 142, p. 689.

342.	Hara S., Mibe K. Chem. Pharm. Bull., 1975, v. 23, p. 2850.

343.	Hara S., Nakahata M. J. Liquid Chromat., 1978, v. 1, p. 43.

344.	Hdrkonen M., Adlercreutz H., Groman E. V. Steroid. Biochem., 1974, v. 5,
p. 717.

345.	Harvey	D.	J.	J.	Chromat.,	1978, v. 147,	p.	291.

345a.	Harvey	D.	J.	J.	Chromat.,	1980, v. 196,	p.	156.

346.	Hartman I. S.,	Wotiz H.	H Biochim.	Biophys.	Acta, 1964, v. 90, p. 334.

347.	Hassan	S.	S.	M. Z. Anal.	Chem., 1974,	v.	269,	p.	363.

348.	Hassan S. S. M., Abdel Fattah M. M., Zaki M. T. M. Z. Anal. Chem., 1976,
v. 281, p. 371.

349.	Hassan	S.	S. M., Zaki M. T. M. Taianta, 1976, v.	23,	p.	546.

350.	Hattori	T.,	Washio Y., Kamiya N., Itoh Y., Inoue	M.	J.	Pharm.	Soc.	Japan,

1979, v. 99, p. 537.

351.	Hayden	A.	L. J. Pharm. Sci., 1962, v. 51, p. 617.

352.	Hayden	A.	L., Sammul 0. R. J. Am. Pharm. Ass.,	Sci., Ed.,	1960,	v.	49,

p. 484.

353.	Headley S. K., Slikker W., Hill D. E. Teratology, 1979, p. 19, p. 30A.

354.	Heasman M. J., Wood A. J. J. Pharm. Pharmacol., 1971, v. 23, p. 176S.
355.	Heftmann Е. Chromatography of Steroids. Elsevier, Amsterdam, Oxford,
New York, 1976, pp. 29—44, 83—86, 91—92, 96—98.

356.	Heftmann E. J. Liquid Chromat., 1979, v. 2, p. 1137.

357.	Heikkila J., Adlercreutz H. J. Steroid. Biochem., 1970, v. 1, p. 243.

357a. Heikkinen R., Fotsis T., Adlercreutz H. Clin. Chern., 1981, v. 27, p. 1186.

358.	Heineman W. R., Anderson C. W.t Halsall H. B. .Science, 1979, v. 204,
p. 865.

359.	Heineman W. R., Halsall H. B., Anderson C. W. Abstr., Papers Am. Chern.
Soc. 177 Meet. Pt. 1 Anal. 176, 1979.

360.	Heizman R, J., Oettel G., Hoffmann B. J. Endocrinol., 1976, v. 69, p. 10.

361.	Helboe P., Thomsen M. Arch. Pharm. Chern. Sci. Ed., ,1978, v. 6, p. 57.

362.	Heller K., Wagner U. Z. Anal. Chern., 1959, v. 167, p. 90.

363.	Henderson G. D., Chesworth J. M. Lab. Pract., 1977, v. 26, p. 866.

364.	Henry R. A., Schmit J. A., Dieckman J. F. J. Chromat. Sei., 1971, v. 9,
p. 513.

365.	Hermansson J. J. Chormat., 1978, v. 152, p. 437.

365a. Hermansson J. J. Chromat., 1980, v. 194, p. 80.

366.	Heusgham C. J. Pharm. Belg., 1950, v. 5, p. 3.

367.	Heusgham C., Jehoite J. M. J. Pharm. Belg., 1957, v. 12, p. 418.

368.	Heusgham С., Vtiers M. J. Pharm. Belg., 1950, v. 5, p. 276.

369.	Hillier S. G., Brownsey B. G., Cameron E. H. D. Steroids, 1972, v. 21,
p. 735.

370.	Hilmer P. E., Hess W. C. Anal. Chern., 1949, v. 21, p. 822.

371.	Hinckley С. C. In Heftmann E. (Editor). Modern Methods of Steroid Ana-
lysis. Academic Press, New York, London, 1973, pp. 265—291.

371a. Hirai S., Hussain A., Babhair S. J. Pharm. Sci., 1980, v. 69, p. 857.

3716. Hiroshima 0., Ikenoya S., Ohmae M., Kawabe K. Chern. Pharm. Bull.,
1980, v. 28, p. 2512.

372.	Hoffmann B., Oettel G. Steroids, 1976, v. 27, p. 509.

373.	Hofmann H. Ergeb. Exp. Med., 1975, v. 20, p. 62.

374.	Holch K. Dansk Tidskr. Farm., 1972, v. 46, p. 169.

375.	Holder C. L., Blakemore W. M., Bowman M. C. J. Chromat. Sci., 1979,
v. 17, p. 91.

376.	Hollis D. P. In Heftmann E. (Editor). Modern Methods of Steroid Ana-
lysis. Academic Press, New York, London, 1973, pp. 245—264.

377.	Holsboer F., Knorr D. J. Steroid Biochem., 1977, v. 8, p. 1197.

378.	Hopkinson C. N. R., Park В. K-, Johnson M. W., Sturm G., Steinbach K-,
Hirschhaeuser C. J. Steroid Biochem., 1977, v. 8, p. 1253.

379.	Horgan E. D., Riley W. J. Clin. Chern., 1974, v. 20, p. 430.

380.	Horikawa R., Tanimura T., Tamura Z. Anal. Biochem., 1978, v. 85, p. 105.

381.	Horikawa R., Tanimura T., Tamura Z. J. Chromat., 1979, v. 168, p. 526.

382.	Horning M. G., Moss A. M., Boucher E. A., Horning E. C. Anal. Letters,
1968, v. 1, p. 311.

383.	Horning M. G., Moss A. M., Horning E. C. Anal. Biochem., 1968, v. 22, *
p. 284.

383a. Hosongadi B. D., Farias С. M. Ind. J. Pharm. Sci., 1980, v. 42, p. 124.

3836. Hosoda H., Yoshida H., Sakai Y„ Miyairi S., Nambara T. Chern. Pharm.

Bull., 1980, v. 28, p. 3035.

384.	Hoyer G. A., Junghans K-, Cleve G. Berichte, 1974, v. 107, p. 363.

385.	Hrdy 0. Coll. Czech. Chern. Comm., 1962, v. 27, p. 2447.

386.	Hsiu H. C. Japan Analyst, 1974, v. 23, p. 1266.

387.	Hsiu H. C. Japan Analyst, 1976, v. 25, p. 302.

388.	Huber J. F. K>> Alderlieste E. T., Harren H., Poppe H. Anal. Chern., 1973,
v. 45, p. 1337.

389.	Huber J. F. K-, Huisman J. A. R. J., Meijers С. A. M. J. Chromat., 1971,
v. 62, p. 79.

390.	Huck H. J. Chromat., 1975, v. 110, p. 125.
391.	Huettemann R. Е., Shroff А. Р. J. Chromat. Sci., 1975, v. 13, р. 357.

392.	Hughes Е. W., Lanouette M., Lodge B. A. Can. J. Pharm. Sci., 1978, v. 13,
p. 102.

393.	Hull M. G. R., Braunsberg H., Irving D. Clin. Chim. Acta, 1975, v. 58,
p. 71.

393a. Hunter I. R., Walden M. R., Heftmann E. J. Chromat, 1979, v. 176, p. 485.

394.	Huttenrauch R. Z. Physiol. Chern., 1961, v. 326, p. 166.

395.	Huttenrauch R. Arch. Pharm., 1962, v. 295, p. 721.

396.	Hdttenrauch R., Reiner I. Pharmazie, 1965, v. 20, p. 242.

397.	Ilea S., Dodica С., 1 ovanovici Z. Z. Klin. Chern. Llib. Biochem., 1970, v. 8,
p. 577.

397a. Isaaks J. T., McDermott I. R., Coffey D. S. Steroids, 1979, v. 33, p. 639.

398.	Ishinara T., Sugimoto I. Drug Develop. Ind. Pharm., 1979, v. 5, p. 263.

399.	Ito A., Amakasu 0. J. Pharm. Soc. Japan, 1957, v. 77, p. 1083.

400.	Ittrich G. Z. Physiol. Chern., 1958, v. 312, p. 1.

401.	Ittrich G. Acta Endocrinol., 1960, v. 35, p. 34.

402.	Ittrich G. Z. Physiol. Chern., 1960, v. 320, p. 103.

403.	Ittrich G. J. Clin. Chern. Clin. Biochem., 1977, v. 15, p. 629.

403a. Ittrich G. Endokrinologie, 1978, v. 72, p. 339.

404.	Ivashkiv E. Biotechn. Bioeng., 1961, v. 13, p. 561.

405.	Ivashkiv E. Appl. Microbiol., 1970, v. 20, p. 251.

406.	Jaakonmaki P. I., Yarger R. A., Horning E. C. Biochim. Biophys. Acta,
1967, v. 137, p. 216.

407.	Jacob R., Vogt W., Rnedel M. Ann. Chern., 1979, p. 878.

408.	Jacob R., Vogt W., Fischer L, Rnedel M. Tetrahedron Letters, 1975,
p. 1927.

409.	Jacob R., Vogt W. J. Chromat., 1978, v. 150, p. 339.

410.	Jakowicki J., Ervast H. S., Adlercreutz H. J. Steroid. Biochem., 1973,
v. 4, p. 181.

411.	James T. J. Pharm. Sci., 1970, v. 59, p. 1648.

412.	James T. J. Ass. Off. Anal. Chern., 1971, v. 54, p. 1192.

413.	James T. J. Pharm. Sci., 1972, v. 61, p. 1306.

414.	Janouskova M., Fingerova H., Talas M. Radiochem. Radioanal. Lett,
1978, v. 34, p. 289.

415.	J arc H., Ruttner O., Rrocza W. J. Chromat., 1977, v. 134, p. 351.

415a. Jarvenpaa P-, Fotsis T., Adlercreutz H. J. Steroid. Biochem., 1979, v. 11,
p. 1583.

4156. Jarvenpaa P., Rosunen T., Fotsis T., Adlercreutz H. J. Steroid. Biochem.,
1980, v. 13, p. 345.

416.	Jawad M. J., Wilson E. A., Rincaid H. L. Clin. Chem., 1979, v. 25, p. 99.

417.	Jayle M. F. Analyse des Steroides Hormonaux. Masson, Paris, 1962,
pp. 4—17, 25—39.

418.	Jayle M. F. Analyse des Steroides Hormonaux. V. III. Masson, Paris,
1965.

418a. Jeff coate S. L. (Editor). Recent Advances in Steroid Radioimmunoassay/
Proceedings of the Symposium on Radioimmunoassay and Related Pro-
cedures in Medicine. Berlin, 1977, IAEA Vienna, 1978.

419.	Joe H. T., Leach C. S., Lassiter С. B. Chromatographia, 1978, v. 11,
p. 671.

419a. Johnson D. W., Phillipou G., Blair I. A., Seamark R. F. Experientia,
1979, v. 35, p. 1261.

420.	Johnson L. P., Subba Rao S. C., Fenselau C. Anal. Chem., 1978, v. 50,
p. 2022.

421.	Johnson R. N., Masserano R. P., Haring R., Rho В. T., Shilling G.
J. Pharm. Sci., 1975, v. 64, p. 1007.

422.	Johnson R. N., Masserano R. P., Rho В. T., Adams W. P. J. Pharm.
Sci., 1978, v. 67, p. 1218.

13 Заказ № 182
423.	Jones Н. A., Hahnel R. Steroids, 1969, v. 13, p. 693.

424.	Joyce B. G., Fahmy D. J. Endocrinol., 1975, v. 65, p. 43 P.

425.	Joyce B. G., Read G. F., Fahmy D. R. J. Endocrinol., 1976, v. 71, p. 53 P.

426.	Joyce B. G., Read G. F., Fahmy D. R. Steroids, 1977, v. 29, p. 761.

427.	Joyce B. G., Turkes A., Ozoran A., Read G. F., Fahmy D. R. In Pal S. B.
(Editors). Enzyme Labelled Immunoassay of Hormones and Drugs.
De Gruyter, Berlin, New York, 1978, p. 247.

428.	Jucnge E. C., Brower J. F. J. Pharm. Sci., 1979, v. 68, p. 551.

429.	Julesz M., Toth J., Faredin J. Acta Med. Acad. Sci. Hung., 1972, v. 29,
p. 167.

430.	Kabasakalian P„ DeLorenzo S., McGlotten J. J. Anal. Chem., 1956, v. 28,
p. 1669.

431.	Kabasakalian P., McGlotten J. J. Am. Chem. Soc., 1956, v. 78, p. 8032.

432.	Kabasakalian P., McGlotten J. Anal. Chem., 1959, v. 31, p. 1091.

433.	Kabasakalian P., McGlotten J. Anal. Chem., 1962, v. 34, p. 1440.

434.	Kabasakalian P., Townley E. R., Yudis M. D. Anal. Chem., 1959, v. 31,
p. 375.

435.	Kadin H., Ugolini M. S., Roberts H. R. J. Pharm. Sci., 1964, v. 53, p. 13.

436.	Kagi H., Miescher K. Helv. Chim. Acta, 1939, v. 22, p. 683.

437.	Kakac B., Vejdelek Z. J. Handbuch der Kolorimetrie. VEB Gustav Fischer
Verlag. Jena, V. II, 1963, pp. 848—850, 896—897.

438.	Kakac B., Vejdelek Z. J. Handbuch der Photometrischen Analyse Orga-
nischer Verbindungen. Verlag Chemie, Weinheim, 1974.

439.	Kallner A., Lantto O. Clin. Chim. Acta, 1977, v. 79, p. 325.

440.	Kammerl E., Mutschler E. Pharm. Acta Helv., 1975, v. 50, p. 269.

440a. Kanluan T., Masironi B., Cekan S. Z. Clin. Chim. Acta, 1981, v. 109,
p. 169.

441.	Kaplan H. G., Капу L., Abraham R. Clin. Chim. Acta, 1974, v. 51, p. 113.

442.	Karch K-, Sebastian I., Haldsz I., Engelhardt H. J. Chromat., 1976, v. 122,
p. 171.

443.	Karim A., Hribar J., Aksamit W., Doherty M., Chinn L. J. Drug Metab.
Disp., 1975, v. 3, p. 467.

444.	Karkhanis P. P., Anfinsen J. R. J. Pharm. Sci., 1970, v. 59, p. 535.

445.	Kasler F. Quantitative Analysis by NMR Spectroscopy. Academic Press,
London, New York, San Francisco, 1973.

446.	Казаринов H. А., Дзюба H. 77. Мед. пром. СССР, 1965, т. 19, с. 47.

447.	Keay G. R. Analyst, 1968, v. 93, р. 28.

448.	Kecskes L., Tenyi I., Nemeth L., Juricskay Sc., Temesi M. Endokrinologie,
1975, v. 66, p. 94.

449.	Kelly R. W., Taylor P. L. Anal. Chem., 1976, v. 48, p. 465.

450.	Ker avis G., Lafosse M., Durand M. H. Chromatographia, 1977, v. 10,
p. 678.

451.	Kerebel A., Morfin R. F., Berthou F. L., Picart D., Bardou L. G.,
Floch H. H. J. Chromat., 1977, v. 140, p. 229.

452.	Ke/r E., Park В. K., Dean P. D. G. Clin. Chim. Acta, 1977, v. 77, p. 77.

453.	Khoury A. J., Cali L. J. J. Pharm. Sci., 1967, v. 56, p. 1485.

454.	Kimura M., Kawata M., Akiyama K-, Harita K., Miura T. Chem. Pharm.
Bull., 1973, v. 21, p. 1720, 1741.

455.	Kimura M., Nishina T., Sakamoto T. Chem. Pharm. Bull., 1967, v. 15,
p. 454.

456.	King R. H., Grady L. T., Reamer J. T. J. Pharm. Sci., 1974, v. 63, p. 1591..

457.	Kirk D. N., Hartshorn M. P. Steroid Reaction Mechanisms, Elsevier, Am-
sterdam, London, New York, 1968, p. 182.

458.	Kirk D. N., Shaw P. M. J. Chem. Soc., 1971, p. 3979.

459.	Kirschbaum J. J. Pharm. Sci., 1978, v. 67, p. 275.

460.	Kirschner M. A., Taylor J. P. Anal. Biochem., 1969, v. 30, p. 346.
461.	Kitazawa Т., Naito М., Yoshida F. J. Pharm. Soc. Japan, 1960, v. 80,
p. 116.

462.	Kitazawa T., Naito M., Yoshida F., Maruyama M. J. Pharm. Soc. Japan,
1961, v. 81, p. 496.

463.	Klein D. N., Weiner N., Gordon S. M.	Anal. Chem.,	1948, v. 20,	p.	174.

464.	Klein S., James A. E., Tuckerman M.	M. J. Am. Pharm. Ass., Sci.	Ed.,

1960, v. 49, p. 314.

465.	Klopper A., Michie E. A., Brown J. B.	J. Endocrinol.,	1955, v. 12,	p.	209.

466.	Knapstein P., Trieber L. R., Touchstone	J. C. Steroids,	1968, v. 11,	p.	915.

467.	Knights B. A. In Carstensen H. (Editor). Steroid Hormone Analysis.
Marcel Dekker, New York, 1967, pp. 367—406.

468.	Ignore D. W. R., Kirschner M. A., Taylor J. P. J. Clin. Endocrinol., 1970,
v. 31, p. 409.

469.	Knuppen R., Haupt O., Schramm W., Hoppen H. O. J. Steroid Biochem.,
1979, v. 11, p. 153.

470.	Kober S. Biochem. Z., 1931, v. 239, p. 209.

471.	Kohen F., Hollander Z., Boguslaski R. C. J. Steroid Biochem., 1979, v. 11,
p. 161.

472.	Kohen F., Hollander Z., Yeager F. N., Carrico R. J., Boguslaski R. C.
In Pal B. S. (Editor). Enzyme Labelled Immunoassay of Hormones and
Drugs. De Gruyter, Berlin, New York, 1978, p. 67.

473.	Kohli J. C., Arora A. K. Ann. Chim., 1977, v. 2, p. 67.

474.	Kolthoff I. M., Lingane J. J. Polarography, Interscience, New York, Lon-
don, 1952, pp. 666—675.

475.	Kopp R. H., Schmermund J. T. Clin. Chem., 1976, v. 22, p. 1187.

476.	Korany M. A., Abdel Salam M., Wahbi A. M. Analyst, 1977, v. 102,
p. 683.

477.	Koshy К. T. J. Chromat., 1976, v. 126, p. 641.

478.	Koshy К. T., Kaiser D. G., VanDerSilk A. L. J. Chromat. Sci., 1975, v. 13,
p. 97, 3299.

479,	Коваленко Л. И. Фармация,	1967,	т. 16, с. 51.

480.	Коваленко Л. И. Фармация,	1968,	т. 17, с. 36.

481.	Krushaar L. A., Epstein Е.,	Zak В. Clin. Chem., 1966,	v.	12,	р.	282.

482.	Krzeminski L. F., Geng S.,	Cox	B. L. J. Ass. Off.	Anal.	Chem.,	1976,

v. 59, p. 507.

483.	Kuhinsky S., Mirrasoul M., Bennett G. Clin. Biochem., 1977, v. 10, p. 52.

484.	Kuhnert-Brandstotter M., Winkler H. Sci. Pharm., 1976, v. 44, p. 177,
191.

485.	Kurasawa Y., Takada A., Ueda T. Chem. Pharm. Bull. (Tokyo), 1976,
v. 24, p. 1268.

486.	Kuschak D., Sturm G. J. Clin. Chem. Clin. Biochem., 1976, v. 14, p. 375.

487.	Kutner A., Smolinska J., Cieslik W. Chem. Anal., 1978, v. 23, p. 727.

488.	Kutpmann W. R., Breuer H. J. Clin. Chem. Clin. Biochem., 1977, v. 15,
p. 225.

489.	Lafosse M., Keravis G., Durand M. H. J. Chromat., 1976, v. 118, p. 283.

490.	Lahoud H. J., Luttrell В. M., Steinbeck A. W. Steroids, 1976, v. 27, p. 211.

491.	Landowne R. A., Lipsky S. R. Anal. Chem., 1963, v. 35, p. 532.

492.	Langenbach R. J., Knoche H. W. Steroids, 1968, v. 11, p. 123.

493.	Langer L., Veleminsky J., Hampl R., Starka L., Holan J. Radiochem.
Radioanal. Lett., 1978, v. 34, p. 267.

494.	Legrand M., Delaroff V., Smolik R. J. Pharm. Pharmacol., 1958, v. 10,
p. 683.

495.	Lehtinen T., Adlercreutz H. J. Steroid Biochem., 1977, v. 8, p. 99.

496.	Leone R. M. J. Chromat., 1977, v. 135, p. 527.

497.	Leunissen W. J. J., Thijssen J. H. FL J. Chromat., Biomed. Appl., 1978,
v. 146, p. 365.

498.	Lever M., Powell J. C., Peace S. M. Biochem. Med., 1973, v. 8, p. 188.
499.	Levi S., Reisfeld R. Anal. Chim. Acta, 1978, v. 97, p. 343.

499a. Lewis C. J., Vose C. W. Anal. Proc., 1981, p. 253.

500.	Liedtke R. J., Greaves J. P., Batjer J. D., Bushby B. Clin. Chem., 1978,
v. 24, p. 1100.

500a. Lin J. T., Heftmann E., Hunter I. R. J. Chromat., 1980, v. 190, p. 169.

501.	Lipsett M. B. (Editor). Gas Chromatography of Steroids in Biological
Fluids. Plenum Press, New York, 1965.

502.	Lisboa В. P. Methods Enzymol., 1969, v. 15, p. 3.

503.	Lisboa В. P. Steroids. In Macek K. (Editor). Pharmaceutical Applications
of Thin-layer and Paper Chromatography. Elsevier, Amsterdam, 1972,
pp. 275—348.

504.	Lisboa В. P., Schneider H. T., Breuer H. Acta Endocrinol., 1976, v. 82,
p. 57.

504a. Lisboa В. P., Hoffmann U. J. Chromat., 1975, v. 115, p. 177.

505.	Lisboa В. P., Strassner M. J. Chromat., 1975, v. Ill, p. 159.

506.	Little A. J., Aulton R., Payne R. B. Clin. Chim. Acta, 1975, v. 65, p. 167.

507.	Llewelyn D. E. H, Hillier S. G., Read G. F. Steroids, 1976, v. 28, p. 339.

508.	Lodge B. A. Can. J. Pharm. Sci., 1970, v. 5, p. 74.

509.	Lodge B. A., Lanouette M. Can. J. Pharm. Sci., 1979, v. 14, p. 53.

510.	Lodge B. A., Toft P. Can. J. Pharm. Sci., 1979, v. 9, p. 41.

511.	Lovelock J. E., Simmonds P. G., Van den Heuvel IF. J. A. Nature, 1963,
v. 197, p. 249.

512.	Lotscher R., Rem H. Chimia, 1973, v. 27, p. 348.

5L3. Ludwig H., Reiner J., Spiteller G. Berichte, 1977, v. 110, p. 217.

514.	Ludwig-Rohn H., Messing E., Spiteller G. J. Chromat., Biomed. Appl.,
1979, v. 162, p. 573.

515.	Ludwig-Rohn H., Spiteller G., Matthaei D., Scheier G. J. Chromat., Bio-
med. Appl., 1978, v. 146, p. 381.

516.	Lue Yen Bower E., Winefordner J. D. Anal. Chim. Acta, 1978, v. 101,
p. 319.

517.	Lund H. Acta Chem. Scand., 1957, v. 11, p. 283.

518.	Lutoslawska G., Sawicka T. Farm. Polska, 1976, v. 32, p. 743.

519.	Luukkainen T., Van den Heuvel W. J. A., Haahti E. O. A., Horning E. C.
Biochem. Biophys. Acta, 1961, v. 52, p. 599.

519a. Madani C., Chambaz E. M. J. Am. Oil. Chem. Soc., 1981, v. 58, p. 63.

520.	Madigan J. J., Zenno E. E., Pheasant R. Anal. Chem., 1951, v. 23, p. 1691.

521.	Magin D. F. J. Chromat., 1975, v. 115, p. 687.

522.	Manila H, Rambegawa A. Nippon Naibumpi Gakkai Zasshi, 1978, v. 54,
p. 11.

523.	Marciniec B. Acta Pol. Pharm., 1976, v. 33, p. 725.

524.	Marian M., Matkovics B. Z. Anal. Chem. 1974, v. 272, p. 37.

525.	Mariani A., Mariani-Vicari C. Zbl. Pharm., 1972, v. Ill, p. 19.

526.	Martin F., Adlercreutz H. In Carattini, Sand Berendes H. (Editors).
Pharmacology of Steroid Contraceptive Drugs. Raven Press, New York,
1977, pp. 99—105.

527.	Martin J. L., Duncombe R. E., Shaw W. H. C. Analyst, 1975, v. 100,
p. 243.

528.	Mathieu H. P., Mathieu-Nast C., Vrignaud C. Steroids, 1977, v. 30, p. 33.

529.	Matsui M., Hakozaki M., Rinuyama Y. J. Chromat., 1975, v. 115, p. 625.

530.	Matsui M., Takahashi M. Anal. Biochem., 1976, v. 75,. p. 441.

531.	Matthews J. S., Pereda A. L. V., Aguilera A. P, J. Chromat., 1962, v. 9,
p. 331.

532.	Mathiesen U., Staib W. Chromatographia, 1977, v. 10, p. 70.

533.	Mattox V. R., Goodrich J. E., Litwiller R. D. J. Chromat., 1975, v. 108,
p. 23.

534.	Mattox V. R., Litwiller R. D., Goodrich J. E. J. Chromat., 1975, v. 109,
p. 129.
535.	Майте В. F., Майте G. М., Durand J., Padieu Р. J. Chromat., 1971,
v. 58, р. 277.

536.	Maynard Р. V. J. Endocrinol., 1977, v. 73, р. 16 Р.

537.	Maynard Р. V., Pike A. W., Weston A., Griffiths К. Europ. J. Cancer,
1977, v. 13, p. 971.

538.	Mazella P. P., Ma T. S. Microchim. Acta, 1968, p. 253.

539.	Mazor L. Acta Chim. Hung., 1976, v. 89, p. 289.

540.	McErlane К. M., Curran N. M. J. Pharm. Sci., 1977, v. 66, p. 523.

541.	McKinley W. P., Devlin D. F. Can. J. Biochem. Physiol., 1957, v. 35,
p. 669.

542.	Menger F. M., Hopkins J. J., Cox G. S., Maloney M. J., Bayer F. L.
Anal. Chem., 1978, v. 50, p. 1135.

543.	Menini E., Norymberski J. K- Biochem. J., 1964, v. 93, p. 11.

544.	Mesley R. J. Spectrochim. Acta, 1966, v. 22, p. 889.

545.	Mesley R. J., Johnson C. A. J. Pharm. Pharmacol., 1965, v. 17, p. 329.
545a. Messeri G., Longo G., Pedone L. Clin. Chem., 1979, v. 25, p. 1663.

546.	Mestres R., Berges J. L. Trav. Soc. Pharm. Montpellier, 1972, v. 32,
p. 313.

547.	Mestres R., Youssef A. F., Berges J. L. Trav. Soc. Pharm. Montpellier,
1972, v. 32, p. 331.

548.	Metcalf M. G. Steroids, 1976, v. 28, p. 311.

549.	Meunier J. C. Agressologie, 1976, v. 17, p. 251.

550.	Meyer A. S. J. Org. Chem., 1955, v. 20, p. 1240.

551.	Meyer A. S., Lindberg M. C. Anal. Chem., 1955, v. 27, p. 813.

552.	Mickan H. Steroids, 1976, v. 27, p. 65.

553.	Михайлова Л. H., Кадатский Г. M., Гриненко Г. С. Химико-фармацевт.
ж, 1975, т. 9, с. 58.

554.	Miklosi S., Biggs J. S. G., Selvage N., Canning J., Lythal G. Steroids,
1975, v. 26, p. 671.

555.	Miller J. H. McB., Duguid P. Proc. Anal. Div. Chem. Soc., 1976, v. 13,
p. 9.

556.	Millington D. S., Buoy M. E., Brooks G., Harper M. E., Griffiths K.
Biomed. Mass Spectrum., 1975, v. 2, p. 219.

557.	Millner S. N., Taber C. A. Clin. Chim. Acta, 1976, v. 71, p. 67.

558.	Miura M., Kimura M. Chem. Pharm. Bull., 1978, v. 26, p. 171.

559.	Miura T., Takagi H., Harita K., Kimura M. Chem. Pharm. Bull., 1979,
v. 27, p. 452.

560.	Miura T., Takagi Н.» Kimura M. Chem. Pharm. Bull., 1979, v. 27, p. 783.

561.	Miyai K-, Ishibashi K., Ogihara T., Tanizawa O., Nishi K., Kawashima M.,
Kumahara У. In Pal S. B. (Editor). Enzyme Labelled Immunoassay of
Hormones and Drugs. De Gruyter, Berlin, New York, 1978, p. 287.

562.	Miyazaki H., Ishibashi M., Itoh M. J. Chromat., 1977, v. 135, p. 109.

563.	Miyazaki H, Ishibashi M., Itoh M., Nambara T. Chem. Pharm. Bull.,
1975, v. 23, p. 3033.

564.	Mizsei A., Szabo A. Biotechn. Bioeng., 1961, v. 3, p. 21, 119.

564a. Moneti G., Pazzagli M., Fiorelli G.t Serio M. Ann. Chim., 1979, v. 69,
p. 499.

565.	Moore J. W. Clin. Chim. Acta, 1972, v. 39, p. 532.

566.	Moore J. W. Clin. Chem., 1973, v. 19, p. 706.

567.	Moore J. W., Cooper W. Clin. Chim. Acta, 1974, v. 56, p. 215.

568.	Moore R. A., Ryan M., Penfold W. A. F. Clin. Chim. Acta, 1976, v. 67,
p. 1.

569.	Moretti G., Cavina G., Chiappetta G., Fattori L, Pompi V. Boll. Chim.
Pharm., 1977, v. 116, p. 463.

570.	Moretti G., Cavina G., Sardi di Valverde J. J. Chromat., 1969, v. 40,
p. 410.

571.	Morgan E. D., Poole C. F. J. Chromat., 1974, v. 89, p. 225.
572.	Morreal С. Е., Dao Т. L. Steroids, 1975, v. 25, р. 421.

573.	Moscrop R. Н., Antcliff А. С., Braunsberg Н., James V. Н. Т., Gou-
die J. Н., Burneti D. Clin. Chim. Acta, 1974, v. 56, p. 265.

573a. Mourey T. H., Siggia S. Anal. Chem., 1980, v. 52, p. 881.

574.	Mohrle	H., Tenczer J. Pharm. Acta Helv., 1976, v. 51, p. 219.

575.	Musey	P.	I.,	Collins D. C.f Preedy J. R. R. Steroids, 1977, v. 29,	p.	657.

576.	Musey	P.	I.,	Collins D. C., Preedy J. R. R. Steroids, 1978, v. 31,	p.	573.

577.	Muller	J.	R.,	Robinette J. A., Yannone M. E. J. Steroid Biochem., 1972,

v. 3, p. 735.

578.	Nambara T. J. Chromat., 1972, v. 64, p. 239.

579.	Nambara T., Iwata T., Rigasawa R. J. Chromat., 1976, v. 118, p. 127.

580.	Nambara T., Rigasawa R., Iwata T., Ibuki M. J. Chromat., 1975, v. 114,
p. 81.

581.	Nambara T., Rudo T., Hosoda H„ Yamanouchi R.t Goya S. J. Chromat.,
1967, v. 31, p. 538.

581a. Nambara T., Numazawa M., Tanaka T., Ohkubo T. J. Steroid Biochem.,
1978, v. 9, p. 785.

5816. Nambara T., Numazawa M., Tanaka T., Ohkubo T. J. Pharm. Dyn., 1978,
v. 1, p. 55.

581b. Nambara T., Shimada R., Ohta H. J. Steroid Biochem., 1980, v. 13,
p. 1075.

582.	Neher R. Chromatographic Mobilities. In Engel L. L. (Editor). Physical
Properties of Steroid Hormones. Pergamon Press, Oxford, 1963.

583.	Neher R. Steroid Chromatography. Elsevier, Amsterdam, 1964, pp. 280—
315.

584.	Neher R. TLC of Steroids and Related Compounds. In Stahl E. (Editor).
Thin-Layer Chromatography. Springer Verlag, Berlin, Heidelberg, New
York, 1969, pp. 133—155.

585.	Neubert P., Roch R. J. Pharm. Sci., 1977, v. 66, p. 1131.

586.	Neudert	W., Ropke H. Atlas of Steroid Spectra.	Springer,	Berlin, 1965.

587.	Neurath	G. B., Ambrosium D. J. Chromat., 1979,	v. 163, p.	230.

588.	Nice E.	C., O'Hare M. J. J. Chromat., 1978, v. 166, p. 263.

589.	Nice E.}	Williams R. Anal. Biochem., 1974, v. 59, p.	399.

590.	Nicklin M. G., Hewitt J. W., Watson D. J. Clin. Pathol., 1976, v. 29,
p. 561.

591.	Nicolas J. C., Boussioux A. M., Descomps B., Crastes de Paulet A. Clin.
Chim. Acta, 1979, v. 92, p. 1.

592.	Nishina T., Sakai Y., Rimura M. Chem. Pharm. Bull., 1965, v. 13, p. 414.

593.	Njau E. J. Pharm. Sci., 1977, v. 66, p. 1478.

594.	Nocke W. Biochem. J., 1961, v. 78, p. 593.

595.	Norymberski J. R.t Stoddart N., Wolstenholme J. B. Biochem. J., 1975,
v. 145, p. 47.

596.	Novotny M., Maskarinec M. P., Steverink A. T. G., Farlow R. Anal..
Chem., 1976, v. 48, p. 468.

597.	Novotny M., Zlatkis A. J. Chromat., 1971, v. 56, p. 353.

598.	Novotny M., Zlatkis A. J. Chromat. Sci., 1970, v. 8, p. 346.

599.	Numazawa M., Haryu A., Rurosaka R., Nambara T. FEBS Lett., 1977,
v. 79, p. 396.

599a. Numazawa M., Tanaka T., Nambara T. Clin. Chim. Acta, 1979, v. 91,
p. 169.

600.	Oehrle	R.	L.,	Vogt R., Hoffmann B. J.	Chromat., 1975, v.	114,	p.	244.

601.	Oehrle	R.	L.,	Vogt R. Acta Endocrinol., 1976, v. 82, Suppl., p. 202,	61.

602.	Oertel	G.	W.,	Eik-Nes R. B. Anal. Chem.,	1959, v. 31, p. 98.

603.	Oertel	G.	W.,	Penzes L. P. Z. Anal. Chem., 1970, v. 252, p.	306.

604.	O'Hare M. J., Nice E. C., Magee-Brown R., Bullman H. J. Chromat.,
1976, v. 125, p. 357.

605.	Okerholm R. A., Clark S. J., Wotiz H. H. Anal. Biochem. 1971, v. 44, p. 1.
606.	Okuno L, Higgins W. Н. Bull. Environ. Contam. Toxicol., 1977, v. 18,
p. 428.

607.	Oliver R. W. A., Jensen S. R., Crossley G. Clin. Chem., 1976, v. 22,
p. 679.

608.	Opheim L. N. Anal. Chim. Acta, 1977, v. 89, p. 225.

609.	Osterman T. M., Juntunen K. 0., Gothoni G. D. Clin. Chem., 1979, v. 25,
p. 716.

610.	Pang S., Hotchkiss J., Drash A. L., Levine L. S., New M. I. J. Clin.
Endocrinol. Metab., 1977, v. 45, p. 1003.

611.	Papineau-Couture G., Burley E. A. J. Am. Pharm. Ass., Sci. Ed., 1950,
v. 39, p. 683.

612.	Parker L. N„ Grover P, K., Odell W. D. Steroids, 1977, v. 29, p. 715.

613.	Pasternak C. A. (Editor). Radioimmunoassay in Clinical Biochemistry.
Heyden and Son. London, New York, Rheine, 1975, pp. 139—183.

614.	Pastor J., Pauli A., Papoccia N. Trav. Soc. Pharm. Montpellier, 1973,
v. 33, p. 411.

615.	Pasqualini J. R. Analysis and Identification of Steroid Conjugates.
In Carstensen H. (Editor). Steroid Hormone Analysis. Marcel Dekker,
New York, v. 1, 1967, pp. 407—456.

616.	Passonneau J. V., Lowry О. H. In Bergmayer H. U. (Editor). Grund-
lagen der enzymatischen Analyse. Verlag Chemie, Weinheim, New York,
1977, p. 89—90.

616a. Pdtthy M., Tomori Ё. J. Chromat., 1980, v. 191, p. 145.

617.	Paul S. M., Axelrod J. Life Sciences, 1977, v. 21,	p. 493.

618.	Pawelczyk	E.,	Marciniec	B., Pluta	I. Acta Pol.	Pharm.,	1972,	v.	29,

p. 375.

619.	Pawelczyk	E.,	Opielewicz	M. Farm.	Polska, 1978,	v. 34, p.	531.

620.	Pawelczyk	E.,	Pluta L,	Marciniec	B. Acta Pol.	Pharm.,	1973,	v.	30,

p. 289.

621.	Penner M. H., Tsilifonis D. C., Chafetz L. J. Pharm. Sci.,, 1971, v. 60,
p. 1388.

622.	Pesez M. Bull. Soc. Chim. Franc., 1957, p. 414.

623.	Pesez M. J. Pharm. Pharmacol., 1959, v. 11, p. 475.

624.	Pesez M., Bartos J. Taianta, 1960, v. 5, p. 216.

625.	Pesez M., Bartos J. Taianta, 1963, v. 10, p. 69.

626.	Pesez M., Bartos J. Ann. Pharm. Franc., 1964, v. 22, p. 541.

627.	Pesez M., Bartos J. Taianta, 1969, v. 16, p. 331.

628.	Pesez M., Bartos J. Bull. Soc. Chim. Franc., 1964, p. 912.

629.	Pfaffenberger C. D., Horning E. C. J. Chromat., 1975, v. 112, p. 581.

630.	Pfaffenberger C. D., Horning E. C. Anal. Biochem., 1977, v. 80, p. 329.

631.	Pfaffenberger C. D., Malinak L. R., Horning E. C. J. Chromat., 1978,
v. 158, p. 313.

631a. Pfeifer P., Spiteller G. J. Chromat. Biomed. Appl., 1981, v. 223, p. 21.

632.	Pharmacopoeia Helvetica VI. Verlag Eidgenossische Drucksachen und
Materialzentrale. Bern, 1971, pp. 455, 1228.

632a. Pharmacopoeia of Japan VIII. English Edition, Society of Japan Pharma-
copoeia, 1973, p. 418.

633.	Philips J. C., Hammond J. E., Savory J. Clin. Chem., 1977, v. 23, p. 1136.

634.	Phillipou	G. J. Chromat., 1976, v. 129, p. 384.

635.	Phillipou	G.,	Bigham D. A., Seamark R. F. Steroids, 1975,	v.	26, p.	516.

635a.	Phillipou	G.,	Frith R. G. Clin. Chim. Acta, 1980, v.	103,	p.	129.

636.	Pierce A.	E.	Silylation of Organic Compounds. Pierce	Co.,	Rockfort,	III.,

1968.

637.	Pinelli A., Nair P. P. J. Chromat., 1969, v. 43, p. 223.

638.	Pirke К. M. Steroids, 1977, v. 30, p. 53.

639.	Polvani F., Surace M., Luisi M. (Editors). Gas Chromatographic Determi-
nation of Hormonal Steroids, Academic Press, New York, London, 1967.
640.	Pontius D. J. Anal. Chem., 1962, v. 34, p. 168.

641.	Потапов В. M., Демьянович В. М., Раковская Р. С., Гриненко Г. С.
Кадацкий Г. М. Ж- аналит. химии, 1978, т. 33, с. 534.

642.	Poteczin Е., Feher Т., Kiss С., Gy dry G. Endokrinologie, 1975, v. 64,
p. 151.

643.	Pranskevich C. A., Lozak С. M. Clin. Chem., 1978, v. 24, p. 1044.

644.	Pratt J. J. Clin. Chem., 1978, v. 24, p. 1869.

645.	Pratt J. J., Woldring M. G. Clin. Chim. Acta, 1976, v. 68, p. 87.

646.	Prochdzka Z. In Deyl H., Macek K-, Janak J. (Editors). Liquid Column
Chromatography. Elsevier, Amsterdam, Oxford, New York, 1975, pp. 593—
622.

647.	Puah С. M., Kjeld J. M., Joplin G. F. J. Chromat., 1978, v. 145, p. 247.

648.	Quilliam M. A., Templeton J. F., Westmore J. B. Steroids, 1977, v. 29,
p. 613.

649.	Quilliam M. A., Westmore J. B. Steroids, 1977, v. 29, p. 579.

650.	Rademaker B., Jongejan-Timmer A., Poortman J., Thijssen J. H. H. Clin.
Chim. Acta, 1976, v. 70, p. 349.

651.	Rajkowski К. M., Cittanova N., Desfosses B., Urios P., Jayle M. F. In
Pal S. B. (Editor). Enzyme Labelled Immunoassay of Hormones and
Drugs. De Gruyter, Berlin, New York, 1978, p. 311.

652.	Rajkowski К. M., Cittanova N., Desfosses B., Jayle M. F. Steroids, 1977,
v. 29, p. 701.

653.	Rajkowski К- M., Cittanova N., Urias P., Jayle M. F. Steroids, 1977,
v. 30, p. 129.

653a. Rao G. R., Sivaramakrishnan M. V., Srivastava С. M. R. Ind. J. Pharm.
Sci., 1979, v. 41, p. 233.

654.	Rao P. N., Moore P. H. Steroids, 1977, v. 29, p. 461.

655.	Rao P. N., Moore P. H., Peterson D. M., Tcholakian R. K. J. Steroid.
Biochem., 1978, v. 9, p. 539.

656.	Rapp J. P., Eik-Nes К. B. J. Gas. Chromat., 1965, v. 3, p. 235.

657.	Reed S. R., Walters S. M. Anal. Letters, 1970, v. 3, p. 585.

658.	Reich H., Crane K- F., Sanfilippo S. J. J. Org. Chem., 1953, v. 18, p. 822.

659.	Rigby F. L., Karavolas H. J., Norgard D. W., Wolf R. C. Steroids, 1970,
v. 16, p. 703.

660.	Rizk	M.,	Valton J. J.,	Babinand A. Anal.	Chim.	Acta,	1973,	v.	65,	p.	220.

661.	Rizk	M.,	Vallon J. J.,	Babinand A. Anal.	Chim.	Acta,	1974,	v.	70,	p.	457.

662.	Rizk	M.,	Walash M. L	Pharmazie, 1978, v.	33, p.	521.

663.	Roberts	G., Gallagher B. S., Jones R. N. Infrared	Absorption	Spectra

of Steroids, V. II. Interscience, New York, 1958.

664.	Roberts	H.	R., Florey K- J. Pharm. Sci., 1962, v. 51, p. 794.

665.	Roberts	H.	R., Siino M. R. J. Pharm. Sci., 1963, v. 52, p. 370.

666.	Roman	R.,	Yates С. H., Millar J. F. J. Pharm. Sci., 1979, v.	68,	p.	736. •

667.	Roman	R.,	Yates С. H., Millar J. F. J. Chromat. Sci., 1977, v.	15,	p.	555.

668.	Roman	R.,	Yates С. H., Millar J. F., O’Neill J., Zweig J. S.	J.	Pharm.

Sci., 1979, v. 68, p. 733.

669.	Roman R., Yates C. H.r Millar J. F., Van den Heuvel W. J. A. Can. J.
Pharm. Sci., 1975, v. 10, p. 12.

670.	Ronco G., Desmet G., Bezoc J. F. Clin. Chim. Acta, 1977, v. 81, p. 119.

671.	Roos	R.	W.	J.	Chromat. Sci., 1976, v. 14, p. 505.

672.	Roos	R.	W.	J.	Pharm. Sci., 1974, v. 63,	p. 594.

673.	Roos	R.	W.	J.	Pharm. Sci., 1978, v. 67,	p. 1735.

673a.	Roos	R.	W.	J.	Assoc. Off. Anal. Chem.,	1980, v. 63, p. 80.

6736. Roos R. W., Medwick T. J. Chromat. Sci., 1979, v. 17, p. 624.

673b. Roos R. W., Medwick T. J. Chromat. Sci., 1980, v. 18, p. 626.

674.	Rosenkrcntz H., Potvin P., Skogstrom P. J. Am. Chem. Soc., 1958, v. 77,
p. 2737.
675.	Rossi Е., Pascale A., Negrini Р., Frigerio A., Castegnaro Е. J. Chromat.,
1979, v. 169, р. 416.

676.	Rossler И., Bruckner К. Naturwissensch., 1961, v. 48, р. 695.

677.	Russo-Alesi F. М. Ann. N. Y. Acad. Sci., 1968, v. 153, p. 511.

678.	Ryan J. A., Cali L. J., McGonigle E. Anal. Chim. Acta, 1971, v. 54,
p. 105.

679.	Ryan J. J. J. Chromat., 1976, v. 127, p. 53.

680.	Ryan M., Gray В. C. Clin. Chim. Acta, 1975, v. 60, p. 197.

681.	Ruback G. J. Chromat., 1976, v. 116, p. 207.

682.	Sachs L. Nature, 1964, v. 201, p. 296.

683.	Sadee W.t Dagjioglu M., Riegelman S. J. Pharm. Sci., 1972, v. 61,
p. 1126.

684.	Sadee W., Riegelman S., Johnson L. F. Steroids, 1971, v. 17, p. 595.

685.	Sanghvi A., Wight C., Serenko A., Balachandran R. Clin. Chim. Acta,
1974, v. 56, p. 49.

686.	Sarfaty G. A., Fales H. M. Anal. Chem., 1970, v. 42, p. 288.

687.	Sato K., Ohsawa N. Steroids, 1977, v. 29, p. 295.

688.	Satyaswaroop P. G., Lopez de la Osa E., Gurpide E. Steroids, 1977,
v. 30, p. 139.

689.	Saxena B. N., Shrimanker R, Fotherby R. J. Steroid Biochem., 1977, v. 8,
p. 1117.

690.	Schiller H. S., Hasselbrack R„ Riggs R. S., Brammal M. A. Clin. Chem.,
1976, v. 22, p. 1659.

691.	Schindler A. E., Gnad R., Walk T. Clin. Chim. Acta, 1975, v. 64, p. 287.

692.	Schmidt G. J., Vandemark F. I., Slawin W. Anal. Biochem., 1978, v. 91,
p. 636.

693.	Schneider H. T., Lisboa В. P., Breuer H. Z. Anal. Chem., 1976, v. 279,
p. 161.

694.	Schneider J. J. J. Chromat., 1971, v. 54, p. 97.

695.	Scholler R., Jayle M. F. (Editors). Gas Chromatography of Hormonal
Steroids. Gordon and Breach-Dunod, New York, Paris, 1968.

696.	Scholler R., Wohnlich J., Jayle M. F. In Jayle M. F. (Editor). Analyse
des Steroids Hormonaux. Masson, Paris, v. II, 1963, p. 368.

696a. Schoneshdfer M., Maxeiner J., Fenner A. J. Chromat. Biomed. Appl., 1981,
v. 224, p. 229.

697.	Schroeder I., Lopez-Sanchez G., Medina-Acevedo J. С., M. del Carmen
Espinosa. J. Chromat. Sci., 1975, v. 13, p. 37.

697a. Schulten H. R., Muller R., O'Brien R. E., Tzodikov N. Z. Anal. Chem.,
1980, v. 302, p. 387.

698.	Schulz E. P. J. Pharm. Sci., 1965, v. 54, p. 144.

699.	Schulz E. P., Diaz M. A. J. Pharm. Sci., 1964, v. 53, p. 1115.

700.	Schulz E. P., Diaz M. A., Guerrero L. M. J. Pharm. Sci., 1964, v. 53,
p. 1119.

701.	Schulz E. P., Diaz M. A., Lopez G., Guerrero L. M., Barrara FL, Pe-
reda A. L., Aguilera A. Anal. Chem., 1964, v. 36, p. 1624.

702.	Schulz E. P., Neuss J. D. Anal. Chem., 1957, v. 29, p. 1662.

703.	Schwarz V., Trojanek J. Coll. Czech. Chem. Comm., 1961, v. 26, p. 117.

704.	Scott J. Z., Stanczyk F. Z., Goebelsmann U., Mishell D. R. Steroids,
1978, v. 31, p. 393.

705.	Scott R. M., Sawyer R. T. Microchem., 1975, v. 20, p. 309.

706.	Seamark R. F., Phillipou G., McIntosh J. E. A. J. Steroid. Biochem., 1977,
v. 8, p. 885.

707.	Segura R.f Golto A. M. J. Chromat., 1974, v. 99, p. 643.

707a. Segura R., Navarro X. J. Chromat., 1981, v. 217, p. 329.

708.	Семенов В. А., Попов Д. M. Хим. фарм. ж., 1977, т. II, с. 136.

709.	Seth J. J. Chromat., 1968, v. 38, р. 139.

710.	Shackleton С. Н. L., Honour J. W. Clin. Chim. Acta, 1976, v. 69, p. 267.
710а. Shackleton С. Н. L.f Whitney J. О. Clin. Chim. Acta, 1980, v. 107, p. 231;
1981, v. 223, p. 33.

711.	Shaikh B., Hallmark M. R., Issaq H. J., Risser N. H., Kawalek J. C.
J. Liquid Chromat., 1979, v. 2, p. 943.

712.	Sheldon P. E., Coppenger C. J. Steroids, 1977, v. 30, p. 149.

713.	Shibusawa H., Sano Y., Yamamoto T., Kambegawa A., Ohkawa T., Sa-
toh N., Okinaga S., Arai K. Endocrinol. Jpn., 1978, v. 25, p. 185.

713a.	Shimada	K.,	Tanaka	T.,	Nambara T. J. Chromat.,	1979, v.	178, p. 350..

7136.	Shimada	K.,	Tanaka	T.,	Nambara T. J. Chromat.	Biomed.	Appl., 1981,

v. 223, p. 33.

713b.	Shimada	K.,	Tanaka	T.,	Nambara T. Anal. Letters,	1980, v.	13, p. 1129.

713r.	Shinohara Y.,	Baba S., Kasuya Y. J. Clin. Endocrin. Metab.,	1980, v. 51,.

p. 1459.

714.	Shirsat L. S., Shah M. H. Bull. Haffkine Inst., 1976, v. 4, p. 115.

715.	Short P. M., Rhodes С. T. Steroids, 1970, v. 16, p. 217.

716.	Shrimanker K., Saxena B. N., Fotherby K. J. Steroid Biochem., 1978,.
v. 9, p. 359.

717.	Shroeder Medina-Acevedo J. C., Lopez-Sanchez G. J. Chromat. Sci.,
1972, v. 10, p. 183.

718.	Shroff A. P., Grodsky J. J. Pharm. Sci., 1967, v. 56, p. 460.

719.	Shroff A. P., Huettemann R. E. J. Pharm. Sci., 1967, v. 56, p. 654.

720.	Shroff A. P., Huettemann R. E. J. Pharm. Sci., 1968, v. 57, p. 882.

721.	Siekmann L. J. Steroid Biochem., 1979, v. 11, p. 117.

722.	Siekmann L., Martin S., Siekmann A., Breuer H. Acta Endocr., 1976,
v. 82, p. 65.

723.	Siekmann L.,	Siekmann A., Breuer H.	Z. Anal.	Chem.,	1978, v. 290,

p. 159.

724.	Siekmann L.,	Siekmann A., Breuer H.	Z. Anal.	Chem.,	1978, v. 290,

p. 122.

725.	Siggia S., Dishman R. A. Anal. Chem., 1970, v. 42, p. 1223.

726.	Silvestri S. Farmaco, Ed. Pr., 1971, v. 26, p. 288.

727.	Simpson T. H., Wright R. S. Steroids, 1978, v. 31, p. 691.

728.	Skramovsky V., Haeberle P. Clin. Chim. Acta, 1968, v. 22, p. 161.

729.	Singh H., Paul D., Raj Bhardwaj T., Bhutani К. K., Ram J. J. Chromat.,
1977, v. 137, p. 202.

730.	Sjostrom E., Nykdnen L. J. Am. Pharm. Ass., Sci. Ed., 1957, v. 46, p. 321.

731.	Sidvall J., Axelson M. J. Steroid Biochem., 1979, v. 11, p. 129.

731a. Slikker W., Lipe G. W., Newport G. D. J. Chromat. Biomed. Appl., 1981,
v. 224, p. 205.

732.	Smed-Nielsen L. Arch. Pharm. Chem., 1969, v. 76, p. 965.

733.	Smith A. G., Joannou G. E., Mak M., Uwajima T., Terada O., Brooks C. J. W.
J. Chromat., 1978, v. 152, p. 467.

734.	Smith L. L. In Engel L. L. (Editor). Physical Properties of Steroid Hor-
mones. Pergamon Press, Oxford, London, New York, Paris, 1963, pp. 321 —
448.

735.	Smith	L.	L. Steroids,	1963, v. 1, p. 544.

736.	Smith	L.	L., Foell T.	Anal. Chem., 1959,	v. 31, p.	102.

737.	Smith	L.	L.t Muller	W. H. J. Org. Chem., 1958,	v. 23,	p.	960.

738.	Smith	R.	V., Hassal	T. H., Liu S. C. J.	Ass Off.	Anal.	Chem.,	1970, v. 53,.

p. 1089.

739.	Snair D. W., Swinghammer L. A. J. Pharm. Pharmacol., 1961, v. 13.
p. 148.

740.	Snedden W., Parker R. B. Biomed. Mass Spectrom., 1976, v. 3, p. 295.

741.	Solomon-Ionescu L, Russu C.t Enache S. Pharm. Zentralhalle, 1965, v. 104„
p. 242.

742.	Spahr J. L., Knevel A. M. J. Pharm. Sci., 1966, v. 55, p. 1020.
742а. Sperandeo F., Pedrozzini S., De Marchi G., Marre E. Bull. Chim. Farm.,
1979, v. 118, p. 200.

743	Spiegelhalder B., Rohle G., Siekmann L., Breuer H. J. Steroid Biochem.,
1976, v. 7, p. 749.

743a. Steele J. W., Schlunegger U. P. Can. J. Pharm. Sci., 1979, v. 14, p. 50.

744.	Stenlake J. B., Williams W. D. J. Pharm. Pharmacol., 1957, v. 9, p. 908.

745.	Straw R. F., Hanson F. W. J. Med., 1975, v. 6, p. 369.

746.	Sturm G., Stahler E. Z. Anal. Chem., 1976, v. 279, p. 164.

746a. Stiiber W., Mutscheler E., Steinbach D. Arch. Pharm., 1981, v. 314,
p. 148.

747.	Swendsen R., Nedergaard M. Farm. Tidende, 1964, v. 42, p. 749.

748.	Swan D. F. R. Column, 1971, v. 13, p. 12.

749.	Swan D. F. R. Column., 1972, v. 14, p. 9.

750.	Symes E. R., Thomas B. S. J. Chromat., 1976, v. 116, p. 163.

751.	Szabo A. Magyar Kern. Lapja, 1963, v. 9, p. 613.

752.	Szabo A. Acta Pharm. Hung., 1977, v. 47, p. 24.

753.	Szabolcs L. Acta Pharm. Hung., 1972, v. 42, p. 68.

754.	Szdcz Gy., Bududri-Bdrany Zc. Acta Pharm. Hung., 1974, v. 44, p. 233.

755.	Szepesi G., Gorog S. Analyst, 1974, v. 99, p. 218.

756.	Talbot N. B., Ulick S., Roupreianow A., Zygmuntowich A. J. Clin. Endo-
crinol. Metab., 1955, v. 15, p. 301.

757.	Talmage J. M., Penner M. H., Geller M. J. Pharm. Sci., 1965, v. 54,
p. 1194.

758.	Tan S. Y., Murphy В. E. P. Steroids, 1975, v. 25, p. 283.

759.	Tanemori R., Horiuchi Y., Shinobara T., Ozaki H., Yoshida T., Takagi S.,
Rambegawa A., Rokubu T. Horumon To Rinsho, 1977, v. 25, p. 303.

760.	Tansey R. P., Cross J. M. J. Am. Pharm. Ass., Sci. Ed., 1950, v. 39,
p. 660.

761.	Tateishi R., Yamamoto H., Ogihara T., Hayashi C. Steroids, 1977, v. 30,
p. 25.

761a. Tateishi R., Hamaoka T., Hayashi C., Goto J., Ikegawa S., Nambara T.
Steroids, 1980, v. 36, p. 283.

7616. Taylor J. T., Rnotts J. G., Schmidt G. J. Clin. Chem., 1980, v. 26, p. 130.

762.	Taylor N. F., Shackleton С. H. L. J. Clin. Endocrinol. Metab., 1979, v. 49,
p. 78.

763.	Templton R. J., Arnett W. A., Jakovljevic I. M. J. Pharm. Sci., 1968, v. 57,
p. 1168.

764.	The National Formulary XIV, American Pharmaceutical Association, Wa-
shington, 1975. a) p. 493, 6) p. 503.

765.	Thenot J. P., Horning E. C. Anal. Letters, 1971, v. 4, p. 683.

766.	Thompson R. M. J. Steroid Biochem., 1976, v. 7, p. 845.

767.	Thompson R. M., Oei T. O. Clin. Chem., 1977, v. 23, p. 1135.

768.	Thornton	L.	R.	FDA Drug Autoanalysis Manual, Method No. 22, 1972.

769.	Thun R.,	Jutz	G., Fricker C. Schweiz. Arch. Tierheilkd., 1978, v. 120,

p. 205.

770.	Tikkanen	M.	J.,	Adlercreutz H. J. Steroid Biochem., 1972, v. 3, p. 807.

771.	Tikkanen	M.	J.,	Adlercreutz H. Acta Endocrinol., 1973, v. 73, p. 555.

772.	Tinschert R., Trager L. J. Chromat., 1978, v. 152, p. 447.

773.	Tishler F., Brody S. M. J. Pharm. Sci., 1964, v. 53, p. 161.

774.	Tishler F., Sheth P. B., Giaimo M. B., Mader W. J. J. Pharm. Sci., 1962,
v. 51, p. 1175.

774a. Tomsovd Z.f Gregorova I., Horky R. J. Chromat., 1980, v. 200, p. 221.

775.	Touchstone J. C., Murawec T. Anal. Chem., 1960, v. 32, p. 822.

776.	Treiber L. R. J. Chromat., 1976, v. 123, p. 23.

777.	Tresguerres J. A. F., Tamm J. J. Steroid Biochem., 1979, v. 11, p. 143.

778.	Trocha P., D'Amato N. A. Clin. Chem., 1978, v. 24, p. 193.

778a. Трубников В. И. Фармация, 1980, т. 29, с. 40.
779.	Tscherne R. J., Capitano G. J. Chromat., 1977, v. 136, p. 337.

780.	Tsilifonis D. C., Chafetz L. J. Pharm. Sci., 1967, v. 56, p. 625.

780a. Tsilifonis D. C., Chafetz L. J. Pharm. Sci., 1980, v. 69, p. 1461.

781.	Tyler J. P. P., Hennam J. F., Newton J. R., Collins W. R. Steroids, 1973,
p. 22, p. 871.

782.	Umberger E. J. Anal. Chem., 1955, v. 27, p. 768.

783.	United States Pharmacopoeia XX, USP Convention Inc., Rockville, Md.,
1980. a)	p.	296, 6)	p. 297, в) p. 299, r) p.	307, д)	p.	313, e) p. 326,

ж) p. 556,	з) p. 569, и) p. 587, к) p. 741, л)	p. 773,	m)	p. 774.

784.	Urbanyi	T.,	Mollica	J. A. J.' Pharm. Sci., 1968, v. 57,	p.	1257.

785.	Urbanyi	T.,	Rehm C.	R. J. Pharm. Sci., 1966, v.	55, p. 501.

786.	Urbanyi T., Pagliery M., Rehm C. R. Anal. Chem., 1967, v. 39, p. 1656.

787.	Valle L. B. S., Oliviera-Filho R. M. J. Chromat., 1975, v. 105, p. 201.

788.	Van Bennekom W. P., Reeuwijk H. J. E. M., Schute J. B. Anal. Chim.
Acta, 1975, v. 74, p. 387.

789.	Van den Heuvel W. J. A. J. Chromat., 1967, v. 28, p. 406.

790.	Van den Heuvel W. J. A. Can. J. Pharm. Sci., 1975, v. 10, p. 8.

791.	Van den Heuvel W. J. A. J. Chromat., 1967, v. 27, p. 85.

792.	Van den Heuvel W. J. A., Horning E. C. Biochem. Biophys. Res. Comm.,
1960, v. 3, p. 33, 356.

793.	Van den Heuvel W. J. A., Horning E. C. Biochim. Biophys. Acta, 1962,
v. 64, p. 416.

794.	Van den Heuvel W. J. A., Sjovall J., Horning E. C. Biochim. Biophys.
Acta, 1961, v. 48, p. 596.

795.	Van den Heuvel W. J. A., Smith J. L., Albers-Schonberg G., Plazonnet B.,
Belanger P. In Heftmann E. (Editor). Modern Methods of Steroid Ana-
lysis. Academic Press, New York, London, 1973, pp. 199—219.

796.	Van den Heuvel W. J. A., Sweeley С. C., Horning E. C. J. Am. Chem.
Soc., 1960, v. 82, p. 3481.

797.	Van der Molen H. J., Groen D. In Grant J. K. (Editor). The Gas Liquid
Chromatography of Steroids. Cambridge University Press, 1967, p. 155.

798.	Van der Merwe P. J., Muller D. G., Clark E. C. J. Chromat., 1979, v. 171,
p. 519.

799.	Van der Wal Sj. Ph. D. Thesis. Amsterdam, 1977.

800.	Van	der	Wal	Sj.,	Huber	J. F. K. J. Chromat., 1974, v. 102, p. 353.

801.	Van	der	Wal	Sj.,	Huber	J. F. K. J. Chromat, 1977, v. 135, p. 287.

802.	Van	der	Wal	Sj.,	Huber	J. F. K. J. Chromat., 1977, v. 135, p. 305.

803.	Van	der	Wal	Sj.,	Huber	J. F. K. J. Chromat., 1978, v. 149, p. 431.

804.	Van	Hout P.,	Szafranec	J., Pfaffenberger C. D., Horning E. C. J.	Chro-

mat., 1974, v. 99, p. 103.

805.	Van Weeman В. K., Bosch A. E. G., Dawson E. C., Schuurs H. W. M.
J. Steroid Biochem., 1979, v. 11, p. 147.

806.	Varma P., Curry C., Croecker G., Titus Dillon P., Ahluwalia B. Clin.
Chim. Acta, 1975, v. 53, p. 363.

807.	Veitch F. P., Milone H. S. J. Biol. Chem., 1945, v. 158, p. 61.

807a. Vessman J. J. Chromat., 1980, v. 184, p. 313.

808.	Vestergaard P. In Heftmann E. (Editor). Modern Methods of Steroid
Analysis. Academic Press, New York, London, 1973, pp. 1—35.

809.	Vestergaard P., Bachman A. Clin. Chem., 1975, v. 21, p. 1270.

810.	Vestergaard P., Sayegh J. F., Mowat J. H., Hemmingsen L. Estimation
after Multi-Column Liquid Chromatography of Common Urinary Neutral
Steroids with an Application to the Assay of Plasma 17-Oxosteroids.
Acta Endocrinol., Suppl. 217, Vol. 88, 1978.

811.	Vestergaard P., Sayegh J. F., Mowat J. H. Clin. Chim. Acta, 1975, v. 62,
p. 163.

812.	Vihko R., Hammond G. L. J. Steroid Biochem., 1979, v. 11, p. 125.

813.	Viinikka L. J. Steroid Biochem., 1978, v. 9, p. 979.
814.	Viricel М., Lemar М. J. Chromat., 1976, v. 116, р. 343.

815.	Vogt К-> Oehrle К. L. Arch. Lebensmittelhyg., 1977, v. 28, p. 44.

816.	Vogt W., Fisher I., Knedel M. Z. Anal. Chem., 1973, v. 267, p. 28.

817.	Vogt W., Jacob K-, Fischer I., Knedel M. Z. Anal. Chem., 1976, v. 279,
p. 158.

818.	Vollmin J. A. Chromatographia, 1970, v. 3, p. 233, 238.

819.	Vdllmin J. A., Curtins H. Ch. Z. Klin. Chem. Klin. Biochem., 1971, v. 9,
p. 43.

820.	Waichenberg B. L., Sugawara S. H., Mesquita С. H., Lerario A. C.,
Wachslicht H., Pieroni R. R., Mattar E. Clin. Chim. Acta, 1976, v. 68,
p. 67.

821.	Wal J. M., Peleran J. C.> Bories G. J. Chromat., 1977, v. 136, p. 165.

822.	Watanabe F., Nakahara M.> Tsubota N., Tsukuda K., Saiki K-, Ito M.
Clin. Chim. A?ta, 1978, v. 88, p. 21.

823.	Watkins R.> Feldkamp C. S., Epstein E., Thibert R. J., Zak B. Microchem.
J., 1976, v. 21, p. 466.

824.	Weber D. J., Mitchner H., Kaldy L., Yasaki K- J. Pharm. Sci., 1971, v. 60,
p. 467.

825.	Wehner R., Handke A. Clin. Chim. Acta, 1979, v. 93, p. 429.

825a. Wehner R., Handke A. J. Chromat., 1979, v. 177, p. 237.

826.	Wei R., Almirez R. Biochem. Biophys. Res. Commun., 1975, v. 62, p. 510,

827.	Weiss P. A. M., Esterbauer H., Scherr F. Endokrinologei, 1975, v. 65,
p. 249.

828.	Weiss P. A. M., Winter R., Scherr F., Bayer H. Geburtsh. Frauenheilk.,
1976, v. 36, p. 256.

829.	Weiss P. A. M. Z. Klin. Chem. Klin. Biochem., 1974, v. 12, p. 279.

830.	Weiss P. A. M., Esterbauer H., Scherr F. Geburtsh. Frauenheilk., 1975,
v. 35, p. 476.

831.	Wendland W., Lohmann К Biochem. Z., 1957, v. 328, p. 420.

832.	Wiedemann M., Wirtz A., Karl J. H., Raith L. Z. Anal. Chem., 1974,
v. 272, p. 195.

832a. Williams M. C., Goldzieher J. W. Steroids, 1980, v. 36, p. 255.

833.	Williamson D. E. J. Pharm. Sci., 1976, v. 65, p. 138.

834.	Wilson D. W., John В. M., Groom G. V., Pierre point C. G.t Griffiths K.
J. Endocrinol., 1977, v. 74, p. 503.

835.	Winkler W. V., Strong J. M., Finley R. A. Steroids, 1977, v. 29, p. 739.
835a. Wintersteiger R. Microchim. Acta, 1982, p. 279.

836.	Wolfe J. K., Hershberg E. B.t Fieser L. F. J. Biol. Chem., 1940, v. 136,
p. 663.

837.	Wolfrum R. Aertzl. Lab., 1974, v. 20, p. 335.

838.	Woodson A. L., Smith D. E. Anal. Chem., 1970, v. 42, p. 242.

839.	Woodson A. L. J. Pharm. Sci., 1971, v. 60, p. 1538.

840.	Wortbetg B., Woller R., Chulamorakot T. J. Chromat., 1978, v. 156, p. 205.

841.	Wortmann W., Wortmann B., Schnabel C.> Touchstone J. C. J. Chromat.
Sci., 1974, p. 12, p. 377.

842.	Wotiz H. H., Clark S. J. Gas Chromatography in the Analysis of Steroid
Hormones. Plenum Press, New York, 1966: a) p. 77—85.

843.	Wotiz H. H., Martin H. F. Anal. Biochem., 1962, v. 3, p. 97.

844.	Wright K., Collins D. C., Musey P. I., Preedy J. R. K. Steroids, 1978,
v. 31, p. 407.

845.	Wu	J.	Y. P. J. Ass. Off. Anal. Chem., 1970, v.	53, p. 831.

846.	Wu	J.	Y. P. J. Ass. Off. Anal. Chem., 1971, v.	54, p. 617. -

847.	Wu	J.	Y. P. J. Ass. Off. Anal. Chem., 1974,	v. 57, p. 747.

848.	Wu	J.	У. P. J. Ass. Off. Anal. Chem., 1975,	v. 58, p. 75.

849.	Wu	J.	Y. P. J. Ass. Off. Anal. Chem., 1977,	v. 60, p. 922.

850.	Yadav R. N., Teare F. W. J. Pharm. Sci., 1978, v. 67, p. 436.

851.	Yamaguchi Y., Hayashi C. Rinsho Kagaku, 1977, v. 5, p. 140.
852.	Yamaguchi Y., Hayashi C., Kumahara Y. Clin. Chem., 1976, v. 22, p. 1066.

853.	Yamaguchi Y., Tateishi K., Hayashi C. Clin. Chim. Acta, 1976, v. 66,
p. 449.

853a. Yamaguchi Y. J. Chromat. Biomed. Appl., 1979, v. 163, p. 253.

8536. Yamaguchi Y. Clin. Chem., 1980, v. 26, p. 491.

853b. Yamaguchi Y., Hayashi C„ Miyai K. J. Chromat., Biomed. Appl. 1980,
v. 182, p. 430.

854.	Yamamoto У., О saw a Y., Kirdani R. Y., Sandberg A. A. Steroids, 1978,
v. 31, p. 233.

855.	Yapo E. A., Barthelemy-Clavey A., Racadot A., Mizon J. J. Chromat.,
Biomed. Appl., 1978, v. 145, p. 478.

856.	Yee H. Y., Jackson B. Anal. Chem., 1976, v. 48, p. 1704.

857.	Yorde D. E„ Pluta P. E., Sasse E. A. In Pal S. B. (Editor). Enzyme
Labelled Immunoassay of Hormones and Drugs. De Gruyter, Berlin,
New York, 1978, p. 360.

858.	Yoshizawa I., Ryoko O., Nakagawa A. Chem. Pharm. Bull., 1977, v. 25,
p. 2137.

859.	Youssejf A. F.t Mestres R., Berges J. L. Trav. Soc. Pharm. Montpellier,
1972, v. 32, p. 343.

859a. Yousseff A. F., Mestres R. Trav. Soc. Pharm. Montpellier, 1973, v. 33,
p. 35.

860.	Zaffaroni A. Rec. Progr. Hormone Res., 1953, v. 8, p. 51.

861.	Zak B., Epstein E. Chem. Anal., 1963, v. 52, p. 45.

862.	Zamencik J., Armstrong D. T., Green K. Clin. Chem., 1978, v. 24, p. 627.

863.	Zaretskii V. I. Mass Spectrometry of Steroids. Wiley, New York, To-
ronto, 1976.

864.	Zielinski W. L., Johnston K., Muschik G. M. Anal. Chem., 1976, v. 48,
p. 907.

865.	Zimmerman W. Z. Physiol. Chem., 1935, v. 233, p. 257.

866.	Zimmerman W. Chemische Bestimmungsmethoden von Steroidhormonen
in Korperfliissigkeiten. Springer, Berlin, Heidelberg, Gottingen, 1955,
pp. 53—57, 63—75.

867.	Zuleski F. R., Loh A., Carlo F. J. D. J. Pharm. Sci., 1978, v. 67, p. 1138.

868.	Zuman P. Taianta, 1965, v. 12, p. 1337.

869.	Zuman P., Tenygl J., Brezina M. Coil Czech. Chem. Comm., 1954, v. 19,
p. 46.
3

КОРТИКОСТЕРОИДЫ

3.1.	ОСНОВЫ ХИМИИ КОРТИКОСТЕРОИДОВ

Гл. 3 посвящена анализу гормонов, выделяемых корой над-
почечников, их синтетических производных и метаболитов.

Как и половые гормоны (см. с. 18), кортикостероиды об-
разуются в организме из холестерина в серии каталитических
реакций, промежуточным продуктом в которых является проге-
стерон.

Как видно из схемы (3.1), общими структурными элемен-
тами кортикостероидов являются прегнановый скелет, Л4-3-кето-
и 20-кетогруппы, оксигруппа при С-21, в большинстве соедине-
ний оксигруппа при С-11 (в некоторых случаях она заменена
кетогруппой), а в глюкокортикоидах еще одна оксигруппа при
С-17. 17-Дезоксипроизводные составляют группу минералокор-
тикостероидов, главная функция которых заключается в регули-
ровании процессов метаболизма под действием электролитов
и воды, в то время как глюкурониды влияют на метаболизм
с участием углеводов.

Метаболизм кортикостероидов включает совместное восста-
новление 3-кетогруппы и Л4-двойной связи с образованием
«тетрагидропроизводных», которые могут существовать в четы-
рех изомерных формах (За, 5а; 30, 5а; За, 50; 30, 50). Как
в 50-, так и в 5а(алло)-изомерах 3-оксигруппа находится пре-
имущественно в а-конфигурации.

На последующей стадии метаболизма происходит восста-
новление 20-кетогруппы с образованием двух изомеров (напри-
мер, а- и Р-кортола в случае гидрокортизона). Все упомянутые
(а также неупомянутые) метаболиты выводятся из организма
в виде глюкуронидов или сульфатов (преимущественно по 3-
и (или) 21-оксигруппам) или подвергаются дальнейшему пре-
вращению с образованием 17-кетостероидов с отщеплением бо-
ковой 17-цепи (производные андростерона и этиохоланолона).

тетрагидрокортизол
Рамки этого небольшого раздела не позволяют даже очер-
тить обширную область терапии, в которой применяются корти-
костероиды. Их используют при нарушениях функции коры над-
почечников, в качестве противовоспалительных средств (в виде
инъекций, таблеток и препаратов для наружного применения),
а также при лечении аллергических и ряда других заболеваний.
Из природных кортикостероидов в терапии находят применение
дезоксикортикостерон и особенно гидрокортизон и его 11-кето-
аналог (кортизон). В настоящее время в терапии, как пра-
вило, используются синтетические кортикостероиды. Можно
назвать следующие важнейшие структурные изменения, вноси-
мые в молекулы стероидов с целью усиления терапевтического
эффекта и расширения области применения:

а)	введение двойной связи в положение Л1 с образованием
преднизолона и преднизона из гидрокортизона и кортизона;

б)	введение галогенов, в основном фтора, в положения 6
и (или) 9, а иногда и в другие положения; так, например, фтор-
кортизон является 9-фторпроизводным гидрокортизона;

в)	введение метильной группы в положение 6 или 16
и оксигруппы в положение 16; например, медрол представляет
собой ба-метильное производное преднизолона;

г)	комбинированное введение указанных функциональных
групп, приводящее к получению большого числа новых очень
эффективных лекарственных препаратов: дексаметазона и бета-
метазона (соответственно 16а- и 1бр-метильные производные
9-фторпреднизолона), флуметазона (6а,9-дифтор-16а-метилпред-
низолон), триамцинолона (9-фтор-16а-оксипреднизолон), флюо-
цинолона (6а,9-дифтор-16а-оксипреднизолон), флюокортолона
(Д1-6а-фтор-16а-метильное производное кортикостерона) и бек-
лометазона (9-хлор-1бр-метильное производное преднизолона);

д)	применение как природных, так и синтетических корти-
костероидов в терапии в форме сложных эфиров, в основном по
*21-оксигруппе, а иногда по 16- или 17-оксигруппе. Что касается
этих эфиров, то особенно важны водорастворимые натриевые
соли их 21-фосфатов или гемисукцинатов. Водорастворимые
производные можно также получить замещением 21-оксигруппы
на аминопроизводные. Например, деперзолон есть не что иное,
как гидрохлорид 21-N-(N-метилпиперазинил)преднизолон.

16а, 17а-Диоксикортикостероиды (триамцинолон, флюоци-
нолон и т. и.) часто используются в форме циклических кета-
лей, образующихся при взаимодействии с ацетоном и другими
кетонами.

Кортикостероиды (даже встречающиеся в природе) полу-
чают в промышленном масштабе полусинтетически, в основном
из стероидов растительного происхождения (сапогенинов, стери-
нов) химическими и микробиологическими методами.
* Об изомерных формах см. с. 236.

14 Заказ № 182
3.2.	МЕТОДЫ АНАЛИЗА КОРТИКОСТЕРОИДОВ

3.2.1.	УФ-СПЕКТРОФОТОМЕТРИЧЕСКИЕ

И КОЛОРИМЕТРИЧЕСКИЕ МЕТОДЫ,

ОСНОВАННЫЕ НА ХИМИЧЕСКИХ РЕАКЦИЯХ*

В этом разделе обсуждаются спектрофотометрические и ко-
лориметрические методы, основанные на реакциях а-кетольной
С-17 боковой цепи кортикостероидов. Реакционноспособность
С-17 боковой цепи создает разнообразные возможности для
анализа. Кроме того, эта весьма чувствительная часть моле-
кулы легко подвергается действию окислителей, кислот и осно-
ваний, что можно использовать для разработки селективных
методов [128]. Методы определения ненасыщенной 3-кето-
группы, изложенные в разделе, посвященном их применению
в анализе половых гормонов (разд. 2.2.2), иногда используются
и для определения кортикостероидов (в основном ГИН-метод),
но они малоизбирательны.

Методы с использованием солей тетразолия

Этот метод, впервые использованный для прямого колори-
метрического определения кортикостероидов Ченом и сотр.
[63] и Мадером и Буком [191], сейчас является важнейшим
фотометрическим методом анализа кортикостероидных лекар-
ственных препаратов, сохранившим в то же время свое преж-
нее значение в анализе биологических объектов.

Механизм реакции между кортикостероидами и бесцвет-
ными тетразолиевыми солями с образованием формазанов
исследован Гёрёгом и Хорватом [115], Грэхемом и сотр.
[121 —123,	125,	126, 226]! и Мёрле и Шиттенхельмом

[213, 214].

Ниже представлена реакция между С-17 боковой цепью кор-
тикостероидов и хлоридом трифенилтетразолия с образованием
спектрофотометрически активного формазана. Молярный ко-

* Прямой УФ-спектрофотометрический анализ кортикостероидов обсуж-
дается в разд. 2.2.1, озаглавленном «аф-Ненасыщенные кетоны», поскольку
при определении кортикостероидов по их 4-ен-З-кето- или 1,4-диен-З-кето-
группам, как и при определении половых гормонов, содержащих те же
группы, возникают одинаковые трудности.
эффициент поглощения в максимуме (при 485 нм) равен при-
мерно 16 200.

Если использовать димерную форму тетразолиевого синего
(ТС) [хлорид (3,3'-3,3'-диметокси-4,4'-дифенилен)бис(2,5'-дифе-
нил-2Н-тетразолия)], то в принципе могут образоваться два
окрашенных продукта восстановления: красный моноформазан,
МФ (лмаКс = 525 нм; е=24000) и синий диформазан, ДФ
(^макс = 590 нм; е=42000). Однако в действительности кон-
станта равновесия

. [ТС] [ДФ]
л [МФ]2

0,021

(3.3)

имеет очень малую величину [НЯ Это означает, что в обыч-
ных аналитических условиях фактически существует лишь кра-
сная форма, а синий диформазан образуется только при повы-
шенной температуре или в присутствии избытка стероида,
например если тетразолиевый синий используется в качестве
обнаруживающего реагента в тонкослойной или бумажной хро-
матографии.

На практике нашли применение оба реагента (и тетразолие-
вый синий, и хлорид трифенилтетразолия). Преимущество тет-
разолиевого синего состоит в его несколько более высокой чув-
ствительности, но эта цветная реакция имеет повышенную чув-
ствительность к свету [122] и чистоте реагента [174]. Основным
же недостатком реакции с солями трифенилтетразолия является
влияние кислорода воздуха, вследствие чего ее следует прово-
дить в атмосфере азота [158].

Подбору оптимальных условий и практическому применению
этого метода посвящены многочисленные статьи и несколько
обзоров, из которых здесь будут упомянуты лишь самые по-
следние [29, 116, 221, 306а].
Несмотря на то что некоторые восстановители, не относя-
щиеся к стероидам, дают положительную реакцию [128], в ко-
торую А4-3-кетогруппа кортикостероидов вносит свой, хотя и не-
большой, вклад [205] (в более жестких условиях эту же реак-
цию можно использовать для количественного определения
данной группы [268, 278] ), метод с использованием солей тетра-
золия пригоден для решения ряда практических задач как
в фармацевтическом, так и в биологическом анализе.

На реакционную способность боковой цепи влияют некото-
рые структурные особенности молекулы стероида. 21-Эфиры
кортикостероидов реагируют медленно и их нужно сначала под-
вергнуть гидролизу в щелочной среде [131, 274а]. (21-Фосфаты
можно определить только после ферментативного гидролиза
[302].) 11-Кетопроизводные более реакционноспособны, чем со-
ответствующие 11р-оксисоединения [125, 131]. Стерические пре-
пятствия у молекул 16-замещенных производных также могут
привести к уменьшению реакционной способности [125].

Для того чтобы повысить активность более инертных про-
изводных, нужно заменить этанол, обычно используемый в ка-
честве растворителя хлороформом [15] или еще лучше дихлор-
метаном. С помощью последнего Грэхем и сотр. [121, 123, 124]
сумели при комнатной температуре определить мало реакцион-
носпособные производные типа эфиров бетаметазона, которые
обычным методом можно анализировать только при повышен-
ной температуре.

Интересно заметить, что если наличие или отсутствие 17-ок-
сигруппы незначительно влияет на реакционную способность, то
в случае триамцинолона, содержащего 16а,17а-диоксигруппи-
ровки, интенсивность окраски, образующейся в результате ре-
акции с тетразолиевым синим, в два раза больше, чем в случае
16-дезоксипроизводного [15, 125]. Вероятно, это связано с D-ro-
моперегруппировкой кольца D первоначально образующегося
21-альдегида [115].

Эти методы определения кортикостероидов рекомендованы.
практически всеми фармакопеями (за основу обычно прини-
мают методики Джонсона и сотр. [158] и Кунца и Дэвиса [174],
принятые британской фармакопеей [39] и фармакопеей США
[299в] соответственно). Кроме того, следует упомянуть, что ме-
тод определения кортикостероидов в лекарственных готовых
формах с использованием тетразолиевого синего в ряде лабора-
торий автоматизирован [31, 32, 43] (см., например, разд. 3.3.2).

За последние несколько лет Грэхем и сотр. тщательно ис-
следовали кинетику реакции с участием тетразолиевого синего
и влияние на константу скорости (псевдопервого порядка) та-
ких факторов, как температура [226], pH [126] и диэлектриче-
ская проницаемость растворителя [121].
Опираясь на результаты этих исследований, Отейза и сотр.
[225] и Куппарис с сотр. [171а] разработали кинетические ме-
тоды определения гидрокортизона и фторкортикостероидов
(соответственно) в кожных мазях. В основе этих методов ле-
жит автоматическая регистрация первого линейного участка
кинетических кривых на спектрофотометрической установке
с остановленной струей и линейная зависимость наклона этих
кривых от концентрации кортикостероидов. Эти методы позво-
лили сократить время реакции с 90 мин (в равновесных мето-
дах) до 30—90 с. Лэндис [175а] предложил проточно-инжекци-
онный метод с продолжительностью реакции 30 с, основанной
на взаимодействии между кортикостероидами и тетразолиевым
синим в спирали длиной 3 м при нагревании до 55°С, который
позволяет анализировать 100 проб в час.

Метод Портера—Зильбера

Портер и Зильбер [232] первыми сообщили о появлении
желтой окраски при взаимодействии глюкокортикоидов с фе-
нилгидразином в сильнокислой среде (минералокортикосте-
роиды, не содержащие 17-оксигруппу, в эту реакцию не всту-
пают). Роль 17-оксигруппы ясна из приведенного ниже меха-
низма реакции: на первой стадии происходит катализируемое
кислотой внутримолекулярное окисление-восстановление с по-
терей 17-оксигруппы и образованием 21-альдегида; последний
вступает в реакцию конденсации с фенилгидразином, который
находится в сильнокислом растворе в виде окрашенного кати-
она фенилгидразония в енольной форме [25, 178].

(3.4>

Если основной областью применения тетразолиевого метода
является серийный фармацевтический анализ, то метод Пор-
тера—Зильбера (за исключением чрезвычайно редких случаев
применения в этой области [116]) всегда используется для
•определения глюкокортикоидов в моче и до сих пор остается
важнейшим методом анализа биологических объектов.

Хотя при определении конъюгатов в моче метод Портера—
Зильбера можно использовать непосредственно без разложения
конъюгатов, их обычно гидролизуют в присутствии р-глюкуро-
нидазы [94—96, 132, 258, 271а], чтобы получить экстрагируемые
свободные кортикостероиды. Экстракция дихлорметаном [94—
96, 300] очень важна, так как позволяет удалить нестероидные
хромогенные примеси. Эти примеси можно предварительно экс-
трагировать петролейным эфиром до экстракции дихлормета-
ном [90а, 300]. Ферментативный гидролиз и жидкостную экс-
тракцию можно заменить обработкой пробы мочи каолином
с последующим связыванием стероидов на колонке, заполнен-
ной смолой XAD-2 [14].

Что касается собственно колориметрической реакции, то ав-
торы первоначального варианта методики использовали в ка-
честве растворителя для фенилгидразина (65 мг/100 мл) смесь
метанола с водой в соотношении 62:38 (по объему) и прово-
дили реакцию в течение 20 мин при 60 °C, смешивая 8 мл ре-
агента с 1 мл метанольного раствора кортикостероидов [232].
Позднее метанол был заменен этанолом [271] и несколько сни-
жена концентрация серной кислоты (в большинстве методик,
рекомендуемых для серийного анализа).

Оптимальная длина волны при измерении около 410 нм. На-
дежность метода можно повысить, вводя поправку Аллена [14,
94, 300] [см. уравнение (2.8)]. Молярный коэффициент погло-
щения окрашенного соединения равен примерно 28 000. Хотя
на практике различные варианты метода дают несколько мень-
шие значения, чувствительность его достаточно высока, чтобы
провести определение глюкокортикоидов в нескольких милли-
литрах мочи.

Упомянем, что Хэдд [132] предложил использовать тетра-
тидрокортизон-З-Р-П-глюкуронид для проверки правильности
этого метода при определении конъюгатов кортикостероидов
в моче.

Для повышения чувствительности и устойчивости окраски
“Сангви и сотр. [257, 258] предложили использовать в качестве
реагента 4-гидразинбензолсульфокислоту. При взаимодействии
с этой кислотой в смеси 85 %-ной фосфорной кислоты и воды
в соотношении 4:6 (по объему) при нагревании до 100°С в те-
чение 1 ч 17-оксикортикостероиды образуют желтые продукты
(^макс = 355 нм). Благодаря увеличению чувствительности (е =
= 32 000) метод можно использовать для определения 17-окси-
кортикостероидов не только в моче [258], но и в плазме (2 мл),
как это описано Хэддом [133].
Наконец, остается упомянуть, что определениям по методу
Портера—Зильбера мешают различные лекарственные препа-
раты или их метаболиты: карбамазепин [13], эритромицин, фе-
назопиридин, манделат метенамина [95], ацетилспирамицин,
лейкомицин, триацетилолеандромицин, рифампицин и хлорпро-
мазин [94]. Автор этих последних статей Фуруйя предложил
устранять мешающее влияние этих веществ путем обработки
пробы гидросульфитом натрия после ферментативного гидро-
лиза до экстракции дихлорметаном.

Другие методы

Важное значение имеют также методы, основанные на реак-
циях боковой цепи кортикостероидов, которые можно считать
вариантами двух основных методов фотометрического анализа
кортикостероидов — тетр азол иевого и Портера—Зильбера. Лью-
барт и Мэттокс [177] предложили проводить окисление боковой
цепи (как 17-окси-, так и 17-дезоксипроизводных) ацетатом
меди(11) до 20-кето-21 -альдегида, который вступает в реакцию
конденсации с фенилгидразином в более мягких условиях (без
нагревания), чем рекомендуемые в первоначальной методике
Портера—Зильбера. Хотя метод Льюбарта—Мэттокса был раз-
работан для анализа биологических объектов, в дальнейшем
принцип, положенный в его основу, был использован главным
образом для анализа лекарственных препаратов, как это пока-
зано в табл. 3.1.

Приведенные в таблице данные показывают, что селектив-
ность методов анализа можно обеспечить правильным выбором
реагента и условий реакции. Например, при проведении реак-
ции Портера—Зильбера в жестких условиях 21-эфиры корти-
костероидов подвергаются гидролизу, и, таким образом, можно*
определить суммарное содержание эфира и свободного спирта.
Однако на основе вышеописанного принципа возможно селек-
тивное определение даже 0,1 % 21-оксигруппы в присутствии
эфиров [118]. Если в качестве окислителя использовать ацетат
ртути (II), то можно избирательно определить 21-амино-
кортикостероиды, поскольку этот реагент не взаимодействует
с 21-оксикортикостероидами [117]*.

Для одновременного определения 17-валерата бетаметазона
и продуктов его расщепления разработан дифференциальный
кинетический метод [134в], основанный на разной скорости

* Для оценки содержания 21-аминокортикостероидов применяются также
гравиметрия [119] и тонкослойная хроматография [114] (основанные на этой
же реакции).
Таблица 3.1. Фотометрическое определение кортикостероидов, основанное на
окислении С-17 боковой цепи до глиоксаля

Автор	Год	Стероиды	Образец	
Хафез и др. [59]	1974	Бензоат бетаметазона	Препараты для наруж- ного исследования	
Хафез, Цилифонис 158]	1977	Гидрокортизон, ацето- нид триамцинолона и т. п.	Лекарственные дозиро- ванные формы	
Гёрёг и Чепези [118]	1972	21 -Оксикортикостероиды	В массе фабричного продукта	
Чепези и Гёрёг (284]	1975	Преднизолон, ацетонид триамцинолона	Лекарственные дозиро- ванные формы	
Гёрёг и Чепези [117]	1972	21 -Аминокортикостерои- ды (деперзолон)	Лекарственные дозиро- ванные формы	
Токунага и сотр. [291]	1976	17 -Дезоксикортикосте- роиды	В массе фабричного продукта	
Токунага и сотр. [292]	1977	17-Оксикортикостероиды	В массе фабричного продукта, таблетки	
Бундгаард и Хан-	1978,	Различные кортикосте-	В массе фабричного	
•сен [43а, 1346]	1981	роиды	продукта, таблетки	
Окислитель	Конденсирующий агент	Длина волны, нм	е
Ацетат Си (II)	Хлорид фенилгидрази- ния+Н25О4	425	
Ацетат Си(II)	Хлорид фенилгидрази- ния	352—370	17 000—20 500
Ацетат Си (II)	4,5-Диметил-о-фенилен- диамин, НС1	351	12 500-12 700
Ацетат Си (II)	4,5-Диметил-о-фенилен- диамин, НС1	349—351	11800—12 600
Хлорид Hg(II) + + ЭДТА	4,5-Диметил-о-фенилен- диамин, НС1	351	12 500
Ацетат Си (II)	Пиррол, НС1	570	29 700—42 600
Ацетат Си (II)	Пиррол, НС1	590-600	26 600—35 000
Ацетат Си (II)	Гидразон 3-метил-бенз- тиазол-2-она	394—400	22 900—23 700
конденсации 20-кето-21-альдегидов с гидразоном 3-метилбенз-
тиазол-2-она, в котором использованы условия фотометрической
методики Бундгаарда и Хансена [43а, 134а] (см. табл. 3.1).

Колориметрический метод определения кортикостероидов,
основанный на отщеплении боковой цепи при действии сильных
окислителей и измерении количеств образующихся при этом
формальдегида или 17-кетогруппы (методом Циммермана, см.
разд. 2.2.2), используется в качестве стандартного метода
оценки содержания метаболитов кортикостероидов (формаль-
дегидогенных или 17-кетогенных стероидов) в моче. Для озна-
комления с этим вопросом можно обратиться к монографии
Джейла [156].

В качестве окислителя чаще всего применяют висмутат нат-
рия [220]. Для устранения мешающего влияния других кето-
групп их (а также 20-кетогруппы) можно восстановить боро-
гидридом натрия с последующим окислением образовавшихся
вицинальных диолов висмутатом натрия [10] или иодной кис-
лотой [90] до 17-кетонов. В настоящее время публикации по
этому вопросу появляются редко. Однако заслуживающим вни-
мания исключением является недавно вышедшая статья Сен-
сиола и сотр. [265]. Авторы сообщают об определении метабо-
литов кислотного характера в моче человека (20-кето-21-карбо-
новые кислоты). Эти метаболиты разделяют на смоле XAD-2
и жидкостной экстракцией, восстанавливают (20-кетогруппы)
борогидридом натрия, а затем окисляют иодной кислотой. Как
показано на схеме (3.5), 17-кетогруппа (которую можно опре-
делить методом Циммермана) селективно образуется из 17-ок-
сипроизводных.

соон

внг

соон
I

Другой классический метод колориметрического определения
кортикостероидов заключается в их обработке концентриро-
ванными минеральными кислотами. Концентрированная серная
кислота и различные реагенты на ее основе, описанные
в разд. 2.2.2 в основном как реагенты для определения эстроге-
нов (серная кислота, разбавленная различными растворите-
лями, реагенты типа реагента Кобера), успешно используются
также и в анализе кортикостероидов. В качестве исчерпываю-
щего литературного источника по этому вопросу рекомендуем

Л, нм

Рис. 3.1. Спектры поглощения кортикостероидов в концентрированной соляной
кислоте после нагревания при 80 °C в течение 30 мин [283].

1 — 17,21-диокси-4-прегнен-3,20-дион;	2 — 11а,17,21-триокси-4-прегнен-3,20-

дион; 3— 1 ip, 17,21-триокси-4-прегнен-3,20-дион (гидрокортизон); 4— 17,21-ди-
окси-4-прегнен-3,11,20-трион (кортизон).

монографию Какача и Вейделека [163]. Здесь же упомянем
лишь редко используемый хромогенный реагент — соляную
кислоту. Рис. 3.1, взятый из статей Шабо и Мицеи [283], ил-
люстрирует удивительную специфичность этого реагента. Из че-
тырех стероидов, отличающихся только заместителями при
С-11, 1 ф-оксипроизводное (гидрокортизон) обладает специфи-
ческой полосой поглощения при 465 нм (е^ 10 000); производ-
ные, не имеющие 11-заместителя или содержащие lla-окси- или
11-кетогруппу, не поглощают свет при этой длине волны.
В спектрах 17-дезоксипроизводных характерная полоса
1 ip-оксигруппы смещена к 365 нм, а у А^производных (напри-
мер, у преднизолона) она появляется при 540 нм.

Риу-Лакоста и Виль [244], нагревая кортикостероиды с ре-
агентом, содержащим уксусную кислоту, серную кислоту и ди-
фениламин (или N-метилдифениламин), получили продукты,
спектры которых отличаются необычно длинноволновым макси-
мумом. Положение полосы поглощения (600—650 нм) и скорость
реакции зависят от характера заместителя, особенно при С-11.

Для анализа кортикостероидов также применяется 2,4-ди-
нитрофенилгидразин с последующей обработкой полученных
производных гидроксидом натрия. Эта реакция характеризуется
чрезвычайно высокой чувствительностью, (молярный коэффици-
ент поглощения при определении преднизона равен 51600
при 480 нм [318]).

Наконец, следует упомянуть о необычайно избирательном
методе Гёрёга и Туба [120], предназначенном для определения
21-хлор- или 21-бром- и активных 21-сульфонилоксикортикосте-
роидов. Если эти стероиды нагреть с пиридином, а получив-
шееся производное 21-пиридиния перевести в щелочной среде
в желтый енолят [см. реакцию (3.6)], то молярный коэффициент
поглощения при 415 нм достигает 21 000.

R=H, ОН

Х=С1, Вг, 0-тозил?0-мезил и т.п.

3.2.2.	ФЛУОРИМЕТРИЯ

Интенсивность флуоресценции, вызываемой кислотами,
у кортикостероидов обычно меньше, чем у эстрогенов, тем не
менее этот метод повсеместно используется для их определения
в биологических образцах (но не в фармацевтическом анализе).
Обзоры литературных данных, полученных в этой области за
ранние годы, сделаны Голдцихером [107], Джейлом [156а]
и Зильбером [270].

Обычно в качестве флуорогенных реагентов используют
смеси серной кислоты и органических растворителей в различ-
ных соотношениях. Связь между структурой и интенсивностью
флуоресценции при действии наиболее часто применяемого ре-
агента [смеси серной кислоты и метанола в соотношении 3: 1
(по объему)] изучена Мондером и Кендэллом [209]. Некоторые
результаты их исследований приведены в табл. 3.2, из которой
следует, что этот реагент полезен при определении гидрокорти-
зона и кортикостерона — двух основных кортикостероидов, со-
держащихся в плазме и моче. Кроме того, необходимо отме-
тить, что помимо 4-ен-З-кетогруппы в появлении флуоресценции
важную роль играет 11-оксигруппа, тогда как 17-оксигруппа та-
ким свойством не обладает, а 21-оксигруппу можно заменить
альдегидной или карбоксильной группой без существенного ос-
лабления интенсивности флуоресценции. Наиболее интенсивная
флуоресценция наблюдается у 17|3-карбоксипроизводного. За-
служивает внимания и тот факт, что введение альдегидной
группы в положение 18 почти полностью гасит флуоресценцию,
а Д^двойная связь полностью подавляет ее. Чувствительность
этих методов определения гидрокортизона и кортикостерона
составляет порядка 10—100 нг/мл реагента. Флуоресценция
развивается полностью за 5—10 мин, и ее интенсивность
обычно не меняется по крайней мере в течение 1 ч. Поскольку
в литературе имеются сообщения об изменении интенсивности
неспецифической флуоресценции во времени, было предпринято
несколько попыток улучшить селективность метода выбором со-
ответствующего инкубационного периода [270], но ни одна из
них, по-видимому, не привела к решению проблемы, вследствие
чего приходится прибегать к жидкостной экстракции или
хроматографической очистке.

Таблица 3.2. Интенсивность флуоресценции кортикостероидов относительно
гидрокортизона а

Стероид	Интенсивность флуоресценции
1 ip,17а,21-Триокси-4-прегнен-3,20-дион (гидрокортизон)  11 а, 17а,21 -Триокси-4-прегнен-3,20-дион  Пр, 17а,20а,21-Тетраокси-4-прегнен-3-он  11 р,21-Диокси-4-прегнен-3,20-дион (кортикостерон)  17а,21-Диокси-4-прегнен-3,20-дион (вещество S Рейхштейна) ПР,17а-Диокси-3-кето-4-андростен-17-карбоновая кислота Гидрат 11р,17а-диокси-3,20-дикето-4-прегнен-21-аля  11Р,17а-Диокси-3,20-дикето-4-прегнен-21-карбоновая кислота 11р,17а-Диокси-3,20-дикето-4-прегнен-18-аль (альдостерон)  11Р, 17а,21 -Триокси-1,4-прегнадиен-3,20-дион (преднизолон) 17а,21-Диокси-5а-прегнан-3,11,20-трион	100  37  53  169 0,23  411  10  26 0,21 0  0

Условия'. 1 мкг кортикостероида реагирует с 2 мл смеси серной кислоты и этанола в соот-
ношении 3:1 (по объему) при комнатной температуре в течение 10 мин. Возбуждение при
470 нм, испускание при 520—530 нм [209].

Для экстракции пробы обычно применяют дихлорметан.
В этом случае флуориметрический анализ можно проводить,
экстрагируя флуорофор из органического слоя реагентом, со-
стоящим из серной кислоты и этанола. Для того чтобы значи-
тельно повысить избирательность определения, пробу следует
проэкстрагировать эфиром до экстракции дихлорметаном
и промыть дихлорметановый экстракт 0,1 М гидроксидом нат-
рия для уменьшения неспецифической флуоресценции. Из боль-
шинства «ускоренных методик» [105, 199, 219, 239] эти и дру-
гие (в основном хроматографические [146]) стадии очистки
чаще всего исключены, но последние исследования (например,
Бутте и сотр. [48, 49]) показали, что ускоренные методики
дают существенно завышенные результаты. Особого внимания
заслуживают систематические исследования Радо и сотрудни-
ков, показавших, что некоторые синтетические лекарственные
препараты, например карбамазепин [235], бенциклан * [236],
имипрамин * и тримипрамин [237], окспренолол и пропрано-
лол * [238], интенсивно флуоресцируют и, следовательно, ме-
шают флуориметрическому определению кортикостероидов
в плазме и моче по широко известной методике Мэттиньи
[199]. Аналогичное действие оказывают спиронолактоны и их
метаболиты [204].

Если целью анализа является не только определение об-
щего содержания кортикостероидов, но также индивидуальных
концентраций гидрокортизона и кортикостерона, часто приме-
няют экстракцию смесью воды и тетрахлорида углерода. Напри-
мер, по последнему варианту этого метода, предложенному
Пейнтером и др. [227], остаток после выпаривания дихлормета-
нового экстракта растворяют в водном этаноле, промывают
гексаном и экстрагируют тетрахлоридом углерода. Кортикосте-
рон можно определить непосредственно в органической фазе,
а гидрокортизон нужно сначала экстрагировать из водной фазы
дихлорметаном. Путем добавления к пробе меченного тритием
кортикостерона и меченного 14С гидрокортизона с последующим
измерением на сцинтилляционном счетчике были внесены по-
правки на взаимное загрязнение экстрактов из-за неполной экс-
тракции. В этом методе неспецифическая флуоресценция была
учтена путем использования в качестве холостого раствора
аликвотной части дихлорметанового экстракта, проведенного
через все стадии определения, после гашения флуоресценции
кортикостероидов путем превращения их в 3-оксимы.

Как видно из табл. 3.2, альдостерон при действии реагента
серная кислота—этанол флуоресцирует очень слабо. Чтобы
сделать возможным определение этого кортикостероида, Вигхэм
[311] окислил его 19-альдегидную группу в карбоксильную ре-
агентом Бенедикта [сульфат меди (II)—цитрат натрия—карбо-
нат натрия]. В этой форме альдостерон проявляет флуоресцен-
цию, позволяющую проводить его определение в моче. Флуорес-
центную реакцию проводят в две стадии; желтый продукт,
полученный при нагревании пробы с 85?/0-ной (по объему) сер-
ной кислотой, переводят в красный продукт (возбуждение при
586 нм, излучение при 610 нм) путем добавления метанольного

* В государственной фармакопее СССР приняты названия галидор, ими-
зин и анаприлин соответственно.— Прим, перев.
раствора хлорида железа(III), что значительно улучшает изби-
рательность метода.

Из флуориметрических методов, не связанных с вызываемой
кислотами флуоресценцией, привлекает внимание методика
Токунаги и сотр. [2926]. По этой методике 20-кето-21-альдегид-
ная группа, полученная окислением а-кетольной боковой цепи
ацетатом меди(II), конденсируется с пирролом с образованием
сильного флуорофора (возбуждение при 594 нм, испускание при
617 нм; линейная зависимость от концентрации наблюдается
в области нанограммовых концентраций).

3.2.3.	ПОЛЯРОГРАФИЯ

Проблемы и возможности полярографического анализа как
природных и синтетических кортикостероидов, так и андрогенов
и гестогенов очень схожи, поскольку все они содержат одни и
те же полярографически активные центры, а именно 4-ен-З-ке-
то- или 1,4-диен-З-кетогруппы. Поэтому общие положения, из-
ложенные во введении к разд. 2.2.6, справедливы и для ана-
лиза стероидных гормонов этого класса.

Если не считать раннего периода, полярография применяется
почти исключительно для анализа лекарственных дозированных
форм. Описан ряд случаев применения даже классической по-
лярографии в определении преднизолона и преднизона в таб-
летках [81], гидрокортизона в мазях [98] и т. п. Введение со-
временных методов создало новые возможности использования
полярографии в анализе кортикостероидов (переменнотоковая
полярография [319], полярография по второй гармонике [138],
использование апротонных растворителей [319]).

Наиболее важным этапом развития следует, вероятно, счи-
тать введение дифференциальной импульсной полярографии.
Повышенная чувствительность этого метода (область опреде-
ляемых концентраций 5—40 мкг/мл [154, 321]) позволяет ана-
лизировать низкодозированные препараты с высокой степенью
точности. Существенным достоинством метода является то, что
он требует меньших затрат труда, нежели спектрофотометриче-
ские, колориметрические и т. п. методы, так как при анализе
таблеток преднизона и преднизолона [321] и некоторых других
не нужно отделять основу таблеток, а при определении гидро-
кортизона в некоторых мазях и кремах не требуется проведе-
ния экстракции [154]. Однако мази, содержащие декамин или
полиэтиленгликоль, нельзя анализировать без предваритель-
ного разделения, поскольку эти поверхностно-активные веще-
ства полностью ингибируют восстановление гидрокортизона.
В серии недавно опубликованных статей Де Бойер и сотрудники
подробно рассмотрели практические [71 (а—в)] и теоретические
[71, 71г] вопросы определения кортикостероидов в чистых со-
единениях [71а] и сложных [71в] растворах, мазях и кремах
методом дифференциальной импульсной полярографии. Опре-
деление ацетонида флуоцинолона в аналогичных лекарствен-
ных формах описали Люнг и Там [1766]. Следует заметить, что
эти методы не позволяют оценить стабильность препарата, так
как возможное разрушение кортикостероидов по С-17 боковой
цепи не влияет на пик, обусловленный восстановлением А4-3-
кетогруппы.

Напряжение, В

Рис. 3.2. Дифференциальная импульс-
ная полярограмма дексаметазона
(10~4 М) (растворитель 0,03 М гид-
роксид тетраметиламмония в мета-
ноле, амплитуда импульса 100 мВ,
период капания 2 с) [71].

Кроме процесса восстановления, приводящего к образованию
димерного пинакона [см. реакцию (2.11)], Де Бойер и сотр.
[71] наблюдали небольшой пик, отвечающий частичному вос-
становлению А1’4-3-кетостероидов до мономерного спирта. По
наблюдениям тех же авторов, кортикостероиды, содержащие
оксигруппы как в 17-, так и 21-положениях, дают интенсивные
пики около 2,0 В, соответствующие восстановлению 20-кетог
группы. Все три пика можно видеть на полярограмме дексаме-
тазона (рис. 3.2).

Стоит упомянуть также, что полярографический пик флу-
рандренолона (16,17-ацетонид 6а-фтор-11р,16а,17,21-тетраок-
си-4-прегнен-3,20-диона), который используется для определе-
ния его в мазях по методу, предложенному Хисманом и Вудом
[ 138], соответствует восстановительному элиминированию
фтора. Это, вероятно, обусловлено соседством с А4-3-кетогруп-
пой, так как ничего подобного не наблюдается для дексамета-
зона, содержащего атом фтора в положении 9, т. е. изолиро-
ванного от ненасыщенной кетогруппы [71, 71г].
3.2.4.	КОЛОНОЧНАЯ ХРОМАТОГРАФИЯ

Колоночная хроматография является важным методом раз-
деления и очистки кортикостероидов в биохимическом и фарма-
цевтическом анализе, а также, как и в случае анализа половых
гормонов, при подготовке проб (см. разд. 2.2.9) [139, 218, 234].
Стадия хроматографирования на колонке часто предшествует
определению спектрофотометрическими, газохроматографиче-
скими, радиоиммунными и другими методами.

Как правило, кортикостероиды — более полярные соедине-
ния, чем половые гормоны, но различие в полярности не очень
велико, поэтому для их разделения используют колонки с теми
же наполнителями, но с более полярными элюентами. До сих
пор находят применение «классические» адсорбенты типа сили-
кагеля, оксида алюминия и флорисила [87, 296], но роль их
уменьшилась по крайней мере в биологическом анализе. Ка-
вина и сотр. [56] описали интересный случай применения ко-
лонки длиной 30—100 см с внутренним диаметром 2 мм, запол-
ненной силикагелем. Используя градиентное элюирование
смесью хлороформа с метанолом, удалось удовлетворительно
разделить восемь кортикостероидов. Этот метод был использо-
ван для разделения компонентов экстрактов коры надпочечни-
ков перед идентификацией и количественным определением их
методом ТСХ [52].

Из разнообразных колоночных распределительных хромато-
графических систем [72, 129] отметим систему Грэхема и др.
[129], которые выделяли кортикостероиды на колонке с систе-
мой ацетонитрил—диатомит, а менее полярные компоненты и
продукты их разложения элюировали я-гептаном. Кортикосте-
роиды (вместе с ацетонитрилом) вымывали затем хлороформом
и определяли колориметрически.

Очень часто проводят хроматографирование на колонке, за-
полненной амберлитом XAD-2, в основном для «экстракции»
кортикостероидов. Целью ее может быть простое отделение сте-
роида от неорганических солей, мочевины и других компонен-
тов, как, например, в методе Скандретта и др. [260], в котором
после элюирования стероидов с колонки, заполненной смолой
XAD-2, метанолом необходимы стадии жидкостной экстракции,
хроматографирования на колонке (с сефадексом LH-20) и ТСХ
(в полиамидном слое), прежде чем определять альдостерон и
его тетрагидропроизводное в моче или плазме методом РИА
или газохроматографически. (Для аналитических целей служит
только смола XAD-2, см. рис. 3.3.) В ряде случаев хроматогра-
фирование на XAD-2 можно использовать также для простого
фракционирования, как, например, в методе Миябо и Корнела

15 Заказ № 182
Доза для приема
альдостерона и
р н ]- альдостерона

у

Пропускание мочи
через амберлит

XAD-2

Жидкость-мидкостная
экстракция (хлороформ ~/
вода)	/

у /
/
Хроматографирование
на DEAE-сефадексе

V

Амберлит ХАВ-2

Распределительная
.хроматография
(система Е)

у

Ионообменная
хроматография
(система Р) _

Амберлит ХАР-2

О 4	8	12

^Альдостерон-18/3-глюкозидуроновая
кислота

Рис. 3.3. Выделение альдостерон-18р-глюкозидуроновой кислоты из мочи чело-
века [53].

Заштрихованы зоны, содержащие альдостерон-18р-глюкозидуроновую кислоту
(альдо-18Р-ГК). НС — нейтральные соединения; С — сульфаты; система Е*:
целит—1,2-дихлорэтан—2-метилпропан-2-ол—вода—уксусная кислота (3:1:
:3 : 1); система Р: целит—аликват—0,2 М водный КС1.

[206], которые выделили фракцию метаболитов гидрокортизона
в форме сульфатов перед последующим разделением на инди-
видуальные конъюгаты методами бумажной хроматографии и
высоковольтного электрофореза на бумаге.

Из полидекстрановых гелей для разделения кортикостерои-
дов перед определением довольно часто используется сефадекс
LH-20. Из многочисленных примеров упомянем отделение гид-
рокортизона и эстрадиола от мешающих стероидов (в каче-
стве элюента смесь бензол—метанол (17 : 3), определение мето-
дом конкурирующего связывания белка [282]), разделение ве-
щества S Рейхштейна и альдостерона (в качестве элюента
смесь дихлорметан—ацетон (8:2), определение методом РИА
[273]), автоматическое многоколоночное разделение кортикосте-
роидов плазмы [272], отделение гидрокортизона, содержащегося
в моче, на колонке, заполненной липидексом 5000, с последую-
щим определением методом РИА (в качестве элюента смесь
петролейный эфир — хлороформ (1:1) [И]) и т. д.

Наконец, на рис. 3.3, взятом из статьи Карпентера и Мэт-
токса [53], представлена схема сложного процесса разделения,
включающая не менее шести стадий хроматографирования на
колонке. Целью этой работы было выделение ранее неизвест-
ного метаболита альдостерона для последующей идентификации
(было доказано, что это был 18Р-О-глюкуронид).

3.2.5.	БУМАЖНАЯ И ТОНКОСЛОЙНАЯ ХРОМАТОГРАФИЯ

Бумажная хроматография

Данная глава является единственной, в которой бумажная
хроматография выделена в отдельный подраздел. Причина
в том, что сейчас в хроматографии стероидных гормонов бу-
мажная хроматография сохранила большее значение в области
кортикостероидов (и особенно их конъюгатов), чем в области
стероидов с менее полярными группами. В дополнение к обсуж-
дению во введении к разд. 2.2.10 (включая ссылки на фунда-
ментальные монографии и главы, посвященные этому вопросу)
следует упомянуть недавно опубликованный обзор Мэттокса и
Литвиллера [203], в котором табулированы данные о подвиж-
ностях на бумаге 61 производного ди-, три и тетраоксипрегна-
нов в нескольких классических системах растворителей типа
систем Заффарони и Буша. (Первые использовали сильнополяр-
ные, малолетучие неподвижные фазы, например гликоль и фор-
мамид, и гексан, бензол и т. п. в качестве подвижной фазы,
а вторые — те же подвижные фазы в сочетании с летучими не-
подвижными фазами, например смесями вода—метанол или
этанолом и т. п.) Мэттокс и др. [200—202] изучили большое
число жидких ионообменников с целью использования их для
разделения конъюгатов кортикостероидов кислого характера.
Один из методов заключается во введении ионообменника (ор-
ганические амины и их соли) в подвижную фазу для увеличе-
ния растворимости стероидов [200, 201], а в другом методе [202]
вышеупомянутые соли, например аликват (хлорид метилтрика-
приламмония), используют в качестве неподвижной фазы
15 *
в сочетании с водными растворами хлорида калия в качестве
подвижной фазы.

Ряд других методов с использованием бумажной хромато-
графии находит применение в сложных аналитических методи-
ках для очистки или разделения кортикостероидов перед по-
следующей идентификацией и количественным определением [53,
67, 73, 88, 170, 206, 261, 276, 316а].

Разделение методом ТСХ
и проблемы детектирования

Несмотря на преимущества бумажной хроматографии для
анализа кортикостероидов, тонкослойная хроматография потес-
нила ее даже здесь, главным образом благодаря своей скоро-
сти и универсальности. В качестве основных литературных
источников можно пользоваться теми же книгами, которые реко-
мендованы для изучения анализа половых гормонов, а большин-
ство положений разд. 2.2.10 применимо и к кортикостероидам.

Адсорбентом чаще всего служит силикагель, а употребляе-
мые системы растворителей несколько более полярны, чем при
разделении половых гормонов. В табл. 3.3, составленной по ха-
рактеристикам удерживания, заимствованным из статей Лисбоа
[182] и Бэйли и сотр. [23], приведены некоторые характерные
примеры разделения природных кортикостероидов и синтетиче-
ских лекарственных препаратов на этом адсорбенте. (Данные
об удерживании восьми кортикостероидов на силикагеле и ок-
сиде алюминия содержатся также в табл. 2.8.)

Фундаментальные сведения о разделении кортикостероидов
методом ТСХ на силикагелевых пластинках приводятся в ос-
новном в публикациях Лисбоа [181—183]. Из многочисленных
более поздних примеров применения ТСХ назовем исследова-
ния разделений методом двумерной хроматографии [277], раз-
деление А4- и А1’4-3-кетостероидов из растворов при фермента-
ции [8] и контроль стабильности кортикостероидов в лекарст-
венных дозированных формах [176] и биологических объектах
[190].

Из других адсорбентов, реже используемых в ТСХ для раз-
деления кортикостероидов, следует упомянуть о применении по-
лиамидных слоев (вместо колонки, заполненной сефадексом
LH-20 [259]) и поливинилпирролидонового слоя [194].

Поскольку из всех групп стероидов кортикостероиды наи-
более чувствительны к окислению, следует принимать во вни-
мание возможность их разложения вследствие окисления, в ча-
стности если действию кислорода воздуха подвергаются неболь-
шие количества вещества в течение длительного времени (на-
пример, при авторадиографии). Такое разложение можно
Таблица 3.3. Разделение некоторых адренокортикоидов и родственных
лекарственных препаратов (значения RF) с помощью ТСХ
на силикагеле [23, 182]

Стероид	Элюент					
	1	2	3	4	5	б
						
21-ОН-Р-4-ен-3,20-дион (дезоксикор- тикостерон)	40	62	55	55		
21-ОН-Р-4-ен-3,20-дион-21-Ас (ацетат дезоксикортикостерона)						70
11р,21-Ди-ОН-Р-4-ен-3,20-дион (кор- тикостерон)	22	31	37	38		
11а,21-Ди-ОН-Р-4-ен-3,20-дион	13	20	22	26		
17,21-Ди-ОН-Р-4-ен-3,20-дион  (вещество S Рейхштейна)	38	41	57	49		
21-ОН-Р-4-ен-3,11,20-трион	21	49	37	42		
17,21-Ди-ОН-Р-4-ен-3,11,20-трион (кортизон)	21	34	41	43		
17,21-Ди-ОН-Р-4-ен-3,11,20-трион-21- Ас (ацетат кортизона)					97	46
11 р, 17,21 -Три-ОН-Р-4-ен-3,20-дион (гидрокортизон)	28	18	44	37	58	9
ИР, 17,21-Три-Он-Р-4-ен-3,20-дион-21-  Ас (ацетат гидрокортизона)					90	32
11а, 17,21-Три-ОН-Р-4-ен-3,20-дион	16	11	28	25		
17,20р,21-Три-ОН-Р-4-ен-3,11-дион	9	16	20	25		
11 р,21-Ди-ОН-3,20-дикето-Р-4-ен- 18-аль (альдостерон)	16	26	26	32		
1 ip,17,21-Три-ОН-Р-1,4-диен-3,20-дион (преднизолон)					47	7
Продолжение табл. 3.3

Стероид	Элюент					
	1	2	3	4	5	б
11Р, 17,21 -Три-ОН-Р-1,4-диен-3,20-  дион-21-Ас (ацетат преднизолона)					82	27
17,21-Ди-ОН-Р-1,4-диен-3,11,20-трион (преднизон)					68	18
17,21-Ди-ОН-Р-1,4-диен-3,11,20-трион-  21-Ас (ацетат преднизона)					94	39
9-Р-11р,17,21-Три-ОН-Р-4-ен-3,20-  дион-21-Ас (ацетат фторкортизона)					94	36
9-Р-16а-Ме-11р,17,21-Три-ОН-Р-1,4-  диен-3,20-дион (дексаметазон)					61	9
9-Р-16р-Ме-11р,17,21-Три-ОН-Р-1,4-  диен-3,20-дион (бетаметазон)					62	10
9-Р-1бР-Ме-НР,17,21-Три-ОН-Р-1,4- диен-3,20-дион-17-валерат (валерат бетаметазона)						32
9-F-11р,16а,17,21-Тетра-ОН-Р-1,4-  диен-3,20-дион (триамцинолон)					37	5
9-F-11 р, 1 бос, 17,21 -Тетра-ОН-Р-1,4- диен-3,20-дион-16,21 -ди-Ас (диацетат триамцинолона)					82	38
9-F-11Р,16а,17,21-Тетра-ОН-Р-1,4-  диен-3,20-дион- 16,17-ацетонид (аце- тонид триамцинолона)						29

Обозначения. 1: циклогексан—этилацетат—этанол (9:9:2); 2: хлороформ—этанол
(9:1); 3: этилацетат—гексан—уксусная кислота—этанол (144:27:20:9); 4: бензол—эта-
нол (4:1); 5: дихлорметан—диоксан—вода (2:1:1) (нижняя фаза); 6: дихлорэтан-
метанол—вода (95 : 5 : 0,2); Р — прегнан; F — фтор; ОН — окси; Ас — ацетат; Me — метил.
предотвратить с помощью антиоксидантов, например путем об-
работки слоя насыщенным этанольным раствором аскорбиновой
кислоты [93].

Для проявления пятен можно использовать опрыскивающие
реагенты, обычно применяемые в анализе стероидов и перечис-
ленные в разд. 2.2.10, но чаще всего таким реагентом для кор-
тикостероидов (специфичным для восстановления боковой цепи)
служит тетразолиевый синий (или другие тетразолиевые реа-
генты), чувствительность которых можно повысить введением
их в слой [308] (химизм реакции обсуждается в разд. 3.2.1).

Количественный анализ

Определение кортикостероидов после разделения методами
ТСХ и элюирования пятен — очень широко распространенный
прием в фармацевтическом анализе стероидов. В качестве при-
мера можно привести метод УФ-спектрофотометрического опре-
деления на основе светопоглощения Д4-3-кетогруппой при
240 нм, опубликованный Мачиочи и Фиотеком [189]. Авторы
определяли гидрокортизон в мази, содержащей хлорамфеникол
и метилпарабен, после их разделения методами ТСХ на сили-
кагеле (дихлорметан—бутанол—ацетон в соотношении 254 : 30 :
: 14) и элюирования пятен метанолом. Проведение реакции
с тетразолиевым синим после ТСХ-разделения и элюирования
пятна — один из стандартных методов в фармакопее XX США
[299г]. Предварительное разделение методом ТСХ значительно
повышает селективность реакции с тетразолиевым синим и по-
зволяет использовать его для изучения устойчивости и определе-
ния главных компонентов в присутствии родственных стероидов,
как, например, при определении ацетонида флурандренолона
(16,17-ацетонида 6а-фтор-11р, 16а, 17,21-тетраокси-4-прегнен-3,20-
диона). Бишара и Яковлевич [33] проверяли этим способом
чистоту последнего. Хроматографирование и многократное
элюирование проводили на пластинке, покрытой силикагелем
с добавкой флуоресцентного индикатора; при облучении корот-
коволновым УФ-излучением по гашению флуоресценции было
проведено полуколичественное определение посторонних родст-
венных стероидов (путем визуального сравнения с соответст-
вующими стандартными препаратами). Основное пятно элюиро-
вали этанолом и проводили в элюате реакцию с тетразолиевым
синим.

Разделение и очистка методом ТСХ перед определением иг-
рает важную роль и при анализе биологических объектов. Ста-
дия ТСХ либо является частью сложного подготовительного
процесса, либо (в небольшом числе случаев) методика опреде-
ления достаточно специфична, чтобы ограничиться только од-
ним (или несколькими) разделением в тонких слоях. Примером
может служить определение кортикостероидов в плазме по ме-
тоду Сейбла-Эмплиса и др. [254], по которому дихлорметано-
вый экстракт из плазмы крови подвергают ТСХ с многократ-
ным элюированием, а пятно кортикостерона (после проявления
парами иода) элюируют метанолом и количественно опреде-
ляют флуориметрически.

Важной областью применения тонкослойной хроматографии
является очистка пробы для последующего РИА или другого
варианта метода конкурирующего связывания белка [141, 144,
233]. Специальные проблемы подготовки пробы и источники
ошибок разобраны в обзоре Глейспаха [104].

Существуют разные возможности для прямого сканирования
in situ тонкослойных хроматограмм кортикостероидов. Первая
из них заключается в измерении ослабления интенсивности по-
лосы поглощения при 240 нм ненасыщенной 3-кетогруппы
[183а]. Таким путем Каммерль и Мучлер [164] провели опреде-
ление преднизолона в отдельной таблетке. Тот же прием был
успешно использован Поляковым и сотр. [231а] для определе-
ния гидрокортизона в сыворотке. Гудел [109] показал, что при
исследовании ацетонида флюоцинолона лучше использовать бо-
лее тонкий слой, чем обычно (0,14 мм), так как при этом мо-
жно уменьшить интерференцию, вызываемую поглощением си-
ликагеля G при сканировании в относительно коротковолновой
области (238 нм).

Другой возможностью использования полосы поглощения
при 240 нм является сканирование хроматограмм, основанное
на гашении флуоресценции при 254 нм на пластинке, покрытой
силикагелем F-254. Сравнивая точность этого метода и УФ-
спектрофотометрического метода (с элюированием пятна), Ма-
чиочи и Фиотек [189] пришли к выводу, что стандартное откло-
нение первого метода гораздо выше.

Сканирование хроматограмм можно проводить и в видимой
области спектра, если проявлять пятна соответствующим опрыс-
кивающим реагентом. Таким реагентом может быть тетразолие-
вый синий [134, 183а] или смесь серная кислота—этанол [212].-
В последнем случае содержание преднизолона в плазме можно
определить, нанося экстракт непосредственно на пластинку.
Хаф и сотр. [151] разработали метод ТСХ с денситометриче-
ским детектированием для определения ацетата гидрокорти-
зона в мазях, используя для опрыскивания п-толуолсульфокис-
лоту и сканируя хроматограммы при 404 нм. Функ и сотр.
[93а] добились исключительно высоких чувствительности (до
2,5 пг) и селективности при определении гидрокортизона в сы-
воротке, используя предварительную дериватизацию дансилгид-
разином и измеряя флуоресценцию (возбуждение при 365 нм,
излучение при 460 нм).
3.2.6.	ГАЗОВАЯ ХРОМАТОГРАФИЯ

Термическая неустойчивость С-17-боковой цепи

Общие вопросы газохроматографического анализа стероид-
ных гормонов обсуждались в разд. 2.2.11 (см. также приведен-
ные в нем ссылки на работы, в которых содержатся важные
сведения по применению этого метода для определения корти-
костероидов). Однако следует подчеркнуть, что общие положе-
ния, обсуждавшиеся в разд. 2.2.11, только частично справед-
ливы для обнаружения кортикостероидов. Причина здесь в том,
что если большинство других стероидных гормонов можно хро-
матографировать без дериватизации, а целью дериватизации яв-
ляется обычно улучшение селективности, повышение чувстви-
тельности и уменьшение потерь, то надежное газохроматогра-
фическое определение кортикостероидов возможно только
в виде производных. Из-за термической неустойчивости корти-
костероидов [обусловленной наличием 17- и (или) 21-оксигрупп
в 20-кетопрегнановой боковой цепи, в целом устойчивой] дери-
ватизация является главной проблемой газовой хроматографии
кортикостероидов.

Основной путь разрушения стероидов с диоксиацетоновой
боковой цепью состоит в раскрытии 17—20-связи и образовании
17-кетопроизводных [19, 20, 111], но следует принимать во вни-
мание и другие реакции (например, образование D-гомопроиз-
водных [251]).

Несмотря на то что эти проблемы решаются путем дерива-
тизации (описанной в следующем разделе) и для газохромато-
графического анализа кортикостероидов разработаны довольно
надежные методы, многие аналитики все же считают газохро-
матографические методы громоздкими и недостаточно точными
и отдают предпочтение высокоэффективной жидкостной хрома-
тографии. О существовании такого предпочтения свидетельст-
вуют следующие факты:

1.	Газовая хроматография, по-видимому, не нашла приме-
нения в анализе лекарственных дозированных форм кортикосте-
роидов, где требования к воспроизводимости и точности выше,
чем в биологическом анализе стероидов *.

2.	После введения высокоэффективной жидкостной хромато-

* По мнению автора, здесь имеются два исключения. Токунага и др.
[292а] сообщают о применении газовой хроматографии для анализа декса-
метазона в таблетках после триметилсилилирования. В примечании к статье
Фэйрбразера [85] имеется указание об определении ацетонида триамцинолона
фирмы «Сквибб» (после триметилсилилирования) газохроматографическим
путем. Следует, однако, заметить, что в этом соединении 17а-оксигруппа,
оказывающая главное влияние на устойчивость, блокирована высоко устойчи-
вым 16,17-ацетонидным кольцом.
графин в анализ стероидов в отличие от ситуации, сложившейся
в анализе других групп стероидных гормонов, число статей,
посвященных газохроматографическому анализу кортикостерои-
дов, значительно снизилось, в то же время огромное количество
статей публикуется по ВЭЖХ в биохимическом анализе корти-
костероидов.

Тем не менее газовая хроматография кортикостероидов все
еще играет важную роль в анализе биологических объектов
при установлении профиля концентрации стероидов (см. разд.
2.2.11) и при определении низких концентраций отдельных кор-
тикостероидов, когда необходима (например, при определении
альдостерона) более высокая чувствительность, которую обес-
печивает газовая хроматография (особенно с детектором элек-
тронного захвата). Другая причина важности газохроматогра-
фических исследований кортикостероидов состоит в возможно-
сти использования высокоизбирательного и чувствительного ме-
тода хромато-масс-спектрометрии.

Методы дериватизации

На схемах (3.7) — (3.12) представлена серия реакций, ис-
пользованных Мейсоном и Фрезером [195] для дериватизации
кортикостероидов плазмы.

Дезоксикортикостерон (ДОК) и кортизон, не содер-
жащие 17-оксигрупп, становятся термически устойчивыми в ре-
зультате превращения в 21-гептафторбутираты [реакции (3.7) и
(3.8)]. В указанных условиях [реакция протекает за 30 мин
при 60 °C в смеси гептафтормасляного ангидрида и бензола
в соотношении 1 : 1 (по объему)] образуется также гептафтор-
бутират енольной формы А4-3-кетогруппы (см. разд. 2.2.11), что
позволяет определять эти производные с высокой чувствитель-
ностью при помощи детектора электронного захвата (1,44 пг
ДОК и 2,50 пг кортикостерона дают пик высотой 1 см при мак-
симальной чувствительности детектора). 17-Дезоксипроизводные
иногда анализируют газохроматографически в форме 21-ацета-
тов [82, 267].

С=О
I

C3F7

Окислительные реакции (3.9) и (3.10) напоминают про-
цессы, происходящие при термическом разложении 17,21-диок-
сикортикостероидов в испарителе, т. е. образование 17-кетопро-
изводных (следует заметить, что раньше самопроизвольное раз-
рушение недериватизированной боковой цепи более или менее
успешно использовалось в газовой хроматографии для количе-
ственного определения [111, 188]). Термически устойчивые про-
изводные переводят в гептафторбутираты енольной формы с це-
лью повышения чувствительности, так как в этом случае можно
использовать ДЭЗ. Окислительное отщепление боковой цепи
обычно проводят с помощью висмутата натрия [19, 20, 305].

Как следует из схем (3.11) и (3.12), иодная кислота окис-
ляет 18-оксидезоксикортикостерон и альдостерон до устойчивых
лактона и гемикетальлактона соответственно *. Эта реакция
лежит в основе многочисленных газохроматографических мето-
дов [195, 228, 293, 315].

Превращение 17-оксикортикостероидов в 17-кетопроизвод-
ные можно осуществить восстановлением 20-кетогруппы боро-
гидридом натрия с последующим окислением образующегося
гликоля иодной кислотой (см. разд. 3.2.1). Оксигруппы продук-
тов реакции формилируют [193], ацетилируют [69] или пропио-
нилируют [83].

Другим путем защиты С-17 боковой цепи от термического
разложения является триметилсилилирование. Этот способ де-
риватизации применяется чаще, чем описанные до сих пор
методы. Доказано, что в ряде случаев триметилсилилирование
оксигрупп в молекуле кортикостероидов предотвращает их раз-
ложение [250], о чем недавно сообщалось в литературе [79,
103]. При этом в обычных условиях силилирования получаются
(17) ,21 -бис (триметилсилилированные) производные. В более
жестких условиях силилирования (щелочной катализ) происхо-
дит енолизация 20-кетогруппы с образованием 17,20,21-трис (три-
метилсилилокси)-20(21)-прегнена [60, 61], что обеспечивает бо-
лее надежную защиту боковой цепи.

Чаще всего для защиты боковой цепи кортикостероидов не-
обходима двойная дериватизация: образование метоксима по
20-кетогруппе с последующим силилированием 17- и 20-окси-
групп. Этот метод предложен Гардинером и Хорнингом [99] и
Харой с сотр. [135]:

БСА,ТМХС

CH2-O-Si(CH3)j

C=N-O—СНз

(3.13)

БСА — бис(триметилсилил) ацетамид
ТМС — тетраметилхлорсилан

* Применение трех разных реакций в методе Мейсона и Фрезера [195]
стало возможным благодаря предварительному фракционированию стероидов
плазмы методом бумажной хроматографии.
Он до сих пор находит широкое применение [36, 152, 196,
203а, 256, 285]. Двойная дериватизация особенно полезна при
установлении профиля концентраций стероидов в биологических
объектах методом капиллярной колоночной хроматографии.
Много сведений о кортикостероидах можно найти в разд. 2.2.11;
там же приводится подробное описание процесса дериватиза-
ции.

I____________I___________J____________I____________I

50	60	70	90

Время, мин

Рис. 3.4. Газохроматографическое разделение изомеров 18-окситетрагидро-
дезоксикортикостерона (3,18,21-триоксипрегнан-20-она) в виде МО-ТМС-про-
изводных на колонке со стеклянными капиллярами размером 45 мх0,25 мм
с нанесенным SE-30 при 260 °C [36].

1 — За,5а; 2— 3(3,5а; 3— За,5р; 4 — Зр,5р.

Возможности капиллярной газовой хроматографии для раз-
деления МО-ТМС-производных показаны на рис. 3.4 на примере
разделения четырех изомеров 18-окситетрагидродезоксикорти -
костерона, проведенного Бурно и сотр. [36].

Дерке и сотр. [77] определяли скорость образования гидро-
кортизона, улавливая отдельные тритированные кортикостеро-
иды и измеряя их радиоактивность на сцинтилляционном счет-
чике. При этом соединение по боковой цепи превращали в бу-
тилоксим-ТМС-производное.

Для защиты боковой цепи кортикостероидов предложены и
некоторые другие производные, но большинство из них не на-
шло широкого применения. В качестве примера приведем метод
Брукса и сотр. [24, 41, 42], основанный на применении метан-
или бутанборной кислоты для получения высокоустойчивых
17,21-циклических* боратов. Тот же принцип был недавно ис-
пользован Гэскеллом и Бруксом [101] для дериватизации аль-
достерона с образованием 20,21-циклических боратов. Реакция
протекает мгновенно при комнатной температуре при смешива-
нии альдостерона с 1,1 моля соответствующей борной кислоты
в пиридине или этилацетате. Это производное находит широкое
применение при исследованиях методом хромато-масс-спектро-
метрии. Уравнение (3.14) описывает реакцию дериватизации
ацеталь-гемикетальной таутомерной формы альдостерона.

Для газохроматографического разделения кортикостероидов
после дериватизации, проведенной тем или иным способом, по-
чти всегда используются силоксановые неподвижные фазы
(обычно неполярные метилсилоксаны). Хартер и Ван Ри [152]
для разделения МО-ТМС-производных стероидов (в том числе
кортикостероидов) методом капиллярной газовой хроматогра-
фии предложили использовать смешанные бинарные фазы
(OV-225 + OV-275). Ни одна неподвижная фаза не обеспечивает
разделения всех стероидов, служащих стандартами при иссле-
дованиях, например тетрагидрокортизола (За,11(3,21-триокси-
5Р-прегнан-20-он) и а-кортолона (3а,17а,20а,21-тетраокси-5(3-
прегнан-11-он), но смеси неподвижных фаз позволяют это сде-
лать.

Подготовка пробы при определении кортикостероидов
в сложных биологических смесях методами газовой хроматогра-
фии обычно включает предварительное разделение или очистку
на колонке или в тонких слоях. С той же целью иногда прово-
дятся химические реакции. Например, Мэтин и Амос [196] уда-
ляли гидрокортизон из преднизолона, используя способность
гидрокортизона к взаимодействию с реактивом Жирара (реак-
тив Т) с образованием водорастворимого производного.
3.2.7.	ВЫСОКОЭФФЕКТИВНАЯ ЖИДКОСТНАЯ ХРОМАТОГРАФИЯ

Среди стероидов первыми методом ВЭЖХ были проанали-
зированы кортикостероиды [140, 269]. С тех пор ВЭЖХ стала
одним из наиболее ценных методов разделения и определения
кортикостероидов. Обзор литературы по этому
; вопросу недавно опубликован Фицпатриком
[91].

Одной из возможных причин вытеснения
1	газовой хроматографии методом ВЭЖХ в ана-

лизе кортикостероидов является, вероятно,
чувствительность С-17 боковой цепи к нагре-
ванию (см. предыдущий раздел). Кроме того,
метод ВЭЖХ позволяет проводить определение
всех кортикостероидов с довольно высокой
чувствительностью по интенсивной полосе
поглощения в УФ-области спектра (за исклю-
чением, конечно, 4,5-насыщенных метаболи-
тов). Высокая чувствительность ВЭЖХ позво-
ляет решать почти все задачи, которые могут

Время, мин

Рис. 3.5. Разделение методом ВЭЖХ ацетата галопре-
дона (2-бром-6р,9-дифтор-11р,17,21-триокси-1,4-прегна-
диен-3,20-дион-17,21 -диацетат) (пик/) и ба-фторэпимера
(пик 2) на колонке размером 25 смХ4 мм, заполненной
лихросорбом SI-100 (5мк),при элюировании 0,22 %-ным
метанолом в насыщенном водой дихлорметане со скоро-
стью 4,5 мл/мин и детектированием на УФ-детекторе
(254 нм) [294].

встать перед аналитиками в области фармацевтики и биомеди-
цины, поэтому уже в первые несколько лет после введения этого
метода был опубликован огромный материал о практическом
применении его в обеих областях ([21, 22, 140, 175, 208, 224] и
[172, 320] соответственно). В табл. 3.4 и 3.5 приведены сведе-
ния о применении ВЭЖХ для решения различных задач фарма-
цевтического и биологического анализа.

Достоинство метода ВЭЖХ состоит в возможности разделе-
ния изомеров. Примерами могут служить разделение 6₽- и 6а-
фторэпимеров ацетата галопредона, описанное Тоскано и сотр.
[294] (рис. 3.5), и разделение 17- и 21-валератов бетаметазона,
проведенное Бургесом [44] (рис. 3.6), с использованием адсорб-
ционной и распределительной (с обращенной фазой) систем
соответственно. Особый интерес представляет работа Уикби,
Рис. 3.6. Разделение мето-
дом ВЭЖХ 17-валерата бе-
таметазона (/) и 21-вале-
рата бетаметазона (2) на
колонке размером 20 смХ
Х4,6 мм, заполненной сфе-
рисорбом ODS (10 мк), при
элюировании 37,5 %-ным
раствором этанола в воде
при 60 °C со скоростью
2 мл/мин и детектировании
на УФ-детекторе (240 нм)
[44].

Рота и др. [252а, 312, 313], в которой обсуждаются практические
и теоретические аспекты разделения эпимерных циклических
ацеталей 16а,17а-диоксикортикостероидов.

Что касается хроматографических систем для разделения,
то широкое применение нашли как адсорбционные хроматогра-
фические системы (в основном сили-
кагелевые носители с малым размером
частиц), так и распределительные си-
стемы с обращенной фазой [в боль-
шинстве случаев силикагель с приви-
тыми молекулами (октадецилсуль-
фат)]. Кавина и др. [57] и Таймс
[298] опубликовали большое число
характеристик удерживания на раз-
личных обращенных фазах и в разных
адсорбционных системах соответст-
венно. Рассмотрение этих и других ли-
тературных данных позволяет сделать
вывод о том, что практически все
кортикостероиды, присутствующие сов-
местно в биологических объектах или
лекарственных препаратах, можно
разделить на адсорбционных или рас-
пределительных обращенно-фазных си-
стемах, если подобрать соответствую-
щие носители и элюенты. Адсорбцион-
ная хроматография оказалась более
популярной при анализе биологиче-
ских образцов [304], а в фармацевти-
ческом анализе кортикостероидов чаще
используются системы с обращенными
фазами.

Для анализа хроматограмм почти
исключительно применяются УФ-де-
текторы. Как видно из табл. 3.4 и 3.5,
во всех случаях можно измерять по-

глощение на спектрофотометрическом УФ-детекторе при 240 нм,
но значения оптических плотностей при 240 и 254 нм достаточно
близки, чтобы, не жертвуя чувствительностью, использовать де-
тектор, настроенный на определенную длину волны; большин-
ство исследователей пользуются этим приемом. Преимущество
обнаружения и количественного определения по одной и той же
хромофорной группе состоит в том, что чувствительность для
разных кортикостероидов почти одинакова. Интервал опреде-
ляемых концентраций по градуировочному графику составляет
10—100 нг в пробе, а предел обнаружения — примерно 1 нг.

16 Заказ № 182
Таблица 3.4. Определение кортикостероидов в готовых лекарственных формах
методом ВЭЖХ

Автор	Год	Определяемые соединения	Образец
Бэйли и Бриттен [21]	1972	Ацетонид флюоцинолона и его ацетат	Мазь, крем
Моллика и Штруц [208]	1972	Пивалат флуметазона	Крем
Гаэтани и Лаурери [97]	1974	Ацетонид триамцино- лона, дексаметазон	Крем, таблетка
Хиггинс [143]	1975	Ацетонид триамцино- лона	Основа таблетки
Гордон и Вуд [ПО]	1976	Ацетонид триамцино- лона	Крем, суспензия
Корпи и др. [171]	1976	Гидрокортизон и его фосфат	Препарат для инъекций
Амин и Шнейдер [7]	1978	Бутиловый эфир 11- окси-3,20-дикето-1,4- прегнадиен-21 -кислоты и родственные производ- ные	Эмульсия, мазь, свечи
Аптон и др. [301]	1978	Натриевая соль фосфата бетаметазона	Препарат для инъекций
Абдо и др. [1]	1978	Ацетат флудрокорти- зона	Таблетка а
Бургес [44, 45]	1978	Бетаметазон, бекломе- тазон, клобетазон и эфиры	Крем, мазь, таб- летка, препарат . для инъекций
Кавина и др. [57]	1978	Ацетонид флюоциноло- на, триамцинолона и т. п.	Мази
Мэджерс и Джонсон [192]	1978	Ацетонид флюоцинолона	Крем
Мюллер и Штюбер [216]	1978	Преднизолон	Мазь
Эст и Абдо [16]	1979	Ацетат флудрокортизона	Таблетка
Смит и Хоффман [275]	1979	Гидрокортизон, метил- преднизолон и их ге- мисукцинаты	Лиофилизирован- ный препарат для инъекций
Фармакопея XX США [2996]	1980	Ацетонид и гексацето- нид триамцинолона	Крем, суспензия
Гупта [130]	1979	Преднизолон, преднизон	Таблетки, рас- творы
Ли-Ван-По и др. [183в]	1979	17-Валерат бетаметазона	Мазь
.	Носитель	Элюент	Длина волны УФ-детектора, нм
t.  Шермафаза ODS	Вода—метанол (8 : 2) или (7 : 3)	254
Зипакс с нанесенным р,р'-ок- < сидипропионитрилом	5 % этилацетата, 0,2 % ацето- нитрила в гексане	Не указана
[ Силикагель	Этанол—дихлорметан (1 :19)	254
^Силикагель (зипакс)	Дихлорметан	254
Сферисорб S10 ODS	Метанол—вода (56 : 44)	254
g-Бондапак Ci8	Метанол—вода (42 : 50) с 2,2X Х10-4 М формиата тетрапен- тилаМмония	254
(Зипакс ЕТН, пермафаза	Метанол—вода (3 : 7) или (1:1)	254
|р,-Бондапак С!8	Метанол—0,09 М водный рас- твор КН2РО4	254
i ц-Бондапак Ci8	Ацетонитрил—вода (1:1)	254
J Сферисорб ODS или гиперсил jODS	Метанол—вода (57,5 : 42,5) или (45 : 55) (pH 5) при 60 °C	236—240
Биосил А, пермафаза ODS	СН2С12—метанол—вода  (97 : 1 : 2) и т. п., вода—мета- нол (80 : 20—50 : 50)	254
^Микропак TSK 1000H поли- стирольный гель	Тетрагидрофуран	254
1 Нуклеосил 10 Ci8  i	Метанол—вода—диоксан (28: 11:1)	240
 pt-Бондапак Ci8	Ацетонитрил—вода (40 : 60)	254
'Сферисорб 5 ODS	Ацетонитрил—вода—уксусная кислота (35 : 65 : 2) или (40 : 60 : 2)	242
Силикагель в виде шариков	Хлороформ—2-пропанол (10 : 1)	254
jx-Бондапак Ci8	0,01 М КН2РО4—метанол (1:1)	254
Сферисорб  ГК-					Этилацетат—хлороформ— метанол (71 : 28 :1)	260
Автор	Год	Определяемые соединения	Образец	
Киршбаум и др. [166а]  Страуд и др. [2796]  Ли и др. [176а]  Гань и др. [97а]  Гань и Лодж [976]  Ван-Дейм [302а]	1980  1980  1980  1980  1980  1980	Хальцинонид  Натриевая соль фосфата преднизолона  Ацетат гидрокортизона Ацетат гидрокортизона (4-левомицитин) Натриевая соль фосфата дексаметазона  Ацетаты кортикостерои- дов	Мазь, крем Раствор  Мазь, крем Суспензия, мазь  Растворы  Таблетка, сус- пензия, мазь, крем	

♦ Контроль за скоростью растворения.

Таблица 3.5. Определение кортикостероидов в биологических объектах
методом ВЭЖХ

Автор	Год	Стероид	Биологический объект
Трефц и др. [295]	1975	Гидрокортизон	Плазма
Мацузава и др. [198]	1977	Гидрокортизон	Сыворотка крови
Шведт и др. [263]	1977	Гидрокортизон	Моча
Ван-ден-Берг и др. [303]	1977	Гидрокортизон	Плазма крови
Скотт и Диксон [264]	1979	Гидрокортизон	Плазма крови
Хессе и др. [142]	1974	Гидрокортизон, кортикостерон	Сыворотка крови
Ишии и др. [153]	1978	Гидрокортизон, кортизон, корти- костерон	Сыворотка крови
Сайто и др. [255]	1977	Гидрокортизон, кортизон, альдо- стерон (18-ОН)- ДОК и т. п.	Плазма крови -
Роуз и Джаско [248]	1979	Гидрокортизон, преднизолон, преднизон	Плазма крови, слюна, моча
Рирдон и др. [241]	1979	Гидрокортизон, вещество S Рейх- штейн а	Сыворотка крови
Гарг и др. [100]	1977	Гидрокортизон, метилпреднизолон	Плазма
'	Носитель	Элюент	Длина волны УФ-детектора, нм
‘Колонки, заполненные Ci8  Партисил 10 SAX  р-Бондапак Ci8  RP-2  р-Бондапак Ci8  | р-Бондапак Ci8	Ацетонитрил—вода (6: 4)  Буферный раствор (pH 5,2) — метанол (9:1)  Метанол—вода (7 : 3)  Буферный раствор (pH 5) — метанол (58 : 42)  0,07 М КН2РО4—тетрагидро- фуран—метанол  Смеси ацетонитрила и воды	239, 254  254  240  242  (274)  254  240

Носитель	Элюент	Длина волны УФ-детектора, нм
Зорбакссил	Дихлорметан—этанол—вода (242 : 5 : 3)	239
Силикагель	Дихлорметан—метанол—этанол— вода (963: 5 : 20 : 12)	254
Зорбакссил или нуклео- сил 50-5	Хлороформ—метанол—вода (97,8 : 2 : 0,2) _	254
Нуклеосил NO2	Дихлорметан—2-пропанол—вода (97,5 : 2,3 : 0,2)	240
? Гиперсил ODS	Метанол—вода (45 : 55)	239
Сферосил ХОА 400	Нижняя фаза смеси дихлорметан— этанол—вода (94,8 : 3,5 : 1,7)	240
Микроколонка (145Х Х0,5 мм), заполненная силикагелем Джаско SS-05	Насыщенный водой дихлорметан— метанол (97: 3)	240
Пермафаза ЕТН	Градиентное (линейное) элюирование гексан->хлороформ	РИА
Зорбакссил	Дихлорметан—метанол	240, 280
р-Бондапак Cie	Метанол—вода (6 : 4)	254
р-Бондапак	Метанол—вода—уксусная кислота (53 : 42 : 5)	254
Автор	Год	Стероид	Биологический объект
Бютте и др. [50, 51]	1979	Гидрокортизон, флуокортолон	Сыворотка крови
Шёнёсхофер и Дульче [262]	1979	Гидрокортизон и другие стероиды коры надпочечни- ков и гонад	Сыворотка крови, моча
Хольбе и др. [145, 247]	1976  1979	6Р-Оксигидрокор- тизон	Моча
Де-Фриз и др. [80]	1977	Альдостерон	Моча
Чен и др. [62]	1977	18-Оксидезокси- кортикостерон, кортикостерон	Экстракты коры надпочечников
Л у и др. [185]	1977	Преднизолон	Плазма
Лу и др. [186]	1977	Преднизолон, преднизон, декса- метазон	Плазма
Де-Паолис и др. [76]	1977	Дексаметазон	Молоко
Цой и Эшли [297]	1978	Дексаметазон	Плазма крови, моча
Кржемински и др. [172]	1972	Метилпреднизолон	Молоко
Рябов и Гудат [242]	1977	Натриевая соль сукцината метил- преднизолона	Сыворотка крови
Смит [274]	1979	Метилпреднизо- лон, гидрокорти- зон и их гемисук- цинаты	Сыворотка крови*
Кавина и др. [55]	1979	Природные корти- костероиды	Экстракты коры надпочечников
Кабра и др. [161]	1979	Гидрокортизон	Сыворотка крови
Фрей и др. [92а]  1	1979	Г люкокортикоиды	Плазма крови
Носитель	Элюент	Длина волны УФ-детектора, нм
Лихросорб SI-60	Дихлорметан—метанол—вода (100:2:0,1)	240
Лихросорб DIOL	Градиентное элюирование гексан-> гексан-диоксан (1:1)	254 + РИА
Силикагель	Г ексан—дихлорметан—этанол—вода	240
Микропак SI-10	Хлороформ (наполовину насыщен- ный водой)—метанол (98,5: 1,5)	254
Бондапак/фенил/пора- сил В	Ацетонитрил—вода (7 : 3)	244 или 254
Лихросорб SI-60	Г ексан—дихлорметан—этанол— уксусная кислота (63,8 : 30 : 6 : 0,2)	254
Лихросорб SL60	Г ексан—дихлорметан—этанол— уксусная кислота (65,8 : 30 : 4 : 0,2) или (66,3:30:3,5:0,2)	254
Партисил ODS	Вода—ацетонитрил (77 : 23)	254
Микропак SL5	Дихлорметан—1-бутанол—вода (94,7 : 5 : 0,3)	240
Зипакс с нанесенным углеводородным полиме- ром	Вода—метанол (3:1)	254
ODS Sil-X-1	Метанол—вода (4 : 6)	254
Сферисорб ODS	Ацетонитрил—уксусная кислота— вода (35 : 65 : 2 или 30 : 70 : 2)	254
Лихросорб DIOL или SL100	Градиентное элюирование смесью метанол—хлороформ	254
ц-Бондапак Ci8	Фосфатный буфер—ацетонитрил (7:3)	254
Силикагель	Дихлорметан—тетрагидрофуран— метанол—уксусная кислота (96,85 : 1 : 2,1 : 0,05)	254
Автор	Год	Стероид	Биологический объект	
Гёль и др. [106а]	1979	Гидрокортизон в форме дансил- гидразона	Плазма крови	
Петерсен и др. [229а]	1980	Бетаметазон, его ацетат, гидрокор- тизон	Плазма крови, моча	
Скотт и др. [264а]	1980	Преднизолон, преднизон, гидро- кортизон	Плазма крови	
Прайс-Джонс и Васс [234а]	1980	Преднизолон	Синовиальная жидкость	
О’Хейр и др. [223а]	1980	18-Гидроксилиро- ванные производ- ные	Ткань опухоли коры надпочечни- ка	
Агабейоглу и др. [1а]	1980	Преднизолон, преднизон, гидро- кортизон	Плазма крови	
Де-Фриз и др. [80а]	1980	Гидрокортизон, вещество S Рейх- штейна	Плазма крови	
Баллерини и др. [24а]	1980	Гидрокортизон, кортизон, альдо- стерон и т. п.	Экстракты коры надпочечников	
Шёнёсхофер, Джастер и др. [155а, 262а, б]	1980	Гидрокортизон, альдостерон и т. д.	Моча	
Мунсон и Вильсон [214а]	1981	Ципионат гидро- кортизона	Суспензия	
Роччи и Джаско [245а]	1981	Преднизолон, преднизон и их метаболиты	Моча	
Носитель	Элюент	,	Длина волны /Ф-детектора, нм
Лихросорб SI 60	Дихлорэтан—бутанол—вода (91 : 8,5 : 0,5)	Флуориметри- ческое детек- тирование
RP-8	Метанол—вода (6 : 4)	240, 254
Силикагель, партисил	Дихлорметан—этанол—вода	239
Сферисорб 5-ODS	Метанол—уксусная кислота—вода (53 : 5 : 42)	254
Обращенные фазы и обычные системы фаз		240, 254
Силикагель	Г ексан—дихлорметан—этанол— уксусная кислота (68,8 : 25 : 6 : 0,2)	254
Силикагель	Хлороформ—изооктан—метанол— вода (48,5:48,5:2,9:0,12) или (71 : 25 : 3,75 : 0,25)	254
Лихросорб SI-100  Лихросорб RP-8	Градиентное элюирование смесями хлороформ—метанол, ацетонитрил— вода	242
Лихросорб DIOL	Градиентное элюирование смесью гексан—2-пропанол (3:1)	254 РИА
ц-Бондапак Ci8	Ацетонитрил—вода (1:1)	254
Зорбакссил	Г ептан—дихлорметан—этанол— уксусная кислота (38 : 18:5: 1)	254
На практике в большинстве случаев такая чувствительность
достаточно высока, чтобы обойтись без дериватизации.

Недавно Хорикава и сотр. [149]

Рис. 3.7. Определение аце-
тонида триамцинолона
в фармацевтическом креме
методом ВЭЖХ на колонке
размером 25 смХ5 мм, за-
полненной сферисорбом S10
ODS, при элюировании
смесью метанол—вода (56 :
: 44) со скоростью 1,3—
1,5 мл/мин и детектирова-
нии на УФ-детекторе
(254 нм) [ПО].

1 — ацетонид триамцино-
лона; 2 — преднизолон (вну-
тренний стандарт); 3 — ме-
тил-п-оксибензоат; 4 — про-
пил-/г-оксибензоат.

предложили проводить дериватизацию
кортикостероидов после выхода с ко-
лонки с образованием комплексов
алюминия с гидразоном 3-изоникоти-
новой кислоты. Кортикостероиды де-
тектируют по флуоресценции этих
комплексов, что приводит к повыше-
нию избирательности (но не чувстви-
тельности) метода.

Кроме того, недавно Кавасаки
и сотр. [166] и Гейл с сотр. [106а]
описали метод доколоночной дерива-
тизации для определения гидрокорти-
зона в плазме и моче методом ВЭЖХ
в виде дансилгидразона с последую-
щим флуориметрическим детектирова-
нием (возбуждение при 350 нм, испу-
скание при 505 нм) с пределом обна-
ружения 0,2 нг. Такой же чувствитель-
ности добились Готелли и сотр. [110а],
используя флуориметрический детек-
тор (возбуждение при 366 нм, испу-
скание при 488 нм) и доколоночную
дериватизацию (смесью серной кис-
лоты и этанола в соотношении
7:3).

Любопытный метод дериватизации
предлагают Деккер и Бейнен [71д].
Для того чтобы полнее отделить пред-
низолон от продукта его окислитель-
ного отщепления, 21-альдегида пред-
низолона, последний переводят в суль-

фит добавлением сульфита натрия
к элюенту при хроматографировании с обращенной фазой.

Следует упомянуть, что ВЭЖХ начали применять для пред-

варительного фракционирования при последующем определении
методом РИА [47, 155а, 255, 262, 262,а—в]. Высокая селектив-
ность обоих методов и большая чувствительность РИА позво-
лили создать гибридный метод, замечательный с обеих точек

зрения.

Что касается использования ВЭЖХ в фармацевтическом

анализе кортикостероидов, то весьма вероятно, что он станет
частью теста для контроля за чистотой новых лекарственных
препаратов, как это показано, например, Тоскано и др. [294]
для ацетата галопредона (17,21-диацетата 2-бром-6|3,9-дифтор-

-0,03

- 0,07

- 0,00

0,05

о.о^

0,03

Время, мин

Рис. 3.8. Определение гидрокортизона в плазме человека методом ВЭЖХ на
колонке размером 20 см X4,6 мм, заполненной нуклеосилом NO2, при элюиро-
вании смесью дихлорметан—пропан-2-ол—вода (97,5 : 2,3 : 0,2) со скоростью
1,15 мл/мин и детектировании на УФ-детекторе (240 нм) [303].

1 — гидрокортизон; 2 — 86 нг преднизолона (внутренний стандарт).

11(3,17,21-триокси-1,4-прегнадиен-3,20-диона). Однако главной
областью применения метода ВЭЖХ является анализ низкодо-
зированных мазей и кремов (см. табл. 3.4), которые трудно
анализировать любым другим методом. В большинстве случаев
при правильном выборе хроматографических систем их селек-
тивность позволяет проводить анализ после простого растворе-
ния пробы или экстракции, минуя трудоемкие этапы очистки.
На рис. 3.7 представлены две хроматограммы, полученные Гор-
доном и Вудом [НО] в процессе определения ацетонида триам-
цинолона в мази. В этом примере пробу экстрагировали изоок-
таном и метанолом и последний вводили непосредственно в хро-
матограф.
ВЭЖХ — идеальное средство контроля устойчивости корти-
костероидных лекарственных препаратов и установления пути
их разложения. В качестве примеров упомянем исследования,
проведенные Корнейо и др. [67а] и Хансеном и Бундгаардом
[134а] по гидрокортизону, Деккером и Бейненом [71д] — по
преднизолону, Штраудом и др. [2796] — по натриевой соли
фосфата преднизолона, Киршбаумом и др. [166а] — по халци-
нониду и Ли-Ван-По и др. [183в] — по 17-валерату бетамета-
зона.

Были сделаны попытки автоматизировать анализ лекарст-
венных дозированных форм методом ВЭЖХ [30], а также опи-
сано использование этого метода для определения скорости
растворения таблеток кортикостероидов [906].

За исключением особых случаев подготовка проб для ана-
лиза кортикостероидов методом ВЭЖХ в плазме и моче также
гораздо проще, чем в других методах. Обычно достаточно про-
мыть экстракт гидроксидом натрия, выпарить его досуха и рас-
творить сухой остаток в элюенте. В качестве примера на
рис. 3.8 приведена хроматограмма, взятая из работы Ван-ден-
Берга и сотр. [303].

Целью анализа в этом случае было определение гидрокор-
тизона в плазме. Как видно из рисунка, пик гидрокортизона
достаточно далеко отстоит от пиков других компонентов крови
и внутреннего стандарта — преднизолона (так же, как и в пре-
дыдущем примере на рис. 3.7 и во многих других случаях).

Метод ВЭЖХ обычно используют для определения свобод-
ных кортикостероидов. Если целью анализа является определе-
ние общей концентрации, то, конечно, предварительно следует
провести гидролиз конъюгатов, как, например, при определении
альдостерона в моче, описанном де-Фризом и др. [80].

3.2.8.	РАДИОИММУННЫЙ

И ДРУГИЕ РАДИОИЗОТОПНЫЕ МЕТОДЫ

Обсуждение, приведенное во введении к разд. 2.2.13, почти -
полностью можно отнести к использованию радиоизотопных
методов для анализа кортикостероидов в биологических объ-
ектах.

Меченые кортикостероиды обычно применяют для контроля
полноты экстракции и разделения на отдельных этапах слож-
ных аналитических методик в анализе биологических образцов
[88], а также лекарственных дозированных форм, например ма-
зей и масляных растворов [1].

Метод двойного изотопного разбавления раньше был очень
популярен в этой области, но в последние годы сообщения
о его применении, так же как и для анализа половых гормонов,
поступают редко. Прекрасный обзор, посвященный этому и род-
ственным методам, .был опубликован Бойзеном и сотр. [35].
В нем рассматривается использование стероидов, меченных три-
тием и 14С, в качестве радиоактивных индикаторов и образова-
ние n-иодбензолсульфонатов, содержащих либо 35S, либо 1251.
В недавно опубликованной статье Мацумото и сотр. [197] опи-
сали определение кортикостероидов в плаценте человека с при-
менением тритированных индикаторов и 355-тиосемикарбазида
для получения радиоактивных производных по 3-кетогруппе.

Метод конкурирующего
связывания белка

Хотя, по литературным данным, радиоиммунный анализ
в области кортикостероидов обладает более высокой избира-
тельностью и лучшей чувствительностью, методы конкурирую-
щего связывания белка также нашли широкое применение и
применяются до настоящего времени. Большинство опублико-
ванных статей посвящено анализу гидрокортизона в моче [74,
92] и крови [27, 28, 68, 70, 74, 157, 169, 215, 217, 222, 245], но
описаны также методы анализа других кортикостероидов, на-
пример кортикостерона [139а, 157, 167, 169, 279], дезоксикорти-
костерона [157, 169], преднизолона [288, 316] и т. д.

В качестве связывающего белка обычно используют богатые
транскортином сыворотки, получаемые из разных источников.
Специфичность сильно зависит от источника получения сыво-
ротки. Например, Мэрфи [215] обнаружил, что транскортин ло-
шадей обладает низким сродством к прогестерону; следова-
тельно, при использовании этого связывающего белка мешаю-
щее влияние прогестерона ничтожно. При использовании менее
избирательных белков мешающего влияния менее полярных
стероидов можно избежать путем проведения предварительной
экстракции тетрахлоридом углерода [70, 157, 160]. Кортикосте-
роиды обычно экстрагируют дихлорметаном, а во многих слу-
чаях анализ можно провести прямо в биологической пробе.
Очевидно, что предварительное хроматографирование повышает
избирательность метода, но этот прием в повседневной работе
используется редко [169, 316]. Хроматографирование, конечно,
неизбежно при определении большого числа компонентов. На-
пример, Колановски [169] определял гидрокортизон, его 11-де-
зоксианалог и кортикостерон в плазме и моче после экстракции
дихлорметаном и разделения методом ТСХ с последующим ана-
лизом отдельных фракций методом конкурирующего связывания
белка.

Для разделения свободного и связанного кортикостероидов
чаще всего используют древесный уголь с нанесенным декстра-
ном, но имеются также сообщения о применении хроматогра-
фии на сефадексе [27] или флорисиле [215]. Заслуживает вни-
мания любопытный подход к этой проблеме Мюллера и др.
[217]: авторы проводили все стадии анализа (т. е. отделение
гидрокортизона от сыворотки, его выделение из комплекса
с белком, взаимодействие до установления равновесия со свя-
зывающим белком транскортином и разделение связанного и
несвязанного гидрокортизона) на колонке, заполненной сефа-
дексом G-10, облегчив тем самым автоматизацию метода.

По методике Тана и др. [286], при определении гидрокор-
тизона в амниотических жидкостях для повышения избиратель-
ности проводят экстракцию этилацетатом и хроматографирова-
ние на сефадексе LH-20, а процент выделения на этих этапах
устанавливают при помощи тритированного гидрокортизона.
Стероидом-индикатором, конкурирующим с гидрокортизоном за
активные центры белка транскортина плазмы человека, служит
тритированный кортикостерон (в присутствии 10—14 нг гидро-
кортизона степень его связывания изменяется на 50 %). Равно-
весие устанавливается за 1 ч при 0 °C, после чего добавляют
древесный уголь с нанесенным декстраном и разделяют свобод-
ный и связанный кортикостерон центрифугированием; в полу-
ченной надосадочной жидкости измеряют радиоактивность.

Из статей, цитированных в этом разделе, особого внимания
заслуживают те, в которых проводится сравнение метода кон-
курирующего связывания белка и метода радиоиммунного ана-
лиза [74, 157, 288].

Радиоиммунный анализ

Как и в случае половых гормонов (см. разд. 2.2.13), РИА
становится одним из важнейших микрометодов определения
кортикостероидов в биологических объектах.

Основные положения упомянутого выше раздела почти пол-
ностью справедливы и для кортикостероидов, поэтому, не об- 
суждая ряд методик, опубликованных между 1977 и 1980 гг.
(табл. 3.6), остановимся здесь лишь на некоторых специальных
вопросах.

Данные табл. 3.6 показывают, что, несмотря на преимуще-
ства 1251, отмеченные работающими с ним исследователями [2,
108], тритированные индикаторы, судя по недавно опубликован-
ным работам, применяются шире (даже шире, чем в области
половых гормонов), главным образом благодаря меньшему пе-
рекрестному взаимодействию. Последнее утверждение, однако,
не бесспорно [240]. Вообще говоря, преимущество методов с ис-
пользованием в качестве метки 1251, а не 3Н, связано с преиму-
Таблица 3.6. Определение кортикостероидов радиоиммунными методами

Разделение фракций связанного и несвя- занного стероидов	ДДУ	ДДУ	ДДУ		Иммобилизован- ные антитела	Сульфат аммония	ДДУ	Иммобилизован-	ные антитела	ДДУ	ДДУ	ДДУ		ДДУ	ДДУ	ДДУ	>>  ГТ
-OHtfEd	Не	Не	Не		1  Не	Не	X со	1251		Не	Не	Зн		1  i Не	Не	125J	Не
Условия хромато- графиро- вания	1	1	Бумага		1	1	1	1		1	ТСХ	Бумага		Бумага	|	1	1
Образец	Плазма	Слюна	Сыворотка		[ Сыворотка i	Сыворотка	Плазма	Сыворотка		Плазма	Плазма, моча	Моча		Моча	Плазма	Плазма	Моча
			к о Оч ф									гико-					
е( S			о W Я  &									о я я  я о					
Л  <У  и	Гидрокортизон	Гидрокортизон	Гидрокортизон,	альдостерон	Гидрокортизон  1	Гидрокортизон	Г идрокортизон	Гидрокортизон		Альдостерон	Альдостерон	Альдостерон-18-	стерон	Альдостерон	Альдостерон	Альдостерон	Альдостерон
Год	1977	1978	1977		1977	1978	1978	1978		1978	1978	1978		1977	1978	1977	1977
																[2]	
Автор	Карр и др. [54]	О О со,  Я  S4 W ч о >>	СО сч.  Он ф  о X  :ф Я :ф а		о  к ф 00  »Я Я *	сч,  Я Оч Оч о	О’ СО,  Я я ф  CQ  Я  Я ч ч о я я о	о  я  X о		о ОО  о  &  я  я ф я  ®я я |=:	d, я  ф* я я Оч ф X!	СО,  Я я ч ч о я я о &		я 03 Оч я ф из  я я я  S  ф ст	ОО сч  о.  я я  Н	Оч я я е* СО  Я я »я я 2 я сТ я  <!	со сч  Оч  •=( я  я ю  ф  &

ществами гамма-счетчиков перед сцинтилляционными счетчи-
ками [40, 173, 240].

Стероид-белковые комплексы, используемые в последнее
время для выращивания антисывороток, не столь разнообразны,
как в случае половых гормонов. Применяются почти исключи-
тельно 3- (иногда 20-)-О-карбоксиметоксимные * или 21-сукци-
нильные производные. Антитела, полученные для конкуренции
с этими производными, оказались специфичными для большого
числа стероидов, но остались проблемы «трудных» пар, напри-
мер альдостерон [307] — тетрагидроальдостерон, гидрокорти-
зон—преднизолон и т. п. Поэтому при решении конкретной
задачи следует с особым вниманием отнестись к выбору анти-
тела. Эти трудности, а также часто низкие концентрации опре-
деляемых веществ привели к необходимости применять при ре-
шении сложных задач предварительное хроматографическое
разделение чаще, чем в анализе половых гормонов. В некото-
рых благоприятных случаях селективность можно улучшить
избирательной экстракцией, как, например, при определении
концентрации преднизолона и 21-сукцината преднизолона в сы-
воротке, когда оба соединения можно разделить до определе-
ния экстракцией дихлорметаном [321а].

Из других производных высокой специфичностью отличаются
соединения, содержащие 4-оксигемисукцинатный мостик, пред-
ложенные Хосодой и др. [149а, б].

В табл. 3.7 приведены данные о специфичности, а на
рис. 3.9—стандартные кривые и антитела для определения аль-
достерона (конкурирующего с белковыми комплексами 18,21-ди-
сукцината и 3-карбоксиметоксима альдостерона). Для опреде-
ления альдостерона в плазме и моче Херкнер и сотр. [141] вы-
брали более селективный и чувствительный дисукцинат альдо-
стерона. Следует заметить, однако, что, несмотря на довольно
хорошую избирательность антисыворотки, выработанной против
этого антигена, все же рекомендуется проводить отделение
альдостерона методом ТСХ, в основном из-за влияния фона,
создаваемого неизвестными примесями.

Во многих случаях перед инкубированием смеси с антисы-
вороткой проводят также химические реакции, главным обра-
зом с целью улучшения избирательности определения. Помимо
обычного сольволитического и ферментативного разложения
конъюгатов и стероид-белковых комплексов используются спе-
цифические реакции. Например, можно добиться высокой се-
лективности, если получить антисыворотку к комплексу

* Специфичность антисыворотки, конкурирующей с 3-карбоксиметокси-
мом, можно существенно улучшить путем тщательной очистки ее от изо-
мерных 20-оксима и 3,20-диоксима методом ТСХ (перед связыванием с ти-
роглобулином бычьей сыворотки) [279а].

17 Заказ № 182
у-лактона альдостерона с З-О-карбоксиметоксимом альбумина
бычьей сыворотки, а экстрагированный из плазмы альдостерон
окислить в лактон иодной кислотой в этаноле до инкубирования
с антисывороткой [9, 281] [см. схему (3.12)].

Рис. 3.9. Стандартные кривые радиоиммунного определения альдостерона.

I — антисыворотка против альдостерон-З-О-карбоксиметоксим-белкового ком-
плекса; 2 — антисыворотка против альдостерон-18,21-дисукцинат-белкового
комплекса [141].

Интересный подход к улучшению избирательности радиоим-
мунного определения преднизолона в плазме предложен Лу и
сотр. [187]. Мешающее влияние эндогенного гидрокортизона

Таблица 3.7. Степень перекрестного взаимодействия некоторых стероидов
с двумя разными альдостеронными антисыворотками [141]

Стероид	18,21-Дисук- цинат альдо- стерона	З-О-Карбокси- метоксим- альдостерона
Гидрокортизон (кортизол)	<0,01	<0,1
Кортизон	0,06	<0,1
Кортикостерон	<0,01	<0,1
Дезоксикортизол	0,06	<0,1
Дезоксикортикостерон	<0,01	<0,1
Зр,5а-Тетрагидроальдостерон	1,00	7,0
3(3,5(3-Тетрагидроальдостерон	0,20	7,0
Тетрагидрокортизол	<0,01	. <0,1
Т етрагидрокортизон	<0,01	<0,1
Тетрагидродезоксикортизол	<0,01	<0,1
Тетрагидродезоксикортикостерон	<0,01	<0,1
устраняли путем обработки пробы реактивом Т Жирара (хло-
рид бетаингидразида), который практически избирательно реаги-
рует с 3-кетогруппой гидрокортизона, образуя водораство-
римое производное, легко отделяемое от непрореагировавшего
преднизолона экстракцией до радиоиммунного определения.

На заключительной стадии определения отделяют свобод-
ные кортикостероиды от связанных с антителом с помощью дре-
весного угля, покрытого декстраном, но возможны и другие спо-
собы, в том числе разделение на стенках пробирок с привитым
антителом [137].

3.2.9.	ФЕРМЕНТАТИВНЫЕ МЕТОДЫ

Фотометрические
и флуориметрические методы

Ферментативные фотометрические и флуориметрические ме-
тоды определения кортикостероидов основаны на окислении-
восстановлении оксикетонных систем, и в частности на восста-
новлении 20-кетогруппы [3, 4, 5, 136, 137] в присутствии
(3|3)20сс-оксистероид—дегидрогеназы. Во всех случаях контроль
за реакцией осуществляется при помощи системы НАД(Ф) —
НАДН. При этом для измерений используют либо уменьшение
концентрации НАДН (спектрофотометрия при 340 нм [3—5]),
либо разложение НАДН под действием соляной кислоты и пре-
вращение НАД в флуоресцирующее производное путем обра-
ботки 6,6 М гидроксидом натрия при 60°С [136, 137]. Для опре-
деления 11|3-оксикортикостероидов предложен [46] также
флуориметрический метод, основанный на превращении 11р-ок-
систероид—НАД (Ф) -оксидоредуктазных систем.

Этими методами можно также решать задачи, связанные
с определением гидрокортизона и родственных соединений
в плазме [46, 136, 137] и моче [3—5]. Для улучшения избира-
тельности в некоторых случаях применяют также колоночную
хроматографию на сефадексе LH-20 [136, 137] или ТСХ [46].

Иммуноферментный анализ

Как и в анализе половых гормонов, для анализа кортико-
стероидов наряду с РИА стал применяться иммуноферментный
анализ. Основные положения разд. 2.2.14 справедливы и для
этой области.

Почти все цитируемые ниже работы относятся к определе-
нию гидрокортизона в крови [12, 106, 146, 159, 168, 207] *, для

* Хосода и сотр. [149г] предложили метод определения 6|3-оксигидрокор-
тизона в моче.
чего используют как ферментные системы, уже описанные
в разд. 2.2.14 (пероксидаза—о-фенилендиамин—Н2О2 [159], ще-
лочная фосфатаза — фенилфосфат — 4-аминоантипирин —
КзРе(СЫ)6 [168, 207, 223], p-D-галактозидаза— о-нитрофенилф-
D-галактопиранозид [65, 106, 149в, 149г]), так и другие си-
стемы. Аракава и сотр. [12] использовали аналогичную систему
(пероксидаза — меченый гидрокортизон), но определение актив-
ности фермента проводили по люминесценции, возникающей при
реакции пероксида водорода с люминолом. Хольдер [146] свя-
зывал глюкозоксидазу с 21-гемисукцина-тной цепью гидрокорти-
зона и измерял активность фермента по окраске (^макс =
=415 нм), развивающейся при взаимодействии пероксида во-
дорода, являющегося побочным продуктом окисления глюкозы,
с 2,2z-a3HHO-6HC (З-этилбензтиазолин-6-сульфо) кислотой.

Фермент-метку обычно вводят в стероид, используя 21-геми-
сукцинатную или З-О-карбоксиметильную части молекулы, но
заслуживает упоминания также реакция гидрокортизона с ще-
лочной фосфатазой, протекающая с участием 21-аминогруппы
[168].

Для разделения фаз используются как иммобилизованное
антитело (на сефарозе [12] или целлюлозе [159]), так и метод
двойных антител [146, 207].

3.2.10.	МАСС-СПЕКТРОМЕТРИЯ И РОДСТВЕННЫЕ МЕТОДЫ

Масс-спектрометрия — ценный метод установления структуры
кортикостероидов, так же как и других групп стероидных гор-
монов. Помимо общих литературных источников, приведенных
в разд. 2.2.15, привлекает внимание ряд статей, посвященных
специально фрагментации недериватизованных кортикостерои-
дов, в основном синтетических аналогов, опубликованных не так
давно Тофтом и др. [184, 289, 290].

Очевидно, что при масс-спектроскопической идентификации
кортикостероидов после газохроматографического разделения
в ионизационную камеру масс-спектрометра вводят дериватизо-.
ванные соединения. Для дериватизации в большинстве случаев
используются 20-метоксим- (11,17)21 -триметилсилильные произ-
водные (МО-ТМС-производные)* [84, 1836, 230, 231, 285] , но
предложены и другие соединения, в первую очередь цикличе-
ские бораты (см. разд. 3.2.6), фрагментационные характери-
стики которых были тщательно изучены.

Для масс-фрагментографического количественного анализа
кортикостероидов почти исключительно получают МО-ТМС-
производные. Газохроматографическое разделение можно про-

* Аксельсон [18] исследовал другие алкоксимные производные и кинетику
их взаимопревращений, в том числе производные, содержащие 15N.
водить на насадочных колонках, но в последнее время все чаще
и чаще используют капиллярную хроматографию в сочетании
с масс-спектрометрией (с одно- или многоканальным детекти-
рованием). Количественную оценку проводят по молекулярным
пикам и (или) по интенсивным пикам с т/е для фрагмента
М—31, которые характерны для отщепления метоксигруппы от
метоксимной группировки.

Хонор, Шеклетон и др. [147, 148, 226] определяли различные
кортикостероиды и метаболиты в моче на ионселективной реги-
стрирующей аппаратуре, используя для их оценки пики фраг-
ментов М+ и [М — 31]+. При определении аллотетрагидроальдо-
стерона (содержащего За-оксигруппу) в качестве внутреннего
стандарта было взято эпимерное 3(3-оксипроизводное [147]. При
исследовании метаболитов 18-оксикортикостерона в моче про-
водили их отделение на смоле XAD-2 и фракционирование на
колонке, заполненной сефадексом LH-20 с последующим ана-
лизом МО-ТМС-производных методом хромато-масс-спектромет-
рии. Внутренним стандартом при определении главного мета-
болита, За 18,21-триокси-5р-прегнан-11,20-диона, служил его 3£-
эпимер [266]. Аналогичные стадии очистки и фракционирования
были выполнены при определении глюкуронида тетрагидроаль-
достерона в моче после ферментативного гидролиза; причем
внутренним стандартом служило 3|3-окси-5-а-соединение [148].

При определении гидрокортизона в плазме Бъёркем и сотр.
[34] использовали в качестве внутреннего стандарта [4-14С]-гид-
рокортизон. После экстракции дихлорметаном обе кетогруппы
превращали в метоксимные и триметилсилилировали все три
оксигруппы. Количество гидрокортизона в плазме рассчитывали
по отношению площадей пиков гидрокортизона и его 14С-про-
изводного, детектирование которых проводили одновременно
с многоканальным детектированием с использованием ионов
с т/е 605 и 607, что соответствует фрагментам М — 31. Мэтин и
Амос [196] разработали метод определения преднизона и пред-
низолона в' плазме человека, сочетая газовую хроматографию
с ионизационной (химической) масс-спектрометрией. Сканиро-
вание проводили при т/е 561, 635 и 667, что соответствует
(М + 1) пикам МО-ТМС-производных преднизона, преднизолона
и клопреднола (внутреннего стандарта) соответственно.

В последние несколько лет методом масс-фрагментографии
был определен ряд других кортикостероидов, в том числе
За,21 -диокси-5р-прегнан-20-он и 5-прегнен-Зр,20а-диол (метабо-
литы дезоксикортикостерона и прегненолона соответственно)
[246] и различные 6-гидроксилированные кортикостероиды мочи
[78, 79]. В последнем случае селективность метода была суще-
ственно улучшена путем сочетания высокоэффективной жидко-
стной хроматографии с ГХ-МС.
Особый интерес представляет метод масс-фрагментографиче-
ского определения преднимустина в плазме, предложенный Як-
хаммером и сотр. [155]. Было обнаружено, что этот препарат
(хлорамбуциловый эфир преднизолона) не годится для масс-
фрагментографического анализа ни сам по себе, ни в дерива-
тизованной форме. Поэтому его подвергли переэтерификации
метанолом с образованием хлорамбуцилметилового эфира,
масс-фрагментографическое определение которого послужило
основой для косвенного определения преднимустина с дейтери-
рованным хлорамбуцилметиловым эфиром в качестве внутрен-
него стандарта.

3.2.11. ДРУГИЕ МЕТОДЫ

Косвенный гравиметрический метод определения 21-амино-
кортикостероидов, описанный Гёрёгом и др. [119], основан на
взвешивании стехиометрического количества каломели, обра-
зующейся при окислении этих производных хлоридом ртути(II)
(стр. 215).

Солиман и Белэл [278а] разработали два метода косвенного
титриметрического определения способной к восстановлению
а-кетольной боковой цепи кортикостероидов. По первому ме-
тоду 21-оксигруппу окисляют до альдегида щелочным раство-
ром тетраиодмеркурата(П) калия и образовавшуюся металли-
ческую ртуть определяют иодометрически. По второму методу
боковую цепь окисляют щелочным раствором купритартрата
калия до 20-кето-21-карбоновой кислоты и образовавшийся ок-
сид меди(1) определяют перманганатометрически. Обычно ис-
пользуемый классический метод, основанный на щелочном гид-
ролизе и обратном титровании избытка щелочи, не применим
для определения 21-эфиров кортикостероидов, поскольку в ки-
пящей щелочи боковая цепь разрушается с образованием кис-
лых продуктов. Гёрёг [ИЗ] проводил это определение, исполь-
зуя в качестве реагента смесь гидроксида натрия и борогидрида
натрия. В этом случае перед гидролизом 21-эфира происходит
восстановление 20-кетогруппы с образованием 20-оксипроизвод-
ного, нечувствительного к воздействию атмосферного кислорода
или щелочи. В результате можно без затруднений провести гид-
ролиз и обратное титрование с индикатором феноловым
красным.

ЯМР-Спектроскопия впервые была применена Авдовичем
и др. [17] в анализе кортикостероидных лекарственных препа-
ратов в массе фабричного продукта, а также в виде таблеток и
препаратов для инъекций. Были изучены 1,4-диен-З-кетопроиз-
водные, причем в зависимости от присутствия мешающих для
анализа веществ использовали сигналы протонов при С-1, С-2
или С-4. Вычисления проводили на основе сигналов внутренних
стандартов (фумаровая кислота, гидрохлорид триэтиламина).

Наряду с другими лекарственными препаратами Боуэр и
Вайнфорднер [37] описали фосфоресцентные характеристики
локортена (6,9-дифтор-16-метилпреднизолон), пригодные для
его обнаружения и определения.

Метод определения свободных гидрокортизона и альдосте-
рона в крови по скорости диализа их меченных тритием произ-
водных описан Россом [252].

3.3.	ПРОБЛЕМЫ В АНАЛИЗЕ КОРТИКОСТЕРОИДОВ

3.3.1.	КОНТРОЛЬ ЧИСТОТЫ КОРТИКОСТЕРОИДОВ

В МАССЕ ФАБРИЧНОГО ПРОДУКТА

В общих чертах вопросы контроля чистоты стероидных гор-
мональных препаратов в массе продукта рассмотрены
в разд. 2.3.1. Установленные там положения с некоторыми ви-
доизменениями применимы и для кортикостероидов. Главное
различие между ними заключается в том, что газовая хромато-
графия не применяется совсем, а из нехроматографических ме-
тодов анализа применимы практически только УФ-спектрофото-
метрия и колориметрический метод с использованием солей
тетразолия.

Чаще всего методы анализа кортикостероидов в массе фаб-
ричного продукта основаны либо на спектрофотометрическом
измерении производных 3-кетогруппы по поглощению при
240 нм, либо на определении боковой цепи методами с исполь-
зованием солей тетразолия. Ни один из них не обладает доста-
точной специфичностью: первый не позволяет фиксировать слу-
чайные разрушения боковой цепи, и ни одним из них нельзя
обнаружить присутствие, например, примесей А4-3-кетосоедине-
ний в Д1’4-3-кетонах и т. п. Для повышения селективности этих
методов применяют различные хроматографические и экстрак-
ционные методы. Фармакопея США после элюирования глав-
ного пятна предписывает проводить ТСХ разделение и колори-
метрическое определение с помощью тетразолиевого синего
[299г]. Селективность УФ-спектрофотометрического анализа
кортикостероид-21-фосфатов повышают, проводя определение
в дихлорметановом растворе, полученном экстракцией раствора
фосфата после ферментативного гидролиза [299а]. Другие ко-
лориметрические методы, описанные в разд. 3.2.1, применяют
главным образом для анализа лекарственных дозированных
форм, но в нескольких исключительных случаях и для анализа
в массе фабричного продукта. Так, например, для анализа те-
бутата преднизолона применяют такие реагенты, как смесь сер-
ной кислоты и метанола (измеряют поглощение при 550 нм)
[298а], а для определения примеси свободного гидрокортизона
в ацетате гидрокортизона применяют реагент Гёрёга и Чепези
[118], который представляет собой смесь хлорида меди(П) и
4,5-диметил-о-фенилендиамина.

При анализе любым из этих методов контроль чистоты ле-
карственного препарата в массе фабричного продукта можно
дополнить количественной оценкой его чистоты методом тонко-
слойной хроматографии. В дополнение к работам, цитируемым
в разд. 2.2.10 и 3.2.5, следует упомянуть статью Вандерхаге
и Хебиуса [306], где описаны пять подвижных фаз [хлороформ,
толуол—хлороформ (3: 1), циклогексан—этилацетат—вода
(25 : 75 : 1), дихлорметандиэтиловый эфир—метанол—вода
(77 : 15 : 8 : 1,2) и дихлорэтан—метанол—вода (95 : 5 : 0,2)], при-
годных в сочетании с серной кислотой в качестве опрыскиваю-
щего реагента для разделения наиболее фармацевтически важ-*
ных кортикостероидов.

Из современных методов наиболее эффективным для одно-
временного анализа и контроля чистоты является высокоэффек-
тивная жидкостная хроматография. Это нашло отражение
в том, что этот сравнительно новый метод уже появился в фар-
макопеях в качестве метода анализа, например гексацетонида
триамцинолона [2996]. По-видимому, в ближайшее время в этой
области следует ожидать больших достижений.
3.3.2.	ОПРЕДЕЛЕНИЕ КОРТИКОСТЕРОИДОВ
В ЛЕКАРСТВЕННЫХ ФОРМАХ

Экстракция кортикостероидов из таблеток не вызывает за-
труднений. Обычно для этого применяют метанол или этанол
или проводят жидкость-жидкостную экстракцию с помощью
воды и хлороформа.

Экстракцию хлороформом или дихлорметаном обычно прово-
дят из водных суспензий, также поступают (после фермента-
тивного гидролиза) с водными растворами 21-фосфатов корти-
костероидов.

Более сложно проводить экстракцию кортикостероидов
(главным образом фторпроизводных в низкодозированных фор-
мах) из мазей и кремов. Если для экстракции использовать ме-
танол или этанол, неполярные наполнители не растворяются,
что затрудняет количественное извлечение кортикостероида.
Другая проблема заключается в том, что экстракт содержит
много компонентов, мешающих определению кортикостероида.
Поэтому рекомендуется проводить хроматографическое разде-
ление на колонках, как, например, в работе Грэхема и др. [129].
Колоночная хроматография пригодна также для отделения
кортикостероидов от энтеросептола [127] или антибиотиков [38]
в препаратах местного действия. В отдельных случаях удобнее
пользоваться менее трудоемко?! процедурой, которая состоит
в распределении мази или крема между неполярными и уме-
ренно полярными органическими растворителями, причем
в первый перейдет большая часть наполнителей, а во второй —
кортикостероид. В табл. 3.8, взятой из статьи [86], приведены
некоторые пригодные для этой цели сочетания пар раствори-
телей.

Из систем растворителей, приведенных в табл. 3.8, успешно
используется пара ацетонитрил—гексан. Ацетонитрильную фазу
можно вводить непосредственно в высокоэффективный жидкост-
ный хроматограф или анализировать колориметрическим мето-
дом, используя реакцию с солями тетразолия или с гидразидом
изоникотиновой кислоты [85].

Ранее уже упоминались важнейшие методы определения
кортикостероидов в дозированных формах. Наиболее распрост-
раненным является колориметрический метод с использованием
хлорида трифенилтетразолия или даже чаще тетразолиевого си-
него. Многие работы, цитируемые в разд. 3.2.1, посвящены ана-
лизу дозированных лекарственных форм. Анализ таблеток с по-
мощью тетразолиевого синего часто выполняют на автоматиче-
ских или полуавтоматических анализаторах. На рис. 3.10
показана схема метода Броуэра [43] для полуавтоматического
анализа таблеток преднизолона и преднизона.
Таблица 3.8. Распределение кортикостероидов между несмешивающимися
растворителями [86]

Более полярный растворитель	Менее полярный растворитель	Стероид	Коэффициент рас- пределения (менее полярный растворитель) (более полярный растворитель)
Ацетонитрил	Гексан	Ацетонид триамцино- лона  Пентанонид триамцино- лона  Преднизолон	6,5 • 10’3  8,8 • 103  11 • io-3
Нитрометан	Гексан	Пентанонид триамцино- лона	3,5 • 103
Нитрометан	Циклогексан	Ацетонид триамцино-  лона  17-Валерат бетаметазона	7,4 • 10‘4  6,5 • 10~4
Диметилсульфок- сид	Гексан	Ацетонид триамцинолона 17-Валерат бетамета- зона  Преднизолон	2,1 • 10 3  1,9 • 10 3  8,4 • 10~4
Диметилсульфок- сид	Циклогексан	Пентанонид триамцино- лона	7,4 • 10'3

В этом методе экстракцию таблетки выполняют вручную,
используя в качестве экстрагента 50 %-ный (по объему) вод-
ный раствор этанола. Затем этот раствор экстрагируют сегмен-
тированным воздухом хлороформом в двойном смесителе авто-
анализатора, а экстракт смешивают с сегментированными
тетразолиевым синим и гидроксидом тетраметиламмония. В ре-
акционной спирали происходит реакция, и в проточной кювете
колориметра измеряют поглощение формазана при 525 нм. Для
анализа дозированных форм иногда используют и другие спек-
трофотометрические и колориметрические методы, основанные
на химических реакциях.

Спектрофотометрический метод анализа по поглощению при
240 нм пригоден только для относительно простых по составу
таблеток. В более сложных случаях (например, при определе-
нии кортикостероидов в мазях и кремах в присутствии спектро-
фотометрически активных антибиотиков и наполнителей) можно
применять дифференциальный спектрофотометрический метод
с использованием борогидрида натрия [64, 112] или метод, ос-
нованный на вычитании спектра поглощения мешающих веществ
[6] с помощью программ ЭВМ [162].

В этой области также быстро возрастает роль высокоэффек-
тивной жидкостной хроматографии, о чем свидетельствует до-
вольно большое число статей, опубликованных за последние
годы (см. табл. 3.4 и 3.5). Причина здесь кроется в том, что
в ВЭЖХ нет необходимости в длительной подготовке пробы,

—Реагент гтма

°'94St Тетразолиевый
синий

0,90 RA ____________

— Воздух

<----®----

Дозирующий насос

Проточная кювета
(15 мм, 525 нм)

Рис. 3.10. Схема непрерывного полуавтоматического определения преднизо-
лона и преднизона [43].

Все соединительные шланги кислоустойчивые [сделаны из асидфлекса (Acid-
flex)]; используются полиэтиленовые трубки диаметром 0,034"; Si — силокса-
новая резина, RA — красные кислотоустойчивые шланги (red Acidflex); Т —
тайгон; S — сольвафлекс (Solvaflex); А — асидфлекс (Acidflex).

а это делает ее идеальным методом проверки устойчивости пре
паратов.
3.3.3.	ОПРЕДЕЛЕНИЕ КОРТИКОСТЕРОИДОВ

И ИХ МЕТАБОЛИТОВ В БИОЛОГИЧЕСКИХ ОБРАЗЦАХ

Подготовка образцов для количественного анализа

Большинство общих положений, рассмотренных в разд. 2.3.3
для половых гормонов, с минимальными видоизменениями при-
годны и для кортикостероидов, и поэтому здесь будет дано лишь
краткое обсуждение этого вопроса.

Наиболее часто изучаемыми биологическими жидкостями яв-
ляются моча и кровь. В моче кортикостероиды и их восстанов-
ленные метаболиты присутствуют главным образом в виде
конъюгатов (в основном в виде глюкуронидов). Поэтому в боль-
шинстве случаев определение кортикостероидов в моче начи-
нают с гидролиза конъюгатов, чтобы получить количественные
данные об общем содержании кортикостероидов. Расщепление
конъюгатов проводят с помощью катализируемого кислотами
гидролиза (обычно к 2 мл мочи прибавляют 0,1 мл концентри-
рованной соляной кислоты и выдерживают при комнатной тем-
пературе 18 ч [310] или подкисляют пробу до pH 1 серной кис-
лотой и выдерживают при комнатной температуре 20 ч [141] )
или с помощью ферментативного гидролиза под действием
Р-глюкуронидазы, например при pH 5 и 42°С или при pH 7 и
37°С [132] в течение 16—18 ч [258]. В отличие от анализа мочи
целью анализа крови в большинстве работ является определе-
ние свободных кортикостероидов, поэтому в большинстве мето-
дов определения кортикостероидов в плазме или сыворотке
крови стадию гидролиза не включают.

Для экстракции кортикостероидов чаще всего применяют
дихлорметан и реже хлороформ. Из полученных экстрактов
кислотные примеси обычно удаляют промыванием 0,1 М раство-
ром гидроксида натрия. Достаточно широко используемый ме-
тод повышения селективности экстракции заключается во вве-
дении стадии предварительной экстракции для удаления непо-*
лярных стероидов и других липидов, способных экстрагиро-
ваться вместе с кортикостероидами дихлорметаном. Для этой
цели пригодны различные насыщенные углеводороды.

Во многих случаях для достижения требуемой селективно-
сти необходимы также стадии хроматографической очистки или
разделения, но ими пользуются довольно редко. Колоночную,
тонкослойную или бумажную хроматографию применяют в тех
случаях, когда метод количественного определения недоста-
точно специфичен, а также если цель анализа состоит в опреде-
лении минорных компонентов или если специфичность метода и
надежность результатов более важны, чем затрачиваемое на
выполнение анализа время. Другая причина применения хрома-
тографии для очистки пробы (главным образом на колонках
с сефадексом LH-20 и амберлитом XAD-2) перед ферментатив-
ным гидролизом — это желательность удаления эндогенных ин-
гибиторов (3-глюкоронидазы [132].

Количественное определение

Методы, основанные на измерении собственного поглоще-
ния, не играют заметной роли при определении кортикостерои-
дов в биологических образцах. Среди фотометрических методов,
основанных на химических реакциях для определения кортико-
стероидов в моче [14, 94—96, 132, 232, 258, 271], до сих пор
широко используется классический метод Портера—Зильбера
[232]. Кроме того, находят применение и методы, основанные на
тех же принципах, но с использованием модифицированных реа-
гентов [133, 257, 258].

Из колориметрических методов метод с использованием со-
лей тетразолия и методы, основанные на окислительном отщеп-
лении боковой цепи с образованием формальдегида или 17-ке-
тостероидов, которые можно легко определить, стали первыми
стандартными методами определения кортикостероидов в био-
логических образцах. Они до сих пор применяются в некоторых
лабораториях, но работы, в которых публикуются результаты
их новых применений, теперь появляются редко [89, 265].

Чувствительность методов, основанных на измерении инду-
цируемой кислотами флуоресценции, значительно выше чувст-
вительности колориметрических методов, но селективность по-
чти такая же. Эти методы находят и сейчас довольно широкое
применение.

Можно сказать, что колориметрические и флуориметрические
методы являются простыми, быстрыми и пригодными для при-
менения в недостаточно хорошо оснащенных лабораториях. Од-
нако в первоначальном виде их селективность спорна. Для того
чтобы значительно повысить селективность, нужно проводить
предварительное хроматографическое разделение анализируе-
мой пробы.

В результате тщательных исследований найдены подходя-
щие производные для газохроматографического изучения корти-
костероидов, так что эта проблема, по-видимому, решена. Тем
не менее, газовая хроматография играет меньшую роль в опре-
делении кортикостероидов в биологических образцах, чем в оп-
ределении стероидов других классов. Применение газовой хро-
матографии необходимо при установлении профиля концентра-
ций стероидов, включающем дериватизацию (главным образом
образование метоксим-триметилсилильных производных) и
хроматографию стероидов (в частности, кортикостероидов), со-
держащихся в крови и моче, и при газовой хроматографии —
массспектрометрии кортикостероидов обычно в виде производ-
ных. Задача определения индивидуальных кортикостероидов
также решена, но из-за необходимости проведения утомительных
стадий дериватизации метод, по-видимому, имеет значение
только в случае малого содержания компонентов, когда высокая
чувствительность газовой хроматографии является большим
преимуществом (например, при определении альдостерона [195]
и 18-окси-(11-дезокси )кортикостерона [195, 228, 256, 293,
315]).

Практически все проблемы определения кортикостероидов
в биологических объектах можно решить довольно просто с по-
мощью высокоэффективной жидкостной хроматографии, ввиду
чего важность этого метода в данной области быстро растет.
Это можно видеть по многочисленным новым публикациям, ци-
тируемым в табл. 3.5.

В табл. 3.6 приведены данные, взятые из работ, посвящен-
ных применению радиоиммунного анализа для определения
кортикостероидов в биологических объектах, за 1977—1980 гг.
Большое число статей, опубликованных за этот период, а также
в более ранние годы, свидетельствует о том, что РИА и родст-
венные методы (метод конкурирующего связывания белка и
иммуноферментный анализ) относятся к наиболее важным ме-
тодам анализа биологических объектов. Их популярность объ-
ясняется высокой чувствительностью и (особенно в сочетании
с предварительным хроматографическим разделением) селек-
тивностью, в результате чего РИА стал, по-видимому, наиболее
распространенным методом серийных клинических определений
кортикостероидов.

3.3.4.	ОПРЕДЕЛЕНИЕ КОРТИКОСТЕРОИДОВ

В ПИЩЕВЫХ ПРОДУКТАХ

Задача анализа кортикостероидов в пищевых продуктах
в основном сводится к их определению в молоке. Этому вопросу
посвящен недавно опубликованный обзор Райана [253].

Поскольку из природных кортикостероидов в молоке в от-
носительно высоких концентрациях содержатся 17-оксипроиз-
водные (гидрокортизон и кортизон), для их определения можно
применять метод Портера—Зильбера (разд. 3.2.1). Методы
Муни и Пасарелы [210], а также Труксеса и др. [296], осно-
ванные на этой реакции, позволяют снизить предел обнаруже-
ния до 10 нг/мл. В первом случае подготовка пробы включает
три стадии экстракции с последующим разделением методом
ТСХ и элюированием пятна [210], во второй методике хлоро-
формный экстракт подвергают хроматографическому разделению
на колонке с флорисилом [296].

В последние годы в этой области находит применение и вы-
сокоэффективная жидкостная хроматография. Кржеминский
и др. [172] определяли до 5 нг/мл метилпреднизолона. Для того
чтобы добиться такой высокой чувствительности, нужны очень
чувствительный УФ-детектор (254 нм; 0,005 единиц оптической
плотности на всю шкалу), эффективное концентрирование и
очистка пробы, основанные на экстракции 200 мл молока этил-
ацетатом и жидкость-жидкостной экстракции с участием ацето-
нитрила и гексана, а затем дихлорметана и воды. Аналогич-
ный метод определения дексаметазона в молоке опубликован
де-Паолисом и сотр. [76]. В этом методе вслед за стадией
экстракции этилацетатом для удаления липидов проводят экс-
стракцию смесью гексан—ацетонитрил. После упаривания аце-
тонитрила остаток растворяют в метаноле, содержащем ацето-
нид триамцинолона, используемый в качестве внутреннего стан-
дарта. Детали хроматографирования для всех методов можно
найти в табл. 3.5.

ЛИТЕРАТУРА

1.	Abdou Н. М„ Ast Т. М., Cioffi F. J. J. Pharm. Sci, 1978, v. 67, p. 1397.
la. Agabeyoglu I. T., Wagner J. G., Kay D. R. Res. Commun. Chem. Pathol.

Pharmacol, 1980, v. 28, p. 163.

2.	Al-Dujaili E. A. S., Edwards C. R. W. J. Endocrinol, 1978, v. 77, p. 13 P.
3. Allner R. Med. Lab, 1977, v. 30, p. 59.

4.	Allner R., Eggstein M., Kujawski H. Klin. Wochenschr, 1975, v. 53,
p. 876.

5.	Allner R., Zies H. Arztl. Lab, 1976, v. 22, p. 33.

6.	Amer M. M., Hassan S. M., Kheir A, About A, Mostafa A. A. Pharmazie,
1978, v. 33, p. 344.

7.	Amin M., Schneider P. W. Analyst, 1978, v. 103, p. 1076.

8.	Андреев Л. В., Кощенко К. А. Ж. аналит. химии, 1976, т. 31, с. 343.

9.	Antunes J. R., Dale S. L., Melby J. C. Steroids, 1976, v. 28, p. 621.

10.	Appleby J. L., Norymberski J. K. Biochem. J, 1955, v. 60, p. 460.

11.	Apter D., Janne O., Vihko R. Clin. Chim. Acta, 1975, v. 63, p. 139.

12.	Arakawa H„ Madea M., Tsuji A. Bunseki Kagaku, 1977, v. 26, p. 322;
Anal. Biochem, 1979, v. 97, p. 248.

13.	Arisue K-, Katayama У, Ogawa Z., Hayashi C., Miyata M., Shimada K.>
Nambara T. Chem. Pharm. Bull, 1976, v. 24, p. 3093.

14.	Ariyoshi У, О saw a Z. Clin. Chem, 1976, v. 22, p. 232.

15.	Ascione P., Fogelin C. J. Pharm. Sci, 1963, v. 52, p. 709.

16.	Ast T. M., Abdou H. M. J. Pharm. Sci, 1979, v. 68, p. 42!.

17.	Avdovich H. W., Hanbury P., Lodge B. A. J. Pharm. Sci, 1970, v. 59,
p. 1164.

18.	Axelson M. Anal. Biochem, 1978, v. 86, p. 133.

19.	Bailey E. J. Endocrinol, 1964, v. 28, p. 131.

20.	Bailey E. In Grant J. K. (Editor). The Gas-Liquid Chromatography of
Steroids, Cambridge University Press, 1976, p. 138.

21.	Bailey F., Brittain P. N. J. Pharm. Pharmacol, 1972, v. 24, p. 425.
22.	Bailey F., Brittain P. N. J. Chromat., 1973, v. 83, p. 431.

23.	Bailey K, By A. W., Lodge B. A. J. Chromat., 1978, v. 166, p. 299.

24.	Baillie T. A., Brooks C. J. W., Middletich B. S. Anal. Chem., 1972, v. 44,
p. 30.

24a	. Ballerini R., Chinol M., Ghelardoni M. J. Chromat, 1980, v. 193, p. 413.
25. Barton D. H. R., McMorris T. C., Segovia R. J. Chem. Soc., 1961, p. 2027.
26. Batterbee H. D., Farrar G. E., Braley J. K. J. Appl. Physiol., 1977, v. 42,
p. 643.

27.	Baum C. K., Tudor R., Landon J. Clin. Chim. Acta, 1974, v. 55, p. 147.

28.	Baumann G., Rappaport G., Lemarchand В. T., Felber J. P. J. Clin. Endo-
crinol. Metab., 1975, v. 40, p. 462.

29.	Bauwens J. P., Logghe G. N. Pharm. Weekblad, 1976, v. Ill, p. 633.

30.	Beyer	W.	F., Gleason D. D. J. Pharm. Sci., 1975,	v. 64,	p. 1557.

31.	Beyer	W.	F. J. Pharm. Sci., 1966, v. 55, p. 200.

32.	Beyer	W.	F., Smith E, W. J. Pharm. Sci., 1970, v.	59, p.	248.

33.	Bishara R. H., Jakovljevic I. M. J. Pharm. Sci., 1970, v. 59, p. 124.

34.	Bjorkhem L, Blomstrand R., Lantto O., Loef A., Svensson L. Clin. Chim.
Acta, 1974, v. 56, p. 241.

35.	Bojesen E., Buus O.t Svendsen R., Thuneberg L. In Carstensen H. (Edi-
tor). Steroid Hormone Analysis, Marcel Dekker, New York, 1968, pp. 2—
53.

36.	Bournot P., Prost M., Майте B. F. J. Chromat., 1975, v. 112, p. 617.

37.	Bower E. L. Y., Winefordner J. D. Anal. Chim. Acta, 1978, v. 101, p. 319.

38.	Bracey A., Garett L., Weiss P. J. J. Pharm. Sci., 1966, v. 55, p. 1113.

39.	British Pharmacopoeia 1980, HM. Stationary Office, London, 1980, p. 44.

40.	Brock P., Eldred E. W.t Woiszwillo J. E., Doran M., Schoemaker H. J.
Clin. Chem., 1978, v. 24, p. 1595.

41.	Brooks C. J. W., Middletich B. S., Harvey D. J. Org. Mass Spectrom.,
1971, v. 5, p. 1429.

42.	Brooks C. J. W., Harvey D. J. J. Chromat., 1971, v. 54, p. 193.

43.	Brower J. F. J. Ass. Off. Anal. Chem., 1977, v. 60, p. 27.

43a. Bundgaard H. Arch. Pharm. Chem. Sci. Ed., 1978, v. 6, p. 127.

44.	Burgess C. Perkin Elmer Anal. News, 1977, v. 14, p. 1.

45.	Burgess C. J. Chromat, 1978, v. 149, p. 233.

46.	Burton A. F. J. Clin. Endocrinol. Metab., 1974, v. 39, p. 950.

47.	Butler J., Fanti V„ Lim С. K. In Dixon P. F., Gray С. H., Lim С. K.,
Stoll M. S. (Editors). High Pressure Liquid Chromatography in Clinical
Chemistry, Academic Press, London, New York, San Francisco, 1976,
p. 59.

48.	Butte J. C., Kakihana R.t Noble E. P. Steroids, 1978, v. 32, p. 607.

49.	Butte J. C., Noble E. P. Acta Endocrinol., 1969, v. 61, p. 678.

50.	Butte W. J. High Res. Chromat, 1979, v. 2, p. 74.

51.	Butte W., Schruba K, Hartmann F. J. Clin. Chem. Clin. Biochem., 1979,
v. 17, p. 145.

52.	Cantafora A., Cavina G., Moretti G. Farmaco, Ed. Prat., 1974, v. 29,
p. 35.

53.	Carpenter P. C., Mattox V. R. Biochem. J., 1976, v. 157, p. 1.

54.	Carr P J., Millar R. P., Crowley H. Ann. Clin. Biochem., 1977, v. 14,
p. 207.

55.	Cavina G., Moretti G., Alimenti R., Gallinella B. J. Chromat., 1979, v. 175,
p. 125.

56.	Cavina G., Moretti G., Cantafora A. J. Chromat., 1973, v. 80, p. 89.

57.	Cavina G., Moretti G., Gallinella B., Alimenti R., Barichiesi' R. Boll.
Chim. Farm., 1978, v. 117, p. 534.

58.	Chafetz L., Tsilifonis D. C.	J. Pharm. Sci., 1977, v. 66, p. 1145.

59.	Chafetz L., Tsilifonis D. C.,	Moran C. J. Pharm. Sci., 1974, v. 63,	p.	1771.

60.	Chambaz E. M., Def aye G.,	Madani C. Anal. Chem., 1973, v. 45,	p.	1090.
61.	Chambaz	Е. М., Madani С.,	Ros A. J. Steroid Biochem., 1972, v. 3, p. 741.

62.	Chan	T.	H., Moreland M.,	Hum W. T., Birmingham M.	K.	J. Steroid

Biochem., 1977, v. 8, p. 243.

63.	Chen	C.,	Wheeler J., Tewell	H. E. J. Lab. Clin. Med., 1953,	v.	42, p. 479.

64.	Coda	L.,	Timallo L. Boll. Chim. Farm., 1976, v. 115, p. 515.

65.	Comoglio S., Selada F. J. Immunol. Methods, 1976, v. 10, p. 161.

66.	Connolly T. M., Vecsei P. Clin. Chem., 1978, v. 24, p. 1468.

67.	Connolly T. M., Vecsei P., Haack D., Kohl К H., Abdelhamid S., Am-
menii A. Klin. Wochensch., 1978, v. 56, p. 173.

67a. Cornejo J., Hermosin M. C., White J. L., Peck G. E., Hem S. L. J. Pharm.
Sci., 1980, v. 69, p. 945.

68.	Cox R. A., Gocken M. J. Clin. Endocrinol. Metab., 1973, v. 37, p. 670.

69.	Craig A., Chamberlian J. Ann. Clin. Biochem., 1972, v. 9, p. 88.

70.	Daugherty P., Jones K., Bacchus H. Clin. Res., 1978, v. 26, p. 105A.

71.	De Boer H. S., Den Hartigh J., Ploegmakers H. H. J. L., Van Oort W.

J. Anal. Chim. Acta, 1978, v. 102, p. 141.

71a. De Boer H. S., Lansaat P. H., Kooistra K. R., Van Oort W. J. Anal.
Chim. Acta, 1979, v. Ill, p. 275.

716	. De Boer H. S., Lansaat P. H., Van Oort W. J. Anal. Chim. Acta, 1979,
v. 108, p. 389.

71b. De Boer H. S., Lansaat P. H., Van Oort W. J. Anal. Chim. Acta, 1980,
v. 116, p. 69.

71r. De Boer H. S., Van Oort W. J., Zuman P. Anal. Chim. Acta, 1980, v. 120,
p. 31.

71	д. Dekker D., Beijnen J. H. J. Chromat., 1980, v. 193, p. 480.

72.	Delassalle A., Cesselin F., Carayon A., Legrand S., Antreassian J., Lago-
guey A., Lergand J. C., Desgrez P. Steroids, 1977, v. 29, p. 725.

73.	De Man A. J. M., Benraad T. J. Clin. Chim. Acta, 1977, v. 79, p. 489.

74.	Demers M. L., Derek D. D. Clin. Biochem., 1977, v. 10, p. 104.

75.	Den K., Honda M., Kambegawa A., Tomita M., Tochigi B., Yoshida T.,
Takagi S. Endocrinol. Jpn., 1978, v. 25, p. 171.

76.	DePaolis A. M., Schnabel G., Katz S. E., Rosen J. D. J. Ass. Off. Anal.
Chem., 1977, v. 60, p. 212.

77.	Derks H. J. G. M„ Muskiet F. A. J., Wolthers B. G., Thijssen J. H. H.
Clin. Chem., 1977, v. 23, p. 518.

78.	Derks H. J. G. M., Dray er N. M. Steroids, 1978, v. 31, p. 9.

79.	Derks H. J. G. M., Dray er N. M. Steroids, 1978, v. 31, p. 289.

80.	DeVries С. P., Popp-Snijders C., DeKieviet W., Akkerman-Faber A. C.

J. Chromat., Biomed. Appl., 1977, v. 143, p. 624.

80a. DeVries С. P., Lomecky-Janousek M., Popp-Snijders C. J. Chromat., 1980,
v. 183, p. 87.

81.	Deys H. P., Pinxerten J. A. C. Pharm. Weekblad. 1958, v. 93, p. 760.

82.	Diedrichsen G., Sinterhauf K-, Wolff H. P., Lomer D. J. Steroid Biochem.,
1977, v. 8, p. 631.

83.	Edwards R. W. H. Acta Endocrinol., 1975, v. 80, Suppl. p. 199, 253.

84.	Egger H. J., Reiner J., Spiteller G., Hafele R. J. Chromat., Biomed.
Appl., 1978, v. 145, p. 359.

85.	Fairbrother J. E. In Reid E. (Editor). Methodological Developments in
Biochemistry. Longman, London, v. 5, 1974, p. 141.

86.	Fairbrother J. E., Siam A. Proc. Anal. Div. Chem. Soc., 1978, v. 15,
p. 243.

87.	Faredin L, T6th I. Acta	Med.	Acad. Sci. Hung.,	1964,	v. 20, p.	185.

88.	Feher T.,	Koref O., Tanko L,	Bodrogi L.,	Poteczin	Ё.	Arzneim.	Forsch.,

1975, v. 25, p. 1314.

89.	Feinstein	W., Sciarra J.	J. J.	Pharm. Sci.,	1975,	v.	64,	p. 1050.

90.	Few J. D.	J. Endocrinol.,	1961,	v. 22, p. 31.

18 Заказ № 182
90а. Fidanza A., Floridi S., Lenti L. Boll. Soc. Itai. Biol. Sper., 1980, v. 56,
p. 14.

906.	Finlay G., Jefferies J. P., Sharma S. P. J. Pharm. Pharmacol., 1979, v. 31,
p. 634.

91.	Fitzpatrick F. A. Adv. Chromat., 1978, v. 16, p. 16.

92.	Fonzo D., Lauro L., Dogliotti L., Paschero G. Minerva Med., 1974, v. 65,
p. 1749.

92a. Frey F. J., Frey B. M., Benet L. Z. Clin. Chem., 1979, v. 25, p. 1944.

93.	Frgacic S., Kniewald Z. J. Chromat., 1974, v. 94, p. 291.

93a. Funk W., Kerler R., Boll E., Dammann V. J. Chromat., 1981, v. 217,
p. 349.

94.	Furuua E. Am. J. Clin. Pathol., 1975, v. 64, p. 315.

95.	Furuya E. Clin. Chem., 1977, v. 23, p. 2136.

96.	Furuya E., Graef V., Nishikaze 0. Anal. Biochem., 1978, v. 90, p. 644.

97.	Gaetani E., Laureri C. F. Farmaco, 1974, v. 29, p. 110.

97a.	Gagne D., Lauriault G., Lebelle M. J., Lodge B. A. Can. J. Pharm. Sci.,
1980, v. 15, p. 12.

976.	Gagne D., Lodge B. A. J. Chromat., 1980, v. 193, p. 160.

98.	Gantes P., Juhdsz J. P. Ann. Pharm. Franc., 1966, v. 24, p. 687.

99.	Gardiner W. L., Horning E. C. Biochim. Biophys. Acta, 1966, v. 155,
p. 524.

100.	Garg D. C., Ayres J. W., Wagner J. G. Res. Comm. Chem. Pathol. Phar-
macol., 1977, v. 18, p. 137.

101.	Gaskell S. J., Brooks C. J. W. J. Chromat., 1978, v. 158, p. 331.

102.	Gifzen A.	H.	J. J. Mol. Med., 1977, v.	2,	p. 99.

103.	Gleispach	H.	Ergeb. Exp. Med., 1975,	v.	20, p.	55.

104.	Gleispach	H.	Chromatographia, 1977,	v.	10, p.	40.

105.	Glick D„ Von Redlich D., Levine S. Endocrinology, 1964, v. 74, p. 653.

106.	Gnemmi E., O'Sullivan M. I., Chieregatti G., Simmons M., Simmonds A.,
Bridges J. W., Marks V. In Pal S. B. (Editor). Enzyme Labelled Immu-
noassay of Hormones and Drugs. De Gruyter, Berlin, New York, 1978,
p. 29.

106a. Goehl T. J., Sundaresan G. M., Prasad V. К J. Pharm. Sci., 1979, v. 68,
p. 1374.

107.	Goldzieher J. W. Fluorescence Spectra. In Engel L. L. (Editor). Physical
Properties of the Steroid Hormones. Pergamon, Oxford, London, New
York, Paris, 1963, pp. 288—320.

108.	Gomez-Sanchez C., Milewich L., Holland О. B. J. Lab. Clin. Med., 1977,
v. 89, p. 902.

109.	Goodall R. R. J. Chromat., 1975, v. 103, p. 265.

110.	Gordon G., Wood P. R. Analyst, 1976, v. 101, p. 876.

110a. Gotelli G. R., Wall J. H., Kabra P. M., Marton L. J. Clin. Chem., 1981,
v. 27, p. 441.

111.	Gottfried H. Steroids, 1965, v. 5, p. 385.

112.	Gorog S. J. Pharm. Sci., 1968, v. 57, p. 1737.

113.	Gorag S. J. Pharm. Pharmacol., 1969, v. 21, p. 46S.

114.	Gdrog S., Hajos Gy. J. Chromat., 1969, v. 43, p. 541.

115.	Gorog S., Horvath P. Analyst, 1978, v. 103, p. 346.

116.	Gorog S., Szasz Gy. Analysis of Steroid Hormone Drugs. Akademiai
Kiado, Budapest: Elsevier, Amsterdam, 1978, pp. 330—347, 385—391.

117.	Gorog S., Szepesi G. Analyst, 1972, v. 97, p. 519.

118.	Gorog S., Szepesi G. Anal. Chem., 1972, v. 44, p. 1079.

119.	Gdrog S., Tuba Z., Egyed I. Analyst, 1969, v. 94, p. 1044.

120.	Gorog S., Tuba Z. Analyst, 1972, v. 97, p. 523.

121.	Graham R. E., Biehl E. R., Kenner С. T. J. Pharm. Sci., 1976, v. 65,
p. 1048.

122.	Graham R. E., Biehl E. R., Kenner С. T. J. Pharm. Sci., 1977, v. 66,
p. 965.
123.	Graham R. E., Biehl E. R., Kenner С. T. J. Pharm. Sci., 1978, v. 67,
p. 360.

124.	Graham R. E., Biehl E. R., Kenner С. T. J. Pharm. Sci., 1978, v. 67,
p. 792.

125.	Graham R. E., Biehl E. R., Kenner С. T., Luttrell G. H., Middleton D. L.
J. Pharm. Sci., 1975, v. 64, p. 226.

126.	Graham R. E., Kenner С. T. J. Pharm. Sci., 1973, v. 62, p. 103.

127.	Graham R. E., Kenner С. T., Biehl E. R. J. Pharm. Sci., 1975, v. 64,
p. 1013.

128.	Graham R. E., Williams P. A., Kenner С. T. J. Pharm. Sci., 1970, v. 59,
p. 1152.

129.	Graham R. E., Williams P. A., Kenner С. T. J. Pharm. Sci., 1970, v. 59,
p. 1472.

130.	Gupta V. D. J. Pharm. Sci., 1979, v. 68, p. 908.

131.	Guttmann D. E. J. Pharm. Sci., 1966, v. 55, p. 919.

132.	Hadd H. E. J. Clin. Endocrinol. Metab., 1977, v. 45, p. 1128.

133.	Hadd H. E. Biochem. Med., 1975, v. 13, p. 353.

134.	Hamman B. L., Martin M. M. Anal. Biochem., 1967, v. 20, p. 423.

134a. Hansen J., Bundgaard H. Arch. Pharm. Chemi, Sci. Ed., 1980, v. 8, p. 91.

1346. Hansen J., Bundgaard H. Arch. Pharm. Chemi, Sci. Ed., 1981, v. 9,
p. 34.

134b. Hansen J., Bundgaard H. Internal. J. Pharm., 1981, v. 8, p. 121.

135.	Hara S., Watabe T., Ike Y. Chem. Pharm. Bull., 1966, v. 14, p. 1311.

136.	Hdrkdnen M., Adlercreutz H. J. Steroid Biochem., 1974, v. 5, p. 527.

137.	Harkonen M., Adlercreutz H., Groman E. V. J. Steroid Biochem., 1974,
v. 5, p. 717.

138.	Heasman M. J., Wood A. J. J. Pharm. Pharmacol., 1971, v. 23, p. 176 S.

139.	Heftmann E. Chromatography of Steroids. Elsevier, Amsterdam, 1976,
pp. 96—106.

139a. Henning S. J. Steroids, 1980, v. 35, p. 673.

140.	Henry R. A., Schmidt J. A., Dieckman J. F. J. Chromat. Sci., 1971, v. 9,
P. 513.

141.	Herkner E., Nowotny P., Waldhausl W. J. Chromat., Biomed. Appl., 1978,
v. 146, p. 273.

142.	Hesse C., Pietrzik K, Hotzel D. Z. Klin. Chem. Klin. Biochem., 1974,
v 12, p. 193.

143.	Higgins J. W. J. Chromat., 1975, v. 115, p. 232.

144.	Hilfenhaus M. J. Steroid Biochem., 1977, v. 8, p. 847.

145.	Holbe R., Hovermann W., Roots I., Hildebrandt A. G. Arch. Pharmacol.,
1967, v. 293, Suppl. R61.

146.	Holder G. In Pal S. B. (Editor). Enzyme Labelled Immunoassay of Hor-
mones and Drugs. De Gruyter, Berlin, New York, 1978, p. 221.

147.	Honour J. W., Milla P., Dillon M., Shackleton С. H. L. Acta Endocrinol.,
1975, v. 80, Suppl.J99, p. 217.

148.	Honour J. W., Shackleton С. H. J. J. Steroid Biochem., 1977, v. 8, p. 299.
149. Horikawa R., Tanimura T., Tamura Z. J. Chromat., 1979, v. 168, p. 526.
149a. Hosoda H., Miyairi S., Nambara T. Chem. Pharm. Bull., 1980, v. 28,
p. 1924.

1496.	Hosoda H., Miyairi S., Kobayashi N., Nambara T. Chem. Pharm. Bull.,
1980, v. 28, p. 3369.

149b. Hosoda H., Kawamura N., Nambara T. Chem. Pharm. Bull., 1981, v. 29,
p. 1969.

149r. Hosoda H., Sakai Y., Nambara T. Chem. Pharm. Bull., 1981. v. 29, p. 170.

150.	Hubl W., Buchner M., Haussig K, Rohde W., Stahl F. Endokrinologie,
1978, v. 71, p. 60.

151.	Huf F. A., Herberts J. С. M., Span M. A. Pharm. Weekblad, 1979, v. 114,
p. 660.
152.	Hurter Р., Van Ree T. J. Chromat., 1979, v. 169, p. 93.

153.	Ishii D., Hibi K> Asai K, Nagaya M., Mochizuki K, Mochida У. J. Chro-
mat., 1978, v. 156, p. 173.

154.	Jacobsen E., Korvald B. Anal. Chim. Acta, 1978, v. 99, p. 255.

155.	Jakhammer T., Olsson A., Svensson L. Acta Pharm. Suec., 1977, v. 14,
p. 485.

155a. J aster H. J., Dulce H. J. Acta Endocrinol., 1980, v. 94, p. 145.

156.	Jayle M. F. Analyse des Steroides Homonaux. Masson, Paris, 1962, v. II,
pp. 156—169; a) pp. 119—126.

157.	Jiang N. S., Machacek D., Wadel О. P. Clin. Chem., 1975, v. 21, p. 387.

158.	Johnson C. A., King R., Vickers C. Analyst, 1960, v. 85, p. 714.

159.	Joyce B. G., Turkes A., Ozoran A., Read G. F., Fahmy D. R. In Pal S. B.
(Editor). Enzyme Labelled Immunoassay of Hormones and Drugs.
De Gruyter, Berlin, New York, 1978, p. 247.

160.	Juselius R. E., Barnhart F. Clin. Chem., 1974, v. 20, p. 1470.

161.	Kabra P. M., Tzai L. L., Marton L. J. Clin. Chem., 1979, v. 25, p. 1293.

162.	Kakac B., Rejholec V. Cesk. Farm., 1977, v. 26, p. 124.

163.	Kakac B., Vejdelek Z. Handbuch der Kolorimetrie. V. II. Gustav Fischer
Verlag, Jena, 1963.

164.	Kammerl E., Mutschler E. Pharm. Acta Helv., 1975, v. 50, p. 269.

165.	Kano T., Mizuchi A., Miyachi Y. Nippon Naibumpi Gakkai Zasshi, 1978,
v. 54, p. 654.

166.	Kawasaki T., Maeda M., Tsuji A. J. Chromat., 1979, v. 163, p. 143.

166a. Kirschbaum J., Poet R., Bush KT Petrie G. J. Chromat., 1980, v. 190,
p. 481.

167.	Kley H. K, Herberg L., Kriiskemper H. L. J. Steroid Biochem., 1976,
v. 7, p. 381.

168.	Kobayashi Y., Ogihara T., Amitani K, Watanabe F., Kiguchi T., Nino-
miya I., Kymahara I. Steroids, 1978, v. 32, p. 137.

169.	Kolanowski J. J. Steroid Biochem., 1974, v. 5, p. 55.

170.	Komei L., Miyabo S., Saito Z. J. Chromat., 1975, v. Ill, p. 200.

171.	Korpi J., Wittmer D. P., Sandmann B. J., Haney W. G. J. Pharm. Sci.,
1976, v. 65, p. 1087.

171a. Koupparis M. A., Walczak К M., Malmstadt H. V. J. Pharm. Sci., 1979,
v. 68, p. 1479.

172.	Krzeminski L. F., Cox B. L., Perrel P. N., Schiltz R. A. J. Agricult. Food.
Chem., 1972, v. 20, p. 970.

173.	Kumar M. S., Safa A. M., Deodhar S. D. Clin. Chem., 1976, v. 22, p. 1845.

174.	Kunze F. M., Davis S. J. J. Pharm. Sci., 1964, v. 53, p. 1170, 1259.

175.	Landgraf W. C., Jenning E. C. J. Pharm. Sci., 1973, v. 62, p. 278.

175a. Landis J. B. Anal. Chim. Acta, 1980, v. 114, p. 114.

176.	Lanouette M., Lodge B. A. J. Chromat., 1976, v. 129, p. 475.

176a	. Lea A. R., Kennedy J. M., Low G. К C. J. Chromat., 1980, v. 198, p. 41.

1766. Leung С. P., Tam S. Y. K. Analyst, 1981, v. 106, p. 100.

177.	Lewbart M. L., Mattox V. R. Anal. Chem., 1961, v. 33, p. 559.

178.	Lewbart M. L., Mattox V. R. J.	Org. Chem., 1964, v. 29, p. 513,	521.

179.	Lijnen P., Amery A. Bull. Soc.	Chim. Belg., 1978, v. 87, p. 15.

180.	Lijnen P., Amery A., Fagard R.	Arch. Int. Physiol. Biochim., 1978,	v. 86,

p. 205.

181.	Lisboa В. P. Acta Endocrinol., 1963, v. 43, p. 47.

182.	Lisboa В. P. Steroids, 1966, v. 7, p. 41.

183.	Lisboa В. P. J. Chromat., 1969, v. 39, p. 173.

183a. Lisboa В. P., Strassner M., Tresguerres J. A. F. In Frigerio A., McCa-
mish M. (Editors). Recent Developments in Chromatography and Electro-
phoresis, v. 10. Elsevier, Amsterdam, 1980, p. 155.
1836. Lisboa В. Р., Halket J. М. In Frigerio A., McCamish M. (Editors). Re-
cent Developments in Mass Spectroscopy in Biochemistry and Medicine,
v. 6. Elsevier, Amsterdam, 1980, p. 129.

183b. Li Wan Po A., Irwin W. J., Yip Y. W. J. Chromat., 1979, v. 176, p. 399.

184.	Lodge	B.	A.,	Toft P. J.	Pharm. Pharmacol., 1971, v. 23, p. 196.

185.	Loo	J.	С.	K.,	Butterfield	A. G., Moffatt J., Jordan N. J. Chromat.,	Bio-

med. Appl. 1977, v. 143, p. 275.

186.	Loo	J.	С.	K.,	Jordan N.	J. Chromat. Biomed. Appl., 1977, v. 143, p.	314.

187.	Loo	J.	C.	K.,	Vilim A.	B., Jordan N., Moffatt J. J. Pharm. Sci., 1976,

v. 65, p. 461.

188.	Luetscher J. A., Gould G. R. J. Chromat., 1964, v. 13, p. 350.

189.	Macioci F., Fiotek C. Boll. Chim. Farm., 1975, v. 114, p. 468.

190.	MacKichan J. J., Jusko W. J. J. Pharm. Sci., 1979, v. 68, p. 623.

191.	Mader	W.	J., Buck A.	H. Anal. Chem., 1952, v. 24, p. 666.

192.	Majors	R.	E., Johnson	E. L. J. Chromat., 1978, v. 167, p. 17.

193.	Makin	H.	L. J., Trafford D. J. FL Clin. Chim. Acta, 1971, v	32,	p.	299.

194.	Marcos	J.	M., Moreno	J. Pla Delfina J. M. Cienc. Ind. Farm.,	1977,	v.	9,

p. 92.

195.	Mason P. A., Fraser R. J. Endocrinol., 1975, v. 64, p. 277.

196.	Matin S. B., Amos B. J. Pharm. Sci., 1978, v. 67, p. 923.

197.	Matsumoto LL, Kunugi A., Nagase Y. Chem. Pharm. Bull., 1978, v. 26r
p. 1473.

198.	Matsuzawa T., Kato M., Sekiguchi M., Ishiguro I. Rinsho Kagaku, 1977,
v. 5, p. 239.

199.	Mattingly D. J. Clin. Path., 1962, v. 15, p. 374.

200.	Mattox V. R., Goodrich J. E., Litwiller R. D. J. Chromat., 1975, v. 108,
p. 23.

201.	Mattox V. R.t Litwiller R. D., Goodrich J. E. J. Chromat., 1975, v. 109,
p. 129.

202.	Mattox V. R., Litwiller R. D., Goodrich J. E., Tan W. C. J. Chromat.,
1976, v. 120, p. 435.

203.	Mattox V. R-, Litwiller R. D. Steroids, 1979, v. 34, p. 227.

203a. Майте B. F., Millot C., Mesnier D., Patouraux D., Doumas J., Tomori E.
J. Chromat., 1979, v. 186, p. 581.

204.	Metcalf M. G. Brit. Med. J., 1964, v. 2, p. 1201.

205.	Meyer A. S., Lindberg M. C. Anal. Chem., 1955, v. 27, p. 813.

206.	Miyabo S., Komei L. J. Steroid Biochem., 1974, v. 5, p. 233.

207.	Miyai K., Ishibashi K., Ogihara T., Tanizawa O., Nishi K., Kawashima M.,
Kumahara Y. In Pal S. B. (Editor). Enzyme Labelled Immunoassay of
Hormones and Drugs, De Gruyter, Berlin, New York, 1978, p. 287.

208.	Mollica J. A., Strusz R. F. J. Pharm. Sci., 1972, v. 61, p. 444.

209.	Monder C., Kendall J. Anal. Biochem., 1975, v. 68, p. 248.

210.	Mooney R. P., Pasarela N. R. J. Agr. Food Chem., 1966, v. 14, p. 12.

211.	Morris R. Ann. Clin. Biochem., 1978, v. 15, p. 178.

212.	Morrison P. I., Bradbrook I. D., Rogers H. J. Brit. J. Clin. Pharmacol.,
1977, v. 4, p. 597.

213.	Mohrle FL, Schittenhelm D. Pharm. Ztg., 1967, v. 112, p. 1400.

214.	Mohrle H., Schittenhelm D. Arch. Pharm., 1970, v. 303, p. 771.

214a. Munson J. W., Wilson T. D. J. Pharm. Sci., 1981, v. 70, p. 177.

215.	Murphy В. E.	P. J. Clin. Endocrinol.	Metab., 1975, v. 41, p. 1050.

216.	Muller К- H.,	Stuber B. Pharm. Acta	Helv., 1978, v. 53, p. 124.

217.	Muller O. A.,	Braun J., Frohlich R.,	Scriba P. C. Z. Klin. Chem.	Klim

Biochem., 1974, v. 12, p. 276.

218.	Neher R. Steroid Chromatography. Elsevier, Amsterdam, 1964, pp. 280—
315.

219.	Nordstrom C. G., Peltola O. Scand. J. Rheumat., 1974, v. 3, p. 143.

220.	Norymberski J. K-, Stubbs R. D., West FL F. Lancet, 1953, v. 264, p. 1276.
221.	Occhipinti В., Rigamonti G., Calati M. Farmaco, Ed. Pr., 1974, v. 29, p. 611.

222.	Oelgaard K., Madsen S. Clin. Biochem., 1976, v. 9, p. 265.

223.	Ogihara T., Miyai K., Nishi K-, Ishibashi K., Kumahara Y. J. Clin. Endo-
crinol. Metab., 1977, v. 44, p. 91.

223a. O'Hare M. J., Nice E. С., Capp M. J. Chromat., 1980, v. 198, p. 23.

224.	Olson M. C. J. Pharm. Sci., 1973, v. 62, p. 2001.

225.	Oteiza R. M., Krottinger D. L.t McCracken M. S., Malmstadt H. V. Anal.
Chem., 1977, v. 49, p. 1586.

226.	Oteiza R. M., Wooten R. S., Kenner С. T., Graham R. E., Biehl E. R.
J. Pharm. Sci., 1977, v. 66, p. 1385.

227.	Painter K., Shaw S. M., Russel H. T. Biochem. Med., 1974, v. 9, p. 184.

228.	Palem-Vliers M., Sulon J. J. Steroid Biochem., 1978, v. 9, p. 239.

229.	Park В. K. J. Steroid Biochem., 1978, v. 9, p. 963.

229a. Petersen M. C., Nation R. L., Ashley J. J. J. Chromat., 1980, v. 183, p. 131.

230.	Pfaffenberger C. D., Horning E. C. J. Chromat., 1975, v. 112, p. 581.

231.	Pfaffenberger C. D., Horning E. C. Anal. Biochem., 1977, v. 80, p. 329.
231a. Поляков П. M., Гизатулин 3. Я., Панин Л. Е. Проблемы эндокриноло-
гии, 1981, т. 27, с. 74.

232.	Porter С. С., Silber R. Н. J. Biol. Chem., 1950, v. 185, р. 201.

233.	Prcdt J. H, Holbrook M. M., Dale S. L., Melby J. C. J. Steroid Biochem.,
1977, v. 8, p. 677.

234.	Prochazka Z. In Deyl Z., Macek K., Janak J. (Editors). Liquid Column
Chromatography. Elsevier, Amsterdam, Oxford, New York, 1975, pp. 593—
622.

234a. Pryce Jones R. H., Vass S. W. J. Pharm. Pharmacol., 1980, v. 32, p. 99 P.

235.	Rado J.	P. Horm. Metab. Res., 1973, v. 5, p. 63.

236.	Rado J.	P. Int. J. Clin. Pharmacol., 1976, v. 14, p. 186.

237.	Rado J.	P., Simon T., Juhos J., Tako O. Endokrinologie, 1974, v. 64, p. 22.

238.	Rado J.	P., Vegh L. Int. J. Clin. Pharmacol., 1977, v.	15,	p.	5.

239.	Ratiff C. R., Hall F. F. Clin. Chem., 1973, v. 19, p. 1400.

240.	Read G. F.,	Fahmy D.	R.,	Walker R. F. Endocrinol., 1977, v. 73,	p.	57 P.

241.	Reardon G.	E., Caldarella	A. M., Canalis E. Clin. Chem., 1979, v. 25, p. 122.

242.	Riabov D. K-, Gudat J.	C.	Clin. Chem., 1977, v. 23, p. 1145.

243.	Riad-Fahmy	D., Read	G.	F., Gaskell S. J., Dyas J., Hindawi	R.	Clin.

Chem., 1979, v. 25, p. 665.

244.	Rioux-Lacoste C., Viel C. Ann. Pharm. Franc., 1975, v. 33, p. 163.

245.	Robin P., Predine J., Milgrom E. J. Clin. Endocrinol. Metab., 1978, v. 46,
p. 277.

245a.	Rocci M.	L.,	Jusko W. J. J. Chromat.	Biomed. Appl., 1981,	v.	224,	p. 221.

246.	Romanoff	L.	P., Brodie H. J. J. Steroid Biochem., 1976, v.	7,	p. 289.

247.	Roots I.,	Holbe R., Hovermann W.,	Nigam S., Heinemeyer	G.,	Hilde-
brandt A.	G.	Eur. J. Clin. Pharmacol.,	1979, v. 16, p. 63.

248.	Rose J. Q., Jusko W. F. J. Chromat. Biomed. Appl., 1979, v. 162, p. 273.'
249. Rosenblum C., Meriwether H. T. J. Radioanal. Chem., 1968, v. 1, p. 163.
250. Rosenfeld R. S. Steroids, 1964, v. 4, p. 147.

251.	Rosenfeld R. S., Lebau M. C., Jandorek R. D., Salumaa T. J. Chromat.,
1962, v. 8, p. 355.

252.	Ross H A. Experientia, 1978, v. 34, p. 538.

252a. Roth G., Wikby A., Nilson L., Thalen A. J. Pharm. Sci., 1980, v. 69, p. 766.

253.	Ryan J. J. J. Chromat., 1976, v. 127, p. 53.

254.	Sable-Amplis R., Agid R., Abadie D. J. Chromat., 1974, v. 94, p. 287.

255.	Saito H, Hashiba T., Miyamoto M., Takeda R. Nippon Naibumpi Gakkai
Zasshi, 1977, v. 53, p. 765.

256.	Salmenpera M., Kahri A. I. Acta Endocrinol., 1976, v. 83, p. 781.

257.	Sanghvi A., Taddeini L., Wight C. Anal. Chem., 1973, v. 45, p. 207.

258.	Sanghvi A., Wight C., Parikh B., Desai H. Am. J. Clin. Path., 1973, v. 60,
p. 684.
259.	Scandrett М. S., Ross E. J. Clin. Chim. Acta, 1976, v. 72, p. 165.

260.	Scandrett M. S., Wilson M., Ross E. J. Clin. Chim. Acta, 1976, v. 72, p. 97.

261.	Schoneshofer M. J. Steroid Biochem., 1977, v. 8, p. 995.

262.	Schoneshofer M., Dulce H. F. J. Chromat., Biomed. Appl., 1979, v. 164,
p. 17.

262a. Schoneshofer M., Jaster H. J., Fenner A. Z. Anal. Chem., 1980, v. 301,
p. 130.

2626.	Schoneshofer M., Fenner A., Altinok G., Dulce H. J. Clin. Chim. Acta,
1980, v. 106, p. 63.

262b. Schoneshofer M., Skobolo R.t Dulce H. J. J. Chromat., Biomed. Appl.,
1981, v. 222, p. 478.

263.	Schwedt G., Bussemas H. H., Lippmann Ch. J. Chromat., Biomed. Appl.,
1977, v. 143, p. 259.

264.	Scott N. R., Dixon P. F. J. Chromat., Biomed. Appl., 1979, v. 164, p. 29.
264a. Scott N. R., Chakraborty J., Marks V. Anal. Biochem., 1980, v. 108,
p. 266.

265.	Senciall I. R.t Riley C., Rahal S., Dey A. C., Harding C. A., Acharya M.
Clin. Biochem., 1977, v. 10, p. 32.

266.	Schackleton С. H. L., Honour J. W. J. Steroid Biochem., 1977, v. 8, p. 199.

267.	Sharama D. P., Venkitasubramanian T. A. Biochem. Med., 1974; v. 11,
p. 103.

268.	Short P. M„ Rhodes С. T. Steroids, 1970, v. 16, p. 217.

269.	Siggia S.r Dishman R. A. Anal. Chem., 1970, v. 42, p. 1223.

270.	Silber R. H. Fluorimetric Analysis of Corticoids. In Glick (Editor).
Methods of Biochemical Analysis. Interscience, New York, London, Syd-
ney, v. 14, 1966, pp. 63—78.

271.	Silber R. H„ Porter С. C. J. Biol. Chem., 1954, v. 210, p. 923.

271a. Simon M., Babich Armstrong M. Clin. Chim. Acta, 1980, v. 103, p. 101.

272.	Sippet W. G., Lehmann P., Hollmann G. J. Chromat., 1975, v. 108, p. 305.

273.	Sippel W. G., Putz G., Scheuerecker M. J. Chromat., 1978, v. 146, p. 333.

274.	Smith M. D. J. Chromat., Biomed. Appl., 1979, v. 164, p. 129.

274a. Smith M. D. J. Pharm. Sci., 1980, v. 69, p. 960.

275.	Smith M. D., Hoffman D. J. J. Chromat., 1979, v. 168, p. 163.

276.	Smith P., Hall C. J. Arm. Clin. Biochem., 1976, v. 13, p. 454.

277.	Smith P., Hall C. J. J. Chromat., 1974, v. 101, p. 202.

278.	Smith R. V., Hassal T. H., Liu S. C. J. Ass. Off. Anal. Chem., 1970r
v. 53, p. 1089.

278a. Soliman R., Belal S. Pharmazie, 1980, v. 35, p. 153.

279.	Sparagana M., Kucera L. Biochem. Med., 1974, v. 9, p. 363.

279a. Stalla G., Giesemann G., Muller O. A., Wood W. G., Scriba P. C. Z. Anal.
Chem., 1980, v. 301, p. 129.

2796. Stroud N., Richardson N. E., Davies D. J. G., Norton D. A. Analyst,
1980, v. 105, p. 455.

280.	Sulon L, Sparano F. J. Steroid Biochem., 1978, v. 9, p. 253.

281.	Sulon J. Palem-Vliers M., Genard P., Cittanova N., Desfosses B. Clin.
Chim. Acta, 1976, v. 72, p. 275.

282.	Sybulski S., Maughan G. B. Am. J. Obstet. Gyn., 1975, v. 121, p. 32.

283.	Szabo A., Mizcei A. Steroids, 1970, v. 15, p. 513.

284.	Szepesi G., Gorok S. Boll. Chim. Farm., 1975, v. 114, p. 98.

285.	Tan E. M. L., Pearce P. H., Runkis J. O., Au D. C., Abbott F. S. Can.
J. Pharm. Sci., 1978, v. 13, p. 101.

286.	Tan S. Y., Gewolb I. H., Hobbins J. C. J. Clin. Endocrinol. Metab., 1976,
v. 43, p. 412.

287.	Tan S. Y., Noth R., Mulrow P. J. Clin. Chem., 1978, v. 24, p. 1531.

288.	Tembo A. V., Ayres J. W7., Sakmar E., Hallmark M. R., Wagner J. G.
Steroids, 1977, v. 29, p. 679.

289.	Toft P., Lodge B. A. Can. Spectr., 1970, v. 15, p. 137.
.290. Toft Р., Lodge В. A., Simard М. В. Can. J. Pharm. Sci., 1972, v. 7, р. 53.

291.	Tokunaga Н., Kimura Т., Kawamura J. Bunseki Kagaku, 1976, v. 25,
p. 392.

292.	Tokunaga H., Kimura T., Kawamura J. Bunseki Kagaku, 1977, v. 26,
p. 154.

292a. Tokunaga H., Kimura T., Kawamura J. Yakugaku Zasshi, 1979, v. 99,
p. 800.

2926. Tokunaga H., Kimura T., Kawamura J. Yakugaku Zasshi, 1980, v. 100,
p. 200.

293.	Tomsovd Z., Gregorovd K-, Horky, Dvorakovd J. J. Chromat., Biomed.
Appl., 1978, v. 145, p. 131.

294.	Toscano L., Guadagnini G., Grisanti G. Arzneim. Forsch., 1977, v. 27,
p. 1636.

295.	Trefz F. K-, Byrd D. J., Kochen W. J. Chromat., 1975, v. 107, p. 181.

296.	Trucksess M. W., Donoso J., Craig G. J. Ass. Off. Anal. Chem., 1969,
v. 52, p. 932.

297.	Tsuei S. E., Ashley J. J. J. Chromat., Biomed. Appl., 1978, v. 145, p. 213.
298. Tymes N. W. J. Chromat. Sci., 1977, v. 15, p. 151.

298a. United States Pharmacopoeia XIX, USP Convention Inc., Rockville, Md.,
a) 1975, p. 402.

299.	United States Pharmacopoeia XX, USP Convention Inc., Rockville, Md.,
1980, a) p. 652, 6) p. 814, в) p. 916, r) p. 927.

300.	Uppal S. S., Osaki S. Clin.-Chem., 1978, v. 24, p. 994.

301.	Upton L. M., Townley E. R., Sancilio F. D. J. Pharm. Sci., 1978, v. 67,
p. 913.

302.	Van	Dame H.	C.	J. Ass. Off.	Anal. Chem., 1974, v. 57, p. 731.

302a.	Van	Dame H.	C.	J. Ass. Off.	Anal. Chem., 1980, v. 63, p. 1184.

303.	Van	den Berg	J.	H. M., Mol	Ch. R., Deelder R. S., Thijssen J.	H. H.

Clin. Chim. Acta, 1977, v. 78, p. 165.

304.	Van den Berg J. H. M., Milley J., Vonk N., Deelder R. S. J. Chromat.,
1977, v. 132, p. 421.

305.	V andenheuvel F. A. J. Chromat., 1977, v. 133, p. 107.

306.	Vanderhaeghe H., Hoebius J. J. Pharm. Belg., 1976, v. 31, p. 25.

306a. Veeman G. E. Farm. Weekblad, 1981, v. 116, p. 109.

307.	Vecsei P., Gless К. H. Aldosteron-Radioimmunoassay. Ferdinand Enke
Verlag, Stuttgart, 1975.

308.	Vecsei P., Kemeny V., Gorgenyi A. J. Chromat., 1964, v. 14, p. 506.

309.	Walker R. F., Riad-Fahmy D., Read G. F. Clin. Chem., 1978, v. 24,
p. 1460.

310.	Walsh P. R., Wang M. C., Turner	E. A. Clin. Chem.,	1979, v.	25, s.	1226.

311.	Whigham W. R. Clin.	Chem., 1976,	v. 22, p. 369.

312.	Wikby A., Nilsson L., Hallsds G. J. Chromat., 1978, v. 157, p. 51.

313.	Wikby A., Thalen A.,	Oresten G.	J. Chromat., 1978,	v.	157,	p. 65.

314.	Will H., Aderjan R.,	Winkler T.,	Penke B., Vecsei	P.	Acta	Endocrinol.,

1977, v. 86, p. 369.

315.	Wilson A., Mason P. A., Fraser R. J. Endocrinol., 1976,	v. 68,	p.	24P.

316.	Wilson C. G., Sendagire R., May C. S., Paterson J.	W. Brit.	J?	Clin.

Pharmacol., 1975, v. 2, p. 321.

316a.	Witzgall H., Hassan-Ali S. J. Chromat., 1980, v. 198,	p.	70.

317.	Wong P. Y., Mee A. V., Ho F. F. K. Clin. Chem, 1979,	v.	25, p.	914.

318.	Woodson A. L. J. Pharm. Sci, 1971, v. 60, p. 1538.

319.	Woodson A. L., Smith D. E. Anal. Chem, 1970, v. 42, p. 242.

320.	Wortmann W., Schnabel C, Touchstone J. C. J. Chromat, 1973, v. 84,
p. 396.

321.	Yadav R. N., Teare F. W. J. Pharm. Sci, 1978, v. 67, p. 436.

321a. Yanagihashi K-, Mizuchi A., Yotsumoto H., Miyashi Y. Clin. Chem, 1980,
v. 26, p. 1301.
4

ХОЛЕСТЕРИН И РОДСТВЕННЫЕ СТЕРИНЫ

4.1.	ОСНОВЫ ХИМИИ СТЕРИНОВ

Большинство стеринов можно охарактеризовать как соедине-
ния со стероидным скелетом, несущим ангулярные метильные
группы в положениях 10 и 13, боковую цепь из 8—10 углерод-
ных атомов в положении 17, двойную связь между С5 и Сб и
оксигруппу при С3. Наиболее важным представителем этого
класса соединений является холестерин, содержащий в поло-
жении 17 холестанового скелета 2-(6-метилгептильную) группу.

Другие алкильные группы могут находиться при С-4, С-14
(4,4,14а-триметилхолестан, т. е. л аностан) и С-24. В этом слу-
чае при С-24 возникает новый центр асимметрии и образуются
два ряда производных (24R и 24S) [(245)-24-метилхолестан,
т. е. эргостан, (24R)-24-этилхолестан, т. е. стигмастан]. В 5,6-на-
сыщенных производных (станолы) водород в положении 5 имеет
а- или ^-конфигурацию (ряды холестана и копростана). Кроме
Д5-положения двойные связи могут находиться в Д7-, Д8-, Д22-,
Д24-, Д24(28)-положениях и т. д. При наличии двойных связей
в боковой цепи наблюдается геометрическая изомерия и обра-
зуются производные Е- и Z-рядов. В молекулах стеринов могут
быть дополнительные оксигруппы в различных положениях,
например 1, 4, 7, 25, 26 и т. д. Ниже приведены формулы наи-
более важных стеринов:

Фитостерины
брассикастерин
(5,22-эргостадиен-ЗР-ол)

Мико стераны

кампестерин

[ (24R) -5-эргостен-Зр-ол]

Зоостерины

десмостерин	ланостерин

(5,24-холестадиен-ЗР-ол)	(8,24-ланостадиен-Зр-ол)

Стерины, синтезированные в организмах растений или жи-
вотных из уксусной кислоты, классифицируют соответственно
на фитостерины (микостерины) и зоостерины.

Стерины составляют менее полярную группу стероидов. Они
растворяются в неполярных растворителях (углеводороды),
которые не растворяют стероиды других классов, и поэтому со-
держатся в липидных фракциях животного и растительного
происхождения.

Наиболее важный представитель стеринов — это холестерин,
являющийся одной из главных составных частей тканей и крови
животных (частично этерифицированный жирными кислотами
и связанный белками). Определение сывороточного холестерина
относится к обычным серийным клиническим тестам. В больших
количествах холестерин используют в фармацевтической и пар-
фюмерной промышленности в качестве эмульгатора. Для про-
мышленных целей его получают главным образом из спинного
мозга крупного рогатого скота, свиней и т. д., где он находится
в свободном состоянии, и шерстяного воска, где он иногда со-
держится вместе с ланостерином, часто в этерифицированном
состоянии.

Экстрагированный из дрожжей эргостерин применяют в ка-
честве исходного сырья для синтеза витамина ЕЬ, для синтеза
же витамина D3 используют 7-дегидрохолестерин, получаемый
из холестерина.

Наиболее важным стерином растений (и водорослей) явля-
ется ситостерин, которому сопутствует множество других сте-
ринов.

Стерины всегда были важным исходным материалом для по-
лучения стероидных гормонов. Отщепление боковой цепи хими-
ческими методами экономично лишь в том случае, когда она
содержит двойную связь (например, стигмастерин). В послед-
ние годы разработан микробиологический метод отщепления
боковой цепи, и поэтому стерины (в основном ситостерин) стали
наиболее важным промышленным сырьем для получения раз-
личного рода стероидных гормонов.

4.2.	МЕТОДЫ АНАЛИЗА СТЕРИНОВ

4.2.1.	СПЕКТРОФОТОМЕТРИЧЕСКИЕ

И КОЛОРИМЕТРИЧЕСКИЕ МЕТОДЫ

Из всех важнейших стеринов только стерины, содержащие
Д5’7-сопряженную двойную связь (эргостерин и 7-дегидрохоле-
стерин), можно определять по их собственному поглощению.
Максимум поглощения эргостерина, типичного ^z/c-диена, наб-
людается при 282 нм и характеризуется молярным коэффици-
ентом поглощения 12150, а второстепенные максимумы лежат
при 271,5 и 293,5 нм [261].

Максимумы поглощения стеринов с изолированной двойной
связью лежат при <210 нм, что не позволяет использовать их
для количественного определения. В последнее время важность
этих полос поглощения возросла, поскольку они стали основой
обнаружения и количественного определения стеринов после
разделения методом высокоэффективной жидкостной хромато-
графии.

Фотометрические методы определения стеринов основаны
почти исключительно на использовании химических реакций.
Меньшая часть этих методов включает стехиометрическое окис-
ление оксигруппы стеринов и колориметрическое определение
продуктов окисления. В методе, разработанном Нишиной и сотр.
[200, 201], в качестве окислителя используют оксид хрома (VI)
и измеряют при 595 нм поглощение образовавшегося Л4-3,6-
диона после реакции с и-нитрофенилгидразином и омыления
в среде диметилформамида. Значительно более важны методы,
разработанные в последнее время и основанные на фермента-
тивном окислении и последующем колориметрическом опреде-
лении образующегося пероксида водорода. Эти методы обсуж-
даются отдельно в разд. 4.2.9.

Из классических колориметрических методов определения
стеринов (главным образом холестерина) наиболее важным яв-
ляется, несомненно, метод Либермана—Бурхарда. Обсуждение
многочисленных работ, посвященных превращению первоначаль-
ной методики качественного обнаружения [38, 168] в надежный
метод количественного определения и его применению для ре-
шения различных задач, можно найти в монографиях [20, 55,
133, 155] и обзорных статьях [179, 304]. Здесь будут рассмот-
рены только наиболее важные особенности этого метода.

Анализ основан на измерении интенсивности зеленовато-го-
лубой окраски, возникающей после обработки холестерина
смесью уксусного ангидрида и серной кислоты в соотношении
•от 20 : 1 до 5 : 1. Во многих работах сообщается, что этот реа-
гент разбавляют различными растворителями (главным обра-
зом хлороформом и уксусной кислотой). Для приготовления
реагента Абеля и сотр. [1, 2], наиболее часто используемой мо-
дификации реагента Либермана—Бурхарда, 1 объем концен-
трированной серной кислоты смешивают с 20 объемами уксус-
ного ангидрида, охлажденного ниже 10°С, и затем к смеси,
охлажденной в течение 9 мин, добавляют 10 объемов ледяной
уксусной кислоты. Такой реагент пригоден для работы в тече-
ние 1 ч. Определяемый стерин растворяют непосредственно
в этом реагенте. Скорость развития окраски и ее устойчивость
зависят от температуры. Упомянутые выше исследователи [1,
2] указывают, что продолжительность реакции составляет 30—
35 мин при 25°С. Хуанг и сотр. [117] получили устойчивый реа-
гент (при хранении в холодильнике пригодный в течение ме-
сяца), готовя 2 %-ный раствор сульфата натрия в смеси уксус-
ного ангидрида, уксусной и серной кислот в соотношении 6:3:1
(по объему). Этот реагент до сих пор находит широкое приме-
нение.

Окрашенный продукт характеризуется двумя максимумами
поглощения при 420 и 620 нм, причем последний используется
в большинстве аналитических методов, несмотря на то что из-
вестно, что поглощение при меньшей длине волны более ста-
бильно [138]. Чувствительность этого метода довольно низкая,
так как, согласно данным по поглощению, приводимым раз-
ними авторами, молярный коэффициент поглощения для холе-
стерина лежит в интервале 1800—2000. Для эфиров холесте-
рина чувствительность несколько выше.

Селективность реакции обсуждалась многими авторами, но
наиболее полно она изучена Куком [56]. Кук установил, что
в данном случае содержание серной кислоты в реагенте на-
много ниже, чем в реагенте для колориметрического определе-
ния стероидных гормонов. Благодаря этому большинство сте-
роидных гормонов не образует с реагентом характерно окра-
шенного продукта и не мешает определению холестерина. Хотя
развитие окраски обусловлено наличием в молекуле Р, у-нена-
сыщенной оксигруппы, Л5-3-оксистероиды, не имеющие углерод-
ной боковой цепи при С-17, положительной реакции не дают.
Положение и интенсивность полос практически не зависят от
природы боковых цепей при С-17 в случае Д5-Зр-оксистеринов,
и поэтому этот метод ни в коем случае не пригоден для прямого
анализа смеси стеринов растительного происхождения. Интен-
сивность окраски Д5’7-3-оксистеринов почти в 4 раза выше ин-
тенсивности окраски холестерина, и, что даже более интересно,
она развивается почти мгновенно, тогда как в идентичных экс-
периментальных условиях для развития окраски в присутствии
холестерина требуется около получаса. Это явление было ис-
пользовано для одновременного определения холестерина и
7-дегидрохолестерина по измерению поглощения при 620 нм че-
рез 1,5 и 33 мин с момента начала реакции [184].

Селективность и устойчивость окраски можно повысить вве-
дением в реагент ароматических сульфокислот. Из многочис-
ленных модификаций этого метода следует упомянуть метод
Уотсона [292] с использованием 2,5-диметилбензолсульфокис-
лоты, на который часто ссылаются.

Очень важной особенностью специфичности этого метода яв-
ляется то, что на возникновение и развитие окраски не влияет
присутствие дигитонина, поэтому его можно непосредственно
применять для количественного определения свободных стери-
нов, выделенных из сложных биологических систем в форме
нерастворимых дигитонидов (см. разд. 4.2.3 и 4.3.2), на чем ос-
нованы классические методики Шенхаймера—Сперри [255] и
Сперри—Вебба [267].

Изучению механизма реакции Либермана—Бурхарда посвя-
щено много статей. В основном благодаря работам Брискорна
и сотр. [29—32] установлено, что при этом образуется ряд окра-
шенных продуктов, спектральные характеристики которых
можно получить после разделения методом колоночной хромато-
графии на сефадексе LH-20 [30]. Первая стадия реакции заклю-
чается в дегидратации с образованием 3,5-диенов с последую-
щей окислительной ди- и тримеризацией последних до высоко
сопряженных производных. Роль серной кислоты не ограничи-
вается только дегидратирующим и окислительным действием —
она сульфирует продукты реакции, затрудняя тем самым их
экстракцию и изучение структуры.

Из других колориметрических методов с методом Либерма-
на—Бурхарда по важности сравним только метод Златкиса—
Зака и др. [302—304, 308]. В качестве реагентов в многочислен-
ных модификациях первоначальной методики служит смесь ук-
сусной кислоты, серной кислоты и хлорида железа (III). Обычно
соотношение серной и уксусной кислот в конечной реакционной
смеси составляет 40:60 (по объему), а концентрация железа
приблизительно 10 мг в 100 мл. Почти мгновенно возникает
красная окраска, а максимум поглощения наблюдается при
560 нм. Молярные коэффициенты поглощения холестерина и
его эфиров идентичны. Главное преимущество этого метода по
сравнению с методом Либермана—Бурхарда заключается втом„
что его чувствительность приблизительно в 8 раз выше. Такая
же окраска возникает в присутствии и других А5-3-оксистерои-
дов, более того наблюдаются помехи со стороны ряда других
веществ, находящихся в биологических системах. Поэтому к ре-
зультатам, полученным методом Златкиса—Зака для сложных
биологических систем, следует относиться с осторожностью.
Для устранения этих затруднений рекомендуются очистка ана-
лизируемого образца на ионообменной смоле дауэкс 1-Х8 и эк-
стракция смесью хлороформа с метанолом (2:1) [264]. Парэк
и др. [212, 213] предложили реагент, содержащий ацетат же-
леза (III), сульфат железа(II) и уранилацетат. Поскольку
в первоначально предложенном реагенте присутствовал только
хлорид железа(III), ожидалось, что последний реагент будет
более специфичен, что, однако, недавно было подвергнуто со-
мнению [10].

При использовании железосодержащих реагентов для опре-
деления холестерина в плазме, консервированной азидом нат-
рия, получаются заниженные результаты [139].

Следует упомянуть о применении реагента Чугаева (хлорид*
цинка и ацетилхлорид в уксусной кислоте). В присутствии хо-
лестерина и его эфиров возникает красно-розовая окраска, мак-
симум поглощения наблюдается при 526 нм. По чувствитель-
ности относительно холестерина реагент Чугаева занимает про-
межуточное положение между двумя обсужденными выше
(е^8800), причем в присутствии эфиров холестерина окраска
менее интенсивна. В силу ряда технических трудностей этот
метод не получил такого же широкого распространения для ко-
личественного определения стеринов, как методы, описанные
выше. Недавно реакция Чугаева была подвергнута новой про-
верке в работе Холодовой и др. [140].
Для количественного колориметрического определения сте-
ринов описаны и другие реагенты [20, 55, 133, 154], но большин-
ство из них уже не применяется. Во многих работах, посвящен-
ных колориметрическому определению стеринов, в последнее
время описываются варианты методов Либермана—Бурхарда,
Златкиса и Зака [304, 308] или колориметрический вариант
ферментативного метода, обсуждаемого в разд. 4.2.9. Одна из
редких попыток предложить новый реагент описана в работе
Джунгриса и Раппа [131], которые использовали реагент, со-
держащий 20 мл хлорида сурьмы(V) и 5 г хлорида сурьмы(III)
в 100 мл хлороформа и образующий окрашенное соединение
с максимумом поглощения при 470 нм.

4.2.2.	ФЛУОРИМЕТРИЯ

Когда с целью колориметрического определения (обсуждав-
шегося в предыдущем разделе) холестерин обрабатывают реа-
гентами, содержащими большие количества серной кислоты, об-
разование окрашенных соединений обычно сопровождается
флуоресценцией, которая может стать основой более чувстви-
тельного метода определения, чем колориметрический метод.

Альберс и Лоури [5], например, превращали холестерин,
содержащийся в экстрактах тканей, в флуоресцирующее про-
изводное путем обработки его реагентом, подобным реагенту
Либермана—Бурхарда [экстракт обрабатывали 6 мкл серной
кислоты после растворения в 150 мкл смеси 1,1,2-трихлорэтана
и уксусного ангидрида (5:1)]. Холестерин и его эфиры дают
очень близкие по интенсивности, чрезвычайно устойчивые сиг-
налы, если измерение основано на регистрации красной флуо-
ресценции, возбуждаемой линией ртутной лампы при 546 нм.
Этим методом можно определять очень небольшие количества
холестерина (до 0,1 мкг). Подобные методы описаны и дру-
гими авторами [43, 181, 294] и обсуждены в обзорах Бартоша
и Пезе [20] и Элевича [74].

Недавно Майески и др. [174] описали флуориметрический
вариант реакции Сальковского, в котором смешивают равные
объемы концентрированной серной кислоты и раствора опре-
деляемого холестерина в дихлорметане, энергично встряхивают
и измеряют флуоресценцию сернокислого слоя при 450 нм, ис-
пользуя источник возбуждения с длиной волны 415 нм. Эфиры
холестерина перед выполнением анализа омыляют. Этот метод
имеет значительно более низкую чувствительность, чем метод
Альберса—Лоури, но все же он пригоден для определения хо-
лестерина в 250 мкл сыворотки крови.

Применение реагента, содержащего смесь хлорида же-
леза (III) и серной кислоты (растворенных в этилацетате),
позволило разработать чувствительный метод определения 0,1—
5 мкг холестерина, описанный Баджио и др. [14]. Его успешно
применяли для определения холестерина в липопротеиновой
фракции, полученной электрофорезом на геле агарозы.

Флуориметрический вариант ферментативного определения
холестерина описан в разд. 4.2.9.

4.2.3.	МЕТОДЫ ОСАЖДЕНИЯ В ВИДЕ ДИГИТОНИДОВ

Ранние наблюдения Виндауса [296] об образовании нерас-
творимого молекулярного комплекса (1:1) между холестери-
ном и дигитонином послужили основой для разработки одного
из ставших классическим методов анализа стероидов.

R = ксилоза— (галактоза) 2— (глюкоза) 2—

Позже было установлено, что стерины, содержащие свобод-
ные Зр-оксигруппы и Д5-двойные связи или 5а-водород, также
дают реакцию с дигитонином, тогда как другие стерины, глав-
ным образом За-оксипроизводные, не вступают в нее, и по-
этому этот метод имеет важное значение для определения конфи-
гурации 3-оксигруппы [102].

Реакцию с дигитонином можно использовать для количест-
венного определения только стеринов (другие Зр-окси'стероиды
не образуют достаточно нерастворимых соединений, которые
можно было бы определять на основе этой реакции). Образо-
вание комплекса между стеринами и дигитонином можно раз-
личными способами использовать для количественного опреде-
ления стеринов или их разделения при определении другими
аналитическими методами. (Несмотря на то, что другие сапо-
нины, например гитонин [61], образуют даже менее раство-
римые молекулярные комплексы, чем дигитонин, а также на то,
что описано образование осадка с алкалоидом томатином
[256], дигитонин остается единственным реагентом, до сих пор
сохраняющим значение в анализе стеринов.)

Если для выполнения анализа располагать по крайней мере
10—20 мг стерина, гравиметрический метод обеспечивает по-
лучение надежных результатов. Для уменьшения потерь из-за
неполноты осаждения образец, растворенный в 10 мл этанола,
обрабатывают при 70°С небольшим избытком дигитонина, рас-
творенного в смеси 12 мл этанола и 5 мл воды. Для ускоре-
ния осаждения к реакционной смеси можно добавить хлорид
алюминия [36]. После стояния в течение 2 ч осадок отфильтро-
вывают и высушивают при 105°С. Гравиметрический фактор
имеет небольшую величину (0,239 для холестерина), что бла-
гоприятствует анализу. Если присутствуют также эфиры сте-
ринов с жирными кислотами, перед выполнением анализа не-
обходимо провести их омыление (например, нагревая в тече-
ние 3 ч при 50—60°С в присутствии 1 % гидроксида калия)
[172].

Осаждение и выделение осадков стеринов находят широкое
применение при их удалении из сложных смесей. В неомыляе-
мых фракциях липидов растительного или животного происхо-
ждения стерины содержатся в таком большом избытке, что их
необходимо удалить перед проведением анализа, чтобы можно
было определять содержание минорных компонентов в филь-
трате. Из многочисленных примеров следует упомянуть опре-
деление витамина D3 в жире печени трески методом колори-
метрии [4] или газовой хроматографии [22], где осаждение
стеринов в форме дигитонидов является важной стадией пред-
варительной подготовки пробы перед определением витамина
D, поскольку последний не осаждается дигитонином. Для тех
же целей можно использовать метод колоночной хроматогра-
фии на целите, модифицированном дигитонином, так как такие
колонки селективно поглощают стерины [150, 210].

Комплексы стеринов с дигитонином и томатином, что очень
важно, легко разлагаются при обработке кислотами, пириди-
ном и т. п. Поскольку образующиеся при этом дигитонин и
томатин не мешают применению метода Либермана—Бурхарда,
то осадок можно прямо проанализировать с помощью этого
метода. Такой принцип, впервые использованный Шенхаймером
и Сперри [225], в последнее десятилетие нашел широкое при-
менение. Здесь уместно процитировать только несколько публи-
каций [12, 85, 118, 132, 267]. Главным достоинством введения
этой стадии в методику Либермана—Бурхарда является по-
вышение ее селективности. Модифицированные методы обычно
заключаются в экстракционном отделении стеринов от биоло-
гической матрицы подходящим растворителем, осаждении ком-
плекса, отделении его центрифугированием и использовании
осадка по методу Либермана—Бурхарда.

Гарно [93а] описал способ фракционирования дигитонидов
стеринов с помощью тонкослойной и колоночной хромато-
графии на силикагеле, а Эл-Олеми и Штос [75]- сообщили

19 Заказ № 182
о возможности их разложения и хроматографического разделе-
ния на компоненты на сефадексе LH-20.

Используя зависимость скорости осаждения дигитонидов
стеринов от таких структурных особенностей, как степень не-
насыщенности, конфигурация при С-5 и С-17 и длина боковой
цепи при С-17 [102, 103, ИЗ], Попов [230] разработал мето-
дику фракционированного осаждения, пригодную для разделе-
ния различных классов стеринов, содержащихся в морских бес-
позвоночных, что облегчает их дальнейшее изучение комбини-
рованым методом газовой хроматографии — масс-спектро-
метрии.

Для полноты картины следует кратко упомянуть о таких
ранних методах, как, например, метод, основанный на окисле-
нии выделенного комплекса [270], количественный метод, ос-
нованный на ингибировании холестерином гемолиза красных
кровяных телец, вызываемого дигитонином [166], и нефело-
метрический метод определения холестерина в виде дигитонида
[227]. С помощью автоанализатора «Техникой» [171] был авто-
матизирован турбидиметрический метод определения холесте-
рина.

4.2.4.	ЭЛЕКТРОАНАЛИТИЧЕСКИЕ МЕТОДЫ

Стерины полярографически не активны; в период развития
классической полярографии предпринимались попытки превра-
тить их в соединения, способные восстанавливаться на капаю-
щем ртутном электроде [28]. Гершберг и сотр. [106, 107]
превращали А5-3-оксистероиды (в том числе стерины) в А4-3-ке-
топроизводные окислением по Оппенауэру, которые после пре-
вращения в производные Т Жирара можно определять поляро-
графически. Другая возможность заключается в образовании
3,5-динитробензоатов и полярографическом определении по вос-
становлению нитрогрупп [28].

Моравек [185, 186] описал способ осциллополярографиче-
ского определения холестерина и его эфиров жирных кислот-.
Определение этих соединений основано на их способности ад-
сорбироваться на поверхности ртутного электрода, в результате
чего на осциллополярограмме наблюдается максимум, высота
которого пропорциональна концентрации холестерина или его
эфиров. Чувствительность данного метода при определении эфи-
ров намного выше.

Хотя описанные выше методы можно успешно использовать
для решения таких практических задач, как опредёление сы-
вороточного холестерина, вызывают интерес недавно разрабо-
танные методы, si которых полярографическому определению
предшествует ферментативное окисление холестерина. Эти ме-
тоды будут рассмотрены отдельно в разд. 4.2.9; там же будут
обсуждаться возможности разработки холестеринселективного
электрода.

4.2.5.	КОЛОНОЧНАЯ ХРОМАТОГРАФИЯ

Большая часть методов количественного анализа стеринов
начинается с фракционирования образца с помощью колоноч-
ной хроматографии. Цель этой стадии заключается либо в отде-
лении фракции стеринов от других липидов, присутствующих
в образце, либо в разделении стеринов для того, чтобы повы-
сить селективность последующего определения. Фракциониро-
вание на этой стадии полезно даже в том случае, если анализ
проводят такими высокоселективными методами, как высокоэф-
фективная жидкостная хроматография или газовая хромато-
графия, поскольку без предварительного фракционирования
хроматограммы сложной смеси стеринов были бы слишком
трудными для расшифровки.

Обычно посвященные хроматографии монографии содержат
обширные данные по практике и применению колоночной хро-
матографии для разделения стеринов [63, 104, 146, 194]. Мы
рассмотрим только несколько характерных примеров.

Отделение стеринов от других липидов описано в работах
Хирша и Аренса [109] и Кэролла [44, 45]. Эти исследователи
использовали колонки с силикагелем и флорисилом соответст-
венно и градиентное элюирование с помощью растворителей,
начиная с углеводородов и кончая метанолом или смесью ук-
сусной кислоты и диэтилового эфира. Стерины относятся к наи-
менее полярным компонентам липидов. Эфиры холестерина
элюируются в первых фракциях, а свободный холестерин вы-
мывается после триглицеридов.

Из адсорбентов для разделения стеринов чаще всего ис-
пользуют силикагель [49, 89, 144, 157, 159, 165], оксид алюми-
ния [77, 78, 215, 217, 230] или (если предполагается провести
разделение в соответствии со степенью ненасыщенности) те же
адсорбенты, модифицированные нитратрм серебра [64, 164, 207,
214, 230, 291, 307]. Возрастает значение гель-хроматографии
на сефадексе LH-20 [48, 75, 76, 79, 80, 288] или его оксиал-
коксипропилпроизводном (липидексе) [218]. Применяются
также жидкостная распределительная хроматография с исполь-
зованием в качестве твердого носителя целита 545 и различные
системы растворителей с прямыми и обращенными фазами
[39, 40, 193]. Несколько примеров из большого числа всевоз-
можных хроматографических методов разделения стеринов при-
ведено в табл. 4.1.
Таблица 4.1. Некоторые методы разделения стеринов с помощью колоночной хроматографии

Метод определения	о	о  £	S	в  §11	s	S  £.	><	><	е- е  i g g S	||  •-	as.  §	£ б X S §	§  U	Н	(-	&	&
Элюент	св .	Я  s	Я	я	я	я  м o'	£	м	s	з	Е	®  2 S. a » s |  1	i	®	°	£	i	i	2  I	§	-	о.	е	g.	s.s	§	i  go	a	g.	s	g	„	°	c ।	g*	§  5	” 2 > f “§«	° S a. s  3	t	®	t	«	S	1	„	Э	®	8	S'  ч	Я	i	к	3	св	я	3	g	§	10  о	я _ Й = от	янсв2^55л-  СП	О	СХ	о	3	О	1	О)	О	Н	св	Он	л	••  к	w	к	м	я а	^^Я'-усхк^ю  a)	<и л. S о a>	,<и Ьн. я ю св о <  1	ф	L_(	ч	С—।
Колонка	Смесь силикагеля и хай- фло-сюперселя (2 : 4) Оксид алюминия, брок- ман III 30 % AgNO3 на оксиде алюминия 25 % AgNO3 на силика- геле  Липидекс Сефадекс LH-20  Целит 545
Разделяемые материалы	. < < св	2	Св	S	®  Г)	О	Я	и  _	®	а4	сч	2  л	°	О	О	сч «  §	и	§	И	о	и  |	§	л	I	k	s	и  8	о.	5	§	"	6	5  2	я	2	к	сч	со  £	3	св	3	я	о  я	3	3	3	&	3	я	о  5	во	§	S	§	у	t	П  *	&	g &	1	§	о	а	&  о	Ок	О 8 О к X	s Я о
Год	со	со	ю	со	О  о	&>	сп	о	о  w-H	»—<	—<
Автор	S	&	®  „	о	К	®	Я	в	О’	.  о	°	а	5	о.	я	SL  оо,	я	8	& ’й «  •	1	И*	g	ф Ж  к	о г—-1	г—।	е* >  ।	. .	я it  Св	КО	K N	н	oo	S	схд  Сц	О СО	О о	Св <	св	о  в	X £1 С SL	иэз

4Д.6. ТОНКОСЛОЙНАЯ ХРОМАТОГРАФИЯ

Проблемы разделения и обнаружения

Тонкослойная хроматография является очень важным мето-
дом идентификации стеринов, их разделения, а также отделе-
ния от других веществ с целью последующего анализа.

Поскольку стерины составляют наименее полярный и наи-
более липофильный класс стероидов, то их сравнительно легко
отделить от стероидов других классов и от липидов. В лите-
ратуре описано множество пригодных для этих целей систем.
Более трудную задачу представляет их отделение от любых
других близких по структуре стеринов. Хроматография на си-
ликагеле, являющемся очень эффективным адсорбентом для
решения упомянутых выше задач, а также для разделения сте-
роидов других классов, обеспечивает лишь очень низкую эф-
фективность разделения стеринов. Решению этой задачи посвя-
щено большое число работ. Наиболее полные в этой области
обзоры составлены Нейером [194, 195] и Хефтманном [104].
Объем данной книги позволяет лишь кратко осветить основные
тенденции и результаты.

Как уже упоминалось, чистый силикагель не является до-
статочно подходящим адсорбентом для решения большого
числа задач. Результаты можно значительно улучшить, если
для разделения стеринов с разной степенью ненасыщенности
и различным положением двойных связей применять силика-
гель, обработанный нитратом серебра (обычно 5—15%) [11,
51, 58, 122, 147, 189, 231]. В основе этого метода лежит образо-
вание л-комплексов между ионами серебра(I) и двойными
связями. При разделении стеринов подходящим носителем для
нитрата серебра служит также оксид алюминия [135].

Для разделения эпимерных пар стеринов более эффективна
хроматография с использованием других адсорбентов, особенно
оксида магния [136] или смеси его с силикагелем (аназил В)
[23, 147]. Это иллюстрируется табл. 4.2, составленной на осно-
вании данных Найтса [147]. В этой таблице наряду с данными,
свидетельствующими о плохом разделении отдельно на сили-
кагеле и оксиде алюминия, приведены данные, иллюстрирую-
щие хорошее разделение ненасыщенных стеринов на силика-
геле, содержащем нитрат серебра. Здесь же можно видеть, что
на аназиле В можно удовлетворительно разделить такие «труд-
ные пары» стеринов, как кампестерин и 5-эргостенол, различаю-
щихся только конфигурацией 24-метильных групп.

Другой способ улучшения разделения заключается в приме-
нении распределительных хроматографических систем, содер-
Таблица 4.2. Разделение ацетатов стеринов методом тонкослойной
хроматографии а [147]

Исходный стерин	Силикагель	20 % AgNO3 на силикагеле	Оксид алю- миния	Аназил В (SiO2+MgO)
Холестерин	1,00	1,00	1,00	1,00
Холестанол	1,02	1,26	1,02	—
Кампестерин	1,04	1,06	1,03	1,21
5-Эргостенол	1,00	1,06	1,01	1,12
Ситостерин	1,10	1,06	1,03	1,17
7 -Дегидрохолестерин	0,80	0,10	0,71	0,78
Брассикастерин	1,10	0,56	0,91	1,03
Стигмастерин	1,10	0,81	0,88	0,90
Эргостерин	0,84	0,05	0,58	0,61

а Система растворителей: 1 %-ный раствор диэтилового эфира в петролейном эфире.
Величины отнесены к ацетату холестерина.

жащих силикагель или кизельгур, пропитанных парафином или
низшими углеводородами, в сочетании с различными подвиж-
ными фазами [57, 58, 62]. В последние годы эти системы, по-
видимому, несколько утратили свое значение. Следует заме-
тить, что подобного рода разделения протекают значительно
легче, если в качестве адсорбента использовать силанизирован-
ный силикагель [289].

Что касается проведения химических реакций перед хрома-
тографическим разделением стеринов, то, по-видимому, следует
считать, что этерификация 3-оксигруппы с образованием аце-
татов, бензоатов и т. д. приводит к улучшению разделения.
Бромирование [41, 58] или эпоксидирование [13] двойных свя-
зей в ядрах стероидов позволяет разделить насыщенные и не-
насыщенные стерины.

Для проявления пятен стеринов на хроматограммах предло-
жено большое число реагентов. Наиболее часто используются
растворы серной кислоты и хлорида сурьмы(III), но в моно-
графиях [170, 194, 195] рекомендуются и детально обсужда-
ются также другие реагенты: пары иода, сульфохром, фосфор-
ная кислота, /г-толуолсульфокислота, хлорсульфоновая кислота,
реагент Либермана—Бурхарда, хлорная кислота—нафтохинон,
анисовый альдегид—серная кислота, хлорид сурьмы (V), хлорид
цинка, хлорид железа (III)—серная кислота, флуоресцеин
и т. д. В соответствии с последними достижениями имеет смысл
упомянуть, что воспроизводимость окраски, возникающей в при-
сутствии хлорида железа (III), можно улучшить включая его
в слой силикагеля и опрыскивая хроматограмму серной кис-
лотой [253]. Есть сообщения об использовании смеси оксида ва-
надия (V) с серной кислотой [175], различных красителей типа
малахитового зеленого [274], альцианового синего и толуиди-
нового синего [282].

Количественный анализ

Очень часто тонкослойная хроматография применяется для
количественного разделения и очистки стеринов, которые затем
элюируют и анализируют подходящим методом, например с по-
мощью колориметрии [8, 69, 152, 155, 157, 177, 209] или газовой
хроматографии [146]. По этому вопросу опубликовано много
статей, большая часть которых цитируется в монографиях, упо-
мянутых в начале настоящей главы.

Часто, главным образом при анализе липидов, денситомет-
рическую оценку содержания стеринов проводят непосредст-
венно в пятнах на тонкослойной хроматограмме. В некоторых
случаях достаточно полуколичественного визуального сравнения
пятен образца и стандарта [37]. Типичным примером количе-
ственного денситометрического метода является методика Вик-
лунда и Элиассона [295]. Холестерин и его эфиры отделяют
от других липидов методом тонкослойной хроматографии на
силикагеле G, а пластинку обрабатывают смесью диэтилового
эфира и уксусной кислоты (99:1), затем смесью гексана, ди-
этилового эфира и уксусной кислоты (85:15:1). Пятна опры-
скивают 70 %-ной серной кислотой, насыщенной бихроматом
калия, нагревая при 180°С в течение 25 мин. Денситограмма
полученной таким образом хроматограммы приведена на
рис. 4.1. Содержание индивидуальных липидов находят по пло-
щадям соответствующих пиков.

Кастеллани и сотр. [47] разделяли хроматографически ли-
пидную фракцию на слое, приготовленном из смеси 30 г кизель-
гура Н и 9 г сульфата аммония. После трехкратного элюиро-
вания [гексаном, бензолом и, наконец, смесью гексана, диэти-
лового эфира и уксусной кислоты (70:30: 1)] пятна проявляют
просто нагреванием без опрыскивания и получают вопроизво-
димые пятна, пригодные для последующей денситометрии.

В методе, разработанном Фельдманом и Фосслайном [83],
разделение осуществляют на силикагеле смесью петролейного
эфира, диэтилового эфира и уксусной кислоты (90: 10:1). Об-
наруживающим агентом служит 410 %-ный раствор молибдо-
фосфорной кислоты в 95 °/о-ном этаноле, затем хроматограмму
холестерина, его эфиров и других липидов сканируют, измеряя
отражение при 750 нм. Аналогичная методика описана в ра-
боте Петера и Рейнольдса [223].
Денситометрию сывороточных липидов после опрыскивания
хлоридом сурьмы(У) описали Нушель и Оке [149]. Кроме
того, описаны денситометрические методы определения нано-
граммовых количеств холестерина, например метод Тоучстона
и сотр. [279], основанный на использовании раствора ацетата
меди (И) в фосфорной кислоте в качестве обнаруживающего

Рис. 4Л. Денситограмма пятен на тонкослойной хроматограмме смеси липидов
(подробное обсуждение хроматографирования см? в тексте) [295].

S — старт: 1 — монопальмитин; 2 — холестерин; 3—1,2-дипальмитин; 4 —
1,3-дипальмитИн; 5 — пальмитиновая кислота; 6 — трипальмитин; 7 — метило-
вый эфир гептадекановой кислоты (внутренний стандарт); 8 — пальмитат
холестерина.

агента и прямого денситометрического измерения при 600 нм,
а также метод Винтерштайгера и Гюбитца [297], в котором
хроматограмму погружают в раствор реагента, состоящего из
натриевой соли 1,2-нафтохинон-4-сульфокислоты и хлорной кис-
лоты, и сканируют при 620 нм.

Прямое денситометрическое определение стеринов без опры-
скивания возможно только в случае их УФ-активных производ-
ных, поглощающих в УФ-области. Например, Кройциг [153]
описал определение эргостерина в мицелии плесневого гриба
после омыления и экстракционного отделения неомыленных
компонентов. Количественное определение эргостерина прово-
дилось по поглощению при 282 нм.

Часто используют также флуориметрическую оценку хрома-
тограммы. Николози и др. [199] использовали родамин 6G
в качестве обнаруживающего агента и сканировали хромато-
грамму по флуоресценции пятен липидов после разделения на
силикагеле в смеси растворителей диэтиловый эфир—уксусная
кислота—петролейный эфир (20 : 2 : 78) и хлороформ—мета-
нол—уксусная кислота—вода (65 : 20 : 6 : 4).

Млекуш и сотрудники измеряли флуоресценцию стеринов и
других липидов после опрыскивания серной кислотой [183]
или разделения в слое силикагель—сульфат аммония [182].

Липиды плазмы, включая свободный и этерифицированный
холестерин, были разделены Вандаммом и сотр. [283] на сили-
кагеле смесью петролейного и диэтилового эфиров (85: 15). Ко-
личественную оценку проводили с помощью пламенно-иониза-
ционного детектора.

4.2.7.	ГАЗОВАЯ ХРОМАТОГРАФИЯ

Впервые о применении газовой хроматографии для разде-
ления стеринов сообщалось в статье Ван-ден-Хойвеля и др.
[285]. Это была одна из первых публикаций, посвященных при-
менению этого метода в анализе стероидов. С тех пор по этому
вопросу опубликовано несколько сотен статей, и теперь можно
считать, что газовая хроматография является несомненно наи-
более важным хроматографическим методом количественного
анализа стеринов. Причины этого таковы:

а)	стерины — сравнительно устойчивые соединения даже
при повышенных температурах, и поэтому их можно легко хро-
матографировать и в исходном виде, и в виде производных;

б)	разрешающая способность газового хроматографа доста-
точна для разделения даже близких по структуре стеринов и
их эпимерных пар (за исключением некоторых «трудных»
пар);

в)	большинство анализируемых образцов обычно содержит
достаточные количества стеринов, так что чувствительность
газовой хроматографии (даже при использовании только пла-
менно-ионизационного детектора) позволяет получить надеж-
ные результаты количественных определений;

г)	перед выполнением анализа методом газовой хромато-
графии не требуется проводить трудоемкие операции разделе-
ния и очистки.

Прежде чем дать описание наиболее важных результатов,
содержащихся в огромном числе публикаций, обратим внима-
ние читателей на два отличных обзора в этой области, напи-
санных Найтсом [146] и Хефтманном [104], охватывающих ли-
тературу до 1972 и 1974 гг. соответственно. Особого упомина-
ния среди многочисленных обзорных статей, появившихся позд-
нее, заслуживают работы Куксиса [158] и Хомберга [Ш].

Дериватизация

Дериватизация стеринов не представляет таких серьезных
трудностей, как в анализе стероидов некоторых других клас-
сов. Большинство стеринов, обладающих 5-ен-Зр-оксигруппи-
ровкой, достаточно устойчиво, и их можно хроматографировать
без дериватизации. Образование 3,5-диенов в качестве продук-

тов разложения наблюдается только в случае, если при хро-
матографировании создаются чрезвычайно неблагоприятные

условия (слишком высокая темпе-
ратура, металлический испаритель
и т. д.) *.

Несмотря на это, по меньшей
мере в половине статей, посвящен-
ных анализу стеринов методом га-
зовой хроматографии, сообщается
об использовании дериватизирован-
ных стеринов. Необходимость дери-
ватизации объясняется главным
образом тем, что форма пиков
стеринов на некоторых непод-
вижных фазах неудовлетворитель-
на: наблюдается образование хво-
стов, что делает ненадежными ре-
зультаты количественного анализа.

Рис. 4.2. Газовая хроматограмма стерино-
вой фракции из побочного продукта мыло-
варенной промышленности [163].

Стеклянная колонка размером 1,8 мХ2 мм,
заполненная 3 % OV-101 на газохроме Q
(120/140 меш); температура 280°С.

/ — холестерин (внутренний стандарт); 2 —
брассикастерин; 3— кампестерин; 4 — стиг-
мастерин; 5 — [3-ситостерин.

(Статьи, содержащие характеристики удерживания различных
стеринов на неподвижных фазах, могут ввести в заблуждение
относительно возможности количественного анализа, так как
обычно в них не упоминается о форме пиков индивидуальных
стеринов). Важным шагом вперед послужило открытие Грюн-
вальда [97, 98], который установил, что образование хвостов
у пиков стеринов сильно уменьшается, если вместо широко рас-
пространенных полиметилсилоксанов (OV-1, SE-30 и т. д.)
применять метилсилоксановое масло OV-101. Эти наблюдения
были подтверждены автором при изучении неомыленных фрак-
ций различных жиров и пищевых масел [163] (рис. 4.2).

* Описан также метод пиролитической газовой хроматографии, дающий
те же самые главные продукты пиролиза [95].
Термоустойчивая PZ-176 [16] и недавно разработанная
С87"углеводородная неподвижные фазы также успешно приме-
няли для разделения стеринов [17].

Другой областью эффективного применения прямого газо-
вого хроматографического анализа является разделение различ-
ных эфиров холестерина [174, 271, 272]. На рис. 4.3, взятом

Рис. 4.3. Газовая хроматограмма смеси эфиров холестерина и родственных
соединений [174].

Стеклянная колонка размером ПО смХ4 мм, заполненная 3% SP-2250 на
супелькопорте, температура инжектора 290°С, колонки 240°С, изотермический
режим 10 мин, затем программированный подъем температуры со скоростью
4°С/мин до 335°С, пламенно-ионизационный детектор.

1 — 5а-холестан; 2— 3,5-холестадиен; 3— метиловый эфир холестерина; 4 —
холестерин; 5 — формиат холестерина; 6 — ацетат холестерина; 7—миристат
холестерина; 8 — пальмитат холестерина; 9 — гептадеканоат холестерина;
10 — линолеат и олеат холестерина.

из работы [174], показаны результаты анализа с программи-
рованием температуры семи эфиров и трех других производных
холестерина.

Чаще всего стерины превращают в триметилсилиловые
эфиры. Экваториальная вторичная 30-оксигруппа стеринов спо-
собна количественно реагировать со стандартными силилирую-
щими агентами с образованием триметилсилильных производ-
ных даже в относительно мягких условиях. Так, например,
Куксис и др. [160] растворяют пробу непосредственно в смеси
гексаметилдисилазан—триметилхлорсилан—пиридин (12:5:2)
и вводят раствор в газовый хроматограф без нагревания. В ка-
честве силилирующего агента Розански [249] использовал
смесь тетрагидрофуран—гексаметилдисилазан—триметилхлор-
силан (100:50:1 ), причем реакция протекала при 55°С
в течение 40 мин. Очевидно, можно использовать и более силь-
ный силилирующий агент.

Из других силильных производных полученные Келли и Тей-
лором [137] трет-бутилдиметилсилиловые эфиры более устой-
чивы к гидролизу, и, кроме того, их можно идентифицировать
масс-спектрометрически [100а]. Морган и Пул [187] предло-
жили производные фторзамещенных простых силиловых эфи-
ров, из которых наиболее подходящим для газохроматографи-
ческого анализа стеринов оказался пентафторфенилдиметилси-
лиловый эфир [188]. Это соединение не только отличается вы-
сокой термической устойчивостью и летучестью, но и позволяет
использовать детектор электронного захвата и поэтому при-
годно для определения нанограммовых количеств стеринов,
а в случае ди- или триоксистеринов — даже субнанограммовых
количеств. Для тех же целей применяли галогенметилдиметил-
силильные производные [70, 275]. Вообще, однако, надо сказать,
что случаи, требующие применения детектора электронного за-
хвата, в анализе стеринов встречаются сравнительно редко.
В качестве производных для анализа стеринов рекомендуются
не только силиловые эфиры, но и 3-метиловые эфиры [84, 121].

В анализе стеринов методом газовой хроматографии слож-
ные эфиры стеринов играют менее важную роль. Наиболее
часто получают ацетаты [94, 206, 216]. Применение галоген-
ацетатов, как, например, монохлорацетата [162], хлордифтор-
ацетата [226], трифторацетата [249, 284] или гептафторбути-
рата [228], позволяет проводить чувствительное обнаружение
с помощью детектора электронного захвата, но их термическая
устойчивость ниже, чем устойчивость исходных стеринов [228].

Сообщалось [72, 127], что 5-ен-З-оксистерины перед их газо-
хроматографическим анализом окисляют до соответствующих
4-ен-З-кетонов.

Разделение и количественную оценку производных, образуе-
мых холестерином с различными жирными кислотами, можно
провести путем переэтерификации в смеси метанол—бензол—
серная кислота с получением эфиров жирных кислот [141] или
омылением и последующим метилированием реагентом трифто-
рид бора—метанол [247]. Перед хроматографическим разделе-
нием эпоксидов стероидов их обрабатывают алюмогидридом
лития и образовавшуюся при этом оксигруппу превращают
в триметилсилильную [140а].

Проблемы разделения

Возможности разделения стеринов методом газовой хрома-
тографии показаны в табл. 4.3, где даны относительные вре-
мена удерживания наиболее важных стеринов и их некоторых

о
си

QF-1	ацетат и	ОЮООСЧОСЧСЧФОООСЧЮ ооооо404согоююо4гооо  т—Н т—Н	т—М т—Н	т—Н
	ТМС-эфир3	ООО—<О4ООООСОС©С0ООГ^'Ч*
	свободный ж	О	О	СО	К-	Г4*	К-	К-ОООЬ-  о	о	—	о	од	04	ОО | Ю Ю сч	ОО  т-Н	т—Ч	’“<	»“<
OV-17	ацетат е	О О 04 rf 05 —< ю	Ю	Ю  О О 04 — 04 ОО.	| СО |	| СО |
	ТМС-эфир д	0000040400^.00000  О О 04 —•ОООО’гГиООГ-ООООО  т—М	•—И т—М Т—Ч	»"< ’—И
	свободный1.	00004040000000'^'00 ОО—«—<ООООтРОООООООО  »—<	Т—Ч	•—<
SE-30	ацетат®	Ос0СТ>0404О04'Ч*00 00 С0Ь.'Ч*  ООО—<04 00'4ии0с0с004с000  т—.1 т—1 т—1 т—1 т—<	1 т—< »—<	»““< —и	—<
	ТМС-эфир	8 8 8 2 S а 8 Й 8 3 8.8 8
	свободный а	8	8	8	2	S	а	8	S	3	з	а	8	8  V—.	»—<	там	*—<	’“<	»"М	»"М	—и	’“<	—<	—<	—«  Q	О?	О	О	Ю	О?	Ф	,	Р	Р	О	0?	О  О	О	О	04	04	00	О	О	СО	Г-	00  *4^
Стерин		Холестерин Холестанол Десмостерин Брассикастерин Эргостерин Кампестерин Стигмастерин Ланостерин Ситостерин Фукостерин 24-Метиленхолестерин Стигмастанол Кампестанол

х

S

и S а 0)	
о	
ч	
о ~ Хем	сТ
	—м
	
и-	—>	см
	
О и	х	—  X 2	х
	X
	3
2 *	X	со
X 5  К? S	X X	я
й л	£	X
X о	£	X  о	а  z;	о)
3 §	О	г.  5	°
_ О	о	а)
X sz К *	X	ч  _	о
	а	х
8«  M’S	X •в*	а  СП	х
<Z)	*в*
»х	
	3	s=-  ю	-
Ю о	о £
JГ ч	ч	®
X	х 2
. ч	ч 5
%? Я	• X	s  c?q	ч
	LO ч .я
	X — Г со ч
X	я О S2 X
X §	х 2 —‘ £
Е§.	S ®	X S  е*	я х
О со	°
	
яр	хО S7 .
я 00 Лю	а© я о
0>СМ	(У см Я ио
	ь	асм
Т1	<и . а) см
	о со н
	-Д§О  ЧОе-Д
	
О	О.	1QE1
	
см	3£<2°со^
	
а	
С CL О о	а> х ^2 ф cd o§8ox£S
Л о	ал о &ч g О
Ч S в о Fa	х ч s х х х а о <и в о s 2 х со К о я О
Q х	2 о х и 3 ах
	я я X х х
X х	я==х=х£
о © О Ь- Г'-	1	.  со со со V 7 7 — V	
	
	
	

СОСО СО СО СО — —'со —
насыщенных аналогов, взятые из различных источников [112,
123, 206, 216, 259]. Надежность этих результатов подтвержда-
ется данными, приведенными в первом столбце (цифры в скоб-
ках), которые удовлетворительно согласуются с ранее получен-
ными данными, относящимися к той же неподвижной фазе, но

при других экспериментальных
условиях [123].

Как можно видеть, разделе-
ние большинства обычных стери-
нов лишь слабо улучшается за
счет образования силиловых эфи-
ров и ацетатов или при увеличе-
нии полярности неподвижной

Рис. 4.4. Газохроматографическое разде-
ление 5а/(3-холестан-За/Р-олов на нема-
тической жидкокристаллической фазе
[306].

Стеклянная колонка размером 120 смХ
Х4 мм, заполненная 5 % ^Лт/-бис(/г-ме-
тилоксибензилиден) -а,а'-ди-/г-толуидина
на хромосорбе WHP, температура ин-
жектора 225°С, колонки 250°С, скорость
потока гелия 70 мл/мин, пламенно-иони-
зационный детектор.

1 — 50-холестан-За-ол; 2 — 50-холестан-
30-ол; 3 — 5а-холестан-3а-ол; 4 — 5а-хо-
лестан-3|3-ол.

фазы. В более трудных случаях разделения, однако, необ-
ходимо получение производных и применение селективных фаз.
Д5-Производные и их насыщенные 5а- и 5р-аналоги обычно раз-
деляют на полярных неподвижных фазах (или на наиболее
полярных силоксановых или полиэфирных фазах). Эта же ме-
тодика пригодна для разделения других пар насыщенных и не-
насыщенных стеринов. Эпимерные пары стеринов (главным об-
разом За/Зр-пары) также разделяются на полярных фазах.
При дериватизации стерические эффекты усиливаются, и вслед-
ствие этого на неселективных фазах можно разделить в виде
производных многие критические пары. Описано [252] также
разделение гидроксилированных производных холестерина.

Детальное обсуждение отдельных задач ГХ-разделения вы-
ходит за рамки данной книги. Здесь мы дадим ссылки только
на некоторые наиболее важные статьи, посвященные этим во-
просам [15, 16, 52, 93, 94, 96, 98, 112, 112а, 123, 126, 126а, 142,
145, 206, 216, 285].

Чрезвычайно эффективное разделение достигается при ис-
пользовании в качестве неподвижной фазы нематических жид-
ких кристаллов. Это иллюстрируется рис. 4.4, данными по раз-
делению 5а/|3-холестан-3а/|3-олов, взятыми из работы Зилин-
ского и сотр. [306]. Хорошего разделения можно также до-
биться на капиллярных колонках [17, 71, 72, 205, 262, 278а,
287].

Количественный анализ

Если целью анализа является количественное определение
индивидуальных стеринов, обычно применяется внутренний
стандарт.

При анализе многокомпонентных смесей стеринов процент-
ное содержание индивидуального компонента часто рассчи-
тывают по площади его пика относительно общей площади
пиков. Этот способ, однако, можно рассматривать только как
грубое приближение, поскольку относительные отклики пла-
менно-ионизационного детектора для индивидуальных стеринов
значительно различаются, несмотря на их относительно близ-
кие структуры. В табл. 4.4 приведены относительные весовые

Таблица 4.4. Относительные весовые чувствительности (ОВЧ) ПИД
для различных стеринов и их триметилсилиловых эфиров
(относительно холестана)а [98]

Соединение	ОВЧ	
	свободный	триметилсилиловый эфир
Холестерин	0,837	1,077
Кампестерин	0,901	1,127
Стигмастерин	0,812	1,031
р-Ситостерин	0,671	0,880
а Температура колонки	225°С, скорость потока гелия	10 мл/мин.

чувствительности для четырех важных стеринов и их триметил-
силиловых эфиров, определенные Грюнвальдом [98]. Следует
заметить, что эти величины слегка зависят от температуры ко-
лонки и скорости потока. Аналогичные результаты получены
Розанским [249].

Разделение стеринов методом газовой хроматографии часто
заканчивается идентификацией или количественным определе-
нием с помощью масс-спектрометрии. Эти методы будут обсу-
ждаться в разд. 4.2.10.

4.2.8.	ВЫСОКОЭФФЕКТИВНАЯ ЖИДКОСТНАЯ ХРОМАТОГРАФИЯ

Как показано в предыдущем разделе, газовая хроматогра-
фия пригодна для решения почти всех задач, возникающих при
разделении и количественном анализе сложных смесей стери-
нов. В силу этого, а также по ряду некоторых других обсу-
ждаемых ниже причин для стеринов высокоэффективная жид-
костная хроматография (ВЭЖХ) является менее важным ме-
тодом, чем для стероидов других классов.

Главный недостаток ВЭЖХ применительно к анализу сте-
ринов обусловлен тем, что большинство стеринов обладает
только изолированной двойной связью (связями) и, следова-
тельно, плохо поглощают УФ-излучение, т. е. их можно обна-
ружить с достаточно хорошей чувствительностью лишь при
длинах волн менее 210 нм, что весьма сложно при хромато-
графировании образцов биологического происхождения. Эта
трудность устраняется при разделении стеринов в форме бен-
зоатов. В таком случае обнаружение с достаточно высокой чув-
ствительностью можно выполнить при 230 нм [87, 214], но при
этом ухудшается разрешение [241]. Егрен и сотр. [209а] опи-
сали послеколоночный ферментный реактор для превращения
холестерина и его производных в спектрофотометрически вы-
сокоактивные 4-ен-З-кетопроизводные. Описано также примене-
ние рефрактометрического детектора [241] и детектора с движу-
щейся лентой [46, 300], однако они слишком чувствительны, что
не очень удобно при решении многих практически важных задач.

Хотя возможности высокоэффективной жидкостной хрома-
тографии используются не так полно, как возможности газовой
хроматографии, на основании фундаментальной статьи Риса
и др. [241], шшводивших разделение на колонке с обращен-
ной фазой ц-бондапак Cis смесью метанол—хлороформ—вода
(71:16:13), можно заключить, что большинство важных сте-
ринов (холестерин, ситостерин, кампестерин, брассикастерин
и др.) можно разделить и в свободном виде, и в форме ацета-
тов. Хорошо разделяются и некоторые «трудные пары», напри-
мер 5а/р-холестанолы, тогда как другие разделить нельзя,
и в целом следует заключить, что применение ВЭЖХ с точки
зрения разделения не является шагом вперед по сравнению
с газовой хроматографией.

Тем не менее есть один момент, когда ВЭЖХ имеет опреде-
ленные преимущества по сравнению с газовой хроматографией.
При изучении сложных смесей стеринов разделенные с по-
мощью ВЭЖХ чистые компоненты гораздо легче затем иденти-
фицировать или изучать их структуру спектроскопическими ме-
тодами [241]. В качестве примера можно привести работу
Гюнтера и др. [120], успешно разделивших и выделивших хо-
лестерин. из 500-кратного избытка растительных стеринов,
и работу Ределя и Капиллона [240], разделивших трудную эпи-
мерную пару 25R- и 255-26-оксихолестеринов.

Интересно, что холестерин был одним из первых веществ,
проанализированных непосредственно комбинированным мето-
дом ВЭЖХ и масс-спектрометрии [258].
В качестве замечательного примера применения ВЭЖХ
в анализе липидов [3] можно привести работу Картера и сотр.
[46], использовавших колонку с силикагелем для отделения
холестерина и его эфиров от других сывороточных липидов,
и работу Кэррола и Руделя [45а], применивших для тех же це-
лей колонку с обращенной фазой зорбакс ODS.

Колин и др. [54] сообщили об успешном использовании
ВЭЖХ для разделения стеринов растительного происхождения.
Их работа заслуживает особого упоминания, поскольку пред-
ставляет собой первый случай использования колонки с пиро-
графитом в анализе стеринов (элюент хлороформ—метанол
в соотношении 3:2). Дункан и др. [68] определяли свободный
и общий сывороточный холестерин методом ВЭЖХ на колонке
с неподвижной фазой ц-бондапак Cis при элюировании смесью
2-пропанол—ацетонитрил—вода (6:3: 1). Содержание свобод-
ного и общего холестерина находили по площади пика холесте-
рина до и после омыления.

ВЭЖХ оказалась пригодной для изучения промежуточных
продуктов биосинтеза холестерина. Хорошее разделение на-
блюдали на колонках с силикагелем [101а, 276] или ц-бонда-
паком Cis при элюировании безводным ацетонитрилом [101]
или смесью ацетонитрил—вода (88: 12) [101а].

Методом ВЭЖХ с необращенными фазами можно опреде-
лить 7-дегидрохолестерин в коже крысы [301]. Таллова и Хакл
[272а] определяли холестенон в экстрактах надпочечников
крыс, используя систему с обращенными фазами.

Представляет интерес применение ВЭЖХ в анализе продук-
тов автоокисления холестерина [9, 281], поскольку недостаточ-
ная устойчивость образующихся гидропероксидов и эпоксидов
не позволяет использовать газовую хроматографию.

4.2.9.	ФЕРМЕНТАТИВНЫЕ МЕТОДЫ

Общие положения

В 1973 г. Флегг [88] и в 1974 г. Ричмонд [242] и Рёшлау
с сотр. [250] опубликовали статьи, посвященные определению
холестерина в сыворотке, включающему ферментативное окис-
ление холестерина и колориметрическое определение образую-
щегося пероксида водорода. Этот принцип быстро приобрел по-
пулярность; так, за последние 5 лет он был описан примерно
в 50 работах, и различные варианты оригинального метода
теперь стали стандартными при выполнении клинических ана-
лизов. Столь быстрому развитию метода способствовали сле-
дующие причины:

20 Заказ № 182
1)	В различных вариантах этого метода, обсуждаемых
ниже, участвуют по крайней мере один, а в некоторых случаях
два или даже три фермента. Высокая специфичность фермен-
тативных реакций обусловливает очень высокую специфичность
метода.

2)	Высокая специфичность метода позволяет не прибегать
к длительным стадиям разделения, необходимым при проведе-
нии анализа менее специфичными методами.

3)	Холестерин определяют косвенным методом по содер-
жанию пероксида водорода, который с аналитической точки
зрения является гораздо менее «трудным» соединением, чем
сам холестерин.

4)	Ни колориметрические, ни электрохимические варианты
этого метода не требуют агрессивных реагентов, часто необ-
ходимых при выполнении анализа химическими методами.

5)	Ни один из вариантов ферментативного метода не явля-
ется трудоемким и длительным и легко поддается автомати-
зации.

6)	Эти методы характеризуются высокой чувствительностью.
Все варианты ферментативного метода основаны на реакции:

холестерин

холестериноксидаза

Холестериноксидазу, используемую большинством исследо-
вателей, выделяют из Nocardia erythropolis (этот фермент вы-
пускает фирма «Boehringer» Mannheim, ФРГ). Отани и сотр.
[208] рекомендуют применять фермент, выделенный из Strepio-
myces. Нома и Накаяма [203] опубликовали результаты срав-
нительного изучения холестериноксидаз из двух упомянутых
и других источников. Изучено влияние pH, концентрации фер-
мента и субстрата, ионной силы, природы двухзарядных кати-
онов и различных поверхностно-активных веществ на актив-
ность фермента.

Смит и Брукс [35, 266] изучали специфичность фермента.
Они нашли, что скорости окисления стеринов, обладающих
Зр-оксигруппой, сопоставимы, тогда как реакционная способ-
ность других 5-ен-Зр-оксистероидов (ряда прегнана и особенно
.андростана) на порядок-другой ниже.

Если выполнение анализа начинают с ферментативного
окисления, определить можно, очевидно, только свободный хо-
лестерин. Для определения общего содержания холестерина
перед окислением необходимо провести гидролиз его эфиров.
Большинство исследователей проводят его с помощью холесте-
ринэстеразы.

эфиры холестерина+Н2О	кислоты (4.2)

Сообщается также и об использовании щелочного гидролиза
[161, 243]. Очень важно и на стадии омыления, и на стадии
окисления добавлять подходящее поверхностно-активное веще-
ство (тритон Х-100, оксиполиэтоксидодекан, холат натрия),
чтобы разрушить комплексы с сывороточными липопротеинами
и удержать холестерин в мицеллярном растворе.

Количественное определение во всех случаях основано на
образовании пероксида водорода. Описаны две основные ме-
тодики — колориметрическая и электроаналитическая.

Колориметрические методы

В основе наиболее распространенных колориметрических ме-
тодик лежит реакция между пероксидом водорода, фенолом и
4-аминоантипирином, приводящая в присутствии пероксидазы
к образованию хинониминового красителя, поглощение которого
можно измерить при 500—520 нм [6, 19, 42, 53, 73, 108, 167,
208, 221, 222, 238, 246, 273, 293, 298, 309]. Эти методики
чрезвычайно просты. Хотя последовательно протекает фермента-
тивный гидролиз, окисление и образование красителя, все три
реакции проводят в одном реакционном сосуде одновременно
и все необходимые ферменты и химические вещества смеши-
вают в процессе приготовления реагента. Например, метод
определения общего содержания холестерина в сыворотке
(Отани и др. [208]) основан на инкубировании -в течение
30 мин при 37°С 25 мкл сыворотки с 2,5 мл реагента, содер-
жащего 0,82 мМ 4-аминоантипирина, 14 мМ фенола, 20 мМ хо-
лата натрия, 100 мМ фосфатного буферного раствора (pH 6,8),
400 ME холестеринэстеразы, 37 ME холестериноксидазы и
1900 ME пероксидазы. Поглощение измеряют при 500 нм от-
носительно раствора реагента. Аналогичным образом опреде-
ляют содержание свободного холестерина, но при этом исполь-
зуют 100 мкл сыворотки и реагент, не содержащий холесте-
ринэстеразы. Методики, описанные в других статьях, имеют
много общего, главное различие между ними заключается
в способе и степени автоматизации *.

Другой колориметрический метод, впервые описанный
Рёшлау и др. [250], также основан на автоокислении холесте-
рина, катализируемом холестериноксидазой. В этом случае об-
разующийся пероксид водорода реагирует с метанолом в при-
сутствии каталазы с образованием формальдегида, который
затем подвергается циклизации Ганча с ацетилацетоном и ам-
миаком. Образующийся дигидродиацетиллутидин определяют,
измеряя поглощение при 405—415 нм.

каталаза	,Л

Н2О2 + СНзОН -----------► НСНО 4- 2 Н2О	<4’4)

3,5-диацетил-1, л-дигидролутидин

* Интересное применение этого метода описали Гобб и Сандерс [53].
Сывороточные липопротеины, связывающие холестерин, разделяют электро-
форезом на ацетилцеллюлозе. Образовавшийся слой прессуют со вторым
слоем, вымоченным в ферменте и подходящем реагенте. После нагревания
при 37°С в течение 30 мин проводят денситометрическое измерение исходного
слоя при 505 нм.
Если требуется определить общее содержание холестерина,
перед проведением анализа необходимо провести гидролиз
эфиров холестерина.

Преимущество этой методики состоит в том, что в отличие
от методики с образованием хинонимина выполнению опреде-
ления не мешает билирубин, о чем часто упоминается в лите-
ратуре, а недостаток — в медленном развитии окраски: в ориги-
нальной методике [250] указано, что продолжительность
реакции 1 ч. С целью облегчить применение автоматических ана-
лизаторов обсуждаемый метод был модифицирован и время ана-
лиза сокращено до нескольких минут [73, 148, 192, 202, 220,
245, 248, 268, 305].

В качестве типичного примера кратко рассмотрим методику
Ноббса и др. [202]. Реагент, применяемый в этом методе, со-
держит 550 мМ фосфатного буфера (pH 7,0), 1,6 мМ метанола,
19 мМ ацетилацетона, 6,4-105 ME каталазы, 130 ME холесте-
ринэстеразы, 80 ME холестериноксидазы и 0,1 % оксиполиэток-
сидодекана. Из смеси 0,1 мл плазмы и 0,2 мл воды отбирают
20 мкл пробы и вводят в реакцию с 500 мкл этого реагента
при 37 °C. Содержание общего холестерина рассчитывают по-
изменению поглощения при 405 нм в течение первых 7 мин
после начала реакции.

Статья Ричмонда [242], посвященная колориметрическому
измерению концентраций хелата титана(IV) с пероксидом во-
дорода и ксиленоловым оранжевым, была первым сообщением
о ферментативном определении холестерина, основанном на
измерении количества пероксида водорода, образовавшегося
в процессе ферментативного автоокисления. Хотя описан [243]
и автоматизированный вариант этого метода, он не получил та-
кого широкого распространения, как методы, обсуждавшиеся
ранее. Для ферментативного определения использовали также
реакцию комплексообразования с 2,2'-азинобис (3-этилбензо-
тиазолин-6-сульфокислотой) [299].

Метод Хэкеля и Перлика [99] основан на взаимодействии
пероксида водорода, образующегося в процессе ферментатив-
ного окисления холестерина, с этанолом с образованием аце-
тальдегида; он восстанавливает никотинамидадениндинуклео-
тидфосфат в присутствии альдегиддегидрогеназы, давая окра-
шенное соединение, поглощение которого можно измерить при
334—340 нм.

Наконец, стоит заметить, что ферментативное превращение
3-оксистеринов может привести к образованию 4-ен-З-кетопро-
изводных, сильно поглощающих при 240 нм. Этот принцип по-
ложен в основу определения активности ферментов [35, 266,
299].
Флуориметрические методы

При ферментативном определении холестерина флуориметри-
ческие методы играют гораздо менее важную роль, чем коло-
риметрические. В основе их также лежат реакции (4.1) и (4.2).
Метод Фрухарта и др. [91, 92] включает те же химические ста-
дии, что и обсуждавшийся выше метод Рёшлау и др. [250].
Образующийся дигидродиацетиллутидин определяют по флуо-
ресценции при 485 нм (возбуждение при 405 нм).

В методиках Хуанга и др. [115] и Хайдера и Бойетта [105]
пероксид водорода в присутствии пероксидазы окисляет гомо-
ванилиновую и п-оксифенилуксусную кислоту соответственно
с образованием флуоресцирующих соединений.

Как известно, пероксид водорода индуцирует хемилюми-
несценцию различных реагентов, что положено в основу метода
Ригина [244]. Пробу (100 мкл плазмы) пропускают через две
колонки, одна из которых содержит иммобилизованную холесте-
ринэстеразу, а другая — холестериноксидазу, и затем элюат из
второй колонки, содержащий пероксид водорода, смешивают
с люминесцентным реагентом, содержащим бис (3,4,6-трихлор-
фенил) оксалат, 9,10-дифенилантрацен и триметиламин в ди-
оксане.

Электроаналитические методы

Электрохимические варианты метода ферментативного опре-
деления холестерина также основаны на реакциях (4.1) и (4.2),
и в них измеряют либо увеличение концентрации пероксида во-
дорода, либо уменьшение парциального давления кислорода за
счет потребления его в реакции (4.1).

Впервые эта возможность была использована Папастафо-
пулосом и Рехнитцем [211]. В разработанном ими методе обра-
зующийся пероксид водорода обрабатывали иодид-ионами
[в присутствии катализатора Mo(VI)]:

Moot"

Н2О2 + 21- + 2Н+ -12 + Н2о	(4.6)

Уменьшение концентрации иодид-иона, измеренное с по-
мощью иодид-селективного мембранного электрода, прямо про-
порционально концентрации пероксида водорода и, следова-
тельно, холестерина. Калибровочный график линеен до кон-
центрации холестерина примерно 5 г/л. Воспроизводимость
результатов сравнима с воспроизводимостью данных колоримет-
рических методов, а измерения можно автоматизировать с по-
мощью системы автоанализатора, что делает метод пригодным
для серийных анализов образцов сыворотки.
Другой тип определений основан на измерениях расхода
кислорода в процессе реакции (4.1), проводимых амперомет-
рически с помощью кислородного электрода. Кислород, рас-
творенный в водном буферном растворе, взятом в качестве
растворителя при проведении ферментативной реакции, содер-
жится в избытке по сравнению со стехиометрическим количе-
ством кислорода, расходуемого в реакции (4.1). Поэтому кон-
центрация кислорода в ячейке в процессе измерения зависит
от его исходной концентрации, концентрации холестерина и ско-
рости ферментативной реакции при условии, что измерение
проводят в герметической ячейке, где исключен контакт атмо-
сферного кислорода с раствором. Если эти условия выполня-
ются, изменение концентрации кислорода в процессе реакции
происходит прямо пропорционально концентрации холестерина.

Концентрацию кислорода можно определить с помощью кис-
лородного электрода Кларка [24, 50]. Он представляет собой
мембранный электрод, состоящий из поляризуемого при —0,6 В
платинового катода и Ag/AgCl-электрода сравнения; ячейку
заполняют водным раствором хлорида калия (рН>7) и отде-
ляют проницаемой для кислорода мембраной. При восстанов-
лении кислорода на катоде за счет деполяризации последнего
происходит изменение тока пропорционально изменению пар-
циального давления (концентрации) кислорода.

Все исследователи, применявшие этот принцип для опреде-
ления холестерина [24, 33, 161, 203, 204], использовали анали-
затор * на глюкозу фирмы «Бекман» (таким же способом, но
с другим ферментом можно определять глюкозу). Это позволяет
одновременно записывать ток восстановления кислорода и
кривую скорости расхода кислорода. На рис. 4.5 показаны та-
кие кривые, взятые из статьи Номы и Накаямы [204], кото-
рые получили их следующим образом. В реакционную ячейку
(вместимостью приблизительно 1 мл) помещают водный рас-
твор, содержащий 0,6 М фосфатный буфер (pH 7,0), 10 мг/л
азида натрия и 10 мл/л тритона Х-100. При проведении экспе-
римента раствор непрерывно перемешивают. Добавляют 30 мкл
холестериноксидазы (20 МЕ/мл), регистратор прибора устанав-
ливают в соответствующее положение и затем добавляют
10 мкл сыворотки. После того как ток вновь достигнет постоян-
ного значения, прибавляют 20 мкл холестеринэстеразы
(20 МЕ/мл) и, наконец, вводят 10 мкл стандартного раствора
холестерина. Вся процедура занимает не более 6 мин, чувст-
вительность, правильность и воспроизводимость при этом хо-
рошие.

* Сато и др. [254] в качестве мембраны, прикрепленной к кислородному
электроду, использовали иммобилизованный фермент.
Для количественного анализа пригодны как кривая тока

восстановления кислорода, так и кривая скорости расхода кис-

лорода. Первую из них рекомендуют использовать Нома и На-

рве. 4.5. Ферментативно-ампе-
рометрическое определение сво-
бодного и этерифицированного
холестерина в сыворотке [204].

1 — кривая зависимости тока
кислорода от времени; 2—
кривая изменения скорости;
F — свободный сывороточный
холестерин; Е — этерифициро-
ванный сывороточный холесте-
рин; S — стандартный образец
холестерина.

каяма [204], а также Камено и др.
[134], вторую — изготовители при-
бора [21].

Азид натрия, сильный ингибитор
каталазы, вводят в реакционную
смесь, потому что каталаза может
присутствовать в качестве примеси.
Каталаза способна разлагать перо-
ксид водорода на воду и кислород,
так что наблюдаемый расход кисло-
рода был бы заниженным.

Третий вариант электрохимиче-
ского метода ферментативного оп-
ределения холестерина основан на
амперометрическом определении пе-
роксида водорода, образующегося
в процессе ферментативного окисле-
ния. Этот принцип положен в ос-
нову метода, разработанного Хуан-
гом и сотр. [116], которые предло-
жили «холестериновый электрод»
с иммобилизованным ферментом.
Пероксид водорода восстанавлива-
ется на платиновом электроде при
+ 0,6 В относительно насыщенного
каломельного электрода. Холесте-

риноксидазу одну или вместе с хо-
лестеринэстеразой иммобилизуют на
поверхности вращающейся пори-
стой ячейки из стекла, содержащего
остатки алкиламина, модифициро-
ванные глутаровым альдегидом.
Перемешивание осуществляется
с помощью магнитной мешалки со

скоростью 1080 об/мин. Для определения холестерина можно
использовать и кинетический метод, и метод, основанный на из-
мерении изменения общего тока. Для достижения устойчивого
тока после добавления образца сыворотки (15 мкл) требуется
около 10 мин. Если определяют свободный холестерин, и общее
содержание холестерина, мешалка содержит в иммобилизован-

ном виде только холестериноксидазу, а холестеринэстеразу до-
бавляют в раствор в ячейке на второй стадии, как описано
выше. Большим преимуществом этого метода является то, что
иммобилизованные ферменты очень устойчивы (в течение 1—
2 мес при хранении в холодильнике) и с одним образцом фер-
мента можно выполнить несколько сотен анализов. Это позво-
ляет в клинической практике проводить чрезвычайно дешевые
анализы, и в ближайшем будущем следует ожидать быстрого
развития метода [239].

Измерительная ячейка другого типа с использованием ана-
логичного принципа была сконструирована Ханом и Олсоном
[100]. В разработанной ими методике гексацианоферрат(П)
калия окисляется образующимся в процессе ферментативного
окисления холестерина пероксидом водорода. Метод основан
на амперометрическом определении образующегося гексациано-
феррата (III) калия с помощью цилиндрического графитового
электрода.

В заключение раздела, посвященного ферментативному оп-
ределению холестерина, важно упомянуть несколько работ,
в которых проводится сравнение результатов этого метода
с данными других методов [42, 60, 86, 90, 151, 246].

4.2.10.	МАСС-СПЕКТРОМЕТРИЯ И РОДСТВЕННЫЕ МЕТОДЫ

В монографиях, упоминавшихся в разд. 2.2.15, содержатся
обширные сведения по масс-спектрометрии стеринов.

Газовая хроматография в сочетании с масс-спектрометрией
является ценнейшим методом быстрой идентификации стери-
нов в сложных смесях. Стерины обычно предварительно пре-
вращают в триметилсилиловые эфиры, пригодные для газовой
хроматографии и масс-спектрометрии [15, 34, 205]. Для тех же
целей описано получение высших алкилсилиловых [100а, 237]
и фторфенилдиметилсилиловых [229] эфиров.

Хотя наиболее часто ионизацию осуществляют пучком элек-
тронов, есть сообщения и об использовании химической иони-
зации [81, 93, 191].

Что касается новейшей техники в масс-спектрометрии, то
при анализе стеринов в биологических образцах возрастает роль
масс-спектрометрии фрагментов (фрагментография). С помощью
этого метода Сейяма и др. [260] определяли холестерин и хо-
лестанол в плазме с холестаном в качестве внутреннего стан-
дарта. Еще большей специфичностью обладают методы, в ко-
торых в качестве внутреннего стандарта применяют меченые
производные определяемых соединений. Например, Зикман
и др. [265] определяли холестерин в сыворотке, используя в ка-
честве внутреннего стандарта олеат холестерина, меченный 14С
в положении 4. Известное количество этого соединения вводят
в образец сыворотки, эфиры холестерина гидролизуют этаноль-
ным раствором гидроксида калия и холестерин экстрагируют
циклогексаном. После выпаривания досуха холестерин превра-
щают в триметилсилильное производное, смесь вводят в систему
газовый хроматограф—масс-спектрометр и хроматограммы од-
новременно сканируют при mje 458 и 460, соответствующих мо-
лекулярным ионам триметилсилильных производных немеченого
и [14С]-холестерина. По интенсивностям этих двух пиков и
количеству внутреннего стандарта можно рассчитать концен-
трацию холестерина в образце сыворотки.

По методике Гамберта и сотр. [93], разделение компонен-
тов гидролизованной сыворотки проводилось с помощью капил-
лярной газовой хроматографии после силилирования. Внутрен-
ним стандартом при масс-спектрометрии фрагментов с химиче-
ской ионизацией служил [3,4-13С] -холестерин, а в качестве
ионизирующего газа — метан. Для количественного определения
были выбраны ионы М-15.

Аналогичная методика описана Бъёркхемом и др. [26, 27],
которые хроматографировали свободный холестерин и рассчи-
тывали содержание сывороточного холестерина по отношению
сигналов при т/е 386 и 389, являющимися соответственно мо-
лекулярными массами холестерина и его тридейтерированного
производного. В методе, разработанном Тома и др. [277],
в качестве внутренних стандартов применяли дейтерированные
холестанолы.

Благодаря высокой разрешающей способности газовой хро-
матографии и высокой селективности масс-спектрометрии со-
четание их представляет несомненно наиболее специфичный ме-
тод определения стеринов в биологических образцах и поэтому
является идеальным эталонным методом. В то же время бла-
годаря высокой чувствительности масс-спектрометрического
детектирования эти методы также обладают чрезвычайно высо-
кой чувствительностью и позволяют анализировать образцы
сыворотки объемом до 0,5 мкл.

4.2.11.	ДРУГИЕ МЕТОДЫ

Наличие А5-двойной связи у холестерина и других стеринов
позволяет использовать титриметрические методы. Шварц и
Троянек [257] проводили реакцию между двойной связью и
избытком брома в смеси хлороформа (или дихлорэтана) и
уксусной кислоты и избыток реагента определяли обратным
йодометрическим титрованием. Прямое титрование бромом
в уксусной кислоте описано в статье Томичека и Долежала
[278], а также Перельмана и Гаврилина [219]. Тришлер и
Шивос [280] использовали в качестве титранта раствор Л^-бром-
сукцинимида в уксусной кислоте при титровании с двумя инди-
каторными электродами.
Основой количественного метода может также служить аце-
тилирование 3-оксигруппы смесью пиридин—уксусный ангид-
рид и титрование избытка реагента [224].

Стигмастерин в смеси стеринов можно селективно опреде-
лить по полосе поглощения А22-двойной связи в инфракрасной
области [128].

В отличие от стероидов других классов радиоизотопные ме-
тоды не играют заметной роли в анализе стеринов. Виикари
[290] описал прямое определение радиоактивного холестерина
в тканях. Определение микросомного холестерина описано Ни-
колау и др. [198]. После экстракции холестерин обрабатывали
меченным тритием уксусным ангидридом, удаляли избыток ре-
агента и ацетат холестерина отделяли с помощью тонкослой-
ной хроматографии на оксиде алюминия. После проявления
молибдофосфорной кислотой пятно удаляли и измеряли его
активность жидкостным сцинтилляционным счетчиком. Доинс
и др. [65] разработали метод изотопного разбавления для оп-
ределения стигмастерина.

Маречи и Скотт [178] на примере одновременного определе-
ния ацетата холестерина и 3|3-хлор-5-холестена показали при-
годность ЯМР-спектрометрии на ядрах 13С для количествен-
ного анализа стеринов.

Изучение холестерина с помощью дифференциальной кало-
риметрии впервые описали Джой и др. [130]. Д’Ачензо и др.
[59] успешно использовали этот метод для определения холе-
стерина в желчных камнях. Количество теплоты, поглощенной
при 37°С в процессе обратимого фазового перехода, служит
мерой количества холестерина, который можно определить
в течение 10 мин без предварительной обработки образца.

4.3.	ПРОБЛЕМЫ АНАЛИЗА СТЕРИНОВ

4.3.1.	ОПРЕДЕЛЕНИЕ ХОЛЕСТЕРИНА

В СЫВОРОТКЕ КРОВИ И ДРУГИХ БИОЛОГИЧЕСКИХ ОБРАЗЦАХ

Подавляющее число статей, посвященных анализу стеринов,
касается определения холестерина в биологических объектах,
главным образом в сыворотке крови *.

Работы, посвященные определению холестерина в сыворотке,
можно разделить на две группы:

а)	Цель анализа состоит главным образом в получении на-
дежных данных о содержании свободного и общего холестерина

* Использование холестерина в качестве стандарта часто затрудняет ана-
лиз сыворотки, поскольку он нерастворим в воде. Рекомендуется применять
водорастворимые производные, например гемисукцинат холестерина с мор-
фолином [143] или триэтаноламином [269], а также полиэтоксиэтаниладипат
холестерина [232].
в сыворотке крови. Необходимость знать содержание холесте-
рина в сыворотке для диагностики и лечения кардиосклероза
и других сердечно-сосудистых заболеваний привела к быстрому
увеличению числа анализов проб сыворотки в клинических ла-
бораториях. Поскольку такие определения проводятся в кли-
нических лабораториях ежедневно, хороший аналитический ме-
тод должен удовлетворять следующим требованиям:

давать правильные и воспроизводимые результаты и быть
пригодным для определения содержания свободного и этери-
фицированного холестерина;

быть быстрым и не очень трудоемким;

быть удобным для автоматизации;

обеспечивать выполнение анализа из минимального объема
сыворотки.

Сказанное выше означает, что методы, требующие длитель-
ных хроматографических разделений, для серийных анализов не
пригодны. В наиболее современных методах неудобна даже
стадия экстракции. Комбинированный метод, сочетающий газо-
вую хроматографию с масс-спектрометрией [26, 27, 225, 260,
265], который можно рассматривать как почти «абсолютный»,
в этом случае может служить лишь только контрольным
методом.

Что касается собственно метода газовой хроматографии,
то он был рекомендован для серийных клинических определе-
ний холестерина в различных биологических жидкостях [7, 66,
84, 124, 129, 173, 180]. Эти методы требуют экстракционного
разделения, трудоемки и поэтому не получили столь широкого
распространения, как колориметрические или ферментативные
методы. Газовая хроматография имеет наиболее важное зна-
чение как метод установления профиля концентраций липидов
сыворотки и др. (см. п. «б»).

Хотя многие варианты классических колориметрических ме-
тодов, описанные в разд. 4.2, не совсем удовлетворяют приве-
денным выше требованиям, до начала 1970 г. преобладали
именно эти методы, и их до сих пор еще применяют во многих
лабораториях. Даже в самых передовых лабораториях, где
приняты наиболее современные методы, в качестве контроль-
ных часто используют модифицированные методы Либермана—
Бурхарда и Златкиса и др. [308]. С этой точки зрения наибо-
лее важным представляется вариант метода Либермана—Бур-
харда, разработанный Абелем, как в оригинальном ручном
виде [1, 2], так и в автоматизированном [286].

При анализе классическими колориметрическими методами
сталкиваются с такими трудностями:

агрессивность реагентов;
влияние мешающих компонентов (билирубина и т. д.), ко-
торое можно устранить только с помощью длительных экстрак-
ционных разделений и проведения холостых опытов;

необходимость предварительного осаждения дигитонидов
перед раздельным определением свободного и общего холе-
стерина;

довольно большой объем сыворотки (100—500 мкл), требуе-
мый в большинстве случаев для единичного анализа.

Эти трудности устранимы при использовании колориметри-
ческих или (что даже лучше) электрохимических вариантов
ферментативного определения холестерина, детально разобран-
ных в разд. 4.2.9. Практически все эти методы полностью авто-
матизированы, и для проведения анализа требуется 1—50 мкл
сыворотки.

В ряде статей [18, 108, 110, 125, 169, 173, 176, 190] срав-
ниваются результаты определения холестерина ручными и авто-
матизированными колориметрическими, ферментативными и
газохроматографическими методами.

б)	Цель анализа состоит в получении данных о содержании
свободного и этерифицированного холестерина (и, возможно,
других стеринов), иногда о содержании индивидуальных эфи-
ров холестерина с различными жирными кислотами и очень ча-
сто о содержании нестероидных сывороточных липидов. Эти
задачи можно решить только с помощью хроматографических
методов.

В анализе липидов часто используют методы, сочетающие
хроматографическое разделение на колонке или в тонком слое
с последующим количественным определением (обычно колори-
метрическим). Большинство примеров, приведенных в разд. 4.2.5
и 4.2.6, относится к определению холестерина в сыворотке или
других липидах. Общим недостатком таких методов является
их трудоемкость, обусловленная продолжительностью стадий
разделения и количественного определения. Это относится к ме-
тодам тонкослойной хроматографии с денситометрическим и
флуориметрическим детектированием in situ [47, 83, 149, 155,
182, 183, 199, 223, 295], а значительно более высокая разре-
шающая способность газовой хроматографии и легкость коли-
чественного определения, без сомнения, позволяют ей быть
лучшим из хроматографических методов, пригодным для ре-
шения более сложных задач. Некоторые работы, цитируемые
в разд. 4.2.7, относятся к применению газовой хроматографии
в анализе сыворотки и других липидов. Высокая эффективность
этого метода иллюстрируется рис. 4.6, взятом из статьи Куксиса
и др. [160], где приведена хроматограмма образца сыворотки
после дефосфорилирования с помощью фосфолипазы, экстрак-
ции и триметилсилилирования. На хроматограмме кроме пиков
силиловых эфиров и эфиров жирных кислот и различных гли-
церидов можно найти пять четких пиков стеринов.

Из многочисленных статей по газохроматографическому оп-
ределению холестерина в других биологических образцах можно

Рис. 4.6. Газовая хроматограмма образца плазмы после дефосфорилирования,
экстракции и силилирования [160].

Стальная колонка размером 50 смХ2 мм, заполненная 3 % OV-1 на газохроме
Q, температура колонки 175°С, программированный подъем температуры со
скоростью 4°С/мин, пламенно-ионизационный детектор, 350°С, скорость по-
тока азота 80 мл/мин.

1 — триметилсилиловый эфир холестерина; 2 — триметилсилиловый эфир сито-
стерина; 5, 4, 5 — холестериновые эфиры жирных кислот Cie, С^, С20; внутрен-
ний стандарт — тридеканоилглицерин; пики до холестерина — триметилсили-
ловые эфиры жирных кислот и триметилсилиловые эфиры моноацилглицерина;
пики между внутренним стандартом и эфирами холестерина — триметилсили-
ловые эфиры диацилглицерина; пики после эфиров холестерина — триацилгли-
церины.

упомянуть его определение в тканях [114], фекалиях [96],
моче [25], слезах [251].

4.3.2.	ОПРЕДЕЛЕНИЕ ХОЛЕСТЕРИНА

В ИСХОДНОМ СЫРЬЕ ДЛЯ ЕГО ПОЛУЧЕНИЯ
(ШЕРСТЯНОЙ ВОСК, СПИННОЙ МОЗГ)

Из классических колориметрических методов для определе-
ния холестерина в шерстяном воске применяли методы Злат-
киса—Зака и Либермана—Бурхарда. Путней и Парута [236]
изучали первый способ. Согласно их методике, образец гидро-
лизуют 50 %-ным водным раствором гидроксида калия при
65°С в течение 3 ч. После нейтрализации холестерин осаждают
дигитонином в присутствии хлорида алюминия, причем другой
важный стериновый компонент шерстяного воска, ланостерин,
также реагирующий с реагентом Златкиса—Зака, в этих усло-
виях не осаждается. Поэтому после растворения дигитонида
в уксусной кислоте (6 мл) холестерин может быть определен
после прибавления 0,4 мл модифицированного реагента Злат-
киса—Зака (2,12 г РеС12-2МН4С1-Н2О в 100 мл 80 %-ной уксус-
ной кислоты, реагент устойчив по крайней мере 6 мес) и 4 мл
концентрированной серной кислоты. Через 10—25 мин регист-
рируют поглощение при 560 нм.

При определении холестерина в шерстяном воске по ме-
тоду Либермана—Бурхарда мешающее влияние ланостерина
можно либо устранить предварительным разделением с по-
мощью дигитонина, либо воспользоваться тем, что ланостерин не
мешает определению холестерина с помощью реагента Либер-
мана—Бурхарда при измерении поглощения в области 620—
630 нм [67, 172].

Из новейших методов определения холестерина в шерстяном
воске лучшим является газохроматографический способ (как
видно из табл. 4.3, разделение холестерина и ланостерина не
представляет проблем).

Анализ спинного мозга, другого важного источника холе-
стерина, можно проводить теми же методами, что и анализ
шерстяного воска. В этом случае ситуация намного проще, по-
тому что в отличие от шерстяного воска, где холестерин нахо-
дится главным образом в виде эфиров и ему сопутствуют дру-
гие стерины (ланостерин), в спинном мозге количества сопутст-
вующих стеринов и эфиров холестерина пренебрежимо малы
по сравнению с содержанием свободного холестерина.

4.3.3.	ОПРЕДЕЛЕНИЕ СТЕРИНОВ В РАСТЕНИЯХ

Важной задачей анализа растений является определение
стеринов в различных частях растений и в выделяемых из них
маслах. Поскольку объекты растительного происхождения со-
держат 5—10 главных и различное количество второстепенных
компонентов, надежный количественный анализ отдельных ком-
понентов и установление профиля концентраций стеринов в об-
разце возможны только путем хроматографического анализа
или по крайней мере после предварительного хроматографиче-
ского разделения.

Газовая хроматография представляется наиболее эффектив-
ным методом для этих целей. Качественный и количественный
газохроматографический анализ смесей стеринов, полученных
непосредственно из экстрактов растений или после их омыле-
ния, можно провести непосредственно или после превращения
в подходящие производные. Следует заметить также, что при
анализе наиболее сложных смесей разрешающей способности
одной газовой хроматографии недостаточно для разделения всех
компонентов и в таких случаях часто необходимо прибегать
к предварительному разделению методом тонкослойной или ко-
лоночной хроматографии. Детально эти вопросы обсуждаются
в разд. 4.2.5—4.2.7. Исчерпывающий обзор работ по данному
вопросу можно найти в монографии Хефтманна, в главе, на-
писанной Найтом [146], в которой наряду с обширной библи-
ографией из 222 названий содержатся практические указания
и подробное описание экспериментального определения стери-
нов более чем в 60 растительных образцах методом газожид-
костной хроматографии. Здесь же в качестве типичных при-
меров упомянем только две недавно опубликованные статьи,
посвященные определению содержания и строения стеринов и
их эфиров в маслах из подсолнечника и семян мака [1276],
а также в масле соевых бобов [127а].

Общее содержание стеринов можно определить колоримет-
рическими или, как недавно показано [156], ферментативно-
колориметрическими методами.

4.3.4.	ОПРЕДЕЛЕНИЕ СТЕРИНОВ В ПИЩЕВЫХ ПРОДУКТАХ

Если цель анализа образца пищевого продукта состоит не
только в определении общего содержания стеринов, но и в об-
наружении индивидуальных стеринов, а иногда и в установле-
нии присутствия их эфиров различных жирных кислот, то един-
ственным методом, дающим надежные результаты за приемле-
мое время, является газовая хроматография.

Один из способов анализа заключается в омылении пробы
и определении общего содержания стеринов в неомыляемой
фракции [196]. К недостаткам этого метода относятся невоз-
можность получения данных о составе содержащихся в пробе
жирных кислотах, а также трудность разделения холестерина
и а-токоферола. Последнюю трудность можно устранить путем
химической обработки экстракта, содержащего свободные сте-
рины, с тем чтобы превратить их в триметилсилиловые [234,
235] или сложные эфиры [197, 263].

Критический момент при выполнении анализа — стадия
экстракции. По-видимому, лучшим из использованных раствори-
телей была смесь хлороформа и метанола (2:1) [119, 233].

Шеппард и сотр. [263], разработавшие метод определения
стеринов в разнообразных пищевых продуктах — мясе, тортах,
майонезах, паштетах и пр.,— проводили экстракцию упоми-
навшейся выше смесью растворителей. Эфиры стеринов пре-
вращали в свободные стерины и метиловые эфиры жирных кис-
лот реакцией с метанолом, катализируемой трифторидом бора.
Далее стерины превращали в бутираты обработкой смесью мас-
ляного ангидрида и пиридина (2:1). Полученные эфиры раз-
деляли и количественно определяли при 250—265°С, используя
в качестве неподвижной фазы 1 % SE-30 на газохроме Q. С по-
мощью этого метода можно определить до 1 мг стерина (холе-
стерин, ситостерин, кампестерин, стигмастерин) в 100 г пи-
щевого продукта. Метод одновременно позволяет определить
состав жирных кислот из того же экстракта.

ЛИТЕРАТУРА

1.	Abell L. L., Levy В. В., Brodie В. B.t Kendall F. Е. J. Biol. Chem., 1952,
v. 195, р. 357.

2.	Abell L. L., Levy В. В. Standard Methods Clin. Chem., 1958, v. 2, p. 26.

3.	Aitzetmiiller K. J. Chromat, 1975, v. 113, p. 231.

4.	AU S. L. Z. Anal. Chem., 1972, v. 262, p. 278.

5.	Albers R. Lowry О. H. Anal. Chem., 1955, v. 27, p. 1829.

6.	Allain С. C., Poon L. S.t Chan C. S, Richmond W., Fu P. C. Clin. Chem.,
1974, v. 20, p. 470.

7.	Ambert I. P., Cahour A., Hartman L. Clin. Chim. Acta, 1976, v. 68, p. 31.

8.	Amenta L S. Clin. Chem., 1970, v. 16, p. 339.

9.	Ansari G. A. S, Smith L. L. J. Chromat., 1979, v. 175, p. 307.

10.	Artiss L D., Thibert R. J., Zak B. Microchem. J., 1978, v. 23, p. 237.

11.	Avigan J., Goodman D. S., Steinberg D. J. Lipid. Res., 1963, v. 4, p. 100.

12.	Avigan A., Steinberg D„ Vroman H. E., Thompson M. J., Mosettig E.
J. Biol. Chern, 1960, v. 235, p. 3123.

13.	Azarnoff D. L., Tucker D. R. Biochim. Biophys. Acta, 1963, v. 70, p. 589.

14.	Badzio T., Winnicka IL, Solecki A. Chem. Anal. (Warsaw), 1975, v. 20,
p. 701.

15.	Ballantine J. A, Roberts J. C., Morris R. J. J. Chromat, 1975, v. 103,
p. 289.

16.	Ballantine J. A., Williams K. J. Chromat, 1978, v. 148, p. 504.

17.	Ballantine J. A., Williams K., Morris R. J. J. Chromat, 1978, v. 166,
p. 461.

18.	Barbour H. M. Ann. Clin. Biochem, 1977, v. 14, p. 22.

19.	Barkhoff J., Niemeyer D. H., Wetzchewald D. Munch. Med. Wochenschr,
1977, v. 119, p. 439.

20.	Bartos /, Pesez M. Colorimetric and Fluorimetric Analysis of Steroids.
Academic Press, London, New York, San Francisco, 1976, pp. 8—12,
60—105.

21.	Beckman Bulletin GR-6301A.

22.	Bell 1. G., Christie A. A. Analyst, 1973, v. 98, p. 262.

23.	Bennett D. R., Heftmann E. J. Chromat, 1963, v. 12, p. 245.

24.	Bergmeyer H. U. Grundlagen der enzymatischen Analyse. Verlag Chemie,
Weinheim, New York, 1977, pp. 169, 170, 180.

25.	Bigham D. A, Farrant R. K., Phillipou G.t Seamark R. F. Clin. Chim.
Acta, 1976, v. 69, p. 537.

26.	Bjorkhem L, Blomstrand R., Lantto O., Svensson L., Ohman G. Clin.
Chem, 1976, v. 22, p. 1789.

27.	Bjorkhem L, Blomstrand R., Svensson L. Clin. Chim. Acta, 1974, v. 54,
p. 185.

28.	Brezina M., Zuman P. Die Polarographie in der Medizin, Biochemie und
Pharmazie. Akademische Verlagsgesellschaft, Leipzig, 1956, pp. 412—413.

21 Заказ № 182
29.	Brieskorn С. Н., Capuano L. Berichte, 1953, v. 86, p. 866.

30.	Brieskorn С. H., Grenier G. Arch. Pharm., 1975, v. 308, p. 375.

31.	Brieskorn С. H., Herrig H. Arch. Pharm., 1959, v. 292, p. 485.

32.	Brieskorn С. H., Hofmann H. Arch. Pharm., 1964, v. 297, p. 677.

33.	Bronzeri T. J., Brewer B. Clin. Chem., 1977, v. 23, p. 2089.

34.	Brooks С. I. W., Horning E. C., Young I. S. Lipids, 1968, v. 3, p. 391.

35.	Brooks С. I. W., Smith A. G. J. Chromat., 1975, v. 112, p. 499.

36.	Brown H. H., Zlatkis A., Zak B., Boyle A. J. Anal. Chem., 1954, v. 26,
p. 397.

37.	Buckley G. C., Little I. A., Antar M. A., Csima A., Sullivan K., Yano R.
Clin. Chim. Acta, 1969, v. 23, p. 53.

38.	Burchard H. Inaugural Dissertation. Rostock, 1889, through Chem. Zentr.
1890, v. 61, I., p. 25.

39.	Burstein S., Kimball H. L., Chaudhuri N. K., Gut M. J. Biol. Chem.,
1968, v. 243, p. 4417.

40.	Burstein S. Zamoscianyk H. Steroids, 1970, v. 15, p. 13.

41.	Cargill D. I. Analyst, 1962, v. 87, p. 865.

42.	Carlson S. E., Goldfarb S. Clin. Chim. Acta, 1977, v. 79, p. 575.

43.	Carpenter K. L, Gotsis A., Hegsted D. M. Clin. Chem., 1957, v. 3, p. 233.

44.	Carrol К. K. J. Lipid Res., 1961, v. 2, p. 135.

45.	Carrol К. K. J. Amer. Oil. Chem. Soc., 1963, v. 40, p. 413.

45a. Carrol К. K., Rudel L. L. J. Lipid Res., 1981, v. 22, p. 359.

46.	Carter T., Magnani H. N., Watts R. in Dixon P. F., Gray С. H., Lim С. K.,
Stoll M. S. (Editors). High Pressure Liquid Chromatography in Clinical
Chemistry, Academic Press, London, New York, San Francisco, 1976,
pp. 33—40.

47.	Castellani T., Kjelgaard-Nielsen P., Wolf-Iensen I. J. Chromat. 1975,
v. 104, p. 123.

48.	Cham В. E., Hurwood I. I., Knowless B. R., Powell L. W. Clin. Chim.
Acta, 1973, v. 49, p. 109.

49.	Chemtob C., Fawaz F., Puisieux F. Ann. Pharm. France, 1975, v. 33,
p. 243.

50.	Clark L. С. пат. США, 1959, No 2913368.

51.	Claude I. R. J. Chromat., 1965, v. 17, p. 596.

52.	Claude I. R. J. Chromat., 1966, v. 23, p. 267.

53.	Gobb S. A., Sanders I. I. Clin. Chem., 1978, v. 24, p. 1116.

54.	Colin H., Guiochon G., Siouffi A. Anal. Chem., 1979, v. 51, p. 1661.

55.	Cook R. P. Cholesterol. Academic Press. New York, 1958, pp. 80—88.

56.	Cook R. P. Analyst, 1961, v. 86, p. 373.

57.	Copius-Peereboom I. W., Beekes H. W. J. Chromat., 1962, v. 9, p. 316.

58.	Copius-Peereboom L W., Beekes H. W. J. Chromat., 1965, v. 17, p. 99.

59.	D’Ascenzo G., Cardarelli E., Magri A. D., Bica T., Sabbatini M. Clin.
Chem., 1978, v. 24, p. 119.

60.	De Hoff I. L., Davidson L. M., Kritchevsky D. Clin. Chem., 1978, v. 24,*
p. 433.

61.	Delsal J. L. Bull. Soc. Chim. Biol., 1943, v. 25, p. 361.

62.	De Souza N. L, Nes W. R. J. Lipid Res., 1969, v. 10, p. 243.

63.	Deyl Z., Macek K., Janak I. (Editors). Liquid Column Chromatography.
Elsevier, Amsterdam, Oxford, New York, 1975; a) Lipids, by Pokorny I.,
pp. 581—592; 6) Sterols, by Prochazka Z., pp. 604—607.

64.	De Vries B. Chem. Ind., 1962, p. 1049.

65.	Doins R. A., Ott A. C., Drake N. Anal. Chem., 1957,	v.	29,	p. 464.

66.	Driscoll	J.	L., Aubuchon D., Descoteaux M., Martin	H.	F.	Anal.	Chem.,

1971, v. 43, p. 1196.

67.	Duewell	H.	Anal. Chem., 1953, v. 25, p. 1548.

68.	Duncan	I.	W., Culbreth P. H., Burtis C. A. J. Chromat.,	1979,	v.	162,

p. 281.
69.	Dutta L, Biswas A., Saha S., Deb C. J. Chromat., 1976, v. 124, p. 29.

70.	Eaborn C., Holder C. A., Walton D. R. M. J. Chem. Soc., 1969, v. C18,
p. 2502.

71.	Edmonds C. G., Brooks C. J. J. Chromat., 1976, v. 116, p. 173.

72.	Edmonds C. G., Smith A. G„ Brooks C. J. W. J. Chromat., 1977, v. 133,
p. 172.

73.	Eisenwiener H. G. Med. Lab., 1975, v. 28, p. 81.

74.	Elevitch F. R. Fluorimetric Techniques in Clinical Chemistry. Little,
Brown and Co., Boston, 1973, p. 250.

75.	El-Olemy M. M., Stohs S. J. J. Pharm. Sci., 1975, v. 64, p. 161.

76.	Elingboe J., Nystrom E., Sjovall J. J. Lipid Res., 1972, v. 11, p. 266.

77.	Eneroth P., Hellstrom R., Ryhage R. J. Lipid Res., 1964, v. 5, p. 245.

78.	Eneroth P., Hellstrom R., Ryhage R. Steroids, 1965, v. 6, p. 707.

79.	Eneroth P., Nystrom E.	Steroids, 1968, v.	11, p. 417.

80.	Eneroth P., Nystrom E.	Steroids, 1968, v.	11, p. 187.

81.	Fales H. M., Milne G.	W., Axenrod T. Anal. Chem., 1970,	v. 42,	p. 1432.

82.	Fedeli E., Cortesi N.,	Mariani C. Riv.	Itai. Sost. Grasse,	1976, v.	53,

p. 130.

83.	Feldman S. A., Fosslein E. J. Chromat., 1971, v. 63, p. 63.

84.	Ferrell W. J., Repola D., Batsakis J. G. Clin. Biochem., 1977, v. 10, p. 118.

85.	Ferro P. V., Ham A. B. Amer. J. Clin. Pathol., 1960, v. 33, p. 545.

86.	Fingerhut B. Clin. Chem., 1978, v. 24, p. 1624.

87.	Fitzpatrick F. A., Siggia S. Anal. Chem., 1973, v. 45, p. 2310.

88.	Flegg H. M. Ann. Clin. Biochem., 1973, v. 10, p. 79.

89.	Frantz I. D. J. Lipid Res., 1963, v. 4, p. 176.

90.	Fruchart I. C., Buassa-Bu-Tsumbu, Cornyn D., Sezille G. Pharm. Biol.,
1977, v. 11, p. 37.

91.	Fruchart I. C., Buassa-Bu-Tsumbu, Dewailly P., Sezille G., laillard I.
Annals. Biol. Clin., 1975, v. 33, p. 453.

92.	Fruchart I. C., Buassa-Bu-Tsumbu, laillard I., Sezille G. Clin. Chim.
Acta, 1975, v. 63, p. 399.

93.	Gambert P., Lallemant C., Archambault A. J. Chromat., Biomed. Appl.
1979, v. 162, p. 1.

93a. Garneau F. X., Cote I., Harvey O., Simard I.-L., J. Chromat., 1980, v. 188,
p. 445.

94.	Gassiot M., Fernandez E., Firpo G., Carbo R., Martin M. J. Chromat.,
1975, v. 108, p. 337.

95.	Gassiot-Matas M., Danes E. I. Chromatographia, 1972, v. 5, p. 493.

96.	Gerhardt R. O., Gehrke C. W., Rogers I. T., Flynn M. A., Hentges D. I.
J. Chromat., 1977, v. 135, p. 341.

97.	Grunwald C. J. Chromat., 1969, v. 44, p. 173.

98.	Grunwald C. Anal. Biochem., 1970, v. 34, p. 16.

99.	Haeckel R., Perlick M. J. Clin. Chem., Clin. Biochem., 1976, v. 14, p. 411.

100.	Hahn Y., Olson C. L. Anal. Chem., 1979, v. 51, p. 444.

100a. Halket I. M., Lisboa В. P. J. Chromat., 1980, v. 180, p. 267.

101.	Hansbury E., Scallen T. I. J. Lipid Res., 1978, v. 19, p. 742.

101a. Hansbury E., Scallen T. I. J. Lipid Res., 1980, v. 21, p. 921.

102.	Haslam R. M., Rlyne W. Biochem. J., 1953, v. 55, p. 340.

103.	Haust H, Ruksis A., Beveridge I. Can. J. Biochem., 1966, v. 44, p. 119.

104.	Heftmann E. Chromatography of Steroids, Elsevier, Amsterdam, Oxford,
New York, 1976, pp. 55—69.

105.	Heider I. G., Boyett R. L. J. Lipid Res., 1978, v. 19, p. 514.

106.	Hershberg E. B., Wolfe I. R., Fieser L. F. J. Am. Chem. Soc., 1940, v. 62,
p. 3516.

107.	Hershberg E. B., Wolfe I. R., Fieser L. F. J. Biol. Chem., 1941, v. 140,
p. 215.
108.	Heuck С. С., Wirth A. J. Clin. Chem. Clin. Biochem., 1977, v. 15, p. 213.

109.	Hirsch I., Ahrens E. A. J. Biol. Chem., 1958, v. 233, p. 311.

110.	Hohenwallner W., Sommer R., Wimmer E. Clin. Chim. Acta, 1976, v. 66,
p. 19.

111.	Homberg E. Fette, Seifen, Anstrichm., 1977, v. 79, p. 234.

112.	Homberg E. J. Chromat., 1977, v. 139, p. 77.

112a. Homberg E., Bielefeld B. J. Chromat., 1979, v. 180, p. 83.

113.	Homberg E., Seher A. Z. Lebensm. Unter. Forsch., 1972, v. 149, p. 129.

114.	Hooper S. N., Chandler R. F. J. Pharm. Sci., 1978, v. 67, p. 1157.

115.	Huang H. S., Kuan I. C., Guilbault G. G. Clin. Chem., 1975, v. 21,
p. 1605.

116.	Huang H. S., Kuan I. C., Guilbault G. G. Clin. Chem., 1977, v. 23, p. 671.

117.	Huang T. C., Chen С. P., Wefler V., Raferty A. Anal. Chem., 1961, v. 33,
p. 1405.

118.	Huang T. C., Wefler V., Raferty A. Anal. Chem., 1963, v. 35, p. 1757.

119.	Hubbard W. D., Sheppard A. I., Newkirk D. R., Osgood T. J. Am. Oil
Chem. Soc., 1977, v. 54, p. 81.

120.	Hunter I. R., Walden M. K., Heftmann E. J. Chromat., 1978, v. 153, p. 57.

121.	Idler D. R., Safe L. M., Safe S. M. Steroids, 1970, v. 16, p. 251.

122.	I kan R., Cudzinovski M. J. Chromat., 1965, v. 18, p. 422.

123.	Ikekawa N., Watanuki R„ Tsuda K, Sakai K- Anal. Chem., 1968, v. 40,
p. 1139.

124.	Ishikawa T. T., MacGee I., Morrison I. A., Gluck С. I. J. Lipid Res., 1974,
v. 15, p. 286.

125.	Ishikawa T. T., Morrison I. A., Fallat R., Parsons D., Gliick С. I. J. Lab.
Clin. Med., 1974, v. 84, p. 281.

126.	Itoh T., Tamura T., Iida T., Matsumoto T. Steroids, 1974, v. 23, p. 687.
126a. Itoh T., Tamura T., Iida T., Matsumoto T. Steroids, 1975, v. 26, p. 93.
127. Itoh T., Tamura T., Ogawa S., Matsumoto T. Steroids, 1975, v. 25, p. 729.
127a. Johansson A. J. Am. Oil Chem. Soc., 1979, v. 56, p. 886.

1276. Johansson A. Lipids, 1979, v. 14, p. 285.

128.	Johansson I. L., Grostic M. F., Jensen A. 0. Anal. Chem., 1957, v. 29,
p. 468.

129.	Jones О. V. M., Ho F. K., Mazzuchin A., Doran T., Liedgren S., Por-
ter С. I. Clin. Chem., 1976, v. 22, p. 224.

130.	Joy E., Bonn I. D., Bernard A. I. Termochim. Acta, 1971,	v. 2,	p.	57.

131.	Jungreis E., Rapp H. Israel J. Chem., 1974, v. 12, p. 911.

132.	Kabara I, /., McLaughlin I. T., Riegel C. A. Anal. Chem.,	1961,	v.	33,

p. 305.

133.	Kakac B., Vejdelek I. Handbuch der Kolorimetrie. VEB Gustav Fischer
Verlag, Jena, 1966, v. 3, pp. 512—536.

134.	Kameno Y., Nakano N., Baba S. Clin. Chim. Acta, 1977, v. 77, p. 245.

135.	Kammereck R., Lee W. H., Paliokas A., Schroepfer G. I. J. Lipid Res.,
1967, v. 8, p. 282.

136.	Kartnig T., Mikula G. J. Chromat., 1970, v. 53, p. 537.

137.	Kelly R. W., Taylor P. L. Anal. Chem., 1976, v. 48, p. 465.

138.	Kenny A. P. Biochem. J., 1952, v. 52, p. 611.

139.	Khayam-Bashi H., Sims C., Parekh A. C. Clin. Chim. Acta, 1976, v. 66,
p. 69.

140.	Холодова Ю. Д., Якимович P. И., Вендт В. П. Ж. медицинской химии,
1976, т. 22, с. 122.

140а. Kimura М., Yamamoto Т., Nagasawa К., Tohma М. Chem. Pharm. Bull.,
1979, v. 27, р. 2203.

141.	Kingsbury К. J., Morgan D. M. L., Brett C. G. Biochem. Med., 1977, v. 18,
p. 37.

142.	Klause K. A., Subbiah M. T. R. J. Chromat., 1975, v. 103, p. 170.

143.	Klein B., Kleinman N. B., Foreman J. A. Clin. Chem., 1974, v. 20, p. 482.
144.	Klein Р. D., Szczepanik Р. A. J. Lipid Res., 1962, v. 3, р. 460.

145.	Knights В. A. Phytochemistry, 1970, v. 9, р. 903.

146.	Knights В. A. Qualitative and Quantitative Analysis of Plant Sterols by
Gas-Liquid Chromatography, in Heftmann E. (Editor). Modern Methods
of Steroid Analysis. Academic Press. New York, London. 1973, pp. 103—
138.

147.	Knights B. A. Anal. Biochem., 1977, v. 80, p. 324.

148.	Knob M., Rosenmund H. Z. Clin. Chem. Clin. Biochem., 1975, v. 13,
p. 493.

149.	Knuechel F., Ochs H. Arzt. Lab., 1974, v. 20, p. 120.

150.	Kobayashi T., Adachi A., Furuta K> J. Nutr. Sci. Vitaminol., 1976, v. 22,
p. 215.

151.	Koedam J. C. Clin. Chim. Acta, 1977, v. 79, p. 607.

152.	Kremmer T., Ferenczy E., Posch E. Chromatographia, 1969, v. 2, p. 142.

153.	Kreuzig F. Z. Anal. Chem., 1976, v. 281, p. 135.

154.	Kritchevsky D. Cholesterol. Wiley. New York, 1958, pp. 232—255.

155.	Kritchevsky D., Davidson L. M., Kim H. K., Malhorta S. Clin. Chim.
Acta, 1973, v. 46, p. 63.

156.	Kritchevsky D., Tepper S. A. Clin. Chem., 1979, v. 25, p. 1464.

157.	Kuksis A. Can. J. Biochem. Physiol., 1964, v. 42, p. 407.

158.	Kuksis A. Fette, Seifen, Anstrichm., 1973, v. 75, p. 420.

159.	Kuksis	A.,	Huang T. C. Can. J. Biochem. Physiol., 1962, v. 40, p.	1493.

160.	Kuksis	A.,	Myher J. J., Marai L., Geher K. J. Chromat. Sci., 1975,	v.	13,

p. 423.

161.	Kumar	A.,	Christian G. D. Clin. Chim. Acta, 1977, v. 74, p. 101.

162.	Landowne	R. A,, Lipsky S. R. Anal. Chem., 1963, v. 35, p. 532.

163.	Lauko A., Gorog S., unpublished data.

164.	Lee W. FL, Lutsky B. N., Schroepfer G. J. J. Biol. Chem., 1969, v. 244,
p. 544.

165.	Lefant M., Ellouz R., Das B., Zissmann E., Lederer E. Eur. J. Biochem.,
1969, v. 7, p. 159.

166.	Leupold F., Buttner H. Klin. Wochschr., 1953, v. 31, p. 867.

167.	Lie R. F., Schmitz J. M., Pierre K. J., Gochman N. Clin. Chem., 1976,
v. 22, p. 1627.

168.	Lubermann C. Berichte, 1885, v. 18, p. 1803.

169.	Lillienberg L., Svanborg A. Clin. Chim. Acta, 1976, v. 68, p. 223.

170.	Lisboa B. Steroids, in Macek K. (Editor) Pharmaceutical Applications
of Thin-layer and Paper Chromatography. Elsevier. Amsterdam, London,
New York, 1972, pp. 275—348.

171.	Lopez A., Vial R., Gremillion L„ Bell L. Clin. Chem., 1971, v. 17, p. 994.

172.	Luddy F. E., Turner A., Scalan J. T. Anal. Chem., 1953, v. 25, p. 1497.

173.	Lutmer R. F., Parsons D., Gluck C. J., Morrison J. A., Stewart L., Bra-
zier J. B., Buncher C. R., Ishikawa T. T. J. Lipid Res., 1974, v. 15, p. 611.

174.	Majeski E. L, Seltzer E. J., Carter P. L., Howlett D. R., Stuart J. D.
Clin. Biochem., 1977, v. 23, p. 1976.

175.	Malaiyandi M., Barrette J. P., Lanouette M. J. Chromat., 1974, v. 101,
p. 155.

176.	Manasterski A., Bartzack C., Thiebert R., Zak B. Mikrochim. Acta, 1975,
v. II, p. 1.

177.	Manners M. J., Kidder D. E., Parsons P. P. J. Chromat., 1969, v. 43,
p. 276.

178.	Mareci T. H., Scott K. N, Anal. Chem., 1977, v. 49, p. 2130.

179.	Martinek R. G. J. Am. Med. Technol., 1970, v. 32, p. 64.

180.	Matsui M., Mizunuma H., Ikekawa N. Japan Analyst, 1973, v. 22, p. 987.

181.	McDougal D. B., Farmer H. S. J. Lab. Clin. Med., 1957, v. 50, p. 485.

182.	Mlekusch W., Truppe W., Paletta P. J. Chromat., 1973, v. 78, p. 438.

183.	Mlekusch W., Truppe W., Paletta P. Clin. Chim. Acta, 1973, v. 49, p. 73.
184.	Moore Р. R., Baumann С. A. J. Biol. Chem., 1952, v. 195, р. 615.

185.	Moravek V. Publ. Fac. Univ. J. E. Purkyne, Brno, 1965, No. 462, p. 175.

186.	Moravek V. Z. Inn. Med., 1965, v. 20, p. 481.

187.	Morgan E. D., Poole C. F. J. Chromat., 1974, v. 89, p. 225.

188.	Morgan, E. D., Poole C. F. J. Chromat., 1975, v. 104, p. 351.

189.	Morris L. J. J. Lipid Res., 1963, v. 4, p. 357.

190.	Munster D. J., Lever M., Carrel R. W. Clin. Chim. Acta, 1976, v. 68,
p. 167.

191.	Murata T., Takahashi S., Takeda T. Anal. Chem., 1975, v. 47, p. 577.

192.	Miiller-Beissenhirtz W., Schulz P., Loch R., Muller H. A. C. Arzt. Lab.,
1976, v. 22, p. 43.

193.	Nakaparksin S., Birrell P., Gil-Av E., Oro J. J. Chromatogr. Sci., 1970,
v. 8, p. 177.

194.	Neher R. Steroid Chromatography. Elsevier, Amsterdam, 1964.

195.	Neher R., Sterols, in Stahl E. (Editor). Thin-layer Chromatography.
Springer Verlag, Berlin, Heidelberg, New York. 1969, pp. 329—334.

196.	Nelson J. P., Milun A.	J. J. Am. Oil Chem.	Soc., 1968, v. 45, p.	848.

197.	Nelson J. P., Milun A.	J. J. Am. Oil Chem.	Soc., 1970, v. 47, p.	259.

198.	Nicolau G., Shefer S., Mosbach E. FL Anal. Biochem., 1975, v. 68, p. 255.

199.	Nicolosi R. J., Smith S.	C., Santerre R. F. J.	Chromat., 1971 v. 60, p. 111.

200.	Nishina T., Kimura M.	Chem. Pharm. Bull.,	1964, v. 12, p. 521.

201.	Nishina T., Sakay Y., Kimura M. Chem. Pharm. Bull., 1965, v. 13, p. 414.

202.	Nobbs В. T., Smith J. M., Walker A. W. Clin. Chim. Acta, 1977, v. 79,
p. 391.

203.	Noma A., Nakayama K- Clin. Chim. Acta, 1976, v. 73, p. 487.

204.	Noma A., Nakayama K- Clin. Chem., 1976, v. 22, p. 336.

205.	Novotny M., Lee M. L., Low С. E., Maskarinec M. P. Steroids, 1976, v. 27,
p. 665.

206.	Nordby H. E., Nagy S. J. Chromat., 1973, v. 75, p. 187.

207.	Nordby FL E., Nagy S. J. Chromat., 1973, v. 79, p. 147.

208.	Otani T., Ishimaru K., Nakamura S., Kamei T., Suzuki H. Chem. Pharm.
Bull, 1977, v. 25, p. 1452.

209.	Owen S. J., Mederios J. S., Ramalho V., Cechinel Y. Ann. Clin. Biochem,
1978, v. 15, p. 226.

209a. Ogren L., Csiky L., Risinger L., Nilsson L. G., Johansson G. Anal. Chim.
Acta, 1980, v. 117, p. 71.

210.	Panalaks T. J. Ass. Off. Anal. Chem, 1971, v. 54, p. 1299.

211.	Papastathopoulos D. S., Rechnitz G. A. Anal. Chem, 1975, v. 47, p. 1792.

212.	Parekh A. C., Creno R. J. Biochem. Med, 1975, v. 13, p. 241.

213.	Parekh A. C., Jung D. H. Anal. Chem, 1970, v. 42, p. 1423.

214,	Pascaud A., Pascaud M., Lievremont M. Bull. Soc. Chim. Biol, 1966,
v. 48, p. 192.

215.	Patterson G. W. Comp. Biochem. Physiol, 1969, v. 31, p. 391.

216.	Patterson G. W. Anal. Chem, 1971, v. 43, p. 1165.

217.	Patterson G. W., Krauss R. W. Plant Cell Physiol, 1965, v. 6, p. 211.

218.	Patterson G. W., Khalil M. W., Ilder D. R. J. Chromat, 1975, v. 115,
p. 153.

219.	Перельман Ю. M., Гаврилин Г. Ф. Ж- аналит. химии, 1963, т. 18, с. 529.

220.	Pesce	М.	A.,	Bodourian S. Н.	Clin.	Chem, 1976, v. 22, р. 2042.

221.	Pesce	М.	A.,	Bodourian S. Н.	Clin.	Chdm, 1977, v. 23,	p.	280.

222.	Pesce	M.	A,	Bodourian S. H.	Clin.	Chem, 1977, v. 23,	p.	757.

223.	Peter	F., Reynolds R. G. J. Chromat,	1977, v. 143, p. 153.

224.	Petersen J. W., Hedberg K. W., Christensen В. E. Anal. Chem, 1943,
v. 15, p. 225.

225.	Petty F., Ragland J. B., Kuiken L. B., Sabasin S. M., Wander J. D. Lipids,
1975, v. 10, p. 800.

226.	Pinelli A., Nair P. P. J. Chromat, 1969, v. 43, p. 223.
227.	Pollack О. J., Wadler В. J. Lab. Clin. Med., 1952, v. 39, p. 791.

228.	Poole C. F., Morgan E. D. J. Chromat., 1974, v. 90, p. 380.

229.	Poole C. F., Morgan E. D. Org. Mass Spectrom., 1975, v. 10, p. 537.

230.	Popov S., Carlson R. M. K., Wegmann A., Djerassi C. Steroids, 1976,
v. 26, p. 699.

231.	Prabhudesai A. V. Lipids, 1977, v. 12, p. 242.

232.	Proksch G. J., Bonderman D. P. Clin. Chem., 1978, v. 24, p. 1924.

233.	Punwar	J.	K. J. Ass.	Off. Anal.	Chem., 1975, v. 58, p. 804.

234.	Punwar	J.	K. J. Ass.	Off. Anal.	Chem., 1976, v. 59, p. 46.

235.	Punwar	J.	K-, Derse	P. S. J. Ass. Off. Anal. Chem., 1978, v.	61, p. 727.

236.	Putney	B.	F., Paruta A. N. J.	Pharm. Sci., 1963, v. 52,	p. 174.

237.	Quilliam M. A., Westmore J. B. Steroids, 1977, v. 29, p. 579.

238.	Rautela G. S. Liedtke R. J. Clin. Chem., 1978, v. 24, p. 108.

239.	Rawis R. L. Chem. Eng. News, 1976, v. 54, p. 19.

240.	Redel J., Capillon J. J. Chromat., 1978, v. 151, p. 418.

241.	Rees H. H., Donnahey P. L., Goodwin T. W. J. Chromat., 1976, v. 116,
p. 281.

242.	Richmond W. Clin. Chem., 1973, v. 19, p. 1350.

243.	Richmond W. Clin. Chem., 1976, v. 22, p. 1579.

244.	Ригин В. И. Ж. аналит. химии, 1978, т. 33, с. 1623.

245.	Rivano R., Altrinetti Е., Belucci Р. Pathologica, 1975, v. 67, р. 227.

246.	Robinson С. A. Clin. Chem., 1976, v. 22, p. 1542.

247.	Rockerbie R. A., Dobson R. D., Frohlich J. Clin. Chem., 1979, v. 25,
p. 1411.

248.	Roda A., Festi D., Sama C., Mazzella G., Aldini R., Roda E., Barbara L.
Clin. Chim. Acta, 1975, v. 64, p. 337.

249.	Rozanski A. Anal. Chem., 1966, v. 38, p. 36.

250.	Roschlau	P., Bernt	E., Gruber W. Z. Klin. Chem., 1974,	v.	12, p.	226.

251.	Ruiz R.,	Dea P. J.	Chromat., Biomed. Appl., 1978, v. 146, p.	321.

252.	Sanghvi	A., Kienle	M. G., Galli G. Anal. Biochem., 1978,	v.	85, p.	430.

253.	Saphiro	D. R., Kuwahata S. S. Clin. Chem., 1973, v. 19,	p.	1305.

254.	Sato Karube L, Suzuki S. Biotechnol. Bioeng., 1977, v. 19, p. 1095.

255.	Schoenheimer R., Sperry W. M. J. Biol. Chem., 1934, v. 106, p. 745.

256.	Schulz G., Sander H. Z. Physiol. Chem., 1957, v. 308, p. 122.

257.	Schwarz V., Trojanek J. Coll. Czech. Chem. Comm., 1961, v. 26, p. 117.

258.	Scott R. P. W., Scott C. G., Munroe M„ Hess J. J. Chromat., 1974, v. 99,
p. 395.

259.	Seher A., Vogel H. Fette, Seifen. Anstrichm., 1976, v. 78, p. 106.

260.	Seyama Y., Ichikawa K, Yamakawa T. J. Biochem. (Tokio), 1976, v. 80,
p. 223.

261.	Shaw W. H. C., Jefferies J. P., Hoft T. E. Analyst, 1957, v. 82, p. 2.

262.	Shen-nan Lin, Horning E. C. J. Chromat., 1975, v. 112, p. 465.

263.	Sheppard A. J., Newkirk D. R., Hubbard W. D., Osgood T. J. Ass. Off.
Anal. Chem., 1977, v. 60, p. 1302.

264.	Shin Y. S., Lee J. C. Anal.	Chem., 1961, v. 33, p. 1220.

265.	Siekmann L., Hiiskes К.	P-, Breuer H. Z. Anal. Chem.,	1976, v. 279,

p. 145.

266.	Smith A. G., Brooks C. J. W. J. Chromat., 1974, v. 101,	p.	373.

267.	Sperry W. M., Webb M. J.	Biol. Chem., 1950, v. 187, p. 97.

268.	Stdhler F., Munz E., Kattermann R. Dent. Med. Wochensch., 1975, v. 100,
p. 876.

269.	Steel A. E. Clin. Chem., 1977, v. 23, p. 2351.

270.	Szent-Gyorgyi A. Biochem. Z., 1923, v. 136, p. 112.

271	Takagi T., Sakai A., Hayashi K, Itabashi Y. J. Chromat. Sci., 1979, v. 17,
p. 212.

272.	Takagi T., Sakai A., Itabashi Y., Hayashi H. Lipids, 1977, v. 12, p. 228.
272a. Tallovd J., Hakl J. J. Chromat., 1980, v. 202, p. 487.
273.	Tarbutton Р. N., Gunter С. R. Clin. Chem., 1974, v. 20, p. 724.

274.	Teichman R. L, Takei G. H., Cummins J. M. J. Chromat., 1974, v. 88,
p. 425.

275.	Thomas B. S., Eaborn C., Walton D. R. M. Chem. Commun., 1966, v. 13,
p. 408.

276.	Thowsen J, R., Schroepfer G. J. J. Lipid Res., 1979, v. 20, p. 681.

277.	Tohma M., Nakata Y., Kurosawa T. J. Chromat., 1979, v. 171, p. 469.

278.	Tomicek 0., Dolezal J. Acta Pharm. Intern., 1950, v. 1, p. 31.

278a. Tomori E., Orban E., Maderspach A. J. Chromat., 1980, v. 191, p. 261.

279.	Touchstone J. C., Dobbins M. F., Hirsch C, Z., Baldino A. R., Kritschev-
sky D. Clin. Chem., 1978, v. 24, p. 1496.

280.	Trischler F., Szivos K. Acta Pharm. Hung., 1969, v. 39, p. 281.

281.	Tsai L. S., Hudson C. A. J. Am. Oil Chem. Soc., 1979, v. 56, p. 178A.

282.	Valle L. B. S., Oliveira-Filho R. M., Camara S. A. J. Chromat., 1975,
v. 115, p. 183.

283.	Vandam me D., Blaton V., Peeters H. J. Chromat., Biomed. Appl., 1978,
v. 145, p. 151.

284.	Van den Heuvel W. J. A., Sjdvall J., Horning E. C. Biochim. Biophys.
Acta, 1961, v. 48, p. 596.

285.	Van den Heuvel W. J. A., Sweeley С. C., Horning E. C. J. Am. Chem.
Soc., 1960, v. 82, p. 3481.

286.	Van der Honing J., Saar loos C. C., Stip J. Clin. Chem., 1968, v. 14,
p. 960.

287.	Van Hout P., Szafranek J., Pfaffenberger C. D., Horning E. C. J. Chro-
mat., 1974, v. 99, p. 103.

288.	Van Lier J. E.>	Smith L. L. J. Chromat., 1969, v. 41,	p.	37.

289.	Vidrine D. W.,	Nicholas H. J.	J. Chromat., 1974, v. 89,	p.	92.

290.	Viikari J. Anal.	Biochem., 1975,	v. 63, p. 566.

291.	Vroman H. E.,	Cohen C. F. J.	Lipid Res., 1967, v.	8,	p.	150.

292.	Watson D, Clin. Chim. Acta, 1960, v. 5, p. 637.

293.	Wentz P. W., Cross R. E., Savory J. Clin. Chem., 1976, v. 22, p. 188.

294.	White С. E., Argauer R. J. Fluorescence Analysis, Marcel Dekker, New
York. 1970, p. 295.

295.	Wiklund B., Eliasson R. J. Chromat., 1972, v. 68, p. 153.

296.	Windaus A. Berichte, 1909, v. 42, p. 238.

297.	Wintersteiger R., Giibitz G. Sci. Pharm., 1978, v. 46, p. 269.

298.	Witte D, L., Barrett D. A., Wycoff D. A. Clin. Chem., 1974, v. 20, p. 1882.

299.	Wortberg B. Z. Lebensmittelunters. u. Forsch., 1975, v. 157, p. 333.

300.	Worth H. C. J, in Dixon P. F., Gray С. Н.» Lim С. K., Stoll M. S. (Edi-
tors). High Pressure Liquid Chromatography in Clinical Chemistry. Aca-
demic Press. London, New York, San Francisko, 1976, pp. 11—16.

301.	Yasumura M., Okano T., Mizuno K., Kobayashi T. J. Nutr. Sci. Vita-
minol., 1977, v. 23, p. 513.

302.	Zak B. Am. J. Clin. Pathol., 1957, v. 27, p. 583.

303.	Zak B., Epstein E. Clin. Chim. Acta, 1961, v. 6, p. 72.

304.	Zak B., Epstein E., Baginski E. S. Ann. Clin. Lab. Sci., 1972, v. 2, p. 102.

305.	Ziegenhorn J. Z. Klin. Chem. Clin. Biochem., 1975, v. 13, p. 109.

306.	Zielinski W. L., Johnston K., Muschnik G. M. Anal. Chem., 1976, v. 48,
p. 907.

307.	Ziller S. A., Doisy E. A... Elliot W. H, J. Biol. Chem., 1968, v. 243,
p. 5280.

308.	Zlatkis A., Zak B., Boyle A. J. Lab. Clin. Med., 1953, v. 41, p. 486.

309.	Zoppi F., Fenili D. Clin. Chem., 1960, v. 22, p. 690.
5

ВИТАМИНЫ D И РОДСТВЕННЫЕ СОЕДИНЕНИЯ

5.1.	ОСНОВЫ ХИМИИ ВИТАМИНОВ D

Витамины D являются 9,10-секопроизводными А5’7-стеринов.
Наиболее важные представители соединений этого класса вита-
мины D2 и D3 получают соответственно из эргостерина и 7-де-
гидрохолестерина (5,7-холестадиен-Зр-ол), и поэтому для их
наименования широко используются тривиальные названия
эргокальциферол и холекальциферол. Согласно правилам
ИЮПАК—ИЮБ [97], их следует называть 9,10-секо-5,7,10(19),
22-эргостатетраен-Зр-ол и 9,10-секо-5,7,10(19)-холестатриен-
Зр-ол.

Что касается структурных формул витаминов D, то в ран-
ней литературе, а иногда даже и в современной (например,
в упомянутых выше правилах ИЮПАК—ИЮБ) приводят фор-
мулы, отражающие их секо-стероидный характер (tfac-конфи-
гурация относительно 6—7-связи). Найдено, что в кристалли-
ческом состоянии витамины имеют 6—7-тракс-конфигурацию,
а в растворе между обеими формами устанавливается равно-
весие. В соответствии с этим в настоящее время более принята
структурная формула, характерная для траке-конфигурации
молекулы. Это естественно вызывает кажущееся противоречие,
поскольку все заместители, обозначенные в соответствии с пра-
вилами ИЮПАК—ИЮБ как р, в таких структурных формулах
оказываются a-заместителями (например, Зр-оксигр“уппа) и
наоборот (например, 1а-оксигруппа у их метаболитов).
Витамин D3 образуется из 7-дегидрохолестерина в коже мле-
копитающих под действием ультрафиолетового облучения. Он
стимулирует транспорт кальция в кишечнике и кальцинацию
костей. Его дефицит вызывает рахит и остеомаляцию, поэтому
витамины D являются важными лекарственными средствами,
которые принимают в виде таблеток, капсул, масляных пре-
паратов и т. д. индивидуально или вместе с другими жиро- или
водорастворимыми витаминами.

Наиболее важными природными источниками витамина D3
являются жир печени рыб, яичный желток и молоко.

В промышленности витамины D2 и D3 получают из эргосте-
рина (содержится в дрожжах) и 7-дегидрохолестерина (путем
бромирования в положение 7 и дегидробромирования холесте-
рина) соответственно. Эргостерин и 7-дегидрохолестерин по-
этому часто называют провитаминами D2 и D3. Провитамины
превращаются в соответствующие витамины D под действием
ультрафиолетового облучения. Облучение в сочетании с тепло-
вой обработкой приводит к получению равновесной смеси, со-
держащей не только витамин D, но и неактивные или слабоак-
тивные побочные продукты, а также токсичные продукты сверх-
радиации (супрастерины, токсистерины). Такая сложная равно-
весная система показана на схеме 5.1, а некоторые дальнейшие
превращения витаминов D представлены на схеме 5.2.

токсистерины
Индивидуальные равновесия в этих схемах важны не только
с точки зрения промышленного синтеза, их часто используют,
или по крайней мере учитывают, также и аналитики. Напри-
мер, термическое равновесие между превитамином и витами-
ном D [20, 120, 215] означает, что превитамин можно рас-
сматривать как потенциальный витамин D. В лекарственных
препаратах превитамин частично превращается в витамин D.
В то же время, если даже, например, для приготовления масля-
ного раствора использовать чистый витамин D, часть его нахо-
дится в виде превитамина.

5.2.	МЕТОДЫ АНАЛИЗА ВИТАМИНОВ D

5.2.1.	МЕТОДЫ УФ-СПЕКТРОФОТОМЕТРИИ

В этанольной среде витамины D2 и D3 образуют интенсив-
ный максимум поглощения при 265 нм. Для витамина D2
А 'см = 460, для витамина D3— 485 [189]. Хотя эти цифры и
„ служат характеристиками интенсивности спектров, простое
спектрофотометрическое измерение позволяет решать только
менее сложные задачи, например изучать характеристики кри-
сталлических веществ или определять витамины в спиртовых
растворах и простых по составу таблетках. При анализе мас-
ляных препаратов или поливитаминов перед измерением обычно
необходимо хроматографическое разделение [3, 30, 65, 93, 147],
поскольку определению * сильно мешают витамины А и Е. Это
необходимо при определении витаминов D2 и D3 в смолообраз-
ных продуктах УФ-облучения и тепловой обработки провита-
минов, поскольку последние и их фотохимические изомеры со-
держат сопряженные диены и триены, которые сильно погло-
щают примерно при 265 нм. В табл. 5.1 приведены спектраль-
ные характеристики наиболее типичных представителей в ряду
превращений витамина D2.

После предварительного хроматографического разделения
(см. разд. 5.2.6) Шоу и др. [175, 176], измеряя поглощение при
двух длинах волн и решая два уравнения с двумя неизвест-
ными, смогли определить даже неразделенные пары соедине-
ний, например кальциферол — тахистерин, прекальциферол —
лумистерин. Позднее Стернберг и др. [186] определили витамин
D2, превитамин D2, провитамин D2, (лумистерин )2 и (тахисте-

* Недавно Хассан [79] описал методику спектрофотометрического опреде-
ления витамина D в масляных препаратах после омыления масла, экстракции
эфиром, выпаривания и растворения в 2-пропаноле. Для введения поправки
на фоновое поглощение используют алгебраический метод.
рин)2 без хроматографического разделения с помощью алгебраи-
ческих вычислений и подбора эмпирического уравнения.

Таблица 5.1. Спектральные данные для витамина D2 и родственных
соединений в этаноле [106, 175]

Соединение	^тах	А1 % см	е
Витамин D2	265	475	18 850
Провитамин D2 (эрго-	271,5	290	11 500
стерин)	282	306	12 150
	293,5	174	6 900
(Лумистерин)2	272	238	9 450
	280 (перегиб)	224	8 900
Превитамин D2	260	230	9 150
Пировитамин D2	274	259	10 250
	284,5	273	10 850
	296	161	6 400
Изопировитамин D2	274	261	10 350
	284	259	10 250
	295 (перегиб)	142	5 650
5,6-транс-Витамин D2	273	604	24 000
Изовитамин D2	276	852	33 800
	300	812	32 200
	287	1105	43 900
(Тахистерин)2	271 (перегиб)	596	23 650
	281	734	29 150
	290 (перегиб)	594	23600
(Изотахистерин)2	280	799	31 700
	290	1022	40 850
	302	756	30 000
Супрастерины I и II	Выше 22i неселектр	0 нм поглощение 1вное	

Заслуживают упоминания спектрофотометрические методы
определения родственных соединений, например дигидротахи-
стерина (продукта гидрирования тахистерина). Метод Хома
и др. [90] основан на использовании максимумов поглощения
при 251 и 261 нм (Л1 °см = 1010 и 650 соответственно) и мини-
мума при 257 нм. Для устранения фонового поглощения поль-
зуются разностью между величинами поглощения при 251 и
257 нм, а не поглощением при 251 нм. Этот метод успешно при-
меняли для установления однородности таблеток после экстрак-
ции этанолом. Для того чтобы решить, действительно ли уст-
ранено фоновое поглощение, рассчитывали отношение (Л 251—
Л 257)/И251 — Л261) и сравнивали со стандартом. Для повышения
селективности метода целесообразно ввести стадию гидролиза,
обрабатывая образец в течение ночи раствором гидроксида ка-
лия с концентрацией порядка 0,8 н. в атмосфере азота в при-
сутствии пирогаллола в качестве антиоксиданта. Затем рас-
твор следует разбавить водой и экстрагировать гексаном. Опи-
санный выше способ спектрофотометрического измерения по-
глощения гексанового экстракта позволяет получить хорошие
результаты при установлении однородности эластичных жела-
тиновых капсул, но погрешность можно значительно умень-
шить, если перед спектрофотометрическим измерением экст-
ракты очистить с помощью тонкослойной хроматографии.

5.2.2.	КОЛОРИМЕТРИЧЕСКИЕ МЕТОДЫ

Низкая специфичность ультрафиолетовой спектрофотометрии
и проблемы поглощения фона, рассмотренные в предыдущем
разделе, обусловливают проявление заметного интереса к ко-
лориметрическим методикам с самого начала развития ана-
лиза витаминов. Некоторые из разработанных методик сохра-
няют значение до сих пор, несмотря на то что проблема фона
по-прежнему существует и специфичность реакции или колори-
метрической методики в большинстве случаев также весьма
проблематична. При решении более сложных задач неизбежно
предварительное хроматографическое разделение.

Бартош и Пезе [10] рассмотрели большое число методик,
основанных на использовании таких реагентов, как серная кис-
лота—фурфурол [122], серная кислота—анисовый альдегид
[6], хлорная кислота—анисовый альдегид [172], хлорная кис-
лота—ванилин [172], трихлоруксусная кислота—фурфурол
[162], глицерин—1,3-дихлоргидрин [27, 183], трифторуксусная
кислота—пероксид водорода [68, 69], соляная кислота—тетра-
хлорэтан [78] и др. Наиболее важным из них несомненно
является метод, основанный на использовании хлорида
сурьмы (III).

Этот метод основан на измерении поглощения оранжевого
комплекса примерно при 500 нм; его чувствительность прибли-
зительно в 4 раза выше чувствительности метода УФ-спектро-
фотометрии. Со времени применения этого метода в анализе
витаминов D2 и D3 Брокманом и Ченом [25] оригинальная ме-
тодика подверглась некоторым улучшениям. Замена первона-
чально предложенного хлороформа дихлорэтиленом привела
к повышению устойчивости реагента [44], а добавление аце-
тилхлорида к реакционной смеси ускорило развитие окраски и
повысило ее устойчивость [148]. Для повышения селективности
метода из величины поглощения в максимуме (500 нм) надо
вычесть поглощение при длине волны 550 нм, при которой по-
глощение оранжевого комплекса незначительно, но наблюда-
ется сильное поглощение мешающих веществ. Гораздо более
эффективного улучшения селективности удается достичь путем
добавления к реакционной смеси уксусного ангидрида, который
полностью подавляет развитие окраски витамина D, но не ме-
шает измерению фонового поглощения мешающих веществ. Для
этого выполняют два определения: в отсутствие и в присутст-
вии уксусного ангидрида. Величину поглощения комплекса ви-
тамина D с хлоридом сурьмы(III) получают путем вычитания
из поглощения при 500 нм, измеренного в первом опыте, по-
глощения, измеренного во втором опыте [222]. Если анализи-
руемый образец содержит гидролизующиеся компоненты
(масло и др.), рекомендуется ввести стадию гидролиза водным
или спиртовым раствором щелочи и затем стадию экстракции
эфиром. Очень важно на стадии гидролиза добавлять антиок-
сидант (гидрохинон [6], пирогаллол [140, 141, 191], 2,6-ди-трет-
бутил-и-крезол [212]). Следует заметить, что в процессе гидро-
лиза может произойти частичная изомеризация витаминов D,
но это не влияет на реакцию образования окрашенного соеди-
нения [1896]. Хотя описанные выше модификации сильно улуч-
шили селективность метода, решение большинства практиче-
ских задач (определение витаминов D в присутствии родствен-
ных соединений, витаминов А и Е и др.) возможно только
после предварительного разделения колоночной или тонкослой-
ной хроматографией (см. разд. 5.2.6 и 5.2.7). Например, в фар-
макопее XX США в методику определения витамина D [212],
включающую все модификации метода с использованием хло-
рида сурьмы(III), введено две стадии разделения с помощью
колоночной хроматографии.

Недавно опубликованный метод Мулдера и др. [140, 141]
включает следующие стадии: гидролиз, экстракцию, хромато-
графическое разделение на колонке с оксидом алюминия, об-
работанным фосфатом, разделение методом распределительной
хроматографии с помощью полиэтиленгликоля 600 на целите,
разделение с помощью адсорбционной хроматографии на фло-
рексе, обработку малеиновым ангидридом для устранения
транс-изомеров витаминов D * и фотометрирование при 500 и
550 нм в присутствии и в отсутствие уксусного ангидрида.

* транс-Витамин D и родственные соединения вступают в быструю ре-
акцию Дильса—Альдера с малеиновым ангидридом, с цис-изомерами реакция
протекает медленнее, а изотахистерин в нее не вступает, что позволяет про-
водить его селективное определение [20а, 42].
Метод Мулдера успешно применяли для анализа различных по-
ливитаминов. Хотя правильность и воспроизводимость коло-
риметрических методов удовлетворительны (результаты по-
падают в интервал 96,3—98,9 %, относительное стандартное от-
клонение 0,015—0,04), эти методы трудоемки, и поэтому их
важность уменьшается в пользу методов высокоэффективной
жидкостной хроматографии.

5.2.3.	ИНФРАКРАСНАЯ СПЕКТРОФОТОМЕТРИЯ

Метод количественной инфракрасной спектрофотометрии,
по-видимому, также пригоден для решения некоторых практи-
ческих аналитических задач [189в]. Кэрол [29] и Моррис
с сотр. [139] использовали незначительные различия в спек-
трах витаминов D2 и D3 в интервале от 1000 до 950 см-1 для
их идентификации и одновременного определения. Относитель-
ное содержание этих витаминов можно рассчитать из графика
зависимости отношения поглощений (Л971—Л952) / (Л962—Л952)
от состава смеси. Погрешность измерения достигает ±15%, по-
этому метод пригоден лишь для анализа искусственных смесей
двух витаминов.

Описано также селективное определение витамина D2
в продуктах облучения эргостерина по полосе при 1170 см-1
[166].

Недавно Мищенко и др. [138] сообщили о количественном
анализе смеси четырех компонентов (витамин D2, эргостерин,
пероксид эргостерина и лумистерин), основанном на различии
в инфракрасных спектрах их 3,5-динитробензоатов в бромо-
форме в спектральном интервале 750—900 см-1. Концентрации
всех четырех индивидуальных компонентов были рассчитаны
на ЭВМ по величинам поглощения при восьми выбранных вол-
новых числах.

5.2.4.	ЯМР-СПЕКТРОСКОПИЯ

Спектроскопия протонного магнитного резонанса также при-
годна для дифференцирования и одновременного определения
витаминов D2 и D3. Метод ЯМР-спектроскопии намного более
точен, чем метод ИК-спектроскопии (разд. 5.2.3), основанный
на использовании небольших различий в ИК-спектрах обоих
витаминов. Для обоих витаминов в области спектра, относя-
щейся к олефиновому протону, появляются квадруплеты при
4,77—5,15 м. д. (протоны метиленовой группы при С19) и 5,8—
6,4 м. д. (Се и Су-протоны), но группа полос при 5,16—5,3 м. д.,
характерная для протонов двойной связи С22—С23 наблюдается
только в спектре витамина D2.

22 Заказ № 182
Используя парамагнитные сдвигающие реагенты, можно ре-
шать еще даже более сложные аналитические задачи. Цукида
и др. [209] сообщили о дифференцировании и одновременном
определении витамина D2 и семи родственных соединений по
ЯМР-спектрам их ацетилпроизводных до и после добавления
комплекса европия с дипивалоилметаном [Еи(брш)з]. Из
табл. 5.2 следует, что химические сдвиги сигнала ацетоксиме-
тильной группы всех изученных соединений очень близки между
собой, но путем добавления сдвигающего реагента можно до-
стичь поразительного их изменения. Этот метод пригоден для
установления структуры чистых материалов, а также для ре-
шения ряда практических количественных аналитических задач,
если с помощью внутреннего стандарта найти интегральную
интенсивность индивидуальных полос, полученных после добав-
ления сдвигающего реагента (например, можно определить со-
став витамина Di после термической изомеризации ацетата
витамина D2 и облучения ацетата эргостерина).

Таблица 5.2. Химические сдвиги б (м. д.) и относительные парамагнитные
сдвиги ацетоксиметильных групп ацетата витамина D2

и родственных соединений (60 МГц, ССЦ) по данным Цукида
и др. [209]

Соединение	Без сдвигающего реагента		В присутствии сдвигающего реа- гента Eu (dpm)3
	б, м. д.	врбр	$обр
		$ац.вит. D2	$ац. вит. D2
Ацетат витамина D2	1,96	1,00	1,00
5,6-транс-Витамин D2	1,93	0,98	0,71
Ацетат эргостерина	1,94	0,99	0,86
Ацетат лумистерина	1,98	1,01	1,23
Ацетат изовитамина D2	1,96	1,00	0,82
Ацетат изотахистерина	1,96	1,00	0,97
Ацетат тахистерина	2,00	1,02	1,00
			(1,05 в C6D6) •
Ацетат превитамина D2	1,95	0,99	0,80

5.2.5. ПОЛЯРОГРАФИЯ

Полярографическое определение витамина D2 основано на
восстановлении сопряженной триеновой системы до диеновой
на капающем ртутном электроде. Эта реакция, была изучена
Такахаши [196, 197], а также Майрановским и сотр. [129]. По-

* Молекулярное соединение витамина D2 и (лумистерина)2.
следние установили, что полярографический метод можно при-
менять для анализа продуктов облучения эргостерина [127]
и одновременного определения витаминов А и D2 [130] даже
в масляных препаратах [128]. Недавно Меникагли и др. [133]
для тех же целей разработали осциллополярографический ме-
тод. В этом случае масляные препараты разбавляли 1 %-ным
раствором бромида тетраэтиламмония в смеси изопропанола и
диметилформамида (1:1). Потенциал полуволны в указанном
фоне —2,52 В относительно насыщенного каломельного элек-
трода. Хотя витамин А также восстанавливается, осциллопо-
лярографический метод позволяет проводить одновременное
определение обоих витаминов.

5.2.6.	КОЛОНОЧНАЯ ХРОМАТОГРАФИЯ

Многие практически важные аналитические задачи в ана-
лизе витамина D можно решить только после предваритель-
ного хроматографического разделения. Важную роль в этой
области всегда играла колоночная хроматография. Сводку наи-
более известных аналитических методик, включающих стадию
предварительного разделения с помощью колоночной хромато-
графии, за последние 20 лет можно найти в табл. 5.3.

Хотя последние достижения в тонкослойной, газовой и вы-
сокоэффективной жидкостной хроматографии до некоторой
степени уменьшили значение классической колоночной хрома-
тографии, она все же остается важным средством отделения и
очистки витаминов D для последующего анализа. Продемон-
стрируем это на примере метода Мулдера и др. [140, 141],
представляющего усовершенствованный вариант методики из
фармакопеи XX США. Метод Мулдера включает следующие
стадии колоночной хроматографии. Сначала проводят хрома-
тографирование на колонке с оксидом алюминия, обработанным
фосфатом, в основном с целью отделения витамина D от боль-
ших количеств витамина Е. Образец, полученный после гидро-
лиза и экстракции, переносят на колонку в виде растворд в пе-
тролейном эфире. Промыванием колонки дополнительными пор-
циями петролейного эфира удаляют каротины, ангидровитамин
А и фенольные антиоксиданты. Последующим элюированием
8 %-ным раствором диэтилового эфира в петролейном эфире
удаляют витамин Е, а витамин D и сопутствующий ему вита-
мин А элюируют 30 %-ным раствором диэтилового эфира
в петролейном эфире. После этих операций на колонке оста-
ются полимеры витамина А. Затем проводят разделение ме-
тодом распределительной хроматографии. Остаток после вы-
паривания элюата с колонки, содержащей оксид алюминия,
22*
Таблица 5.3. Некоторые методы разделения витаминов D и родственных соединений с помощью колоночной
хроматографии

Автор	Год	Разделяемые соединения	Колонка	Элюент	Способ анализа
Шоу и Джефф- рис [176]	1957	Продукты облучения	Оксид алюминия	Петролейный эфир— ацетон (94 :6)	Уф-Спектрофото- метрия Колориметрия с SbCl3
Шмолл и др. [174]	1958	Витамины А и D	Флорекс XXS	Бензол	Колориметрия с SbCl3
Тейвагт и Кэмп- бэлл [202]	1959	Витамины А и D	Целит 545+ +ПЭГ 600	Изооктан	Колориметрия с SbCl3
Штрохекер и Пис [190]	1961	Витамины А и D	Кизельгур + поли- гликоль 400	Петролейный эфир	Колориметрия с SbCl3
Норман и Де-Лю- ка [149]	1963	Продукты облучения	Кремнекислота	Петролейный эфир— диэтиловый эфир (9:1)	УФ-Спектрофото- метрия + радио- изотопный
Баруа и Рао [11]	1964	Неомыляемая фракция рыбьего жира, витамин А+НС1->продукты де- гидратации витамина А	Оксид алюминия	Петролейный эфир	Колориметрия с SbCl3
Кобаяши [105]	1967	Продукты облучения	Оксид алюминия	«-Гексан—диэтиловый эфир (2:1) или гради- ентное элюирование н- гексаном—диэтиловым эфиром	УФ-Спектрофото- метрия
Мариани и- Мари- ани-Викари [131]	1968	Витамины А и D	Оксид алюминия	Петролейный эфир— бензол (9:1)	Колориметрия с SbCl3
Доллвет и Нор- ман [47]	1968	Витамины Da и D3	Фактис	Ацетон—вода (19:1)	УФ+радиоизотоп- ный

Автор	Год	Разделяемые соединения	Колонка	Элюент	Способ анализа
Хаусслер и др. [80]	1968	Метаболиты	Кремнекислота	Градиентное элюирова- ние: петролейный эфир->диэтиловый эфир-*метанол	Радиоизотопный
Осадча и Де-Рит- тер [154]	1968	Витамины D, А и Е в лекарственных препа- ПЯТЯ Y	MgHPO4	Петролейный эфир— диэтиловый эфир (7 : 3)	Колориметрия с SbC13
Белл и Кодичек [И]	1969	pd. 1 tlA  Метаболиты	Кремнекислота	Градиентное элюирова- ние: петролейный эфир-* диэтиловый эфир (3 : 1)->диэтиловый эфир-*метанол->70 %- ный водный метанол	Радиоизотопный
Суда и др. [194]	1969	25-ОН-витамин D2	Кремнекислота	Диэтиловый эфир— скеллизольв В	Радиоизотопный + спектрофотомет- рический
Такахаши и Яма- мото [198]	1969	Витамин D и его изо- меры	Оксид алюминия	16,5 %-ный раствор диэ- тилового эфира в пет- ролейном эфире	Колориметрия с SbCl3
Лоусон и др. [123]	1969	Метаболиты	Силикагель	Градиентное элюирова- ние: 5 %-ный раствор диэтилового эфира в петролейном эфире-*- петролейный эфир-*5 %- ный метанол в диэтило- вом эфире	Радиоизотопный
Вардинская [217]	1969	Препараты витамина D	Бентонит	Хлороформ	Колориметрия с SbCl3
Холик и Де-Люка [88]	1971	Метаболиты	Сефадекс LH-20	Хлороформ—петролей- ный эфир (13 :7)	Радиоизотопный
Автор	Год	Разделяемые соединения	Колонка	Элюент	Способ анализа
Мерме-Бувье [137]	1973	Продукты облучения	Силикагель + ок- сид алюминия (88: 12)	Диэтиловый эфир	УФ-Спектрофото- метрия
Эдлунд и Филип- пики [51]	1973	Поливитамины в таблет- ках	Оксид алюминия, обработанный фосфатом	Петролейный эфир— хлороформ (4:1)	Газовая хромато- графия
Мулдер и Де- Фрис [140]	1974	Препараты поливитами- нов	См. в тексте	См. в тексте	Колориметрия с SbCl3
Гарбо и Госсер [69]	1975	Препараты витамина D	Оксид алюминия или кремнекис- лота	Хлороформ	Колориметрия с СБзСООН
Виггинс [220]	1976	Витамины D, А и Е в пищевых продуктах и лекарственных препа- ратах	Сефадекс LH-20	Изооктан	Газовая хромато- графия
Стронг [191]	1976	Препараты поливитами- нов	Силанизирован- ный кизельгур	90 %-ный водный мета- нол	Колориметрия с SbCl3
Холасова и Блатт- на [87]	1976	Витамины D, А и Е в пищевых продуктах	Сефадекс LH-20	Хлороформ	УФ-Спектрофото- метрия
Кобаяши и Адачи [108]	1976	Препараты поливитами- нов	Оксид алюминия, обработанный фосфатом	30 %-ный раствор диэти- лового эфира в петро- лейном эфире	Газовая хромато- графия
Буиллон и'др. [23]	1976	Метаболиты	Сефадекс LH-20	Хлороформ—н-гексан (1:1)	Метод конкури- рующего связы- вания белка
Айсман и др. [55]	1976	Метаболиты	Сефадекс LH-20	Скеллизольв В—хлоро- форм—метанол (9 : 1 : 1)	Метод конкури- рующего связы- вания белка

Автор	Год	Разделяемые соединения	Колонка	Элюент	Способ анализа
Кобаяши и др. [Ю9]	1976	Рыбий жир	Целит 545+диги- тонин	«-Гексан	Газовая хромато- графия
Хаддад и др. [73]	1977	Метаболиты	Сефадекс LH-20	Хлороформ—н-гексан (65 : 35)	Метод конкури- рующего связыва- ния белка
Де-Леенхеер и Круил [39]	1977	Витамин D3 в плазме	Липидекс	Метанол	ГХ—МС
Соргье и Мираве [184]	1978	Витамин D3 и его мета- болиты, в том числе сульфаты в сыворотке крови	Сефадекс LH-20	Хлороформ—метанол (1:1)	УФ
Дельвин и др. [41]	1979	25-ОН-витамины D2 и D3 в сыворотке крови	Оксиалкоксипро- пил-сефадекс	Хлороформ—гексан— циклогексан (95 : 5 : 5)	УФ + радиоизо- топный
Хей и Джонс [81]	1979	Витамин D2 и его мета- болиты в плазме и тка- нях	Сефадекс LH-20	Хлороформ—гексан (3:2)	Радиоизотопный
Дрейер и Гудман [48а]	1981	Метаболиты в плазме	Сефадекс LH-20	Г ексан—хлороформ— метанол (9:1:1)	вэжх
Ламберт и др. [121а]	1981 .	Метаболиты	Липидекс 5000	Гексан—хлороформ (99 : 5)->(1 : 1)	У Ф + радиоизотоп- ный, конкурирую- щего связывания белка
растворенный в изооктане, переносят на колонку, заполненную
смесью целит 545 — полиэтиленгликоль 600. Для элюирования
также используют изооктан. Витамин D вымывается намного
быстрее витамина А. Фракцию, содержащую витамин D, сразу
переносят на колонку с деактивированным гранулированным
флорексом (фуллерова земля) для удаления последних следов
продуктов разложения витамина А и полиэтиленгликоля 600,
использованного для промывания колонки с целитом. С послед-
ней колонки витамин D элюируют бензолом. Последующие хи-
мические стадии получения окрашенного соединения с SbCh
описаны в разд. 5.2.2. (В отсутствие других жирорастворимых
витаминов хроматографические стадии можно опустить.)

5.2.7.	ТОНКОСЛОЙНАЯ ХРОМАТОГРАФИЯ

Тонкослойная хроматография является важным методом от-
деления витаминов D от других жирорастворимых витаминов
и стеринов, часто сопутствующих им в природных источниках
и лекарственных препаратах, а также служит методом отделе-
ния от фотоизомеров витамина D. Сведения о наиболее харак-
терных методах ТСХ суммированы в табл. 5.4.

Некоторые из рассмотренных в табл. 5.4 методов пригодны
и для более тонких разделений, например для разделения вита-
минов D или их отделения от витамина А и стеринов. В качестве
примера в табл. 5.5 приведены величины Rf для силикагеля, об-
работанного нитратов серебра, из работы Склана и Будовски
[181].

В табл. 5.6 приведены данные по разделению некоторых
фотоизомеров витамина D2, взятые из статьи Мерме-Бувье
[135].

Как следует из данных, приведенных в последнем столбце
табл. 5.4, многие из методов тонкослойной хроматографии при-
годны для предварительного разделения при спектрофотомет-
рических [2, 90, 93, 157, 167, 213], колориметрических [8, 20, 75,
144, 170, 195, 217], прямых денситометрических [113, 114] или
газохроматографических определениях [107, 182] *.

Витамины D чрезвычайно чувствительны к воздействию ат-
мосферного кислорода, следов кислот или щелочей, света
и тепла, особенно в адсорбированном состоянии на поверхности
полярного адсорбента. Для того чтобы устранить разложение,
появление продуктов разложения на хроматограммах и невос-

* Перед введением в практику тонкослойной хроматографии важную
роль в анализах витамина D играла хроматография на бумаге. В настоящее
время она используется очень редко, несмотря на то что позволяет прово-
дить даже более тонкие разделения метаболитов [15].
Определе- ние	Полу- количест- венное Радио - изотоп- ный
Обнаружение^(реагент) 		-	СР	I  -	•	СП	w	,	О	1	, СР  , c^j	g. н	-	оз	о	ч	, ~г	ср о	ЕГ  cP Н	О О	2	Ss	н	Lfi ।	ср	а к	Я ср	г*'  О О *Q< tj	У'	2 f—< щ <**> tj  •§•3	g«g°	«	5	Ч	“	&£££?§  S 5	•G’ о	и	Z	я	5*	О.	я к	>• ч	х  »	§3«®	1	“	§„	»  л к	н w	к	о я	к	о а о  I ьЗ Q 1 Lillig  СО ’6-0 < = X и СЛ	О	сё	С/Э	CL,	G 6 +	Я Я

Таблица 5.4. Некоторые методы ТСХ разделения витаминов D и родственных соединений

Растворитель (элюент)	.	я	.	о  2	6	2	2	~	с?	о _  н	я	§ я	о	§	о	••	К Sx  X-	Е?	Д	t_	хг	Я CCJ О  2	я	2 н	03	Й я ..  <Р	£	В4	1	я—.	я В СО  «	Ss	«	|3	S	§	fg<”'  §	2	8_	s	s ®  m	У .. 0,0.	§	“ tt	ra10	Q.'Oj^S	11^  I	S	1g	&	-e-ts  gog>	§-2^	§2- 2. SO-о ftg  g ••	§ н 2 <	У " s®	® ®	§	ss	2 s® 3
। Адсорбционный СЛОЙ'	§	=	+	+ ь  g 0.2	i? g ч Й 3s  CP	>4^	СР	СР	СР	4	CP co CP	CP co  s-	E? w	U,	f_	U	03 Ui О  я	3	оз оз	оз	оз оз	ccj  w	ч	w я	w	«=t w? w	wjz;  я	ОРЯ	ЯЯ	Я	Я Я tuO Я	Я be  Я	я Я w я Я	Я	я я я । Я	Я/1  О	Оя о и и о=и+и о +
Разделяемые соединения	н3	s^o	Q О »	я  В3 g «	§ a, s w за «  £ л s	2	2*о	я я £	£  о ся н	.	я^ср но	®	® о	СР  ° <	< -йя	О  -°®	2" СХ ® оз	д	-^Я	я  Q Я д. Q	®  «Q	я Q 2 0	я	0  з S	з	2 24	з з я з  я®	я	я	я	® я	®	я	я	я ® я	я  Я Я	Я	Я	Я	Й Я	X	Я	Я	Язя	я  5g S S	S	3 s Q.S	з  оз	я	оз	оз	оз	д	оз	Д	оз	оз д оз	оз  Я й	Я	Я	Я	<N я	£	я&я	я *§* я	я  CQ СХ	ей	0	000m	0	S	0	0>SpQ	0
Год	О	(МСМ	СО Tt<	Tf	TfLOlO	ю  СО	СО со	сОсО	со	сО СО СО	СО  о>	о>о	ОО	О	ООО	о  г—М	г—М	г—М	г—М	г—М	гН

CQ г—। СР

Я

и	сп

Я	е J

.tr
Автор	Год	Разделяемые соединения	Адсорбционный слой	Растворитель (элюент)	Обнаружение (реагент)	Определе- ние
Парек и Вассер- ман [157]	1965	Меченный тритием ви- тамин D3	Силикагель	Ацетон—гексан—мета- нол (15 : 135 : 3)	SbCl3	УФ- Спектро- фотомет- рия+ +радио- изотоп- ный
Богословский и др. [19]	1965	Витамин D и фотоизо- меры	Силикагель+ + AgNO3	Циклогексан—диэтило- вый эфир (1 :4), хлоро- форм—метанол (96 : 4)	Дибромфлуорес- цеин	—
Боллигер и Кёниг [20]	1965	Витамины D в лекарст- венных препаратах	Силикагель	Циклогексан—диэтило- вый эфир (1 : 1); цикло- гексан—этилацетат (3:1)	SbCl3, SbCl5, H2SO4	Колори- метрия с SbCl3
Штрохекер [188]	1966	Витамин и провитамин d2	Силикагель	Циклогексан—хлоро- форм—этанол (15 : 4: 1)	SbCl3	
Вашек и др. [213]	1967	Витамин D3 в лекарст- венных препаратах	Оксид алюми- ния	Хлороформ	УФ	УФ-  Спектро- фотомет- рия
Хашми и др. [77]	1967	Витамины D, А и Е	Силикагель, оксид алюми- ния	Бензол—петролейный эфир (4: 1); толуол— метилэтилкетон (99 : 1) и др.	HC1O4, H2SO4, SbCl5	
Пончон и'Феллере [167]	1968	Витамин D и стерины	Оксид алюми- ния	Хлороформ; петролей- ный эфир—бензол (1:1)	SbCl3, H2SO4, молибдофосфор- ная и вольфрамо- фосфорная кис- лоты	УФ- Спектро- фотомет- рия

Автор	Год	Разделяемые соединения	Адсорбционный слой	Растворитель (элюент)	Обнаружение (реагент)	Определе- ние
Ханвальд и др. [75]	1968	Витамин D3 и фотоизо- меры	Силикагель	Бензол—диэтиловый эфир (4 : 1)	УФ	Колори- метрия с SbCl3
Вардинская [217]	1969	Витамин D в лекарст- венных препаратах	Силикагель	Циклогексан—этилаце- тат (1:1)	УФ	Колори- метрия с SbCl3
Рихтер и Ропте [170]	1969	Витамины D, А и Е	Силикагель + +полиэтилен- гликоль	Петролейный эфир— бензол (1:1)	УФ	Колори- метрия с SbCl3
Пинелли и др. [165]	1969	Витамин D и стерины	Силикагель	Дихлорэтан—бензол— ацетон (9:9:2); ди- хлорэтан—метилизобу- тилкетон (9:1)	Родамин G, SbCl3	—
Мерме-Бувье [135]	1971	Витамин D2 и фотоизо- меры	Силикагель, оксид алюми- ния	См. табл. 5.6	SbCl3	УФ- Спектр о - фотомет- рия
Галечка и др. [66]	1972	Витамин D3, примеси, продукты разложения	Силикагель	Хлороформ или ди- хлорметан	H2SO4, SbCl3	—
VO

t5

a
s
$

Определе- ние	«2 _	д,	2 н-	«2 г*.	Я 5  Й Й 5	S н	s 5	я £ 5	н s  Я	।	i	1	кТ О О	ri ®	в ®	1	/*>  2 5	а> х д о-	о S -Q- А О Н м  « п	n Е S	2 ° Л У С  сч2 Чх £§£• ^u-e-S.
Обнаружение (реагент)	£	сь X3  о	«. 8	I	X  „	§	S	8	=F  х	1	В	ts*	°	I  Е	5	t=( о L >»  »		§•	°	s®°	5.	О  Л	Ох	5 ж С	V	СЛ  °	I п3	JsB	§:?	л	g	£  n.	G	СХ	х Ьь	>> X	U	>>
Растворитель (элюент)	• Л  <у 2	мп	6  #х ? 5	’® г:  3	®	‘г	® 2	Е	£  »•§“	е	।	«§	s	г  О о я	о>	— in	о>	5-z-^	О  3*0.0	5	gg	f-	g  °. § S	I	я—	g, х	х	1-22	ч  . „ м X	1	н	E-.CJ	со	5	X	X  *g * со	S	2 00	&	н	Я	со  §.“«	о.	?""	? g~	S	ЙО.	?	&  о Е о	о	1**	Е • •	5S	о> х	1	Ф  •eggs	-е-	As	§•	§«•	4Л	о  о х • °-	2 —	о;=-	о 1 50	2	2л	яс	ч  О* СО	О	СХ,’-'	Н	n Q. ..	^	0	><;  о SB^xx,	о..	<d ж	X X «г»	£	£ =®	я ••	£  *=3 о> ю о	/5 о	Н со	2 ’G’oo	|_г	>—г 3	Л* м*	г—т  X	л	<о	R	Пт	И	R
Адсорбционный слой	t	ёчччччч  3 со	3 «	£	<D	0)	0>  В§	IS	s	s	з	§	В	В  ч^“	ч	§	®	§	“	“  о +	о +	О	О	О	О	О	и	
Разделяемые соединения	•	•	<D	•	2 2  . ,	X	СО	X	Xi	ч 2  S	S	О	® ®	О.	® Ч  и	О-S «	g.	sg.	go	X §•  Q	*	d.	«	g.S ®5  “	< 8S 4	5	**3 o| Sg-  S	X	cgs	Ш	«§	eg	x и  я	„	q$Q	Q	„ И	Q 5	« 3  ?	ig	si s	s	i|	|§	|s  x	s»	so s	§ x	sSxgg	§2  s?	co	®	co	co	m	co cq	co o>	co	F3	r <->  О	H	О-1	H	S	н	X	Hq	Ь ч	ь	£x!	аС1ч-  '	x	2	X	s	X	x	S Оч	X	CO	S	co	25- co  S	CQ	о	CQ	X	CQ	S	CQ W	cQ т	сь	CQ	н	Rx
Год	CO	co	co	^O	о	ь-  о	о	c>	ex»	ст>	о	Ci  ч—Я	г—<	Ч—1	’—'	’—'
Автор	FT	S ч	•§	f  “	3	5	-	S	§	г-.  “	1	& <а  ci,	>>	<	х  ?	со	S	X		6ч  я	1—!	Я ST	s	К?  s	s	Е	я	^0°	а  <1>	СО	Н	со _	Я  Е	S	С	й	g -	х_-,  2	еП	S,		 с'—'	9п	Ч 00	Юг-	S  §	§00	ио?	§3	eg-	о-	оо	о  (_)	U —.	Н сч	02 х	।—<
Таблица 5.5. Отделение витаминов D от жирорастворимых витаминов
и стеринов (описание эксперимента см. в табл. 5.4) [181]

Соединение		Соединение	Rf
Витамин D2  Витамин D3 Спиртовая форма витамина А  D, L-a-Токоферол	0,35 0,42 0,17  0,69	Эргостерин Стигмастерин Холестерин	0,64 0,71 0,75

Таблица 5.6. Величины R/ витамина D2 и некоторых его изомеров [135]

Соединение	Адсорбент					
	тип T А12О3		тип Е А12О3		кизельгель	
	„ а система растворителей					
	Si	S2	s3	$4	s2	S3
Эргостерин Витамин Da (Тахистерин)2 (Лумистерин) 2 Превитамин D2	0,38  0,51  0,36  0,68	0,34  0,47  0,55  0,62	0,17  0,27  0,33  0,52	0,38  0,51  0,58  0,67	0,45  0,59  0,62  0,70	0,49  0,60  0,62  0,68

a Si — хлороформ : этилацетат (14 : 4); S2 — тетрахлорид углерода : ацетон (10 : 1);
S3 — бензол : ацетон (9 : 1); S4 — бензол : этилацетат (10 : 2,5).

производимые потери в процессе количественных определений,
очень важно принимать следующие меры предосторожности:

а)	работать в прохладном помещении;

б)	на протяжении всего процесса хроматографирования из-
бегать воздействия прямого солнечного света, а если зоны, ко-
торые необходимо элюировать, детектируют при УФ-облучении,
продолжительность облучения должна быть минимальной;

в)	желательно проводить хроматографирование в атмосфере
азота или вводить в растворитель антиоксидант;
г)	необходимо применять растворители высокой чистоты;

д)	для того чтобы устранить разложение витаминов D на
поверхности силикагеля, не следует высушивать образец, нано-
симый на слой адсорбента, т. е. помещать пластинку в хрома-
тографическую камеру сразу же после нанесения испытуемого
раствора, не высушивая его, и после разделения зон детектиро-
вать и элюировать опять-таки не высушивая [20].

5.2.8.	ГАЗОВАЯ ХРОМАТОГРАФИЯ

Если учесть низкую летучесть и высокую термическую не-
устойчивость витаминов D, то естественно предположить, что их
нельзя хроматографировать в исходном виде. Несмотря на это,
применение газовой хроматографии возможно, о чем свидетель-
ствует большое число статей, посвященных использованию га-
зовой хроматографии для решения различных практически важ-
ных аналитических задач. Эти работы можно разделить на две
группы.

а)	Витамины D вводят в газовый хроматограф без предва-
рительной химической обработки или в виде их триметилсили-
ловых эфиров или трифторацетатов. В этом случае, как описано
Зиффером и др. [227], в зоне испарителя хроматографа в ре-
зультате термической циклизации витамины D превращаются
в пирокальциферол и изопирокальциферол и поэтому дают
двойные пики. Поскольку отношение площадей пиков не зави-
сит от экспериментальных условий (температуры испарителя
и др.) в широком интервале и сумма площадей пиков или пло-
щадь одного главного пика хорошо коррелирует с исходной
концентрацией витаминов D, эта методика широко исполь-
зуется исследователями для решения различных аналитических
задач.

б)	Альтернативное решение состоит в изомеризации вита-
минов D в растворе перед проведением газохроматографиче-
ского определения. Эта задача детально изучена Найром.
и Де-Леоном [146], а также Кобаяши и Адачи [106]. Они на-
шли, что необходимым условием для протекания описанной
выше термической циклизации, приводящей к появлению двой-
ных пиков, является наличие 5,6-^ис-двойной связи (наряду
с витаминами D те же продукты образуют превитамины). Про-
изводные, содержащие 5,6-транс-двойную связь (5,6-транс-вита-
мины D, изовитамины D, тахистерины и изотахистерины), не
подвергаются циклизации и дают на хроматограмме единич-
ные пики. Превращение витаминов D в соответствующие изо-
тахистерины можно осуществить с помощью хлорида
сурьмы(III), хлорангидридов или ангидридов карбоновых кис-
лот в качестве катализаторов. (Муррей и др. [142], впервые
описавшие этот принцип, полагали, что единичный пик, полу-

Рис. 5.1. Разделение облу-
ченного раствора эргосте-
рина методом газовой хро-
матографии на стеклянной
колонке размером 180 смХ
Х2 мм, заполненной 3 %
ХЕ-60 на газохроме Q, при
температуре инжектора
260 °C, колонки 230 °C, ско-
рости потока гелия 30 мл/мин
(пламенно - ионизационный
детектор) [136].

/, 2, 3 — токсистерины; 4,
6—пиро- и изопировитами-
ны D2, образующиеся из ви-
тамина D2 в инжекторе; 5 —
(лумистерин)2; 7 — эргосте-
рин (провитамин D2); 8 —
(тахистерин)2.

ченный после изомеризации с помощью хлорида сурьмы (III)
принадлежит изовитамину D. Позднее было найдено, что изо-
меризация действительно протекает через стадию образования
этого интермедиата, но конечным продуктом является изотахи-
стерин [106].)

Теперь обсудим результаты и задачи, связанные с двумя
упомянутыми выше способами. В статье Зиффера и др. [227]
впервые описано появление двойных пиков для недериватизо-
ванных витаминов D. Мерме-Бувье [136] нашел, что этот метод
пригоден для разделения главных компонентов смеси, полу-
чающейся в результате облучения эргостерина. На неполярной
неподвижной фазе SE-30 (лумистерин)2 нельзя отделить от пи-
ровитамина D2, но на более полярной фазе ХЕ-60 четыре глав-
ных компонента и сопутствующие токсистерины (рис. 5.1) раз-
деляются вполне хорошо.
Найр и др. [145] изучили влияние реакций триметилсили-
лирования и трифторацетилирования на разделение витаминов
D2, D3 и родственных соединений. Некоторые полученные ими
результаты, суммированные в табл. 5.7, показывают, что

Таблица 5.7. Относительные времена удерживания а витаминов D
и родственных соединений в исходном виде и в форме
триметил си л и л- и трифторацетилпроизводных [145]

Соединение	Исходное	Трифторацетат	Триметилсилиловый эфир
Витамин D3	1,75б/1,99в	1,45б/1,70в	1,52б/2,22в
Витамин D2	1,97б/2,25в	1,68б/1,94в	1,69б/2,51в
Холестерин Дигидротахисте-	2,01	1,53	2,38
рин	2,13	1,25	1,90
Провитамин D3	2,23	1,59	2,62
Провитамин Da	2,48	1,80	2,85

а Относительно холестана (14,0 мин); температура колонки 225°С; неподвижная
фаза 6,7 % SE-52+3,3 ХЕ-60.

б «Пиропроизводные».

в «Изопиропроизводные».

с точки зрения разделения витаминов D2 и D3 предпочтительнее
триметилсилилирование. Эдланд и др. [52] использовали ви-
тамин D3 в качестве внутреннего стандарта при определении
витамина D2 в сложных по составу таблетках витамина в при-
сутствии ацетата витамина Е. В этом случае вычисления были
основаны на измерении высот пиков пировитаминов D2 и D3
(рис. 5.2). После триметилсилилирования Мерме-Бувье [134]
удалось на SE-30 разделить (супрастерины)2 I и II, а также
отделить их от пиро- и изопировитаминов D2.

Анализ витаминов D после триметилсилилирования описан
во многих других статьях. В качестве неподвижных фаз исполь-
зовали SE-30 [7, 62, 104, 134, 164, 227], сукцинат неопентил--
гликоля [227], OV-225 [64], OV-17 [61, 106, 108—111, 207],
ХЕ-60 [136], JXR [136], смешанную фазу из SE-52 и ХЕ-60
[145], дексил-300 [51, 52], OV-210 [50] и сукцинат бутандиола
[24, 216]. Силилирующими агентами служили БСТФА—ТМХС/
хлороформ [50—52], ГМДС—ТМХС/бензол—пиридин [64, 108,
109, 134], БСА—ТМХС/пиридин [102], N-триметилсилилпирро-
лидин [164] и М-метил-М-триметилсилилтрифторацетамид/пи-
ридин [64].

Разделение триметилсилиловых эфиров витаминов D и род-
ственных соединений на стеклянных капиллярных колонках,
заполненных OV-17, описано Кобаяши и др. [112].
Как уже упоминалось, Зиффер и сотр. [227] нашли, а Найр
и сотр. [145] подтвердили, что отношение площадей пиков пиро-
и изопировитаминов D лишь слегка изменяется при изменении
температуры. Совсем недавно Келлаф и сотр. [102] сообщили,
что при использовании цианосилоксановой фазы OV-275, темпе-
ратуру колонки и инжектора можно установить ниже 180°С.

Рис. 5.2. Разделение экстракта
таблетки поливитаминов, содер-
жащей витамин D2, методом газо-
вой хроматографии (после добав-
ления витамина D3 в качестве
внутреннего стандарта, очистки
с помощью колоночной хромато-
графии и триметилсилилирования)
на стеклянной колонке размером
180 смХ2 мм, заполненной 6 %
дексилом 300 на хромосорбе WHP,
при температуре инжектора 280сС,
колонки 265—280°С и скорости
потока гелия 30 мл/мин (пла-
менно-ионизационный детектор)
[12].

1,2 — пировитамины D3 и D2;
3, 4 — изопировитамины D3 и D2;
5 — ацетат витамина Е.

Хроматографирование силильного производного витамина D3
при этой температуре приводит к образованию почти исключи-
тельно пиропроизводного.

Главное преимущество каталитического превращения вита-
минов D в соответствующие изотахистерины (рис. 5.2) перед их
хроматографированием заключается в том, что в этом случае
наблюдается единичный пик, что очень важно при анализе
сложной смеси. В своей первой работе при определении вита-
минов D в биологических образцах Муррей и др. [142] посту-
пали следующим образом: осаждали стерины дигитонином, про-
водили разделение (из фильтрата) с помощью тонкослойной
хроматографии, элюировали хлороформом, обрабатывали 0,2 мл
хлороформного раствора 2 мл 20%-ного (масса/объем) рас-
твора хлорида сурьмы(III) в течение 1 мин, добавляли 3 мл
40%-ного (масса/объем) водного раствора винной кислоты
и экстрагировали петролейным эфиром. После этих операций
раствор можно вводить в газовый хроматограф, если в качестве
23 Заказ № 182
неподвижной фазы использовать силиконовое масло (3%).
Среди остальных компонентов витамины D2 и D3 хорошо раз-
деляются, так что они могут служить внутренними стандартами

Рис. 5.3. Разделение смеси ди-
гидротахистерина (пик 1) и ви-
тамина D2 (пик 2) [после
катализируемой хлоридом сурь-
мы (III) перегруппировки и
О-метилирования] методом га-
зовой хроматографии на стек-
лянной колонке размером
1,8 мХ2 мм, заполненной 2 %
QF-1 на газохроме Q, при тем-
пературе колонки 218°С [38].

при определении того или другого витамина. Де-Леенхеер
и Круил [38] исключили стадию экстракции петролейным эфи-
ром и после упаривания использовали хлороформный слой для
получения термически устойчивого метилового эфира (реакция
в эфире с метилхлоридом, катализируемая тр^т-бутилатом ка-
лия). На рис. 5.3 показаны результаты разделения витамина
D2 и (дигидротахистерина)2 после двухстадийной деривати-
зации.
Другим катализатором перегруппировки в изотахистерины
служит ацетилхлорид [177, 178]. Можно поступать иначе, эте-
рифицируя образующиеся изотахистерины с помощью трифтор-
уксусного ангидрида [180] или ангидрида гептафтормасляной
кислоты, что позволяет использовать высокочувствительный де-
тектор электронного захвата [220, 224].

Найр и Де-Леон [146] проводили перегруппировку в ди-
хлорэтане, используя в качестве катализатора хлорангидрид
гептафтормасляной кислоты. В этом случае продуктом реакции
является гептафторбутират соответствующего изотахистерина.
В качестве неподвижных фаз применяли OV-17 [220], силокса-
новый каучук W-98 [224], OV-1 [143] и JXR [177, 178].

Специфический метод дериватизации 24,25-диоксивитамина
D3 заключается в образовании циклического борнометилового
эфира за счет ^с-диольных групп. Если после этого дополни-
тельно провести триметилсилилирование по 3-оксигруппе,
можно успешно изучить метаболиты витамина D3 с помощью
капиллярной газовой хроматографии и ГХ—МС [74а].

5.2.9.	ВЫСОКОЭФФЕКТИВНАЯ ЖИДКОСТНАЯ ХРОМАТОГРАФИЯ

Высокоэффективная жидкостная хроматография — чрезвы-
чайно удобный метод решения практически всех задач, возни-
кающих в процессе количественного анализа витаминов D,
и в будущем важность этого метода, видимо, возрастет. При-
чина здесь в следующем:

а)	Высокая разрешающая способность ВЭЖХ позволяет
без каких-либо затруднений разделить практически все изо-
меры, предшественники и метаболиты витаминов D.

б)	Легкость отделения упомянутых выше соединений от
сопутствующих стеринов, жирорастворимых витаминов и т. п.
позволяет либо обойтись без стадий предварительного разделе-
ния и очистки, либо сократить их продолжительность.

в)	Нет необходимости в предварительной дериватизации*,
во время хроматографического разделения не наблюдается раз-
рушения или перегруппировки, как часто случается со многими
из этих соединений (чувствительными к нагреванию, атмо-
сферному кислороду и т. д.) в условиях газовой или тонкослой-
ной хроматографии (см. разд. 5.2.7 и 5.2.8).

г)	Практически все подлежащие определению производные
имеют высокие молярные коэффициенты поглощения в спек-
тральном интервале от 260 до 300 нм, что позволяет проводить
их обнаружение и количественное определение вплоть до нано-

* В порядке исключения Симарк и др. [1746] предложили доколоночное
превращение витаминов D и их метаболитов в производные изотахистерина,
тем самым вдвое увеличив чувствительность УФ-детектора.
граммовых количеств с помощью УФ-детектора, даже если этот
детектор настроен на единственную длину волны (254 нм).

Как следует из данных табл. 5.8, для разделения и опреде-
ления витаминов D в различных образцах широко исполь-
зуются адсорбционные и распределительные системы с обра-
щенными фазами.

Рассмотрим некоторые типичные хроматограммы. На хрома-
тограмме, взятой из статьи Цукида и др. [210] (рис. 5.4), пред-
ставлены результаты разделения девяти наиболее важных изо-
меров витамина D2. Прекрасное разделение показывает, что
этот метод как нельзя лучше подходит для анализа смолооб-
разных продуктов облучения. На рис. 5.5 приведена хромато-
грамма такого образца, взятая из статьи Тартивита и др. [199].

На другой хроматограмме тех же авторов [199] (рис. 5.6)
показана возможность отделения витамина D3 от других жиро-
растворимых витаминов.

0	Ю мин

I_____________J

Рис. 5.4. Разделение девяти изомеров витамина Ds ВЭЖХ на колонке 25 смХ
Х2,1 мм, заполненной зорбаксом SIL, при элюировании 0,15 %-ным раство-
ром метанола и 2 %-ным раствором диэтилового эфира в пентане (а) и 55 %-
ным раствором хлороформа в пентане (б) со скоростью элюирования
0,6 мл/мин (УФ-детектор, 254 нм) [210].

1 — а-нафтол (внутренний стандарт); 2 — 5,6-тра«с-витамин D2; 3 — изовита-
мин D2; 4 — превитамин D2; 5— (лумистерин)2; 6— (изотахистерин)2; 7—ви-
тамин D2; 8—(тахистерин)2; 9 — провитамин D2 (эргостерин).

Таблица 5.8. Определение витаминов D и их метаболитов ВЭЖХ	Замечания	Я <£>	CD	<D	(D	О	(У  О	соХч	о	о	О	Я	X  о	нхя	Я	я	я  о	° 2 cL	я	g сч я	я	я  to	Р4 н	«=: «	® я  S	g S	£ о»® £ а, 5  Ч	я ® §	Я S»-J s Я ®  ES.-e-ES.gg
	Элюент	.« в С?	co	1 Poo4	co 2 m T  о» cd g S я	S4	я I	co я X  « Й CO cd^u o— IS	s £ . О	«яя£«’“*  co’g’-
	Колонка	Д	do  g	go	co	О  •©«	У	о	о  co	Я	со	Я	Я  Я	Я	СО	О /-ч	со	СО  О. СО	Я	\о	Я О	\о	ю  < О	Д?	О	<	О	О  Q 	со	со <со со
	Образец	со	Qu 1  О	СО	CD	Ф СО <0  3	£	я	я	§	3	я	я  я	S	Р	я	я	2	2  я	и	У	2	»	со	«=:	сх  £	3	о	3	§	”	3	2	~	с  2	сх	®	«	я	о	2	о	&	3 со	со  о-®	2 я х	g	3	3  Sc	и Е?	Я е 5 Ef Р т	СО  ё g	«о5я	«5 g о g £ g	g  og-S2.E Е
	Разделяемые соединения	<f	П . я	О н	Q 3 о  ® я Я Я Ж. х со	Q н  -	tsi Я	Я	Я	CD с_	Я	®  го	ш s - 2	-	-S* 5 Е  ь-<	СО (Е	сч Я	СО Д’ ^4 ГО О	3  з	Oq>? QS	g  *2	Q я	S	з я н  Е я 3 „ ян Я	я s .  н я  Г§ ГН	по Я со	«Е со	СО Я	Я	L0  СО Ш	CQ m н со *х CQ н CQ я д РОя сч
	Год	^2	Ю	ю	о  2	ст»	сг	о
	Автор	&	।	. Сэ1  R	X	CD Я ’-ч  и	&  oo	PQ  я	g	s2w  3	я —1	сх	, •—।	я я  Я	®	« а>  Зет	§§.	Spr	gS  я сч	(хсч	g & £ os	S 2 §&  f^E.	не	За	Е(Ч	UJS
Автор	Год	Разделяемые соединения	Образец	Колонка	Элюент	Замечания
Хофсас и др. [86]	1976	Витамин D3 и его изомеры, тахисте- рин, витамин А Витамины D2 и D3 и их изомеры	Смолообразные продукты, масла, концентраты	Партисил 10PXS	1,6 %-ный раствор этанола в изоок- тане	Внутренний стан- дарт—/г-диметил- аминобензаль-
Тартивита и др. [199]	1976		Смолообразные продукты	р-Порасил	Хлороформ—гек- сан—тетрагидро- фуран	
Икекава и Кои- зум и [95]	1976	Витамин D и его метаболиты	Смесь стандартов	Зорбакс SIL	Градиент от 0,02 до 6 % метанола в дихлорметане	дегид
Цукида и др. [210]	1976	Витамин D2 и его изомеры	Смесь стандартов	Зорбакс SIL	0,15 %-ный рас- твор метанола, 2 %-ный раствор эфира в пентане, 55 %-ный раствор хлороформа в пен- тане или 10 %- ный раствор эфи- ра в гексане	
Томпсон и др. [205]	1977	Витамин D	Обогащенное мо- локо	Лихросорб  SI60	0,6—1 %-ный рас- твор 2-пропанола в гексане	Предварительное разделение на ок- сиалкоксипропил- сефадексе
Виггинс [221]	1977	Витамины D2 и D3, превитамины, изотахистерины	Смесь стандартов	Сферисорб  ODS	Метанол—вода (19: 1)	Предварительное разделение на си- ликагеле и целите
Коши и Ван- дер-Слик [116]	1977	25-ОН-витамины  D2 и D3	Сыворотка крови	Зорбакс ODS  Зорбакс SIL	Ацетонитрил—ме- танол—вода (94:3:3); 3 %- ный раствор 2-пропанола в гек- сане	

Автор	Год	Разделяемые соединения	Образец	Колонка	Элюент	Замечания
Коши и Ван- дер-Слик [117]	1977	25-ОН-витамин  D3	Печень, почки, мышцы	Зорбакс ODS	Ацетонитрил—ме- танол—вода (18:1:1)	Предварительное разделение на си- ликагеле и целите
Ламберт и др. [121]	1977	Витамины D2, D3 и их метаболиты	Плазма	р,-Бондапак С18	Градиентное элюирование сме- сью метанол— вода (3 :1)-> ->(19:1) 0,4 %-ный рас- твор этанола в хлороформе; ацетонитрил— метанол (1:1)	Предварительное разделение на се- фадексе LH-20
Рэй и др. [169]	1977	Витамин D3	Пищевые добавки	р.-Порасил, р,-Бондапак С18		Хроматография в системе с нор- мальными, а затем с обращенными фазами
Осадча и Ара- уджо [153]	1977	Витамины D2, D3 и другие жиро- растворимые ви- тамины	Готовые лекарст- венные формы	Видак, обра- щенные фазы	Метанол—вода (9:1)	
Гильбертсон и Стрид [70, 71]	1977	25-ОН-витамин  D3	Сыворотка	р,-Порасил	Гексан—этанол (19: 1)	Сравнение с мето- дом конкурирую- щего связывания белка
Айсман и др. [57]	1977	25-ОН-витамин  D2 и D3	Плазма крови	р,-Порасил	2,5 %-ный раствор 2-пропанола в гек- сане	Предварительное разделение на се- фадексе LH-20
Черне и Капи- тан© [208]	1977	Витамины D2 и D3	Смесь стандартов	ц-Бондапак С18	2,4 г нитрата се- ребра в 100 мл смеси метанола и воды  (86,5 : 13,5)	
Автор	Год	Разделяемые соединения	Образец	Колонка	Элюент	Замечания
Окано и др.  [152]	1977	Витамин D3	Кожа крысы	Зорбакс SIL	0,16 %-ный рас- твор метанола, 2 %-ный раствор эфира в пентане	Предварительное разделение на се- фадексе, внутрен- ний стандарт р-нафтол
Коши и Ван- дер-Слик [118]	1978	25-ОН-витамин D3	Плазма крови	Зорбакс ODS	Ацетонитрил—ме- танол—вода (18:1:1)	Предварительное разделение на це- лите
Хофсас и др. [85]	1978	Витамин D3 и его изомеры	Масла, смолооб- разные продукты, концентраты	Партисил 10РХ5	0,9 %-ный раствор этанола в изоок- тане	Сефадекс; сра- внение с методом конкурирующего связывания белка
Шафер и Голд- смит [173]	1978	25-ОН-витамин D3	Сыворотка крови	Порасил	Дихлорметан— 2-пропанол (49 : 1)	
Али [5]	1978	Витамин D3	Рыбий жир	Партисил 10PXS	Хлороформ—гек- сан—уксусная кис- лота (70 : 30 : 1)	Предварительное разделение на ко- лонке с флорек- сом XXS
Гендерсон и  Викроски [83]	1978	Витамин D	Обогащенное мо- локо	ODS-HC-SIL-  Х-1	Метанол—ацето- нитрил (1:1)	Предварительное разделение на ок- сиде алюминия
Долан и др. [46]	1978	Витамин D2 и другие жиро- растворимые ви- тамины	Таблетки	LDC RP-8	Метанол—вода (19: 1)	Автоматизирован- ная система
Эрикссон и др. [59]	1978	Витамины D2, А и Е	Таблетки	Микропак СН-10	2—20 %-ный рас- твор воды в мета- ноле	

Автор	Год	Разделяемые соединения	Образец	Колонка	Элюент	Замечания
Борсье и др. [21]	1978	Витамин D3	Масло земляного ореха	ц-Бондапак С18 Меркосорб SI-60	Ацетонитрил— вода (19: 1); гексан—амиловый спирт (399:1)	Сравнение с газо- вой хроматогра- фией
Стрид и Гиль- бертсон [193]	1978	25-ОН-витамины  D2 и D3	Сыворотка крови	Партисил PXS	Гексан—этанол (39:1)	Предварительное разделение на си- ликагеле и сефа- дексе LH-20
Ванхален- Фастре и Ван- хален [214]	1978	Витамины D2, D3 и их изомеры	Смолообразные продукты, масла, концентраты, таблетки	р,-Порасил	Петролейный эфир—дихлор- этан—тетрагидро- фуран (85 : 8 : 7)	
Джонс [99]	1978	Витамины D2 и , D3, 25-ОН-витами- ны D2 и D3	Плазма крови	Зорбакс SIL  Зорбакс ODS	и др.  5,5 %-ный раствор 2-пропанола в гек- сане, 91—98,5 %- ный раствор мета- нола в воде	Разделение в си- стеме с нормаль- ными, а затем с обращенными фазами
Маклеод и  Виггинс [126]	1978	Витамины А и D	Рыбий жир	Лихросорб SI-60	0,375 % -ный рас- твор амилового спирта в гексане	Внутренний стан- дарт для вита- мина D3—витамин п
Де-Фрис и др. [43]	1979	Витамин D3 и его изомеры	Концентраты	Лихросорб SI-60, лихро- сорб RP-18	0,3 %-ный раствор амилового спирта в гексане; ацето- нитрил—пропио- нитрил—вода  (79 : 15 : 6)	и2  Внутренний стан- дарт ;и-крезол Внутренний стан- дарт пропионат витамина D2
Автор	Год	Разделяемые соединения	Образец	Колонка	Элюент	Замечания
Эгаас и Лам- бертсен [53, 54]	1979	Витамин D3	Рыбные продукты	Партисил 10D 010, лих- росорб 10RP18	Гексан—2-пропа- нол (96 : 4) метанол—вода (95 : 5)	Разделение с нор- мальными, а затем с обращенными фазами (внутрен- ний стандарт— витамин D2)
Адачи и Ко- баяши [1]	1979	Витамин D3, 7-де- гидрохолестерин	Молоко	Зорбакс SIL	Метанол—эфир— пентан	Предварительное разделение на ди- гитонин-целите и тонком слое си- ликагеля
Кнапштейн и др. [103]	1979	Витамины D3 и А, превитамин D3	Корма	Партисил 10, бондапак Ci8	Г ексан—этанол (99 : 1); ацетонит- рил—метанол— вода (10 : 10 : 1)	Предварительное разделение в тон- ком слое оксида алюминия и сили- кагеля
Барнетт и  Фрик [9]	1979	Витамин D2, аце- таты витаминов А и Е	Таблетки	Фенил-jx-бон- дапак и р,-бон- дапак Cie	Разные градиент- ные программы с содержанием от 70 до 100 % мета- нола в воде	Внутренний стан- дарт бензоат хо- лестерина
Маккей и др. [125]	1979	Витамин D2 и другие жирорас- творимые вита- мины	Таблетки	Партисил 10	1,25 %-ный рас- твор 2-пропанола в циклогексане	Внутренний стан- дарт 4-оксибифе- нил
Пелк и Холмс  [161]	1979	Витамин D3 и его метаболиты	Плазма крови	Меркосорб SI-60	Дихлорметан—ме- танол (97 : 3)	Препаративное разделение
Ванхален- Фастре и Ван- хален [214а]	1979	1-(OH)-D3, 25-(OH)-D3, 1,25(OH)2-D3	Лекарственные препараты	Лихросорб  SI-60, р,-бон- дапак Cis	Дихлорэтан—пе г- ролейный эфир— тетрагидрофу- ран—пропанол	

Автор	Год	Разделяемые соединения	Образец	Колонка	Элюент	Замечания
Такеда и др. [195а]	1979	Витамин D3	Кожа крысы	Зорбакс SIL, зорбакс ODS	Гексан—2-пропа- нол (199 : 1) метанол—вода (197:3)	—
Гендерсон и Мак-Лин [83а]	1979	Витамины D2, D3	Обогащенное мо- локо, концентраты	Видак TP Cis	Ацетонитрил—ме- танол (9:1)	—
Шепард и др. [176а]	1979	Витамины D2, D3 и их метаболиты	Плазма крови	Зорбакс SIL, зорбакс ODS	Гексан—2-пропа- нол (99 : 1); мета- нол—вода (49 : 1)	Предварительное разделение на LH-20, метод кон- курирующего свя- зывания белка
Мулдер, Де-	1979	Витамины D2 и D3	Лекарственные	Лихросорб	Гексан—амиловый	Колонка для очи-
Фрис, Борсье и др. [42а, 43а, 140а, 141а]	1981		препараты	SI-60, парти- сил 5	спирт (997 : 3)	стки с RP-8; внут- ренний стандарт— 4,6-холестадиенол
Кано и др. [101а]	1979	Витамины D2, D3 и их метаболиты	Плазма крови	Зорбакс SIL	Дихлорметан— метанол (97,5 : 2,5)	Предварительное разделение на LH-20, метод кон- курирующего свя- зывания белка
Коэн, Лапойнт [34а]	1979	Витамин D3	Продукты пита- ния, премиксы	Лихросорб nh2	Гексан—хлоро- форм (7 : 3)	—
Матсуяма [1326]	1979	25-(OH)-D3	Плазма крови	Зорбакс ODS	Метанел—2-про- панол—вода (70 : 12 : 8)	Предварительное разделение на зор- баксе SIL
Автор	Год	Разделяемые соединения	Образец	Колонка	Элюент	Замечания
Барнетт и др. [9а]	1980	Витамины D2, D3+A, Е, К	Лекарства для детей, молочные продукты	Зорбакс ODS	Градиентное элюирование сме- сью метанол— этилацетат (86 : 14)—ацето- нитрил	Внутренний стан- дарт фенилацетат холестерина
Торбурн Бёрнс и Маккей [205а]	1980	Витамины D2+A, Е	Таблетки поливи- таминов	Партисил-10, партисил ODS	1,25 %-ный рас- твор 2-пропанола в циклогексане; метанол—вода (9:1)	Внутренний стан- дарт—4-оксибифе- нил
Уолкер и др. [216а]	1980	Витамины D2, D3	Лекарственные препараты	Силикагель  SI-5A	Гексан (частично насыщенный во- дой)— хлоро- форм—тетрагид- рофуран—уксус- ная кислота (40 : 60 : 1,5 : 0,4)	Внутренний стан- дарт—прогестерон
Мюллер-Муло и др. [144а]	1980	Эфиры жирных кислот витамина  D3	Рыбий жир	Лихросорб SI-60	Гексан с 0,05 % 2-пропанола или 0,18 % диоксана и 0,65 % диизо- пропилового эфи- ра	Предварительное ТСХ разделение

Автор	Год	Разделяемые соединения	Образец	Колонка	Элюент	Замечания
Набхольц и  Херфорт [1446]	1980	Витамин D	Диэтические про- дукты	Сферисорб  SI-5	Гексан—2-пропа- нол (99: 1)	—
Джонс [99а]	1980	Витамины D2 и D3 и их метабо- литы	Стандарты	Зорбакс SIL	Гексан—2-пропа- нол—метанол (87 : 10 : 3); гек- сан—этанол—хло- роформ (8:1:1)	—
Окано и др. .[151а]	1981	25-(OH)-D2, 25-(OH)-D3	Плазма крови	Зорбакс SIL	Гексан—2-пропа- нол (94,5 : 5,5)	Предварительное ВЭЖХ разделение на нуклеосиле С^
Дабек и др. [36а]	1981	25-(OH)-D2, 25-(OH)-D3	Плазма крови	Диоксид крем- ния (3 мкм)	Гексан—2-пропа- нол (1000:24)	Предварительное разделение на сеп- паке Cie
Джонген и др. [100а]	1981	Метаболиты	Плазма и сыво- ротка крови	Нуклеосил iono2	Гексан->гексан— 2-пропанол—вода (800 : 200 : 7)	Метод конкури- рующего связы- вания белка
Рис. 5.5. Разделение типичного смолообразного продукта облучения витамина
D3 ВЭЖХ на колонке размером 30 смХ4 мм, заполненной ц-порасилом при
элюировании смесью хлороформ—н-гексан—тетрагидрафуран (70 : 30 : 1) со
скоростью 1,0 мл/мин (УФ-детектор, 254 нм) [199].

/, 2— смолообразные примеси (прёдположительно превитамин D3 и (изотахи-
стерин)3); 3 — n-диметиламинобензальдегид (внутренний стандарт); 4 — (та-
хистерин)3; 5 — витамин D3.

Рис. 5.6. Разделение синтетической смеси жирорастворимых витаминов ВЭЖХ
в тех же условиях, что и на рис. 5.5 [199].

1 — пальмитат витамина А; 2 — ацетат витамина Е; 3 — ацетат витамина А;

4 — витамин Е; 5 — витамин D3.
Как уже упоминалось в разд. 5.1, в процессе получения ви-
таминов D между витаминами D и их превитаминами устанав-
ливается равновесие. Для расчета активности витамина D не-
обходимо принимать во внимание превитамины. Поскольку их
поглощение в УФ-области значительно ниже поглощения вита-

Рис. 5.7. Разделение гидрокси-
лированных метаболитов вита-
мина D3 ВЭЖХ на колонке раз-
мером 25 см X2,1 мм, заполнен-
ной зорбаксом SIL, при элюи-
ровании 2 % -ным раствором
метанола в дихлорэтане со ско-
ростью 0,4 мл/мин (УФ-детек-
тор, 254 нм) [95].

1 — витамин D3; 2— 24R-OH +
+ 24S-OH;	3 — 25-ОН; 4 —

1а-ОН; 5 — 24R,25-(OH)2; 6 —
la,24R- (ОН)2;	7 — la,24S-

(ОН)2; 5—la,25-(ОН)2.

минов D (см. табл. 5.1), площади пиков превитаминов, прежде
чем суммировать их с площадью пика витамина D, нужно ум-
ножить на соответствующий фактор [42а, 43а, 85, 140а, 205а,
216а]. Фактор пересчета находят из сравнения площадей пиков
стандартного раствора витамина D до и после нагревания до
80—90°С для установления равновесия.

Икекава и Коизуми [95] осуществили разделение восьми
гидроксилированных метаболитов витамина D3 (рис. 5.7). (Де-
тали этого метода см. в разд. 5.3.5.) Здесь упомянем только об
очень интересной находке, сделанной этими авторами. Они пока-
зали, что эпимерную пару 24R,25-(OH)2-D3 и 24S,25-(OH)2-D3,
которую как видно из рис. 5.7, в этих условиях разделить
нельзя, можно разделить после силилирования гидроксильных
групп с помощью ТМСИМ в гексане при 50°С в течение 20 мин.

На основании данных табл. 5.8 можно заключить, что
ВЭЖХ является не только простым методом разделения и ко-
личественного определения витаминов D: довольно часто она
применяется в комплексных аналитических методах. В допол-
нение к примерам, приведенным в табл. 5.8, упомянем еще два
метода. При анализе сухого молока для фракционирования
и очистки применяли патроны сеппак (Sep-Pak) и ВЭЖХ
колонку с диоксидом кремния, а анализ выполняли на колонке
с обращенной фазой, снабженной предохранительной колонкой
[346]. При определении витаминов D в маргарине [147а] ис-
пользовали последовательно две абсорбционные колонки и одну
колонку с обращенной фазой. С другой стороны, ВЭЖХ часто
применяют для очистки или разделения с целью последующего
анализа методом конкурирующего связывания белка, позво-
ляющим проводить одновременное определение гидроксилиро-
ванных метаболитов [За, 57, 70, 92а, 101а, б, 121а, 132а, 159а,
176а, 2006].

5.2.10.	МЕТОД КОНКУРИРУЮЩЕГО СВЯЗЫВАНИЯ БЕЛКА
И ДРУГИЕ РАДИОИЗОТОПНЫЕ МЕТОДЫ

В простейших случаях применения радиохимических мето-
дов меченые витамины D и родственные соединения используют
для проверки полноты экстракции или хроматографического
разделения. Некоторые примеры использования меченых произ-
водных при разделении с помощью колоночной хроматографии
были представлены в табл. 5.3. Другие примеры можно найти
в статьях Гильбертсона и Стрида [70], а также Айсмана и др.
[57], в которых описано определение 25-оксивитаминов D2 и D3
в сыворотке и плазме крови человека соответственно. В обоих
случаях анализ проводили методом ВЭЖХ после экстракции
и хроматографической очистки на колонках с кремнекислотой
и сефадексом соответственно. Перед экстракцией к пробе до-
бавляли меченные тритием 25-оксивитамины и полноту извле-
чения определяли с помощью жидкостного сцинтиллятора. Экс-
тракцию и предварительную хроматографическую очистку во
всех случаях, обсуждаемых в следующей части этого раздела,
посвященного определению витаминов D и их гидроксилирован-
ных производных в крови методом конкурирующего связывания
белка, проводят практически одинаково.

Для установления механизма реакций и путей метаболизма
в этой области, как и в некоторых других областях органиче-
ской химии, также применяются меченные изотопами соедине-
ния. Например, было найдено, что в процессе метаболизма
витамина D3 происходит потеря трития в положении 1, что сви-
детельствует о превращении 1-оксипроизводного в 1-кетопроиз-
водное [60]. Путем изучения методом ВЭЖХ меченных тритием
метаболитов витамина D3 и синтетических меченных тритием
гидроксилированных производных витамина D решена проб-
лема конфигурации при С-25 у 25,26-(ОН) 2-D3, образующегося
в организме человека [169а].

Наиболее важным и характерным радиоаналитическим ме-
тодом, применяемым для определения витаминов D, главным
образом их гидроксилированных производных в крови, яв?
ляется метод конкурирующего связывания белка. Чувствитель-
ность этого метода выше чувствительности ранее обсуждав-
щихся хроматографических методов, поэтому он пригоден для
Определения метаболитов в количестве нескольких нанограммов
в 1 мл, а в некоторых случаях и более низкого их содержания.
Высокая чувствительность, а также необходимость знать точ-
ное содержание этих соединений в крови привели к тому, что
за последние 10 лет по этому вопросу опубликовано чрезвы-
чайно большое количество статей. Объем настоящей книги не
позволяет провести детальное обсуждение всех статей (в боль-
шинстве случаев близких по содержанию), поэтому в свете по-
следних данных рассмотрим в общих чертах наиболее обще-
принятые методики. Они обычно включают следующие стадии:
а) Экстракция. К нескольким миллилитрам образца сы-
воротки или плазмы крови добавляют небольшое количество
меченного тритием определяемого метаболита (обычно в эта-
ноле). Полученный таким образом раствор либо экстрагируют
дихлорметаном [55, 56, 119], или смесью хлороформ—метанол
[73, 156], или смесью дихлорметан—метанол [23, 82], либо раз-
бавляют этанолом и центрифугируют [34, 48, 58, 63, 89, 101,
132, 150].

б)	Хроматография. Почти во всех методиках экстракты
подвергают хроматографированию на колонке. Одна из целей
этой стадии заключается в удалении сопутствующих липидов
перед добавлением связывающего белка. С другой стороны,
специфичность этих белков не достаточно высока, чтобы можно
было с нужной селективностью определять отдельные метабо-
литы. Отделение перед радиоизотопным анализом родственных
соединений с помощью колоночной хроматографии позволяет
решить эту проблему и сильно повысить воспроизводимость ре-
зультатов.

В ранних исследованиях обычно применяли колонки с крем-
некислотой (см. табл. 5.3), но сейчас это бывает значительно
реже [За, 58, 123а, 124, 132, 168]. В настоящее время чаще ис-
пользуют колонки с сефадексом LH-20 [23, 48, 49, 55, 56, 73,
В4, 89, 92, 1016, 119, 156, 178а, 179, 200, 201]. Соответствующие
фракции, полученные путем хроматографирования, после до-
бавления связывающих белков пригодны для анализа. Фрак-
связывания белка обсуждается в разд. 5.2.9.

ционнрование с помощью ВЭЖХ перед применением метода
Следует отметить, что, хотя обычно используют хромато-
графическую очистку, в случае определения только главного
метаболита (25-ОН-витамин D) описано несколько примеров
успешного проведения анализа без стадий хроматографирова-
ния [34, 63, 101, 150].

24 Заказ № 182
в)	Метод конкурирующего связывания. После хроматогра-
фической очистки анализируемую фракцию обычно упаривают,
растворяют в этаноле (около 0,05 мл) и смешивают с прибли-
зительно таким же объемом этанола, содержащего меченный
тритием метаболит. К смеси добавляют связывающий белок
(около 1 мл) в виде суспензии в фосфатном или диэтилбарби-
туратном буфере. Смесь (содержащую в особых случаях также
и добавки) инкубируют при комнатной или более низкой темпе-
ратуре примерно 1—2 ч. За это время устанавливается равно-
весие в местах специфического связывания белка между неме-
ченой и меченной тритием формами анализируемого метаболита.
Немеченый метаболит присутствует в более высокой концентра-
ции, меченный тритием метаболит, образующий комплекс с бел-
ком,— в более низкой. Концентрацию последнего измеряют
с помощью жидкостного сцинтилляционного счетчика после
удаления свободных стероидов центрифугированием в присут-
ствии пропитанного декстраном древесного угля, добавляемого
после инкубирования.

Концентрацию рассчитывают по градуировочному графику,
построенному аналогичным образом с известными количест-
вами определяемого метаболита. При вычислениях следует учи-
тывать количество меченного тритием соединения, добавлен-
ного перед экстракцией (для проверки правильности результа-
тов), и неспецифическое связывание (определяют отдельно).
На рис. 5.8 показана типичная калибровочная кривая, взятая
из статьи Тейлора и др. [201J.

Специфичность измерений сильно зависит от эффективно-
сти предварительного хроматографического разделения и спе-
цифичности связывающего белка. Наиболее часто применяе-
мые связывающие белки получают из сыворотки рахитичных
цыплят или крыс [48, 49, 92, 121а, 123а, 155, 156, 168], сыво-
ротки человека [За, 58, 179], плазмы крови больных остеомаля-
цией [101], почек рахитичных цыплят или крыс [84, 119, 124,
132, 150, 178а, 200, 201] или слизистой оболочки кишок или две-
надцатиперстной кишки рахитичных цыплят [55, 94, 132а]. Спе-
цифичность связывающих белков была подвергнута тщатель-
ному изучению. В качестве примера на рис. 5.9 приведены ре-
зультаты работы Тейлора и др. [201]. Здесь показано относи-
тельное количество меченного тритием 24,25-(ОН) 2-витамина
D3, связанного с цитозолом почек рахитичной крысы, в зависи-
мости от концентрации витамина D3 и различных метаболитов.
Очевидно, что витамин D3 и его 1,25-(ОН ^-производное прак-
тически не влияют на результаты определения 24,25-(ОН) 2-про-
изводного, но другие метаболиты, 25-ОН- и 25,26-(ОН) 2-соеди-
нения, мешают анализу, и их влияние можно устранить только
Рис. 5.8. Калибровочная
кривая для определения
24R,25- (ОН) 2-витамина D3
методом конкурирующего
связывания белка (связы-
вающий белок — цитозол
почки рахитичной крысы)
[201].

24R,25(OH)2-D3,hs

________[_________________|_________________I

10	Юг	103

Концентрация старина, нг

Рис. 5.9. Вытеснение меченного тритием 24,25-(ОН) 2-витамина D3 из цитозола
почки рахитичной крысы витамином D3 и его метаболитами [201].

J — витамин D3; 2 — 1,25-(ОН)2; 3 — 24S,25-(OH)2; 4~ 24R,25-(OH)2; 5 —
25-(ОН); £ — 25,26-(ОН) 2.
с помощью предварительного хроматографического фракциони-
рования, как описано выше.

Опубликовано лишь несколько статей, посвященных приме-
нению радиоиммунного анализа. Клеменс и др. [32а], а также
Пикок и др. [160а] получили антисыворотку при иммунизации
посредством 1,25-(ОН)2-О3-гемисукцината. С помощью этой
сыворотки, а также меченного тритием метаболита и модифи-
цированного декстраном древесного угля они определяли 1,25-
(ОН)2-витамин D в плазме.

5.2.11.	МАСС-СПЕКТРОМЕТРИЯ И РОДСТВЕННЫЕ МЕТОДЫ

Как и в случае других стеринов, масс-спектрометрия яв-
ляется ценным средством идентификации витаминов D. Из мно-
жества возможных примеров сошлемся на работы Окано и др.
[151] и Халкета и Лисбоа [74]. В первой статье продукты облу-
чения 7-дегидрохолестерина в коже крысы были идентифициро-
ваны с помощью ГЖ—МС после экстракции и очистки экс-
тракта методом ВЭЖХ. В другой работе идентификацию и ко-
личественное определение гидроксилированных метаболитов ви-
тамина D3 проводили (после триметилсилилирования) с по-
мощью капиллярной газожидкостной хроматографии и масс-
спектрометрии. Масс-спектрометрический метод определения
витаминов D в присутствии других жирорастворимых витами-
нов описан Цукида и Сакаи [211].

Чрезвычайно высокая селективность и чувствительность
этого метода могут быть использованы для решения разнооб-
разных проблем в анализе витамина D. Де Леенхеер и Круил
[39, 40] сообщили об определении витамина D3 в. плазме. После
экстракции, удаления стеринов осаждением в виде дигитонидов
и очистки на колонке с липидексом 5000 витамин D3, содержа-
щийся в пробе, с помощью гептафтормасляного ангидрида пре-
вращали в гептафторбутират (изотахистерина)3 (разд. 5.2.8),
а затем подвергали хроматографированию на колонке, запол-
ненной 1 % FFAP на газохроме Q. Для количественного опре-
деления были выбраны молекулярные ионы гептафторбутирата
(изотахистерина)3 (т/е 580) и гептафторбутирата (дигидрота-
хистерина)2 (внутренний стандарт; т/е 594). Этот метод позво-
ляет определить до 10 нг/мл витамина D3 в плазме.

Многие другие исследователи, применявшие масс-фрагмен-
тографический метод, превращали витамины D в триметилси-
лильные производные. Бъёркхем и Ларссон [18] определяли
витамин D3 в сыворотке крови человека. В качестве внутрен-
него стандарта они использовали витамин D2, а многоканаль-
ный детектор настраивали на т/е 325 и 337, соответствующие
М—131 пикам триметилсилилированных витаминов D3 и D2.
Бъёркхем и Холмберг [16] для определения 25-оксивитамина
в сыворотке после экстракции, хроматографирования на сефа-
дексе и триметилсилилирования в качестве внутреннего стан-
дарта применяли 26-тридейтерированное производное. Для ко-
личественного определения использовали ионные пары с т/е
131 и 134. Хотя они являются базовыми пиками в масс-спек-
трах, Витней и др. [219] нашли, что с точки зрения точности
определения лучше использовать интервал более высоких масс,,
пригодный для количественного определения других производ-
ных, как, например, ацетил- и трет-бутилдиметилсилильных
производных. При определении 1,25-диоксиметаболита в плазме
крови человека Бъёркхем и др. [17] применяли в качестве внут-
реннего стандарта 26-тридейтерированное производное. Газо-
хроматографическая колонка (как и в двух других работах)
была заполнена SE-30 на хромосорбе W, измерение проводили
по ионам при т/е 452 и 455, соответствующих отщеплению от
молекулярного иона двух триметилсилильных групп. Загалак
и др. [225] определяли витамин D3 и метаболиты в сыворотке
крови после разделения с помощью ВЭЖХ, используя в каче-
стве внутренних стандартов дейтерированные производные.

Всесторонне изученный масс-фрагментографический про-
филь концентраций витаминов D и их метаболитов был описан
Симарком и др. [174а]. После фракционирования и очистки на
липидексе 5000 и ТСХ витамин D3 и его метаболиты подвергали
катализируемой соляной кислотой перегруппировке и силили-
ровали до соответствующих триметилсилиловых эфиров (изо-
тахистерина)3, которые исследовали с помощью ГХ—МС
главным образом по его молекулярному иону, используя в ка-
честве внутреннего стандарта триметилсилиловый эфир (изота-
хистерина)2, полученный из витамина D2.

5.2.12.	ДРУГИЕ МЕТОДЫ

Грин [72] описал титрование витамина D3 трихлоридом
иода. В процессе титрования образуется гексахлорпроизводное
и конечную точку можно обнаружить фотометрически по окра-
ске освобождающегося иода.

В анализе витаминов D флуориметрия не играет столь за-
метной роли, как в анализе некоторых других стероидов. Чен
и др. [32] определяли витамины D в трихлорэтиленовом рас-
творе, используя в качестве реагента смесь уксусного ангидрида
и серной кислоты. Максимумы спектров возбуждения и испуска-
ния лежат соответственно при 390 и 470 нм.

Гергели и др. [67] описали количественный спектрополяри-
метрический метод определения витаминов D в масляных пре-
паратах.
5.3. ПРОБЛЕМЫ АНАЛИЗА ВИТАМИНОВ D

5.3.1.	КОНТРОЛЬ ЧИСТОТЫ КРИСТАЛЛИЧЕСКИХ ВИТАМИНОВ D

Контроль чистоты кристаллических витаминов D, т. е. опре-
деление точного содержания витамина D,— задача весьма труд-
ная. Из методов, описанных в разд. 5.2, УФ-спектрофотометрия
не пригодна для этой цели, поскольку примеси и продукты раз-
ложения также более или менее сильно поглощают вблизи
максимума поглощения витаминов D (265 нм). Поэтому различ-
ные фармакопеи, содержащие методики, основанные на измере-
нии поглощения, не рекомендуют УФ-спектрофотометрию в ка-
честве аналитического метода. Колориметрические методики,
описанные в разд. 5.2.2, ни по точности, ни по селективности для
этой цели не пригодны. Предварительное разделение с по-
мощью колоночной или тонкослойной хроматографии могло бы
устранить трудности, обусловленные низкой селективностью
УФ-спектрофотометрии и колориметрии. Но вместе с тем вве-
дение хроматографических стадий создает новый источник
ошибок, которые могут быть даже выше допустимых для на-
дежного метода. Кроме того, возникают дополнительные труд-
ности из-за чрезвычайно высокой чувствительности витаминов
D к воздействию внешней среды в процессе разделения с по-
мощью тонкослойной хроматографии (см. разд. 5.2.7). Следует
подчеркнуть, что многие из обсуждавшихся ранее методов,
'основанных на спектрофотометрии, колориметрии и др. в соче-
тании с разделением колоночной или тонкослойной хромато-
графией, чрезвычайно полезны для анализа готовых лекарствен-
ных форм, смолообразных продуктов облучения и т. п. В прин-
ципе эти методы пригодны и для анализа кристаллических
препаратов, если есть возможность одновременно анализиро-
вать надежный стандартный образец. Однако в силу указанных
выше причин к полученным результатам следует относиться
очень осторожно. Поэтому ни одна из фундаментальных фар-
макопей не содержит методик анализа витаминов D, а тонко-
слойная хроматография, если она вообще применяется, служит
лишь для идентификации и в лучшем случае для обнаружения
примеси провитамина D. Заслуживает внимания тот факт, что
фармакопея VIII Японии [163] рекомендует для решения по-
следней задачи реакцию с дигитонином. (Обладая структурой
.стеринов, провитамины осаждаются этим реагентом, а вита-
мины D им не осаждаются.)

Хотя работы, обсуждавшиеся в разд. 5.2.9, и не имеют от-
ношения к контролю чистоты кристаллических витаминов D,
можно с уверенностью предсказать, что при наличии подходя-
щего внутреннего стандарта высокоэффективная жидкостная
Хроматография станет для этих целей идеальным методом.

5.3.2.	АНАЛИЗ СМОЛООБРАЗНЫХ

И ДРУГИХ ПРОДУКТОВ ОБЛУЧЕНИЯ

Фотохимическое превращение провитаминов D в соответст-
вующие витамины и другие родственные производные можно
видеть на схеме 5.1. Поскольку и для промышленности, и для
биологии очень важно знать точные количества индивидуаль-
ных продуктов процесса изомеризации, этому основному во-
просу современной химии витаминов D посвящено большое чи-
сло публикаций.

Типичные смолообразные продукты облучения содержат ви-
тамин D2 или D3 вместе с соответствующим провитамином, пре-
витамином, лумистерином, тахистерином, изотахистерином
и некоторыми второстепенными компонентами, как, например,
супрастерин, токсистерин и т. д. Хотя одновременное определе-
ние главных компонентов можно выполнить методом ЯМР-
спектрометрии [209] и даже спектроскопическим методом
с меньшей разрешающей способностью, например УФ- [186] или
ИК- [138] спектроскопии, при использовании математических
приемов, без хроматографического разделения, этот способ
анализа, по-видимому, не получил широкого распространения.
Обычно при применении УФ-спектроскопии или колориметрии
для анализа продуктов облучения проводят предварительное
разделение с помощью колоночной [105, 137, 149, 176] или тон-
кослойной [75, 135] хроматографии.

Простейшими и наиболее надежными методами анализа
продуктов облучения в настоящее время являются газовая
и высокоэффективная жидкостная хроматография. С помощью
газовой хроматографии на неполярных [104, 134, 136, 227] или
более полярных [106, 108—111, 136] силоксановых фазах,
а в последнее время и на капиллярных колонках [112], можна
разделить все главные и второстепенные продукты облучения
(рис. 5.1), обычно после триметилсилилирования. Поэтому ГХ
широко используют и для анализа смолообразных продуктов,
и для изучения облученных смесей с целью нахождения опти-
мальных условий облучения (длина волны, продолжительность
облучения и т. д.).

Высокоэффективная жидкостная хроматография также при-
менима для решения всех задач, которые могут возникнуть при
анализе продуктов облучения [86, 187, 199, 210, 214] (рис. 5.4
и 5.5). Этот метод позволяет решить такую тонкую задачу, как
количественная оценка фотохимического превращения in viva
провитамина D3 в витамин D3 в коже крысы [152]. В этом:
случае (описано Окано и др.) облученную кожу обрабатывают
смесью хлороформа и метанола (1:1), экстракт выпаривают
досуха, гидролизуют этанольным раствором гидроксида калия,
экстрагируют бензолом, экстракт хроматографируют на сефа-
дексе и, наконец, анализируют с помощью ВЭЖХ на зорбаксе
SIL по методу Цукида и др. [210].

При использовании ВЭЖХ для количественного определе-
ния изомеров витамина D следует учитывать, что УФ-детектор
обладает сильно различающейся чувствительностью относи-
тельно отдельных производных. Согласно данным, взятым из
статьи Хофсаса и др. [86], относительные величины отклика
УФ-детектора при 254 нм в ряду D3 составляют: для витамина
D3 1,00, превитамина D3 0,586, провитамина D3 0,25, пировита-
мина D3 0,23, изопировитамина D3 0,20, (лумистерина)3 0,30,
(тахистерина)3 0,70, (изотахистерина)3 0,50.

J.3.3. ОПРЕДЕЛЕНИЕ ВИТАМИНОВ D

В ЛЕКАРСТВЕННЫХ ПРЕПАРАТАХ

Витамины D выпускаются в разнообразных лекарственных
формах: в виде масляных препаратов (вместе с витаминами А
и Е), капсул, водных суспензий, таблеток с высоким и низким
содержанием витамина D, таблеток поливитаминов и др.

Роль УФ-спектрофотометрии, основанной на измерении соб-
ственного поглощения, здесь весьма скромна. Метод применим
только в анализе простейших препаратов [189]; при анализе
более сложных препаратов необходимо предварительное хрома-
тографическое разделение [2, 3, 30, 62, 65, 90, 93, 147, 170],.

В анализе лекарственных препаратов витаминов D важную
роль всегда играли колориметрические методы. Детально это
•обсуждается в монографии Хашми [76]. Несмотря на все не-
достатки, связанные с различными источниками ошибок [33],
одним из наиболее распространенных методов в анализе лекар-
ственных форм является метод, основанный на реакции с SbCl3.
Проведению этой реакции обычно предшествует разделение
с помощью колоночной или тонкослойной хроматографии [22].
Данные о некоторых из этих методов приведены в табл. 5.3
и 5.4, а некоторые общие вопросы обсуждаются в разд. 5.2.2,
5.2.6 и 5.2.7.

Из методов, включающих предварительное разделение с по-
мощью колоночной хроматографии, наиболее современным
и важным является метод Мулдера и др. [140, 141] (см. с. 339
и 344). Из многочисленных статей, описывающих применение
тонкослойной хроматографии в сочетании с колориметрическим
определением по реакции с хлоридом сурьмы(III), особой осно-
вательностью отличается работа Боллигера и Кёнига [20],
в которой даны надежные методики анализа практически всех
видов препаратов. Эти исследователи не прибегали к стадии
омыления, избыток масла или других липидов удаляли разбав-
лением или экстракцией лекарственного препарата этанолом
и вымораживанием при охлаждении водой со льдом. После раз-
бавления водой смесь экстрагировали петролейным эфиром или
хлороформом и экстракт помещали на пластинку для тонко-
слойной хроматографии. После хроматографического разделе-
ния (детали см. в разд. 5.2.7 и табл. 5.4) зону, содержащую ви-
тамин D, экстрагировали хлороформом, экстракт выпаривали
досуха в вакууме и проводили реакцию с хлоридом
сурьмы(III)—ацетилхлоридом в среде хлороформа. Поправку
на фоновое поглощение вводили, ингибируя развитие окраски
с помощью уксусного ангидрида [222]. Через 10—20 с после
добавления реагента измеряли поглощение при 500 нм. В зави-
симости от вида лекарственной формы продолжительность ана-
лиза (два параллельных определения) колеблется от 3 до 7 ч,
относительное стандартное отклонение составляет 1,8—2,7%.

Недавно опубликованные методы Амера и др. [6] и Гарбо
и Госсера [68, 69] в некоторых простых случаях, по-видимому,
наиболее выгодны по сравнению с многочисленными другими
колориметрическими методами, описанными ранее в литературе
и частично обсуждавшимися в разд. 5.2.2. Амер и др. [6] изме-
ряли интенсивность зеленовато-голубой окраски (Zmax 685 нм),
получаемой при обработке примерно 0,3 мг витамина D в 2 мл
метанола в течение 1 мин с помощью 0,6 мл 1 %-ного мета-
нольного раствора анисового альдегида и 1,25 мл серной кис-
лоты (добавляют по каплям), разбавлении смеси до 25 мл
10 %-ным (по объему) раствором серной кислоты в метаноле
и выдерживании в течение 20 мин. Хотя чувствительность этой
реакции в 3—4 раза ниже чувствительности реакции с хлори-
дом сурьмы(III), устойчивость реагента и развивающейся окра-
ски здесь намного выше, и поэтому такой метод пригоден при
анализе масляных препаратов для инъекций (не содержащих
других витаминов) после щелочного омыления и экстракции
эфиром без каких-либо хроматографических разделений.

Гарбо и Госсер [68, 69] также определяли витамин D2 в таб-
летках в отсутствие витамина А. При анализе таблеток с вы-
соким содержанием препарата определение основано на изме-
рении поглощения при 403 нм в смеси хлороформа и трифтор-
уксусной кислоты (4:1) [33] после очистки на хроматографи-
ческой колонке с диоксидом кремния. При анализе таблеток
с низким содержанием витамина применяли хроматографиче-
скую колонку с оксидом алюминия, а отношение хлороформа
и трифторуксусной кислоты брали равным 1 : 1 (Хтах = 490 нм).
В этом случае фоновое поглощение устраняли, добавляя после
измерения поглощения анализируемого раствора пероксид во-
дорода для разрушения окрашенного комплекса. Поглощение
полученного раствора вычитали из результатов первого изме-
рения.

Для определения витаминов D в лекарственных препара-
тах описаны и различные другие методы, например полярогра-
фия [128, 130, 133], денситометрия тонкослойных хроматограмм
[113, 114] и спектрополяриметрия [67], но наиболее распро-
страненными и современными методами в этой области яв-
ляются газовая и высокоэффективная жидкостная хромато-
графия.

Газовая хроматография позволяет решить практически все
проблемы в анализе препаратов витамина D. Успешное приме-
нение нашли оба варианта, описанные в разд. 5.2.8 (превраще-
ние триметилсилилированных витаминов D в их пиро- и изопи-
ропроизводные [50—52, 62, 107—109, 185] и предварительное
превращение в гептафторбутираты изотахистерина [158, 220]).

Анализировать можно и твердые лекарственные формы,
и масляные препараты. Газовая хроматография позволяет от-
делить витамин D от сопутствующих веществ, таких, как дру-
гие жирорастворимые витамины, стерины и т. п., но поскольку
они часто присутствуют в большом избытке, то для получения
надежных результатов обычно необходимы предварительное
омыление и экстракционная или хроматографическая очистка
экстракта на колонке и в тонком слое.

Как было показано на рис. 5.6, с помощью ВЭЖХ можно
легко отделить витамины D от других жирорастворимых вита-
минов, что позволяет проводить определение витамина D в ле-
карственных формах. Вильямс и др. [223], Стейерл [187],
а также Томпкинс и Черне [206] показали, что витамин D
можно определить в капсулах в присутствии больших коли-
честв спиртовой формы витамина А и ацетата витамина А или
ацетата и сукцината витамина Е после простой экстракции
и без хроматографической очистки экстрактов. Хофсас и др. [86]
определяли витамин D3 в масляных препаратах и сухих кон-
центратах, содержащих витамин А. В этих случаях предвари-
тельная хроматографическая очистка не применялась, но при
анализе сухих концентратов необходимо проводить гидролиз
и экстракцию. Некоторые выдержки из этих статей можно найти
в разд. 5.2.9. В заключение можно сказать, что разрешающая
способность ВЭЖХ и чувствительность УФ-детектора вполне
достаточны для решения практически всех задач, которые могут
возникнуть при анализе лекарственных форм витамина D. Ста-
дии предварительной очистки образца можно свести к мини-
муму, и это позволяет надеяться, что значение ВЭЖХ в дан-
ной области будет быстро расти.
5.3.4.	ОПРЕДЕЛЕНИЕ ВИТАМИНОВ D
В ПИЩЕВЫХ ПРОДУКТАХ

Определение витаминов D в различных пищевых продуктах
описано во многих статьях; большинство их посвящено анализу
рыбьего жира (жир печени тресковых) и молока.

Али [4] описал метод определения витамина D3 в жире пе-
чени трески, основанный на колориметрической реакции с хло-
ридом сурьмы(III) после гидролиза, экстракции, осаждения
стеринов дигитонином и отделения от других липидов колоноч-
ной и тонкослойной хроматографией. Наиболее распространен-
ными методами анализа жира печени трески являются газовая
и высокоэффективная жидкостная хроматография. Метод Белла
и Христи [12] включает омыление, экстракцию, колоночную
хроматографию на сефадексе и флорисиле, осаждение стери-
нов дигитонином и газовую хроматографию после превращения
в триметилсилильные эфиры (изотахистерина)з, причем внут-
ренним стандартом служит витамин D2. Этот же внутренний
стандарт, а также сходную методику очистки использовали
Хоммес и Деккер [91]. Основное отличие заключается в том,
что в колоночной хроматографии они применяли колонки с ок-
сидом алюминия и с целитом 545—полиэтиленгликолем 600,
а также включали стадию разделения методом тонкослойной
хроматографии. Перед проведением газохроматографического
определения на OV-1 витамин D3 и в этом случае превращали по
методу Муррея и др. [142] в (изотахистерин)3, Кобаяши и др.
[Ю9] после омыления и экстракции применяли колоночную
хроматографию на целит-дигитонине и тонкослойную хромато-
графию на силикагеле. После триметилсилилирования прово-
дили газохроматографический анализ на OV-17 и определяли
отношение площадей пиков пиро-П3-производного и внутрен-
него стандарта холестерина.

Газовая и высокоэффективная жидкостная хроматография
являются основными методами определения витаминов D в мо-
локе и других молочных продуктах [13, 24, 45]. Подготовка,
очистка и дериватизация пробы проводятся так же, как в об-
суждавшихся выше методиках. Toy и др. [207] применяли газо-
хроматографический метод для анализа пищевых концентратов.

Анализ молока можно выполнять и колориметрическим ме-
тодом с хлоридом сурьмы (III), если достаточно хорошо очи-
стить экстракт, полученный после омыления. С этой целью
Паналакс [159] использовал не менее четырех колонок (целит-
дигитонин, целит-полиэтиленгликоль, оксид алюминия и кремне-
кислота). Занобиби и др. [226] также применяли колориметри-
ческий метод с хлоридом сурьмы (III) для определения
витамина D в фруктах после разделения методом тонкослойной
хроматографии.

Мюллер-Муло и др. [144] определяли соотношение свобод-
ного и этерифицированного витамина D3 в жире печени трески,
используя вымораживание, ТСХ и колориметрию.

В результате чрезвычайно быстрого развития в последние
годы ВЭЖХ стала стандартным методом определения витами-
нов в пищевых продуктах и кормах. Некоторые подробности
можно найти в разд. 5.2.9 [1, 5, 9а, 21, 34а, б, 53, 54, 83, 103,
126, 144а, 147а, 169, 195а, 205].

5.3.5.	ОПРЕДЕЛЕНИЕ ВИТАМИНОВ D
И ИХ МЕТАБОЛИТОВ В КРОВИ

Метаболизм витаминов D включает гидроксилирование
стероидного ядра по Ci и боковой цепи по С24, С23 и С2е; глав-
ными метаболитами являются 25-ОН- и 1а,25-(ОН ^-производ-
ные. В табл. 5.9 перечислены метаболиты витамина D3 [95].

Определение витаминов D в биологических образцах с по-
мощью колоночной и газовой хроматографии описано во мно-
гих статьях, часть из них обсуждалась в разд. 5.2.6 и 5.2.8.

Если цель анализа заключается в одновременном определе-
нии метаболитов, предпочтение перед прочими хроматографиче-
скими методами следует отдать ВЭЖХ. Как показано в рабо-
тах Джонса и Де-Люка [100], а также Икекава и Коизуми [95],
можно легко разделить почти все метаболиты и чувствитель-
ность обнаружения позволяет решить большую часть практиче-
ски важных задач. Коши и Ван-дер-Слик [115] описали опре-
деление порядка 50 нг/мл 25-OH-D3 в плазме крови коровы
после очистки пробы распределительной и колоночной хрома-
тографией на силикагеле. Гильбертсон и Стрид [70] применили
аналогичную методику очистки при определении того же мета-
болита в сыворотке крови человека. Разделение проводили
ВЭЖХ на силикагеле с частицами микронного размера
и смесью гексан—этанол (95:5). Айсман и др. [57] при опре-*
делении 25-13-D2 и 25-OH-D3 в плазме крови человека после
очистки экстракта плазмы на колонке с сефадексом осущест-
вляли хроматографию с прямой фазой.

Для определения витаминов и метаболитов в крови при-
годна также и масс-фрагментография. Это было показано во
многих работах [16—18, 39, 40, 174а, 219, 225], обсуждавшихся
в разд. 5.2.11.

Наиболее чувствительным и поэтому наиболее эффективным
и распространенным методом определения метаболитов вита-
мина D в крови является радиоизотопный метод конкурирую-
щего связывания белка. В большинстве статей, посвященных

а	ехх'хгехххехех: о
а	trxrrrirrrrrx  0	000000
	rrrnrrxrixrrxi 0	0	00
а	ЕДЕХГГХЕХДЕЩД О	О	ОО
а	Х.ХЕХХХХХХХХЖГ  О	ООО	ОО
использованию этого метода, рассматривается определение ме-
таболитов витамина D3, являющегося природным витамином
в организме млекопитающих. Большая часть описанных мето-
дик ставит целью определение главного метаболита 25-OH-D3
[15, 23, 34, 48, 49, 58, 63, 89, 94, 101, 123а, 124, 132, 150, 155.
156, 168, 179] и la,25-(OH)2-D3 [15, 26, 55, 56, 84, 94], но опуб-
ликованы и методы селективного определения 24,25-(ОН )2-D3
[15, 73, 89, 92, 119, 178а, 200, 201] и 25,26-(ОН) 2-D3 [15, 92].
Определение метаболитов витамина D выполняют после раз-
деления с помощью ВЭЖХ [За, 57, 70, 101а, 6s 132а, 176а.
2006]. Некоторые детали теории и практики этих методов затро-
нуты в разд. 5.2.10.

ЛИТЕРАТУРА

1.	Adachi A., Kobayashi Т. J. Nutr. Sci. Vitaminol., 1979, v. 25, p. 67.

2.	Adamski	R., Sawicka J. Farm.	Polska,	1970, v.	26,	p.	131.

3.	Adamski	R.f Sawicka J. Herba	Polska,	1974, v.	20,	p.	57.

3a. Aksnes L. Clin. Chim. Acta, 1980, v. 104, p. 147.

4.	AU S. L.	Z. Anal. Chem., 1972,	v. 262,	p. 278.

5.	AU S. L.	Z. Anal. Chem., 1978,	v. 293,	p. 131.

6.	Amer M. M., Wahbi A. M., Hassan S. M. Analyst, 1975, v. 100, p. 238.

7.	Avioli L. V., Lee S. W. Anal. Biochem., 1966, v. 16, p. 193.

8.	Baczyk S.f Baranowska K., Jakubowka W„ Sobisz J. Z. Anal. Chem.,
1971, v. 255, p. 132.

9.	Barnett S. A., Frick L. W. Anal. Chem., 1979, v. 51, p. 641.

9a. Barnett S. A., Frick L. W., Baine H. M. Anal. Chem., 1980, v. 52, p. 610.

10.	Bartos J., Pesez M. Colorimetric and Fluorimetric Analysis of Steroids.
Academic Press. London, New York, San Francisco. 1976, pp. 105—115.

11.	Barua R. K., Rao M. V. K. Analyst, 1964, v. 89, p. 534.

12.	Bell J. G., Christie A. A. Analyst, 1973, v. 98, p. 268.

13.	Bell J. G., Christie A. A. Analyst, 1974, v. 99, p. 385.

14.	Bell J. G., Kodicek E. Biochem. J., 1969, v. 115, p. 663.

15.	Bikie D. D., Rasmussen H. Biochem. Biophys. Acta, 1974, v. 362, p. 425.

16.	Bjorkhem	I.,	Holmberg I. Clin. Chim. Acta,	1976, v.	68,	p.	215.

17.	Bjorkhem	L,	Holmberg I., Kristiansen T.,	Pedersen	J.	I.	Clin. Chem.»

1979, v. 25, p. 584.

18.	Bjorkhem	L,	Larsson A. Clin. Chim. Acta,	1978, v.	88,	p.	559.

19.	Богословский	H. А., Шнайдман Л. О., Кузнецова	E.	H.	Мед. пром. *

СССР, 1965, т. 19, с. 41.

20.	Bolliger Н. R., Konig A. Z. Anal. Chem., 1965, v. 214, p. 1.

20a. Bolliger H. R., Borsje B. Pharm. Acta Helv., 1980, v. 55, p. 274.

21.	Borsje В., Craenen H. A. H, Esser R. J. E., Mulder F. J., De Vries E. J.

J. Ass. Off. Anal. Chem., 1978, v. 61, p. 122.

22.	Borup I. Pharm. Ind.‘, 1971, v. 33, p. 12.

23.	Bouillon R., Van Kerkhove P., De Moor P. Clin. Chem., 1976, v. 22,
p. 364.

24.	Brendal R.f Janecke H. Z. Anal. Chem., 1972, v. 258, pp. 114,- 118.

25.	Brockmann H., Chen Y. H. Hoope-Seyler’s Z. Physiol. Chem., 1936, v. 241,
p. 129.

26.	Brumbaugh P. F., Haussler M. R. J. Biol. Chem., 1975, v. 250, p. 1588.

27.	Campbell J. A. Analyt. Chem., 1948, v. 20, p. 766.

28.	Campion T. H., Dilley S. Anal. Letters, 1973, v. 6, p. 139.
29.	Carol J. J. Pharm. Sci., 1961, v. 50, p. 457.

30.	Cerny J. Ceskoslov. Farm., 1971, v. 20, p. 103.

31.	Chen P. S. Analyt. Chem., 1965, v. 37, p. 301.

32.	Chen P. S., Terepka A. R.f Lane K- Anal. Biochem., 1964, v. 8, p. 34.
32a. Clemens T. L., Hendy G. N., Graham K. F., Baggliolini E. G., Uskoko-
vic M. R„ O’Riordan J. L. H. J. Endocrinol., 1978, v. 77, p. 49.

33.	Clements J. A., Fober J. Olliff C. J., Rogers A. R. J. Pharm. Pharmacol.,
1967, v. 19, p. 103.

34.	Coen G., Lucentini G., Gallucci G., Bagni A. Acta Endocrinol., 1977,
v. 85, Suppl. 200.

34a. Cohen H., Laponite M. J. Chromat. Sci., 1979, v. 17, p. 510.

346. Cohen H., Wakeford B. J. Ass. Off. Anal. Chem., 1980, v. 63, p. 1163.

35.	Copius-Peereboom J. W., Beekes H. W. J. Chromat., 1962, v. 9, p. 316.

36.	Copius-Peereboom J. W.t Beekes H. W. J. Chromat., 1965, v. 17, p. 99.

36a. Dabek J. T., Harkonen M., Wahlross O„ Adlercreutz H. Clin. Chem.,
1981, v. 27, p. 1346.

37.	Davidek L, Blattnd J. J. Chromat., 1962, v. 7, p. 204.

38.	De	Leenheer	A.	P.,	Cruyl	A. A. M. J. Chromat. Sci., 1976, v.	14, p. 434.

39.	De	Leenheer	A.	P.,	Cruyl	A. A. M. Quantitative Mass Spectrometry in

Life Sciences. Elsevier. Amsterdam, 1977, p. 165.

40.	De	Leenheer	A.	P.,	Cruyl	A. A. M. Anal. Biochem., 1978, v.	91, p. 293.

41.	Delvin E. E., Glorieux F.	H., Dussault M., Bourbonnais R.,	Watters G.

Med. Biol., 1979, v. 57, p. 165.

42.	De Vries E. J., Mulder F. J., Borsje B. J. Ass. Off. Anal. Chem., 1977,
v. 60, p. 989.

42a. De Vries E. J., Mulder F. J., Borsje B. J. Ass. Off. Anal. Chem., 1981,
v. 64, p. 61.

43.	De Vries E. J., Zeeman J., Esser R. J. E., Borsje B., Mulder F. J. J. Ass.
Off. Anal. Chem., 1979, v. 62, p. 129.

43a. De Vries E. J., Zeeman J., Borsje B., Mulder F. J. J. Ass. Off. Anal.
Chem., 1979, v. 62, p. 1285.

44.	De Witt J. B., Sullivan M. X. Ind. Eng. Chem. Anal. Ed., 1946, v. 18,
p. 117.

45.	Dickes G. J., Nicholas P. V. J. Ass. Publ. Anal., 1972, v. 10, p. 87.

46.	Dolan J. W., Gant I. R.f Tanaka N., Giese R. W., Karger B. L. J. Chro-
mat. Sci., 1978, v. 16, p. 616.

47.	Dollwet H. H., Norman A.	W. Acta Biochem.,	1968, v. 25,	p. 297.

48.	Dorantes L. M., Arnaud S.	B., Arnaud	C. D.,	Kilgust K-	A. J. Lab.	Clin.

Med., 1978, v. 91, p. 791.

48a.	Dreyer В. E., Goodman D.	В. P. Anal.	Biochem., 1981, v.	114, p. 37.

49.	Edelstein S., Charman M.,	Lawson D.	E. M.t	Kodicek E.	Clin. Sci.	Mol.

Med., 1974, v. 46, p. 231.

50.	Edlund D. 0., Anfinsen J. R. J. Ass. Off. Anal. Chem., 1970, v. 53, p. 287.

51.	Edlund D. 0., Filippini F. A. J. Ass. Off. Anal. Chem., 1973, v. 56,
p. 1374.

52.	Edlund D. O.f Filippini F. A., Datson I. K. J. Ass. Off. Anal. Chem.,
1974, v. 57, p. 1089.

53.	Egaas E., Lambertsen G. Internal. J. Vit. Nutr. Res., 1979, v. 49, p. 35.
54. Egaas E.f Lambertsen G. J. Am. Oil Chemists Soc., 1979, v. 56, p. 188A.
55. Eisman J. A., De Luca H. F., Kream В. E. Clin. Res., 1976, v. 24, p. 457.
56. Eisman J. A., Hamstra A. Kream В. E., De Luca H. F. Arch. Biochem.

Biophys., 1976, v. 176, p. 235.

57.	Eisman J. A., Shepard R. M., De Luca H. F. Anal. Biochem., 1977, v. 80,
p. 298.

58.	Ellis G., Dixon K- Clin. Chem., 1977, v. 23, p. 855.

59.	Eriksson M., Eriksson T., Sorensen B. Acta Pharm. Suec., 1978, v. 15,
p. 274.
60.	Evans Е. A. Chem. Ind., 1976, р. 394.

61.	Evans Е. A. Clin. Chim. Acta, 1972, v. 42, p. 167.

62.	Feeter D. R., Jacobs M. F., Rawlings H. W. J. Pharm. Sci. 1971 v. 60,
p. 913.

63.	Ferriere C., Gueris J., Miravet L. Nouv.	Presse Med.,	1975,	v.	4, p. 2412.

64.	Fisher A. L., Parfitt A. M.t Lloyd H. M.	J. Chromat.,	1972,	v.	65,	p. 493.

65.	Galecka H. Acta Pol. Pharm., 1975, v. 32,	p. 529.

66.	Galecka H.t Paczek R., Wardynska H.	Acta Pol. Pharm.,	1972,	v. 29,

p. 257.

67.	Gergely A., Milch Gy., Varga R., Szasz Gy. Acta Pharm. Hung., 1981,
v. 51, p. 168.

68.	Gharbo S.	A., Gosser L. A. Analyst, 1974, v. 99,	p.	222.

69.	Gharbo S.	A., Gosser L. A. J. Pharm. Sci.,	1975,	v.	64,	p.	1196.

70.	Gilbertson	T. J., Stryd R. P. Clin. Chem.,	1977,	v.	23,	p.	1139.

71.	Gilbertson	T. J., Stryd R. P. Clin. Chem,	1977,	v.	23,	p.	1700.

72.	Green J. Biochem. J, 1951, v. 49, p. 34.

73.	Haddad J. G., Min C., Mendelsohn M., Slatopolsky E., Hahn T. J. Arch.
Biochem. Biophys, 1977, v. 182, p. 390.

74.	Halket J. M. R., Lisboa В. P. Acta Endocrinol, 1978, v. 87, p. 120.

74a. Halket J. M. R., Ganschow I., Lisboa В. P. J. Chromat, 1980, v. 192,
p. 434.

75.	Hanewald R. H., Mulder F. J., Reuning R. J. J. Pharm. Sci, 1968, v. 57,
p. 1308.

76.	Hashmi M. Assay of Vitamins in Pharmaceutical Preparations. Wiley.
New York, 1973, p. 324.

77.	Hashmi M. H., Chughtai F. R., Adil A. S., Quershi T. Microchim. Acta,
1967, p. 1114.

78.	Hassan S. M. Z. Anal. Chem, 1978, v. 293, p. 416.

79.	. Hassan S. M. J. Ass. Off. Anal. Chem, 1979, v. 62, p. 545.

80.	Haussler M. R., Myrtle J. F., Norman A. W. J. Biol. Chem, 1968, v. 243,
p. 4055.

81.	Hay A. W. M., Jones G. Clin. Chem, 1979, v. 25, p. 473.

82.	Heaysman L. T., Swayer E. R. Analyst, 1964, v. 89, p. 529.

83.	Henderson S. R, Wickroski A. F. J. Ass. Off. Anal. Chem, 1978, v. 61,
p. 1130.

83a. Henderson S. R., McLean L. A. J. Ass. Off. Anal. Chem, 1979, v. 62,
p. 1358.

84.	Henry H. L., Norman A. W. J. Biol. Chem, 1974, v. 249, p. 7529.

85.	Hof sass H., Alicino N. J., Hirsch A. L., Amelka L., Smith L. D. J. Ass.
Off. Anal. Chem, 1978, v. 61, p. 735.

86.	Hofsass H., Grant A., Alicino N. J., Greenbaum S. J. J. Ass. Off. Anal.
Chem, 1976, v. 59, p. 251.

87.	Holasovd M., Blattna J. J. Chromat, 1976, v. 123, p. 225.

88.	Holick M. F., De Luca H. F. J. Lipid Res, 1971, v. 12, p. 460.

89.	Hollis B. W., Burton J. H., Draper H. H. Steroids, 1977, v. 30, p. 285.

90.	Hom F. S., Veresh S. A., Ebert W. R. J. Ass. Off. Anal. Chem, 1977,
v. 60, p. 48.

91.	Hommes M., Dekker L. P. Int. J. Vitam. Nutr. Res, 1973, v. 43, p. 271.

92.	Horst R. L., Shepard R. M., Jorgensen N. A., De Luca H. F. J. Lab. Clin.
Med, 1979, v. 93, p. 277.

92a. Horst R. L., Littledike E. T., Riley J. L., Napoli J. L. Anal. Biochem,
1981, v. 116, p. 189.

93.	Hordy 0. Zbl. Pharm, 1964, v. 113, p. 1255.

94.	Hughes M. R., Baylink D. J., Jones P. G„ Haussler M. R. J. Clin. In-
vest, 1976, v. 58, p. 61.

95.	Ikekawa N., Roizumi N. J. Chromat, 1976, v. 119, p. 227.

96.	Ishikawa S., Ratsui G. Vitamins, 1964, v. 29, p. 203.
97.	ШРАС-ШВ Tentative Rules for Nomenclature of Steroids. Steroids,
1969, v. 13, p. 278.

98.	Janecke H., Maas-Goebels I. Z. Anal. Chem., 1960, v. 178, p. 161.

99.	Jones G. Clin. Chem. 1978, v. 24, p. 287.

99a. Jones G. J. Chromat., 1980, v. 221, p. 27.

100.	Jones G., De Luca H. F. J. Lipid Res., 1975, v. 16, p. 448.

100a. Jongen M. J. M., van der Vijgh W. J. M., Willems H. J. J., Netelen-
bos J. C., Lips P. Clin. Chem., 1981, v. 27, p. 1757.

101.	Justova V., Starka L., Wilczek H., Pacovsky V. Clin. Chim. Acta, 1976,
v. 70, p. 97.

101a. Kano K., Yoshida H., Yata Y., Abe E., Tanabe R., Suda T. J. Nutr. Sci.
Vitaminol., 1979, v. 25, p. 351.

1016. Kann K, Yoshida H., Yata J., Suda T. Endocrinol. Japan, 1980, v. 27,
p. 121.

102.	Khellaf S., Abbeddaim K-, Guermouche M. H. C. R. Acad. Sci. Paris. Ser.
C, 1977, p. 611.

103.	Knapstein H., Piichel P., Scholz H. Fette Seifen Anstrichm., 1979, v. 81,
p. 121.

104.	Kobayahi T. J. Vitaminol. (Kyoto), 1967, v. 13, p. 255.

105.	Kobayashi T. Vitaminol. (Kyoto), 1967, v. 13, p. 258.

106.	Kobayashi	T.,	Adachi	A.	J.	Nutr.	Sci. Vitaminol.,	1973, v.	19, p. 303.

107.	Kobayashi	T.,	Adachi	A.	J.	Nutr.	Sci. Vitaminol.,	1976, v.	22, p. 41.

108.	Kobayashi	T.,	Adachi	A.	J.	Nutr.	Sci. Vitaminol.,	1976, v.	22, p. 209.

109.	Kobayashi	T.,	Adachi	A.,	Furuta	K. J. Nutr. Sci.	Vitaminol., 1976, v. 22,

p. 215.

110.	Kobayashi T.t Moriuchi S., Shimura F., Katsui G. J. Nutr. Sci. Vitaminol.,
1976, v. 22, p. 299.

111.	Kobayashi T., Yasumura M. J. Vitaminol. (Kyoto), 1972, v. 18, p. 78.

112.	Kobayashi T., Yoshimoto S.t Yasumura M. J. Nutr. Sci. Vitaminol., 1977,
v. 23, p. 281, 291.

113.	Koleva	M.f	Joneidi M.}	Budewski O. Pharmazie, 1973, v.	28, p.	317.

114.	Koleva	M.,	Joneidi M.,	Budewski O. Pharmazie, 1975, v.	30, p.	168.

115.	Koshy	К-	T.,	Van	Der	Slik	A.	L.	Anal.	Biochem., 1976, v.	74, p. 282.

116.	Koshy	К.	T.,	Van	Der	Slik	A.	L.	Anal.	Letters, 1977, v. 10, p. 523.

117.	Koshy	К.	T.,	Van	Der	Slik	A.	L.	Agr.	Food Chem., 1977,	v. 25, p. 1246.

Г18.	Koshy	К	T.,	Van	Der	Slik	A.	L.	Anal.	Biochem., 1978, v.	85, p. 283.

119.	Kremer	R.,	Quillemant	S. Clin. Chim. Acta, 1978, v. 86,	p. 187.

120.	Krol G.	J.,	Mannan C.	A., Gemmill F. Q., Hicks G. F., Kho В. T.	J. Chro-

mat, 1972, v. 74, p. 43.

121.	Lambert P. W., Sy ver son B. J., Arnaud C. D., Spelsberg T. C. J. Steroid.
Biochem, 1977, v. 8, p. 929.

121a. Lambert P. W., DeOreo P. B.> Hollis B. W., Fu I. У, Ginsberg G. J.,
Roos B. A. J. Lab. Clin. Med, 1981, v. 58, p. 536.

122.	Laughland D. H., Philips W. E. J. Anal. Chem, 1956, v. 28, p. 817.

123.	Lawson D. E. M., Wilson P. W., Kodicek E. Biochem. J, 1969, v. 115,
p. 269.

123a. Loore F., Gairano G., Signorini A. M. Boll. Soc. Itai. Biol. Sper, 1980,
v. 56, p. 323.

124.	Lund B., Sorensen О. H. Scand. J. Clin. Lab. Invest, 1979, v. 39, p. 23.
125. Mackay C., Tillman J., Thorburn Burns D. Analyst, 1979, v. 104, p. 626.
126. Macleod I. W., Wiggins R. A. Proc. Analyt. Div. Chem. Soc, 1978, v. 15,
p. 329.

127.	Майрановский В. Г., Богословский Н. А, Самохвалов Г. И. Мед. пром.
СССР, 1966, т. 20, с.. 39.

128.	Майрановский В. Г., Самохвалов Г. И. Ж. всес. хим. общ-ва им. Д. И. Мен-
делеева, 1964; т. 9, с. 358.

129.	Майрановский В. Г., Самохвалов Г. И. Электрохимия, 1965, т. I, с. 996.

25 Заказ № 182
130.	Майрановский В. Г., Самохвалов Г. И. Ж. аналит химии, 1966, т. 21,
с. 210.

131.	Mariani A., Mariani-Vicari С. Ann. 1st. Super. Sanita, 1968, v. 4, p. 90.

132.	Mason R. S., Posen S. Clin. Chem., 1977, v. 23, p. 806.

132a. Mason R. S., Lissner D., Grunstein H. S., Posen S. Clin. Chem., 1980,
v. 26, p. 444.

1326. Matsuyama N. J. Nutr. Sci. Vitaminol., 1979, v. 25, p. 469.

133.	Menicagli C., Silvestri S., Nucci L. Farmaco, Ed. Pr., 1976, v. 31, p. 244.

134.	Mermet-Bouvier R. Bull. Soc. Chim. France, 1970, p. 3174.

135.	Mermet-Bouvier R. J. Chromat., 1971, v. 59, p. 226.

136.	Mermet-Bouvier R. J. Chromat. Sci., 1972, v. 10, p. 733.

137.	Mermet-Bouvier R. Anal. Chem., 1973, v. 45, p. 584.

138.	Мищенко В. В., Шостаковская Г. R., Богословский Н. А., Гусаров А. Н.,
Майрановский В. Г. Химико-фармацевтич. ж., 1960, т. 10, с. 136.

139.	Morris W. W., Wilkie J. В., Jones S. W., Friedman L. Anal. Chem., 1962,
v. 34, p. 381.

140.	Mulder F. J., De Vries E. J. J. Ass. Off. Anal. Chem., 1974, p. 57, p. 1349.

140a. Mulder F. J., De Vries E J., Borsje B. J. Ass. Off. Anal. Chem., 1979,
v. 62, p. 1031.

141.	Mulder F. J., De Vries E. J., Borsje B. J. Ass. Off. Anal. Chem., 1977,
v. 60, p. 151.

141a. Mulder F. J., De Vries E. J., Borsje B. J. Ass. Off. Anal. Chem., 1981,
v. 64, p. 58.

142.	Murray T. R., Day R. C., Rodicek E. Biochem. J., 1966, v. 98, p. 293.

143.	Murray T. R, Erdody P., Panalaks T. J. Ass. Off. Anal. Chem., 1968,
v. 51, p. 839.

144.	Muller-Mulot W., Rohrer G., Schwarzbauer R. Fette Seifen Anstrichm.,
1979, v. 81, p. 38.

144a. Muller-Mulot W., Rohrer G., Schwarzbauer R., Maurer R., Oesterhelt G.,
Schidl R., Allemann L. Fette Seifen Anstrichm., 1970, v. 82, p. 171.

1446. Nabholz A., Her forth S. Trav. Chim. Aliment. Hyg., 1980, v. 71, p. 100.

145.	Nair P. P., Bucana C., De Leon S., Turner D. A. Anal. Chem., 1965, v. 37,
p. 631.

146.	Nair P. P., De Leon S. Arch. Biochem. Biophys., 1968, v. 128, p. 663.

147.	Nerlo H., Palak W. Acta Pol. Farm., 1967, v. 24, p. 399.

147a.	Niekerk P.	J., Smit S.	С.	C. J. Am. Oil Chem. Soc.,	1980,	v.	57, p.	39.

148.	Nield С. H., Russel W.	C.,	Zimmerli A. J. Biol. Chem.,	1940,	v.	136, p.	73.

149.	Norman A. W., De Luca H. F. Anal. Chem., 1963, v. 35, p. 1247.

150.	Offermann	G., Dittmar	F.	Hormone Metab. Res., 1974,	v. 6,	p.	534.

151.	Okano T-,	Mizuno R.,	Matsuyama N., Nobuhara N.,	Robayashi Г. Rec.

Trav. Chim. Pays-Bas, 1979, v. 98, p. 253.

151a. Okano T., Mizuno R., Shida S., Takanashi N., Robayashi T., Ruroda E.,
Romada S., Matsuo T. J. Nutr. Sci. Vitaminol., 1981, v. 27, p. 43.

152.	Okano T., Yasumura M., Mizuno R., Robayashi T. J. Nutr. Sci. Vitami--
nol., 1977, v. 23, p. 165.

153.	Osadca M., Araujo M. J. Ass. Off. Anal. Chem., 1977, v. 60, p. 993.

154.	Osadca M.,	DeRitter E. J. Pharm. Sci., 1968, v.	57, p.	309.

155.	Osborn T. W. Dissertation Abstr. Intern.,	1967,	v. 37,	p.	2694.

156.	Osborn T. W., Norman A. W. Clin. Res., 1975, v. 23, p. 113.

157.	Parekh С. H., Wasserman R. H. J. Chromat., 1965, v. 17, p. 261.

158.	Panalaks T.	Int. Z. Vitam. Forsch., 1969, v.	39, p.	426.

159.	Panalaks T.	J. Ass. Off. Anal. Chem., 1971,	v. 54,	p. 1299.

159a. Parviainen M. T., Savolainen R. E., Rorchonen P. H., Alhava E. M.,
Visakorpi J. R. Clin. Chim. Acta, 1981, v. 114, p. 233.

160.	Pasalis J., Bell N. H. J. Chromat., 1965, v. 20, p. 407.

160a. Peacock M., Taylor G. A., Brown W. Clin. Chim. Acta, 1980, v. 104,
p. 93.
161.	Pelc В., Holmes A. L. J. Chromat., 1979, v. 173, р. 403.

162.	Pesez М. Bull. Soc. Chim. France, 1958, p. 369.

163.	Pharmacopoeia of Japan VIII, English Ed., Society of Japan Pharmaco-
poeia, 1973, Part 1, p. 153.

164.	Piekos R., Osmialowski R., Robylczyk R, Grzybowski J. J. Chromat.,
1976, v. 116, p. 315.

165.	Pinelli A., Witzke F., Nair P. P. J. Chromat., 1969, v. 42, p. 271.

166.	Pirlot G. Anal. Chim. Acta, 1948, v. 2, p. 744.

167.	Ponchon G., Fellers F. X. J. Chromat., 1968, v. 35, p. 53.

168.	Preece M. A., O’Riorden J. L. H., Lawson D. E. M., Rodicek E. Clin.
Chim. Acta, 1974, v. 54, p. 235.

169.	Ray A. C., Dwyer J. N., Reagor J. C. J. Ass. Off. Anal. Chem., 1977,
v. 60, p. 1296.

169a. Redel J., Bazely N., Mawer E. B., Hann J., Jones F. S. FEBS Letters,
1979, v. 106, p. 162.

170.	Richter J., Ropte D. Pharmazie, 1969, v. 24, p. 601.

171.	Sanders G. M., Havinga E. Rec. Trav. Chim. Pays-Bas, 1964, v. 83, p. 665.

172.	Schaltegger H. Helv. Chim. Acta, 1946, v. 29, p. 285.

173.	Schaefer P. C., Goldsmith R. S. J. Lab. Clin. Med., 1978, v. 91, p. 104.

, 174. Schmall M., Senkowski B., Colarusso R., Wollish E. G., Shafer E. С. E.

J. Am. Pharm. Ass. Sci. Ed., 1958, v. 47, p. 839.

174a. Seamark D. A., Trafford D. J. H., Makin H. L. J. Clin. Chim. Acta, 1980,
v. 106, p. 51.

1746.	Seamark D. A., Trafford D. J. H., Hiscocks P. G., Makin H. L. J, J. Chro-
mat., 1980, v. 197, p. 271.

175.	Shaw W. H. C., Jefferies J. P., Holt T. E. Analyst, 1957, v. 82, p. 2.

176.	Shaw W. H. C., Jefferies J. P. Analyst, 1957, v. 82, p. 8.

- 176a. Shepard R. M., Horst R. L., Hamstra A. J., De Luca H. F. Biochem.
J., 1979, v. 182, p. 55.

177.	Sheppard A. J., Hubbard W. D. Methods Enzymol. Academic Press, New
York, 1971, p. 733.

178.	Sheppard A. J., LaCroix D. E., Prosser A. R. J. Ass. Off. Anal. Chem.,
1968, v. 51, p. 834.

178a. Shimotsuji T. Clin. Chem. Acta, 1980, v. 106, p. 145.

179.	Skinner R. R., Wills M. R. Clin. Chim. Acta, 1970, v. 80, p. 553.

180.	Sklan	D.,	Budowski	P. Anal. Biochem., 1973, v. 52,	p. 584.

181.	Sklan	D.,	Budowski	P. Anal. Chem., 1973, v. 49, p.	200.

182.	Sklan	D.,	Budowski	P., Ratz M. Anal. Biochem.,	1973, v.	56,	p.	606.

183.	Sobel	A.	E., Mayer	A. M., Rramer B. Ind. Eng.	Chem., Anal.	Ed.,	1945,

v. 17, p. 160.

184.	Sorque У., Miravet L. Steroids, 1978, v. 31, p. 653.

185.	Spencer M., Mehta A. C., Hetherington C. J. Hung. Pharm., 1975, v. 35,
p. 152.

186.	Sternberg J. C., Stillo H. S., Schwedenman R. H. Anal. Chem., 1960, v. 32,
p. 84.

187.	Steuerle H. J. Chromat., 1975, v. 115, p. 447.

188.	Strohecker R. Dt. Apoth. Ztg., 1966, v. 106, p. 1171.

189.	Strohecker R., Henning H. M. Vitamin-Bestimmungen. Verlag Chemie.
Weinheim. 1963. a) p. 264, 6) pp. 268—269, в) pp. 287—290.

190.	Stroheker R., Pies H. Arch. Pharm., 1961, v. 294, p. 600.

191.	Strong J. W. J. Pharm. Sci., 1976, v. 65, p. 698.

192.	Stross P. S., Brealey L. J. Pharm. Pharmacol., 1955, v. 7, p. 739.

193.	Stryd R. P., Gilbertson T. Clin. Chem., 1978, v. 24, p. 927.

194.	Suda T., De Luca H. T., Schnoes H. R., Blut J. W. Biochemistry, 1969»
v. 8, p. 3515.

195.	Szuchovszky Gy., Szocs R. Gyogyszereszet, 1974, v. 18, p. 474.
195а. Takada К., Okano T.t Tamura Y.t Matsui S., Kobayashi T. J. Nutr. Sci.
Vitaminol., 1979, v. 25, p. 385.

196.	Takahashi R. Rev. Polarog. (Kyoto), 1961, v. 9, p. 247.

197.	Takahashi R. Agr. Biol. Chem., 1963, v. 27, p. 8.

198.	Takahashi R., Yamamoto M. Yakugaku Zasshi, 1969, v. 89, p. 933.

199.	Tartivita K. A., Sciarello J. P., Rudy В. C. J. Pharm. Sci., 1976, v. 65,
p. 1024.

200.	laylor С. M., De Silva P., Hughes S. E. Biochem. Biophys. Res. Com-
mum, 1976, v. 70, p. 1243.

200a.	Taylor C. M., Hann J., St. John J., Wallace J. E.t Mawer E. B. Clin.
Chim. Acta, 1979, v. 96, p. 1.

2006.	Taylor G. A., Peacock M., Pelc B., Brown W., Holmes A. Clin. Chim.
Acta, 1980, v. 108, p. 239.

201.	Taylor C. M., De Silva P., Hughes S. E. Calc. Tissue Res., 1977, v. 22,
Supp. 40.

202.	Theivagt J. G., Campbell D. J. Anal. Chem., 1959, v. 31, p. 1375.

203.	Thielemann H. Sci. Pharm., 1974, v. 42, p. 145.

204.	Thielemann H. Z. Anal. Chem., 1974, v. 271, p. 365.

205.	Thompson J. N., Maxwell W. B., L'Abbe M. J. Ass. Off. Anal. Chem.,
1977, v. 60, p. 998.

205a. Thorburn Burns D., Mackay C. J. Chromat., 1980, v. 200, p. 300.

206.	Tompkins D. F., Tscherne R. J. Anal. Chem., 1974, v. 46, p. 1602.

207.	Touw H. D. M., Kroese В. M. C., Molenaar H. M. J. Ass. Off. Anal.

Chem., 1972, v. 55, p. 622.

208.	Tscherne R. J., Capitano G. J. Chromat, 1977, v. 136, p. 337.

209.	Tsukida K., Akutsu К., Ito M. J. Nutr. Sci. Vitaminol., 1976, v. 22, p. 7.

210.	Tsukida K-, Kodama A., Sajki K. J. Nutr. Sci. Vitaminol., 1976, v. 22,
p. 15.

211.	Tsukida K., Sakai K. Int. J. Vitam. Nutr. Res., 1972, v. 42, p. 242.

212.	United States Pharmacopoeia XX, USP Convention Inc., Rockyille Md.,
1975, p. 934.

213.	Vachek J., Kakae B., S ar sunova M. Cesk. Farm., 1967, v. 16, p. 229.

214.	Vanhaelen-Fastre R., Vanhaelen M. J. Chromat., 1978, v. 153, p. 219.

214a. Vanhaelen-Fastre R., Vanhaelen M. J. Chromat., 1979, v. 179, p. 131.

215.	Velluz L. Bull. Soc. Chim. France, 1948, v. 15, p. 1115.

216.	Vessman J., Ahlen G. Acta Pharm. Suec., 1968, v. 1, p. 209.

216a. Walker G. A., Carpenter В. E., Tuescher D. L. J. Pharm. Sci., 1980, v. 69,
p. 4848.

217.	Wardynska H. Acta Pol. Pharm., 1969, v. 26, p. 63.

218.	Washiittl J„ Gemeiner M. Microchim. Acta, 1974, p. 73.

219.	Whitney J. O.f Edmons C. G., Burlingame A. L., Piel C. F. Clin. Res.,
1979, v. 27, p. 88 A.

220.	Wiggins R. A. Proc. Anal. Div. Chem. Soc.,	1976, v. 13,	p. 133.

221.	Wiggins. R. A. Chem. Ind., 1977, p. 841.

222.	Wilkie J. B., Jones S. W., Kline O. L. J. Am.	Pharm. Ass.	Sci. End.,	1958,

v. 47, p. 385.

223.	Williams R. C., Schmidt J. A., Henry R. A. J. Chromat. Sci., 1972, v. 10,
p. 494.

224.	Wilson P. W., Lawson D. E. M., Kodicek E. J. Chromat., 1969, v. 39,
p. 75.

225.	Zagalak B., Curtius H. Ch., Foschi R., Wipf G., Redweik U., Zagalak M. J.
Experientia, 1978, v. 34, p. 1537.

226.	Zanobibi A., Firenzuoli A. M., Bianchi A. Boll. Soc. Itai. Biol. Sper.,
1974, v. 50, p. 887.

227.	Ziffer H., Van den Heuvel W. J. A., Haahti E. O. A., Horning E. C.
J. Am. Chem. Soc., 1960, v. 82, p. 6411.
6

ЖЕЛЧНЫЕ КИСЛОТЫ

4.1. ОСНОВЫ ХИМИИ ЖЕЛЧНЫХ кислот

Желчные кислоты являются Сггстероидами с холановым
скелетом, который может быть получен из прегнана присоеди-
нением к Сгб-атому «-пропильного радикала или отщеплением
от холестанового скелета конечной изопропильной группы
В Сп-боковой цепи. (В действительности последнее кажется
более убедительным, так как желчные кислоты являются мета-
болитами холестерина.) Во всех главных производных кольца
А и В находятся в цис-положении (50-холан).

СггАтом несет карбоксильную функцию. Гидроксильные
группы (обычно в a-конфигурации) находятся в положениях 3,
6, 7 и 12. Из многочисленных производных важнейшими яв-
ляются холевая, дезоксихолевая, хенодезоксихолевая и литохо-
левая кислоты. Среди встречающихся в природе можно найти
Частично окисленные производные, содержащие кетогруппы
Вместо оксигрупп. Такие производные, как дегидрохолевая ки-
слота, получены также синтетически.

холевая кислота	дезоксихолевая кислота

(За,7а,12а-триокси-5Р-холановая кислота)

(За,12а-диокси-5р-холановая кислота)

хенодезоксихолевая кислота
(За,7а-диокси-5р-холановая кислота)

лнтохолевая кислота

(За-окси-5р-холановая кислота)
дегидрохолевая кислота

(3,7,12-трикетохолановая кислота)

гликохолевая кислота	таурохолевая кислота

Большая часть желчных кислот в организме присутствует
в виде водорастворимых натриевых солей глицина или таурина,
ацилированных холевой кислотой. Оксигруппы частично суще-
ствуют в виде сульфатов (и глюкуронидов). Строение некото-
рых важных производных приведено в табл. 6.3.

В желчи содержатся большие количества желчных кислот
(порядка 1—2%), в крови же их содержание примерно на че-
тыре порядка ниже. Определение желчных кислот является
важной задачей клинического анализа, так как эти данные
представляют значительную ценность при диагностике различ-
ных заболеваний.

В промышленности холевую и дезоксихолевую кислоты по-
лучают главным образом из желчи крупного рогатого скота,
а гиодезоксихолевую кислоту—из желчи свиней.

Будучи соединениями с неполярным, жирорастворимым ске-
летом и полярными, водорастворимыми функциональными
группами, желчные кислоты, и особенно их соединения, дей-
ствуют как детергенты; биологическая активность желчных
кислот состоит в эмульгировании жиров и ускорении их пере-
варивания.

В терапии используются главным образом природные холе-
вая и дезоксихолевая кислоты и их полусинтетический аналог —
дегидрохолевая кислота, которые ускоряют секрецию и цирку-
ляцию желчи и поэтому часто применяются при лечении забо-
леваний печени и желудочных заболеваний. Недавно хенодез-
оксихолевая кислота рекомендована в качестве препарата при
лечении желчнокаменной болезни.

Дезоксихолевая и гиодезоксихолевая кислоты раньше имели
большое значение как исходное сырье для полусинтеза стеро-
идных гормонов, но с тех пор, как были открыты другие мате-
риалы, их значение сильно снизилось.

«.2. МЕТОДЫ АНАЛИЗА ЖЕЛЧНЫХ КИСЛОТ

«.2.1. КОЛОРИМЕТРИЧЕСКИЕ МЕТОДЫ

Желчные кислоты неактивны в УФ-области, и даже возмож-
ность их колориметрического определения в значительной мере
лимитируется тем, что они не содержат функциональных групп,
которые могли бы служить основой чувствительных и надеж-
ных колориметрических методов. По этой причине почти все ко-
лориметрические методы, основанные на использовании кон-
центрированных кислот, являются нестехиометрическими. Хотя
большинство этих методов не обладает достаточной специфич-
ностью к желчным кислотам, в некоторых случаях при опреде-
лении отдельных желчных кислот была достигнута неожиданно
высокая селективность. Эти методы имели большое значение
на начальном этапе развития аналитической химии желчных
кислот. Из-за умеренной чувствительности и селективности,
а также быстрого распространения более современных и эффек-
тивных методов роль колориметрии в анализе желчных кислот
значительно снизилась.

Колориметрический метод анализа желчных кислот обсу-
ждался в работе Бартоша и Пезе в 1976 г. [10]. В этом разделе
будут упомянуты только некоторые наиболее важные работы.

Во многих методах в качестве реагентов используют более
или менее концентрированные растворы минеральных кислот.
Например, Виллмарт и Ферде [198] описали селективное опре-
деление холевой кислоты в дезоксихолевой. Желчные кислоты
растворяли в 2 мл 0,2 М раствора гидроксида натрия, обраба-
тывали при 40°С 10 мл фосфорной кислоты и разбавляли до
25 мл бутанолом. Как видно из рис. 6.1, для холевой кислоты
характерен селективный максимум поглощения при 260 нм.

Современный вариант использования классической реакции
желчных кислот с концентрированной серной кислотой описан
Мачиочи и Фиотеком [117]. При определении дегидрохолевой
кислоты в лекарственных препаратах после разделения мето-
дом ТСХ пятно элюировали метанолом, выпаривали раствори-
тель, нагревая 30 мин при 100 °C с концентрированной серной
кислотой, и измеряли поглощение при 381 нм.
Ким и Кричевски [102] определяли индивидуальные желч-
ные кислоты и их конъюгаты после разделения ТСХ, нагревая
соскобленные силикагелевые зоны с 2 мл серной кислоты при
200°С в течение 15 мин, разбавляя 3 мл воды, центрифугируя
и измеряя поглощение при 375 нм.

Описано несколько модификаций оригинальной реакции
Петтенкоффера, которые основаны на использовании в каче-

Рис. 6.1. Спектры поглоще-
ния холевой (/) и дезокси-
холевой (2) кислот после
обработки фосфорной кис-
лотой [198].

стве реагентов минеральных кислот и ароматических альдеги-
дов. Например, Иствуд и др. [50] определяли этим методом
желчные кислоты во фракциях сыворотки крови после разделе-
ния методом ТСХ. Силикагель, содержащий желчные кислоты,
обрабатывали 5 мл 70%-ной серной кислоты при 42°С в тече-
ние 10 мин. Смесь выдерживали в течение 1 ч с 1 мл 0,25%-
ного раствора фурфурола, центрифугировали и измеряли по-
глощение надосадочной жидкости при 510 нм.

Кроме описанных здесь нестехиометрических методов желч-
ные кетокислоты можно определить любым из многочисленных
фотометрических методов, пригодных для обнаружения кето-
стероидов. В качестве реагентов, взаимодействующих с кето-
группой, использовали п-нитрофенилгидразин [148], а в каче-
стве реагентов, взаимодействующих с активными метиленовыми
группами,— Jt-динитробензол [23], 2,6-ди-трет-бутил-п-крезол
П49] и диэтилоксалат [184].

Новым направлением в колориметрическом определении
сильно кислых конъюгатов желчных кислот (таурин и его суль-
фат) является комплексообразование с основным красителем
азур А и экстракция нейтрального комплекса (экстракция ион-
ных пар) смесью хлороформ—метанол (1:1) с последующим
измерением поглощения органической фазы при 645 нм
(41, 197].

4.2.2. ФЛУОРИМЕТРИЯ

Образование окрашенных соединений с концентрированными
растворами кислот (см. предыдущий раздел) сопровождается
обычно флуоресценцией, которую также можно использовать
для количественного определения желчных кислот. Почти все
выводы, сделанные относительно этих реакций во введении
к разд. 6.2.1, уместны и здесь; данный вопрос также обсуждался
Бартошем и Пезе [10].

Пезе [147] описал селективное определение холевой кис-
лоты в присутствии других желчных кислот по голубой флуо-
ресценции, вызываемой фосфорной кислотой. Описан также
флуориметрический вариант реакции Петтенкоффера [112].
Чувствительность этих, а также некоторых других методов зна-
чительно выше чувствительности колориметрических методов.
Если их селективность не достаточна для анализа биологиче-
ских образцов (так обычно и бывает), ее можно повысить пред-
варительным разделением определяемых соединений с по-
мощью ТСХ. Например, Форз и др. [66] определяли желчные
кислоты, элюированные с ТСХ-пластинок, нагреванием в тече-
ние 60 мин при 60°С (возбуждение при 385 нм, испускание при
420 нм).

Феер и Казик [62] в качестве реагента использовали 96,5 %-
ную серную кислоту. Они нагревали 5 мл серной кислоты, со-
держащей 1—5 мкг желчных кислот, при 60 °C в течение
60 мин. Интенсивность флуоресценции измеряли при 510 нм
(длина волны возбуждения 436 нм). При определении желчных
кислот после их ТСХ-разделения флуоресцентную реакцию
можно проводить в присутствии силикагеля, соскобленного
с пластинки. Перед измерением флуоресценции в этом случае
суспензию центрифугируют. Метод Феера и Казика применяли
для определения желчных кислот плазмы [63]. После депро-
теинизации образец конъюгатов гидролизовали щелочью, экс-
трагировали диэтиловым эфиром, разделяли ТСХ, индивиду-
альные фракции ацетилировали и вновь разделяли ТСХ перед
измерением флуоресценции. Аналогичная методика описана для
анализа желчи [64].

Следует отметить, что значение флуориметрии в определе-
нии желчных кислот в последние годы сильно возросло. Ме-
тоды, основанные на измерении НАДН, образовавшегося
в процессе ферментативного окисления желчных кислот, рас-
сматриваются в разд. 6.2.7.

6.2.3.	КОЛОНОЧНАЯ ХРОМАТОГРАФИЯ

Колоночная хроматография перед проведением количествен-
ного анализа служит для разделения и очистки желчных кис-
лот, содержащихся в сложных биологических образцах. Разре-
шающая способность колоночной хроматографии не позволяет
выделять индивидуальные желчные кислоты, но все же она яв-
ляется важным методом отделения группы желчных кислот
в целом или по крайней мере их главных фракций.

Ионообменная хроматография может быть успешно исполь-
зована для отделения желчных кислот и их конъюгатов от нейт-
ральных стероидов и других липидов, что обусловлено кислот-
ным характером желчных кислот. Зандберг и др. [157] поло-
жили этот принцип в основу метода определения желчных
кислот в плазме. Они поглощали желчные кислоты и их конъ-
югаты из разбавленной и слабощелочной (pH 11) плазмы на
анионите амберлист XN-1006 (ОН-форма). Описано также при-
менение амберлиста А-15 [2] и А-26 [39]. Макино и Сьёвалл
[121] с помощью амберлита XAD-2 извлекали желчные кислоты
и их конъюгаты из сильнощелочной плазмы (pH 13). После
промывания водой до нейтральной реакции их можно элюиро-
вать с колонки этанолом или другим растворителем. Ряд
исследователей [2, 6, 13, 61, 85, 96, 120, 140, 160, 191] использо-
вали этот способ для выделения желчных кислот и их конъюга-
тов из плазмы, сыворотки, желчи, мочи и т. д., а затем прово-
дили определение методами газовой хроматографии, ГХ—МС
или высокоэффективной жидкостной хроматографии. Бэрнс
и Читранукрох [9] предложили использовать амберлит XAD-7.

Гель-хроматография на сефадексе LH-20 [6, 35, 101, 120J
пригодна для разделения сульфированных и несульфированных
производных желчных кислот, тогда как эффективное разделе-,
ние неконъюгированных производных, производных глицина
и таурина, а также сульфированных и полисульфированных
производных достигается применением диэтиламинооксипропил-
сефадекса LH-20 [2]. Для выделения дезоксихолевой кислоты
использовали также сефадекс G-25 [36].

Хроматография на оксиде алюминия находит применение
главным образом для очистки желчных кислот после превраще-
ния их в метиловые эфиры [120, 139, 157]. В работах Энерота
и Сьёвалла [57], Куксиса [105] и Прохазки [151] обсуждались
некоторые ранее предложенные варианты колоночной хромато-
графии для разделения желчных кислот, в том числе разделение
на оксиде алюминия, кремнекислоте, целите и т. д.
Колоночная хроматография (в сочетании с тонкослойной
хроматографией) часто применяется для решения задач, связан-
ных с выделением и очисткой желчных кислот. Часто случается
так, что полная схема количественного анализа включает 3—
4 предварительные хроматографические стадии.

6.2.4.	ТОНКОСЛОЙНАЯ ХРОМАТОГРАФИЯ

Одно из наиболее важных достижений тонкослойной хрома-
тографии состоит в том, что этот метод позволяет решать (или
по крайней мере играет существенную роль) практически все
задачи, возникающие при анализе таких сложных стероидов,
как желчные кислоты и их конъюгаты. В этой области наибо-
лее важными являются обзоры Нейера [136], Энерота [55], Хоф-
манна [83] и Хефтманна [81].

С помощью тонкослойной хроматографии можно решить
следующие основные задачи:

а)	выделение и идентификация индивидуальных желчных
кислот и их конъюгатов;

б)	отделение желчных кислот от нейтральных стероидов
и других липидов, отделение желчных кислот от их конъю-
гатов;

в)	выделение и очистка желчных кислот с целью последую-
щего определения (метод элюирования пятен);

г)	разделение и прямое количественное определение желч-
ных кислот на пластинках.

Разделение желчных кислот
и их конъюгатов

При изучении желчных кислот методом ТСХ в качестве сор-
бента наиболее часто используется силикагель G. Так как
желчные кислоты относятся к наиболее полярным производным
стероидов, для их хроматографирования можно применять бо-
лее полярные системы растворителей, чем для хроматографи-
рования стероидов других классов. Большинство исследовате-
лей предпочитают применять смеси, содержащие уксусную
кислоту. Из многочисленных работ, посвященных изучению опти-
мального состава растворителя, следует упомянуть работу Эне-
рота [54], в которой изучена возможность разделения около
40 желчных кислот в 17 системах растворителей. Наиболее био-
логически важные желчные кислоты [холевая (X), дезоксихо-
левая (Д), хенодезоксихолевая (ХД) и литохолевая (Л)] хо-
рошо разделяются смесью триметилпентан—этилацетат—ускус-
ная кислота (10:10:2). Обычно число производных желчных
кислот бывает слишком велико, чтобы разделение можно было
осуществить в одной ТСХ-системе. В упоминавшейся выше
статье и обзорах для разделения близких по структуре пар
приводится несколько систем. Феер и Казик [62] нашли,
что в смеси триметилпентан—этилацетат—уксусная кислота
(50:40 : 10) Rf для X составляют 0,20, ХД 0,69, Д 0,78, Л 0,91,
а в этой же смеси состава 65:35:5 величины /?/ равны соответ^
ственно 0,02, 0,21, 0,23 и 0,67, что позволяет в результате двух
хроматографирований разделить ХД и Д. В той же самой си-
стеме получены прекрасные результаты при разделении метило-
вых эфиров указанных кислот (Rf 0,04, 0,24, 0,30 и 0,73). Дру-
гими удачными системами для разделения желчных кислот ока-
зались смеси триметилпентан—изопропиловый эфир—уксусная
кислота—бутанол—вода (10:5:5:3: 1)	[87] и петролейный

эфир—б> танол—уксусная кислота—этил ацетат—бензол (21 :
:8: 13,5:6:7) [766]. Чавез [38] разделил 3-кетожелчные кис-
лоты, а Куксис и Чайлд [106а]—их ненасыщенные произ-
водные.

Для разделения конъюгатов требуются еще более полярные
системы, что усложняет эту задачу. Например, глициновые
и тауриновые конъюгаты ХД и Д не удавалось разделить до
тех пор, пока в 1978 г. Госвами и Фрей [72] не предложили
подходящую для разделения этих трудных пар систему раство-
рителей (табл. 6.1). Как показано в их статье, смесь, содержа-
щая все восемь приведенных в таблице соединений, можно
удовлетворительно разделить в шесть хроматографических ста-
дий. Хорошие результаты были получены также Баттой и др.
[11]. Тачстон и др. [1876] успешно применяли слой с обращен-
ными фазами и буферный элюент для разделения тауриновых
конъюгатов.

Икава и Гото [96] описали двумерную тонкослойную хрома-
тографию желчных кислот и их конъюгатов.

Таблица 6.1. Разделениеа конъюгатов желчных кислот на ТСХ-пластинках
20X20 см, покрытых силикагелем [72]

Желчная кислота		
	глициновый	тауриновые
Холевая	0,32	0,09
Дезоксихолевая	0,55	0,22
Хенодезоксихолевая	0,61	0,25
Литохолевая	0,83	-0,31

а Система растворителей: хлороформ—изопропанол—изобутанол—уксусная кислота—
вода (30 : 20 : 10 : 2 : 1). Шесть хроматографирований: с пробегом растворителя 15 см
(1—2) и до 7 см (3—6). В таких условиях Rj свободных желчных кислот равно 0,93,
а холестерин перемещается с фронтом растворителя.
Бэк [6] разделял глюкурониды желчных кислот в виде ме-
тиловых эфиров полиацетатов на силикагеле, используя в ка-
честве элюента смесь дихлорэтана и диэтилового эфира (8:2),
а Пармантье и Эйссен [145] провели разделение сульфатов.

Для обнаружения желчных кислот на ТСХ-пластинках
обычно применяют серную и хлорную кислоты, хлорид
сурьмы (III), молибдофосфорную кислоту, смесь анисового аль-
дегида и серной кислоты [136]. В последние годы описано
также применение смеси медь(II)—молибдат аммония—серная
кислота [69—72], смеси n-оксибензальдегида и серной кислоты
[115], пирена [49, 50, 90] и 8-оксипирен-1,3,6-трисульфоната нат-
рия [100, 118, 176].

Фракционирование желчных кислот
с помощью ТСХ

Очень часто ТСХ используют не для выделения индивиду-
альных желчных кислот или их конъюгатов, а для разделения
на фракции, т. е. для отделения желчных кислот от их конъ-
югатов, нейтральных стероидов и других липидов и т. п.

В качестве примера можно привести метод Госвами и Фрея
[70], которые, используя пластинки с силикагелем и смесь изо-
пропанол—этилацетат—вода—водный* раствор аммиака (20:
: 25: 6:4), отделили желчные кислоты и их конъюгаты от нейт-
ральных липидов.

Беки и др. [21] с помощью смеси пропионовая кислота—
изоамилацетат—вода—н-пропанол (3 : 4 : 1 : 2) отделили сво-
бодные и связанные желчные кислоты от холестерина и жирных
кислот. Повторное хроматографирование на той же пластинке
в системе триметилпентан—диизопропиловый эфир—уксусная
кислота—изопропанол (2 : 1 : 1 : 1) привело к разделению сво-
бодных и связанных желчных кислот. Хуанг и Николс [86]
отделили свободные желчные кислоты от связанных в системе
хлороформ—метанол—вода (70 : 25 : 3). Двухступенчатое фрак-
ционное разделение описали Чавез и Кроун [39]. Удалось осу-
ществить также другой тип фракционирования, например раз-
деление глицина и таурина [71], конъюгатов глицина и таурина,
а также сульфопроизводных [37].

Количественный анализ
методом элюирования пятен

Метод тонкослойной хроматографии часто сочетают с коли-
чественными методами анализа; в этих случаях задача хрома-
тографии заключается в выделении и очистке индивидуальных
или группы желчных кислот для последующего определения.
Из обсуждавшихся выше методик (разд. 6.2) некоторые ко-
лориметрические [22, 50, 66, 102, 117], флуориметрические [63,
64], газохроматографические [1, 42, 75, 76, 118, 138], радиомет-
рические [22] и ферментативные [20, 70, 80, 114—116, 163] ме-
тоды основаны на предварительном разделении и очистке с по-
мощью ТСХ. Описано также применение ТСХ для микропрепа-
ративного выделения желчных кислот с целью последующего
изучения их строения [89].

Методы количественного определения in situ

Прямое определение неактивных в УФ-области желчных ки-
слот на пластинках для ТСХ возможно только после обработки
подходящим опрыскивающим реагентом. Арнфред и Педерсен
[4] описали полуколичественный метод определения литохоле-
вой кислоты и ее конъюгатов в желчи человека, основанный на
опрыскивании молибдофосфорной кислотой и сравнении интен-
сивности пятна с интенсивностью пятна стандарта. Семенюк
и Беер [159] применили тот же реагент для прямого денсито-
метрического определения желчных кислот. В качестве опрьг
скивающего реагента при установлении профилей концентраций
желчных кислот в желчи различных животных Хара и др. [77]
использовали концентрированную серную кислоту (60—80°С,
20 мин). Градуировочный график линеен в интервале 1—30 мкг.
Прямая денситометрия после опрыскивания смесью серная ки-
слота—анисовый альдегид использована О’Моором и Персш
Роббом [141]. Шеферд и др. [164] получили линейный градуи-
ровочный график при нанесении порций по 5 мкл 0,1—2 мМ
растворов желчных кислот и их конъюгатов на ТСХ-пластинки,
опрыскивании смесью молибдофосфат—церий (IV )аммоний-
сульфат и денситометрическом измерении при 620 нм.

Для прямого флуориметрического определения в качестве
реагентов применяли также фосфорную кислоту [27], смесь ме-
танола и серной кислоты [25, 159] или этанола и серной ки-
слоты [187а[. Используя последний реагент, Тэйлор и др. [186]
определяли 25—250 нг литохолевой кислоты после отделения от
других желчных кислот с помощью высокоскоростной ТСХ на
бумажной основе, позволяющей сократить время пробега до 5 с.

Наконец, небезынтересно заметить, что Уджи [190], а также
Беки и др. [21а] разделяли связанные желчные кислоты на по-
крытых силикагелем кварцевых стержнях и количественно опре-
деляли их с помощью пламенно-ионизационного детектора.
6.2.5.	ГАЗОВАЯ ХРОМАТОГРАФИЯ

О применении газовой хроматографии для разделения желч-
ных кислот сообщили в 1960 г. Ван-ден-Хойвель и др. [194J,
с тех пор этот метод стал одним из основных методов анализа
желчных кислот. О быстроте развития метода говорит хотя бы
тот факт, что уже несколько лет спустя появились обзоры Сьё-
валла [170] и Куксиса [104] — пионеров в этой области. Наибо-
лее современные сведения можно найти в монографии Хефт-
манна [81].

Основные характеристики наиболее важных методов приве-
дены в табл. 6.2. Из двух функциональных групп желчных кис-
лот по крайней мере по карбоксильной группе можно получить
достаточно высоколетучее производное, пригодное для газохро-
матографического анализа. Для этой цели применяют почти
исключительно метиловые эфиры. В качестве этерифицирую-
щего реагента чаще всего используют только что полученный
[82, 113] или свежеперегнанный диазометан. В смеси раствори-
телей диэтиловый эфир — метанол (9:1) реакция идет мгно-
венно, и конец ее легко определить по остаточной окраске из-
бытка реагента. Некоторые исследователи [42, 106, 118, 128]
использовали этерификацию метанолом, катализируемую соля-
ной кислотой, несмотря на то что продолжительность этой ре-
акции заметно больше (несколько часов). Такой метод, однако,
позволяет получать чистые метиловые эфиры, тогда как при
дериватизации с помощью диазометана наблюдали образование
побочного продукта З-О-метилового эфира [128, 161]. В качестве
катализатора применяли также /г-толуолсульфокислоту [46а].

Особого внимания заслуживает метилирование смесью мета-
нола и 2,2-диметоксипропана, поскольку эта реакция протекает
с большей скоростью при меньшей концентрации соляной кис-
лоты [1, 28, 32, 161].

Барнс и др. [96] описали способ перметилирования желчных
кислот, основанный на использовании в качестве реагента
смеси метилиодид—метилсульфинилметид натрия. Было най-
дено, что при этом количественно протекает метилирование как
карбоксильной, так и оксигрупп. Те же авторы показали, что
если в качестве реагента применять триметилфениламмонийгид-
роксид, то при нагревании в испарителе протекает только ча-
стичное метилирование оксигрупп [9а].

Метилхоланоаты можно хроматографировать без деривати-
зации, но при этом времена удерживания слишком велики и
разрешение пиков не достаточно хорошее из-за образующихся
хвостов. По этой причине почти во всех важных практических
приложениях прибегают к дериватизации оксигрупп.
Таблица 6.2. Некоторые газохроматографические методы разделения и определения желчных кислот

Автор	Год	Объект	Неподвижная фаза	Температура, °C	Производное		Внутренний стандарт
					по COOH	по ОН	
Ван-дер-Хойвель и др. [194]	1960	Стандарты	SE-30	222	СН3	Н	—
Сьёвалл и др. [173]	1961	Стандарты	SE-52	215—220	СН3	Н, Ас, =0	—.
Ван-дер-Хойвель и др. [193]	1961	Стандарты	SE-30	222	СНз	Н, ТФА	—
Эллин и др. [51]	1962	Трикетохолановая кислота в желчи, плазме	ХЕ-60	228	СНз	—	—•
Сьёвалл [169]	1962	Стандарты	QF-1	219	СНз	Н, ТФА	—
Холмс и Стэк [84]	1962	Стандарты	SE-52	250	СН3	Н	—-
Макита и Уэллс [123]	1963	Фекалии	Hi Eff 8В	245	СНз	ТМС	—
Куксис и Гордон [107]	1963	Стандарты	SE-30, QF-1 ХЕ-60	195—200	СНз	Н, Ас, ТФА	—
Тсуда и др. {188]	1964	Желчь	SE-52	250	СНз	Ас	——
Гранди и др. [76]	1965	Фекалии	SE-30, QF-1	240	СНз	ТМС	5а-Холе- стан
Сэндберг и др. [157]	1965	Сыворотка	QF-1, XE-60	240	СНз	ТФА	—
Бриггс и Липски [29]	1965	Стандарты	XE-60	240	СНз	ТМС	——
Окишио и др. [139]	1967	Печень	FS-1265+ 4-SE-30+ +NGS	210	СНз	ТФА	—.
Эврар [59]	1967	Фекалии	XE-60 (предколон- ка, SE-30) JXR	250	СНз	Ас	—.
Эврар и Джанссен [60]	1968	Фекалии		250	СНз	=0	23-Нор дез- оксихолевая кислота
Энерот и др. [56]	1968	Фекалии	QF-1	225—245	СНз	ТФА	—

Заказ № 182

Автор	Год	Объект	Неподвижная фаза	Температура, °C	Производное		Внутренний стандарт
					по СООН	по ОН	
Бэк [5]	1969	Стандарты	UCCW-982	235—250	тмс	ТМС	__
Эллиот и др. [53]	1969	Стандарты (5а и Р)	QF-1, OV-1,17	230, 260	СНз	тмс	—
Кротт й Планч [46]	1970	Желчь	QF-1	Программи- рование (115—225)	СНз	ТФА	
Али и Джавитт [1]	1970	Сыворотка	OV-210	225	СНз	ТФА	Гиодезоксихоле- вая кислота
Мотт и др. [130]	1971	Гиохолевая кис- лота	QF-1	230	СН3	ТФА	—
Канно и др. [96]	1971	Сыворотка	XE-60	200	СНз	ТФА	——
Клаассен [103]	1971	Желчь	QF-1	235	СН3	ТФА	——
Макино и Сьёвалл [121]	1972	Плазма	XE-60 или Hi Eff 8B		СНз	ТФА	—
Суббиа [179]	1973	Фекалии	QF-1	215	СНз	ТФА	Гиодезоксихоле- вая кислота
Грэйм и др. [75]	1973	Печень	Hi Eff 8B OV-210	250	СНз	ТМС	—
Суббиа [178]	1973	Желчь	QF-1	220	СНз	ТФА	Стигмастерин
Хенегоуэн и др. [82]	1974	. Сыворотка, желчь	OV-210	230	СНз	ТФА	7-Кето дезоксихо- левая кислота
Макино и др. [120]	1974	Моча, сыворотка	QF-1	215	СНз	ТФА	
Лаатикайнен и др. [109]	1975	Сыворотка	OV-101, капиллярн.	Программи- рование 150—225	СНз	ТМС	7-Кетодезоксихо- лев а я кислота
Ох и Дюпон [138]	1975	Ткани	OV-210	240	СНз	ТФА	7-Кетолитохо- левая кислота
Коэн и др. [42]	1975	Фекалии	Hi Eff 8BP	250	СНз	ТМС	5а-Холестан
Кэмпбел и др. [35]	1975	Сыворотка	QF-1	225	СНз	ТФА	5р-Холановая кислота
Щепаник и др. [181]	1976	Стандарты	SP-525	240	СНз	Ас	—
Продолжение табл. 6.2

Автор	Год	Объект	Неподвижная фаза	Температура, °C	Производное		Внутренний стандарт
					по СООН	по ОН	
Галеацци и др. [67]	1976	Стандарты	РРЕ-20	265, 240	СН3	Ас, ТМС	За, 7а-Диокси- 12-кетохолановая кислота
Игими [88]	1976	Желчь	Полифенил- диэтанол- аминсук- цинат	240	СН3	ТМС	5а-Холестан
Джонс и др. [95]	1976	Желчь	SP-2401	Программи- рование 215—265	СН3	ТФА	7-Кетолитохо- левая кислота
Имаи и др. [91]	1976	Желчь	QF-1	220	Гекса- фторизо- пропил	ТФА	—
Юсеф и др. [199]	1976	Желчь	OV-225	250—260	СН3	Ас	14С-Холевая кис- лота
Суббиа и др. [180]	1976	Фекалии	QF-1	225	СНз	ТФА	—
Келси и Секстон [101]	1977	Фекальные куль- туры	QF-1	210	СН3	Н	—
Алми и др. [2]	1977	Моча	Hi Eff 8ВР или SE-30	210—240	СНз	ТМС	Копростенол
Харрис и др. [78]	1977	Фекалии	QF-1	215	СНз	ТФА	—
Росс и др. [155]	1977	Сыворотка	OV-210	245	СНз	ТФА	—
Мэдсен и др. [118]	1977	Фекалии, желчь	QF-1, SE-30	220—230	СН3	ТМС	5а-Холестан

Автор	Год	Объект	Неподвижная фаза	Температура, °C	Производное		Внутренний стандарт
					по СООН	по ОН	
Хо-Нгок-Чау и др. [85]	1977	Сыворотка, желчь	QF-l,XE-60	240	CHS	Ас	Норхолевая кис- лота
Такахаши и др. [185]	1978	Фекалии	SE-30	240	СНз	ТМС	5а-Холестан
Саке и др. [156]	1978	Фекалии	OV-17	—	СНз	ТМС	5а-Холестан
Кэмпбел и др. [34]	1978	Фекалии	QF-1	250	СНз	ТМС	—
Куксис и др. [106]	1978	Египетская мумия 3200-летней дав- ности	OV-225	250	СНз	Ас	—
Карлаганис и Паумгарт- нер [97—99]	1978—  1979	Сыворотка, желчь	ПЭГ-20 M, капиллярн.	230—237	СНз	ТМС	Гиодезоксихоле- вая кислота
Мусил и Вилльямс [134]	1979	Желчь	QF-1, OV-225	230	HFB	HFB	—
Брайдон и др. [32]	1979	Кишечник крысы	SE-30	262	СНз	Ас	—
Клэйтон и Мюллер [41а]	1980	Плазма	QF-1	230	СНз	ТФА	7-Кетолитохо- лева я кислота
Хуанг и др. [87а]	1980	Моча	Поли  S-179	240	СН3	Ас	Гиохолевая кис- лота
Янкер и др. [198а]	1981	Желчные кислоты желчи, жирные кислоты, холесте- рин	QF-1	125—215	СНз	Н	Кампестерин
Особенно часто прибегают к получению трифторацетатов
с помощью ангидрида трифторуксусной кислоты, что позволяет
сократить время удерживания и повысить селективность. Часто
применяют также ацетилирование с помощью смеси уксусного
ангидрида и пиридина; ТМС-эфиры получают главным образом
в тех случаях, когда анализ проводят методом ГХ—МС. Необ-
ходимо заметить, что реакционная способность оксигрупп отно-
сительно различных силилирующих агентов заметно зависит от
их положения и конформации; так, например, селективное си-
лилирование более реакционноспособных экваториальных окси-
групп достигается в мягких условиях [29, 34]. От положения и
конформации оксигрупп заметно зависят также времена удер-
живания и степень разделения [53, 107, 139, 169]; иногда эти
характеристики зависят и от положения двойных связей [40].
Детальное обсуждение этого вопроса выходит за рамки книги.

Как видно из табл. 6.2, для анализа желчных кислот были
использованы различные неподвижные фазы, в том числе непо-
лярные метилсилоксановые (SE-30, JXR, OV-1 и OV-101 и т. п.),
высокополярные эфирные, например HiEff8BP, NGS, и т. п.
Наиболее успешное разделение, однако, достигается (табл. 6.3)
на умеренно и сильно полярных фторалкилсилоксановых
(QF-1, OV-210, SP-2401) или цианалкилсилоксановых фазах
(ХЕ-60, OV-225); недавно стали применять нематические жид-
кие кристаллические фазы [93а]. На рис. 6.2, взятом из работы
[199], показано разделение желчных кислот на OV-225 и при-
менение этого метода для анализа биологических образцов.

Газовая хроматография, как показано выше, пригодна для
решения почти всех задач, возникающих при анализе желчных

Время, мин
а
Рис. 6.2. Газохроматографическое разделение ацетатов сложных метиловых
эфиров желчных кислот на стеклянной колонке размером 180 смх2 мм, за-
полненной 1 % OV-225 на газохроме Q (100—120 меш) при температуре ко-
лонки 250°С и скорости потока гелия 20 мл/мин [199].

а — хроматограмма стандартной смеси; б — хроматограмма смеси желчных
кислот из желчи крысы; в — хроматограмма смеси желчных кислот из желчи
человека.

1— холестерин; 2— литохолат; 3 — 30-эпимер «2»; 4 — дезоксихолат; 5 — хе-
нодезоксихолат; 6 — гиодезоксихолат; 7 — холат; 8 — гиохолат; 9 и 10 — а- и
0-мурихолат.
Таблица 6.3. Времена удерживания некоторых производных метиловых
эфиров желчных кислот относительно соответствующих
производных метилового эфира дезоксихолевой кислоты

Метиловый	Положение	Производное						
		свободная  ОН-группа		тмс		ацетат	трифтораце- тат	
эфир желчной кислоты	оксигрупп	СО  > О	[г. О’	OV-1B	&	е( ю сч со  о	9oe-as	1 ь- О
Литохолевой	За	0,62	0,49	0,85	0,91	0,51	1,14	0,70
Хенодезоксихоле- вой	За, 7а	1,08	1,18	1,04	1,09	1,29	1,19	1,32
Дезоксихолевой	За, 12а	1,00	1,00	1,00	1,00	1,00	1,00	1,00
Гиодезоксихоле- вой	За, 6а	1,20	1,50	1,12	1,20	1,50	1,30	1,51
Холевой	За, 7а, 12а	1,66	2,33	1,09	1,05	2,28	1,03	2,13
Гиохолевой	За, 6а, 7а	1,85	3,14	1,15	1,38	2,64	—-	1,94
а-Мурихолевой	За, 66, 7а	1,84	2,42	1,12	1,05	3,11	—.	—
р-Мурихолевой	За, 6₽, 7₽	1,68	2,33	1,45	1,44	3,59	—	—
3,7,12-Трикетохо- лановой	—	1,39	6,40	—	—	4,13	—	—
Урсодезоксихоле- вой	За, 76	1,06	1,27	1,21	1,24	1,55	—•	1,54

а 3 % OV-1	на	газохроме Q,	260°С,	метиловый	эфир	дезоксихолевой	кислоты

38,4 мин [53].

6 3 % QF-1	на	газохроме Q,	230°С,	метиловый	эфир	дезоксихолевой	кислоты

29,0 мин [53].

в 3 % OV-1 на газохроме Q, 260°С, метиловый эфир дезоксихолевой кислоты, ТМС
27,3 мин [53].

г 3 % QF-1 на газохроме Q, 230°С, метиловый эфир дезоксихолевой кислоты,
ТМС 10,0 мин [53].

Д 1 % OV-225 на газохроме Q, 250°С, ацетат метилового эфира дезоксихолевой кис-
лоты 14 мин [199].

е 2,25 % SE-30 на хромосорбе W, 195°С, трифторацетат метилового эфира дезоксихо-
левой кислоты 5,0 мин [107].

ж 1 % QF-1 на газохроме Р, 200°С, трифторацетат метилового эфира дезоксихолевой
кислоты 9,5 мин [107].

кислот: контроль чистоты индивидуальных желчных кислот,
разделение, идентификация (методом ГХ—МС) и количествен-
ный анализ их смесей. Однако наиболее важной областью при-
менения ГХ является анализ биологических объектов, но в этих
случаях прямое газохроматографическое определение невозмо-
жно: перед дериватизацией (а часто и в процессе ее) необхо-
димо провести ферментативный или щелочной * гидролиз конъ-

* Факт образования этиловых эфиров желчных кислот наблюдали Хар-
рис и др. [78] при гидролизе конъюгатов кипящим этанольным раствором
щелочи, последующем подкислении, экстракции и метилировании с помощью
диазометана.
югатов, экстракцию, разделение или очистку с помощью ионо-
обменной, адсорбционной, гель-хроматографии или ТСХ. Эти
задачи будут обсуждаться в разд. 6.3.1.

Газовая хроматография пригодна также для анализа нена-
сыщенных желчных кислот [1066] и желчных спиртов [108].

6.2.6.	ВЫСОКОЭФФЕКТИВНАЯ ЖИДКОСТНАЯ ХРОМАТОГРАФИЯ

Применению высокоэффективной жидкостной хроматографии
для анализа желчных кислот посвящено небольшое число ра-
бот. Причина здесь, возможно, в том, что газовая хроматогра-
фия— настолько удобный и широко распространенный метод
анализа желчных кислот, что высокоэффективная жидкостная
хроматография не имеет такого же важного значения, как
в анализе некоторых других типов стероидов (кортикостеро-
иды, витамины D и т. д.).

Большие затруднения, препятствующие применению этого'
метода в анализе желчных кислот, вызывает то, что приемле-
мая чувствительность УФ-детектора достигается при длинах
волн ниже 210 нм [35а, 73 (а—в), 76а, 123а, 134а, 140, 146,
162], а также необходимость дериватизации желчных кислот
в нитрофенациловые [73], фенациловые [140, 177] или п-бром-
фенациловые [127а] эфиры [см. схему (2.21)], что позволяет
определять до нескольких нанограммов желчных кислот. Той
же чувствительности добились Икенойя и сотр. [90а] при элек-
трохимическом детектировании после получения п-оксианили-
дов. Кемула и Кутнер [101а] применяли полярографический ме-
тод детектирования для недериватизированных желчных кис-
лот. В этом случае чувствительность определения была средней
между указанной выше и чувствительностью детектора по ин-
дексу рефракции, который часто используют, если чувствитель-
ность обнаружения не очень важна [13, 110, 146, 160, 165, 178].

Хотя разрешающая способность метода ВЭЖХ хуже, чем га-
зовой хроматографии, его преимущество перед газовой состоит
в том, что нет необходимости гидролизовать образец перед хро-
матографированием (как в случае газовой хроматографии), по-
скольку ВЭЖХ позволяет разделять и количественно опреде-
лять конъюгаты желчных кислот (включая 3-сульфаты [73в]).
Паррис [146] разделял главные желчные кислоты и несколько
конъюгатов на колонке с обращенной фазой зорбакс ODS, ис-
пользуя смесь метанола и водного'раствора фосфорной кислоты
(pH 2) в соотношении 8 : 2. Джефферсон и Чанг [94] разделяли
метиловые эфиры моно-, ди- и триоксихолановой кислоты на
колонке с ц-порасилом при элюировании смесями этилацетата и
гексана. Шоу и Эллиот [160] предварительно фракционировали
конъюгаты желчных кислот в желчи человека на колонках
с ц-порасилом, а также корасилом II и Cis-корасилом, а затем
проводили повторное хроматографическое разделение получен-
ных фракций с целью количественного получения индивидуаль-
ных желчных кислот и конъюгатов. Бейлок и др. [13] разделяли
следующие желчные кислоты (цифры означают времена удер-
живания в минутах, буквами Т и Г обозначены конъюгаты
таурина й глицина): Т-холевая кислота 3,2; Т-дезоксихолевая

Рис. 6.3. Высокоэффективная жидкостная хроматограмма желчи из желчного
пузыря здоровых беременных женщин (несульфированная фракция, выделен-
ная хроматографированием на сефадексе LH-20), получённая на колонке раз-
мером 30 смХ4 мм, заполненной р,-бондапаком Ci8, при элюировании смесью
2600 мл метанола, 1400 мл воды и ацетатного буфера, приготовленного добав-
лением 10 М гидроксида натрия к 375 мл уксусной кислоты до pH 4,7; рефрак-
тометрический детектор [ПО].

1 — Т-холевая кислота; 2 — Г-холевая кислота; 3 — Т-хенодезоксихолевая кис-
лота; 4 — Т-дезоксихолевая кислота; 5 — Г-хенодезоксихолевая кислота; 6 —
Г-дезоксихолевая кислота.

кислота 4,1; Т-хенодезоксихолевая кислота 4,5; Г-холевая кис-
лота 5,1; Т-литохолевая кислота 5,9; Г-хенодезоксихолевая кис-
лота 7,3; холевая кислота 8,0; Г-дезоксихолевая кислота 8,2;
Г-литохолевая кислота 12,9; дезоксихолевая кислота 14,0; хено-
дезоксихолевая кислота 14,7. Разделение проводили на колонке
с зорбаксом ODS при элюировании смесью метанола, 0,03 М
водного раствора однозамещенного фосфата калия и уксусной
кислоты (80 : 20 : 1) со скоростью 0,5 мл/мин.

В большинстве случаев при определении конъюгатов желч-
ных кислот в биологических жидкостях методом ВЭЖХ приме-
няют колонки с химически связанными неподвижными фазами,
например с различными обращенными фазами Cis [26, 35а,
73а—в, 76а, 90а, 123а, 127а, 134а, 135] и «колонки с жирными
кислотами» [162]; описано также применение колонок с диокси*
дом кремния с необращенными фазами [7].

Рис. 6.3 из работы [ПО] иллюстрирует возможность исполь-
зования ВЭЖХ для серийных клинических анализов.

6.2.7.	ФЕРМЕНТАТИВНЫЕ МЕТОДЫ

Низкая селективность классических колориметрических и
флуориметрических методов способствовала поиску более се-
лективных и надежных методов. Фотометрический или флуори-
метрический вариант метода, основанного на ферментативном
окислении желчных кислот, отвечает этим требованиям, вслед-
ствие чего он быстро стал одним из наиболее важных методов
определения желчных кислот в биологических объектах.

Метод основан на катализируемом ферментом окислении
желчных кислот никотинамидадениндинуклеотидом (НАД) до
соответствующих кетопроизводных желчных кислот. Одновре-
менно образуется восстановленная форма окислителя (НАДН),
имеющая максимум поглощения при 340 нм. Поскольку ни одно
из других участвующих в реакции соединений (окисленные и
восстановленные формы желчных кислот, НАД) при этой длине
волны не поглощают, селективность ферментов позволяет раз-
работать высокоспецифичный метод определения.

он он

НАД+

(6.1>

2Н

-2Н

НАДН
Фотометрический вариант метода [15, 31, 48, 58, 79, 93, 163,
189, 196] характеризуется средней чувствительностью (моляр-
ный коэффициент поглощения НАДН при 340 нм равен 6300
[24]). Поскольку НАДН флуориметрически активен (длина
волны возбуждения 345 нм, испускания 450 нм), чувствитель-
ность значительно увеличивается при использовании флуоримет-
рического варианта метода [15, 20, 61, 80, 116, 132, 144, 168,
195].

Из ферментов используют За-оксистероид—дегидрогеназу
(За-ОСДГ) и 7а-оксистероид—дегидрогеназу (7а-ОСДГ). При
использовании недостаточно чистых ферментов селективность
методики снижается. Например, Энгарт и Тёрнер [58] отмечали
влияние спиртов (образование НАДН), являющихся раствори-
телями желчных кислот. Эти помехи можно легко устранить
при удалении спирта из реакционной смеси. Доступные в на-
стоящее время высокочистые ферменты способствуют решению
проблемы селективности. Определению желчных кислот в об-
разцах сыворотки могут мешать ферменты, содержащиеся в сы-
воротке, поэтому перед добавлением реагента их инактивируют,
например нагреванием при pH 9 и 67°С в течение 20—30 мин
[124, 142].

Что касается селективности внутри класса желчных кислот,
то необходимо сказать, что За-ОСДГ-НАД окисляет все глав-
ные желчные кислоты, и поэтому его можно применять для
определения общей концентрации желчных кислот. Чувстви-
тельность реакции относительно глициновых и тауриновых конъ-
югатов та же [58]. Если цель анализа состоит в получении дан-
ных о концентрациях индивидуальных желчных кислот и их
конъюгатов, то их следует предварительно разделить методом
ТСХ или электрофореза на ацетатцеллюлозном геле [20, 80,
116]. Элюаты, полученные вымыванием зон хроматограмм, ис-
следуют с помощью ферментативного метода. Конъюгаты пары
дезоксихолевая кислота — хенодезоксихолевая кислота с помо-
щью ТСХ разделить трудно. Для устранения этих трудностей
Макдональд и др. [114, 116] поступали следующим образом:
определяли флуориметрическим методом суммарное содержание
конъюгатов дезокси- и хенодезоксихолевой кислот, как описано
выше, а с помощью 7а-ОСДГ [см. схему (6.2)] селективно
определяли конъюгаты хенодезоксихолевой кислоты. Современ-
ный вариант этого метода [116а] включает три стадии с исполь-
зованием За-ОСДГ, 7а-ОСДГ и 12а-ОСДГ.

При ферментативном определении З-кетопроизводных желч-
ных кислот обычно их предварительно восстанавливают боро-
гидридом натрия [14—16]; описано также и ферментативное
восстановление кетогруппы со спектрофотометрическим контро-
лем расхода НАДН [3].
Следует заметить, что равновесие реакции [схема (6.2)]
смещается вправо, если связывать образующиеся кетопроизвод-
ные в форме производных гидразина. Для этого обычно приме-
няют гидразингидрат [20, 31, 48, 58, 61, 93, 163, 189], но описано
также применение семикарбазида [163] и реактива Т Жирара
[163]. Реакции обычно проводят в слабощелочной среде при
инкубировании в течение 30—40 мин. Для введения поправки
на фоновое поглощение или флуоресценцию применяют под-
ходящий реагент и проводят холостой опыт.

В наиболее современном варианте ферментативного опре-
деления желчных кислот дальнейшее увеличение селективности
достигается за счет проведения дополнительной ферментатив-
ной реакции. Осуга и др [142], Скред и др. [174], Бруусгаард
и др. [30] и Гилус-Мо и Гогстад [68] использовали метод, пред-
ложенный Машиге и др. [124], для серийного определения
желчных кислот сыворотки. В этом методе НАДН, образую-
щийся в первичной реакции, взаимодействует с резазурином
в присутствии диафоразы с образованием флуориметрически ак-
тивного продукта — резоруфина (длина волны возбуждения
565 нм, испускания 580 нм).

+ НАД*
Согласно методике [142], 0,1 мл сыворотки смешивали
с 2,5 мл буферного раствора (pH 9) и нагревали для инакти-
вации ферментов при 67°С в течение 20 мин. Затем прибавляли
0,4 мл реагента, содержащего 0,1 мл За-ОСДГ (0,0048 ME),
0,1 мл 0,5 мкМ НАД, 0,1 мл диафоразы (0,25 ME) и 0,1 мл
200 мкМ резазурина. Смесь инкубировали 40 мин при 20°С.
Для введения необходимых поправок проводили холостой опыт,
используя воду вместо сыворотки или то же самое количество
сыворотки, но в отсутствие За-ОСДГ. Линейный градуировоч-
ный график можно построить для интервала концентрации
желчной кислоты от 0 до 80 мкмоль/л. Увеличение селективно-
сти метода позволяет опустить стадию экстракции при опреде-
лении желчных кислот в сыворотках и делает его пригодным
даже для анализа окрашенных фекальных экстрактов [18].

Обзор работ по применению ферментов для определения
желчных кислот не будет полным, если хотя бы кратко не упо-
мянуть о ферментативном гидролизе конъюгатов желчных кис-
лот. В разд. 6.2.5 уже упоминалось, что гидролиз необходим,
например, при выполнении газохроматографического анализа.
Применение холоилглицин-гидролазы позволяет провести гид-
ролиз в очень мягких условиях (pH 5,6, комнатная темпера-
тура, небольшая продолжительность реакции), что является
заметным преимуществом перед обычным щелочным гидроли-
зом [154], требующим более жестких условий.

Матерн и др. [126] применяли ферментативный иммунный
метод для определения желчных кислот сыворотки. В качестве
ферментативного комплекса использовали холилглицин-перок-
сидазу и связанное с сефарозой антитело, обладающее специ-
фичностью относительно свободных и связанных желчных кис-
лот. Определение основано на реакции пероксида водорода
с 5-аминосалициловой кислотой, катализируемой пероксидазой
(поглощение изменяли при 492 нм).

«.2.8. МАСС-СПЕКТРОМЕТРИЯ И РОДСТВЕННЫЕ МЕТОДЫ

Применению масс-спектрометрии для идентификации желч-
ных кислот посвящены многочисленные статьи и подробные об-
зоры [33, 52, 171, 172]. Обычно ионизацию осуществляют пуч-
ком электронов, но описано также успешное использование и
химической ионизации [466, 108а, 175, 181, 183].

При определении желчных кислот в сложных биологических
образцах необходимо независимым методом подтвердить дан-
ные, полученные с помощью газовой хроматографии (главным
образом данные по содержанию минорных компонентов), для
чего газовую хроматографию обычно комбинируют с масс-спек-
трометрией (ГХ—МС). Во многих газохроматографических ме-
тодах, обсуждавшихся в разд. 6.2.5, применяется масс-спектро-
метрическая идентификация пиков [2, 42, 78, 108, 138, 181].

Масс-спектрометрия как метод количественного анализа
также приобрела некоторое значение для определения желчных
кислот. При анализе таких сложных смесей, как желчь или
другие биологические жидкости, содержащие желчные кислоты
вместе с другими липидами, расшифровать газовую хромато-
грамму иногда трудно даже с помощью масс-фрагментографии
с многоканальным детектором. Проблемы расшифровки можно
решить, используя подходящий внутренний стандарт и сочетая
ГХ—МС с ЭВМ. Таким способом Миязаки и др. [128] иденти-
фицировали и количественно определяли желчные кислоты ,и
их конъюгаты в желчи. Внутренним стандартом служили дей-
терированные желчные кислоты. Образец желчи экстрагиро-
вали, проводили гидролитическое удаление сульфогрупп, ще-
лочное гидролитическое расщепление глициновых и тауриновых
конъюгатов и получали триметилсилиловые метиловые сложные
эфиры *. Выделенные фракции исследовали с помощью масс-
фрагментографии. Главными фрагментами, используемыми для
анализа и вычислений, были ионы с т/е 253, 343 и 368 для хо-
левой кислоты, 255, 345, 355 и 370 для дезокси- и хенодезокси-
холевой кислот. Эти фрагменты можно получить из триметил-
силиловых метиловых сложных эфиров при отщеплении 1, 2
или 3 молекул триметилсиланола и (или) боковой цепи при
€-17 и 19-ангулярной метильной группы. Идентификация и ко-
личественное определение индивидуальных компонентов в при-
сутствии изомеров и примесей основано на использовании боль-
шого различия в относительных интенсивностях упомянутых
выше пиков фрагментов, которое можно заложить в ЭВМ перед
проведением масс-хроматографического исследования.

Дейтерированная хенодезоксихолевая кислота служила внут-
ренним стандартом при определении желчных кислот сыворотки
в виде триметилсилиловых метиловых сложных эфиров с по-
мощью газовой хроматографии на капиллярной колонке по ме-
тоду Карлаганиса и др. [99а].

Другой интересный метод решения указанной выше проб-
лемы описан Иноу и др. [92]. Образец, содержащий смесь желч-
ных кислот, метилируют смесью метанола и полностью дейте-
рированного метанола (1:1), а затем силилируют обычным
способом. Желчные кислоты проявляются в масс-спектрах в виде
дублетов равной интенсивности, отличающихся на 3 массовые
единицы (заметного изотопного эффекта в реакции этерифика-
ции не обнаружено). При использовании этих дублетов для

* В последних работах Миязаки и др. [129, 137] показали преимущества
использования этилдиметилсилиловых эфиров (см. также с. 98).
идентификации и количественного определения мешающее влия-
ние примесей легко устраняется. Очевидно, в тех случаях, когда
боковая цепь при С-17, содержащая сложноэфирную группу,
остается нетронутой, можно использовать только эти пики. На-
пример, для холевой кислоты такие дублеты наблюдаются при
т/е 623 — 626, 458 — 461 и 368 — 371, и они соответствуют
фрагментам, образующимся из трис(триметилсилил)метилхо-
лата при отщеплении 19-метильной группы и 2 или 3 молей
триметилсиланола соответственно.

Желчные кислоты можно дериватизировать по карбоксиль-
ным функциональным группам с помощью анилина и дицикло-
гексилкарбодиимида в карбоксианилиды. Хорошую возможность
для количественного определения открывает применение дейте-
рированного анилина [150].

Из недавно опубликованных статей можно упомянуть сле-
дующие. Шино и др. [166] использовали 12-кетохенодезоксихо-
левую кислоту в качестве внутреннего стандарта при определе-
нии желчных кислот в различных биологических объектах по-
сле экстракции, хроматографического разделения на амберлите
XAD-2 и сефадексе LH-20, сольволиза, щелочного гидролиза и
дериватизации с целью получения пропионатов метиловых
эстеров. Отличительной особенностью работы Нишикавы и др.
[137] является использование капиллярной газовой хроматогра-
фии (стеклянная колонка) в сочетании с масс-спектрометрией,
что позволяет достичь очень высокой селективности и чувстви-
тельности (предел обнаружения 5 пг). Щепаник и др. [182]
анализировали ацетаты метиловых сложных эфиров на термо-
стойкой неподвижной фазе поли S-179, а Беппу и др. [22а] про-
водили дериватизацию с образованием трифторацетатов гекса-
фторпропиловых сложных эфиров. Тома и др. [187а] описали
метод определения урсодезоксихолевой кислоты в желчи чело-
века, основанный на использовании в качестве внутреннего
стандарта глицинового конъюгата 50-холен-3-овой-24 кислоты.

6.2.9.	РАДИОИММУННЫЙ МЕТОД

Радиоиммунный метод в анализ желчных кислот ввели Сим-
мондс и сотр. [167] и Мёрфи с сотр. [133] в 1973—1974 гг.; до-
вольно большое число работ, опубликованных с тех пор па
этому вопросу, показывает, что значение радиоиммунного ме
тода в анализе желчных кислот также растет.

Некоторые публикации посвящены определению связанных
холевой кислоты [8, 47, 119, 125, 127, 152, 192], хенодезоксихо-
левой кислоты [8, 47, 119, 152, 158], дезоксихолевой кислоты
[47, 119], сульфированной [44] и несульфированной [43, 153]
литохолевой кислоты и урсодезоксихолевой кислоты [122] глав-
ным образом в сыворотке крови.

Антисыворотки позволяют применять в качестве иммуноге-
нов конъюгаты желчных кислот и альбумина бычьей сыворотки.
Их получают сочетанием карбоксильной группы желчной кис-
лоты или (даже чаще) карбоксильной группы глицинового
конъюгата с е-аминогруппой лизина в альбумине бычьей сыво-
ротки (АБС).

Рис. 6.4. Определение конъюгатов холевой кислоты радиоиммунным методом.
Специфичность антисыворотки, выращенной против комплекса гликохолевой
кислоты с альбумином бычьей сыворотки [192].

1 — гликохолевая кислота; 2— таурохолевая кислота; 3— гликохенодезокси-
холевая кислота; 4 — гликодезоксихолевая кислота; 5 — таурохенодезоксихо-
левая кислота; 6 — тауродезоксихолевая кислота; 7 — холевая кислота; 8 —
хенодезоксихолевая кислота; 9—дезоксихолевая кислота.

Специфичность различных антисывороток обычно вполне
достаточна для довольно селективного определения конъюгатов
основных желчных кислот в сыворотке человека. Следует, од-
нако, учитывать, что антисыворотки не позволяют различать
глициновые и тауриновые конъюгаты.

На рис. 6.4 приведены данные, показывающие высокую се-
лективность антисыворотки против комплекса гликохолевая
кислота—АБС. Из рисунка ясно, что особенно высока селектив-
ность относительно свободных желчных кислот; вполне удов-
летворительна селективность и относительно связанных диокси-
желчных кислот [192].

В качестве индикаторов используют исключительно мечен-
ные тритием (обычно в положениях 11 и 12) желчные кислоты.

Достаточно высокая селективность антисывороток обычно
исключает необходимость предварительного разделения желч-
ных кислот с помощью ТС или колоночной хроматографии.
Почти во всех упомянутых выше статьях образцы сыворотки
вводят в инкубируемую смесь либо сразу, либо после разбавле-
ния. Матерн и др. [125] выделяли желчные кислоты из образца
сыворотки с помощью ионообменной колонки с XAD-2 и затем
исследовали элюат радиоиммунным методом.

Связанные с антителами и свободные желчные кислоты
обычно разделяют путем добавления сульфата аммония [8, 47,
152, 153, 158] или полиоксиэтиленгликоля [43, 44, 122, 127] с по-
следующим центрифугированием; свободные радиоактивные
кислоты в супернатанте определяют затем с помощью жидкост-
ного сцинтилляционного счетчика. Описано также применение
иммобилизованных антител (связанных с активированной
CNBr сефарозой 4-В) [192].

Поскольку содержание желчных кислот в сыворотке до-
вольно велико и радиоиммунные методы достаточно чувстви-
тельны, для выполнения анализа обычно хватает 0,1 мл сыво-
ротки; градуировочные графики, как правило, охватывают об-
ласть от 10 до 100 пМ.

6.2.10.	ДРУГИЕ МЕТОДЫ

Карбоксильную группу желчных кислот можно легко отти-
тровать щелочными титрантами, например водным раствором
гидроксида натрия в водно-спиртовой среде в присутствии ин-
дикатора фенолфталеина [187]. Крисафио и Чаттен [45] опи-
сали способ неводного титрования с помощью раствора меток-
сида натрия в смеси бензола и метанола; титрование проводят
в смеси бензол — метанол (10:1) или хлороформ — диметил-
формамид (25:1) в присутствии индикатора тимолового си-
него.

Три кетогруппы дегидрохолевой кислоты можно определить
с помощью различных вариантов метода, основанного на реак-
ции образования оксима и титровании избытка гидроксил-
амина. Так, Гёрёг и Томшани [74] применили в качестве реа-
гента салициловокислый гидроксиламин, а титрование его изг
бытка проводили с помощью раствора соляной кислоты в смеси
пропиленгликоля и хлороформа в среде хлороформа и мета-
нола (2 : 1); индикатором служила смесь диметилового желтого
и метиленового синего.

В монографии Фориста и Джонсона [65] можно найти лите-
ратуру по применению других классических методов определе-
ния желчных кислот.

Баттачария и Банкавала [12] показали, что ЯМР-спектро-
скопию можно с успехом применить не только для идентифика-
ции желчных кислот, но и одновременно для определения эпи-
мерных желчных кислот, как, например, хенодезоксихолевая и
урсодезоксихолевая.

6.3. ПРОБЛЕМЫ АНАЛИЗА ЖЕЛЧНЫХ КИСЛОТ

6.3.1.	ОПРЕДЕЛЕНИЕ ЖЕЛЧНЫХ КИСЛОТ

И ИХ КОНЪЮГАТОВ В БИОЛОГИЧЕСКИХ ОБРАЗЦАХ

Важность определения желчных кислот в биологических об-
разцах возрастает, поскольку эти данные представляют цен-
ность для диагностики желчнопеченочных заболеваний, а также
в других областях. Хотя иногда достаточно знать «общее содер-
жание желчных кислот», современные аналитические методы
открывают новые возможности для определения главных желч-
ных кислот, их глициновых и тауриновых конъюгатов, а также
сульфатов. Подавляющее большинство опубликованных статей
посвящено решению именно этих задач анализа желчных
кислот.

Колориметрические и флуориметрические методы, основан-
ные на применении сильнокислых хромогенных или флуороген-
ных реагентов, обычно позволяют получить данные только об
общем содержании желчных кислот. Для повышения селектив-
ности этих методов требуется предварительное ТСХ-разделение
на индивидуальные компоненты [50, 102]. Хотя селективность
многих современных ферментативно-колориметрических и флуо-
риметрических методов значительно выше, чем классических,
прямым методом можно определить только фракционированные
кислоты (За-окси, 7а-оксипроизводные); в этом случае также
неизбежно ТСХ-разделение на индивидуальные желчные кис-
лоты [20, 80, 116].

Наиболее широко распространенным методом количествен-
ного определения индивидуальных желчных кислот является
газовая хроматография, несмотря на то что она имеет ряд не-
достатков: необходимость двухстадийной дериватизации и очень
тщательная хроматографическая очистка анализируемого об-
разца. Главная проблема заключается в том, что этим методом
хроматографировать конъюгаты невозможно, и поэтому он не-
пригоден для получения данных по распределению желчных
кислот по различным конъюгатам. Кроме того, конъюгаты
(глициновые и тауриновые) необходимо подвергать фермента-
тивному гидролизу или гидролизовать нагреванием с гидрокси-
дом натрия, тогда как сульфаты [Ша, 143, 145] следует под-
вергать сольволизу, например путем обработки подкисленной
смесью этанола и ацетона.

Проблему конъюгатов можно решить с помощью высоко-
эффективной жидкостной хроматографии, пригодной для

27 Заказ № 182
разделения и количественного определения индивидуальных
конъюгатов [135а]. Несмотря на ограниченную чувствительность
ВЭЖХ при определении желчных кислот, ее роль в этой обла-
сти быстро возрастает. В последующие годы можно ожидать
дальнейшего развития ВЭЖХ и особенно радиоиммунологиче-
ского метода — наиболее современного, чувствительного и се-
лективного для определения желчных кислот в сыворотке.

В зависимости от поставленной задачи, природы анализи-
руемого образца и избранного метода анализа перед выполне-
нием количественного определения необходимо осуществить це-
лый ряд предварительных стадий. Прямой анализ без предва-
рительной очистки или разделения возможен только в некото-
рых радиоиммунных и ферментативных методах [116а, 124,
142]. В большинстве случаев требуются по крайней мере одна
или гораздо чаще несколько стадий очистки. Сюда относится
осаждение белков (обычно этанолом), гидролиз конъюгатов
(если цель анализа не преследует получения данных о концен-
трации индивидуальных конъюгатов) и отделение желчных кис-
лот от других липидов и т. п. с помощью колоночной или тон-
кослойной хроматографии.

Гидролиз проводят либо щелочью в очень жестких условиях
(например, при нагревании с 1—4 М раствором гидроксида нат-
рия при 110—120°С в течение нескольких часов при повышен-
ном давлении) * или ферментативным методом (см. разд. 6.2.7).
Хроматографическую очистку или фракционирование образца
проводят обычно с помощью комбинированных методов, упоми-
навшихся в разд. 6.2.3 и 6.2.4, причем наиболее современными
являются ионообменная хроматография на амберлите XAD-2
или гель-хроматография на сефадексе.

Ниже кратко описаны две типичные методики определения
желчных кислот в сыворотке и желчи.

В методе Росса и др. [155] 6 мкг 7-кетолитохолевой кислоты
(внутренний стандарт) добавляют к 0,5—2 мл сыворотки. Белки
осаждают 3 мл этанола, центрифугируют и промывают осадок
таким же объемом этанола. Из объединенных супернатантов *
при длительном охлаждении осаждаются некоторые пептиды.
После повторного центрифугирования супернатант осторожно
выпаривают досуха и остаток растворяют в 0,1 мл смеси мета-
нола и воды (1:1). Затем проводят ферментативный гидролиз
конъюгатов, для чего инкубируют водно-метанольный раствор
1 ч при 37°С с 0,8 мл фосфатного буфера (pH 5,5) и 0,3 мл

* Оксипроизводные желчных кислот такую обработку выдерживают,
а кетопроизводные (особенно содержащие кетогруппу в положении 3) не вы-
держивают, поэтому рекомендуется предварительное восстановление боро-
гидридом натрия [17, 19, 117].
раствора фермента (приготовленного из ацетонового порошка
Clostridium welchii). Раствор подкисляют до pH 1 соляной кис-
лотой и экстрагируют тремя порциями этилацетата по 2 мл
каждая. Объединенные экстракты выпаривают досуха и раство-
ряют в 0,5 мл смеси метанола и воды (7:3). Полученный рас-
твор очищают, удаляя нейтральные липиды экстракцией н-геп-
таном. Водно-метанольный раствор выпаривают досуха, прово-
дят метилирование диазометаном и после трифторацетилиро-
вания выполняют газохроматографическое определение.

Лаатикайнен и др. [110] дважды обрабатывали 0,1 мл желчи
10 мл 96 %-ного этанола. После выпаривания объединенных су-
пернатантов остаток растворяли в смеси хлороформ—метанол
(1:1), содержащей 0,01 М хлорида натрия и хроматографиро-
вали на колонке с 4 г сефадекса LH-20. Несульфированные
конъюгаты желчных кислот элюировали и собирали фракции
объемом 10—70 мл, которые затем исследовали с помощью
ВЭЖХ (см. рис. 6.3 в разд. 6.2.6). Сульфированные фракции
элюировали 70 мл метанола, выдерживали 2 сут в подкислен-
ной смеси этанола и ацетона для удаления сульфатных остат-
ков, затем подвергали щелочному гидролизу (5 ч нагревают
при Д20°С в 15 %-ном растворе гидроксида натрия в 50 %-ном
водном этаноле). Перед газохроматографическим определением
желчные кислоты метилируют диазометаном и очищают на ко-
лонке с оксидом алюминия.

6.3.2.	ОПРЕДЕЛЕНИЕ ЖЕЛЧНЫХ КИСЛОТ

В МАССЕ ФАБРИЧНОГО ПРОДУКТА
И В ЛЕКАРСТВЕННЫХ ПРЕПАРАТАХ

Простейшая возможность количественного определения
желчных кислот в массе заключается в титровании их карбок-
сильных групп [45, 187]. Хотя это и не слишком селективный
метод, с его помощью можно контролировать качество отдель-
ных желчных кислот в сочетании с подходящим хроматографи-
ческим тестом на присутствие других желчных кислот. Для
этих целей обычно применяют тонкослойную хроматографию,
но для решения более тонких задач (например, определение до
0,1 % литохолевой кислоты в хенодезоксихолевой кислоте) бо-
лее эффективна газовая хроматография.

Поскольку в лекарственных препаратах содержатся отно-
сительно большие количества желчных кислот, их аналитиче-
ское исследование не представляет серьезной проблемы. Для
анализа таких объектов можно с успехом применять все упо-
минавшиеся выше, а также колориметрические методы.
ЛИТЕРАТУРА

1.	АН S. S., Javitt N. В. Can. J. Biochem., 1970, v. 48, р. 1054.

2.	Aime В., Bremmelgaard A., Sjovall J., Thomassen P. J. Lipid Res., 1977,
v. 18, p. 339.

3.	Anwer M. S., Hegner D. Anal. Biochem., 1979, v. 99, p. 408.

4.	Arnfred T.> Pedersen L. Scand. J. Gastroent., 1976, v. 11, p. 497.

5.	Back P. Z. Klin. Chem. Klin. Biochem., 1969, v. 7, p. 365.

6.	Back P. Z. Physiol. Chem., 1976, v. 357, p. 213.

7.	Baker R. IF. R., Ferrett J., Murphy G. M. J. Chromat., 1978, v. 146,
p. 137.

8.	Bagir У. A., Murison J., Ross P. E., Bouchier I. A. D., Pennington C. R.
J. Clin. Pathol., 1979, v. 32, p. 560.

9.	Barnes	S.,	Chitranukroh	A.	Ann. Clin. Biochem., 1977, v. 14, p. 235.

9a. Barnes	S.,	Pritchard D.	G.	Gastroenterology, 1980, v. 79, p. 1003.

96.	Barnes	S.,	Pritchard D.	G.,	Settine R. L.f Geckle M. J. Chromat., 1980,

v. 183, p. 269.

10.	Bartos J., Pesez M. Colorimetric and Fluorimetric Analysis of Steroids.
Academic Press. London, New York, San Francisco, 1976, pp. 66—70,
119—130.

11.	Batta A. K., Salen G.f Shefer S. J. Chromat., 1979, v. 168, p. 557.

12.	Battacharyya P. K., Bankawala У. G. Anal. Chem., 1978, v. 50, p. 1462.

13.	Baylocq D., Guffroy A., Pellerin F., Ferrier J. P. C. R. Acad. Sc. Paris,
1978, v. 286, Serie C71.

14.	Beher W. T., Lin G. J., Sanfield J., Stradnieks S. Henry Ford Hosp. Med.
Journal, 1978, v. 26, p. 5.

15.	Beher W. T., Lin G. J,, Stradnieks S., Sanfield J. Abstr. Papers Am.
Chem. Soc. 174 Meet. Biol., 1977, v. 49.

16.	Beher W. T., Sanfield J., Stradnieks S., Lin G. J. J. Chromat., 1978,
v. .155, p. 421.

17.	Beher W. T., Stradnieks S., Beher G. R., Lin G. J. Steroids, 1978, v. 32,
p. 355.

18.	Beher IF. T„ Stradnieks S., Lin G. J. Henry Ford Hosp. Med. Journal,
1978, v. 26, p. 58.

19.	Beher W. T., Stradnieks S., Beher G. R., Lin G. J. Henry Ford Hosp.
Med. Journal, 1978, v. 26, p. 62.

20.	Beke R., De Weerdt G. A., Parijs J., Berbier F. Clin. Chim. Acta, 1976,
v. 71, p. 27.

21.	Beke R., De Weerdt G. A., Parijs J., Huybrechts W., Barbier F. Clin.
Chim. Acta, 1976, v. 70, p. 197.

21a. Beke R., De Weerdt G. A., Barbier F. J. Chromat., 1980, v. 193, p. 504.

22.	Belobaba D. T. E., Carlson G. L., La Russo N. F. J. Chromat., 1979, .
v. 172, p. 410.

22a. Beppu T., Seyama У., Rasama T., Yamakawa T. J. Biochem., 1981, v. 89,
p. 1963.

23.	Bergamini C., Veronese W. Sperim. Sez. Chim. Biol., 1953, v. 4, p. 79.

24.	Bergmayer H. U. (Editor). Grundlagen der Enzymatischen Analyse. Ver-
lag Chemie. Weinheim, New York. 1977, pp. 45—146.

25.	Blass K. G., Persaud D. Abstr. Papers, Am. Chem. Soc. Joint Conf., 1977,
v. 51.

26.	Bloch C. A., Watkins J. B. J. Lipid Res., 1978, v. 19, p. 510.

27.	Boucard M., Massa V., Serrano J. J., Susplugas P., Sincholte D. Trav.
Soc. Pharm. Montpellier, 1974, v. 34, p. 19.

28.	Braun P., Nemedy K., Vdradi D. A., Klebovich I. Magy. Belorv. Arch.,
1978, v. 31, p. 17.

29.	Briggs T., Lipsky S. R. Biochem. Biophys. Acta, 1965, v. 97, p. 579.
30.	Bruusgaard A., Pedersen L, R., S<t>rensen H. Clin. Chim. Acta, 1979,
v. 93, p. 1.

31.	Bruusgaard A., S$rensen H.t Gilhuus-Moe С. C., Skalhegg B. A. Clin.
Chim. Acta, 1977, v. 77, p. 387.

32.	Brydon W. G., Tadesse R., Smith D. M., Eastwood M. A. J. Chromat.,
1979, v. 172, p. 450.

33.	Budzikiewich H., Djerassi C., Williams D. H. Structure Elucidation of
Natural Products by Mass Spectrometry. Holden-Day, San Francisco,
1964, v. II.

34.	Campbell R. L., Gantt J. S., Nigro N. D. J. Chromat., 1978, v. 155, p. 427.

35.	Campbell С. B., McGuffie C., Powell L. W. Clin. Chim. Acta, 1975, v. 63,
p. 249.

35a. Cantafora A., Di Biase A., Angelico M., Attilli A. F., Capocaccia L. Clin
Res., 1980, v. 28, p. 628A.

36.	Carbis R. A., Rodda S. J., Hampson A. W. J. Chromat., 1979, v. 173,
p. 182.

37.	Cass 0. W., Cowen A. E., Hofmann A. F., Coffin S. B. J. Lipid Res.,
1975, v. 16, p. 159.

38.	Chaves M. N. J. Chromat., Biomed. Appl., 1979, v. 162, p. 71.

39.	Chaves M. N., Krone C. L. J. Lipid Res., 1976, v. 17, p. 545.

40.	Child P., Kuksis A., Myher J. J. Canad. J. Biochem., 1979, v. 57, p. 639.

41.	Christie W. H. M., Macdonald L. A., Williams C. N. J. Clin. Lab. Med.,
1975, v. 85, p. 505.

41a. Clayton P. T., Muller D. P. P. Clin. Chim. Acta, 1980, v. 105, p. 401.

42.	Cohen В. I., Raicht R. F., Salen G., Mosbach E. H. Anal. Biochem., 1975,
v. 64, p. 567.

43.	Cowen A. E., Korman M. G., Hofmann A. F., Turcotte J., Carter J. A.
J. Lipid Res., 1977, v. 18, p. 692.

44.	Cowen A. E„ Korman M. G., Hofmann A. F., Turcotte J., Carter J. A.
J. Lipid Res., 1977, v. 18, p. 698.

45.	Crisafio R., Chatten I. G. J. Am. Pharm. Ass. Sci. Ed., 1955, v. 44, p. 529.

46.	Crotte A. M., Planche N. E. Clin. Chim. Acta, 1970, v. 27, p. 331.

46a. Dayal B., Speck J., Bagan E., Tint G. S., Salen G. Steroids, 1981, v. 37,
p. 239.

466. DeMark B. R., Klein P. D. J. Lipid Res., 1981, v. 22, p. 166.

47.	Demers L. M., Hepner G. Clin. Chem., 1976, v. 22, p. 602.

48.	De Wael J., Raaymakers С. E., Endeman H. J. Clin. Chim. Acta, 1977,
v. 79, p. 465.

49.	Eastwood M. A., Hamilton D. Biochem. J., 1967, v. 105, p. 37.

50.	Eastwood M. A., Hamilton D., Mowbray L. J. Chromat., 1972, v. 65,
p. 407.

51.	Ellin R. I., Mendeloff A. I., Turner D. A. Anal. Biochem., 1962, v. 4,
p. 198.

52.	Elliot W. H. in Waller G. R. (Editor) Biochemical Applications of Mass
Spectrometry. Wiley-Interscience. New York. 1972, pp. 291—312.

53.	Elliot W. H., Walsh L. B., Mui M. M., Thorne M. A., Siegfried С. M.
J. Chromat., 1969, v. 44, p. 452.

54.	Eneroth P. J. Lipid. Res., 1963, v. 4, p. 11.

55.	Eneroth P. in Marinetti G. V. (Editor). Lipid Chromatographic Analysis.
Marcel Dekker. New York. 1969, v. 2, pp. 149—186.

56.	Eneroth P., Hellstrom K., Sjovall J. Acta Chem. Scand., 1968, v. 22,
p. 1729.

57.	Eneroth P.f Sjovall J. Methods Enzymol., 1969, v. 15, p. 237.

58.	Engart R., Turner M. D. Anal. Biochem., 1973, v. 51, p. 399.

59.	Evrard E. J. Chromat., 1967, v. 27, p. 40.

60.	Evrard E., Janssen G. J. Lipid Res., 1968, v. 9, p. 226.

61.	Fausa O. Scand. J. Gastroenterol., 1975, v. 10, p. 747.
62.	Feher Т., Kazik М. Magyar Kem. Foly., 1972, v. 78, p. 186.

63.	Feher T., Papp J., Kazik M. Clin. Chim. Acta, 1973, v. 44, p. 409.

64.	Feher T., Papp J., Kazik M. Z. Klin. Chem. Klin Biochem., 1973, v. 11,
p. 376.

65.	Forist A. A., Johnson J. L. in Higulchi T. and Brochmann—Hanssen
(Editors). Pharmaceutical Analysis. Interscience. New York, London. 1961,
pp. 114—119.

66.	Forth W., Doenecke P., Glasner H. Klin. Wochschr., 1965, v. 43, p. 1102»

67.	Galeazzi R.,	Kok E., Javitt N. J. Lipid Res., 1976,	v.	17, p. 288.

68.	Gilhuus-Moe	С. C., Gogstad	G. Z. Anal. Chem., 1978,	v. 290, p. 181.

69.	Goswami S. K, Frey C. F. J. Chromat., 1974, v. 89, p. 87.

70.	Goswami S.	K., Frey C. F.	J. Chromat., 1974, v.	100,	p. 200.

71.	Goswami S.	K., Frey C. F.	Biochem. Aled., 1977,	v.	17, p. 20.

72.	Goswami S. K., Frey C. F. J. Chromat., Biomed. Appl., 1978, v. 145,
p. 147.

73.	Goto J., Hasegawa M., Kato H, Nambara T. Clin. Chim. Acta, 1978,
v. 87, p. 141.

73a. Goto J., Kato H., Nambara T. J. Liquid Chromat., 1980, v. 3, p. 645.

736. Goto J., Kato H., Nambara T. J. Liquid Chromat., 1980, v. 3, p. 991.

73b. Goto J., Kato H., Nambara T. Lipids, 1978, v. 13, p. 908.

74.	Gorog S.f Tomcsanyi L. Acta Chim. Hung., 1966, v. 47, p. 121.

75.	Greim H., Czygan P., Schaffner F.f Popper H. Biochem. Med., 1973, v. 8,
p. 280.

76.	Grundy S. M., Ahrens E. H., Miettinen T. A. J. Lipid. Res., 1965, v. 6,
p. 397.

76a	. Guffroy A., Baylocq D., Pellrin F., Ferrier J. P. Compt. Rend. Ser. C.,
1980, v. 290, p. 393.

766. Guveli D. E., Barry B. W. J. Chromat., 1980, v. 202, p. 323.

77.	Hara S.f Takeuchi M.f Tachibana M., Chihara G. Chem. Farm. Bull. (To-
kyo), 1964, v. 12, p. 483.

78.	Harris W. S., Marai L., Myher J. J., Subbiah M. T. R. J. Chromat., 1974,
v. 131, p. 437.

79.	Hashimoto H., Itagaki Y., Makino I., Nakagawa S. Rinsho Kensa, 1976,
v. 20, p. 70.

80.	Haslewood G. A. D., Murphy G. M., Richardson J. M. Clin. Sci., 1973,
v. 44, p. 95.

81.	Heftmann E. Chromatography of Steroids. Elsevier, Amsterdam, Oxford,
New York, 1976, pp. 71—76.

82.	HenegGuwen G. P., van Berge Ruben A., Brandt К- H. Clin. Chim. Acta,
1974, v. 54, p. 249.

83.	Hofmann A. F. in James A. T., Morris L. J. (Editors). New Biochemical
Separations. Van Nostrand, New York, 1964, pp. 261—282.

84.	Holmes W. L., Stack F. Biochim.	Biophys. Acta, 1962, v.	56, p.	163.

85.	Ho-Ngoc-Chau, Bali J. P., Solere	M. Clin. Chim. Acta, 1977, v. 75,	p. 41.

86.	Huang С. T. L., Nichols B. L. J.	Chromat., 1975, v. 109,	p. 427.

87.	Huang С. T. L., Nichols B. L. J.	Chromat., 1974, v. 101,	p. 235.

87a. Huang С. T. L., Szezepanik P. A., Nichols B. L. J. Chromat., 1980,
v. 196, p. 150.

88.	Igimi H. Life Sci., 1976, v. 18, p. 993.

89.	Ikawa S. J. Chromat., 1976, v. 117, p. 227.

90.	Ikawa S., Goto M. J. Chromat., 1975, v. 114, p. 237.

90a. Ikenoya S., Hiroshima O., Ohmae M., Kawabe K- Chem. Pharm. Bull.,
1980, v. 28, p. 2941.

91.	Imai K, Tamura Z., Mashige F., Osuga T. J. Chromat., 1976, v. 120,
' p. 181.

92.	Inoue M., Itoh M., Ishibashi M., Miyazaki H. Chem. Pharm. Bull., 1974,
v. 22, p. 1949.
-93.	Iwata Т.,	Yamasaki К. J. Biochem. (Tokyo),	1964, v. 56, p. 424.

93a.	Janini G.	M., Manning W. B., Zielinski W.	L., Muschik G. M. J.	Chro-

mat., 1980, v. 193, p. 444.

*94.	Jefferson	W. E., Chang F. C. Anal. Letters,	1976, v. 9, p. 429.

95.	♦	Jones D.	C., Melchior G. W., Reewes M. J. W. J. Lipid Res., 1976,	v.	17,

p. 273.

96.	Kanno T., Tominaga K>, Fujii T., Funatani F. J. Chromat. Sci., 1971, v. 9,
p. 53.

97.	Karlaganis G., Paumgartner G. J. Lipid Res., 1978, v. 19, p. 771.

98.	Karlaganis G., Paumgartner G. J. High Resol. Chromat., 1978, v. 1,
p. 54.

99.	Karlaganis G., Paumgartner G. Clin. Chim. Acta, 1979, v. 92, p. 19.

99a. Karlaganis G., Schwarzenbach R. P., Paumgartner G. J. Lipid Res., 1980,
v. 21, p. 377.

100.	Kellog T. F. J. Lipid Res., 1970, v. 11, p. 498.

101.	Kelsey M. I., Sexton S. A. J. Chromat., 1977, v. 133, p. 327.

101a. Kemula W., Kutner W. J. Chromat., 1981, v. 204, p. 131.

102.	Kim H. K., Kritchevsky D. J. Chromat., 1976, v. 117, p. 222.

103.	Klaassen C. D. Clin. Chim. Acta, 1971, v. 35, p. 225.

104.	Kuksis A. Methods Biochem. Anal., 1966, v. 14, p. 325.

105.	Kuksis A. in Nair P. P., Kritchevsky D. (Editors). The Bile Acids, Ple-
num Press, New York, 1971, vol. 1, pp. 173—208.

106.	Kuksis A., Child P., Myher J. J., Marai L., Yosef I. M., Lewin P. K. Can.
J. Biochem., 1978, v. 56, p. 1141.

106a	. Kuksis A., Child P. J. Am. Oil Chem. Soc., 1980, v. 57, p. 149.

1066. Kuksis A., Child P. Lipids, 1980, v. 15, p. 770.

107.	Kuksis A., Gordon B. A. Can. J. Biochem. Physiol., 1963, v. 41, p. 1355.

108.	Kuramoto T., Cohen В. I., Mosbach E. H. Anal. Biochem., 1976, v. 71,
p. 481.

108a. Kuriyama R., Ban Y., Nakashima T. Steroids, 1979, v. 34, p. 2540.

109.	Laatikainen T., Hesso A. Clin. Chim. Acta, 1975, v. 64, p. 63.

110.	Laatikainen T., Lehtonen P., Hesso A. Clin. Chim. Acta, 1978, v. 85,
p. 145.

111.	Lapage G.,	Fontaine A., Roy С. C. J. Lipid	Res.,	1978, v.	19,	p.	505.

Illa.	Lapage G.,	Roy С. C., Weber A. M. J. Lipid	Res.,	1981, v. 22,	p. 705.

112.	Levin S. J.,	Irvin J. L., Johnston C. G. Anal. Chem., 1961,	v.	33,	p. 856.

113.	Levitt M. J.	Anal. Chem., 1973, v. 45, p. 618.

114.	Macdonald I. A. Clin. Biochem., 1976, v. 9, p. 153.

115.	Macdonald I. A. J. Chromat., 1977, v. 136, p. 348.

116.	Macdonald I. A.t Williams C. N., Mahony D. E. Anal. Biochem., 1974,
v. 57, p. 127.

116a. Macdonald I. A., Williams C. N.f Musial В. C. J. Lipid Res., 1980, v. 21,
p. 381.

117.	Macioci F., Fiotek C. Boll. Chim. Farm., 1976, v. 115, p. 457.

118.	Madsen D., Beaver M., Chang L., Bruckner-Kardoss E., Wostmann B.
J. Lipid Res., 1976, v. 17, p. 107.

119.	Maentausta O., Janne O. Clin. Chem., 1979, v. 25, p. 264.

120.	Makino L, Shinozaki K-> Nakagawa S.t Mashimo K- J. Lipid Res., 1974,
v. 15, p. 132.

121.	Makino L, Sjovall J. Anal. Letters, 1972, v. 5, p. 341.

122.	Makino L, Tashiro A., Hashimoto H., Nakagawa S., Yoshizawa I. J. Li-
pid Res., 1978, v. 19, p. 443.

123.	Makita M., Welts W. W. Anal. Biochem., 1963, v. 5, p. 523.

123a. Maruyama K-, Tanimura H„ Hisaka Y. Clin. Chim. Acta; 1980, v. 100,
p. 47.

124.	Mashige F., Imai K-, Osuga T. Clin. Chim. Acta, 1976, v. 70, p. 79.

125.	Matern S., Krieger R., Gerok W. Clin. Chim. Acta, 1976, v. 72, p. 39.
126.	Mater п S., Tietjen К., Mater n H., Gerok W. in Pal S. B. (Editor). En-
zyme Labelled Immunoassay of Hormones and Drugs, de Gruyter, Ber-
lin, New York. 1978, p. 457.

127.	Mihas A. A., Spenney J. C., Hirschowitz В. I., Gibson R. G. Clin. Chim.
Acta, 1977, v. 76, p. 389.

127a. Minigrone G., Greco A. V., Passi S. J. Chromat., 1980, v. 183, p. 277.

128.	Miyazaki H., Ishibashi M., Inoue M., Itoh M., Kubodera T. J. Chromat.,
1974, v. 99, p. 553.

129.	Miyasaki H., Ishibashi M., Yamashita K. Biomed. Mass. Spectrom., 1978,
v. 5, p. 469.

130.	Mott G. E., Moore R. W., Reiser R. J. Lipid Res., 1971, v. 12, p. 117.

131.	Murata M., Kuramoto T., Hoshita T. Steroids, 1978, v. 31, p. 319.

132.	Murphy G. M., Billing В. H., Baron D. N. J. Clin. Pathol., 1970, v. 23,
p. 594.

133.	Murphy G. M., Edkins S. M., Williams J. W., Catty D. Clin. Chim. Acta,
1974, v. 54, p. 81.

134.	Musial В. C., Williams C. N.	J.	Lipid Res., 1979, v. 20, p. 78.

134a.	Nakayama F., Nakagaki M.	J.	Chromat., 1980, v. 183, p. 287.

135.	Namabara T., Goto J., Kato	H.	Abstr. Papers Am. Chem. Soc.	177. Meet.

Pt. 1, Anal. 4, 1979.

135a. Namabara T., Goto J., Hasegawa M., Kato H. in Hawk G. L. (Editor).
Biological/Biomedical Applications of Liquid Chromatography IL, Marcel
Dekker, New York, 1979, p. 359.

136.	Neher R. in Stahl E. (Editor). Thin-Layer Chromatography. Springer,
Berlin, Heidelberg, New York, 1969, pp. 351—354.

137.	Nishikawa J., Yamashita K-, Ishibashi M., Miyazaki H. Chem. Pharm.
Bull., 1978, v. 26, p. 2922.

138.	Oh S. Y., Dupont J. Lipids, 1975, v. 10, p. 340.

139.	Okishio T., Nair P. P., Gordon M. Biochem. J., 1967, v. 102, p. 654.

140.	Okuyama S., Uemura D., Hirata Y. Chem. Letters, 1976, v. 9, p. 679.

141.	O'Moore R. R., Percy-Robb I. W. Clin. Chim. Acta, 1973, v. 43, p. 39.

142.	Osuga T., Mitamura K-, Mashige F., Imai K. Clin. Chim. Acta, 1977,
v. 75, p. 81.

143.	Pageaux J. F. Duperray B., Anker D., Dubois M. Steroids, 1979, v. 34,
p. 73.

144.	Palmer К. H. in Clayton R. B. (Editor). Methods in Enzymology. Acade-
mic Press. New York, London. 1969, v. 15, pp. 280—282.

145.	Parmentier G., Eyssen H. J. Chromat., 1978, v. 152, p. 285.

146.	Parris N. A. J. Chromat., 1977, v. 133, p. 273.

147.	Pesez M. Ann. Pharm. France, 1953, v. 11, p. 670.

148.	Pesez M., Bartos J. Taianta, 1960, v. 5, p. 216.

149.	Pesez M., Bartos J. Taianta, 1969, v. 16, p. 331.

150.	Pramanik B. N. Dissertation Abstr. Intern. 1977, v. 38, p. 2680.

151.	Prochazka Z. in Deye Z., Macek K., Janak J. (Editors). Liquid Column
Chromatography. Elsevier, Amsterdam, Oxford, New York. 1975, pp. 617—
618.

152.	Roda A., Roda E., Aldini R., Festi D., Mazella G., Sama C., Barbara L.
Clin. Chem., 1977, v. 23, p. 2107.

153.	Roda A., Roda E., Mazella G., Sama C., Barbara I. Steroids, 1978, v. 32,
p. 13.

154.	Roseleur O. L, van Gent С. M. Clin. Chim. Acta, 1976, v. 66, p. 269.

155.	Ross P. E., Pennington C. R., Bouchier I. A. D. Anal. Biochem., 1977,
v. 80, p. 458.

156.	Sacquet E., Leprince C., Riottot M., Mejean C., Raibaud P. Steroids, 1978,
v. 32, p. 1.

157.	Sandberg D. H., Sjovall J., Sjovall K., Turner D. A. J. Lipid Res., 1965,
v. 6, p. 182.
158.	Schalm S. W.t Van Berge-Henegouwen G. P., Hofmann A. F., Cowen A. E.,
Turcotte J. Gastroenterology, 1977, v. 73, p. 285.

159.	Semenuk G., Beher W. T. J. Chromat., 1966, v. 21, p. 27.

160.	Shaw R., Elliot W. H. Anal. Biochem., 1976, v. 74, p. 273.

161.	Shaw R.,	Elliot	W. H. J. Lipid Res., 1978, v. 19, p. 783.

162.	Shaw R.,	Smith	J. A., Elliot W. H. Anal. Biochem., 1978,	v.	86,	p.	450.

163.	Sheltawy	M. L,	Losowsky AL S. Clin. Chim. Acta, 1975,	v.	64,	p.	127.

164.	Shepherd	R. W.,	Bunting P. S., Khan M., Hill J. G., Soldin S.J., Gall D. G.

Clin. Biochem., 1978, v. 11, p. 106.

165.	Shimada K-, Hasegawa M., Goto J., Nambra T. J. Chromat., 1978, v. 152,
p. 431.

166.	Shino M., Nezu Y., Tateyama T., Sakaguchi K, Katayama K, Tsutsumi Y.,
Kawabe K. Yakugaku Zasshi, 1979, v. 99, p. 421.

167.	Simmonds W. J., Korman M. G., Go V. L. W., Hofmann A. E. Gastro-
enterology, 1973, v. 65, p. 705.

168.	Siskos P. A., Cahill P. T., Javitt N. B. J. Lipid Res., 1977, v. 18, p. 666.

169.	Sjovall J. Acta Chem. Scand., 1962, v. 16, p. 1761.

170.	Sjovall J. Methods Biochem. Anal., 1964, v. 12, p. 97.

171.	Sjovall J. in Grant J. K. (Editor) Gas-Liquid Chromatography of Ste-
roids. Cambridge University Press, 1967, pp. 243—257.

172.	Sjovall J., Eneroth P., Ryhage R. in Nair P. P., Kritchevsky D. (Editors).
The Bile Acids. Plenum Press. New York, 1971, v. 1, pp. 209—248.

173.	Sjovall J., Meloni C. R., Turner D. A. J. Lipid Res., 1961, v. 2, p. 317.

174.	Skrede S., Solberg H. E., Blomhoff J. P., Gjone E. Clin. Chem., 1978,
v. 24, p. 1095.

175.	Smith J. L., Van den Heuvel W. J. A. Anal. Letters, 1972, v. 5, p. 51.

176.	Spears R., Vukusich D., Mangat S., Reddy B. S. J. Chromat., 1976, v. 116,
p. 184

177.	Stellaard F., Hachey D. L., Klein P. D. Anal. Biochem., 1978, v. 87,
p. 359.

178.	Subbiah M. T. R. Ann. Clin. Lab. Sci., 1973, v. 3, p. 372.

179.	Subbiah M. T. R. J. Lipid Res., 1973, v. 14, p. 692.

180.	Subbiah M. T. R., Tyler N. E.t Buscaglia M. D., Marai L. J. Lipid Res.,
1976, v. 17, p. 78.

181.	Szczepanik P. A., Hachey D. L., Klein P. D. J. Lipid Res., 1976, v. 17,
p. 314.

182.	Szczepanik P. A.f Hachey D. L., Klein P. D. J. Lipid Res., 1978, v. 19,
p. 280.

183.	Szczepanik P. A., Hachey D. L., Thistle J. L., Hofmann A. F.t Klein P.D.
Gastroenterology, 1975, v. 69, p. 869.

184.	Szepesi G.t Gorog S. Acta Pharm. Hung., 1973, v. 43, p. 269.

185.	Takanashi M., Raicht R. F., Sarwal A. N., Mosbach E. H., Cohen В. I,
Anal. Biochem., 1978, v. 87, p. 594.

186.	Taylor W. A., Blass К G., Ho C. S. J. Chromat, 1979, v. 168, p. 501.

187.	The National Formulary XIV, American Pharmaceutical Association, Wa-
shington, 1975, p. 172.

187a	. Tohma M., Nakata Y., Yamada H., Kurosawa T., Makino I., Nakagawa S.
Chem. Farm. Bull., 1981, v. 29, p. 137.

1876.	Touchstone J. C., Levitt R. E., Soloway R. D.f Levin S. S. J. Chromat.,
1979, v. 178, p. 566.

188.	Tsuda K, Sato Y., Ikekawa N., Tanaka S., Higashikuze H.f Suzuki S.,
Ohkobo K., Anazawa Y. Chem. Pharm. Bull., 1964, v. 12, p. 710.

189.	Turley S. D., Dietschy J. M. J. Lipid Res., 1978, v. 19, p. 924.

190.	Uji A. Yakugaku Zasshi, 1975, v. 95, p. 214.

191.	Van Berge-Henegouwen G. P., Hoffman A. F. Clin. Chim. Acta, 1976,
v. 73, p. 469.
192.	Van den Berg J. W. 0., Van Blankenstein M., Bosman-Jacobs E. P.,
Frenkel M., Horchner P., Oost-Harwig О. I., Wilson J. H. P. Clin. Chim.
Acta, 1976, v. 73, p. 277.

193.	Van den Heuvel W. J. A., Sjovall J., Horning E. C. Biochim. Biophys.
Acta, 1961, v. 48, p. 596.

194.	Van den Heuvel W. J. A., Sweeley С. C., Horning E. C. Biochim. Biophys.
Res. Comm., 1960, v. 3, p. 33.

195.	Villmo P., Finholt P. Medd. Nor. Farm. Selsk., 1978, v. 40, p. 127.

196.	Wael J. D., Raaymakers С. E., Endeman H. J. Clin. Chim. Acta, 1977,
v. 79, p. 465.

197.	Webb G. R.f Macdonald I. A., Williams C. N. Clin. Chem., 1977, v. 23,
p. 460.

198.	Willemart R., Fer det J. Ann. Pharm. France, 1959, v. 17, p. 336.

198a. Y tinker R. L., Hassan A. S., Subbiah M. T. R. Clin. Chem., 1981, v. 27,
p. 1780.

199.	Yousef I. M.f Fisher M. M.f Myher J. J„ Kuksis A. Anal. Biochem., 1976,
v. 75, p. 538.
7

СЕРДЕЧНЫЕ ГЛИКОЗИДЫ

7.1.	ОСНОВЫ ХИМИИ СЕРДЕЧНЫХ ГЛИКОЗИДОВ [10]

Углеродный скелет стероидных агликонов (генинов) сердеч-
ных гликозидов характеризуется следующими особенностями:
а) А/В-г{ис-сочленением колец,
б) В/С-траяс-сочленением колец,
в) С7/)-г{ис-сочленением колец (в отличие от других групп
стероидов),

г)	наличием в положении 17(3 ненасыщенной пятичленной
лактонной группы (карденолиды) или шестичленной лактонной
группы с двумя двойными связями (буфадиенолиды),

Таблица 7.1. Некоторые важные компоненты Digitalis lanata и Digitalis
purpurea (все производные содержат бутенолидное кольцо
в 17(3-положении)

е( к О.	Соединение а	Заместитель			
		3₽	123	143	163
А	Ланатозид А	О—D—D—DAc—G	н	он	н
	Десланозид А	О—D—D—D—О	н	он	н
	Ацетилдигитоксин  (« и Р)	О—D—D—DAc	н	он	и
	Дигитоксин [трис(ди- гитоксозид)дигитокси- генина]	О—D—D—D	н	он	н
	Бис (дигитоксозид) ди- гитоксигенина	О—D—D	н	он	н
	Монодигитоксозид дигитоксигенина	О—D	н	он	н
	Дигитоксигенин	ОН	н	он	н
В	Ланатозид В	О—D—D—DAc—О	н	он	он
	гитоксин	О—D—D—D	н	он	он
	гитоксигенин	ОН	н	он	он
С	Ланатозид С	О—D—D—DAc—G	он	он	н
	дигоксин	О—D—D—D	он	он	н
	дигоксигенин	ОН	он	он	н
D	Ланатозид D	О—D—D—DAc—О	он	он	он
	дигинатин	О—D—D—D	он	он	он
	дигинатигенин	ОН	он	он	он
Е	Ланатозид Е	О—D—D—DAc—G	н	он	осон
	гиталоксин	О—D—D—D	н	он	осон
	гиталоксигенин	ОН	н	он	осон

a D — дигитоксоза, DAc — 3-ацетилдигитоксоза (а) и 4-ацетилдигитоксоза (3), G —
глюкоза.
д)	наличием оксигрупп в положениях 3 (обычно р), 14Р,
а также очень часто 12(3 или (что встречается реже) в положе-
ниях 1,5, 11, 16 и 19.

В природных гликозидах этих генинов сахарный остаток при-
соединен гликозидной связью к 3-оксигруппе. Помимо глюкозы
сахарный остаток состоит обычно из 6-дезоксисахаров рамнозы
и т. д. (или 2,6-дидезоксисахаров), дигитоксозы и т. д., их ме-
тиловых эфиров или ацетатов. В табл. 7.1 приведены основные
компоненты Digitalis lanata и Digitalis purpurea, важнейшие
лекарственные вещества этой группы и сопутствующие примеси.

Поскольку эти препараты оказывают действие на сердечную
мышцу, их уже в течение длительного времени используют для
лечения сердечной недостаточности. Важнейшие в терапии со-
единения (дигоксин, дигитоксин, ланатозид Сит. д.) извле-
кают из листьев Digitalis lanata и Digitalis purpurea. Заслу-
живают упоминания также такие полусинтетические производ-
ные, как р-метилдигоксин и гликозиды, получаемые из других
растений (уабаин, К-строфантозид, К-строфантин). Все они со-
держат в положении С-17 пятичленное ненасыщенное лактон-
ное кольцо. Менее важны производные с шестичленным лактон-
ным кольцом (сцилларен А). Последние получают из растений
и жаб.

R = H, дигоксин

R=CH3, а-метилдигоксин

Для производства дигоксина и дигитоксина в промышленном
масштабе необходимо не только выделение природных веществ,
но также и отщепление ацетильной группы концевой молекулы
глюкозы ланатозида С и А соответственно *.

* Производные, содержащие концевую молекулу глюкозы, называются
«первичными гликозидами», а производные только с тремя дигитоксозными
фрагментами — «вторичными гликозидами».
Из-за наличия сахарного остатка сердечные гликозиды ма-
лочувствительны к действию кислот и окислению. Наличие лак-
тонного кольца обусловливает их чувствительность к действию
щелочей. При метаболизме происходят постепенное разрушение
сахарных остатков и превращение ненасыщенного лактонного
кольца в насыщенное с образованием 20,22-дигидропроизводных.

7.2.	МЕТОДЫ АНАЛИЗА СЕРДЕЧНЫХ ГЛИКОЗИДОВ

7.2.1.	УЛЬТРАФИОЛЕТОВАЯ СПЕКТРОФОТОМЕТРИЯ

а, P-Ненасыщенное пятичленное лактонное (бутенолидное)
кольцо сердечных гликозидов имеет максимум поглощения при
215 нм. Несмотря на то что интенсивность данной полосы до-
вольно высока (1g 8 около 4,2 [20]), она находится в области
слишком коротких длин волн, чтобы ее можно было использо-
вать для количественных определений. Однако в последние
годы важность этой области длин волн значительно возросла
в связи с тем, что она позволяет применять очень удобный ме-
тод детектирования и количественного определения сердечных
гликозидов и агликонов с помощью высокоэффективной жидко-
стной хроматографии с УФ-детектором (см. разд. 7.2).

Наличие в шестичленных лактонах буфадиенолидов допол-
нительной двойной связи приводит к смещению максимума
поглощения в более длинноволновую область и позволяет про-
водить их количественное определение. Наиболее чувствитель-
ное и селективное определение можно провести в щелочном рас-
творе, в котором лактонное кольцо раскрывается и молекула
присутствует в виде енолята «сложноэфирного диена», что
в свою очередь сопровождается сильным батохромным и гипер-
хромным эффектами [143, 171]. Айниг и Майер [36] использо-
вали это явление для количественного определения мепросцил-
ларина в таблетках [Zmax (метанол) 297 нм, 8=61 000, Zmax
(1 М раствор КОН в метаноле) 355 нм, 8=44 600].

но он

Аналогичный принцип был положен Винце-Вермесом и др.
[162] в основу метода определения геллебрина и продуктов его
распада в экстрактах из растений после разделения методом
тонкослойной хроматографии.

7.2.2.	КОЛОРИМЕТРИЧЕСКИЕ МЕТОДЫ

Многообразие функциональных групп в молекулах сердеч-
ных гликозидов представляет самые различные возможности
для их колориметрического определения. В этой области опуб-
ликовано чрезвычайно большое число работ, так как до введе-
ния хроматографических методов колориметрические методы
служили единственным способом количественного определения
сердечных гликозидов. Колориметрические методы почти не
утратили своего значения, даже несмотря на появление хрома-
тографических методов анализа. Более того, предварительное
разделение с помощью тонкослойной бумажной или колоночной
хроматографии значительно расширило область применения ко-
лориметрических методик и повысило их селективность. Коло-
риметрические методы по-прежнему сохраняют свое значение:
все приводимые в последних изданиях фармакопей методики
определения сердечных гликозидов в массе фабричного про-
дукта и в готовых лекарственных формах включают колоримет-
рическое обнаружение после хроматографического разделения.

Уникальным источником литературы по этому вопросу слу-
жит монография Бартоша и Пезе [9]. Здесь будет рассмотрено
только несколько методик, которые еще сохранили свое значе-
ние (табл. 7.2).

Из представленных в табл. 7.2 методов определения различ-
ных дигитоксозидов в таблетках дигитоксина после хроматогра-
фического разделения на колонке среди других методов нахо-
дится классический метод Келлера—Килиани, в котором реа-
гентом служит смесь хлорида железа(III), серной кислоты и
уксусной кислоты [158].

Первоначальный метод Пезе [121], основанный на использо-
вании смеси ксантгидрола и соляной кислоты, подвергся раз-
личным изменениям, главным образом с целью стабилизации
окраски. Для этого соляную кислоту заменяли п-толуолсульфо-
кислотой [8] и вводили диксантилмочевину [4, 126, 145], из ко-
торой в процессе цветной реакции в кислой реакционной смеси
выделяется ксантгидрол *. Данные, представленные в табл. 7.2,
показывают, что молярный коэффициент поглощения до некото-
рой степени зависит от экспериментальных условий, но в общем
этот метод очень чувствительный. Интересно отметить, что отно-
шение молярных коэффициентов поглощения первичных глико-
зидов ко вторичным равно 2 : 3. Это показывает, что в реакции
не участвует ни концевой фрагмент глюкозы, ни фрагмент аце-
тилдигитоксозы или дигитоксозы, с которыми они связаны гли-
козидной связью, поскольку реакция идет до образования
свободной дигитоксозы или других 2-дезоксиоз (цимарозы, оле-
андрозы). Уабаин, содержащий рамнозу, вообще не вступает
в реакцию. Огромным преимуществом ксантгидрольного метода
является то, что, если его сочетать с тонкослойной хроматогра-
фией, не нужна дополнительная реакция проявления пятен, так
как после обработки ксантгидролом пятна можно соскоблить и
проэкстрагировать тем же реагентом [68].

Как следует из табл. 7.2, чувствительность метода с перй-
одатом калия и тиобарбитуровой кислотой еще выше. Окрашен-
ный продукт образуется из 2-дезоксисахаров в две стадии. На
первой стадии в процессе окисления иодной кислотой образу-
ется малоновый альдегид, который после восстановления из-
бытка иодной кислоты мышьяковистой кислотой конденсируется
с тиобарбитуровой кислотой. Эта реакция весьма специфична
для 2-дезоксисахаров и их гликозидов. В отличие от ксантгид-
рольной реакции даже 3-метиловые эфиры 2-дезоксисахаров
дают положительную реакцию. Если реакцию с иодной кислотой

* Подробнее о диксантилмочевинном методе см. в разд. 7.3.1.
Таблица 7.2. Некоторые колориметрические методы определения сердечных
гликозидов

Автор	Год	Функциональная груп- па, вступающая в реакцию	Реагент	
Pharm. Helv. VI [123]	1971	Стероидное ядро	84%-ная Н3РО4	
Эванс и др. [43]	1974	Стероидное ядро	Хлорид сурьмы(III)	
Кеннеди [84]	1950	Бутенолидное кольцо	Пикриновая кислота— гидроксид тетраэтилам- мония	
Кафаги и Гиргис [85]	1974	Бутенолидное кольцо	Пикриновая кислота— гидроксид натрия	
Рабич и Юнглинг  [127]	1969	Бутенолидное кольцо	2,2',4,4'-Тетранитроди- фенил — гидроксид нат- рия	
Бёрнс [18]	1976	Бутенолидное кольцо	1,3,5-Тринитробензол— гидроксид натрия	
Меснард и Дево [102, 103]	1961	Сахарный остаток	Иодная кислота, затем мышьяковистая кислота, затем тиобарбитуровая кислота	
Майрик [109]	1969	Сахарный остаток	Иодная кислота, затем мышьяковистая кислота, затем тиобарбитуровая кислота	
Жуль [79]	1975	Сахарный остаток	Иодная кислота, затем мышьяковистая кислота, затем тиобарбитуровая кислота	
Татье [152]	1954	Сахарный остаток	Хлорид железа (III) — серная кислота—уксус- ная кислота	
Бартош [8]	1963	Сахарный остаток	Кса нтги д рол—zi-то луол- сульфокислота	
Бикан-Фистар и Меркас [12]	1969	Сахарный остаток	Диксантилмочевина	
Пёттер и Бариш [124—126]	1963—1972	Сахарный остаток	Диксантилмочевина	
Сцилаги и др. [149]	1977	Сахарный остаток	Ксантгидрол—соляная кислота	

а Данные не приведены.

б Из работы [68а].
	^max« нм	Молярный коэффициент поглощения	Анализируемый образец	Предварительное хро- матографическое раз- деление
	474	а	Дигоксин, таблет- ки дигитоксина	—
	540, 592	4000 (сумма агликонов)	Экстракты расте- ний	ТСХ
	495	28 000 гитоксигенин  17 400 дигитоксин  15 400 дигоксин  12 900 ланатозид С	Стандартные образцы	—
	494	а	Готовые лекарст- венные формы экстрактов расте- ний	ТСХ
	630	26 800 (дигитоксин)	Дигитоксин	ТСХ, бумажная хроматография
	565	11 400 (дигитоксин), 13 000 (уабаин)	Стандартные образцы	—
	532	15 800 6	Стандартные образцы	
	530	а	Таблетки дигок- сина	—
	530	а	Таблетки дигок- сина	—
	600	а	Дигитоксин, гитоксин	—
	570	а	Стандартные об- разцы	—
	535	а	Дигитоксин, гитоксин	ТСХ
	530	64 000 (дигоксин)  45 000 (ланатозид С)	Экстракты расте- ний	ТСХ
	530	46 000 (дигитоксин)  32 000 (ланатозид А)	Экстракты расте- ний	Бумажная хрома- тография  4

f

28 Заказ № 182
проводить при комнатной температуре, то реагируют толька
концевые остатки сахаров. Если концевые фрагменты содержат
глюкозу (например, ланатозид С) или 3-ацетилдигитоксозу (на-
пример, ацетилдигоксин), реакция не идет. Однако с повыше-
нием температуры и увеличением времени эти производные
также дают положительную реакцию. В случае тридигитоксози-
дов чувствительность метода возрастает, но в то же время зна-
чительно понижается воспроизводимость [68]. Следует отметить,
что Майрик [109] и Джул [79] приспособили периодатно-тиобар-
битуратный метод для проведения автоматизированного анализа.

В дополнение к вышеуказанным методам, основанным на
реакциях остатков сахаров сердечных гликозидов, существует
ряд методов, использующих наличие в молекулах бутенолид-
ного кольца. Эти методы пригодны для определения всех гли-
козидов, а также агликонов, имеющих аналогичную молекуляр-
ную основу. В большинстве случаев при этом используют
ароматические динитро- и тринитропроизводные, например
jw-динитробензол, 3,5-динитробензойную кислоту, пикриновую
кислоту, 1,3,5-тринитробензол, 2,2/,4,4'-тетранитродифенил и т. п.
Все реакции проходят в щелочной среде и по механизму ана-
логичны реакции Циммерманна с участием 17-кетостероидов
(см. разд. 2.2). При этом происходит конденсация активной
группы бутенолидного кольца с ароматическим нитропроизвод-
ным в положение между его нитрогруппами [18, 88].

Из перечисленных методов наиболее важным в настоящее
время является, несомненно, метод, основанный на использова-
нии пикратов щелочных металлов. В фармакопеях [158] его ре-
комендуют для анализа фабричного продукта в массе и гото-
вых лекарственных препаратов. Хафаги и Гиргис [85] приме-
няли его для определения компонентов листьев дигиталиса по-
сле ТСХ-разделения.

Из других реагентов чувствительностью и устойчивостью ок-
раски образующихся продуктов отличается 2,2/,4,4'-тетранитро-
дифенил [127—129, 1646].

Известен также ряд методов, основанных на реакциях в сте-
роидном ядре с различными кислыми реагентами, которые при-
водят к образованию окрашенных продуктов. Возникновение
окраски, как правило, сопровождается флуоресценцией, что в
используют в анализе. Эти методы обсуждаются в следующем
разделе.

7.2.3.	ФЛУОРИМЕТРИЯ

Флуориметрические методы довольно часто используют для
определения сердечных гликозидов и агликонов. По сравнению
с колориметрическими методами они обладают рядом преиму-
ществ:

а)	высокой чувствительностью, что позволяет использовать
их для прямого анализа отдельных таблеток с низкой дозиров-
кой лекарственного вещества [15, 29, 104, 130, 154].

б)	поскольку эти методы основаны на реакциях в стероид-
ном ядре, они позволяют селективно определять одни производ-
ные в присутствии других. Например, с их помощью можно
определять гитоксин в присутствии дигоксина и дигитоксина,
используя в качестве флуорогенного реагента смесь концентри-
рованной соляной кислоты и глицерина (1:1) [75] или пропи-
ленгликоля [108]. Этот метод основан на дегидрировании гиток-
сина, имеющего 16-оксигруппу, до диангидропроизводного.

диангидрогитоксин

(7.2)

Характеристики некоторых важнейших флуорометрических ме-
тодов даны в табл. 7.3, взятой из работы Миллера [104]. Из
приведенных в этой таблице методов наиболее широкое распро-
странение получил метод, основанный на использовании в ка-
честве реагента смеси аскорбиновая кислота — пероксид водо-
рода—соляная кислота—метанол. Этот реагент использовали и

Таблица 7.3. Некоторые флуориметрические методы определения дигоксина

Автор	О	Реагент	Длина волны, нм		Относительная интенсивность флуоресценции
			к  о ПЮ Ч	испус- кания	
Дженсен [75]	1952	Соляная кислота — гли- церин (1:1) Аскорбиновая кислота — Н2О2—НС1—метанол	350	490	2
Уэллс и др. [170]	1961		360	480	ЮЗ
Яковлевич [71]	1963	Трифторуксусная кис- лота—уксусный ангид- рид—ацетилхлорид (3:1:1)	350	400	86
Миллер [104]	1974	Серная кислота—этанол (7:3)	380	410	100
другие исследователи [29, 72, 76, 142, 154]. Согласно методике
Уэллса и сотр. [170], образец растворяли в 2 мл 0,1 %-ного ме-
танольного раствора аскорбиновой кислоты. После добавления
3 мл концентрированной соляной кислоты и 0,2 мл 0,003 М. рас-
твора пероксида водорода смесь выдерживали в течение 30 мин
и регистрировали флуоресценцию при 490 нм для дигоксина и
570 нм для дигитоксина (возбуждение при 350 и 395 нм соот-
ветственно) *. Метод Уэллса и сотр. удобен для проведения
анализа в автоматическом режиме [29, 130].

Найк и др. [113] в качестве реагента для определения ди-
гоксина и дигитоксина применяли 96 %-ную серную кислоту.
Реагент Бабилева [5], предназначенный для анализа таблеток
гитоксина, представляет собой смесь серной кислоты и этанола,
а реагент Бриттена и Ньяу [15]— 10 %-ный (масса/объем) рас-
твор трихлоруксусной кислоты в 80 %-ном этаноле. (Этот же
реагент, но содержащий также хлорамин Т использовали Фрер-
жак и де-Граве [48].) Бриттен и Ньяу показали, что добавле-
ние последнего компонента несущественно.

Как и в случае стероидных гормонов (см. разд. 2.2.3 и
3.2.2), механизм флуорогенной реакции заключается в дегидри-
ровании и миграции двойных связей с образованием сопряжен-
ной системы, которая протонируется, давая способные к резо-
нансу структуры, подобные карбониевым ионам.

7.2.4.	КОЛОНОЧНАЯ ХРОМАТОГРАФИЯ

Выделение методом колоночной хроматографии — это одна
из стандартных стадий в получении гликозидов дигиталиса из
растительных экстрактов даже в промышленном масштабе. Ко-
лоночная хроматография всегда была и по-прежнему остается
важнейшим методом разделения и очистки при определении ин-
дивидуальных гликозидов в сложных смесях.

Широко применяется адсорбционная хроматография на си-
ликагеле [28, 81] или флорисиле [166], а также распределитель-,
ная хроматография с использованием в качестве неподвижной
фазы порошка целлюлозы, пропитанного формамидом [2, 57,
114, 116, 117], формамида на целите-535 [139] или кремнекислоты
[27]. В качестве подвижных фаз применяли смеси гептан—кси-
лол—метилэтилкетон [114, 116, 117], бензол [139], хлороформ
(с 1 % я-бутанола) [2] и т. п.

В фармакопее XX США [158] колориметрическому определе-
нию дигитоксина (в массе фабричной продукции или в готовом
лекарственном препарате) предшествует разделение методом

Другой вариант этой методики описан в разд. 7.3.2.
распределительной хроматографии на кремнеземах, покрытых
формамидом, в качестве неподвижной фазы и смесью бензол—
хлороформ (3:1) в качестве подвижной фазы. После элюиро-
вания дигитоксина можно выделить хлороформом сопутствую-

Рис. 7.1. Фракционирование
меченных тритием дигидро-
дигоксина (/) и дигоксина
(2) на колонке (40X1 см),
заполненной DEAE-сефа-
дексом LH-20, смесью хло-
роформ—метанол (17 : 3)
со скоростью	потока

0,25 мл/мин [146].

щие более полярные гликозиды и определить их колориметри-
чески в отдельном тесте.

В последние годы для разделения сердечных гликозидов и
родственных веществ методом колоночной хроматографии реко-
мендуются почти исключительно декстрановые гели.

Эль-Олеми и Стос [37] использовали сефадекс LH-20 и
95 %-ный этанол в качестве элюента для отделения гликозидов,
от их агликонов. Для отделения гликозидов ряда дигитоксиге-
нина от гликозидов ряда дигоксигенина и частично от ряда ги-
токсигенина Цюллих и др. [179] опробовали различные смеси
растворителей на том же адсорбенте, среди которых наиболее-
эффективной оказалась смесь толуол—циклогексан—хлоро-
форм—метанол (4 : 4 : 1 : 1). Голт и др. [52] с помощью смеси
хлороформ—метанол (85 : 15) осуществляли отделение и коли-
чественное выделение дигоксина и его метаболитов из мочи.

Сагден и сотр. [146], а также Петерс и Калман [122] прово-
дили разделение дигоксина и его метаболита дигидродигоксина
на диэтиламиноэтоксилированном сефадексе LH-20 (DEAE-ce-
фадекс LH-20) при элюировании смесью хлороформ—метанол
(17 : 3) (рис. 7.1). С помощью этого адсорбента удалось улуч-
шить разделение по сравнению с необработанным сефадексом
LH-20.

7.2.5.	ТОНКОСЛОЙНАЯ ХРОМАТОГРАФИЯ

Проблемы разделения и детектирования

Сердечные гликозиды — наиболее полярная группа стерои-
дов, и даже их агликоны умеренно полярны по сравнению с дру-
гими стероидами. Поэтому методы распределительной хромато-
графии, а также бумажной хроматографии всегда играли важ-
ную роль в их анализе. Прекрасный обзор методов разделения
карденолидов бумажной и тонкослойной хроматографией опуб-
ликован Новером [115]. В этом разделе кратко рассмотрена
только тонкослойная хроматография.

Величины R/ некоторых важнейших сердечных гликозидов
в различных смесях растворителей приведены в табл. 7.4. Из
приведенных данных видно, что ни одна из указанных смесей
не позволяет разделить все производные. На практике в боль-
шинстве случаев, которые требуют проведения тонкослойной
хроматографии (ТСХ), присутствует еще большее число компо-
нентов, чем приведено в табл. 7.4. Поэтому следует либо ис-
пользовать по крайней мере две различные комбинации раство-
рителей, либо применять как адсорбционную, так и распредели-
тельную ТСХ или ТСХ в сочетании с бумажной хроматографией.

В особо трудных случаях необходимо разделение специаль-
ными смесями растворителей и многократное опрыскивание.
Например, для разделения таких пар, как 20(R)- и 20(S)-про-
изводные 20,22-дигидродигитоксигенина, Йошиока и Фуллертон
[177] использовали различные смеси дихлорметана, этилацетата
и метанола (в данном случае смесь 20 : 2 : 1).

Для разделения сложных смесей успешно применяется также
двумерная ТСХ. Кларк и Кобб [25] с помощью этого метода
разделяли карденолиды из листьев Digitalis lanata. Применяя
смесь этилацетат—дихлорметан—метанол—вода (120 :’72 : 7 : 4)
для разделения в одном направлении и смесь дихлорметана и
метанола (9:1) —в другом, им удалось выделить и идентифи-
цировать 31 производное.
Таблица 7.4. ТСХ-разделение гликозидов дигиталиса на силикагеле
(кизельгель 60) при помощи смеси дихлорметан—метанол—вода
[68а]

Стероид			
	90 : 9 :1	85 : 13,5 : 1,5	80 : 18 : 2
Дезацетилланатозид С	3	13	38
Дезацетилланатозид А	4	23	51
Ланатозид С	5	26	58
Ланатозид В	6	29	61
Ланатозид А	8	35	66
Дигинатин	17	50	70
Дигоксин	24	53	71
Гитоксин	28	59	73
Гиталоксин	38	68	78
Дигитоксин	39	68	78
а-Ацетилдигоксин	39	68	78
а-Ацетилгитоксин	39	68	78
а-Ацетилдигитоксин	60	79	84
р-Ацетилдигоксин	43	72	81
р-Ацетилгитоксин	43	72	81
р-Ацетилдигитоксин	64	80	85
Бис (дигитоксозид) дигоксигенина	24	53	71
Монодигитоксозид дигоксигенина	24	54	71
Дигоксигенин	30	61	74
Бис (дигитоксозид) дигитоксигенина	39	68	78
Монодигитоксозид дигитоксигенина	40	71	79
Дигитоксигенин	54	76	82
Изодигоксин	41	70	81

Разделение можно улучшить, применяя специальные мето-
дики. Например, Целецки [148] разработал газофазную мето-
дику пропитки силикагелевых пластинок борной кислотой, кото-
рая образует комплексы с некоторыми гликозидами дигиталиса,,
изменяя их хроматографическую подвижность. Производные, со-
держащие г{Ш>1,2-диольную группу в концевом сахарном
остатке, в смеси хлороформ—метанол—уксусная кислота
(90:10:1) мигрируют медленнее, чем производные, содержа-
щие 1,3-диольную группу в стероидном ядре (7р,14|3-диол, 140,-
160-диол). Меггес и др. [99, 100] изучали влияние борной кис-
лоты и ее производных (а также других реагентов на диолы)
на подвижность карденолидов при разделении методом бумаж-
ной хроматографии. Целецки и Ланг [148а] установили, что фе-
нилборная кислота образует устойчивые циклические эфиры
с 1,3-диольными группами карденолидов, что облегчает их очи-
стку и разделение методом ТСХ.
Фабер [44], а также Картниг и Кобосил [82] для разделе-
ния гликозидов применяли ТСХ высокого разрешения. Окумура
[118а] распространил метод хроматографии на тонких слоях,
полученных спеканием, на сердечные гликозиды и другие сте-
роиды. Блох [12а] описал успешное использование силикагеле-
вых пластинок с обращенной Cis-фазой.

Для опрыскивания тонкослойных и бумажных хроматограмм
сердечных гликозидов и агликонов предложено большое число
реагентов [48, 115]. Для детектирования (и определения in situ)
разделенных компонентов (см. ниже) используют описанные
в разд. 7.2.2 и 7.2.3 колориметрические и флуорометрические
реакции.

Если опрыскивающий реагент необходим только для визу-
ального наблюдения пятен, чаще всего применяют растворы
серной [134, 145] и хлорной [78] кислот, особенно в сочетании
с анисовым альдегидом и ванилином [94, 140, 178]. Широко
применяют и другие кислые реагенты, например пары соляной
кислоты [44, 46], трихлоруксусную кислоту с различными до-
бавками [82, 158], смесь аскорбиновая кислота—соляная кис-
лота—пероксид водорода [74, 133] и смесь фосфорная кисло-
та—хлорид цинка—пероксид водорода [158]. Ароматические
нитропроизводные, например пикраты [85] и 3,5-динитробензо-
аты [164], используют главным образом в количественном ана-
лизе, однако в комбинации с иодом [12] их применяют и как
опрыскивающие реагенты. Сведения относительно селективно-
сти и чувствительности этих реагентов можно найти в ориги-
нальных работах.

Комбинируя различные опрыскивающие реагенты и другие
микрохимические реакции, можно идентифицировать неизвест-
ные производные, не смывая их с пластинок. Обсуждение таких
тиетодов [47, 115] выходит за пределы нашей книги.

Из новейших работ в этой области можно привести приме-
нение часто используемой радио-ТСХ методики [59] для выде-
ления и идентификации нового метаболита дигитоксина.

Количественный анализ с элюированием пятен

Тонкослойная хроматография играет в количественном опре-
делении карденолидов не меньшую роль, чем в качественном
анализе. Цель большого числа работ, посвященных этому во-
просу, заключается в разработке надежных методов определе-
ния индивидуальных производных в биологических образцах
и растительных экстрактах.

Ряд методов основан на элюировании пятен с последующим
колориметрическим определением. В качестве адсорбента
обычно используют силикагель. Описано также применение ки^
зельгура, пропитанного формамидом [126]. Пятна чаще всего
элюируют смесью хлороформ—метанол (1:1). Для этих целей
применяли основные колориметрические методики, описанные
в разд. 7.2.2: ксантгидрольный и диксантилмочевинный методы
[12, 61, 62, 126, 149] (последний [149] после разделения методом
бумажной хроматографии), пикратный метод [27, 58, 69, 85],
метод с 3,5-динитробензойной кислотой [55], тетранитродифе-
нильный метод [127] и метод с хлоридом сурьмы(III) [43]. Раз-
работаны также флуориметрический метод [72] и метод радио-
активных индикаторов (рубидий-86) [145] (см. разд. 7.2.9) в со-
четании с предварительным разделением ТСХ и элюированием
пятен.

Методы количественного определения in situ

В последние годы получили широкое распространение раз-
нообразные варианты методов анализа in situ. Бенчер и др. [6],
а также Картниг и Кобосил [82] показали возможность коли-
чественного определения без опрыскивания хроматограмм с по-
мощью спектрофотометрирования в отраженном свете при
225 нм. Этот метод в сочетании с ТСХ высокого разрешения
[82] позволяет определить очень малые количества вещества —
до 30 нг агликонов или 50 нг тетрагликозидов. Перед сканиро-
ванием хроматограммы формамид, используемый для пропитки
слоя силикагеля, удаляют нагреванием при 120°С в течение
30 мин. Относительное стандартное отклонение при определе-
нии 150 нг дигитоксигенина составляет ±2,37 %.

Недостатком описанного прямого метода является необхо-
димость использования довольно дорогого спектрофотометра
для сканирования хроматограмм, что препятствует применению
метода в большинстве лабораторий. Более доступны для таких
лабораторий разнообразные денситометрические и главным об-
разом флуориметрические методы, основанные на различных
химических реакциях.

Дёлкер и др. [33] описали успешное применение денситомет-
рического исследования тонкослойных хроматограмм после
опрыскивания такими реагентами, как ксантгидрол, тетранит-
родифенил или смесь соляная кислота—аскорбиновая кис-
лота—пероксид водорода. Последний реагент применяли также
Сабатка и др. [133].

В наиболее распространенном флуориметрическом методе
в качестве флуорогенного реагента использовали пары соляной
кислоты [44—46, 49, 50, 67, 160]. Пластинку, высушенную при
100—110°С, помещали в темный бокс, содержащий пары соля-
ной кислоты, приблизительно на 1 ч. При последующем облу-
чении УФ-светом (кварцевая галогенная лампа) в течение 12—
13 мин происходило образование флуорофора. Интенсивность
флуоресценции можно повысить, покрывая пластинку тонким
слоем жидкого парафина. Фабер и др. [44—46] сканировали
хроматограммы при 536 нм (дигитоксин и метаболиты) или при
455 нм (дигоксин и метаболиты) (возбуждение при 365 нм).
Предел обнаружения находится в субнанограммовом интервале,

Рис. 7.2. Разделение сердечных гликозидов (а) и их генинов (б) на силика-
геле в системе растворителей хлороформ—метанол (9:1) (а), этилацетат—
ацетон (3:1) (б); пламенно-ионизационный детектор [119].

7 — дигитоксин; 2 — дигоксин; 3 — гитоксин; 4 дигитоксигенин; 5 — дигокси-
генин; 6 — гитоксигенин.

а надежные количественные результаты можно получить в ин-
тервале от 2 до 20 нг гликозидов, что позволяет определять их
в сыворотке крови [45, 46].

Использовали и другие реагенты, например смесь соляной
кислоты, аскорбиновой кислоты и пероксида водорода [33] и
смесь хлорида железа (III), серной кислоты и уксусной кислоты
[34].

Для разделения и количественного определения сердечных
гликозидов и их генинов Окумура и др. [119] применяли метод
стержневой тонкослойной хроматографии с прямым пламенно-
ионизационным детектированием. На рис. 7.2 показаны две
типичные хроматограммы.

7.2.6.	ГАЗОВАЯ ХРОМАТОГРАФИЯ

Поскольку решение многих проблем анализа сердечных гли-
козидов требовало привлечения весьма чувствительных методов
с высокой разрешающей способностью, обеспечивающих разде-
ление близких по структуре производных, большой интерес вы-
звало использование газовой хроматографии. После первой ча-

А. АЛ„

J_I_1_I_1

10	15	20	25	30

Время, мин

I।||।

230	255	280	305	330

Температура, °C

Рис. 7.3. Газохроматографическое разделение ТМС-эфиров карденолидов на
колонке (30 смХ4 мм), заполненной 1,6 % SE-30 на газохроме Q (80—
100 меш) (пламенно-ионизационный детектор, скорость подачи азота 60 мл/мин)
[173].

1 — ТМС-эфир дигоксигенина; 2 — ТМС-эфир монодигитоксозида дигоксиге-
нина; 3 — ТМС-эфир бисдигитоксозида дигоксигенина; 4—ТМС-эфир диго-
ксина.

стично успешной попытки Джеллиффа и Бланкенхорна [73] воз-
можности метода были тщательно изучены Вильсоном и др.
[173, 174]. Было найдено, что после силилирования смесью гек-
саметилдисилазана, триметилхлорсилана и пиридина (10 : 1 : 10)
при комнатной температуре в течение 30 мин различные агли-
коны дигиталиса и гликозиды можно хроматографировать на
неполярных силиконовых неподвижных фазах. Так, например,
на рис. 7.3 показано разделение четырех членов С-серий хро-
матографией с программируемой температурой.
Буфадиенолиды жаб и родственные производные были про-
анализированы газохроматографически в виде ТМС-эфиров
Кубо и др. [90], а также Тогаки и Ито [150].

Из-за трудностей, возникающих в процессе хроматографиро-
вания при повышенных температурах, гликозиды перед сили-
лированием и количественным определением гидролизуют раз-
бавленной соляной кислотой. Полученные при этом агликоны
удалось более или менее успешно (ТМС-эфиры дигоксигенина
и дигитоксигенина разделяются, а гитоксигенин элюируется
вместе с дигоксигенином) разделить, например на SE-30 при
250°С.

Были предприняты некоторые дальнейшие попытки улучшить
возможности метода газовой хроматографии при определении
карденолидов. Тан [151] установил, что при обычных условиях
стерически сильно затрудненные третичные 14р-оксигруппы де-
риватизировать нельзя. Наличие такой оксигруппы неблагопри-
ятно влияет на термическую устойчивость карденолидов и их
разделение. При этом было найдено, что с обеих точек зрения
перспективно предварительное дегидрирование смесью тионил-
хлорид—пиридин.

Т’ «с-эфир дигитоксигенина

Другая возможность заключается в защите 14-оксигруппы
путем катализируемого основаниями образования 14,21-эпоксида
и последующего ацетилирования уксусным ангидридом с обра-'
зованием устойчивого метилового эфира 3,21-диацетокси-14,21-
эпоксидигитоксигениновой кислоты, как было описано Мейлин-
ком и др. [101].

Иной путь решения указанных выше проблем дает косвен-
ное газохроматографическое определение гликозидов дигита-
лиса, основанное на отщеплении остатка сахаров и хроматогра-
фировании силилированных сахаров [1].

Из-за низкого содержания сердечных гликозидов в биологи-
ческих жидкостях при анализе последних необходимо использо-
вать детекторы, более чувствительные, чем пламенно-ионизаци-
онные. Уотсон и др. [166, 167] показали, что с помощью детек-
тора электронного захвата можно определить даже малые ко-
личества дигоксина — до 25 пг, если предварительно перевести
образец в гептафторбутирильное (ГФБ) производное. Время
удерживания ГФБ-производного дигоксигенина на 3 % OV-1 на
газохроме Q при 240°С и скорости подачи гелия 50 мл/мин со-
ставляет 9 мин, а время удерживания ГФБ-производного диги-
токсигенина (внутренний стандарт) 11,3 мин. Эта система ока-
залась также удобной для разделения дигидродигоксина и ди-
гоксина. Следует отметить, что сахарный остаток отщепляется
в процессе получения ГФБ-производного и из всех гликозидных
производных образуется ГФБ-агликон. Следовательно, если за-
дачей анализа является определение индивидуальных количеств
гликозидов, их следует до газохроматографического измерения
разделить с помощью тонкослойной хроматографии.

В связи с указанными трудностями газовая хроматография
редко используется для серийных клинических и других анали-
зов [40].

7.2.7.	ВЫСОКОЭФФЕКТИВНАЯ ЖИДКОСТНАЯ ХРОМАТОГРАФИЯ

Ввиду довольно скромных достижений газовой хроматогра-
фии в анализе сердечных гликозидов (см. предыдущий раздел)
в качестве быстрого и надежного метода разделения и количе-
ственного определения всех видов встречающихся в природе
сердечных гликозидов и родственных им веществ была испы-
тана высокоэффективная жидкостная хроматография (ВЭЖХ).

Полоса поглощения ненасыщенного лактонного кольца кар-
денолидов (см. разд. 7.2.1) позволяет использовать УФ-детек-
тор при 220 нм. Хотя эта область довольно коротких длин волн,
что затрудняет выбор растворителя для элюирования, и чувст-
вительность метода также недостаточно высока, его большое
преимущество заключается в отсутствии необходимости дерива-
тизации. Поэтому в большинстве работ, связанных с анализом
этих объектов, сообщается об использовании УФ-детектора
в области 220 нм [19, 22, 39, 41, 42, 50а, 92, 144]. Минимально
обнаруживаемое количество карденолидов в зависимости от ус-
ловий хроматографирования и природы соединения составляет
от 4 до 76 нг [22]. Использование микрооборудования для
ВЭЖХ позволило Фуджи и др. [50а] снизить предел обнаруже-
ния до 1 нг.

Помимо использованной Эвансом [42] ионообменной колонки
•с SCX в первых работах по применению ВЭЖХ для анализа
карденолидов применялись адсорбционные колонки с силикаге-
лем и колонки с химически привитой обращенной фазой.

Линднер и Фрей [92] и Кобб [26] использовали колонки
с мелкодисперсным силикагелем лихросорб SI-60. Удовлетвори-
тельное разделение агликонов и гликозидов было осуществлено
с помощью таких хроматографических систем, как смесь пента-
нол—ацетонитрил—изооктан—вода (35 : 12 : 124 : 2), смесь

Рис. 7.4. Разделение дигоксина, диги-
токсина и их метаболитов ВЭЖХ на
колонке с ц-бондапаком Cis (30 смХ
Х4 мм); УФ-детектор, Л=220 нм, ли-
нейный градиент концентрации ацето-
нитрила в воде от 25 до 40 % по
5 %/мин, скорость потока 2,2 мл/мин,
25°С [22].

1 — пик растворителя; 2 — дигокси-
генин; 3 — монодигитоксозид диго-
ксигенина; 4 — бис(дигитоксозид) ди-
гоксигенина; 5 — дигоксин; 6 — диги-
токсигенин; 7 — монодигитоксозид
дигитоксигенина; 8 — бис (дигитоксо-
зид) дигитоксигенина; 9 — дигито-
ксин.

трет-бутанол—ацетонитрил—гептан—вода (204 : 93 : 712 : 10,4)
[92] или смесь циклогексан—этанол—уксусная кислота
(60:9:1) [26].

Такие же хорошие результаты были получены на системах
с обращенной фазой [19, 22, 39, 50а, 52а, 79а, 144, 153(а, б)].
Кастл [22] использовал колонку с ц-бондапаком Cis и водой*
содержащей от 25 до 40 % ацетонитрила. Как видно из рис. 7.4,
эти системы оказались самими удобными для разделения гли-
козидов и их метаболитов.

Бай и Браун [19] на колонке со сферисорбом ODS при элюи-
ровании смесью вода—метанол (5 : 4) выделили дигоксин из
лекарственных препаратов. Энсон и Сайбер [39] применяли ко-
лонку с ц-бондапаком Ci8 и смесь воды и ацетонитрила (7 : 3)
для хроматографирования сердечных гликозидов (эриокарпин,
лабриформидин, лабриформин, калотропин, калактин) из расте-
ний, выделяющих млечный сок, и из королевских бабочек. Да-
выдов и др. [29а, 30] добились хорошего разделения на сила-
низированном лихросорбе SI-60 при элюировании смесью эта-
нол—вода при 50°С.

Эрни и Фрей [41] опубликовали результаты сравнительного
изучения разрешающей способности адсорбционных систем и
систем с обращенной фазой (табл. 7.5) применительно к зада-
чам разделения и количественного определения. Из данных,
приведенных в табл. 7.5, можно заключить, что эти два хрома-
тографических метода дополняют друг друга и исследователю
необходимо выбирать одну из систем в соответствии с решаемой
задачей. Например, на адсорбционной колонке достигается хо-
рошее разделение компонентов С-ряда (см. также рис. 7.5),
в то время как на всех системах с обращенной фазой разделе-
ние значительно хуже. В то же время, например, пары дигиток-
син—гиталоксин и дигоксин—гитоксин намного легче разделять
на системах с обращенной фазой.

Таблица 7.5. Сравнение значений kr гликозидов дигиталиса, разделенных
ВЭЖХ на адсорбционной колонке и на обращенной фазе [41]

Соединение	Адсорбция а	Обращенная фаза &		
	дихлорметан— метанол—во- да (920 : 80 : 12)	ацетонитрил— вода (37 : 63)	диоксан— вода (45 : 55)	тетрагидрофу- ран—диоксан — вода (22:11: 67)
Дигитоксигенин	0,35	7,15	2,55	3,77
Гитоксигенин	0,91	2,65	1,10	2,20
Дигоксигенин	1,56	1,30	0,30	1,14
Дигинатигенин	3,9	0,85	0,17	0,63
Гиталоксигенин	0,35	4,60	1,70	2,64
Дигитоксин	0,76	13,80	11,10	7,77
Гитоксин	1,55	4,90	4,56	4,21
Дигоксин	1,90	1,95	1,43	1,65
Дигинатин	3,40	1,10	0,80	1,10
Гиталоксин	0,86	8,40	7,20	8,00
•Ланатозид А	5,50	8,60	9,00	9,52
Ланатозид В	8,71	3,10	3,85	4,89
Ланатозид С	11,27	1,30	1,18	1,99
Ланатозид D	13,40	0,80	0,70	1,16
Ланатозид Е	8,60	3,10	3,70	4,54
Дезацетилланатозид С	15,40	0,90	1,40	1,41

а Лихросорб SI 100, 5 мкм, 15 см X 3 мм.
$ Нуклеосил С18, 10 мкм, 30 см X 3,5 мм.
Гфеллер и сотр. [53] также показали, что в этом случае
наиболее эффективна система с обращенной фазой [нуклеосил
Cis и ацетонитрил—диоксан—вода (2:2:6)]. Чувствительность
обнаружения была значительно повышена благодаря послеко-
лоночной дериватизации и флуориметрическому детектирова-
нию. Обработка элюата дегидроаскорбиновой и соляной кисло-

Рис. 7.5. Разделение гликози-
дов дигиталиса С-ряда мето-
дом адсорбционной хромато-
графии на колонке с лихросор-
бом SI 60 (5 мкм) размером
15 смХЗ мм элюентом: 8 %-ный
метанол в дихлорметане, насы-
щенном водой, со скоростью
потока 2 мл/мин; УФ-детектор
(Z=230 нм), температура ком-
натная [41].

1 — дигоксигенин; 2 — диго-
ксин; 3 — ланатозид С; 4 —
дезацетилланатозид С.

тами и использование автоанализатора позволяют снизить пре-
дел обнаружения до субнанограммовых количеств.

Для того чтобы облегчить детектирование в коротковолно-
вой ультрафиолетовой области, Нахтманн и др. [НО—112] про-
водили 4-нитробензоилирование оксигрупп стероидных ядер и
остатков сахаров. 4-Нитробензоильные производные имеют
максимумы поглощения при 260 нм. За исключением стериче-
ски экранированных 14-ОН-групп, все оксигруппы стероидных
ядер и остатков сахаров количественно реагируют с п-нитро-
бензоилхлоридом. Каждая п-нитробензоилированная окси-
группа вносит в суммарный молярный коэффициент поглощения
полученного производного приблизительно 14 800. Это означает,
что молярный коэффициент поглощения, например дигитоксиге-
нина (одна реакционноспособная оксигруппа), равен 14 800,
дигоксина (пять реакционноспособных оксигрупп) 73’600 и дез-
ацетилланатозида С (восемь реакционноспособных оксигрупп)
118 000. Чувствительность детектирования особенно высока
в случае последних производных.
Рис. 7.6. Разделение гликозидов и агликонов дигиталиса в виде п-нитробен-
зоильных производных на колонке с лихросорбом SI 60 (5 мкм) размером
20 смХЗ мм элюентом: н-гексан—хлороформ—ацетонитрил (30: 10:9); УФ-де-
тектор (Л=260 нм) [112].

1 — гитоксигенин; 2— дигитоксигенин; 3— дигинатигенин; 4 — дигоксигенин;
5 — гита л окси гении; 6 — гитоксин; 7 — дигитоксин; 8— дигинатин; 9 — диго-
ксин; 10 — гиталоксин; 11 — ланатозид В; 12 — ланатозид А; 13— ланато-
зид D; 14 — ланатозид С; 15 — ланатозид Е.

Для проведения дериватизации берут максимум 0,5 мг гли-
козида, растворяют в 50 мкл пиридина и обрабатывают 150 мкл
10 %-ного (масса/объем) раствора п-нитробензоилхлорида
в пиридине в течение 10 мин при комнатной температуре. Рас-
творитель удаляют при 50°С в вакууме водоструйного насоса,
а избыток реагента гидролизуют 2 мл 5 %-ного водного рас-
твора карбоната натрия, содержащего 5 мг диметиламинопири-
дина. Полученные производные экстрагируют 2 мл хлороформа,
экстракт промывают 2 мл раствора гидрокарбоната натрия и
29 Заказ № 182
затем еще дважды 3 мл 0,05 М соляной кислоты, содержащей
5 % хлорида натрия.

Помимо благоприятного сдвига полосы поглощения и повы-
шения чувствительности детектирования м-нитробензоильное
производное обладает отличными хроматографическими свойст-
вами. Это показано на рис. 7.6, где приведены результаты раз-
деления 15 компонентов А-, В-, С-, D- и Е-рядов, осуществлен-
ного за 15 мин.

Как и в анализе стероидов других классов, ВЭЖХ стано-
вится широко распространенным методом предварительного
разделения дигоксина и его метаболитов перед радиоиммуно-
анализом [54а, Юба].

ВЭЖХ пригодна для разделения и количественного опреде-
ления буфадиенолидов. Шимада и др. [136, 137] разделяли раз-
личные агликоны и их конъюгаты на колонке с ц-бондапаком
Cie при элюировании смесями воды (или водных буферных рас-
творов) метанола и тетрагидрофурана. Для определения буфа-
диенолидов в лекарственных препаратах Титтель и Вагнер
[153а] использовали системы с обращенной фазой.

Гюнтер и др. [70] провели разделение витанолидов на ко-
лонке с порасилом, используя смеси гексана и 2-пропаиола или
хлороформа и метанола.

7.2.8.	РАДИОИММУНОАНАЛИЗ

И ФЕРМЕНТНЫЙ ИММУНОАНАЛИЗ

Радиоиммуноанализ и ферментный иммуноанализ впервые
были применены для определения дигоксина в 1969 г. [141] и
родственных препаратов в биологических жидких средах
в 1975 г. [23]. С этих пор методы иммуноанализа стали стан-
дартными в клиническом анализе. Важную информацию со-
держат отдельные главы в книге Пастернака [3, 175] и недавно
опубликованный обзор Ван-дер-Вига [159].

Радиоиммуноанализ

За немногими исключениями, описанные методы радиоимму-
ноанализа (РИА) гликозидов дигиталиса относятся к диго-
ксину. Ряд статей посвящен определению дигитоксина [13, 95]
и уабаина [161]. Антисыворотка выращивается против ком-
плекса карденолид—альбумин бычьей сыворотки (АБС), полу-
чаемого сочетанием 3-оксигруппы агликона или сахарного
остатка гликозида с белком через сукцинильный мостик. Полу-
ченная таким способом антисыворотка не обладает заметной
перекрестной активностью по отношению к стероидным гормо-
нам, присутствующим в сыворотке крови человека. Поэтому
в используемой на практике методике РИА не требуется пред-
варительных стадий хроматографического разделения или очи-
стки. В большинстве случаев также не применяется и экстрак-
ция (предварительная экстракция этилацетатом для удаления
примесей, вызывающих неспецифические помехи при определе-
нии дигоксина в моче, описана в работе [56]).

Ранее считали, что синтетические стероидные гормоны, спи-
'ронолактон и преднизон, реагируют перекрестно. Более поздние
исследования показали, что это мнение, вероятно, было вызвано
низкой селективностью антисыворотки, использовавшейся в на-
чальный период развития РИА карденолидов, так как ни спи-
ронолактон, ни преднизон не реагируют перекрестно [32, 107,
131] и даже их метаболиты не вступают в перекрестные реак-
ции, за исключением тех случаев, когда исходные вещества
даются сверх терапевтической дозы [138, 159].

Что касается родственных сердечных гликозидов, то, напри-
мер, дигитоксин в зависимости от антитела и методики РИА
реагирует перекрестно с дигоксином на 5—10 % [32, 107].
С практической точки зрения это не имеет значения, по-
скольку кровь больных, принимавших дигоксин, обычно не со-
держит дигитоксина. Аналогичная ситуация наблюдается для
ланатозида С, перекрестно реагирующего даже в большей сте-
пени. Метаболиты дигоксина (дигоксигенин и его моно- и бис-
дигитоксозиды) также вступают в сильное перекрестное взаи-
модействие [95]. Однако это не вызывает никаких серьезных
проблем, поскольку целью клинических исследований уровня
дигоксина в сыворотке крови является получение данных по
диагностике интоксикации дигоксином для правильного прове-
дения дигоксиновой терапии. Существует корреляция между
кардиотонической активностью этих метаболитов и их связыва-
нием с антителами дигоксина.

Перекрестная реакционноспрсобность неактивных 20,22-ди-
гидрометаболитов варьирует в зависимости от антисыворотки.
Следовательно, если необходима селективность дигоксинового
РИА по отношению к этому метаболиту, то надо учитывать
сродство дигидропроизводного относительно используемой анти-
сыворотки [56, 89, 118] (см. табл. 7.6).

Если для решения специальных проблем антисыворотка не-
достаточно селективна, рекомендуется проводить разделение
анализируемого гликозида и его метаболитов методом ВЭЖХ
[54а, 105а].

В качестве радиоактивных индикаторов пригодны производ-
ные, меченные тритием и 1251. Поскольку поглощение р-излучения
тритиевых производных часто создает трудности при использова-
29*
Таблица 7.6. Концентрации дигоксина, полученные с помощью
дигидродигоксина с четырьмя серийными наборами
для РИА [89]

Концентрация дегид- родигоксина, мкг/л	Наблюдаемая концентрация, мкг/л			
	А	в	с	D
0,4	0,027	0,036	0,072	0,27
1,0	0,036	0,062	0,042	0,38
2,0	0,087	0,15	0,13	0,69
3,0	0,11	0,25	0,25	0,95
5,0	0,18	0,42	0,29	1,3

нии жидкостных сцинтилляционных счетчиков, то здесь
намного чаще, чем в случае стероидных гормонов, применяют
производные, меченные 1251, контроль за которыми осуществля-
ется с помощью счетчиков у-излучения *. Из производных, со-
держащих радиоактивный иод, наиболее часто применяют про-
изводные тирозина, тирамина, гистамина и т. д., в которых эти
аминокислоты или амины связаны непосредственно с 3-окси-
группой генинов посредством сукцинильного мостика или с кон-
цевой дигитоксозной группировкой сахарного остатка после его
активирования путем окисления перйодатом или обработки
бромцианом [169]. (Эти производные часто используются
в РИА стероидных гормонов, причем мостиком служит обычно
О-карбоксиметилоксимная группировка.)

Инкубацию метки и антисыворотки с образцом, содер-
жащим определяемый гликозид дигиталиса, выполняют спо-
собом, аналогичным описанному в разд. 2.2.13. Следует от-
метить, что в данном случае время инкубации, как правило,
меньше.

Для разделения радиоактивностей, принадлежащих связан-
ной с антителом и свободной меткам, обычно употребляют дре-'
весный уголь, пропитанный декстраном [24, 35, 97, 161, 165,
168]. Используют и все другие методы, описанные в разд. 2.2.13
(сульфат аммония [168, 169], полиоксиэтиленгликоль [120, 135]
и твердофазные методы [21, 32, 35, 107]). Из этих методов наи-
более перспективен последний, особенно когда антитело фикси-
руется на стенках трубок. В этом случае метод значительно

* Преимущества и недостатки использования индикаторов, меченных
тритием и 1251, в РИА дигоксина были обсуждены Барбьери и Ган-
дольфи [7].
упрощается, поскольку исключается стадия центрифугирования.
В таком варианте РИА дигоксина легко автоматизировать [21].

1251-шираминдигоксин

Чувствительность описанного выше метода достаточна для
решения практических задач: он позволяет определять 0,1 —
5 нг/мл дигоксина и родственных веществ в 0,1—0,5 мл плазмы
крови и т. д.

Ферментный иммуноанализ

Со времени появления ферментного иммуноанализа в био-
химическом анализе этот нерадиоактивный вариант РИА вызы-
вает значительный интерес, в том числе для определения ди-
гоксина и родственных веществ, и ему посвящено большое чи-
сло работ [23, 35, 106, 120, 132, 147]. Ферментный иммуноана-
лиз не имеет никаких преимуществ перед РИА, но, поскольку
он дает уникальную возможность определять ультрамикроколи-
чества дигоксина в биологических жидкостях, его можно ис-
пользовать наряду с РИА, особенно в тех лабораториях, где
отсутствует радиоаналитическое оборудование.

Из двух основных вариантов ферментного иммуноанализа
наиболее часто используют метод с гомогенной (EMIT) систе-
мой [23, 35, 106, 132, 147], основанный на применении кова-
лентно связанной t дигоксином глюкозо-6-фосфатдегидрогеназы.
Этот комплекс канализирует реакцию между глюкозо-6-фосфа-
том и НАД с образованием восстановленной формы последнего
(НАДН). Содержание НАДН можно определить спектрофото-
метрически при 334 нм. Специфическое антитело образует не-
активный комплекс с антигенным дигоксин-ферментным произ-
водным, и, следовательно, как результат конкурирования ди-
гоксина и дигоксин-ферментного комплекса за активные места
антитела активность фермента, представленная поглощением
при 334 нм, пропорциональна концентрации дигоксина. Чувстви-
тельность и надежность этого метода сравнимы с аналогичными
параметрами для стандартных методик РИА.

В другом варианте метода (ELISA) [120] антитело фикси-
руют на стенке пробирки, а в качестве ферментной метки для
дигоксина используют пероксидазу. Субстратом служит 2,2'-
азино-бис(З-этилбензотиазолин-б-сульфокислота), которая окис-
ляется с образованием окрашенных соединений. Перед спектро-
фотометрическим измерением цветную реакцию останавливают,
добавляя азид натрия.

7.2.9.	ДРУГИЕ МЕТОДЫ

Было показано, что ненасыщенная лактонная группа сер-
дечных гликозидов способна восстанавливаться на ртутном ка-
пающем электроде. Эти результаты были использованы для их
количественного определения еще на ранних стадиях развития
полярографического анализа [60, 63, 64, 156, 157]. Низкая чув-
ствительность методов классической полярографии не позволяет
проводить анализ низкодозированных лекарственных препара-
тов. Для этих целей Кадиш и Шпилер [80] использовали метод
дифференциальной импульсной полярографии. В качестве рабо-
чего электрода служил капающий ртутный электрод, в качестве
электрода сравнения — каломельный, а в качестве вспомога-
тельного—платиновый проволочный электрод. На фоне 0,01 М
гидроксида или иодида тетрабутиламмония в изопропаноле ди-
гоксин и дигитоксин образуют пики при —2,285 и —2,325 В со-
ответственно. Метод позволяет проводить определение указан-
ных соединений в интервале концентраций 2,5- 10-6—5- 10-4 М.

Вследствие ограниченной применимости газовой хромато-
графии для определения сердечных гликозидов метод ГЖ—МС
не играет здесь такой же важной роли, как в анализе стерои-
дов других классов. Можно упомянуть о количественном масс-
спектрометрическом методе (прямой ввод пробы), разработан-
ном Гринвудом и др. [56]. Эти исследователи определяли соот-
ношение дигоксина и его метаболита, дигидродигоксина, в био-
логических образцах после экстракции хлороформом.

Метод с применением изотопа рубидий-86 [11, 54, 83, 91]
(использованного также Сторстейном [145] после ТСХ-разделе-
ния) основан на ингибировании сердечными гликозидами по-
глощения рубидия красными кровяными тельцами. Образец,
анализируемый на содержание сердечных гликозидов или их
метаболитов, инкубируют с суспензией красных кровяных телец
и рубидия-86. Концентрацию сердечных гликозидов (порядка
нескольких нг/мл) можно вычислить по радиоактивности рас-
твора с помощью градуировочного графика.

Миллер и др. [105] описали применение метода ЭПР для
определения сывороточного дигитоксина, основанного на том
же принципе, что и РИА. Основное его отличие состоит в том,
что вместо лабильной радиоактивной дигитоксиновой метки ис-
пользуется устойчивое «спин-меченое» производное дигитоксина.
Последнее получают окислением концевого сахара дигитоксина
перйодатом и последующей конденсацией образующегося аль-
дегида с 4-амино-2,2,6,6-тетраметилпиперидиноксидом. В резуль-
тате получают ЭПР-активное N-оксидное производное глико-
зида. Определение дигитоксина основано на измерении сигнала
ЭПР при добавлении анализируемого образца к раствору анти-
тела, насыщенного смесью антидигитоксина и спин-меченого ди-
гитоксина.

Дигитоксин и родственные соединения связываются с актив-
ным центром На+-К+-АТФ-азы, ингибируя ее активность. На
этой основе созданы очень чувствительные и весьма специфиче-
ские аналитические методы [96, 98]. Конкуренцию между ме-
ченным тритием уабаином и дигоксином (и т. п.) за активный
центр фермента можно использовать для определения послед-
него в биологических жидкостях [16, 95]. Этот метод был рас-
смотрен Брукером и Джеллифом [17].

7.3.	ПРОБЛЕМЫ АНАЛИЗА СЕРДЕЧНЫХ ГЛИКОЗИДОВ

7.3.1.	КОНТРОЛЬ ЧИСТОТЫ ВЫДЕЛЕННЫХ СЕРДЕЧНЫХ ГЛИКОЗИДОВ

В различных фармакопеях для анализа сердечных гликози-
дов в массе фабричного продукта рекомендуются почти исклю-
чительно колориметрические методы. Наибольшее распростра-
нение получил щелочно-пикратный метод, рекомендуемый среди
прочих для определения десланозида С британской фармако-
пеей [14] и японской фармакопеей IX [153] и для обнаружения
дигитоксина и ланатозида С японской фармакопеей IX [153] и
фармакопеей XX США [158]. Из-за низкой селективности этого
метода надежные результаты можно получить лишь в том слу-
чае, если колориметрическому определению предшествует хро-
матографическое разделение. Например, дигитоксин опреде-
ляют после хроматографирования на колонке с кремнеземом,
пропитанным формамидом. Дигитоксин элюируют с колонки
смесью бензол : хлороформ (3: 1). Аликвотную порцию элюата,
содержащую около 0,2 мг дигитоксина, упаривают досуха, оста-
ток растворяют в 5 мл этанола и добавляют 3 мл реагента, со-
держащего 0,2 % пикриновой кислоты и 0,5 % гидроксида нат-
рия. Реакцию проводят при температуре 25±3°С вдали от ин-
тенсивных источников света. Затем через 8 мин измеряют
поглощение при длине волны 495 нм относительно раствора
реагента [158].

Описаны также колориметрические методики с применением
ж-динитробензола [158] и фосфорной кислоты [123]. Фармако-
пея II ГДР [4] рекомендует диксантил-мочевинный метод опре-
деления общего содержания гликозида и дигоксина или диги-
токсина в массе фабричного дигоксина и дигитоксина соответ-
ственно. Для нахождения общего содержания гликозида упари-
вают досуха аликвотную порцию раствора, содержащую 0,05 мг
образца. Остаток растворяют в 10 мл свежеприготовленного
0,01 %-ного раствора диксантилмочевины в смеси уксусной и
концентрированной соляной кислот (100: 1). Реакцию проводят
в течении 20 мин при 60°С, затем смесь охлаждают и измеряют
поглощение при 530 нм относительно раствора реагента. Для
определения содержания дигоксина или дигитоксина повторяют
те же операции, но после ТСХ-разделения образца и элюирова-
ния основного пятна.

Если колориметрическое определение выполняют без пред-
варительного разделения с помощью колоночной или тонкослой-
ной хроматографии, то для проверки чистоты образца совер-
шенно необходимо провести отдельный тест с применением
тонкослойной (или бумажной) хроматографии. Хроматографи-
рование обычно выполняют на силикагелевых пластинках раз-
личными системами растворителей типа дихлорметан—мета-
нол—вода (75 : 23 : 2 или подобные смеси [14] ). Для опрыскива-
ния пятен обычно используют разбавленные растворы серной
кислоты.

К нехроматографическим методам обнаружения иди опре-
деления некоторых примесей относится также флуориметриче-
ский метод определения гитоксина в дигоксине (см. разд. 7.2.3)
и метод обнаружения дигитонина по образованию белого осадка
с холестерином (см. разд. 4.2.3).
Важную роль в этой области играет также ВЭЖХ, позво-
ляющая проводить одновременное количественное определение
основного компонента и установление характера примесей
[31, 41].

7.3.2.	ОПРЕДЕЛЕНИЕ СЕРДЕЧНЫХ ГЛИКОЗИДОВ
В ЛЕКАРСТВЕННЫХ ПРЕПАРАТАХ

При определении сердечных гликозидов в жидких лекарст-
венных формах не возникает каких-либо серьезных трудностей.
Активные компоненты экстрагируют хлороформом, дихлормета-
ном или смесью хлороформа с н-пропанолом из подходящим
образом разбавленного водного раствора лекарственного препа-
рата [113, 158]. Для количественного исследования экстракта
используют стандартные колориметрические методы (щелочной
пикрат [123, 153, 158], хлорид железа(Ш)—серная кислота
[14, 158] и т. п.) после предварительного хроматографического
разделения на колонке или без разделения.

Целью стадии экстракции является повышение селективно-
сти метода. Эль-Масри и Халил [38] отмечают, что истинное
содержание дигоксина в частично разложившихся препаратах
для инъекций можно определить только по методике с исполь-
зованием смеси хлорида железа(III) и серной кислоты, реко-
мендуемой фармакопеей XX США [158]. Благодаря предвари-
тельной экстракции образующиеся при гидролитическом раз-
ложении сахара остаются в водной фазе. Согласно методике из
британской фармакопеи 1973 [14], с помощью того же реагента,
но без предварительной экстракции разложение не удается об-
наружить даже в тех случаях, когда образец разлагается прак-
тически полностью.

Что касается лекарственных препаратов, расфасованных
в виде таблеток, экстракция активного компонента не представ-
ляет сложной задачи: для этого пригодны различные спирты,
водно-спиртовые смеси, дихлорметан и хлороформ.

Наиболее распространенными методами количественного
определения являются те же колориметрические методики, что
и в случае жидких лекарственных форм. Вследствие ограничен-
ной чувствительности большинства колориметрических методик
для одного анализа необходимо использовать несколько таб-
леток.

Поскольку содержание дигитоксина и дигоксина в таблет-
ках, как правило, очень низко (до 0,05 мг в таблетке), боль-
шинство колориметрических методик в общем недостаточно
чувствительно для контроля однородности состава таблеток, и
их применение для этих целей подверглось критике [104]. Бла-
годаря более высокой чувствительности флуориметрические
методы представляют идеальный способ для анализа отдельных
таблеток. Например, для анализа дигитоксиновых таблеток фар-
макопея XX США рекомендует методику, основанную на ком-
бинации колоночной хроматографии и колориметрии (щелочно-
пикратный метод) [158], но однородность состава тех же
таблеток определяется флуориметрически. После экстракции
дигитоксина хлороформом из водно-ацетонитрильной смеси хло-
роформ выпаривают, а сухой остаток растворяют в 80 %-ном
этаноле так, чтобы получить раствор с содержанием дигитоксина
5 мкг/мл. К 2 мл этого раствора добавляют 10 мл реагента
(к 100 мл соляной кислоты осторожно добавляют свежеприго-
товленный раствор 35 мг аскорбиновой кислоты в 25 мл мета-
нола) и затем 1 мл 0,003 %-ного водного пероксида водорода.
Через 30 мин измеряют флуоресценцию полученного и стандарт-
ного (проведенного через все стадии анализа) растворов отно-
сительно раствора реагента (возбуждение при 395 нм, испуска-
ние при 580 нм).

Этот реагент [154], а также некоторые другие смеси, содер-
жащие серную [5, 104, 113] и трихлоруксусную [15] кислоты,
часто используют в тех случаях, когда необходима высокая
чувствительность определения.

Высокая чувствительность — это очевидное требование, необ-
ходимое для применения любого метода в автоматизированном
анализе отдельных таблеток с низким содержанием лекарствен-
ного вещества. Наряду с самым чувствительным колориметри-
ческим методом (реагент — смесь иодной и тиобарбитуровой
кислот [79, 109]) были автоматизированы также и флуоримет-
рические методы [29, 130, 142].

В предписываемом фармакопеей США тесте на раствори-
мость дигоксиновых таблеток концентрацию дигоксина в рас-
творе определяют флуориметрически с использованием в каче-
стве реагента смеси аскорбиновая кислота—соляная кислота—
пероксид водорода [158]. Халил и Эль-Масри [86, 87] показали,
что 74 % дигоксина гидролизуется в среде, используемой для
растворения (примерно 0,07 М соляная кислота) в процессе
проведения теста. (Эту цифру можно получить колориметриче-
ским методом с ксантгидролом и предварительной экстракцией
одним хлороформом. Обладая специфичностью относительно
стероидного ядра, флуориметрический метод не чувствителен
к отщеплению сахарного остатка.)

Определение дигоксина и дигитоксина в таблетках можно
проводить методом дифференциальной импульсной полярогра-
фии [80]. Гораздо большее значение имеет ВЭЖХ с деривати-
зацией или без нее [41, 112], поскольку этот метод больше
всего подходит для изучения устойчивости [144].
7.3.3.	ОПРЕДЕЛЕНИЕ СЕРДЕЧНЫХ ГЛИКОЗИДОВ В РАСТЕНИЯХ

Из возможных методов определения сердечных гликозидов
в растениях пригодны практически только тонкослойная хро-
матография (элюирование пятен или колориметрические ме-
тоды in situ) и ВЭЖХ.

Успех применения того или иного метода анализа в сильной
мере зависит от способа экстракции и подготовки лекарствен-
ного растения к экстракции. В листьях Digitalis lanata содер-
жится фермент дигиланидаза, осуществляющий частичное от-
щепление концевой глюкозы, например, от ланатозида С с об-
разованием ацетилдигоксина, который затем вновь частично
гидролизуется до дигоксина. Все эти реакции протекают в про-
цессе высушивания лекарственного растения, проводимого пе-
ред его измельчением (необходимое условие эффективной эк-
стракции), и при длительном настаивании в разбавленных
водных растворах этанола, являющегося обычным. растворите-
лем для экстракции. Поэтому, если целью анализа является
установление истинного состава сердечных гликозидов в расти-
тельном образце, необходима особая осторожность. (Остроум-
ное решение этой проблемы состоит в замораживании листьев
жидким азотом и твердой углекислотой до их измельчения [8Г,
124].) Очень эффективно также кипячение лекарственного расте-
ния с обратным холодильником в 70 %-ном (по объему) эта-
ноле, так как в этих условиях ферменты инактивируются. Боль-
шую часть совместно экстрагируемых примесей можно удалить
до фильтрования раствора, если его разбавить водой до 40 %-
ной (по объему) концентрации [77, 93].

Наиболее распространенный метод удаления пигментов, са-
погенинов и других примесей из экстракта состоит в осажде-
нии их солями свинца [85, 93, 149, 172], именно диацетатом
свинца. Избыток реагента удаляют осаждением динатрийфос-
фатом. Все это необходимо делать быстро, так как при продол-
жительном контакте с ионами свинца(II) происходит деформи-
лирование гликозидов Е-ряда.

Для удовлетворительного разделения первичных и вторич-
ных гликозидов необходимы по крайней мере две хроматогра-
фические системы с тем, чтобы провести разделение компонен-
тов в ожидаемом экстракте. Например, Лугт [93] применял
пластинки, пропитанные формамидом, и смесь хлороформ—те-
трагидрофуран—формамид (50:50:6,5) для разделения пер-
вичных гликозидов и смесь ксилола и метилэтилкетона (7:3),
насыщенную формамидом, для разделения вторичных глико-
зидов.

Для количественного определения небольшого числа ком-
понентов применяют метод элюирования пятен в сочетании
с различными колориметрическими методами [12, 27, 43, 55, 58,
61, 62, 68, 85, 125, 149, 155]. Все эти компоненты можно опреде-
лить in situ денситометрически или лучше флуориметрически
[6, 93].

Иногда целью анализа является не определение всех глико-
зидов, а установление содержания в растении дигоксина и ди-
гитоксина вместе с ланатозидами А и С, а также с ацетилди-
гоксином и ацетилдигитоксином, которые в процессе получения
этих лекарственных веществ из Digitalis lanata и purpurea
в промышленном масштабе превращаются в дигоксин и диги-
токсин соответственно.

В таких случаях, как, например, в методе Хорвата [68], со-
четающем тонкослойную хроматографию и колориметрию,
а также в методе Кобба [26], основанном на ВЭЖХ, остаток
глюкозы удаляют ферментативным отщеплением с помощью
собственного растительного фермента в процессе длительного
настаивания, а затем деацетилируют ацетилдигитоксозу гидро-
ксидом натрия [26] или метилатом натрия [68]. Обработку ще-
лочью необходимо проводить очень осторожно, так как при
этом может произойти раскрытие лактонного кольца.

В заключение приведем краткое описание определения ди-
гоксина в листьях Digitalis lanata по методу Кобба [26].

Высушенные листья измельчают до частиц размером около
500 мкм; 10 г этого порошка настаивают в 25 мл 20 %-ного (по
объему) этанола при 25°С в течение 24 ч. Затем добавляют
еще 75 мл того же растворителя и встряхивают смесь в тече-
ние 4 ч. Взвесь медленно фильтруют через колонку со стеклян-
ным водокном и промывают тем же растворителем до общего
объема 200 мл. К полученному раствору добавляют 20 мл
0,35 М гидроксида натрия при 20°С и оставляют на 15 мин. За-
тем доводят pH раствора до 6—6,5 добавлением 0,35 М соля-
ной кислоты. Раствор экстрагируют пятью порциями по 50 мл
хлороформа, экстракты сушат над сульфатом натрия, объеди-
няют и выпаривают досуха.

Сухой остаток растворяют в 2 мл смеси хлороформа и мета-
нола (1:1) и 5 мкл раствора вводят в хроматограф [силикаге-
левая (10 мкм) колонка, растворитель смесь циклогексан—эта-
нол—уксусная кислота (60:9:1), скорость потока 2 мл/мин].
При количественном определении в качестве внутреннего стан-
дарта можно использовать сульфаметоксазол.

Необходимо отметить, что Вейлер и др. [168, 169, 169а],
а также Летола и др. [91а] для определения дигоксина в Digi-
talis lanata успешно применяли радиоиммуноанализ. Этот ме-
тод примерно в 104 раз чувствительнее, чем флуориметрический.
Кроме того, его легко автоматизировать, и тогда один сотруд-
ник может выполнить до 2000 определений за неделю.
7.3.4.	ОПРЕДЕЛЕНИЕ СЕРДЕЧНЫХ ГЛИКОЗИДОВ
И ИХ МЕТАБОЛИТОВ В БИОЛОГИЧЕСКИХ ЖИДКОСТЯХ

По этому вопросу были опубликованы два прекрасных об-
зора Якутина [176] и Ван-дер-Вига [159].

Хотя сердечные гликозиды могут попадать в организм чело-
века только при приеме лекарств, их определение в жидкостях
организма, главным образом в крови, является важной задачей.
Эти данные необходимы при проведении судебно-медицинской
экспертизы [163], а также при назначении лечения дигоксином
(и др.), так как для таких веществ разница между терапевти-
ческой и токсической дозой очень невелика. Кроме того, подхо-
дящие методы анализа требуются при исследовании фармако-
кинетики [51, 65, 66] и метаболизма [40, 46, 52, 122, 133,
145, 146].

Вследствие очень низких терапевтических доз сердечных
гликозидов их концентрация в крови, как правило, не превы-
шает 0,1 мкг/мл, и поэтому для количественного определения
этих веществ пригодны только самые чувствительные методы.

Ряд методик требует предварительной экстракции образца.
Наилучшим растворителем для экстракции является дихлорме-
тан [145, 166], однако можно использовать также хлороформ
[44, 46, 160], смесь хлороформ—этанол (1:1) [146, 163], смесь
дихлорметан—гептафторбутанол (97 : 3) [40а] и смесь этил-
ацетат—этанол (4 : 1) [164а].

Из хроматографических методов достаточной чувствитель-
ностью обладает только газовая хроматография с детектором
электронного захвата [166]. Хотя селективность этого метода
также достаточно высока и имеются сообщения об его исполь-
зовании в клиническом анализе [40, 90, 122, 166], он не нахо-
дит широкого применения из-за трудностей, отмеченных
в разд. 7.2.6.

Чувствительность ВЭЖХ недостаточна для анализа сердеч-
ных гликозидов, и даже не делалось попыток дериватизации
(сильно повышающую чувствительность) с целью их определе-
ния в жидкостях организма. Примечательно, однако, что Эрикс-
сон и Тэкенбергс [40а] успешно применяли ВЭЖХ для разде-
ления дигоксина и его метаболитов в моче перед количествен-
ным определением с помощью жидкостного сцинтилляционного
счетчика.

Чувствительность метода тонкослойной хроматографии
также ниже чувствительности газовой хроматографии с детек-
тором электронного захвата, однако 1—10 нг сердечных глико-
зидов с достаточной точностью можно определить из несколь-
ких миллилитров мочи или сыворотки крови на пластинках in
situ, используя флуоресценцию, вызываемую соляной кислотой
[46, 100].

Из других хроматографических методов отделения и фрак-
ционирования сердечных гликозидов и их метаболитов из био-
логических объектов часто используют колоночную хромато-
графию обычно на адсорбентах сефадексе LH-20 [52] и DEAE-
сефадексе LH-20 [146].

Методы, основанные на использовании рубидия-86 и Na+-
К+-АТФ-азы, кратко рассмотренные в разд. 7.2.9, пригодны для
определения нанограммовых концентраций и поэтому подходят
для определения сердечных гликозидов в жидкостях организма.

Радиоиммуноанализ и ферментный иммуноанализ имеют
такую же чувствительность. По-видимому, они являются наибо-
лее распространенными методами серийного клинического ана-
лиза сердечных гликозидов. Поскольку это практически един-
ственная область применения указанных методов, мы отсылаем
читателя к разд. 7.2.8.

ЛИТЕРАТУРА

1.	Adriaens С., Finne Е. Farm. Tydschr. Belg., 1978, v. 55, p. 69.

2.	Angeliker F., Barfuss F., Renz J. Helv. Chim. Acta, 1958, v. 41, p. 479.

3.	Aronson J. K. in Pasternak C. A. (Editor). Radioimmunoassay in Clinical
Biochemistry. Heiden, London, New York, Rheine, 1975, p. 91.

4.	Arzneibuch der DDR II Akademie Verlag. Berlin, 1975.

5.	Бабилев Ф. В. Фармацевтич. ж., 1976, с. 61.

6.	Bancher Е., Prey Т., Wurst F. Planta Med., 1976, v. 29, p. 393.

7.	Barbieri U., Gandolfi C. Clin. Chim. Acta, 1977, v. 77, p. 257.

8.	Bartos J. Ann. Farm. Franc., 1963, v. 21, p. 603.

9.	Bartos J., Pesez M. Colorimetric and Fluorimetric Analysis of Steroids.
Academic Press. London, New York, San Francisco, 1976, pp. 219—244.

10.	Baumgarten G. Die herzwirksamen Glykoside. VEB Georg Thieme, Leip-
zig, 1963.

11.	Bertler A., Redfors A. Clin. Pharmacol. Therap., 1970, v. 11, p. 665.

12.	Bican-Fister T., Merkas J. J. Chromat., 1969, v. 41, p. 91.

12a. Bloch D. E. J. Ass. Off. Anal. Chem., 1980, v. 63, p. 707.

13.	Boden G. Prakt. Anaesthetist, 1976, v. 11, p. 97.

14.	British Pharmacopoeia 1980, HM Stationary Office, London, 1980, p. 155.

15.	Britten A. Z., Njau E. Anal. Chim. Acta, 1975, v. 76, p. 409.

16.	Brooker G., Jelliffe R. W. Circulation, 1972, v. 45, p. 20.

17.	Brooker G., Jelliffe R. W.t in Heftmann E. (Editor), Modern Methods
in Steroid Analysis. Academic Press, New York, London, 1973, pp. 437—
449.

18.	Burns L. The Determination of the Path of Reaction of Ouabain and
Digitoxin with Polynitroaromatic Compounds in an Alkaline Medium and
the Development of Alternative Methods of Assay for Ouabain and Digi-
toxin. Ph. D. Thesis, Temple University, Philadelphia, 1976.

19.	Bye A., Brown M. E. J. Chromat. Sci., 1977, v. 15, p. 365.

20.	Canback T. J. Pharm. Pharmacol., 1949, v. 1, p. 201.

21.	Carlton M. T., Witty T. R., Hassler M. J., Bjdrnsen R. E., Painter К. H.

J. Radioanal. Chem., 1978, v. 43, p. 389.

22.	Castle M. C. J. Chromat., 1975, v. 115, p. 437.

23.	Chang J. J., Crowl С. P., Schneider R. S. Clin. Chem., 1975, v. 21, p. 967.
24.	Chen I. W., Sperling M., Voile C., Maxon H. R. Clin. Chem., 1978, v. 24,
p. 1564.

25.	Clarke C. J., Cobb P. H. J. Chromat., 1979, v. 168, p. 541.

26.	Cobb P. H. Analyst, 1976, v. 101, p. 768.

27.	Coropa G. L., Raiteri M. J. Chromat., 1965, v. 19, p. 435.

28.	Corona G. L., Rondanelli R., Mascherpa A. Farmaco, Ed. Pr., 1963, v. 18,
p. 549.

29.	Cullen L. F., Packman D. L., Papariello G. L. J. Pharm. Sci., 1970, v. 59,
p. 697.

29a. Davydov V. Y., Elizalde Gonzalez M., Kiselev A. V. J. Chromat., 1981,
v. 204, p. 293.

30.	Давыдов В. Ю., Киселев А. В., Миронова И. В., Сапожников Ю. М.
Хроматография, 1978, т. 11, с. 591.

31.	Давыдов В. Ю., Киселев А. В., Попов Д. М., Сапожников Ю. М. Хи-
мико-фармацевтич. ж., 1978, т. 12, с. 102.

32.	Doering W., Blumel Е. Klin. Wochenschr., 1978, v. 56, p. 497.

33.	Doelker F., Kapetanidis J., Mirimanoff A. Pharm. Acta Helv., 1969, v. 44,
p. 647.

34.	Dow M. L., Kirchhoefer R. D., Brower J. F. J. Pharm. Sci., 1971, v. 60,
p. 298.

35.	Drost R. H., Plomp T. A., Teunissen A. J., Maas A. H. J., Maes R. A. A.
Clin. Med. Acta, 1977, v. 79, p. 557.

36.	Einig H., Mayer D. Arzneimittel-Forsch., 1978, v. 28, p. 527.

37.	El-Olemy M. M., Stohs S. J. J. Pharm. Sci., 1975, v. 64, p. 163

38.	El-Masry S., Khalil S. A. H. J. Pharm. Pharmacol., 1975, v. 27, p. 35P.

39.	Enson J. M., Seiber J. N. J. Chromat., 1978, v. 148, p. 521.

40.	Erdmann E. Internist, 1975, v. 16, p. 185.

40a. Eriksson В. M., Tekenbergs L. J. Chromat. Biomed., Appl., 1981, v. 223,
p. 401.

41.	Emi F., Frei R. W. J. Chromat., 1977, v. 130, p. 169.

42.	Evans F. J. J. Chromat., 1974, v. 88, p. 411.

43.	Evans J., Flemons P. A., Duignan C. F., Cowley P. S. J. Chromat., 1974,
v. 88, p. 341.

44.	Faber D. B. J. Chromat., 1.977, v. 142, p. 421.

45.	Faber D. B., De Kok A., Brinkman U. A. T. Methodol. Dev. Biochem.,
1976, v. 5, p. 247.

46.	Faber D. B., De Kok A. J. Chromat. Biomed. Appl., 1977,	v.	143, p.	95.

, 47.	Fauconnet L., Waldesbuhl M. Pharm. Acta Helv., 1963, v. 38,	p. 423.

48.	Frerejacques M., de Graeve P. Ann. Pharm. Franc., 1963,	v.	21, p.	509.

. 49.	Frijns J. M. G. J. Pharm. Weckbl., 1970, v. 105, p. 209.

, 50.	Frijns J. M. G. J. Pharm. Weekbl., 1971, v. 106, p. 9.

50a.	Fujii Y., Fukuda H., Saito Y., Yamazaki M. J. Chromat.,	1980, v.	202,

p. 139.

51.	Garrett E. R., Hinderling P. H. J. Pharm. Sci., 1977, v. 66, p. 806.

52.	Gault M. H., Ahmed M., Symes A. L., Vance J. Clin. Biochem., 1976, v. 9,
p. 46.

'52a. Gault M. H., Ahmed M., Tibbo N., Longerich L.t Sudgen D. J. Chromat.,
1980, v. 182, p. 465.

53.	Gfeller J, C., Frey G., Frei R. W. J. Chromat., 1977, v. 142, p. 271.

54.	Gierdrum K. Acta Med. Scand., 1980, v. 187, p. 371.

54a. Gibson T. B., Nelson H. A. Clin. Pharmacol. Then, 1980, v. 27, p. 219.

55.	Gorlich B. Planta Med., 1961, v. 9, p. 442.

56.	Greenwood H., Snedden W., Hayward R. P., Landon L. Clin. Chim.
Acta, 1975, v. 62, p. 213.

57.	Haack E., Kaiser F., Spingler H. Berichte, 1956, v. 1353, p. 89.

58.	Hauser W., Karting T., Verdino G. Sci. Pharm., 1969, v. 37, p. 149.
59.	Havighorst Е., Dwenger A., Trautschold I. Z. Anal. Chem., 1978, v. 290,
p. 157.

60.	Hershberg E. B., Wolfe J. K-> Fieser L. F. J. Am. Chem. Soc., 1940, v. 62,
p. 3516.

61.	Heusser D. Deut. Apoth. Ztg., 1965, v. 105, p. 1101.

62.	Heusser D. Planta Med., 1964, v. 12, p. 237.

63.	Hilton J. G. Science, 1949, v. 110, p. 526.

64.	Hilton J. G. J. Pharmacol. Exp. Ter., 1950, v. 110, p. 258.

65.	Hinderling P. H, Garrett E. R., Wester R. C. J. Pharm. Sci., 1977, v. 66,
pp. 242, 314.

66.	Hinderling P. H., Garrett E. R. J. Pharm. Sci., 1977, v. 66, p. 326.

67.	Hoeke M., Exler T. J. H. Pharm. Weekbl., 1969, v. 104, p. 877.

68.	Horvath P. Acta Pharm. Hung., 1982, v. 52, p. 133.

68a. Horvath P. private communication.

69.	Hdrhammer L., Wagner H. Deut. Apoth. Ztg., 1967, v. 107, p. 1793.

70.	Hunter I. R.t Walden M. K-, Heftmann E. J. Chromat., 1979, v. 170,
p. 437.

71.	Jakovljevic I. M. Anal. Chem., 1963, v. 35, p. 13.

72.	Jelliffe R. W. J. Chromat, 1967, v. 27, p. 172.

73.	Jelliffe R. W.t Blankenhorn D. H. J. Chromat., 1963, v. 12, p. 268.

74.	Jelliffe R. W., Page C. J., Escamilla E. J., Morgan S. J., Stephinson R. G.

J. Chromat., 1967, v. 27, p. 172.

75.	Jensen К.	B.	Acta	Pharmacol.	Toxicol.,	1952,	v. 8, p.	101.

76.	Jensen К.	B.	Acta	Pharmacol.	Toxicol.,	1953,	v. 9, p.	66.

77.	Jensen К.	B.	Acta	Pharmacol.	Toxicol.,	1956,	v. 12, p. 27.

78.	Johnston	E.	J., Jacobs A. L.	J. Pharm. Sci., 1966,	v. 55, p. 531.

79.	Juhl W. E. J. Ass. Off. Anal. Chem., 1975, v. 58, p. 70.

79a. Jurenitsch J., Kopp B., Kirchner H, Kubelka W. Planta Medica, 1980,
v. 39, p. 272.

80.	Kadish К- M., Spiehler V. R. Anal. Chem., 1975, v. 47, p. 1714.

81.	Kaiser F. Arch. Pharm., 1964, v. 299, p. 263.

82.	Kartnig T., Kobosil P. J. Chromat., 1977, v. 138,.p. 238.

83.	Kaufman J. M.t Belpaire F. M. Eur. J. Clin. Pharmacol., 1973, v. 6, p. 54. •

84.	Kennedy E. E. J. Am. Pharm. Ass. Sci. Ed., 1950, v. 39, p. 25.

85.	Khafagy S. M., Girgis A. N, Planta Med., 1974, v. 25, p. 350.

86.	Khalil S. A. H, El Masry S. J. Pharm. Pharmacol., 1976, v. 28, p. 6P.

87.	Khalil S. A. H, El Masry S. J. Pharm. Sci., 1978, v. 67, p. 1358.

88.	Kimura M. Pharm. Bull. Japan, 1955, v. 3, p. 81.

89.	Kramer W. G., Kinnear N. L., Morgan H. K- Clin. Chem., 1978, v. 24,
p. 155.

90.	Kubo K-, Takakuwa T., Handa K- Yakugaku Zasshi., 1977, v. 97, p. 274.

91.	Lader S.t Bye A., Marsden P. Eur. J. Clin. Pharmacol., 1972, v. 5, p. 22.

91a. Lehtola T., Huhtikangas A., Hiltunen R.t Schantz M. Planta Medica,
1980, v. 39, p. 273.

92.	Lindner W., Frei R. W. J. Chromat., 1976, v. 117, p. 81.

93.	Lugt Ch. B. Pharm. Weekblad, 1978, v. Ill, p. 405.

94.	MacLennan A. P. Biochem. J., 1962, v. 82, p. 394.

95.	Marcus F. I., Ryan J. N., Stafford M. G. J. Lab. Clin. Med., 1975, v. 85,
p. 610.

96.	Mardh S. Clin. Chim. Acta, 1973, v. 44, p. 165.

97.	Martin K-> Rietbrock N. Klin. Wochenschr., 1977, v. 55, p. 429.

98.	Medzihradsky F., Nandhasri P. S., Khanna U. Biochem. Med., 1971, v. 5,
p. 285.

99.	Megges R., Streckenbach B., Repke K. R. H. J. Chromat., 1978, v. 154,
p. 197.

100.	Megges R.t Streckenbach B., Repke K. R. H. J. Chromat, 1978, v. 155,
p. 169.
101-	Meilink J. W.t Lenstra J. B., Svendsen A. B. J. Chromat., 1979, v. 170,
p. 35.

102.	Mesnard P., Devaux G. Compt. Rend. Acad. Sci., 1961, v. 253, p. 497.

103.	Mesnard P., Devaux G. Chim. Anal., 1962, v. 44, p. 287.

104.	Miller J. H. McB. Proc. Soc. Analyt. Chem., 1974, p. 291.

105.	Miller W. G., Lott J. A., Bhot H. G. Clin. Chem,, 1975, v. 21, p. 968.

105a. Morrais J. A., Zlotecki R. A., Sakmar E„ Stetson P. L., Wagner J. G.
Res. Commun. Chem. Pathol. Pharmacol., 1981, v. 31, p. 285.

106.	Muller H.t Brauer H., Forster G.t Reinhardt M. Klin. Wochenschr., 1978,
v. 56, p. 493.

107.	Muller H., Brauer H.t Resch B. Clin. Chem., 1978, v. 24, p. 706.

108.	Murphy J. E. J. Am. Pharm. Ass. Sci. Ed., 1954, v. 43, p. 659.

109.	Myrick J. W. J. Pharm. Sci, 1969, v. 58, p. 1018.

110.	Nachtmann	F. Z. Anal. Chem., 1976, v. 282,	p. 209.

111.	Nachtmann	F., Spitzy H., Frei R. W. Anal. Chem., 1976, v.	48, p.	1756.

112.	Nachtmann	F., Spitzy FL, Frei R. W. J.	Chromat., 1976, v. 74,	p.	29.

113.	Naik D. V.,	Groover J. S., Schulman S. C.	Anal. Chim. Acta,	1975,	v.	74,

p. 29.

114.	Nover L. Arch. Pharm., 1969, v. 302, p. 321.

115.	Nover L. in Macek K. (Editor). Pharmaceutical Applications of Thin-
Layer and Paper Chromatography. Elsevier, Amsterdam, London, New
York, 1972, pp. 349—392.

116.	Nover L., Baumgarten G.t Luckner M. J. Chromat., 1969, v. 39, p. 450.

117.	Nover L., Jtittner G., Noack S., Baumgarten G., Luckner M. J. Chromat.,
1969, v. 39, p. 419.

118.	Oge E. K., Polonus P. A. Clin. Chem., 1978, v. 24, p. 1086.

118a. Okumura T. J. Chromat., 1980, v. 184, p. 37.

119.	Okumura T., Kadono T., Iso’o A. J. Chromat., 1975, v. 108, p. 329.

120.	Persinj J. P., Jonker К. M. J. Clin. Chem. Clin. Biochem., 1978, v. 16,
p. 531.

121.	Pesez M. Ann. Pharm. France, 1952, v. 10, p. 104.

122.	Peters U., Kalman S. M. Z. Kardiol., 1978, v. 67, p. 342.

123.	Pharmacopoeia Helvetica VI. Vol. III. Verlag Eidgenossische Druck-
sachen und Materialentrale. Bern. 1971, p. 81.

124.	Potter H. Pharmazie, 1963, v. 18, p. 554.

125.	Potter H. Pharmazie, 1965, v. 20, p. 737.

126.	Potter FL, Bdrisch H. Pharmazie, 1972, v. 27, p. 315.

127.	Rabitzsch	G.,	J tingling S. J. Chromat., 1969, v. 41,	p. 96.

128.	Rabitzsch	G.,	Tambor U. Pharmazie,	1967, v. 22,	p.	668.

129.	Rabitzsch	G.,	Tambor U. Pharmazie,	1969, v. 24,	p.	262.

130.	Ramirez-Munoz J. Anal. Chim. Acta,	1974, v. 73,	p.	167.

131.	Ravel R. Clin. Chem., 1975, v. 21, p. 1801.

132.	Rosental A. F., Vargas M. G., Klass C. S. Clin. Chem., 1976, v. 22,
p. 1899.

133.	Sabatka J. J.t Brent D. A., Murphy J., Charles J.t Vance J., Gault M. H.
J. Chromat., 1976, v. 125, p. 523.

134.	Saha M. K-, Ramakrishna N., Rao E. V. Indian J. Pharm., 1977, v. 39,
p. 158.

135.	Shaw W., Schulman L., Spierto F. W. Clin. Chim. Acta, 1975, v. 60, p. 385.

136.	Shimada K., Hasegawa M., Hasebe K., Fujii Y., Nambara T. J. Chromat.,
1976, v. 24, p. 79.

137.	Shimada K., Hasegawa M.t Hasebe K-> Fujii Y., Nambara T. Chem. Pharm.
Bull., 1976, v. 24, p. 2995.

138.	Silber B., Sheiner L. B.t Powers J. L.t Winter M. E., Sadee W. Clin.
Chem., 1979, v. 25, p. 48.

139.	Singh B.t Rastogi R. P. Indian J. Chem., 1965, v. 7, p. 1105.

140.	Sjoholm I. Svensk. Farm. Tidskr., 1962, v. 66, p. 321.

30 Заказ № 182
141.	Smith Т. W., Butler V. P., Haber E. New Engl. J. Med., 1969, v. 281,
p. 1212.

142.	Spehr Th., Thiese A., Mauer E. Pharm. Ind. 1976, v. 38, p. 1154.

143.	Steidle W. Ann. Chem., 1963, v. 662, p. 126.

144.	Slernson L. A., Shaffer R. D. J. Pharm. Sci., 1978, v. 67, p. 327.

145.	Storstein L. J. Chromat., 1976, v. 117, p. 87.

146.	Sugden D., Ahmed M., Gault M. H. J. Chromat, 1976, v. 121, p. 401.

147.	Sun L., Spiehler V. Clin. Chem., 1976, v. 22, p. 2029.

148.	Szeleczky Z. J. Chromat., 1979, v. 178, p. 453.

148a. Szeleczky Z., Lang T. Planta Medica, 1980, v. 40, p. 320.

149.	Szildgyi L, Zdmbo L, Torok I. Planta Medica, 1977, v. 32, p. 60.

150.	Tagaki S., Ito Y. J. Pharm. Soc. Japan, 1979, v. 99, p. 322.

151.	Tan L. J. Chromat., 1969, v. 45, p. 68.

152.	Tattje D. H. E. Ann. Pharm. France, 1954, v. 12, p. 267.

153.	The Pharmacopoeia of Japan IX, English Edition. Society Japanese Phar-
macopoeia, Tokio, 1978.

153a. Titlel G., Wagner H. Planta Medica, 1980, v. 39, p. 125.

1536. Tittel G., Habermeier H., Wagner H. Planta Med., 1981, v. 42, p. 113.

154.	Tokunaga H, Kimura T., Kawamura J. lyakuhin Kenkyu, 1977, v. 8,
p. 39.

155.	Tschesche R., Grimmer G. Berichte, 1960, v. 93, p. 1477.

156.	Цуканов Ю. В., Брутков Л. И., Буленков Т. И. Химия природн. соедин.,
1978, с. 412.

157.	Цуканов Ю. В., Брутков Л. И., Буленков Т. И. Фармация, 1979, т. 28г
с. 61.

158.	United States Pharmacopoeia XX USP Convention Inc., Rockville, Md.
1980, pp. 239—243, 567—568.

159.	Van der Vijgh W. J. F. Pharm. Weekblad, 1978, v. 113, p. 585.

160.	Van Oostven J. J. J. Pharm. Weekblad, 1976, v. Ill, p. 21.

161.	Verspohl E., Strobach H., Greeff K- Arzneim. Forsch., 1978, v. 28, p. 1694.

162.	Vincze-Vermes M., Verzar-Petri G., Erdei I. Acta Pharm. Hung., 1977,
v. 47, p. 162.

163.	Власенко	Л.	M.	Фармация,	1977, т.	26,	с.	38.

164.	Власенко	Л.	М.	Фармация,	1977, т.	26,	с.	59.

164а. Власенко	Л.	М.	Фармация,	1979, т.	28,	с.	34.

1646. Власенко	Л.	М.	Фармация,	1980, т.	29,	с.	35.

165.	Wagner J. G., Hallmark М. R., Sakmar Е., Ayres J. W. Steroids, 1977,.
v. 29, p. 787.

166.	Watson E., Kalman S. M. J. Chromat., 1971, v. 59, p. 209.

167.	Watson E., Tramell P., Kalman S. M. J. Chromat., 1972, v. 69, p. 157.

168.	Weiler E. W., Zenk M. H. Phytochemistry, 1976, v. 15, p. 1537.

169.	Weiler E. W., Zenk M. H. Clin. Chem., 1979, v. 25, p. 44.

169a. Weiler E. W., Westekemper P. Planta Medica, 1979, v. 35, p. 316.

170.	Wells D., Katzung B., Meyers T. H. J. Pharm. Pharmacol., 1961, v. 13r
p. 389.

171.	Wichtl M., Fuchs L. Arch. Pharm., 1962, v. 295, p. 361.

172.	Wichtl M., Summer-Irsigler R. Planta Med., 1959, v. 7, p. 129.

173.	Wilson W. E., Jihnson S. A., Perkins W. A., Ripley J. E. Anal. Chem.,.
1967, v. 39, p. 40.

174.	Wilson W. E., Ripley J. E. Anal. Chem., 1969, v. 41, p. 810.

175.	Woodcock B. G., Rodgers M., Gibbs A. C. in Pasternak C. A. (Editor).
Radioimmunoassay in Clinical Biochemistry. Heiden, London, New York,
Rheine. 1975, p. 131.

176.	Якутии В. И. Химико-фармацевтич. ж., 1977, с. 128.

177.	Yoshioka К., Fullerton D. S. Steroids, 1978, v. 32, р. 511.

178.	Ziillich G., Braun W., Lisboa В. P. J. Chromat, 1975, v. 103, p. 396.

179.	Zullich G., Damm К. H, Lisboa В. P. J. Chromat., 1975, v. 115, p. 117.
8

ДИОСГЕНИН И РОДСТВЕННЫЕ САПОГЕНИНЫ

8.1.	ОСНОВЫ ХИМИИ СЛПОГЕНИНОВ

Из различных сапогенинов в этой главе будут рассмотрены
только агликоны спиростаноловых гликозидов. Поскольку агли-
коны более важны, собственно сапонины с остатками сахаров
при 3-ОН-группе в молекуле будут упомянуты только в отдель-

ных случаях.

Молекулы сапогенинов имеют спиростановые скелеты с пяти-
и шестичленными кислородсодержащими кольцами Е и F.
Кольца А и В могут находиться в цис- или транс-сочленении
(50- и 5а-ряды). Сочленения колец В и С и С и D являются
«гормоноподобными». В зависимости от конфигурации 25-ме-
тильной группы сапогенины относятся к 25R- или 255-изоме-
рам (изо- и нео-изомеры). Производные обычно содержат 30-
оксигруппу и очень часто А5-двойную связь.

Те заместители в молекулах сапогенинов, о которых упоми-
нается в этой главе, перечислены в табл. 8.1.

Таблица 8.1. Заместители в спиростановом скелете некоторых сапогенинов

Сапогенин	Конфигурация 25-СН3-группы	С-5	Оксигруппы	Кетогруппы
Диосгенин	R изо	д5	33		
Ямогенин	S нео	Д5	зз	—,
Юккагенин	R изо	Д5	2а, 33	—
Лилагенин	S нео	Д5	2а, 33	—
Пенногенин	R изо	Д5	33, 17а	—
Рускогенин	R нео	Д5	13. 33	—
Тигогенин	R изо	а-Н	33	—.
Неотигогенин	S нео	а-Н	33	—.
Смилагенин	R изо	₽-Н	33	—
Сарсасапогенин	S нео	Р-н	33	—
Гекогенин	R изо	а-Н	33	12
Гитогенин	R изо	а-Н	2а, зз	—,
Неогитогенин	S нео	а-Н	2а, 33	—
Дигитогенин	R изо	а-Н	2а, 33, 153	—
Сапогенины выделяют из различных растений после кислот-
ного гидролиза остатков сахаров глюкозидной части по мето-
дике, аналогичной описанной в разд. 8.3.2 для аналитических
разделений.

Важно отметить, что некоторые сапогенины (главным обра-
зом диосгенин, выделенный из различных видов Dioscorea)
служат исходным сырьем для промышленного полусинтеза сте-
роидных гормонов [1,22].

8.2.	МЕТОДЫ АНАЛИЗА САПОГЕНИНОВ

8.2.1.	КОЛОРИМЕТРИЧЕСКИЕ МЕТОДЫ

Сапогенины являются спектрофотометрически неактивными
веществами, и для их определения не подходят даже колори-
метрические методы, основанные на стехиометрических реак-
циях. Однако они образуют окрашенные растворы с различ-
ными реагентами, содержащими большие количества минераль-
ных кислот или хлоридов сурьмы(III) или сурьмы(V). Некото-
рые из этих реакций используются только для идентификации,
однако многие из них пригодны и для количественного анализа.

Ямагиши и Накамура [61], Софовора и Хардман [56], ис-
пользовали хлорид сурьмы(III), тогда как Риши и др. [49] в ка-
честве реагента предложили хлорид сурьмы (V) в 70 %-ной
хлорной кислоте. Слек и Мадер [55] применяли в качестве ре-
агента одну хлорную кислоту. После обработки сапогенинов
70 %-ной хлорной кислотой в течение 10 мин появляется желтое
окрашивание (Zmax = 410 нм). Для определения тигогенина по-
сле отделения тонкослойной хроматографией Хсу и Ли [27]
в качестве реагента предложили смесь ванилин—хлорная ки-
слота—уксусная кислота.

Концентрированная серная кислота образует с сапогенинами
различные окрашенные соединения, причем некоторые из них
пригодны для идентификации [14]. Уоленс и др. [58] проводили
количественное определение с 94 %-ной серной кислотой; в ме-
тоде Лопеса Санчеса и др. [36] реагентом служила смесь сер-
ной кислоты и метанола (4: 1). При комнатной температуре на
проведение последней реакции требуется 2 ч (молярный коэф-
фициент погашения для диосгенина при 405 нм равен 18 000).

Общим недостатком методов, основанных на применении
концентрированных кислот и хлоридов сурьмы, является низкая
селективность, поскольку они также дают окрашивание и с дру-
гими стероидами. Например, Картниг и др. [31, 32] рекомендо-
вали 96%-ную серную кислоту (15 мин при 60°С) для опреде-
ления не только сапогенинов, но и стеринов, сердечных глико-
зидов и др. После разделения тонкослойной хроматографией
и элюирования пятна все эти методы, конечно, применимы для
определения индивидуальных сапогенинов. Метод Картнига
и др. [31, 32], например, был успешно применен Эллнайн-Вой-
ташеком и сотр. [16] для определения дигитонина в семянах
Digitalis purpurea.

Хотя введение альдегидов, как, например, формальдегида
[43, 45] и ванилина [24], до некоторой степени улучшает селек-
тивность и чувствительность серной кислоты, наиболее эффек-
тивным реагентом в этом методе оказалась, несомненно, пред-
ложенная Баккоу и сотр. [2] смесь анисового альдегида, этил-
ацетата и серной кислоты. Согласно их методике, до 40 мкг
•сапогенина растворяют в 2 мл этилацетата и обрабатывают
в течение 20 мин при 60°С 1 мл смеси этилацетата и анисового
альдегида (199: 1) и 1 мл смеси серной кислоты и этил ацетата
(1:1 по объему). Если вместо последней смеси применять чи-
стую серную кислоту, реакция может протекать при комнатной
температуре. Поглощение измеряют при 430 нм.

Спектр окрашенного соединения, образовавшегося в резуль-
тате этой реакции, приведен на рис. 8.1. На рис. 8.2 показано
выполнение закона Бера для четырех сапогенинов.

Максимум поглощения каждого из изученных сапогенинов
лежит при 430 нм (рис. 8.2), и значения молекулярных коэф-
фициентов поглощения также очень близки между собой (е=
= 49,151±1,8 %) *. Поскольку среди этих сапогенинов есть
Д5- и 5,6-дигидропроизводные, 3,5-диены, 3-монокси-, ди-, три-
и тетраоксипроизводные, стероидные ядра скорее всего не иг-
рают заметной роли в возникновении окраски: по-видимому,
она полностью обусловлена системой Е- и F-колец (стерины,
стероидные гормоны и криптогенин, содержащие раскрытые Е-
и F-кольца, а также азотсодержащие аналоги с F-кольцами ре-
акции не дают). Было показано, что помимо этих нереакцион-
носпособных стероидов применению метода не мешают также
различные сахара, жирные кислоты и даже большие количе-
ства нелетучих масел. Вследствие высокой селективности ме-
тод пригоден для прямого определения общего содержания сте-
роидных сапогенинов в растениях. Для определения индивиду-
альных сапогенинов необходимо предварительное разделение
тонкослойной хроматографией. Особого внимания заслуживает
высокое значение молярного коэффициента поглощения; т. е.
этот метод значительно более чувствителен, чем любой другой
колориметрический метод.

* Согласно новейшему варианту метода, основанному на применении
смеси дихлорэтана и этилацетата (77:20) в качестве растворителя, а также
2,5 %-ной (по объему) серной кислоты и 0,17%-ного анисового альдегида
в качестве реагента, величина молярного коэффициента поглощения достигает
67 100 [2а].
Рис. 8.1. Спектр поглощения диосгенина после обработки смесью анисовый
альдегид—серная кислота—этилацетат [2].

Рис. 8.2. Градуировочный график для определения сапогенинов с помощью
реагента анисовый альдегид—серная кислота—этилацетат [2].

1 — диосгенин; 2 — тигогенин; 3 — смилагенин; 4 — гекогенин.
в.2.2. ИНФРАКРАСНАЯ СПЕКТРОФОТОМЕТРИЯ

Для количественного определения сапогенинов применима
и инфракрасная спектрофотометрия [59]. Хардман и др. [6, 23,
28] использовали интервал от 1000 до 800 см-1, в котором
можно найти серию характерных пиков, обусловленных нали-
чием спирокетальных остатков в молекулах сапогенинов; для
определения общего содержания сапогенинов в экстрактах
растений пригодна интенсивная полоса при 980 см-1. После кис-
лотного гидролиза и экстракции петролейным эфиром экстракт
очищают с помощью колоночной хроматографии (как правило,
на колонке с силикагелем [29]), поскольку количественные ре-
зультаты можно получить только для очищенной смеси сапоге-
нинов. ИК-Спектр регистрируют в 0,5—1 %-ном растворе хло-
роформа в 1-миллиметровой кювете.

Если цель анализа смеси диосгенина [(25К)-спиростен-5-6л-
.30] и сопутствующего ему (25S)-эпимера (ямогенина) состоит
не только в определении общего содержания сапогенинов, но
и в установлении соотношения эпимеров, сделать это можно по
поглощению при 920 и 900 см~Ч В спектре диосгенина более
интенсивной является первая полоса, в спектре же ямогенина —
вторая, поэтому соотношение эпимеров можно рассчитать из
соотношения поглощений при этих волновых числах, опреде-
ленных с помощью градуировочного графика.

в.2.3. ТОНКОСЛОЙНАЯ ХРОМАТОГРАФИЯ

Поскольку в растениях содержится большое количество са-
погенинов, часто родственных по структуре, перед их обнару-
жением, идентификацией, а также количественным определе-
нием необходима предварительная стадия разделения с помо-
щью тонкослойной хроматографии. Поскольку стероиды обла-
дают умеренной полярностью (3-оксисапогенины несколько
более полярны, чем соответствующие стерины), обычно их хро-
матографируют на силикагеле. В литературе приведено огром-
ное количество хроматографических данных [3, 17, 39, 57, 60].
В табл. 8.2 подробно рассматриваются некоторые характерные
хроматографические системы для разделения наиболее важных
сапогенинов, взятые из статьи Матсумото [39].

Наиболее трудной задачей является отделение А5-производ-
ных от их насыщенных аналогов, а также разделение эпимер-
ных пар с 25R- или 255-метильной группой. Как и в случае
применения тонкослойной хроматографии для решения анало-
гичных задач разделения стеринов (см. разд. 4.2.6), разделение
можно улучшить, используя пластинки, покрытые силикагелем
Таблица 8.2. Разделение сапогенинов с помощью тонкослойной
хроматографии на силикагеле [39]

Сапогенин	Rf			
	бензол—эта- нол (85 : 15)	гексан—этил- ацетат (1:1)	хлороформ— этанол (95 : 5)	гексан—аце- тон (8 : 2)
Сарсасапогенин	0,67	0,51	0,65	0,42
Диосгенин	0,57	0,46	0,59	0,34
Тигогенин	0,53	0,46	0,59	0,29
Пенногенин	0,50	0,35	0,53	0,22
Гекогенин	0,50	0,21	0,46	0,16
Гитогенин	0,35	0,09	0,19	0,11

или оксидом алюминия и пропитанные нитратом серебра [13,
19, 52]. Характерный пример приведен в статье Розумека [51],
которому удалось провести удовлетворительное разделение ти-
гогенина (/?/ = 0,56), диосгенина (0,46) и ямогенина (0,39) на
силикагелевых пластинках, используя градиент нитрата серебра
от 2,1 %-ного до нулевого содержания и трехкратную обработку
смесью дихлорметан—ацетон (97 : 3).

Заслуживает упоминания работа Окумура [42], в которой
успешно использованы пластинки с покрытием из силикагеля
и оксида алюминия, полученные спеканием на стекле.

Для опрыскивания хроматограмм обычно употребляют сер-
ную кислоту, хлорид сурьмы (III), смесь уксусного ангидрида
и серной кислоты, иод, но есть сведения о применении таких
специфических реагентов, как смесь анисового альдегида, ук-
сусной кислоты, метанола, серной кислоты и молибденофосфор-
ной кислоты [51].

После ТСХ-разделения и элюирования пятна для определе-
ния главных компонентов смеси сапогенинов применимы коло-
риметрические методы, описанные в разд. 8.2.1. Например,
Лопес Санчес и др. [36] использовали колориметрическую реак-
цию со смесью серной кислоты и метанола (4:1) для опреде-
ления диосгенина после разделения на пластинке с силикаге-
лем в смеси хлороформа и ацетона (4:1), проявления пятен
парами иода и элюирования метанолом.

С тонкослойной хроматографией можно комбинировать
и другие аналитические методы, например титриметрию [12],
масс-спектрометрию [18] и метод, основанный на измерении
гемолитической активности [53].

Блунден и др. [4, 5] в качестве метода анализа сапогенинов
in situ разработали денситометрическое определение после про-
явления хлоридом сурьмы (III). Улучшенный вариант этого ме-
тода описали Брайн и Хардман [7]. Согласно их методике,
хлороформный раствор смеси сапогенинов наносят на силика-
гелевую пластинку с помощью автоматического устройства,
хроматографируют в смеси гексана и ацетона (8:1), опрыски-
вают раствором, содержащим 300 г хлорида сурьмы (III)
в 100 мл концентрированной соляной кислоты, сушат на воздухе
2 мин и нагревают 30 мин при 110°С. Затем хроматограмму
сканируют и интегрируют в проходящем свете. Было найдено,
что линейная зависимость между концентрацией диосгенина
и сигналом интегратора наблюдается в интервале 4,5—6,5 мкг.

Локвуд и др. [35] также использовали хлорид сурьмы (III)
в качестве опрыскивающего реагента после отделения стеринов
от диосгенина на силикагеле в смеси гексана и ацетона (4: 1).
Количественное определение выполняли в проходящем свете
при 447 нм, внутренним стандартом служил ланостерин.

Аналогичным способом Николов и др. [41] определяли
рускогенин, используя в качестве обнаруживающего реагента
смесь /г-диметиламинобензальдегид—фосфорная кислота—хлор-
ная кислота—этанол. Как показано Шаиным и Волошиной [54],
прямое определение можно выполнить также флуориметриче-
ским методом с фосфорной кислотой в качестве опрыскиваю-
щего реагента. Градуировочный график для диосгенина линеен
в интервале 0,25—3,5 мкг.

8.2.4.	КОЛОНОЧНАЯ ХРОМАТОГРАФИЯ

И ВЫСОКОЭФФЕКТИВНАЯ КОЛОНОЧНАЯ ХРОМАТОГРАФИЯ

Колоночную хроматографию часто применяют в анализе
различных растений на содержание сапогенинов. Цель приме-
нения этого метода обычно заключается в отделении сапогени-
нов от других стероидов (стеринов и др.) и нестероидных ве-
ществ, а также в разделении сапогенинов на моно- и полигид-
роксилированные фракции. Колоночная хроматография не при-
годна для разделения родственных по структуре производных.
В качестве сорбентов обычно используют силикагель [23, 29],
флорисил [30] и оксид алюминия [44].

На колонке с силикагелем производят разделение диосге-
нин-ямогениновой фракции из экстрактов растений с целью их
последующего определения с помощью ИК-спектроскопии [23]
(см. разд. 8.2.2). В улучшенном варианте, описанном Джеффри-
сом и Хардманом [29], разделение проводили на колонке, за-
полненной силикагелем (активность II), при элюировании сме-
сями гексана и этилацетата (содержащие 20 % насыщающего
количества воды), причем элюирование начинали со смеси 9: 1,
продолжали смесью 3 : 1 и заканчивали смесью 2:3. Первыми
вымывались нелетучие масла, эфиры стеринов и спиростади-
ены-3,5, затем следовали стерины и, наконец, моно- и диоксиса-
погенины.

Хиггинс [25] описал разделение сапогенинов из Agave с по-
мощью ВЭЖХ и их количественное определение. Учитывая

Время, мин

Рис. 8.3. Разделение диосге-
нина (/) и сарсасапогенина (2)
в форме эфиров бензойной кис-
лоты ВЭЖХ на колонке
(25 смХ4 мм), заполненной
лихросорбом RP-8 (10 мкмоль),
подвижная фаза — смесь аце-
тонитрила и воды (8:2). Ско-
рость потока 3,0 мл/мин, УФ-
детектор (235 нм), темпера-
тура комнатная [25].

плохие хромофорные свойства сапогенинов, их превращали
в бензоаты с помощью бензоилхлорида и пиридина. Разделение
выполняли на колонке с обращенной фазой лихросорбом RP-8
(рис. 8.3). Хорошее разделение достигнуто (среди других) для
диосгенина и сарсасапогенина, отличающихся только конфигу-
рацией метильной группы в положении 25 и наличием А5-двой-
ной связи.

Для определения диосгенина в различных видах Dioscorea
Махато и др. [36а] применяли ВЭЖХ на колонке с ц-пораси-
лом, используя смесь петролейного эфира и 2-пропанола (12:1)
в качестве элюента и рефрактометрический детектор. Гюнтер
и др. [27а] разделяли диосгенин, ямогенин, тигогенин, неотиго-
генин, сарсасапогенин и смилагенин в форме ацетатов на ко-
лонках с зорбакс ODS и зорбакс SIL, регистрируя поглощение
при 210 нм.

8.2.5.	ГАЗОВАЯ ХРОМАТОГРАФИЯ

Газовая хроматография — самый распространенный хрома-
тографический метод количественного определения сапогени-
нов, поскольку они обладают удовлетворительной термической
устойчивостью и летучестью.

В большинстве случаев газохроматического определения
диосгенина дериватизации не требуется [8, 9, 15, 29а, 36, 37,
47, 50]. Обычно анализ проводят при температуре колонки
240—250°С на неподвижной неполярной фазе SE-30 (0,75—
2,5%) [8,9, 15,36,50].

ГХ-Методы пригодны для анализа экстрактов из различных
растений, если цель анализа заключается в определении одного
диосгенина и если родственные по структуре производные от-
сутствуют или содержатся в пренебрежимо малых количествах,
поскольку в недериватизированном виде они плохо отделяются
от диосгенина на неполярной неподвижной фазе.

Гекогенин [38] или гекогенин вместе с тигогенином [11, 48]
можно определять как в недериватизированном виде [48], так
и в форме ацетатов [11] или трифторацетатов [38] после раз-
деления на неподвижных фазах SE-30 [48], OV-101 [11] или
ХЕ-60 [38].

Если требуется разделить насыщенные и ненасыщенные
(А5) компоненты и 25R—25S пары, необходимы дериватизация
3-гидроксильной группы, а иногда и других гидроксильных
групп и использование более полярных фаз, например QF-1
[10, 34] и OV-17 [34, 40]. Дериватизация необходима также при
разделении 2а, Зр-диоксипроизводных, так как они разлагаются
при обычных условиях.

Коули и др. [10], а также Мета и Стаба [40] использовали
метилсилилирование, тогда как Найт [34] провел сравнительное
исследование хроматографического разделения недериватизиро-
ванных, силилированных и трифторацетилированных соедине-
ний. Он показал, что наилучшие результаты при разделении
были получены после трифторацетилирования [8а, 34] (15 мин
при комнатной температуре в смеси равных объемов трифтор-
уксусного ангидрида и хлороформа). Это иллюстрируется
рис. 8.4, на котором помимо прекрасного разделения С-25
эпимеров показано разделение насыщенных и ненасыщенных
производных и диоксипроизводных.

8.2.6. ДРУГИЕ МЕТОДЫ

Рис. 8.4. Газовая хромато-
грамма неочищенного диос-
генина после трифторацети-
лирования на стеклянной
колонке (180 смхЗ мм), за-
полненной 3 % QF-1 на хро-
мосорбе Q (100—120 меш),
программированный подъем
температуры колонки в ин-
тервале 200—230°С со
скоростью 2°С/мин через
20 мин после допрограммно-
го выдерживания [34].

1 — 3,5-диен; 2 — диосгенин
в Dioscorea Deltoidea и Syl-
vatica [9, 36а, 50]; 3 — ямо-
генин; 4 — тигогенин; 5 —
неотигогенин; 6 — юккаге-
нин; 7 — лилагенин; 8 — ги-
тогенин; 9 — неогитогенин.

Благодаря, реакционной способности двойной связи можно
осуществить титриметрическое определение А5-ненасыщенных
сапогенинов. Гёрёг [21] производил титрование в среде уксус-
ной кислоты, содержащей 0,5 М ацетата натрия и 0,08 М хло-
рида ртути(II), с помощью 0,1 М раствора брома в уксусной
кислоте. Конечную точку обнаруживали по появлению окраски,
вызываемой избытком брома. Цизер и Гёрёг [12] разработали
микрометод. При добавлении 0,01 М раствора брома из автома-
тической бюретки порциями по 0,25 мл и использовании потен-
циометрической индикации конечной точки можно оттитровать
несколько сотен микрограмм диосгенина. Такой метод пригоден
для определения диосгенина после элюирования с тонкослой-
ных пластинок.

Наличие 12-кетогруппы в гекогенине было использовано Хсу
[26] для селективного титриметрического определения этого со-
единения по реакции образования оксима (см. разд. 2.2.7).
Для контроля чистоты диосгенина Кауфман и др. [33] про-
водили фракционную возгонку.

Сегал и др. [53] нашли применение тому, что сапогенины
можно охарактеризовать по их гемолитической активности.
Изучаемый экстракт растений инкубировали при 37°С с суспен-
зией эритроцитов. Разрушенные клетки затем отделяли ультра-
центрифугированием, суспензию экстрагировали хлороформом,
ацетилировали и помещали на ТСХ-пластинку.

8.3.	ПРОБЛЕМЫ В АНАЛИЗЕ САПОГЕНИНОВ

8.3.1.	КОНТРОЛЬ ЧИСТОТЫ САПОГЕНИНОВ

Необходимо осуществлять контроль за чистотой сапогенинов
в массе фабричного продукта, которые затем используются
в качестве лекарственных препаратов или как исходные мате-
риалы для полусинтеза гормонов.

Так как подходящих абсолютных методов количественного
определения сапогенинов нет, то в большинстве случаев конт-
роль их чистоты по существу ограничивается хроматографиче-
скими тестами. Для этой цели подходят все хроматографиче-
ские методы, описанные в разд. 8.2.3—8.2.5. Способ проверки
чистоты тигогенина описан, например, Пхеидзе и Кемерталидзе
[46]. Навеску образца (100 мкг) помещают на пластинку с си-
ликагелем и проводят элюирование смесью хлороформа и эта-
нола (25: 1). Часть примесей можно обнаружить при УФ-облу-
чении, другие — при опрыскивании парами иода. Главное пятно
проявляют смесью серной кислоты и этанола (4: 1). Для иссле-
дования производных можно использовать другие системы
и после элюирования пятна или in situ проводить количествен-
ное определение.

Для этих же целей подходит и газовая хроматография. Она
обладает отличной разрешающей способностью и позволяет не-
посредственно получать количественные данные. В качестве при-
мера [37] можно привести метод обнаружения и определения
эписмилагенина в дирсгенине с помощью газовой хроматогра-
фии, используя в качестве внутреннего стандарта ацетат прегне-
нолона.

8.3.2.	ОПРЕДЕЛЕНИЕ САПОГЕНИНОВ В РАСТЕНИЯХ

Поскольку наиболее важным исходным материалом для
полусинтеза стероидных гормонов является диосгенин, необхо-
димо обсудить методы его определения.

За исключением редких случаев, цель анализа заключается
в определении сапогенина (но не сапонина), и поэтому анализ
начинают обычно с кислотного гидролиза и экстракции. В наи-
более распространенном варианте метода для проведения гид-
ролиза и экстракции [9, 15, 36, 41] образец кипятят с обратным
холодильником в 2—3 М соляной кислоте в течение 3—8 ч, что
приводит к отщеплению сахарного остатка. После фильтрова-
ния твердый остаток промывают водой до нейтральной реак-
ции, высушивают и, наконец, экстрагируют (обычно в аппарате
Сокслета) хлороформом, гексаном, петролейным эфиром или
смесью петролейного эфира и этанола (95:5). Другой способ
заключается в одновременном проведении гидролиза и экстрак-
ции путем кипячения образца с равными объемами 3 М соля-
ной кислоты и гексана [49].

о
I
сахар

диосцин

диосгенин

(25 R)- 3,5- спиростадиен

(8.1)

Как видно из схемы 8.1, в процессе кислотного гидролиза
Д5-сапонинов до соответствующих сапогенинов происходит
также побочная реакция образования 3,5-диенов. При нормаль-
ных условиях, однако, степень протекания этой реакции не пре-
вышает 6 % [5]. Можно также начинать с экстракции сапонина
метанолом, а затем проводить гидролиз соляной кислотой
[8, 18].

Простейший способ получения данных о содержании сапоге-
нина основан на гравиметрическом определении массы сухого
остатка экстракта. Хотя низкая селективность гравиметриче-
ского метода означает, что к полученным результатам следует
относиться критически, этот метод все же до сих пор находит
применение [20].

Все методы, описанные в разд. 8.2, пригодны для определе-
ния сапогенинов в растениях. Селективность колориметриче-
ских методов обычно недостаточна для надежного определения
индивидуальных компонентов. Это можно сделать только после
хроматографического разделения, для чего обычно применяют
тонкослойную хроматографию в сочетании с элюированием
пятна [36] или денситометрией [4, 5, 7, 35, 41, 54].

Наиболее эффективным методом анализа многокомпонент-
ной смеси сапогенинов является газовая хроматография. Есть
сообщения об использовании этого метода для определения са-
погенинов (главным образом диосгенина) в Dioscorea deltoidea
и sylvatica [9, 36а, 50], Digitalis purpurea [10], Trigonella
Foenum-graecum [15, 34, 47], Dioscorea composita [36, 40],
Solatium aurantiacobaccatum [8] и Agava sisilana [11, 38, 48].

В качестве типичного примера приведем определение диосге-
нина в Dioscorea deltoidea и silvatica по методу Кука [9]. На-
веску (1 г) измельченных клубней кипятят с обратным холо-
дильником 3 ч с 20 мл 2 М соляной кислоты. Смесь фильтруют,
осадок промывают водой и высушивают при 110°С. Затем про-
водят экстракцию в аппарате Сокслета в течение 3 ч петролей-
ным эфиром (т. кип. 60—80°С). Растворитель отгоняют нагре-
ванием в токе воздуха. Остаток растворяют в 1 мл 2-этоксиэта-
нола и 1 мкл раствора вводят в газовый хроматограф (стек-
лянная колонка длиной 75 см, заполненная SE-30 на отмытом
кислотой хромосорбе G, обработанном диметилхлорсиланом;
температура 240°С). Хроматограмму рассчитывают, измеряя
высоту пиков и используя градуировочный график, построенный
по стандартному образцу диосгенина.

ЛИТЕРАТУРА

1.	Appeizweig N. Steroid Drugs. McGraw-Hill, New York, Toronto, London.
1962, v. 1.

2.	Baccou J. C., Lambert F., Sauvaire Y. Analyst, 1977, v. 102, p. 458.
2a. Baccou J. C. private communication.

3.	Blunden G., Hardman R. J. Chromat., 1964, v. 15, p. 273.

4.	Blunden G„ Hardman R. J. Chromat., 1968, v. 34, p. 507.

5.	Blunden G., Hardman R.t Morrison J. C. J. Pharm. Sci., 1967, v. 56,
p. 248.

6.	Brain K. R.t Fazli F. R. I., Hardman R. Phytochemistry, 1968, v. 7, p. 1815.
7. Brain K. R., Hardman R. J. Chromat., 1968, v. 38, p. 355.

8.	Carle K., Alfermann A. W., Reinhard E. Planta Med., 1977, v. 32, p. 195.
8a. Carle R., Reinhard E. Planta Med., 1980, v. 38, p. 381.

9.	Cooke В. K. Analyst, 1970, v. 95, p. 95.
10.	Cowley R. S., Evans F. J., Ginman R. F. A. J. Chromat., 1971, v. 54,
p. 185.

11.	Cripps A. L., Blunden G. Steroids, 1978, v. 31, p. 661.

12.	Csizer E., Gorog S. J. Chromat., 1973, v. 76, p. 502.

13.	Dawidar A. M., Saleh A. A., Elmotei S. L. Planta Med., 1974, v. 24, p. 367.

14.	Diaz G., Zaffaroni A., Rosenkrantz G., Djerassi C. J. Org. Chem., 1952,
v. 17, p. 747.

15.	Dixit B. S., Srivastova S. N. Indian J. Pharm., 1977, v. 39, p. 62.

16.	Ellnain-Wojtaszek M., Kowalewski Z., Lutomski J., Skrzypczakowa L.
Herba Pol., 1975, v. 21, p. 377.

17.	Elmunajjed D. T., Fayez M. B., Radwan A. S. Phytochemistry, 1965, v. 4,
p. 587.

18.	Evans F. J. Biomed. Mass Spectrom., 1974, v. 1, p. 166.

19.	Fayez M. B. E., Radwan A. S. Z. Anal. Chem., 1967, v. 227, p. 30.

20.	Gandotra N., Kapani B. K, Sarin У. K-> Atal С. K. Indian J. Pharm., 1977,
v. 39, p. 135.

21.	Gordg S. Acta Chim. Hung., 1966, v. 47, p. 1.

22.	Hardman R. Steroid Plants in the Production of Contraceptives, in Con-
ception and Contraception, Excerpta Medica. Amsterdam. 1974, p. 60.

23.	Hardman R., Jefferies T. M. Analyst, 1972, v. 97, p. 432.

24.	Hiai S., Oura H., Nakajima T. Planta Med., 1975, v. 29, p. 116.

25.	Higgins J. W. J. Chromat., 1976, v. 121, p. 329.

26.	Hsu L. S. Acta Chim. Sinica, 1977, v. 35, p. 233.

27.	Hsu L. S., Liu A. R. Acta Chim. Sinica, 1977, v. 35, p. 239.

27a. Hunter I. R., Walden M. K., Bailey G. F., Heftmann E. J. Natur. Prod.,
1981, v. 44, p. 245.

28.	Jefferies T. M., Hardman R. Planta Med., 1972, v. 22, p. 78.

29.	Jefferies T. M., Hardman R. Analyst, 1976, v. 101, p. 122.

29a. Кабанов В. С., Стихии В. А., Азаркова А. Ф. Химико-фармацевтич. ж.,
1980. т. 14, с. 102.

30.	Kadkade Р. G., Rolz С., Dwyer J. D. Lloydia, 1976, v. 39, р. 416.

31.	Kartnig Th., Danhofer-Ndhammer R., Wegschaider O. Arch. Pharm., 1972,
v. 305, p. 515.

32.	Kartnig Th., Micula G. Arch. Pharm., 1970, v. 303, p. 767.

33.	Kaufmann S., Medina J. C., Zapata C. Anal. Chem., 1960, v. 32, p. 192.

34.	Knight J. C. J. Chromat., 1977, v. 133, p. 222.

35.	Lockwood G. B., Brain K., Turner T. D. J. Chromat., 1974, v. 95, p. 250.

36.	Lopez Sanchez G., Medina Acevedo J. C., Soto R. R. Analyst, 1972, v. 97,
p. 973.

36a. Mahato S. B., Sahu N. P., Roy S. K. J. Chromat., 1981, v. 206, p. 169.

37.	Marguardt F. H. Chem. Ind., 1978, p. 94.

38.	Matsuki Y., Fukuhara K., Yui T., Nambara T. J. Chromat., 1979, v. 174,
p. 451.

39.	Matsumoto M. Chem. Pharm. Bull., 1963, v. 11, p. 1189.

40.	Mehta A. R., Staba E. J. J. Pharm. Sci., 1972, v. 61, p. 864.

41.	Николов Ст. и др. Фармация, 1976, т. 31, с. 611.

42.	Okumura T. Bunseki Kagaku, 1974, v. 23, p. 893.

43.	Панина	В. В. Мед. пром. СССР,	1965, т. 19, с. 55.

44.	Панина	В. В.,	Мадаева О. С. Химико-фармацевтич. ж., 1967,	т. 1,	с.	37.

45.	Панина	В. В.,	Лошкарев П. М.	Мед. пром. СССР, 1963, т. 17, с. 45.

46.	Пхеидзе	Т. А.,	Кемерталидзе Е.	П. Химико-фармацевтич. ж.,	1976,	т.	10,

с. 127.

47.	Reichelt J., Cizek J. Cesk. Farm., 1978, v. 27, p. 221.

48.	Reichelt J., Stransky K. Cesk. Farm., 1978, v. 27, p. 136.

49.	Rishi A. K., Kapoor R., Vakhlu V. K. Curr. Sci., 1976, v. 45, p. 327.

50.	Rosanski A. Analyst, 1972, v. 97, p. 968.

51.	Rosumek К. E. J. Chromat., 1969, v. 40, p. 97.
52.	Schreiber K.t Aurich О., Osake G. J. Chromat., 1963, v. 12, р. 63.

53.	Segal R., Milo-Goldzweig D., Zaitschek D. V., Noam M. Anal. Biochem.,
1978, v. 84, p. 78.

54.	Шайн С. С., Волошина Д. А. Прикладная биохимия, микробиология, 1977,
т. 13 с. 143.

55.	Slack S. С.', Mader W. J. Anal. Chem., 1961, v. 33, p. 625.

56.	Sofowora E. A., Hardman R. Planta Med., 1974, v. 26, p. 385.

57.	Takeda K., Hara S., Wada A., Matsumoto N. J. Chromat., 1963, v. 11,
p. 562.

58.	Walens H. A., Turner A., Wall M. E. Anal. Chem., 1954, v. 26,v p. 325.

59.	Wall M. E., Eddy R. C.t McLennan M. I., Klumpp M. E. Anal. Chem., 1952,
v. 24, p. 1337.

60.	Wilkomirski B., Bobeiko V. A., Kintya P. K. J. Chromat., 1976, v. 116,
p. 482.

61.	Yamagishi M.t Nakamura I. Chem. Pharm. Bull., 1958, v. 6, p. 421.

31 Заказ № 182
РАЗНЫЕ СТЕРОИДЫ

9.1.	ЭКДИЗОНЫ

Ниже приведены формулы некоторых важных экдизонов.
Можно заметить, что для них характерны 5р-холестановые ске-
леты, наличие Д7-6-кетогруппировки и нескольких оксигрупп как
в стероидном ядре, так и в боковой цепи. Одной из причин,
почему экдизоны не обсуждаются вместе со стеринами в гл. 4,
является то, что вследствие наличия большого числа оксигрупп
и сопряженной кетогруппы они имеют совершенно иные анали-
тические характеристики. Кроме того, важной причиной яв-
ляется их биологическая активность, как как эти стероиды рас-
тительного и животного происхождения регулируют линьку на-
секомых, и поэтому их рассматривают как гормоны линьки
насекомых, важные в качестве инсектицидов.

а-Экдизон

Экдистерон (р-экдизон)
Инокостерон
Макистерон А
Понастерон А

Ri
н
он
он
он
он

R2

ОН
ОН
Н
Н
Н

R3

Н
Н
ОН
ОН
Н

r4
н
н
н
СНз
н

Благодаря наличию Д7-6-кетогруппировки экдизоны обладают
интенсивной полосой поглощения в УФ-области при 240 нм, од-
нако при анализе природных экстрактов это не имеет большого
значения, поскольку они образуют сложные смеси, требующие
длительного разделения перед использованием УФ-спектроско-
пии [51]. Например, Хардман и Бенджамин [15] определяли
экдизоны методом УФ-спектрофотометрии после ТСХ-разделе-
ния и элюирования пятен. Аналогичным образом, хотя для
определения экдизонов и известно несколько цветных реакций
[19], селективное определение можно провести только после
хроматографического разделения. Так, например, Холодова [29]
определяла экдизоны с помощью реакции Чугаева (поглоще-
ние измеряли при 380 нм после реакции с уксуснокислым рас-
твором хлорида цинка при 65°С) после разделения методом
ТСХ.

Экдизоны можно определить флуориметрически после обра-
ботки смесью серной кислоты и 95 %-ного этанола в соотноше-
нии 3 : 1 (по объему) [10, 32]. При этом возникает относительно
устойчивая флуоресценция (возбуждение для а-экдизона при
390 нм, испускание при 440 нм; градуировочный график линеен
в интервале 0,3—3 мкг/мл), но ее можно использовать для ко-
личественного анализа экстрактов только после ТСХ-разделе-
ния и элюирования пятен.

Приведенные выше примеры показывают, что тонкослойная
хроматография играет важную роль в анализе экдизонов. Раз-
деление проводят на силикагелевых пластинках различными
смесями растворителей типа хлороформ—метанол (4:1) [29],
дихлорметан—этанол (5:1) [15], хлороформ—95 %-ный эта-
нол (65:35) [32]. Ру и Блэк [45] изучали несколько систем рас-
творителей для разделения а- и р-экдизонов, и самой эффек-
тивной из них оказалась смесь хлороформа и метанола (4:1)
(величины Rf равны 0,68 и 0,60 соответственно). В итоге можно
заключить, что эти системы растворителей намного более по-
лярны, чем используемые для разделения других стеринов, что
объясняется наличием большего числа оксигрупп в молекулах.
По той же причине успешно применялась бумажная хромато-
графия, с помощью которой получены гораздо лучшие резуль-
таты разделения [9]. Для обнаружения предложен ряд опры-
скивающих реагентов, но наибольшая чувствительность получена
при тушении флуоресценции в коротковолновой УФ-области
[45]. Майер и Свобода [32] использовали тушение флуорес-
ценции для количественного определения in situ экдистерона
и а-экдизона, разделенных на ТСХ-пластинках. Из-за наличия
одинаковой хромофорной группы (Д7-6-кетогруппировка) чув-
ствительность определения обоих соединений одинакова, а гра-
дуировочный график линеен до 5 мкг/пятно.

Что касается количественных методов определения экдизо-
нов, то наиболее обширная литература посвящена методу газо-
вой хроматографии [16]. Поскольку экдизоны являются поли-
оксипроизводными, естественно, что их газохроматографическое
определение может быть выполнено только после дериватиза-
ции оксигрупп. Большинство исследователей используют для
этого триметилсилилирование в различных экспериментальных
условиях, как, например, нагревание в течение 1 мин при 80°С
со смесью БСА и пиридина (5:1) [27] или нагревание при
100°С с ТМСИМ в течение 60 мин [24] или в течение 15 мин
[6]. Результаты этих методов иногда сбивают с толку и трудно
воспроизводимы [46]. Это обусловлено значительным различием
в реакционной способности оксигрупп. В большинстве случаев
авторы различных методик ставили целью получение единич-
ных пиков, а степень силилирования обычно была неясна. Не-
давно этот вопрос был тщательно исследован Морганом и Пу-
лом [36]. Они нашли, что реакционная способность оксигрупп
по отношению с ТМСИМ меняется в ряду 2, 3, 22, 25>20> 14.
Исключительно трудной для силилирования является третич-
ная 14-а-оксигруппа (необходимо нагревание в течение ночи
при 140°С с ТМСИМ или использование катализаторов типа
ацетата калия); в жестких условиях следует принимать также
во внимание енольное силилирование 6-кетогруппы. Экдизоны,
не имеющие оксигруппы в положении 20 (а-экдизон), легко
силилируются при комнатной температуре в течение 30 мин
с помощью ТМСИМ [42], тогда как для дериватизации 20-окси-
группы, например в экдистероне, требуется нагревание при
100°С в течение 4 ч. Силилированные экдизоны обычно разде-
ляют на метилсиликоновых неподвижных фазах (обычно
OV101).

Низкая концентрация анализируемых веществ привела к не-
обходимости повысить чувствительность определения. Для того
чтобы можно было использовать детектор электронного захвата
[35, 42], получали гептафторбутирильные производные. Позднее
Пул и Морган [40, 41], а также Борст и О’Коннор [6] обнару-
жили, что даже без последней дериватизации триметилсилило-
вые производные можно обнаружить с помощью детектора элек-
тронного захвата в количествах до 5 пг. Детальное иссле-
дование этого явления показало, что высокая способность
к электронному захвату экдизонов обусловлена наличием
Д7-6-кето- и 14а-оксигрупп. При силилировании последней проис-
ходит дальнейшее увеличение чувствительности [40].

В некоторых случаях газохроматографические исследования
были дополнены комбинированными методами — газовой хрома-
тографией и масс-спектрометрией, а также масс-фрагментогра-
фией [15а, 24, 36].

Важным методом разделения и очистки экдизонов является
жидкостная хроматография на колонках с силикагелем, окси-
дом алюминия, флорисилом [25], полиамидом [15], амберлитом
XAD-2 [20], сефадексом G-25 [21] и др. Экдизоны были среди
первых стероидов, разделенных ВЭЖХ [17]. С тех пор она
стала стандартным методом анализа природных экстрактов,
содержащих экдизоны, поскольку в отличие от газовой хрома-
тографии ВЭЖХ не требует дериватизации, а высокая актив-
ность экдизонов в УФ-области позволяет определять их при
254 нм с чувствительностью, сравнимой с чувствительностью

пламенно-ионизационного детекто-
ра, но, очевидно, более низкой, чем
чувствительность детектора элек-
тронного захвата.

Разделение проводили на ад-
сорбционных колонках с корасилом
II системами растворителей хлоро-
форм— 95 %-ный этанол [8, 32, 37]
на колонках с обращенными фа-
зами, заполненных фенил-корасилом
марки бондапак (смесь воды и эта-
нола [8] ), а также на колонках
с пермафазой ODS или зорбаксом
ODS (водный раствор метанола)
[38].

Как и во многих других обла-
стях, адсорбционная и распредели-
тельная хроматография здесь также
хорошо дополняют друг друга, что
иллюстрируется рис. 9.1, взятым из
работы Гилгана [8]. На этом ри-
сунке показано, что после разделе-
ния на колонке с обращенной фазой
при градиентном элюировании пять
экдизонов дают 4 пика и лишь ино-
костерон и макистерон разделяются
плохо. Последние два соединения,
различающиеся только 24-СН3-груп-
пой, были легко разделены тем же
исследователем на колонке с кора-
силом II с помощью смеси хлоро-
форма и 95 %-ного этанола в соот-
ношении 8: 1 (которая в свою оче-
редь не разделяет экдистерон и ино-
костерон).

Следует упомянуть, что в про-
цессе исследования экдизонов
ВЭЖХ в исходных экстрактах Ога-
ва и сотр. [38] разделили Л- и В-

Рис. 9.1. Разделение экдизонов
ВЭЖХ на , колонке (100 смХ
ХЗ мм), заполненной фенил-
корасилом марки бондапак
(37—50 мкм). Сначала элюи-
ровали водой (0—10 мин), за-
тем проводили линейное гра-
диентное элюирование до 20 %
этанола, УФ-детектор (254 нм)
[8].

1 — экдистерон; 2 — инокосте-
рон; 3 —• макистерон А; 4 —
а-экдизон; 5 — понастерон А.

изомеры инокостерона на колонке

с пермафазой ODS при линейном

градиентном элюировании сначала чистой водой и кончая 2%-
ным раствором метанола. Те же исследователи повысили селек-
тивность обнаружения экдизонов в экстрактах сканированием
хроматограммы не только необработанного экстракта, но и по-
сле его обработки борогидридом натрия. В результате обработки
происходит восстановление 6-кетогруппы, и поэтому экдизоны
элиминируются из хроматограммы. Скули и Наканиши [46]
сообщали о полупрепаративном разделении различных экдизо-
нов на колонке с порагелем PN градиентным элюированием
водными растворами метанола.

В заключение следует упомянуть две работы, в которых
сообщается об использовании в исследовании экдизонов радио-
иммунного метода [6] и аффинной хроматографии [48].

9.2.	СОЛАСОДИН И РОДСТВЕННЫЕ АЛКАЛОИДЫ

Соласодин является азотсодержащим аналогом диосгенина
(см. гл. 8), в котором атом кислорода в кольце F заменен
NH-группой. Соласодин (сопровождаемый некоторыми произ-
водными) — важный компонент различных видов Solarium. По-
скольку в результате химической реакции соласодин (подобно
диосгенину) можно превратить в ацетат Зр-окси-5,16-прегна-
диен-20-она, он служит заменителем диосгенина в качестве
сырья при полусинтезе стероидных гормонов. В растениях сола-
содин находится в форме глюкоалкалоида соласонина. В боль-
шинстве методик, предложенных для определения соласодина
в растительном сырье, экстракция алкалоида и отщепление ос-
татка сахара от 3-оксигруппы с помощью кислотной обработки
проводятся одновременно.

Азот в кольце F обладает умеренной основностью и поэтому
без особых затруднений может быть оттитрован в неводном
растворителе. Такое титрование легко осуществимо микромето-
дом и поэтому может быть использовано для анализа расти-
тельных экстрактов. Более того, можно утверждать, что это
единственно важный случай, когда титрование играет значи-
тельную роль в определении стероидного соединения в биологи-
ческом образце.

В табл. 9.1 приведены некоторые характеристики четырех*
титриметрических методов, предложенных для анализа различ-
ных видов Solarium.

Для титриметрического определения пригодна и другая
группа соласодина — А5-двойная связь. Гёрёг [11] обнаружил,
что соласодин и его О,М-диацетильные производные можно
легко оттитровать 0,1 н. уксуснокислым раствором брома
в среде уксусной кислоты в присутствии хлорида ртути(II)
и ацетата натрия. При титровании расходуется 2 экв/моль
брома. Интересно заметить, что в случае диацетил-ф-соласо-
дина (промежуточный продукт разложения соласодина, см.
р-цию 9.1), содержащего дополнительно двойную связь такого же
типа, как в виниловом эфире, расходуется 8 экв/моль брома

диацетил-ф-соласодин

Ранние колориметрические методы определения стероидных
алкалоидов собраны в работе Бартоша и Пезе [2]. Из более
новых методов нужно отметить методику Сабо и др. [49], пред-
ложенную для определения соласодина в Solanum laciniatum.
Экстракцию проводят смесью метанола, воды и уксусной кис-
лоты в соотношении 35:61,8:3,2. Глюкоалкалоиды отделяют на
ионообменной колонке с амберлитом CG 601 при pH 6, примеси
удаляют промыванием колонки 5 %-ным водным раствором ам-
миака. Глюкоалкалоиды элюируют смесью пиридина и мета-
нола (1:3). Элюат выпаривают досуха, остаток растворяют
в 1 мл этанола и проводят цветную реакцию обработкой 5 мл
смеси 98 %-ной серной кислоты и 96%-ного этанола в соотно-
шении 35:15 (по объему) при 40°С в течение 15 мин. Поглоще-
ние измеряют при 410 нм.
Таблица 9.1. Титриметрические методы определения соласодина
в различных видах Solatium

Автор	Год	Титрант	Среда	Способ обнаруже- ния конечной точки
Гинес [14] а	1970	0,005 М л-то- луолсульфокис- лота в смеси хлороформ— фенол	ССЦ—фенол	Индикатор ди- метиловый желтый
Бит и др. [4]	1970	0,005 М л-то- луолсульфокис- лота в смеси хлороформ— фенол	СНС1з	Индикатор ди- метиловый желтый
Панина и др. [39]	1976	0,1 М хлорная кислота	Ксилол и ук- сусный ангид- рид	Индикатор кристалличе- ский фиолето- вый
Телек [53]	1977	0,005 М хлор- ная кислота в диоксане	Бензол—аце- тон	Потенциомет- рия

а Титровали глюкоалкалоид соласодин.

Другой тип колориметрического определения основан на об-
разовании ионных ассоциатов соласодина с красителями. Шаш
и др. [50] осуществили реакцию хлороформного раствора сола-
содина (полученного экстракцией лекарственного сырья раз-
бавленной азотной кислотой, осаждением глюкоалкалоида
и гидролизом горячей соляной кислотой) с раствором тропео-
лина ООО в разбавленном водном растворе серной кислоты.
Максимум поглощения находится приблизительно при 500 нм,
молярный коэффициент поглощения достигает примерно 18 000.
Этот же принцип использован Карайя и др. [26] для определе-
ния соласодина в листьях Solarium laciniatum. После экстрак-
ции (и одновременного гидролиза) горячей смесью этанола
и концентрированной соляной кислоты (17:3) и очистке на ко-
лонке с оксидом алюминия получают зеленый комплекс соласо-
дина и бромкрезола в фосфатном буфере (pH 5,2) в водном
растворе этанола; в качестве несмешивающегося растворителя
применяют бензол. Слой бензола, содержащий комплекс, обра-
батывают спиртовым раствором аммиака и измеряют поглоще-
ние при 630 нм; чувствительность такая же, как в описанном
выше примере.

Важную роль при разделении и количественном определении
стероидных алкалоидов играют хроматографические методы.
Ранее уже упоминалось о применении колоночной хроматогра-
фии [26, 49], но чаще сообщается об использовании тонкослой-
ной хроматографии. Наиболее фундаментальной в этой области
является работа Хантера и др. [22], где описано разделение
и обнаружение 26 стероидных алкалоидов на силикагеле с по-
мощью восьми различных систем растворителей. Например,
для разделения соласодина и томатидина наиболее подходя-
щими системами оказались гексан—этилацетат (1:1; Rf равно
0,27 и 0,47) и дихлорметан—ацетон (4:1; Rf равно 0,23
и 0,37). Используют также смесь хлороформ—метанол—вода
(61:32:7) [1] или эту же смесь, содержащую 25 %-ный вод-
ный аммиак вместо воды [5, 25а], смесь этанол—уксусная кис-
лота—вода (43 : 5 : 2) [43] и этилацетат—пиридин—вода
(3:1:3) [4]. Сообщается [44] также об использовании силика-
гелевых пластинок, пропитанных нитратом серебра. Для опры-
скивания обычно применяют серную кислоту [1, 22], серную
кислоту с ванилином [5] или сульфатом церия (IV) [43] и хло-
рид сурьмы(III) [49]. Некоторые из этих методов пригодны
и для количественного определения [1, 5].

Особого внимания заслуживает метод Желлемы и др. [25а],
разработанный для определения гликоалкалоидов картофеля.
После погружения пластинки в раствор бланкофора ВА прово-
дят количественное флуороденситометрическое определение
(возбуждение при 380 нм, испускание при 450 нм).

Применению газовой хроматографии для количественного
определения стероидных алкалоидов посвящены три работы.
Херб и др. [18] разделяли перметилированные производные на
OV-1 или дексиле 300, а Рузен-Рунге и Шнейдер [43] на ко-
лонке с SE-30 разделяли триметилсилильные производные.
Кинг [29а] определял различные алкалоиды картофеля в не-
дериватизированной форме на колонке с OV-17. Если задача
анализа заключается в разделении А5-3-оксистероида и его ди-
гидропроизводного (соланидин—демиссидин), то необходимо
трифторацетилирование оксигруппы. В условиях газохромато-
графического определения трифторацетилированное производ-
ное первого разлагается до производного 3,5-диена, тогда как
производное насыщенного соединения не разлагается, что и об-
легчает разделение.

В последние несколько лет успешно применяется ВЭЖХ.
Хантер и др. [23] применяли этот метод для полупрепаратив-
ного разделения стероидных гормонов на колонке с пораси-
лом А путем градиентного элюирования сначала смесью аце-
тон—гексан (2: 1), затем смесью ацетон—вода (97:3) и, нако-
нец, изократным хроматографированием с последней.

Для аналитического разделения и количественного опреде-
ления алкалоидов и гликоалкалоидов обычно применяют
системы с обращенными фазами [66, в, 7а, 36а] или колонки
с диоксидом кремния [22а] и коротковолновый УФ-детектор.

9.3.	ПАНКУРОНИЙБРОМИД

И РОДСТВЕННЫЕ СОЕДИНЕНИЯ ЧЕТВЕРТИЧНОГО
АММОНИЯ

В последнее десятилетие заметный интерес был проявлен
к новому неполяризующему мышечному релаксанту панкуро-
нийбромиду и продуктам его гидролиза в биологических объ-
ектах. (Все три продукта гидролиза — два моноацетата и пол-
ностью дезацетилированный свободный спирт — считаются ме-
таболитами.)

Для определения панкуронийбромида и его метаболитов
в биологических жидкостях и препаратах для инъекций широко
используют колориметрические и флуориметрические методы.
В первых попытках руководствовались методом с гидроксама-
том железа (III) [6а, 31]. Для того чтобы повысить селектив-

ность этого метода (его низкая селективность обусловлена на-
личием эфирных групп в молекуле) Танака и др. [52] прово-
дили селективную экстракцию дихлорметаном соединений чет-
вертичного аммония в форме ионных ассоциатов с бромфено-
ловым синим. Панкуронийбромид регенерировали для после-
дующего колориметрического определения на колонке с DEAE-
целлюлозой. Ввиду низкой чувствительности определения с гид-
роксаматом железа (III) (е~1800) более предпочтительными
и широко распространенными методами исследования метабо-
лизма панкуронийбромида являются фотометрические или
флуориметрические методы, основанные на измерении' поглоще-
ния или флуоресценции ионных ассоциатов в органической
фазе. Танака и др. [52] экстрагировали комплекс из водного
раствора, содержащего 20 мл раствора панкуронийбромида
(или разбавленной мочи), 10 мл 10%-ного раствора карбоната
натрия и 3 мл 0,1 %-ного раствора бромфенолового синего, сна-
чала 40 мл дихлорметана, затем двумя порциями дихлорметана
по 20 мл. Прглощение органической фазы измеряли при 602 нм.
Бузелло [7] провел тщательное изучение колориметрического
метода определения. Ионный ассоциат с бромфеноловым си-
ним экстрагировали хлороформом при pH 9,8 и измеряли по-
глощение при 590 нм (в ~ 54 000). Эта простая методика при-
годна и для анализа мочи, но при анализе сыворотки крови не-
обходима очистка комплекса с помощью ТСХ. Если цель ана-
лиза состоит в селективном определении непревращенного пан-
куронийбромида и его метаболитов, то экстрагированный ком-
плекс с бромфеноловым синим подвергают ТСХ на силикагеле
смесью к-бутанола, 20 %-ного водного раствора хлорида аммо-
ния и пиридина (75:36:30), в которой комплекс разлагается,
а метаболиты разделяются. После опрыскивания иодом пятна
соскребают, получают комплексы, последние экстрагируют хло-
роформом и, измерив поглощение хлороформных экстрактов,
получают данные по распределению панкуронийбромида и его
метаболитов в исходном материале. Для определения панкуро-
нийбромида и (после ТСХ-разделения) продуктов его распада
Мишель и Кинге [34] разработали аналогичную методику, ос-
нованную на использовании в качестве красителя бромтимоло-
вого синего. Для определения бисчетвертичного 2,16-(М-метил-
пиперазиний) метобромида (ардуанл) в фармацевтических
препаратах (^тах = 410 нм, 8 = 34 500) Гёрёг и Ренье [13] ис-
пользовали экстракцию дихлорметаном комплекса с бромтимо-
ловым синим из боратного буферного раствора (pH 8).

Чувствительность и специфичность анализа можно значи-
тельно повысить путем использования флуоресцирующего кра-
сителя и флуориметрического определения комплекса. Этот
принцип был положен в основу метода, разработанного Керсте-
ном и др. [28]. В качестве флуоресцирующего агента служил
краситель бенгальский розовый. Реакцию проводили в фосфат-
ном буферном растворе (pH 7,8) с последующей экстракцией
хлороформом, содержащим 2,5 % фенола и 5 % этанола. Перед
флуориметрическим измерением (возбуждение при 546 нм, испу-
скание при 570 нм) экстракт разбавляли ацетоном. (Недавно
Уотсон и Мак-Леод [54] сообщили, что применение этанола
вместо ацетона в качестве разбавителя приводит к возникнове-
нию более интенсивной и устойчивой флуоресценции.) Флуори-
метрический метод пригоден для анализа образцов плазмы
с содержанием стероида 20 мкг/л. При анализе биологических
объектов, включая мочу, плазму, сыворотку [55], гомогенаты
желчи, печени и почки, хроматографической очистки не тре-
буется.
Беван и др. [3] разработали радиохимический вариант вы-
шеуказанного метода. В качестве комплексообразующего агента
применяли 1251-бенгальский розовый, а определение панкуроний-
бромида в биологических объектах проводили путем измерения
экстракта с помощью сцинтилляционного счетчика. Сабо и Тас-
сони [49а] также использовали бенгальский розовый для опре-
деления ардуана* в сыровотке крови человека. Количественное
определение основано на спектрофотометрическом измерении
содержания иода в экстрагированном красителе по каталитиче-
скому эффекту реакции между церием (IV) и мышьяком (III).

Уже отмечалось, что важную роль в анализе стероидов —
производных четвертичного аммония — играет тонкослойная
хроматография. В дополнение к упомянутым выше примерам
заметим, что Синг и др. [47] описали шесть систем растворите-
лей для разделения азотсодержащих стероидных производных
на силикагеле, используя для опрыскивания пятен сульфат це-
рия (IV) или иод.

Наиболее трудную задачу представляет разделение двух
изомерных моноацетатов панкуронийбромида. Кинге и Мишель
[30] добились довольно хорошего разделения на силикагелевых
пластинках в смеси н-бутанола, пиридина, уксусной кислоты
и 20 %-ного водного раствора хлорида аммония (60 :40 : 12:48)
в отсутствие насыщения. Получены следующие величины Rf.
для. панкуронийбромида 0,27; 17Р-моноацетата 0,31; За-моно-
ацетата 0,35; 3,17-диоксипроизводного 0,41. Те же авторы опи-
сали метод количественного определения этих производных
[33] в той же хроматографической системе с последующим об-
наружением парами иода и денситометрическим измерением
при 390 нм. Количественное определение возможно также по-
сле опрыскивания пятен реактивом Драгендорфа [52].

Определение стероидных производных четвертичного аммо-
ния методом ВЭЖХ разработано Паанаккером и Ван-дер-Лаа-
ром [38а]. Эти производные экстрагировали из плазмы в виде
ионных пар с иодидом с помощью 1,2-дихлорэтана. Экстракт
вводили в хроматограф и разделяли на колонке с лихросорбом
SI 60 в буферной смеси метанола и воды (99: 1); определение
производили с помощью УФ-детектора при 215 нм.

ЛИТЕРАТУРА

1. Азаркова А. Ф., Коган Л. М. Химико-фармацевтич. ж., 1976, т. 10, с. 104.
2. Bartos J., Pesez М. Colorimetric and Fluorimetric Analysis of Steroids.

Academic Press. London, New York, San Francisco. 1976, pp. 250—254.
3. Bevan D. R., Caldwell J., Dring L. G., D'Souza J., Rouse J., Smith R. L.

Brit. J. Clin. Pharmacol., 1978, v. 5, p. 372P.

4.	Bite P., Mago-Karacsony E., Rettegi T., Uskert A. Acta Chim. Hung.,
1970, v. 64, p. 199.
5.	Борисов В. И., Пикова Л. А., Защепилова Г. Л., Банковский А. Д. Хи-
мико-фармацевтич. ж., 1976, т. 10, с. 116.

6.	Borst D. W., O’Connor J. D. Steroids, 1974, v. 26, p. 637.

6a. British Pharmacopoeia 1980, HM Stationary Office, London, 1980 v. II,
p. 646.

66. Bushway R. J., Barden E. S., Bushway A, W. J. Chromat., 1979, v 178,
p. 533.

6b. Bushway R. J., Barden E. S., Wilson A. M., Bushway A. W. J. Food Sci.,
1980, v. 45, p. 1088.

7.	Buzello IF. Anaesthetist, 1973, v. 23, p. 443.

7a. Grabbe P. G., Fryer C. L. J. Chromat., 1980, v. 187, p. 87.

8.	Gilgan M. W. J. Chromat, 1976, v. 129, p. 447.

9.	Gilgan M. W., Farquharson T. E. Steroids, 1973, v. 22, p. 365.

10.	Gilgan M. W., Zinck M. E. Steroids, 1972, v. 20, p. 95.

11.	Gorog S. Acta Chim. Hung., 1966, v. 47, p. 1.

12.	Gorog S. Acta Chim. Hung., 1966, v. 48, p. 121.

13.	Gorog S., Renyei M. unpublished results.

14.	Gyenes I. Titrationen in nichtwassrigen Medium. Akademiai Kiado, Buda-
pest, 1970, pp. 524—525.

15.	Hardman R., Benjamin T. V. J. Chromat, 1977, v. 131, p. 468.

15a. Hardman R., Benjamin T. V. Planta Medica, 1980, v. 39, p. 148.

16.	Heftmann E. Chromatography of Steroids, Elsevier, Amsterdam, Oxford,
New York, 1976, p. 115.

17.	Henry R. A., Schmidt J. A., Dieckman J. F. J. Chromat, 1971, v. 9, p. 513.

18.	Herb S. F., Fitzpatrick T. J.t Osman S. F. J. Agr. Food Chem., 1975, v. 23,
p. 520.

19.	Hoffmeister H., Ruf er C. Berichte, 1965, v. 98, p. 2376.

20.	Hori M. Steroids, 1969, v. 14, p. 33.

21.	Horn D. H. S., Fabbri S., Hampshire F., Lowe M. E. Biochem. J., 1968,
v. 109, p. 399.

22.	Hunter I. R.t Walden M. K., Wagner J. R., Heftmann E. J. Chromat., 1976,
v. 118, p. 259.

22a. Hunter I. K., Walden M. K-, Heftmann E. J. Chromat., 1980, v. 198, p. 363.

23.	Hunter I. R., Walden M. K.> Wagner J. R., Heftmann E. J. Chromat.,
1976, v. 119, p. 223.

24.	Ikekawa N., Hattori F., Rubio-Lightbourn J., Miyazaki H., Ishibashi M.,
Mori C. J. Chromat., 1972, v. 10, p. 273.

25.	Imai S., Hori M., Fujioka S., Murata E., Goto M., Nakanishi K. Tetra-
hedron Lett., 1968, 3883.

25a. Jellema R., Elema E. T., Malingre T. M. J. Chromat., 1981, v. 210, p. 12L

26.	Karawya M. S., Ghourab M. G., Elrakhawy F. H. J. Ass. Off. Anal. Chem.,
1975, v. 58, p. 528.

27.	Katz M., Lensky Y. Experientia, 1970, v. 26,' p. 1043.

28.	Karsten U. W., Meijer D. K-, Agoston S. Clin. Chim. Acta, 1973, v. 44,
p. 59.

29.	Холодова Ю. Д. Химия природных соединений, 1977, с. 227.

29а. King R. R. J. Ass. Off. Anal. Chem., 1980, v. 63, p. 1226.

30.	Kinget R., Michoel A. J. Chromat., 1976, v. 120, p. 234.

31.	Lubke P., Wellhelm G., Bihler K. Anaesthetist, 1971, v. 20, p. 221.

32.	Mayer R. T., Svoboda I. A. Steroids, 1978, v. 31, p. 139.

33.	Michoel A. J., Kinget R. Farmaco, Ed. Pr., 1976, v. 31, p. 352.

34.	Michoel A. L, Kinget R. J. Ass. Off. Anal. Chem., 1976, v. 59, p. 802.

35.	Miyazaki H., Ishibashi H., Mori C., Ikekawa N. Anal. Chem., 1973, v. 45,
p. 1164.

36.	Morgan E. D., Poole C. F. J. Chromat, 1976, v. 116, p. 333.

36a. Morris S. C„ Lee T. H. J. Chromat., 1981, v. 219, p. 403.
37.	Nigg Н. N., Thompson M. J., Kaplanis J. M., Svoboda J. A., Robbins W. E.
Steroids, 1974, v. 23, p. 507.

38.	Ogawa S., loshida A., Kato R. Chem. Pharm. Bull., 1977, v. 25, p. 904.
38a. Paanakker J. E.t Van de Laar G. L. J. Chromat. Biomed. Appl., 1980,
v. 189, p. 459.

39.	Панина В. В., Глизина Г. С., Авилова О. П., Проскурович А. К-, Ко-
ган Л. М. Химико-фармацевтич. ж., 1976, т. 10, с. 135.

40.	Poole С. F. Chem. and Ind., 1976, р. 479.

41.	Poole С. F., Morgan E. D. J. Chromat., 1975, v. 115, p. 587.

42.	Poole C. F., Morgan E. D„ Bebbington P. M. J. Chromat., 1975, v. 104,
p. 172.

43.	Roosen-Runge C., Schneider E. Z. Lebensm. Unters. Forsch., 1977, v. 164,
p. 96.

44.	Rozumek К E. J. Chromat., 1969, v. 40, p. 97.

45.	Ruh M. F., Black C. J. Chromat., 1976, v. 116, p. 480.

46.	Schooley D. A., Nakanischi K. in Heftmann E. (Editor). Modern Methods
of Steroid Analysis, Academic Press, New York, London, 1973, pp. 37—54.

47.	Singh H„ Paul D., Malbotra R. K-, Bhardwaj T. R. J. Chromat., 1975,
v. 114, p. 270.

48.	Spindler K- D„ Hamann A., Spindler-Barth M., Ihne A., Beckers A., Em-
merich H. Steroids, 1976, v. 27, p. 553.

49.	Szabo A., Patthy M., Mizsei A. Acta Pharm. Hung., 1974, v. 44, p. 47.

49a. Szabo A., Tassonyi E. Arzneim.-Forsch., 1981, v. 31, p. 1013.

50.	Szasz K, Gracza L., Lorincz Cs. Acta Pharm. Hung., 1961, v. 31, p. 211.

51.	Takemoto T., Ogawa S., Moria M., Nishimoto N.f Dome K-, Morishima K.
lakugaku Zasshi, 1968, v. 88, p. 39.

52.	Tanaka K-, Hioki M., Shindo H. Chem. Pharm. Bull., 1974, v. 22, p. 2599.

53.	Telek L. J. Pharm. Sci., 1977, v. 66, p. 699.

54.	Watson M. J., McLeod K. Clin. Chim. Acta, 1977, v. 79, p. 511.

55.	Wingard L. B., Abouleish E., West D. C.f Goehl T. J. J. Pharm. Sci., 1979,
v. 68, p. 914.
ПРЕДМЕТНЫЙ УКАЗАТЕЛЬ

Аллилэстренол 21, 67, ПО
Альдадиен см. Канренон
Альдостерон 209, 221, 222, 225, 229,
234, 236, 239, 244, 246, 255—258,
263, 270

180-глюкуронид 226, 227
18,21-дисукцинат 257
3-карбоксиметоксим 257, 258
Анагестона ацетат 108
5а-Андростан 91, 109
5а-Андростан-За,170-диол 142
5а-Андростан-30,170-диол 142
50-Андростан-За, 170-диол 84
50-Андростан-30,170-диол 84
50-Андростан-З,17-дион 84
50-Андростан- 17-он 84
5-Андростен-30,170-диол 84, 94, 156
4-Андростен-3,17-дион 18, 22, 71, 84,
91, 143

4-Андростен-3,11,17-трион 84

Андростерон 19, 73, 116, 125, 177, 207

Ардуанк 491, 492

Ацетилгитоксин (а, 0) 439

Ацетилдигитоксин (а, 0) 427, 439

Ацетилдигоксин (а, 0) 434, 439, 459
17а-Ацетокси-6-метилен-4-прегнен-

3,20-дион 160

17 а-Ацетокси-6- метил-4,6-прегна диен-
3,20-дион 160

Беклометазон 208, 242

Бетаметазон 208, 229, 242, 248, 256

ацетат 248

бензоат 216

17- или 21-валерат 215, 229,
240—242, 252

натриевая соль фосфата 242,
252

эфиры 212, 242

Брассикастерин 282, 294, 298, 301,305

Витамин Di 338

Витамин D2 330—340, 345—347, 349—

365, 373, 375, 377

ацетат 338

5,6-транс-Витамин D 334, 336, 338,

350, 356

ацетат 338

Витамин D3 330, 333, 335, 337, 340,

346—349, 352—368, 371—376.

379—381

Галопредона ацетат 240, 251

Гекогенин 467, 470, 472, 475, 476

Геллебрин 430

3-Гептафторбутирилокси-3,5-прегна-
диен-20-он 158

Гидрокортизон 23, 74, 208, 209, 213,
216, 219—223, 226, 227, 231, 232,
235, 239, 242, 244, 246
ацетат 74, 229, 232, 244
гемисукцинат 242, 246
фосфат 242
ципионат 248

Гиодезоксихолевая кислота 390, 391,
401, 403

метиловый эфир 405, 406

Гиохолевая кислота 403

метиловый эфир 405, 406

Гиталоксигенин 427, 447, 449

Гиталоксин 427, 439, 447, 449

Гитогенин 467, 472, 476

Гитоксигенин 427, 433, 437, 442, 447,
449

Гитоксин 427, 435, 439, 442, 447, 449,
456

Гитонин 288

Глико дезоксихолевая кислота 390,
408, 415

Гликолитохолевая кислота 390

Гликохенодезоксихолевая кислота
408, 410, 415, 419

Гликохолевая кислота 390, 408, 415

Дегидрохолевая кислота 389—391,
416

7-Дегидрохолестерин 283, 285, 294,
305, 330, 362, 372

Дегидроэтиандростерон 18, 36, 47, 71,
78, 84, 90, 107, 111, 118, 131, 140,
147, 156, 171, 175
сульфат 19, 106, 176
энантат 80

Дезацетилланатозид А 439

Дезацетилланатозид С 439, 447, 448

11-Дезоксигидрокортизон см. Рейх-
штейна вещество S

Дезоксикортикостерон 208, 209, 229,
234, 253, 258

ацетат 229

Дезоксихолевая кислота	389—392,

396, 408, 413, 415
метиловый эфир 396, 405, 406

Дексаметазон 120, 208, 224, 229, 233,
246, 271

натриевая соль фосфата 244

Деперзолон 208, 216

Десмостерин 282, 301

Диангидрогитоксин 435

Диацетилсоласодин 486, 487

Диацетил-Чг-соласодин 486, 487

3,21 - Диацетокси-14,21 -эпоксидигиток-
сигениновая кислота 444

20,22-Дигидродигитоксигенин (20R,
20S) 438

20,22-Дигидродигоксин 437, 452, 455

20а-Дигидропрогестерон 116

20₽-Дигидропрогестерон 71

Дигидротахистерин 334, 348, 352, 354,
372

Дигидротестостерон (5а) 19, 35, 54,
71, 99, 136, 143, 156, 157
17а-Дигидроэквиленин-3-сульфат 117
Дигинатигенин 427, 447, 448
Дигинатин 427, 439, 447, 449
Дигитогенин 467

Дигитоксигенин 427, 439, 442, 444, 449

бис (дигитоксозид) 427, 439

монодигитоксозид 427, 439, 446
Дигитоксин 427, 428, 435, 436, 440,
442, 446, 447, 449, 451, 454—460
Дигитонин 288—290, 319, 374, 379,
456, 469

Дигоксигенин 427, 437, 439, 442—451
бис (дигитоксозид) 439, 443,
446, 451
монодигитоксозид 439, 443, 446,
451

Дигоксин 427, 428, 433, 435—439, 442,
443, 446—461

Дииодтирозинметиловый эфир дигок-
сигенина 453

7а, 17 а-Диметил-19-нортестостерон
см. Миболерон

Димэтистерон 21, 56, 63

*6(5,17(5-Диокси-4-андростен-З-он 75

la,24(R или S)-Диоксивитамин D3

355, 367, 381

la,25-Диоксивитамин D3 362, 367, 371,

373, 381, 382

25-гемисукцинат 372
24К,25-Диоксивитамин D3 355, 367,
371, 381, 382

248,25-Диоксивитамин D3 355, 367,

371, 381, 382

25,26-Диоксивитамин D3 368, 370, 371,
381, 382

11р,17а-Диокси-3,20-дикето-4-прегнен-
21-карбоновая кислота 221

11₽,17а-Диокси-3-кетоандростан-17-
карбоновая кислота 221

11₽,17а-Диокси-3-кетопрегнен-21-аль
221

3a,7 a-Диокси- 12-кетохолановая	кис-

лота 402

За,21 -Диокси-5(3-прегнан-20-он 261

17a,21-Диокси-5а-прегнан-3,11,20-

трион 221

11а,21-Диокси-4-прегнен-3,20-дион

229

Диосгегин 22, 467—479, 486

Диосцин 478

Изовитамин D2, D3 332, 334, 350, 356
ацетат 338

Изодигоксин 439

Изопировитамин D2, D3 332, 334,
351—353, 376, 378

Изотахистерин 332, 334, 336, 350, 353,
355, 356, 372—376, 378, 379

Инокостерон 482, 485

Иодтираминдигоксин 453

Калактин 447

Калотропин 447

Кампестанол 301

Кампестерин 282, 294, 298, 301, 303,
304, 321, 403

Канреноевая кислота 51, 52

Канренон 51, 52, 80, 114

7-Кетодезоксихолевая кислота 401

7-Кетолитохолевая кислота 402, 403,
416

16-Кетоэстрадиол 70, 179

6-Кетоэстриол 70

Клобетазон 242

Клопреднол 261

Копростенол 402

Кортизол см. Гидрокортизон

Кортизон 75, 208, 219, 229, 234, 244,

248, 258, 270

ацетат 75, 229

Кортикостерон 209, 220—222, 229, 234,
235, 244, 258, 270

Корто л (а,Р) 90, 207

Кортоловая кислота 127

Кортолон (а,Р) 90, 239

Криптогенин 469
Лабриформидин 447

Лабриформин 447

Ланатозид А 427, 428, 433, 439, 447,
449, 450, 460

Ланатозид В 427, 439, 447, 449, 450
Ланатозид С 427, 428, 433, 434, 439,
447, 449, 450, 459, 460

Ланатозид D 427, 447, 449, 450

Ланатозид Е 427, 447, 449, 450
Ланостерин 282, 283, 301, 319, 473
Лилагенин 467, 476
Линоэстренол 21, 57, 62, 64, ПО
Литохолевая кислота 389, 396, 398,
408, 415, 419

метиловый эфир 91, 396, 405,
406

30-Литохолевая кислота
метиловый эфир 405

Локортен 263

Лумистерин 331—334, 337, 338, 349,
351, 356, 375, 376

Макистерон А 482, 485

Мегестрола ацетат 21, 23, 57, 108, 156
Медроксипрогестерона ацетат 21, 63,
141, 147, 156

Медрол см. 60-Метилпреднизолон
Меленгестрола ацетат 180, 181
Мепросцилларин 430

Местранол 20, 28, 29, 41, 48, 50, 57,
59, 108—111, 114, 118, 165

Метандиенон (метандростенолон) 19,
47, 57, 75, 94

Метандриол 19, 47, 84, 107
а-Метилдигоксин 427
0-Метилдигоксин 428
24-Метиленхолестерин 301
4-Метил-19-нортестостерон 157
60-Метилпреднизолон 75, 242, 244,
246, 271
натриевая соль сукцината 246

Метилтестостерон 23, 51, 57, 108, ПО
3-Метокси-1,3,5 (10) ,6,8(9)-
эстрапентаен-170-ол 59
3-Метокси-1,3,5 (10) ,8 (9)
эстратетраен- 170-ол-59

3-Метокси-8аН,9аН-13,5 (10) -
эстратриен-170-ол 59

3-Метокси-80Н,90Н-1,3,5 (10) -
эстратетраен-170-ол 59

3-Метокси-80Н,9аН-1,3,5 (10)-
эстратриен-170-ол 59

2-Метоксиэстрон 179

Миболерон (7а, 17а-диметил-19-
нортестостерон) 106

Мурихолевой кислоты (а, 0) метило-
вый эфир 405, 406

32 Заказ № 182

Нандролона деканоат ПО

Неогитогенин 467, 476

Неотигогенин 467, 475, 476

Норгестрел 21, 40, 56, 63, 80, 138,
143, 165

23-Нор дезоксихолева я кислота 400

19-Нортестостерон 74
фенилпропионат 74
2-фурилпропионат 74

Норхолевая кислота 403

Норэтандролон 19, 63, ПО, 120

Норэтинодрел 21, 26, 56, 129

Норэтистерон 21, 26, 56, 62, 74, 78,
108, НО, 118, 120, 129, 141, 156,
157

ацетат 63, 78, 118

оксима ацетат 114

энантат 141

Оксандролон НО

З-Оксиандростан-17-он (За,5а; За,50;

30,5а; 30,50) 84, 86

14а-Окси-4-андростен-3,17-дион 75
За-Окси-5-андростен-17-он 157
30-Окси-13а,5-андростен-17-он 84
1а-Оксивитамин Е)з 362, 367, 381
25-Оксивитамины D 341, 343, 348, 357,
359, 365, 367, 371, 372, 381, 382

24 (R или S) -Оксивитамины D 367, 381
60-Оксигидрокортизон 246, 256
8-Оксидезоксикортикостерон 236, 237,
244, 246, 256, 270

17а-Окси-20а-дигидропрогестерон 116
11 -Окси-3,20-дикето-1,4-прегна диен-
21 -кислота

бутиловый эфир 242

18-Оксикортикостерон 208, 255—261
170-Окси- 17-метил-4-эстрен-3-он 75
16а-Оксипрегненолон 141
17а-Оксипрегненолон 71, 88, 130
2О0-Окси-4-прегнен-3-он 143
21-Окси-4-прегнен-3,11,20-трион 229
17а-Оксипрогестерон 20, 63, 71, 116,
134, 141, 208

гемисукцинат 151

18-Окситетрагидродезоксикортико-
стерон см. 3,18,21-Триокси -
прегнан-20-он

25,26-Оксихолестерин 304
2-Оксиэстрадиол 148
2-Оксиэстрон 141, 148
15а-Оксиэстрон 179
16 (а,0)-Оксиэстрон 179
30-Окси-5,16-прегнадиен-20-он 486

Панкуронийбромид 490—492
Параметазон 57

Пенногенин 467, 472
21-Пиридийпреднизолон 220
Пировитамины D2, D3 334, 351—353,
376, 378, 379

Понастерон А 482, 485

Превитамин D 333, 334, 349, 350, 356,
358, 367, 375, 376
ацетат 338

1,4-Прегнадиен-3,20-дион 113, 114
5а-Прегнан 91
5а-Прегнан-За,20а-диол 76, 156
5а-Прегнан-За,20р-диол 76
5₽-Прегнан-За,20а-диол 20, 44, 78, 90,
97, 107, 141

Прегнан-3,20-дион (5а,5(3) 76, 84
5₽-Прегнен-За,17а,20а-триол 20, 44,
90, 147

5-Прегнен-Зр,20а-диол 261

Прегненолон 18, 130, 148, 159, 171
ацетат 477

Преднизолон 23, 216, 220—223, 229,
232, 239, 242, 244, 246, 252—259,
261, 262, 266, 267
21-альдегид 250
ацетат 229
натрия фосфат 243, 252
21-сукцинат 257
тебутат 264

Преднизон 75, 223, 229, 242, 244, 246,
261, 265, 267, 451
ацетат 229

Преднимустин 262

Провитамин D2 см. Эргостерин

Провитамин D3 см. 7-Дегидрохоле-
стерин

Прогестерон 18, 20, 25, 51, 63, 68, 71,
75, 81, 84, 91, 102, 108—110, 112,
114, 116, 118, 131, 134, 137—143,
147, 149, 151, 154—160, 209, 253
бисдинитрофенилгидразон 125,
126

Рейхштейна вещество S 209, 221, 227,

229, 244, 248

Рускогенин 467

Сарсасапогенин 467, 472—474

Ситостерин 281, 283, 294, 298, 301—

304, 318, 321

Смилагенин 467, 470

Соланидин 489

Соласодин 486—489

Спиронолактон 23, 51, 80, 94, 112, 118,

129, 451

25$-3,5-Спиростадиен 478

Станозолол ПО

Станолон 110

Стигмастерин 281, 283, 294, 298, 301,

303, 315, 321, 349, 401

К-Строфантин 428

К-Строфантозид 428

Супрастерины 321, 334, 352, 375

Сцилларен 428

Тауродезоксихолевая кислота 408, 415
Тауролитохолевая кислота 408
Таурохенодезоксихолевая кислота 408,
410, 415

Таурохолевая кислота 408, 415
Тахистерин 331, 333, 334, 345, 349,
351, 356, 366, 375, 376

ацетат 338

Тестолактон 120

Тестостерон 18, 19, 35, 47, 63, 71,
72, 75, 80, 84—86, 93, 103, 109—
111, 113, 114, 116, 131, 134, 136,
139, 141—144, 149, 154, 156, 157,
160

ацетат 74, 109, 113, 114
глюкуронид 117, 143, 176
изокапронат 85
3-карбоксиметоксим 135, 150
оксим и производные 103
пропионат 74, 85, 108, 109, 111
сульфат 117, 131
фенилпропионат 85
энантат 74, 108

эфиры 63, 68, 86, 108, НО, 120
циклопентилпропионат НО

Тетрагидроальдостерон 225, 256—
258, 261

глюкуронид 261

Тетрагидро-11-дегидрокортикостерон

90

Тетрагидрокортизол 90, 239, 256—258
Тетрагидрокортизон 90, 256, 258

Зр-П-глюкуронид 214
Тетрагидрокортикостерон 90
Тигогенин 467, 470, 472—475, 477
Токсистерины 331, 351, 375
Томатидин 489
Томатин 289
Тренболон 120

ацетат 120

Триамцинолон 208, 230

ацетонид 216, 230, 233, 242,
250, 266

гексацетонид 242, 264

диацетат 230

пентанонид 266
Трикетохолановая кислота см. Дегид-
рохолевая кислота

За, 17а,20а-Триокси-5а-прегнан- 11-он
131

3,18,21-Триоксипрегнан-20-он (За,5а;

За,50; 30,5а; 30,50) 238, 239
17,200,21-Триокси-4-прегнен-3,20-дион
229

la,24(R или S) ,25-Триоксивитамин D3
381

Уабаин 428, 429, 433, 450

Урсо дезоксихолевая кислота 415, 417
метиловый эфир 406

Флудрокортизона ацетат 242
Флуметазон 208
пивалат 242

Флуоксиместерон 63
Флуорокортолон 208, 246
Флурандронолон 224
ацетонид 321

Флюоцинолон 208

ацетонид 26, 224, 232, 242
Фторкортизон 208

ацетат 230

9-Фтор-110-окси-16-метил-1,4-
андростадиен-3,17-дион 118

9-Фторпреднизон 208
Фукостерин 282, 301

Халцинонид 25, 244

Хенодезоксихолевая кислота 389, 390,
395, 396, 408, 413—415, 417, 419
метиловый эфир 396, 405, 406

Хингестанол 69

ацетат 27

Хинэстрол 120

50-Холановая кислота 401

Холевая кислота 389, 393, 396, 402

413—415

метиловый эфир 396, 405, 406
Холекальциферол см. Витамин D3
3,5-Холестадиен 299
5а-Холестан 299, 401—403
5а-Холестан-30-ол 294, 301—304, 313
314

3-бутиловый эфир 91
5а-Холестан-3-он 91, 109
Холестерин 18, 169, 209, 281, 283—
321, 330, 349, 352, 403

ацетат 299, 315

3-бутиловый эфир 90

гемисукцинат 315

гептилат 111

гептадеканоат 299

каприлат 111

линолеат 299

метиловый эфир 299

миристат 299

олеат 299, 313

пальмитат 296, 299

формиат 299

эфиры 287—292, 295, 299, 300,

305, 307, 312, 318

Эквиленин 20, 28, 39

сульфат 117

Эквилин 20, 28, 39, 84, 109

а-Экдизон 482—486

0-Экдизон см. Экдистерон
Экдистерон 482, 483, 485
Эпиандростерон 19, 73, 84, 118, 147
Эписмилагенин 447

Эпитестостерон 133, 136, 157

16-Эпиэстриол 70, 100, 179

Эпиэстрол 100, 179

Эргокальциферол см. Витамин D2
5-Эргостенол 294

Эргостерин 282, 283, 294, 296, 301,
329—331, 333, 334, 337, 339, 345,
349, 351, 352, 356, 375

ацетат 338

пероксид 337

Эриокарпин 447

Эстрадиол 18, 38, 42, 48—50, 54, 70,
71, 75, 84, 85, 91, 100, НО, 139,
141, 146, 147, 154

3-бензоат 24, 57, 74, 85, 108

валерат 29, 48, 74
17-гемисукцинат 135
дипропионат 28
3-метиловый эфир, 59
сложные эфиры 106, 108, НО,
120

фенилпропионат 85

циклопентилпропионат 110

1,3,5 (10) -Эстратриен-3,15a, 16a, 170-
тетрол 70

1,3,5 (10) -Эстратриен-3,6a, 170-триол

70

4-Эстрен-3,17-дион 84

Эстриол 42, 48, 50, 64, 70, 74, 80, 81,
100, 107, 120, 127, 142, 143, 149,
150, 151, 154, 156, 157, 171, 172,
175, 178, 179

16а-глюкуронид 20, 81, 137, 140,
143, 171

4-меркуриацетат 64

3-сульфат 81, 117

Эстрон 18—20, 28, 42, 48, 50, 59, 70,
71, 74, 84, 91, 108, 109, 131, 142,
144, 146, 147, 154, 156, 160, 179
глюкуронид 117

сульфат 117, 143

4-Этил-4-андростен-3,17-дион 157

13-Этил-11 -метилен-18,19-динор-17 а-

прегн-4-ен-20-ин-17-ол 142

Этилэстренол 19, 74, НО

17а-Этинил-3,5-эстрадиен- 17-ол 104

Этинилэстриола-3 циклопентиловый

эфир 110

Этинодиола 17-ацетат 105, 118

Этинодиола диацетат (а,0) 21, 57, 94,

118, 124, 129

Этиохоланолон 19, 90, 111, 118, 142,
175

Этистерон 21, 57, 74

Юккагенин 467, 476

Ямогенин 467, 471, 476
СОДЕРЖАНИЕ

Предисловие	редакторов	перевода.................................  5

Предисловие	к русскому	изданию.................................. 7

Предисловие	..................................................... 8

1.	ВВЕДЕНИЕ................................................. 10

1.1.	Проблемы и тенденции развития современной аналитической
химии стероидов........................................... 10

1.2.	Литература	по аналитической химии стероидов.......... 12

1.3.	Содержание	книги..................................... 14

Литература............................................. 16

2.	ПОЛОВЫЕ ГОРМОНЫ И РОДСТВЕННЫЕ СОЕДИНЕНИЯ ...	17

2.1.	Основы химии половых гормонов.............................. 17

2.2.	Методы анализа половых гормонов............................ 22

2.2.1.	Методы УФ-спектрофотометрии, основанные на собствен-
ном поглощении.............................................. 22

2.2.2.	УФ-Спектрофотометрические и колориметрические методы,
основанные на химических	реакциях....................... 30

2.2.3.	Флуориметрия......................................... 47

2.2.4.	Инфракрасная спектрофотометрия....................... 54

2.2.5.	ЯМР-Спектроскопия.................................... 58

2.2.6.	Полярография......................................... 60

2.2.7.	Титриметрические методы.............................. 64

2.2.8.	Гравиметрические методы.......................... . .	68

2.2.9.	Колоночная хроматография............................. 68

2.2.10.	Тонкослойная хроматография.......................... 72

2.2.11.	Газовая хроматография............................... 82

2.2.12.	Высокоэффективная жидкостная хроматография........	107

2.2.13.	Радиоиммунный и другие радиоизотопные методы ана-
лиза ...................................................... 130

2.2.14.	Ферментативные методы.............................. 145

2.2.15.	Масс-спектрометрия и родственные методы............ 152

2.2.16.	Другие методы...................................... 160

2.3.	Задачи аналитической химии половых гормонов............... 161

2.3.1.	Контроль чистоты гормонов........................... 161

2.3.2.	Определение половых гормонов в готовых лекарственных
формах.................................................... 163

2.3.3.	Определение половых гормонов и их метаболитов в био-
логических объектах....................................... 167

2.3.4.	Определение половых гормонов и анаболических агентов
в пищевых продуктах....................................... 180

Литература................................................. 182

3.	КОРТИКОСТЕРОИДЫ.............................................. 207

3.1.	Основы химии кортикостероидов............................. 207

3.2.	Методы анализа кортикостероидов........................... 210
3.2.1.	УФ-Спектрофотометрические и колориметрические методы,
основанные на химических реакциях........................... 210

3.2.2.	Флуориметрия......................................... 220

3.2.3.	Полярография......................................... 223

3.2.4.	Колоночная хроматография............................. 225

3.2.5.	Бумажная и тонкослойная хроматография................ 227

3.2.6.	Газовая хроматография................................ 233

3.2.7.	Высокоэффективная жидкостная хроматография........... 240

3.2.8.	Радиоиммунный и другие радиоизотопные методы ....	252

3.2.9.	Ферментативные методы................................ 259

3.2.10.	Масс-спектрометрия и родственные методы............. 260

3.2.11.	Другие методы....................................... 262

3.3.	Проблемы в анализе кортикостероидов........................ 263

3.3.1.	Контроль чистоты кортикостероидов в массе фабричного
продукта................................................. 263

3.3.2.	Определение	кортикостероидов	в	лекарственных	формах	265

3.3.3.	Определение кортикостероидов и их метаболитов в био-
логических образцах...................................... 268

3.3.4.	Определение	кортикостероидов в пищевых	продуктах .	.	.	270

Литература............................................... 271

4.	ХОЛЕСТЕРИН И РОДСТВЕННЫЕ СТЕРИНЫ............................... 281

4.1.	Основы химии стеринов...................................... 281

4.2.	Методы анализа стеринов.................................... 283

4.2.1.	Спектрофотометрические и колориметрические методы . .	283

4.2.2.	Флуориметрия......................................... 287

4.2.3.	Методы осаждения в виде дигитонидов.................. 288

4.2.4.	Электроаналитические методы.......................... 290

4.2.5.	Колоночная хроматография............................. 291

4.2.6.	Тонкослойная хроматография........................... 293

4.2.7.	Газовая хроматография...............................  297

4.2.8.	Высокоэффективная жидкостная хроматография........... 303

4.2.9.	Ферментативные методы................................ 305

4.2.10.	Масс-спектрометрия и родственные методы............. 313

4.2.11.	Другие методы....................................... 314

4.3.	Проблемы анализа стеринов.................................. 315

4.3.1.	Определение холестерина в сыворотке крови и других
биологических образцах..................................... 315

4.3.2.	Определение холестерина в исходном сырье для его по-
лучения (шерстяной воск, спинной мозг)..................... 318

4.3.3.	Определение стеринов	в	растениях.................... 319

4.3.4.	Определение стеринов	в	пищевых продуктах............ 320

Литература................................................. 321

5.	ВИТАМИНЫ D И РОДСТВЕННЫЕ СОЕДИНЕНИЯ......................... 329

5.1.	Основы химии витаминов D................................ 329

5.2.	Методы анализа витаминов D.............................. 333

5.2.1.	Методы УФ-спектрофотометрии....................... 333

5.2.2.	Колориметрические методы.......................... 335

5.2.3.	Инфракрасная спектрофотометрия.................... 337

5.2.4.	ЯМР-Спектроскопия................................. 337

5.2.5.	Полярография...................................... 338

5.2.6.	Колоночная хроматография.......................... 339

5.2.7.	Тонкослойная хроматография........................ 344

5.2.8.	Газовая хроматография............................. 350

5.2.9.	Высокоэффективная жидкостная	хроматография........ 355
5.2.10.	Метод конкурирующего связывания белка и другие ра-
диоизотопные методы........................................ 368

5.2.11.	Масс-спектрометрия и	родственные методы............. 372

5.2.12.	Другие методы....................................... 373

5.3.	Проблемы анализа витаминов	D.............................. 374

5.3.1.	Контроль чистоты кристаллических витаминов D......	374

5.3.2.	Анализ смолообразных	и	других продуктов	облучения	375

5.3.3.	Определение	витаминов	D	в лекарственных	препаратах	376

5.3.4.	Определение	витаминов	D	в пищевых продуктах.........	379

5.3.5.	Определение	витаминов	D	и их метаболитов	в крови . .	380

Литература.................................................. 382

6.	ЖЕЛЧНЫЕ КИСЛОТЫ............................................... 389

6.1.	Основы химии желчных кислот................................ 389

6.2.	Методы анализа желчных	кислот.............................. 391

6.2.1.	Колориметрические методы............................. 391

6.2.2.	Флуориметрия......................................... 393

6.2.3.	Колоночная хроматография............................. 394

6.2.4.	Тонкослойная хроматография........................... 395

6.2.5.	Газовая хроматография................................ 399

6.2.6.	Высокоэффективная жидкостная	хроматография........... 407

6.2.7.	Ферментативные методы................................ 409

6.2.8.	Масс-спектрометрия и родственные	методы........... 412

6.2.9.	Радиоиммунный метод.................................. 414

6.2.10.	Другие методы....................................... 416

6.3.	Проблемы анализа желчных	кислот............................ 417

6.3.1.	Определение желчных кислот и их конъюгатов в биоло-
гических образцах........................................... 417

6.3.2.	Определение желчных кислот в массе фабричного про-
дукта и в лекарственных препаратах......................... 419

Литература.................................................. 420

7.	СЕРДЕЧНЫЕ ГЛИКОЗИДЫ........................................... 427

7.1.	Основы химии сердечных гликозидов.......................... 427

7.2.	Методы анализа сердечных гликозидов........................ 429

7.2.1.	Ультрафиолетовая спектрофотометрия................... 429

7.2.2.	Колориметрические методы............................. 430

7.2.3.	Флуориметрия......................................... 434

7.2.4.	Колоночная хроматография............................. 436

7.2.5.	Тонкослойная хроматография........................... 438

7.2.6.	Газовая хроматография................................ 442

7.2.7.	Высокоэффективная жидкостная	хроматография........... 445

7.2.8.	Радиоиммуноанализ и ферментный	иммуноанализ ....	450

7.2.9.	Другие методы........................................ 454

7.3.	Проблемы анализа сердечных гликозидов...................... 455

7.3.1.	Контроль чистоты выделенных сердечных гликозидов . . .	455

7.3.2.	Определение сердечных гликозидов в лекарственных пре-
паратах .................................................... 457

7.3.3.	Определение сердечных гликозидов	в	растениях......	459

7.3.4.	Определение сердечных гликозидов и их метаболитов
в биологических жидкостях.................................. 461

Литература.................................................. 462

8.	ДИОСГЕНИН И РОДСТВЕННЫЕ САПОГЕНИНЫ............................ 467

8.1.	Основы химии сапогенинов................................... 467

8.2.	Методы анализа сапогенинов................................. 468
8.2.1.	Колориметрические методы..........................

8.2.2.	Инфракрасная спектрофотометрия....................

8.2.3.	Тонкослойная хроматография........................

8.2.4.	Колоночная хроматография и высокоэффективная коло-
ночная хроматография.....................................

8.2.5.	Газовая хроматография.......................  .	. .

8.2.6.	Другие методы.....................................

8.3.	Проблемы в анализе сапогенинов.........................

8.3.1.	Контроль чистоты сапогенинов......................

8.3.2.	Определение сапогенинов в растениях...............

Литература...............................................

9.	РАЗНЫЕ СТЕРОИДЫ.............................................

9.1.	Экдизоны...............................................

9.2.	Соласодин и родственные алкалоиды......................

9.3.	Панкуронийбромид и родственные соединения четвертичного
аммония......................................................

Литература..................................................

Предметный указатель........................................

Ш. Гёрёг

КОЛИЧЕСТВЕННЫЙ АНАЛИЗ СТЕРОИДОВ

Научный редактор Б. М. Комарова

Мл. научный редактор Н. Н. Устякова
Художественный редактор М. Н. Кузьмина
Технический редактор М. М. Кренделева
Корректор В. С. Соколов

И Б 5205

Сдано в набор 12.02.85.

Подписано к печати 29.10.85.

Формат 60X90716-

Бумага типографская № 1.

Печать высокая. Гарнитура латинская.

Объем 15,75 бум. л. Усл. печ. л. 31,50.

Усл. кр.-отт. 31,50. Уч.-изд. л. 35,38. Изд. № 3/3539.

Тираж 1650 экз. Заказ № 182. Цена 5 р. 60 к.

ИЗДАТЕЛЬСТВО «МИР»

129820, ГСП, Москва, И-110, 1-й Рижский пер., 2

Ленинградская типография № 8 ордена Трудового Крас-
ного Знамени Ленинградского объединения «Техническая
книга» им. Евгении Соколовой Союзполиграфпрома при
Государственном комитете СССР по делам издательств,
полиграфии и книжной торговли.

190000, Ленинград, Прачечный переулок, 6
468

471

471

473

475

476

477

477

477

479

482

482

486

490

492

495