/
Author: Приезжев А.В. Тучин В.В. Шубочкин Л.П.
Tags: оптика физика медицина биология инженерия лазеры
ISBN: 5-02-0144049-X
Year: 1989
Text
iiimimi
L
lllllllllllM
11 1111 Ilf 11
11111 III 11
11111 IIIP
11111 III I
1111 III! I
11111 IIIf
11111 III I
<illill
HUH
111III
>1111'
Illi
lll>
III
jiiliiiif I iiii iiliiiiill i ill eiHli I-
II11 и ми и 11 и 11 n hi i и i In i hhi
nun i hi и nil tn i hi ini in и im
in hi i in и 11 и iiiiiiiiiii hi in •
II11 II НИ II Hill III III II11 III IM
1111111111111111111 f 11111111 г i
IIIIIII 1IIIIII111! Ill I III II
HIM HIIIHHIIIIIIII
янийиШк и
iiikioi'oivj a
VMlkLDOIklVlll'
BVIkklkVk
НИМЬОЗЛШ ’1Г1Г
HHhAl *9 9
яажЕяиап h v
ПРОБЛЕМЫ НАУКИ
И ТЕХНИЧЕСКОГО ПРОГРЕССА
А. В. ПРИЕЗЖЕВ, В. В. ТУЧИН, Л. П. ШУБОЧКИН
ЛАЗЕРНАЯ
ДИАГНОСТИКА
В БИОЛОГИИ
И МЕДИЦИНЕ
МОСКВА «НАУКА»
ГЛАВНАЯ РЕДАКЦИЯ
ФИЗИКО-МАТЕМАТИЧЕСКОЙ ЛИТЕРАТУРЫ
1 9 8.9
ББК 22.344
П75
УДК 535 + 57(023)
Рецензент
доктор физико-математических наук В. С. Летохов
Приезжев А. В., Тучин В. В., Шубочкин Л. ГЕ
П75 Лазерная диагностика в биологии и медицине.—
М.: Наука. Гл. ред. физ.-мат. лит., 1989.— 240 с.:
ил.— (Пробл. науки и техн, прогресса).
ISBN 5-02-0144049-Х
Изложены физические основы диагностического примене-
ния лазеров в биологии и медицине. Дан анализ наиболее
широко используемых и перспективных методов диагностики.
Главное внимание уделено методам, основанным на анализе
рассеяния света и флуоресценции. Обсуждены также абсорб-
ционные, калориметрические, интерференционные, голографи-
ческие и другие методы диагностики. Представлено описание
лазерной диагностической аппаратуры.
Для физиков и инженеров-разработчиков лазернойг диаг-
ностической аппаратуры, биологов и медиков, использующих
лазерные методы в своей практике, а также для аспирантов
и студентов в качестве введения в специальность.
п 1604060000—101 д4.89
053(02)-89
ББК 22.344
ISBN 5-02-0144049-Х
© Издательство «Наука».
Главная редакция
физико-математической
литературы, 1989
ОГЛАВЛЕНИЕ
Предисловие ..............•..................... . . . 5
Глава 1. Общие сведения о лазерах, областях их примене-
ния в биологии и медицине ................................ 9
1.1. Особенности взаимодействия лазерного из-
лучения с биологическими системами ... 9
1.2. Лазеры и лазерные системы для диагнос-
тики биологических объектов ............... 30
1.3. Техника безопасности при работе с лазерами 46
Г л’а>в а 2. Диагностические методы, использующие упругое
рассеяние света.......................................... 51
2.1. Лазерная нефелометрия................... 51
2.2. Лазерная поляризационная нефелометрия 54
2.3. Индикатор иммунологических реакций . . 75
2.4. Проточные анализаторы микрочастиц ... 76
Глава 3. Лазерная спектроскопия квазиупругого рассея-
ния ..................................................... 82
3.1. Физические основы метода. Основные типы
спектрометров ................................ 82
3.2. Методы обработки сигнала и анализа ре-
зультатов .................................... 89
3.3. Диагностика биологических объектов на
основе измерения коэффициентов диффузии 91
3.4. Диагностика биологических объектов на
основе регистрации скоростей направленного
движения...................................... 97
3.5. Лазерная доплеровская спектроскопия жи-
вых клеток и диагностика внутриклеточной
подвижности.............................. 103
Глава 4. Интерферометрические и голографические ме-
тоды диагностики............................. 114
4.1. Лазерная интерферометрия............ 114
4.2. Голографические методы диагностики . . 123
Глава 5. Абсорбционные и калориметрические методы ди-
агностики .............................................. 126
5.1. Абсорбционно-трансмиссионный анализ с
использованием перестраиваемых лазеров 126
5.2. Абсорбционная спектроскопия быстропро-
текающих процессов....................... 136
1* 3
5.3. Классификация и основы калориметриче-
ских методов диагностики.................... 140
5.4. Особенности экспериментальных исследо-
ваний оптико-акустическим методом . . . 146
5.5. Конструкции спектрофонов и зондов . . 150
5.6. Области применения калориметрических
методов..................................... 159
Глава 6. Лазерная спектроскопия комбинационного рас-
сеяния ........................................... 173
6.1. Физические основы спектроскопии КР и
ее разновидностей........................... 173
6.2. Применение спектроскопии КР в биохими-
ческих исследованиях........................ 180
6.3. КР-микроскопия биологических структур
и живых клеток.............................. 189
6.4. Применение спектроскопии КР в офталь-
мологии .................................... 191
Г л а в а 7. Лазерный флуоресцентный анализ............ 197
7.1. Физические основы метода............... 198
7.2. Лазерная флуоресцентная микроскопия и
микроспектрофлуориметрия.................... 201
7.3. Примеры применения лазерной флуорес-
центной диагностики в медицине .... 207
7.4. Дистанционная флуоресцентная диагнос-
тика растений............................... 216
Заключение................• • • •..................... 221
Список литературы................................ «... 226
ПРЕДИСЛОВИЕ
Всего около тридцати лет отделяет нас от того момента,
когда совместными усилиями радиофизиков и оптиков
были созданы первые оптические квантовые генераторы —
лазеры. Однако за это весьма короткое время прогресс в
развитии лазерной физики и техники оказался настолько
существенным, что на его основе возникли многие направ-
ления науки и техники. Одним из таких новых направ-
лений является лазерная технология, которая охватывает
практически все стороны применения лазеров и использует
все их достоинства: высокую монохроматичность, значи-
тельную энергию и мощность, высокую направленность и
когерентность излучения, возможность получения сверх-
коротких длительностей импульсов и перестройки частоты
во всем диапазоне от ультрафиолетового (УФ) до инфракрас-
ного (ИК) света.
В настоящее время к лазерной технологии относят ши-
рокий круг задач и явлений, которые можно, по-видимому,
разделить на три главных направления: обработка мате-
риалов мощным лазерным излучением, или лазерная
технология материалов (сварка, термообработка, плавление,
резание, сверление, отжиг и пр.), лазерная фотохимиче-
ская технология (разделение изотопов, фотоизомеризация,
лазерный катализ, полимеризация и пр.) и лазерная микро-
и макродиагностика (лазерный спектральный анализ, конт-
роль окружающей среды, лазерные контрольно-измери-
тельные системы: голографические, интерферометрические,
дифракционные, основанные на светорассеянии и пр.).
Лазерная технология имеет дело с самыми разнообраз-
ными объектами различной природы: физическими, хими-
ческими и биологическими. В применении к биологическим
системам она представляет большой практический интерес
для медицины, повышения эффективности сельскохозяйст-
венного производства и защиты окружающей среды. В связи
5
с этим во всем мире ее развитию уделяется все большее
внимание. Для того чтобы показать масштабы исследо-
ваний и приложений, достаточно упомянуть некоторые из
обобщающих работ и специальных выпусков журналов,
посвященных применению лазеров в биологии и медицине
(1—37]. Лазерная биотехнология может быть также раз-
делена на три главных направления: лазерная хирургия
биотканей, клеток и биомолекул, лазерная терапия и фо-
тобиохимия и, наконец, лазерная микро- и макродиагно-
стика. В основе каждого из этих направлений лежат раз-
нообразные эффекты взаимодействия лазерного излучения
с биообъектом на микро- и макроуровнях, определяемые
, свойствами лазерного излучения и структурой биообъекта.
Наиболее полно свойства лазерного излучения реализу-
ются в фотобиохимии и особенно в диагностике.
Охрана здоровья человека, защита окружающей среды,
обеспечение человечества продовольствием — все эти гло-
бальные проблемы нашего и будущего столетия, опреде-
ляют значительный интерес к лазерной биотехнологии.
Во всем мире интенсивно разрабатываются лазеры меди-
цинского назначения, уникальные лазерные биомедицин-
ские комплексы и технологические установки, лазерная
терапевтическая и диагностическая аппаратура. Основой
этих разработок являются достижения в области лазерной
физики и техники, в изучении взаимодействия лазерного
излучения с биосистемами, в создании волоконно-оптиче-
ских средств доставки излучения, измерительной и вычис-
лительной техники. Экспертные оценки показывают, что
одним из самых больших лазерных рынков в мире является
рынок лазерной медицинской аппаратуры. В 1985 г. только
по несоциалистическим странам мировой рынок составил
225 млн. долл. (44 % — офтальмология, 25 % — хирургия,
7 % — эндоскопия, 24 % — остальные применения [38]).
К 1990 г. он должен возрасти до 700 млн. долл., а к 2000 г.
только в США ожидается производство лазерной медицин-
ской аппаратуры на 1 млрд. долл.
Несмотря на то что лазерная медицинская диагно-
стика — одно из самых эффективных направлений приме-
нения лазеров в биомедицине, она пока не получила долж-
ного развития, что видно по приоритетам на мировом рынке
и тем публикациям, которые упоминались выше. Это свя-
зано в основном со сложностью аппаратуры и высокими
требованиями, предъявляемыми к выходным параметрам
лазеров (примерно такие же требования, как в лазерной
спектроскопии и контрольно-измерительной технике), и,
6
конечно, со сложностью самих физических процессов»
лежащих в основе методов лазерной диагностики. Тем не
менее до конца этого столетия прогнозируется предпочти-
тельный рост лабораторно-диагностической лазерной тех-
ники по сравнению с лечебно-хирургической как у нас в
стране, так и во всем мире.
В настоящее время отсутствует обобщающая литера-
тура, в которой было бы представлено все многообразие
методов лазерной диагностики в биологии и медицине, что
затрудняет знакомство с ними и их использование на прак-
тике. В литературе в последнее время появились моно-
графии и обзоры (посвященные одному или нескольким
направлениям диагностики биообъектов [1—4, 7—И, 17,
23, 24, 26, 33, 36, 391), которые могут быть рекомендованы
для углубленного изучения этих методов и их возможно-
стей. Кроме того, многие книги и обзоры по лазерам и
лазерной спектроскопии содержат информацию об иссле-
дованиях биообъектов [40—48]. Представляется важным
в одной книге небольшого объема рассказать о разнооб-
разных методах неразрушающей лазерной диагностики в
биологии и медицине, кратко познакомить с их физиче-
скими основами и возможностями, областями применения
и принципами построения диагностической аппаратуры.
Это, на наш взгляд, должно способствовать лучшему ори-
ентированию при выборе того или иного метода диагно-
стики, адекватного решаемой задаче, должно стимулиро-
вать разработку новых методов диагностики, новые неожи-
данные приложения.
Основные принципы лазерной биомедицинской диагно-
стики изложены в обзоре В. С. Летохова [33]. В настоящей
книге авторы предприняли попытку развить основные
идеи этой работы в части описания неразрушающих методов
диагностики и дополнить ее результатами конкретных
исследований. Авторы постарались осветить самые разно-
образные применения лазеров в биологии и медицине.
При этом за основу изложения взято рассмотрение метода
измерения и анализ его диагностических возможностей.
Предпочтение отдавалось тем методам и примерам, которые
являются общепризнанными или перспективными, с учетом
круга интересов авторов.
Методы диагностики делятся на два больших класса —
макро- и микродиагностики, соответственно книга условно
делится на две части. В гл. 2—4 излагаются методы мак-
родиагностики, основанные на использовании упругого и
квазиупругого рассеяния света, дифракционных и интер-
7
ференционных явлений. В гл. 5—7 рассматриваются прин-
ципы и области применения методов микродиагностики, в
основе которых лежат хорошо развитые методы лазерной
спектроскопии: спектроскопии комбинационного рассея-
ния, абсорбционной и калориметрической спектроскопии,
лазерного флуоресцентного анализа, лазерной масс-спект-
рометрии и пр. В начале книги, в гл. 1 дан обзор принци-
пов работы лазеров, свойств их излучения и технических
характеристик.
Книга предназначена для физиков и инженеров-разра-
ботчиков лазерной диагностической аппаратуры, биологов
и медиков, использующих лазерные методы диагностики
в своей работе, а также аспирантов и студентов в качестве
введения в специальность.
Авторы выражают большую признательность С. А. Ах-
манову за поддержку идеи написания книги и постоянную
помощь и В. С. Летохову за полезные критические заме-
чания.
При написании книги использовались результаты сов-
местных исследований с коллегами по работе П. И. Сапры-
киным, И. Л. Максимовой, Н. И. Коротеевым, Ю. М. Ро-
мановским, М. В. Евдокимовым, В. Г. Колинько, Е. Б. Чер-
няевой, А. Ю. Чикишевым и др., которым авторы приносят
глубокую благодарность. Авторы благодарят всех, кто от-
кликнулся на их просьбу и прислал оттиски своих работ
и комментарии к ним, которые были использованы в книге,
особенно И. М. Арефьева, А. Бертолуззе, Ж. Грейва,
Ю. Озаки, Р. Фарреля, А. Я. Хайруллину.
При написании книги не преследовалась цель дать
исчерпывающую библиографию по всем затрагиваемым
вопросам, поскольку из-за широты обсуждаемой пробле-
матики библиографияЗоказывается огромной. Поэтому там,
где это было возможно, использовались материалы, вошед-
шие в монографии, обзоры, сборники статей и тематические
выпуски журналов, и давались ссылки не на оригинальные,
а на соответствующие обзорные работы.
Глава 1
ОБЩИЕ СВЕДЕНИЯ О ЛАЗЕРАХ,
ОБЛАСТЯХ ИХ ПРИМЕНЕНИЯ В БИОЛОГИИ
И МЕДИЦИНЕ
В данной главе кратко обсуждены общие закономер-
ности взаимодействия света с биологическими системами;
проанализированы свойства лазерного излучения и осо-
бенности его взаимодействия с биологическими объектами;
рассмотрены принципы лазерной терапии, хирургии и
диагностики; приведены наиболее типичные примеры из
указанных областей применения лазеров. Представлены
также сведения о принципах работы и параметрах лазеров
и лазерных систем. В заключение обсуждены вопросы
техники безопасности при работе с лазерами.
1.1. Особенности взаимодействия лазерного излучения
с биологическими системами
Общие принципы и закономерности взаимодействия
света с биообъектами. Применение лазеров в биологии и
медицине основано на использовании широкого круга
явлений, связанных с разнообразными проявлениями взаи-
модействия света с биологическими объектами [П. 1, П. 26,
П. 33]. Лазерное излучение, так же как и обычный свет,
может отражаться, поглощаться, рассеиваться, переизлу-
чаться биологической средой, и каждый из этих процессов
несет информацию о микро- и макроструктуре этой среды,
движении и форме отдельных ее составляющих. Видимый
и УФ свет могут оказывать фотобиохимическое действие.
Яркими примерами этого являются фотосинтез растений
и бактерий, а также механизм зрения [П. 1 — П. 3, 1].
Высокоинтенсивное световое излучение УФ, видимого и
ИК диапазонов длин волн оказывает разрушающее (де-
структивное) действие на биологические объекты. Необ-
Я
ходимые интенсивности можно создать и не только с по-
мощью лазеров. Существуют, например, фотокоагуляторы
тканей глаза на основе мощных ксеноновых ламп [П. 22,
П. 321.
Таким образом, процессы, характеризующие виды взаи-
модействий лазерного излучения с биообъектами, можно
разделить на три группы. К первой относятся все невоз-
мущающие взаимодействия (по крайней мере, в пределах
погрешностей измерений не оказывающие заметного дей-
ствия на биообъект), ко второй — процессы, в которых
проявляется фотохимическое действие, и к третьей —
процессы, приводящие к фоторазрушению. На схеме 1
представлена классификация основных принципов приме-
нения лазеров в биологии и медицине, учитывающая ука-
занные группы процессов.
Поскольку мы имеем дело с живыми объектами, то
помимо физико-химических проявлений действия лазер-
ного излучения необходимо учитывать его влияние и на
функционирование живой материи [П. 34, 1]. Это влияние
определяется степенью гомеостаза живого объекта. Степень
гомеостаза характеризует состояния и процессы, обеспе-
чивающие устойчивость организма к внешним возмуще-
ниям, она является функцией эволюционного развития и
оказывается наинизшей у биологических молекул и наи-
высшей у позвоночных животных. Свет малой интенсив-
ности не запускает адаптационные механизмы биосистемы.
По мере роста интенсивности сначала затрагивается гомео-
стаз живой системы на локальном уровне, затем включа-
ются общие адаптационные и регуляционные механизмы
системы, полностью ее восстанавливающие, далее они уже
не справляются с полным восстановлением и частично
происходят необратимые процессы, которые нарастают и
приводят к разрушениям в системе. Однако объект можно
еще считать «живым». При высоких интенсивностях раз-
рушения оказываются настолько значительными, что объ-
ект уже не может считаться «живым».
С точки зрения применения физических методов иссле-
дования наибольший интерес представляют области очень
малых и очень больших интенсивностей. В первой из них
возможно применение ряда наиболее чувствительных фи-
зических методов исследования, не требующих сильных
световых потоков и, следовательно, не вносящих искаже-
ний в результаты измерений за счет гомеостаза живой
материи даже на локальном уровне. Вторая область ин-
тересна тем, что результаты измерений также оказываются
10
1. Классификация основных принципов применения лазеров в биологии и медицине
неискаженными за счет регуляторных механизмов биоси-
стемы, поскольку она уже «неживая». Однако исследова-
тель в этом случае имеет дело лишь с органической мате-
рией, состав и свойства которой соответствуют моменту
прекращения жизнедеятельности.
Для взаимодействия света с биологическими объектами
оказывается важной и длительность облучения. В этом
также может проявить себя гомеостазная природа живой
материи. В зависимости от длины волны и интенсивности
света пороговая длительность облучения, при которой
начинают происходить морфологические изменения, может
быть весьма различной для одного и того же объекта. При
этом в зависимости от периодичности световых импульсов
возможны резонансные явления, поскольку известно, что
период колебаний фотоотклика биологических систем из-
меняется в пределах от 10-8 до 108 с (П. 34, 1].
Поглощение света является одной из характеристик эф-
фективности взаимодействия света с исследуемым биологи-
ческим объектом. Спектры поглощения биообъектов опре-
деляются типом доминирующих поглощающих центров, так
называемых хромофоров, и содержащейся в них водой.
Рис. 1.1. Зависимость доли световой энергии ЬЕ/Е, поглощенной
кровенаполненной биотканью толщиной 1 мм, от длины волны [2]
У белков хромофорами являются различные остатки амино-
кислот, которые поглощают в УФ области (Х=200—300 нм),
нуклеиновые кислоты также поглощают в этой области.
Поглощение видимого излучения обусловлено такими
биомолекулами, как гемоглобин, хлорофилл, флавины,
каротиноиды, фикобилины и фитохром [П. 7].
В качестве примера на рис. 1.1 показан спектр погло-
щения типичной кровенаполненной биологической ткани
толщиной 1 мм [2]. Свет с длинами волн 0,6—1,5 мкм от-
носительно слабо поглощается и довольно глубоко прони-
кает в биоткань. Например, излучение с %—1,06 мкм про-
никает на глубину в 1 см. Однако в спектральном диапазоне
12
2—12 мкм из-за поглощения воды, содержащейся в био-
ткани, свет слабо проникает в глубь ткани. В области
длин волн 4—6 мкм глубина проникновения порядка 100—
150 мкм, а в области 7—12 мкм сравнима с длиной волны
света. На Х=0,45—0,50 мкм поглощение определяется
Таблица 1.1
Коэффициенты поглощения а некоторых биотканей на отдельных
длинах волн к [П. 26, П. 32, 3]
Биоткань Л, нм а, см“Я Биоткань к, нм а, см"1
Кровь, насы- щенная кисло- родом Кровь, не насы- щенная кисло- родом Белый эпидер- мис Подкожный жир Печень крысы Почка крысы Пигментный эпителий сет- чатки Зрительный пигмент Сосудистая обо- лочка глаза 620 805 620 805 ( 400 < 500 (600 ( 400 500 1 600 1064 1064 ( 400 | 500 600 1 800 V юоо 514 ( 400 500 <! 600 800 V юоо 6,2 6,2 18,2 6,2 2,8 1,2 0,3 0,7 0,4 0,2 15,2 15,5 2300 890 460 140 90 1587 92 130 92 34 16 Эпителий Ткань арте- риальной стенки (в нор- ме) Ткань арте- риальной стенки (пато- логия) Атеросклеро- тическая бляшка в из- вестковом со- стоянии f 633 t 1060 f 193 248 J 308 Л 351 488 ( 532 (308 351 488 (532 249 308 351 488 532 2940 10 600 821 120 10* 103 180±16 145±8,0 32±4,4 30±l ,8 108±17 116±11 25±3,7 37±4,5 650 137 ±33 118±17 42±7,9 34±3,7 5000 500
гемоглобином крови, а в УФ диапазоне многие биоткани
сильно поглощают за счет содержащихся в них белков.
Коэффициенты поглощения некоторых биотканей на от-
дельных длинах волн представлены в табл. 1.1, они лежат в
пределах 10“1—-104 см-1.
Следует отметить, что ткани передней части глаза яв-
ляются в видимой области чрезвычайно прозрачными и
поглощение в них очень мало [П. 32, П. 35, 4]. В то же
13
время спектр пропускания в области коротких длин волн
определяется светорассеянием. Рассеяние света биообъек-
тами — это одно из самых характерных для них явлений.
Оно связано со структурой биосистем, которые, как пра-
вило, состоят из большого числа случайно распределенных
в объеме рассеивающих центров (исключение составляют
лишь некоторые типы тканей, например прозрачные ткани
глаза, в которых эта структура упорядочена (гл. 2)).
Для многих типов биотканей в УФ и ИК диапазонах
длин волн преобладает поглощение, а рассеяние оказы-
вается существенным в видимой и ближней ИК областях:
для длин волн 0,45—0,59 мкм поглощение и рассеяние дают
примерно равные вклады в коэффициент пропускания
ткани, а для длин волн 0,59—1,5 мкм рассеяние превали-
рует над поглощением [5].
Важной оптической характеристикой биообъекта явля-
ется также коэффициент отражения. Например, для боль-
шинства внутренних органов животных коэффициент от-
ражения на отдельных длинах волн в видимой и ближней
ИК областях составляет 10—30 %, кожный покров чело-
века отражает в видимой области 10—60 % световой энер-
гии, а коэффициент отражения глазного дна человека
изменяется от 2 до 20 % при изменении длины волны от
0,4 до 1,0 мкм [П. 26, П. 35, 6]. Отражение обусловлено
как скачком показателя преломления на границе биообъ-
ект — воздух (френелевское отражение, обычно 4—5 %),
так и обратным рассеянием от глубинных слоев ткани.
При этом на глубине 4—5 мм, равной примерно трем оп-
тическим толщинам ткани, коллимированный лазерный
пучок дает сферически симметричное, близкое к изотроп-
ному излучение [5].
Следует отметить, что характер отражения, поглощения,
рассеяния и флуоресценции биообъекта можно эффективно
изменять разнообразными искусственными приемами. На-
пример, окрашиванием можно изменять спектры отраже-
ния и поглощения. Такие биообъекты называются сенсиби-
лизированными, т. е. их чувствительность к свету изме-
нена. Сенсибилизацию биологического материала широко
используют при изучении механизмов взаимодействия
света с отдельными компонентами этого материала, а также
в практической биомедицине для диагностики и селектив-
ной фотодеструкции отдельных компонентов биообъекта.
Для мягких кровенаполненных биологических тканей
можно существенно, до 40 раз, увеличить их пропускание
за счет несильного сдавливания [7]. «Просветление» живой
14
ткани связано с повышением ее оптической однородности
за счет уплотнения рассеивающих центров (коллагеновых
волокон мышечной ткани) и вытеснения крови из области
надавливания, что способствует повышению показателя
преломления базового вещества, который становится срав-
ним с показателем преломления мышечной ткани [4]. Вы-
равнивание показателей преломления светорассеивающих
центров и базового вещества можно осуществить и за счет
введения в ткань соответствующих препаратов. Такое
«просветление» склеры глаза описано в [4].
Свойства излучения и особенности его взаимодействия
с биологическими системами. Традиционная фотобиология
с использованием обычных (тепловых) источников света
довольно успешно развивалась в течение многих лет (есть
свидетельства о том, что еще в Древнем Египте и Индии
тысячи лет назад применялась фототерапия с помощью
солнечного света и лекарственных препаратов, изготовлен-
ных из фруктов и растений) с выходом в практическую
фотомедицину по трем главным направлениям: диагно-
стика, терапия и хирургия [П. 19, П. 22, П. 34, 81. Многое
было сделано для понимания процессов фотосинтеза ра-
стений и бактерий, выяснения природы зрения, фотопе-
риодических явлений и пр. с помощью этих источников
света 1П. 1, П. 2, П. 12, 1, 9]. Появление принципиально
нового инструмента — лазера подняло все эти исследо-
вания и приложения на новый, более высокий уровень,
стимулировало постановку и успешное решение таких
проблем, которые раньше или вовсе не ставились, или
решались косвенным путем.
Прежде чем обсуждать особенности взаимодействия
лазерного излучения с биологическими объектами и те
новые возможности, которые оно дает в фотобиологии и
фотомедицине, необходимо рассмотреть свойства лазерного
излучения и их принципиальные отличия от свойств из-
лучения тепловых некогерентных источников света (ламп
накаливания, дуговых ламп, Солнца и пр.).
Напомним, что лазер представляет собой генератор оп-
тических колебаний, использующий энергию индуциро-
ванно излучающих атомов или молекул в средах с инверс-
ной заселенностью уровней энергии, которые обладают
свойством усиливать свет определенных длин волн [10—
13]. В качестве обратной связи в лазерах используют
зеркала, которые образуют оптический резонатор и обес-
печивают достаточное число проходов светового пучка
через усиливающую среду, чтобы все потери света в системе
15
были скомпенсированы за счет усиления активной среды.
На рис. 1.2 схематически показано устройство лазера,
включающее отражающие зеркала и активный элемент, в
котором за счет различных способов накачки создается
Рис. 1.2. Схема устройства лазера (справа показано распределение
интенсивности > лазерном пучке)
активная среда. При указанных условиях в лазере возни-
кает генерация, спектр которой показан на рис. 1.3, т. е.
лазер излучает несколько волн, отличающихся частотой
и интенсивностью, это так называемые продольные моды
лазера.
Обычный (тепловой) источник света отличается от лазера
тем, что основной вклад в излучение дают спонтанные
Рис. 1.3. Спектр продольных мод лазера
переходы, в системе отсутствуют инверсия и оптическая
обратная связь. Все это приводит к существенным разли-
чиям в свойствах лазерных и нелазерных источников
света. Лазерные источники обладают высокой степенью
монохроматичности (временной когерентности), простран-
ственной когерентности, направленности, поляризован-
ное™, интенсивности и яркости, сверхкороткой длитель-
ностью импульсов и перестраиваемостью длины волны из-
лучения.
Монохроматичность или высокая спектральная плот-
ность мощности (интенсивности) излучения, или знача-
16
тельная временная когерентность лазерного излучения
обеспечивают, во-первых, проведение спектрального ана-
лиза с разрешением, на много порядков превышающим
разрешение традиционных спектрометров; во-вторых, вы-
сокую степень селективности возбуждения определенного
сорта молекул в их смеси, что очень важно именно в био-
логии; в-третьих, позволяют^ реализовывать голографи-
ческие и интерферометрические методы диагностики био-
объектов.
Степень монохроматичности одномодового газового ла-
зера определяется шириной линии генерации Sv этой моды,
которая обусловлена квантовыми флуктуациями, вибра-
циями, акустическими шумами, плазменными колебаниями
в активной среде и т. д. и составляет величину от десятков
герц до десятков мегагерц [14].
Высокая монохроматичность определяет значительную
спектральную плотность излучения. Например, для лазера
с выходной мощностью Р=1 Вт, 8v=l МГц, радиусом
пучка w—2 мм и Х=500 нм спектральная плотность мощ-
ности, падающая на единицу поверхности, равна 2,6 X
X10’ Вт/(нм -см2). Для сравнения, аналогичная величина
для солнечного излучения равна 1,3«10“* Вт/(нм-см2).
Для импульсных лазеров ширина линии ограничена
длительностью импульса ти, 6v«1/th и может составлять
довольно значительные величины для лазеров с короткой
длительностью импульсов (Sv«l ГГц для ти=10-в с).
В зависимости от решаемых задач и конкретных ус-
ловий измерений для лазеров, работающих на многих мо-
дах, можно обеспечить различную степень монохроматич-
ности. С одной стороны, отдельная мода практически со-
храняет свою высокую монохроматичность (узкую ширину
линии Sv), а с другой — мод становится много и их спектр
занимает уже ширину Av«Afc/2nL, где N — число про-
дольных мод, c!2nL — частотное расстояние между ними,
определяемое оптической длиной резонатора nL, с — ско-
рость света, п — показатель преломления активной среды
(рис. 1.3).
Изменения в степени монохроматичности находят от-
ражение и во временной когерентности такого источника,
т. е. его способности образовывать четкую интерференци-
онную картину при соответствующей временной задержке
складываемых световых пучков. Удобно временную ^ко-
герентность характеризовать длиной когерентности
/к = стк » c/Sv,' тк « l/6v.
2 А. В. Приезжев 17
Для одномодовых лазеров длина когерентности может
быть чрезвычайно большой — 3 408—3*10? см, что пре-
восходит типичные потребности биологических и медицин-
ских исследований.
Для импульсных лазеров длина когерентности опреде-
ляется длительностью импульса: 1к^иста и для ти=10“8 с
/к«30 см. У многомодовых лазеров с непрерывной накач-
кой степень когерентности в зависимости от расстояния
носит осциллирующий характер: сначала она падает от
единицы до нуля на длине /K«c/Av (&vmNcl2nL), а затем
снова восстанавливается на длине, равной двум, четырем
и т. д. длинам резонатора. Полная потеря когерентности
произойдет лишь на длине c/Sv. Например, для Не — Ne
лазера (Х=632,8нм) Av«2 ГГц, /К«15 см.
Тепловые источники, например натриевая лампа, имеют
время когерентности тк«10-10 с, т. е. /к«3 см. Лазеры с
субнаносекундной длительностью импульсов или с шири-
ной полосы генерации в несколько гигагерц имеют такую
же малую длину когерентности.
Пространственная когерентность излучения лазеров
дает возможность получать световые пучки с высокой
степенью их направленности (коллимированности) и по-
зволяет фокусировать их на объекте до чрезвычайно малых
размеров. Все это необходимо для дистанционного анализа
изучаемых объектов, обеспечения локальности исследова-
ний и эффективной транспортировки излучения по воло-
конным световодам, что тепловые источники в принципе
обеспечить не могут.
Лазеры, как правило, излучают пространственно-коге-
рентные гауссовские пучки (TEM00q моды), интенсивность
которых
Z(г, z) =/0 (z) ехр {—2 [г/ку (z)]2}.
Здесь /0(г) — интенсивность в центре пучка (r=0); w(z) —
радиус пучка лазера, на котором /(г)—/0(г)ехр(—2). Харак-
терный вид распределения показан на рис. 1.2 справа.
Угол расходимости гауссовского пучка равен (13]
е = Х/лю(0), (1.1)
где а/(0) — радиус пучка в наиболее узкой его части, z=0.
Параметры ш(0) и 0 задаются в основном параметрами
резонатора. При достаточном удалении от лазера a>(z) =
=Xz/no»(O)=z0. Расширение пучка с помощью соответству-
ющей оптической системы позволяет уменьшить расходи-
мость: 0i=01tti1/te>2.
18
Лазерные пучки в режиме поперечной моды наинизшего
порядка (TEMooq) характеризуются чрезвычайно высокой
пространственной когерентностью, близкой к предельной,
обусловленной квантовыми флуктуациями. И только при-
месь поперечных мод высших порядков может существенно
ее уменьшить [14].
Для большинства лазеров расходимость составляет
несколько тысячных радиана (мрад). Такой пучок можно
сфокусировать до очень малых размеров порядка длины
волны: d&FQ (F — фокусное расстояние линзы) с глубиной
резкости A=±d2/X также порядка X. Эти свойства лежат
в основе лазерной микроскопии.
Отметим, что в ряде биологических приложений сфоку-
сированный «рабочий пучок» может оказаться существенно
меньше размеров длины волны и составлять около 0,01 мкм
[П. 29], поскольку действие светового излучения в зави-
симости от интенсивности носит пороговый характер, а
интенсивность в центре пучка максимальная. Таким спо-
собом можно, например, проводить тонкую внутриклеточ-
ную «хирургию».
Роль расходимости излучения можно также представить
себе, если сравнить интенсивности излучения, полученные
от теплового и лазерного источников одинаковой мощности
Р, расположенных на расстоянии z от биообъекта [П. 40]:
/т = Р/4лг2, 1Я « Р/лау2 = Р/лг202.
Следовательно, /л//т«4/02, а поскольку расходимость
0«1О"2, то /л«10в7т.
Лазеры характеризуются высокой степенью поляризо-
ванности излучения. В этом проявляются когерентные
свойства их излучения. Однако вид поляризации (линей-
ная, круговая, эллиптическая) у разных лазеров может
быть разным. В большинстве случаев это связано со свой-
ствами оптического резонатора. Резонаторы с брюстеров-
скими окошками разрядной трубки или внутренними приз-
мами имеют устойчивую линейную поляризацию. Для про-
мышленных лазеров с линейной поляризацией степень
поляризованное™, т. е. отношение интенсивностей света
при взаимно ортогональных положениях поляризацион-
ного анализатора, /ц : /£=500 : 1. При этом для лазеров
с малым усилением квантовые и технические флуктуации
практически не приводят к деполяризации излучения [14].
Другой класс часто используемых резонаторов лазеров —
это изотропные резонаторы. Например, промышленность
выпускает лазеры с внутренними зеркалами. Высокое ка-
2*
19
чество зеркал таких лазеров обеспечивает идеальную кру-
говую поляризацию излучения, /ц : /±=1 : 1. Однако
степень поляризации (азимут и эллиптичность) у этих
лазеров оказывается более чувствительной к возмущениям,
чем в случае сильно анизотропных резонаторов [14].
Передача лазерного излучения по волоконным светово-
дам круглого сечения приводит к деполяризации излучения
за счет возбуждения многих волноводных мод. В зависимо-
сти от типа световода длина, на которой происходит полная
деполяризация излучения, изменяется от нескольких де-
сятков сантиметров до нескольких метров. Сравнительно
широкие медицинские световоды с диаметром сердцевины
400—1000 мкм имеют малую длину деполяризации (не-
сколько десятков сантиметров). Разработаны специальные
одномодовые анизотропные световоды (например, с эллип-
тическим сечением сердцевины), которые сохраняют со-
стояние поляризации на расстояниях в несколько сотен
метров, однако поперечные размеры сердцевины таких
световодов чрезвычайно малы, 5—7 мкм, поэтому суще-
ствует проблема ввода излучения.
Чрезвычайно высокая интенсивность лазерного излу-
чения позволяет сконцентрировать в малом объеме значи-
тельную световую энергию, тем самым вызвать многофотон-
ные и другие нелинейные процессы в биологической среде,
локальный тепловой нагрев, быстрое испарение, гидроди-
намический взрыв и т. д.
Выше уже приводился ряд примеров, иллюстрирующих
высокую интенсивность лазерных пучков. Однако с точки
зрения приложений не интенсивность, а яркость является
наиболее важным параметром любого источника, в том
числе’и лазерного. Яркость В определяется как мощность,
приходящаяся на единицу площади и единицу телесного
угла, или интенсивность в единице телесного угла. Для
пучка кругового сечения радиусом гс/(О), расходимостью 0
и полной мощностью Р яркость
В = Р/л2ау2(О)02,
или с учетом (1.1) для лазерных пучков В=Р/Х2 Вт/(см2 >ср),
где ср — стерадиан — единица телесного угла.
Интенсивность, которую можно получить в фокусе
линзы, оказывается тем больше, чем больше яркость пучка.
Оптическая обработка пучка с помощью системы линз и
других оптических элементов, как правило, не может уве-
личить яркость, поскольку сжатие пучка всегда сопро-
вождается увеличением его расходимости.
20
Спектральная яркость B'v—B/\v или Bb=B/tik, где Av
или Д1 — ширина линии источника в герцах или нано-
метрах, Av=(c/12)A1. Интересно сравнить яркость часто
используемой в биологических исследованиях дуговой
лампы киловаттной мощности с яркостью аргонового ла-
зера мощностью 10 Вт, 1=488,0 нм. Для дуговой лампы
5=103 Вт/(см2-ср), Bv=10-10 Вт/(см2*ср*Гц); для лазера
В=4-10’Вт/(см?-ср), Bv=l Вт/(см2-ср-Гц) [П. 40]. Можно
сравнить и другой хорошо известный в фотобиологии ис-
точник— ртутную лампу высокого давления (Р=100 Вт,
В«95 Вт/(см2-ср), 1=546 нм, Д1=10 нм) с одним из наи-
менее ярких лазерных источников — Не — Ne лазером
(Р=1 мВт, 1=632,8 нм, Av=0,5 кГц, Д1«6-10-10 нм)
[13]. В первом случае спектральная яркость равна В^
«9,5 Вт/(см2-ср-нм), а во втором — В=2,5> 105 Вт/(см2*ср),
Вд.«4,2-1014 Вт/(см2-ср-нм).
Одним из замечательных свойств лазеров и лазерного
излучения является возможность получения импульсов
пикосекундной и субпикосекундной длительности. В видимой
области удалось вплотную подойти к теоретическому пре-
делу по длительности и сформировать импульс длительно-
стью 8 фемтосекунд, что составляет всего четыре световых
колебания [15]. Все это дает возможность изучать очень
быстрые первичные фотопроцессы в биологии прямыми,
а*не косвенными методами [П. 1—П. 3], а также много-
ступенчато возбуждать высокие энергетические состояния
молекул за'2'время значительно меньшее, чем время ре-
лаксации любого промежуточного состояния [П. 33,
П. 42].
Для изучения большинства быстрых фотопроцессов в
биологии достаточной оказывается длительность импульсов
в несколько пикосекунд, однако для изучения ультрабыст-
рых стадий преобразования энергии некоторыми биомоле-
кулами необходимы и субпикосекундные источники (по-
рядка 100 фс). Однако следует помнить, что чем короче
импульс, тем шире его спектр, Avth«1 или ДХти«12/с,
т. е. при ти=100 фс и 1=500 нм Д1«8 нм, а в случае при-
ближения к теоретическому пределу ти=2 фс Д1«400 нм,
что перекрывает всю видимую область, т. е. лазер излу-
чает белый свет.
Свойство перестраиваемости длины волны лазерного
излучения в совокупности с его чрезвычайной монохро-
матичностью позволяет использовать лазеры в качестве
спектрометров ультравысокого разрешения. В принципе
любой лазер допускает перестройку частоты (длины вол-
21
ны). Правда, для одних лазеров она может быть только
дискретной с очень узким диапазоном вблизи дискретных
длин волн, а для других непрерывной в довольно широком
диапазоне длин волн. Наличие перестраиваемых лазеров
во всей области от УФ до ИК позволяет селективно воз-
буждать практически любые состояния биомолекул и от-
дельных ее фрагментов.
Обсуждая свойства лазерного излучения, нельзя не
обратить внимание на одно важное для применения свой-
ство — способность формировать спекл-картину при от-
ражении от шероховатой поверхности. Рассеянный этой
поверхностью свет состоит из хаотического скопления тем-
ных и светлых пятен (спеклов). Причина этого явления
состоит в высокой когерентности лазерного излучения,
и оно обусловлено сложной интерференцией вторичных
волн от небольших рассеивающих центров, расположенных
на поверхности объекта. Поскольку биообъекты в боль-
шинстве своем шероховаты, то они всегда должны форми-
ровать спекл-картину и в этом смысле вносить некоторые
искажения в результаты исследований. С другой стороны,
спекл-поле несет информацию о свойствах поверхности
биообъекта, что можно использовать, например, в диагно-
стических целях.
Если спекл-картина наблюдается на достаточно удален-
ном от объекта экране, то средний диаметр зерна (спекла)
определяется соотношением dt&kllw, где I — расстояние от
объекта до экрана, w — радиус лазерного пучка на объ-
екте [131.
Принципы лазерной диагностики, наиболее типичные
примеры. Настоящая книга целиком посвящена лазерной
диагностике в биологии и медицине. В последующих гла-
вах будут разобраны наиболее интересные методы нераз-
рушающей диагностики, оценены их возможности и пер-
спективы. Здесь, в вводной главе, определены лишь глав-
ные принципы и приведены некоторые из наиболее ярких
примеров [П. 33]. Как уже отмечалось, методы лазерной
диагностики делятся на микродиагностические (на уровне
атомов и молекул) и макродиагностические (на уровне
клеток и органов). Микродиагностика использует все сред-
ства линейной и нелинейной лазерной спектроскопии, а
макродиагностика — методы упругого и квазиупругого
рассеяния, интерферометрию и голографию.
Традиционно, спектральный анализ широко применя-
ется в биологии для анализа, например, следовых концент-
раций веществ при изучении метаболизма живых организ-
22
мов и в токсикологии. Однако нелазерные источники света
позволяют в лучшем случае обеспечить детектирование
сигнала от 1010 атомов или молекул одного сорта. С ис-
пользованием лазеров удается реализовать сверхчувст-
вительные методы, позволяющие детектировать даже от-
дельные атомы или молекулы, проводить атомный анализ
непосредственно на реальных объектах, не прибегая к их
предварительной подготовке. Одним из примеров является
метод прямой резонансной фотоионизации, успешно при-
мененной к определению следовых концентраций алюминия
в крови человека [П. 42].
Сочетание резонансной фотоионизации молекул с тради-
ционной масс-спектрометрией позволяет существенно по-
высить чувствительность и получать ее для случая опре-
деления содержания триптофана в воде на уровне 10“14 г.
Лазерная спектроскопия оказывается особенно эффек-
тивной при исследовании загрязнений окружающей среды
(флоры и фауны, пищевых продуктов и пр.) токсическими
и патогенными веществами и анализе путей их проникно-
вения в человеческий организм. Даже сравнительно про-
стой флуоресцентный анализ в комбинации с хроматогра-
фией при использовании лазеров оказывается очень чув-
ствительным. Лазерно-флуоресцентная спектроскопия с при-
менением сенсибилизаторов патологических тканей, на-
пример производных гематопорфирина, оказывается очень
эффективной при ранней диагностике раковых и других
заболеваний [П. 36].
Оптико-акустическая спектроскопия имеет свои особые
преимущества при исследовании биологических объектов,
главное из которых состоит в малом влиянии рассеяния на
результаты измерения спектров поглощения, что очень
важно для неоднородных по структуре биологических сред
(П. 23, П. 41]. Лазерное возбуждение обеспечивает и здесь
высокое спектральное разрешение, локальность и дистан-
ционность анализа, возможность использования волокон-
ной техники.
Жесткая фокусировка мощных лазерных пучков ис-
пользуется в целом ряде методик, реализующих микро-
спектральный анализ биологических объектов. Лазерный
отбор'/микропробы с поверхности биообъекта путем испаре-
ния микрообъема вещества (1 мкм’) с последующим масс-
спектральным анализом этого пара лежит в основе лазерной
микроаналитической масс-спектроскопии (ЛАММА-метод)
и промышленных лазерных масс-анализаторов [П. 42,
П. 47].
23
Существуют и неразрушающие методы микроспект-
рального анализа биообъектов, например лазерная микро-
флуорометрия отдельных живых клеток или органелл
[П. 7]. Пространственное и временное разрешение метода
составляет, соответственно, 0,3 мкм и 0,2 нс. Он может
быть полезен при флуоресцентном картировании генов.
Для прямого наблюдения первичной структуры ДНК
может оказаться наиболее подходящим комбинированный
метод, сочетающий селективную лазерную ионизацию мо-
лекул хромофоров с ионно-полевой микроскопией. Изотопи-
ческо-селективное детектирование отдельных атомов можех
быть использовано для анализа путей метаболизма живых
организмов in vivo *) в том числе на клеточном уровне.
Лазерные импульсы пикосекундной и субпикосекунд-
пой длительности нашли самое широкое применение для
изучения первичных процессов фотосинтеза, зрения и
биохимических реакций с участием гемоглобина, ДНК и
других биологически важных молекул [П. 1 — П. 3]. Ульт-
рабыстрые процессы являются характерными для биоло-
гии, причем для одного и того же объекта времена фото-
физических и фотохимических процессов могут занимать
очень широкий диапазон, например, для гемоглобина 10-6—
10-16 с [П. 24]. Исследования этих процессов требуют
применения импульсных лазеров и новых методик спект-
роскопии, включая спектроскопию комбинационного рас-
сеяния (КР) в наносекундном и пикосекундном диапазонах,
быстродействующие абсорбционные методы во временном
масштабе от наносекунд до фемтосекунд и пикосекундную
флуоресцентную спектроскопию [П. 1].
Получило развитие и такое направление в диагностике,
как дистанционное лазерное зондирование биологических
объектов (фитопланктона] и нефтяных загрязнений водных
сред, биологически активных примесей в атмосфере, назем-
ной растительности и пр.), основанное на КР и флуорес-
центной спектроскопии [П. 16, П. 17].
В основе биомедицинской макродиагностики лежит ис-
пользование высокой монохроматичности и когерентности
лазерного излучения, которая позволяет измерять положе-
ние, скорость, малые перемещения и форму различных
компонентов биологических объектов. Заметим, что боль-
шинство из перечисленных ниже примеров в принципе не
может быть реализовано с помощью тепловых источни-
ков света.
*) На живом (лат.).
24
Одним из первых эффективных применений лазеров в
биомедицине была пролетная цитометрия, когда лазер
был применен для ускорения анализов и сепарации отдель-
ных клеток млекопитающих за счет точных измерений их
оптических свойств — характеристик вызванной лазером
флуоресценции [16]. Цитофлуориметры первого поколе-
ния на основе Аг лазеров с £=488 нм выпускаются про-
мышленностью. Готовятся к выпуску цитофлуориметры
второго поколения на основе более коротковолнового
Не — Cd лазера с %=441,6 нм.
Другое не менее эффективное применение лазеров — это
лазерная анемометрия, которая заключается в измерении
малых скоростей движения биологических жидкостей (на-
пример, скорости кровотока в сосудах, подвижности бак-
терий, сперматозоидов и пр.). Этот метод основан на из-
мерении доплеровского сдвига частоты излучения лазера,
который возникает при обратном рассеянии света от дви-
жущихся частиц микронного размера.
Голография и интерферометрия являются мощными
средствами диагностики вообще и биомедицинской в част-
ности. Голографические методы позволяют получать трех-
мерные изображения биообъектов, контуры этих объектов
могут быть картированы, а их деформации проанализи-
рованы в реальном масштабе времени. Эти новые возмож-
ности могут оказать влияние на развитие многих разделов
медицины: ортопедию, радиологию, офтальмологию, уро-
логию и отологию. Большие потенциальные возможности
в этом смысле имеет классическая интерферометрия при
использовании лазерных источников (например, при со-
здании ретинометров — устройств для определения рети-
нальной остроты зрения), а также спекл-интерферометрия
(например, для определения структуры и шероховатости
некоторых биотканей).
Упругое рассеяние при использовании лазерных источ-
ников света в сочетании с полным анализом поляризаци-
онных характеристик индикатрисы рассеяния позволяет
эффективно изучать слабопоглощающие анизотропные двух-
компонентные биоткани, например ткани глаза [17]. Уп-
ругое светорассеяние оказывается также эффективным в
ряде задач иммунологии, вирусологии и гематологии.
Применение лазеров в этих исследованиях позволяет су-
щественно упростить измерения и повысить их надежность.
Обсуждая проблемы лазерной диагностики, нельзя не
затронуть две другие области биомедицинских применений
лазеров: лазерную терапию и хирургию, хотя бы потому,
25
что, проводя диагностику, необходимо знать, какие послед-
ствия могут иметь место, если уровни мощности и дозы
лазерной засветки соответствуют терапевтическим или хи-
рургическим. Как и раньше, при изложении будем в ос-
новном следовать работе [П. 33].
Физико-химические основы лазерной терапии, типичные
примеры. В основе лазерной терапии лежит управление био-
химическими процессами с помощью света, который воз-
буждает биомолекулы. Возбужденная молекула либо сама
принимает участие в химической реакции, либо передает
свое возбуждение другой молекуле, участвующей в хими-
ческих превращениях. Различают однофотонное возбуж-
дение (малые интенсивности света — линейная фотобиоло-
гия) и многофотонное (большие интенсивности — нелиней-
ная фотобиология), когда молекула может поглотить более
чем один фотон.
Однофотонные. фотобиохимические процессы, лежащие в
основе фототерапии или фотохимиотерапии желтухи ново-
рожденных (избыточной билирубинемии), различных за-
болеваний кожи [8], а также рака [П. 36], хорошо известны
в фотобиологии. Фотохимиотерапия рака при использо-
вании производных гематопорфирина (ПГП) является клас-
сическим примером. При введении в организм молекулы
ПГП имеют тенденцию накапливаться в клетках патоло-
гических тканей. Один из возможных механизмов, лежащих
в основе терапии, заключается в следующем. Молекулы
ПГП хорошо возбуждаются видимым светом и передают
это возбуждение через триплетные состояния молекулам
кислорода, присутствующим в тканях. В свою очередь
молекулы кислорода возбуждаются в синглетное состояние,
которое является химически активным и разрушает клетки.
Этот процесс называют фотодинамическим эффектом.
Рассматриваемые процессы возможны при сравнительно
малых интенсивностях света (около 1 Вт/см2), которые
можно получить от нелазерных источников света. Тем не
менее применение лазеров дало новый весьма существенный
толчок в развитии фотодинамической терапии, поскольку
благодаря высокой спектральной интенсивности, прост-
ранственной когерентности и малой расходимости их излу-
чения оказалось возможным обеспечить значительную
селективность воздействия и эффективную доставку из-
лучения к труднодоступным тканям с помощью волокон-
ных световодов.
Терапия с помощью красного света (Л=632,8 нм) Не — Ne
лазера нашла широкое применение для лечения трофиче-
26
ских и долго не заживающих ран и язв (например, [П. 25]).
Часто терапевтический эффект красного лазерного света
связывают с его когерентностью или высокой поляризо-
ванностыо. Однако эти аргументы представляются несо-
стоятельными только по той причине, что при использу-
емых интенсивностях скорость возбуждения молекул
оказывается в 1010раз более медленной, чем скорость релак-
сации возбужденных молекул (скорость потери когерент-
ности) в конденсированной среде при нормальной темпе-
ратуре. Действительно, терапевтический эффект наблюда-
ется и с нелазерными источниками света при облучении на
ряде длин волн в диапазоне 400—850 нм, однако лазеры в
соответствии с перечисленными выше причинами оказыва-
ются более удобным инструментом. Местный лечебный эф-
фект низкоинтенсивного излучения на длинах волн Не — Ne
(1=632,8 нм), Не — Cd (1=441,6 нм) и GaAs (1=830 нм)
лазеров, по-видимому, связан с регуляторным действием
света этих длин волн на пролиферативную активность
клетки (скорость прохождения клеточного цикла), когда
свет выступает в роли триггерного регулятора клеточного
метаболизма [18, 19]. Фотоакцепторами низкоинтенсивного
монохроматического лазерного излучения в клетке явля-
ются эндогенные сенсибилизаторы.
Перечислим другие терапевтические применения лазе-
ров малой мощности [20]. В дерматологии — это лечение
нейродермита, экземы, красного плоского и опоясывающего
лишая, рецидивирующего герпеса, липоидного некробиоза,
келоидных рубцов, локального зуда кожи и др. Лазерная
терапия применяется в ортопедии, в том числе при замед-
ленной консолидации и несрастающихся переломах костей,
а также при лечении ревматоидного артрита. В невропа-
тологии ее используют при лечении многих заболеваний
периферической и центральной нервной системы: остеохон-
дроза позвоночника, невралгий тройничного нерва, рас-
сеянного склероза и пр. При этом применяют лазерную
рефлексотерапию (лазеропунктуру), облучая биологически
активные точки, рекомендуемые при соответствующем за-
болевании в классической рефлексотерапии. Лазеры ус-
пешно применяют в гинекологии, стоматологии [П. 31],
при лечении хронических тонзилитов, воспалительных
заболеваний среднего уха, недостаточного кровоснабжения
конечностей (путем внутривенного облучения крови) и пр.
Многофотонное возбуждение биомолекул можно обес-
печить с помощью короткого лазерного импульса сравни-
тельно небольшой энергии, но большой пиковой мощности.
27
При этом для двухступенчатого возбуждения триплетных
уровней достаточно импульсов наносекундной длитель-
ности, а для более короткоживущих синглетных уровней
необходимы длительности в пикосекундном диапазоне.j На-
пример, использование двухквантового возбуждения элект-
ронных состояний биомолекул в растворах приводит к
диссоциации и образованию радикалов молекул раство-
рителя. Принципиальное отличие такого фотолиза от у-
радиолиза состоит в том, что молекулы растворителя дис-
социируют только вблизи молекул-хромофоров, которые
поглощают лазерное излучение, а не во всем облучаемом
объеме, как это происходит при у-радиолизе. Этот эффект
может найти применение в лазерной терапии раковых опу-
холей, поскольку он обеспечивает продуцирование радика-
лов воды, которые поражают раковые клетки.
За счет исключения синглет-триплетной конверсии
двухквантовое возбуждение по сравнению с одноквантовым
позволяет повысить эффективность фотохимической ре-
акции. Например, переход от низкоинтенсивного возбуж-
дения (1 Вт/см2) к высокоинтенсивному (10’ Вт/см2) повы-
шает квантовую эффективность фотомодификации порфи-
рина в растворе в 100 раз. Подобные эксперименты с ПГП
показывают, что такое возбуждение дает более сильный
цитотоксический эффект, чем низкоинтенсивное.
Двухквантовые фотохимические реакции наблюдались
в биологических системах разного уровня организации
(вирусы, дрожжи и клетки). Этот подход должен найти
применение в генной инженерии. Например, при исследо-
ваниях in vivo удается наблюдать различные типы повреж-
дений молекул нуклеиновых кислот (разрывы и сшивки),
что открывает возможность изучения пространственной
структуры и функций сложных биомолекул (белки, нуклеи-
новые кислоты) [П. 1).
Таким образом, многофотонное возбуждение биомоле-
кул является основой новой эффективной нелинейной
фототерапии, использующей короткие лазерные импульсы,
способные производить значительные фотохимические эф-
фекты при таких малых средних интенсивностях, когда
тепловые эффекты отсутствуют.
Основы лазерной хирургии, типичные примеры. Пре-
имущества лазерной хирургии хорошо известны — это
бесконтактность, дающая абсолютную стерильность; се-
лективность, позволяющая выбором длины волны облу-
чения разрушать патологические ткани, не затрагивая
окружающие здоровые; широкий диапазон интенсивностей,
28
что дает возможность обеспечивать требуемое воздействие
на биообъект: плавление и выпаривание при сравнительно
небольшом разогреве, гидродинамическое разрушение за
счет локального интенсивного импульсного нагрева или
фотохимическое разрушение [П. 18 — П. 22, П. 26 — П. 30,
П. 33, П. 37, 21]. Отметим еще бескровность лазерных опе-
раций, а также широкие возможности при микрохирургии
тканей и клеток благодаря высокой степени фокусировки
пучка и пороговому характеру фоторазрушения.
Наиболее значительные достижения лазерная хирургия
имеет в офтальмологии [П. 22, П. 32, П. 37, 22]. Это операции
на стекловидном теле, фотокоагуляция сетчатки, лечение
диабетической ретинопатии, приваривание отслоившейся
сетчатки, пробивка отверстий для обеспечения нормаль-
ного функционирования шлеммова канала при лечении
глаукомы и пр.
Широкие возможности открываются у лазерной хирур-
гии при использовании волоконных световодов, способных
передавать значительные мощности. Например, приме-
нение волоконно-оптических катетеров позволяет реализо-
вать лазерную ангиопластику — разрушение (абляцию)
склеротических бляшек в кровеносных сосудах [П. 26, 23—
26]. Для испарения бляшки достаточно в течение 1—40 с
облучать ее светом аргонового лазера мощностью 3—4 Вт.
Наиболее перспективными для этих целей считаются экси-
мерные лазеры (1=200—300 нм), поскольку разрушающее
действие импульсного УФ излучения на бляшки носит в
основном фотохимический характер, требуемая энергия
при этом существенно меньше, поэтому снижается опасность
повреждения стенок сосудов. Малая глубина проникно-
вения УФ излучения в ткань позволяет осуществлять тон-
кий послойный контроль за процессом абляции.
В последнее время УФ излучение эксимерных лазеров
начинает использоваться при лечении различных керато-
зов, а также для коррекции дефектов зрения за счет по-
слойной абляции тканей роговицы.
Значительные перспективы в биологии имеет лазерная
микрохирургия живых клеток. Локальность воздействия
может быть доведена до 0,01 мкм. Широкие пределы изме-
нения длины волны лазерного излучения и длительности
импульса позволяют реализовать любой из видов фотораз-
Рушения от теплового до многофотонного фотохимического.
Все это дает новые возможности в микрохирургии хромосом,
митатических органелл и цитоплазмы, имеет выход в гене-
тическую инженерию.
29
1.2. Лазеры и лазерные системы
для диагностики биологических объектов
Общая характеристика диагностических лазеров. Слож-
ность и многообразие биологических объектов, значитель-
ное разнообразие в характере их взаимодействия со светом
определяют необходимость привлечения широкого круга
явлений и методов для диагностики этих явлений. Поэтому
оказывается широким и круг лазеров, используемых в
диагностике. Это наиболее простые и надежные с большим
сроком службы газоразрядные лазеры, высокоинтенсивные
химические и эксимерные лазеры, перестраиваемые в ши-
роком диапазоне длин волн жидкостные лазеры на краси-
телях, высокоинтенсивные твердотельные лазеры со сверх-
короткой длительностью импульсов, малогабаритные полу-
проводниковые лазеры и пр. Все эти лазеры перекрывают
-Стекло (Nd3+)(7/73 Дж)
•AHHNd (0,5 Дж)
ЛИГ: Nd
ArF KrF
W Xe/CL-XeF
XeBrlN.
£,Дж"
10°
10~1
10'2
1O'Z
10~*
10~5
100 200 300 400 500 600 700 800нм1 2 34 5 6 7 8 910 Л,мкм
Рис. 1.4. Длины волн и энергетические параметры наиболее рас-
пространенных лазеров: а — непрерывных, б — импульсных
'2
Н2
Rb
Jr»-
широкий диапазон длин волн от 100 нм до 30 мкм; уровни
выходной мощности непрерывных лазеров и средней [мощ-
ности импульсных лазеров составляют от нескольких
милливатт до десятков и сотен ватт; энергия в импульсе
изменяется в пределах от нескольких миллиджоулей до
нескольких джоулей; длительности их импульсов также
изменяются в широком диапазоне: от нескольких милли-
секунд до единиц фемтосекунд; ширина спектра излучения
30
лазеров — от нескольких герц до десятков гигагерц;
угловая расходимость — от десятков градусов у полупро-
водниковых лазеров до долей миллирадиана у газоразряд-
ных [10—15, 27—371. На рис. 1.4 показаны уровни мощ-
ности и энергии наиболее распространенных и доступных
лазеров.
Газоразрядные лазеры. Наиболее простыми и доступ-
ными среди газоразрядных лазеров, да и среди всех лазеров,
являются гелий-неоновые (Не — Ne) лазеры, работающие
на возбужденных атомах неона. Накачка осуществляется
с помощью тлеющего разряда. Лазеры могут работать на
многих линиях в видимой и ближней ИК области спектра
(всего более 130 линий). Наиболее интенсивными являются
линии с длинами волн 632,8; 1152,3 и 3391,2 нм. Уровень
выходной мощности Р изменяется от долей до сотен мил-
ливатт на каждой линии. На 1=632,8 нм мощность с еди-
ницы длины активного элемента равна 50 мВт/м (при усло-
вии, что генерация на конкурирующей линии с 1=3391,2 нм
подавлена). В коммерческих и лабораторных образцах
лазеров применяются разнообразные средства подавления
конкурирующих линий, что повышает не только мощность
рабочей линии, но и ее стабильность.
Применение специальной технологии интерференцион-
ных покрытий зеркал открывает возможность создания
стабильных и надежных лазеров с достаточной мощностью
и широким набором длин волн, удовлетворяющих потреб-
ностям многих задач диагностики (например, для длин
волн, равных 543,3; 593,9; 611,8; 640,1; 730,5 нм). Ряд
зарубежных фирм уже приступил к выпуску Не— Ne ла-
зеров с «новыми» нетрадиционными длинами волн — это
«зеленый» лазер (1=543,3 нм, Р=0,5—1 мВт) и ИК лазер
(1=1523,1 нм). В лабораторных условиях часто, наоборот,
используют широкополосные зеркала, а перестройку осу-
ществляют с помощью дисперсионного элемента внутри
резонатора (призмы). Таким образом можно получить
генерацию на восьми длинах волн вблизи 632,8 нм (543,3—
730,5), а также на ряде линий вблизи 1152,3 нм (1079,8;
1084,4; 1140,9; 1160,1; 1161,4; 1176,7; 1198,6).
Не — Ne лазеры характеризуются высокой стабильно-
стью параметров излучения и значительным сроком служ-
бы (до 10* часов). Кратковременные флуктуации мощности
серийных лазеров и ее долговременные уходы составляют
обычно доли и единицы процентов [14, 27, 28]. Лазеры вы-
пускаются двух типов—с внешними и внутренними зерка-
лами. В первом случае для герметизации активного эле-
31
мента используются окошки Брюстера и излучение лазера
оказывается линейно поляризованным с высокой степенью
поляризации (/ц : Jj_—500 : 1), во втором поляризация
излучения становится круговой (7ц : /±=1 : 1), при этом
удается несколько повысить выходную мощность (примерно
в 1,5 раза).
Для большинства современных конструкций Не — Ne
лазеров характерным является режим работы на наиниз-
шей поперечной ТЕМ00 моде, диаметр пучка 2и/ для лазеров
с %=632,8 нм обычно составляет 0,5—0,8 мм для маломощ-
ных и около 2 мм для более мощных, расходимость излу-
чения 0«1—3 мрад.
При всех достоинствах Не — Ne лазеров они имеют
ряд существенных недостатков, к которым можно отнести
малый коэффициент полезного действия (КПД), порядка
0,1 %, и малый уровень выходной мощности.
Более значительными КПД и уровнями средней мощ-
ности обладают импульсные атомарные лазеры, использу-
ющие пары изолированных атомов в качестве рабочей
среды,— это лазеры на так называемых самоограниченных
переходах ПО]. Наиболее интересными с точки зрения
применений являются лазеры на парах меди и золота,
генерирующие интенсивное излучение вТвидимом диапазоне
на зеленой, желтой и красной линиях. Наиболее интенсив-
ная — это зеленая линия медного лазера с %=510,5 нм
(ее интенсивность составляет примерно 70 % от общей
интенсивности). Длина волны желтой линии этого лазера
равна 578,2 ’нм. Красное излучение лазера на парах зо-
лота имеет длину волны 627,8 нм. Инверсия в этих лазерах
создается импульсным газовым разрядом в смеси паров
металла и буферного газа (гелия или неона).
Средняя мощность у медных лазеров, выпускаемых про-
мышленностью, составляет Рср«8—40 Вт, частота следо-
вания импульсов /«2—20 кГц, их длительность ти«5—
50 нс, мощность в импульсе Р„ достигает 200 кВт. Энергия
импульса Ea=Parn=Pcp/fm2 -10"8 Дж. Для лазеров на
парах золота при прочих равных условиях средняя мощ-
ность в 4—8 раз меньше, примерно во столько же раз
меньше энергия в импульсе. КПД медного лазера порядка
1 %, 0«2 мрад, 2и>«15 мм. Благодаря значительному
усилению среды использование неустойчивого резонатора
позволяет снизить расходимость до 0,9 мрад.
Зарубежными фирмами разработан ряд лазеров специ-
ального медицинского применения, в том числе полностью
автоматизированных с водяным и воздушным охлаждением.
32
С точки зрения диагностического применения в биологии
и медицине они интересны тем, что являются самыми мощ-
ными источниками излучения в видимой области, их из-
лучение хорошо пропускается волоконными световодами,
до 70 % при диаметре световода 1000 мкм, они обладают
узкой линией и имеют малую расходимость.
Среди ионных лазеров на благородных газах наибольшее
распространение получили аргоновые и криптоновые ла-
зеры [П. 40, 10, 13, 27, 28], для возбуждения которых ис-
пользуется дуговой разряд. Они являются самыми мощ-
ными лазерами непрерывного действия видимого и ближ-
него УФ диапазонов длин волн. Суммарная мощность на
многих линиях Аг лазера вблизи 500 нм достигает 10—
20 Вт, а в области 350 нм — 1—2 Вт. Мощность излучения
Кг лазера вблизи 650 нм не превышает 1 Вт. Основные
длины волн излучения Аг лазера перекрывают диапазон
351,1—514,5 нм (10 линий), Кг лазера — 350,7—799,3 нм
(14 линий). Низкий КПД ионных лазеров, который не
превышает 0,1 %, требует использования мощных источ-
ников питания и эффективного охлаждения активного
элемента. Удельная выходная мощность на каждой из ос-
новных линий генерации Аг лазера с >,=488,0 и 514,5 нм
составляет примерно 5 Вт/м при отношении тока разряда к
диаметру рабочего капилляра 25 А/мм. Диаметр пучка
излучения 2о»«1—2 мм, 0«О,6 мрад.
Использование широких капилляров (7—10 мм) по-
зволяет в лабораторных условиях получать непрерывную
мощность до 100 Вт/м, создавать мощные источники УФ
излучения на Л=351,1 и 363,8 нм с мощностью до 10 Вт.
Большой интерес для биологии и медицины представляет
УФ лазер умеренной мощности, излучающий в диапазоне
334,0—363,8 нм суммарную мощность порядка 1 Вт, а на
Х=351,1 нм —0,25 Вт.
Ионные лазеры на парах химических элементов также
являются прекрасными источниками непрерывного излу-
чения в видимой и ближней УФ областях спектра [П. 40,
Ю, 13, 27—29]. Поскольку в качестве рабочего вещества
могут быть использованы пары многих химических элемен-
тов (Cd, Zn, Se, Те и т. д.), то набор длин волн оказывается
существенно шире, чем у Не — Ne и Аг лазеров. При этом
мощность излучения несколько больше, чем у Не — Ne
лазеров, и ее уровень вполне удовлетворяет большинству
задач биомедицинской диагностики. Лазеры работают при
наличии вспомогательного газа, в качестве которого обычно
применяют гелий.
3 А. В. Приезжее 33
Наибольшее распространение получили Не — Cd и
Не — Se лазеры катафорезного типа, в которых подачу
паров и их равномерное распределение внутри активного
элемента обеспечивает процесс катафореза. Обычно воз-
буждение этих лазеров осуществляется продольным тле-
ющим разрядом постоянного тока с такими же примерно
параметрами, как при возбуждении Не — Ne лазера.
Принудительное охлаждение не требуется. Излучение
Не — Cd лазера происходит на синей линии с 1=441,6 нм
и УФ линии с 1=325,0 нм, а излучение Не — Se лазера —
более чем на 19 линиях, перекрывающих почти весь види-
мый диапазон.
Промышленность у нас в стране и за рубежом выпускает
разнообразные модификации Не — Cd лазеров, постоянно
продолжается их модернизация и совершенствование. Этот
лазер оценивается как один из наиболее перспективных
лазеров для диагностики в биологии и медицине — это и
микрофлуориметрия, КР-спектроскопия, новые цитомет-
рические системы, лазерные микроскопы и пр. Мощность
излучения промышленных лазеров в режиме ТЕМ00 моды
на 1=441,6 нм составляет 8—100 мВт, на 1=325,0 нм —
1—20 мВт, 2{о«0,8—3 мм, 0«0,4—1,0 мрад; кратковремен-
ные флуктуации выходной мощности в полосе 10—10е Гц
обычно составляют 6—10 %, у лучших образцов менее 1 %,
долговременные флуктуации 5—10 % за 8 часов, а у луч-
ших образцов 5 % за 24 часа [29]. Срок службы лазеров
(2—5)-103 часов. Есть реальная возможность довести
срок их службы до 8-10s часов.
В отдельных применениях (например, при анализе
загрязнений окружающей среды) полезными могут ока-
заться молекулярные лазеры ИК-диапазона, работающие
на колебательно-вращательных переходах молекул СОа
и СО [П. 40, 10, 11]. СО2 лазер излучает на вращательных
линиях молекулярных полос 9,4 и 10,4 мкм. Он может
работать на многих линиях из этих полос. Перестройка
линий генерации обычно осуществляется с помощью ди-
фракционной решетки, используемой в качестве одного
из зеркал лазера. Наибольшее усиление имеют линии,
длина волны которых близка 10,6 мкм, поэтому лазер без
дисперсионного элемента работает на этой длине волны.
Для возбуждения лазера обычно используется продольный
тлеющий разряд постоянного тока в многокомпонентной
смеси, как правило, с составом СО2— N2— Не—Хе.
Выходная мощность промышленных лазеров малой и сред-
ней мощности составляет 5—40 Вт, размер пучка 5—
34
10 мм, расходимость 1—5 мрад. Этот лазер отличает чрез-
вычайно высокий КПД (10—30 %).
Перспективными для диагностики представляются ма-
логабаритные волноводные СО2 лазеры, которые имеют
узкий рабочий капилляр (волновод), повышенное давление
смеси от 100 Торр до атмосферного, что обеспечивает срав-
нительно высокие уровни мощности с единицы длины,
значительную перестройку частоты в пределах одной
линии излучения лазера (1 ГГц). Выходная мощность вол-
новодных СО2 лазеров в непрерывном режиме может до-
стигать 30 Вт, типичное значение для компактного лазера
1—10 Вт. Размер пучка около 1 мм, однако расходимость
оказывается значительной, порядка 10 мрад. Использо-
вание поперечного высокочастотного возбуждения и вы-
сокого давления смеси позволяют реализовать компактный
спектрометр с квазиплавной перестройкой длины волны в
диапазоне 9,1—11,0 мкм (1096—908 см-1). Еще более плав-
ную перестройку можно получить при работе на смеси
изотопов молекулы СО2 (всего их 18).
СО лазер работает в интервале длин волн 5—6,5 мкм.
Он обладает еще большим КПД (50—75 %), сравнимыми
с СО2 лазером уровнями мощности, также может пере-
страиваться в широком диапазоне длин волн. Рабочая
смесь газов содержит гелий, азот, ксенон и кислород.
Возможно создание компактных инфракрасных спектро-
метров на основе перестраиваемых волноводных СО лазе-
ров с поперечным высокочастотным возбуждением.
Близкие характеристики к СО2 и СО лазерам имеют так
называемые химические лазеры. Их генерация реализуется
на колебательно-вращательных переходах двухатомных
молекул галогеноводородных соединений [10]. Длины волн
лазеров: HF — 2,7 мкм; НС1 — 3,7 мкм; НВг — 4,2 мкм;
DF — 4,3 мкм. Они могут работать в импульсном и непре-
рывном режимах генерации, допускают дискретную пере-
стройку длин волн в пределах колебательно-вращательных
полос генерации.
Молекулярные лазеры, работающие на электронно-ко-
лебательных переходах, излучают в УФ диапазоне длин
волн. Наиболее интересные из них — это лазер на моле-
кулах азота, основная длина волны излучения которого
равна 337,1 нм, и водородный лазер с излучением в вакуум-
ном УФ (Х= 116 и 160 нм) [10, 13]. Эти лазеры могут рабо-
тать только в импульсном режиме, правда, с довольно боль-
шой частотой повторения импульсов f. Например, для N2
лазера /=0,05—1 кГц, что для большинства применений
3*
35
эквивалентно непрерывной генерации. Они имеют не очень
высокие значения КПД (0,01—1 %), Р0р=Ю"3—1 Вт,
ти=1—10 нс, Ри=1—103 кВт. Промышленность выпускает
несколько типов азотных лазеров; наиболее удобны отпа-
янные конструкции без прокачки газов, хотя они не дают
оптимальных характеристик излучения. Эти лазеры при-
меняются в фотобиологии, спектроскопии, а также для
накачки лазеров на красителях.
Важным и чрезвычайно перспективным классом молеку-
лярных лазеров на электронных переходах являются эк-
симерные лазеры [П. 40, 10—13, 37]. В качестве рабочего
вещества таких лазеров используются так называемые
эксимеры — молекулы-димеры, существующие устойчиво
только в возбужденном состоянии и мгновенно распадаю-
щиеся в основном состоянии, что автоматически и обеспе-
чивает инверсию. Накачка этих лазеров осуществляется
быстрым поперечным разрядом, также как и некоторых
типов азотных лазеров. Эксимерные лазеры имеют значи-
тельный КПД (1—15 %) и могут перестраиваться по длине
волны в пределах 2—6 нм, средние длины волн эксимерных
лазеров на галогенидах инертных газов: ArF — 193 нм,
КгС1 — 222 нм, KrF — 248 нм, ХеВг — 308 нм, XeF —
351 нм, энергия их импульсов 0,01—0,25 Дж, /=100—
150 Гц, ти=4—20 нс, РСр=5—40 Вт. Пучок излучения
этих лазеров представляет собой прямоугольник с раз-
мерами 10x25 мм, а расходимость разная по двум коор-
динатам и составляет 2x5 мрад.
Жидкостные лазеры на красителях. Активные среды ла-
зеров на красителях представляют собой размещенные в
специальных кюветах или прокачиваемые в струе на воз-
духе растворы органических красителей, инверсия в ко-
торых создается за счет внешней оптической накачки с
помощью ламп или лазеров. Они обладают значительным
КПД преобразования. Плавная перестройка длины волны
излучения для одного типа красителя осуществляется с
помощью дисперсионных элементов внутри резонатора в
пределах нескольких десятков нанометров. Заменой кра-
сителей и источников накачки можно осуществить пере-
стройку длин волны во всем спектральном диапазоне от
УФ до ближнего ИК.
Наиболее простую конструкцию имеют импульсные
лазеры на красителях с ламповой накачкой [П. 40, П. 32, 30].
Созданы десятки моделей промышленных образцов таких
лазеров. Они перекрывают диапазон длин волн от 340
до 960 нм. За счет удвоения и параметрического преобра-
36
зования частоты диапазон еще более расширяется (217—
380 нм и 1,06—3,1 мкм). Энергия их излучения прости-
рается от 1 мДж до 50 Дж в периодическом режиме, до
400 Дж в режиме одиночных импульсов, средняя мощ-
ность — от 0,06 до 20 Вт, длительность импульса — от
7 нс до 8 мкс, частота повторения импульсов — от 200 Гц
до одиночных импульсов, максимальный КПД лазеров —
от 0,08 до 0,8 %. Ширина линии излучения лежит в пре-
делах 0,4—0,001 нм, а рекордные значения для систем с
усилителями достигают 10~4—10-5 нм. Расходимость излу-
чения в зависимости от конструкции резонатора изменя-
ется в пределах от 0,5 до 20 мрад.
Эффективную накачку в импульсном режиме обеспечи-
вают азотный, медный и эксимерные лазеры, а также из-
лучения второй и третьей гармоник гранатового лазера
(532 и 355 нм) [П. 40, 10, 12, 13]. Используются как попереч-
ная, так и продольная накачка (вдоль оси резонатора).
Эффективность преобразования УФ излучения азотного
лазера в видимое излучение лазера на красителях состав-
ляет около 10 %. Диапазон перестройки такого лазера
350—1000 нм и 217—300 нм с удвоением частоты. Ширина
линии генерации 0,01 нм, а с эталоном Фабри — Перо
внутри резонатора 0,001 нм. Частота повторения импуль-
сов /=50—100 Гц, ти=5—10 нс, Ри«10 Вт, 0«1О мрад.
При накачке излучением эксимерных лазеров диапазон
длин волн — 320—980 нм, Рср«0,4 Вт. Накачка медным
лазером мощностью 4 Вт позволяет с помощью четырех
красителей перекрыть диапазон длин волн 530—710 нм
со средней мощностью 6 Вт, обеспечить высокую частоту
повторения импульсов, 10 кГц, и малую расходимость
излучения, 3 мрад.
Лазеры на красителях являются уникальными пере-
страиваемыми источниками когерентного излучения и в
непрерывном режиме. Для создания инверсии необходима
жесткая фокусировка излучения лазера — накачки (до
размера пучка 10—30 мкм), поскольку требуется высокая
плотность мощности порядка 1 МВт/см2. При этом необхо-
димое охлаждение облучаемого объема красителя проис-
ходит за счет быстрой его прокачки (струя в воздухе).
В максимуме полосы красителя родамина-бЖ мощность
генерации достигает 3 Вт, для других красителей она не
превышает 100—200 мВт. Мощность лазеров накачки обычно
5 7 Вт. При использовании Аг и Кг лазеров диапазон
Длин волн лазера на красителях составляет 400—1000 нм,
тонкая перестройка частоты осуществляется в пределах
37
10—30 ГГц, ширина линии достигает 10—100 МГц, а при
наличии системы стабилизации — менее 100 кГц; диаметр
пучка около 5 мм, его расходимость 1,5—2 мрад.
Твердотельные лазеры [П. 40, 10—13]. Первым в мире
лазером, созданным в 1960 г., является рубиновый лазер.
С него началась история лазеров и их применений. Этот
лазер представляет собой рубиновый стержень, накачива-
емый обычно излучением спиральной или линейной ксе-
ноновыми импульсными лампами. Лазер излучает красную
линию на длине волны 694,3 нм. Изменяя температуру
рубинового стержня в пределах 77—500 К, оказывается
возможным перестраивать длину волны излучения в пре-
делах примерно 50 см-1. По сравнению с другими твердо-
тельными лазерами рубиновый лазер имеет низкий КПД
(0,1 %). Длительность импульсов в режиме свободной
генерации составляет 1—3}мс, энергия в импульсе в ТЕМ00
моде Дж, f«l Гц, 0«1 мрад, 2и>т2—10 мм.
Лазеры на стекле с неодимом работают на силикатном
и фосфатном стеклах. Рабочим веществом являются ионы
неодима Nds+. Длина волны излучения лазеров на сили-
катном стекле 1061 нм, а на фосфатном — 1054 нм. Эти
лазеры работают в импульсном режиме и характеризу-
ются высокими уровнями энергии в импульсе (до 10s Дж),
широкими линиями флуоресценции, 26 и 19 нм, малой ча-
стотой повторения импульсов, 1—2 Гц. В режиме свобод-
ной генерации 2о»=5—10 мм, 0=5—10 мрад.
Наиболее широкое применение из всех твердотельных
лазеров находят лазеры на амомоиттриевом гранате с
неодимом (АИГ : Nd). В качестве накачки используются
обычно криптоновые и ксеноновые дуговые лампы. Наи-
более легко возбуждается линия с Х=1064 нм, генерация
происходит также на линиях с Х=946, 1319 и 1833 нм, КПД
лазеров 2—2,5 %. Создано уже несколько сотен промыш-
ленных образцов лазеров на гранате. Их можно разделить
на три категории: непрерывные, импульсные с непрерыв-
ной накачкой и импульсные с импульсной накачкой.
Непрерывные лазеры работают при очень больших
уровнях мощности 65—250 Вт на %=1064 нм и 30 Вт на
Х=1319 нм, 0лЯО—12 мрад. Средняя мощность излучения
импульсных лазеров с непрерывной накачкой (Х=1064 нм)
в многомодовом режиме составляет 20—40 Вт, в ТЕМ00
моде 3—16 Вт, 0«1,2—2 мрад. Выпускаются лазеры с
Х=1319 нм, а также с преобразованием частоты во вторую
и четвертую гармоники с длинами волн: 532, 266, 659 нм.
Мощность излучения на Х= 1319 нм — 4 Вт, на Х=532 нм —
38
2—4 Вт, на Х=266 нм — 0,5 Вт. В этих лазерах предус-
мотрена периодическая модуляция добротности резонатора
с частотой 5—50 кГц. Импульсные гранатовые лазеры с
импульсной накачкой характеризуются большой по срав-
нению с рубиновыми и стеклянными лазерами частотой
повторения импульсов, /«25—300 Гц, ти«8—100 нс,
£и«0,05—0,5 Дж, Ри=5—5 -10s кВт, 0=0,05—6 мрад.
Перспективным для биологических применений является
АИГ : Ег3+ лазер (эрбиевый) [11]. По своим параметрам он
практически не уступает гранатовому лазеру, а длина
волны его излучения %=2,94 мкм лежит в полосе нормаль-
ных колебаний молекулы воды (Хтах«2,94 мкм для «свобод-
ной» и Хтах «3,05 мкм для «связанной» воды), что и оп-
ределяет его переспективность для применений в биологии
и медицине.
Волоконные лазеры представляются весьма перспек-
тивными для диагностических целей в биологии и медицине
[П. 32]. Типичный медицинский лазер многоцелевого на-
значения использует оптические волокна с диаметром
сердцевины 7—10 мкм (диаметр оболочки 25—30 мкм),
изготовленные из различных лазерных материалов, причем
для волокон, активированных различными редкоземель-
ными элементами, длину волны излучения можно варьи-
ровать в широких пределах от УФ до ИК. Излучатель
лазера представляет собой спиралеобразный световод,
расположенный вокруг лампы накачки, дистальный конец
которого длиной 1—10 м выводится в область взаимодей-
ствия излучения с биологическим объектом. При актива-
ции материала волокна неодимом в моноимпульсном режиме
выходная энергия лазера на Х=1061 нм составляет 0,6—
0,7 Дж при ти=100—120 мкс, /=10—20 Гц, РСр=20—
25 Вт.
Рабочее вещество твердотельного лазера на красителях
типа ЛКИ-301 представляет собой набор красителей в
твердой матрице (полиметилметакрилат), например рода-
мин-бЖ, родамин-С, оксазин-17, оксазин-1. Активный эле-
мент изготовляют из дисков, накачку осуществляют вто-
рой гармоникой АИГ: Nd лазера по квазипродольной
схеме. Спектральная область перестройки лазера 550—
750 нм, ширина линии генерации без эталона Фабри —
Перо 1 нм, с эталоном 0,1 нм, ти«20 нс, /<100 Гц, 0«
^4 мрад, на Х=580 нм КПД преобразования 30 %.
Лазеры на центрах окраски по своим параметрам близки
к лазерам на красителях, и, что очень важно, они могут
излучать не только в видимой, но и в ближней ИК области
39
Длин волн вплоть до 4 мкм, где нет подходящих красителей
[10, 12, 13]. Рабочей средой лазеров на центрах окраски
являются ионные кристаллы, обычно щелочно-галоидные
(ЩГК), в которых различными способами (фотохимическим,
аддитивным или электронно-лучевым окрашиванием) со-
здаются те или иные комплексы точечных дефектов, обла-
дающие собственной частотой поглощения, так называемые
F-центры или собственные центры окраски. Наиболее
стабильными являются Г2-, F}F*-, FA- и Гв-центры.
Спектры их люминесценции перекрывают диапазон 600—
4000 нм. С помощью лазеров на ЩГК (NaF, LiF, КС1: Li,
RbCl: Li, KC1 : Na, KC1 : Na+ : Or и др.) осуществлена
плавная перестройка длин волн: 630—730, 800—1500,
1700—2200, 2250—3300 нм. Эти лазеры работают как в
Импульсном, так и в непрерывном режимах. Некоторые
из них эффективны лишь при низких температурах (77 К),
другие имеют хорошие выходные характеристики при ком-
натной температуре.
Обычно используется лазерная накачка по аналогич-
ным с лазерами на красителях схемам, при этом порог
генерации оказывается существенно более низким, чем у
лазеров на красителях. Например, для непрерывных ла-
зеров пороговая мощность накачки составляет всего 13—
50 мВт. В качестве источников накачки обычно использу-
ются Аг, Кг, АИГ : Nd лазеры. Эффективность лазеров
на центрах окраски меняется в довольно широких пределах
и может быть весьма большой (2,1—60 %). Выходная мощ-
ность излучения также меняется в довольно широких
пределах (6 мВт — 1 Вт), в импульсном режиме энергия
одного импульса достигает десятков миллиджоулей.
Приведем данные отечественного лазера МАЛСАН-201,
первого в мире промышленного лазера на ЩГК, работаю-
щего при комнатной температуре кристалла [31]. Он ин-
тересен также тем, что полностью автоматизирован с по-
мощью встроенной мини-ЭВМ. В лазере обеспечена син-
хронная генерация в двух спектральных диапазонах (840—
1100 нм и 1090—1240 нм) с одним источником накачки (гра-
натовый или стеклянный лазеры), а также нелинейное
преобразование этого излучения во вторую гармонику,
перекрывающее соответственно два диапазона (420—550 нм
и 545—620 нм). Эффективность нелинейного преобразо-
вания составляет 10 %. Рабочий кристалл LiF (F£, Ft).
Эффективность преобразования составляет 8 % при на-
качке 5 МВт на 532 нм и 15 % при накачке 25 МВт на ос-
новной гармонике (1064 нм), ти=5—30 нс, f<12,5 Гц.
40
Ширина линии излучения с дифракционной решеткой
1—3 см-1, с дифракционной решеткой и эталоном 0,3 см”1.
Расходимость излучения равна 3 мрад при расходимости
пучка накачки 1 мрад.
Полупроводниковые инжекционные лазеры. Большин-
ство рассмотренных лазеров имеют малый КПД, значи-
тельные размеры и довольно сложное устройство. Все это
препятствует созданию на их основе компактных средств
диагностики. В значительной мере конкуренцию им могут
составить инжекционные полупроводниковые лазеры, ко-
торые перекрывают диапазон от 575 нм до 46,2 мкм, име-
ют высокую эффективность (20 %), чрезвычайно ком-
пактны и просты конструктивно [П. 40, П. 42, 10—13,
32, 33J.
Полупроводниковый лазер представляет собой полу-
проводниковый диод ср — n-переходом, в области кото-
рого при пропускании инжекционного тока в прямом на-
правлении создается инверсия населенности. В лазерах
наиболее часто используются двойные гетероструктуры,
когда в диоде создаются два перехода между различными
материалами. Толщина активного слоя у таких лазеров
0,1—0,3 мкм, они работают при комнатной температуре.
Для расширения спектрального диапазона и снижения
пороговой накачки используют разнообразные тройные и
четверные соединения. Например, Ga(As!_x Рж) лазеры
перекрывают диапазон от 830 (х=0) до 640 нм (х=0,4).
Наименьшая длина волны %=575 нм получена для соеди-
нения 1п!_ж GaxAstfPj_y. Этот четверной сплав при у=2,2х
для разных значений х дает лазеры с длинами волн от 920
до 1500 нм.
Для ИК спектроскопии важным классом полупровод-
никовых лазеров являются лазеры на основе соединений
свинца PbSx.^Se*, Pbi_x SnxTe и Pbj-^Sn^Se и аналогич-
ных, для которых получена генерация в диапазоне 2,5—
46,2 мкм. При заданной концентрации компонентов пере-
стройка длины волны осуществляется изменением темпе-
ратуры кристалла, тока через диод (тепловой эффект),
приложением внешнего магнитного поля и давления. Глав-
ным недостатком лазеров на соединениях свинца является
необходимость их достаточно глубокого охлаждения (20—
40 К) при работе в непрерывном режиме, поэтому в про-
мышленных ИК спектрометрах наряду с непрерывными
используются импульсные диоды, для охлаждения которых
можно применять простую технику — термоэлектрические
холодильники [П. 421.
41
Если первые инжекционные лазеры имели сравни-
тельно небольшую мощность (3—5 мВт), то в настоящее
время созданы лазеры, которые в одной моде могут давать
непрерывное излучение мощностью до 50 мВт. Созданы
сфазированные структуры, состоящие из десяти или более
лазеров, генерирующие излучение мощностью до 2,5 Вт.
Конечно, главным недостатком полупроводниковых лазе-
ров является чрезвычайно малый размер пучка на выходе
(0,5—1,0 мкм), что влечет за собой по сравнению с другими
лазерами значительную расходимость излучения (20—40°
в плоскости, перпендикулярной плоскости активного слоя,
и 5—10° в плоскости этого слоя).
Однако разнообразные технологические приемы позво-
ляют уменьшить расходимость. Именно, применение сфа-
зированных диодных структур способствует увеличению
размеров пучка и снижению расходимости. Например,
излучение структуры из десяти лазерных диодов (Х=770 нм,
Робщ^ЭО мВт) удается сфокусировать в пятно диаметром
2,5 мкм, что уже дает возможность эффективно использовать
одномодовые световоды для передачи этого излучения и
обеспечить диагностику биологических микрообъектов [32].
Следует отметить значительную ширину линии усиления
инжекционных лазеров, малые размеры резонатора (около
1 мм), соответственно значительную разреженность про-
дольных мод (50 ГГц, 1,6 см"1), чрезвычайно узкую ширину
линии отдельной моды, которая может не превышать 50 кГц.
Перестраиваемые лазерные источники света. Успех
применения методов лазерной спектроскопии и диагно-
стики, в том числе и в медико биологических задачах, во
многом определяется существованием простого и надеж-
ного источника лазерного излучения, перестраиваемого в
нужном диапазоне длин волн. По мере описания различных
лазеров мы особое внимание уделили именно этой про-
блеме, как одной из главных для диагностики. Кроме
представленных выше перестраиваемых лазеров сущест-
вуют и другие способы получения перестраиваемого коге-
рентного излучения. Рассмотрим наиболее важные из них
[П. 40, 10—13].
Часто для получения перестраиваемого излучения ис-
пользуют явление вынужденного комбинационного рас-
сеяния (ВКР). Одним из представителей ВКР лазеров
является полупроводниковый лазер на основе комбинацион-
ного рассеяния с переворотом спина, например на основе
InSb. Диапазон длин волн этого лазера при накачке из-
лучением СО лазера составляет 5—6,5 мкм, а при накачке
42
С02 лазером 9—14 мкм. Мощность генерации достигает
1 Вт. Изменением напряженности магнитного поля ча-
стоту излучения можно перестраивать в довольно широ-
ких пределах со скоростью 2 см-1/кГс. При использо-
вании сверхпроводящих магнитов диапазон перестройки
составляет примерно 80 см-1.
Существуют так называемые комбинационные лазеры,
работающие на ВКР в газах и конденсированных средах.
Так, использование в качестве источников'накачки лазеров
на красителях позволяет в комбинационных лазерах на
газообразном водороде получить плавную перестройку в
диапазоне 185 нм — 7 мкм. Для конденсированных актив-
ных сред, например. одномодовых кварцевых волоконных
световодов, нет необходимости в перестраиваемом источ-
нике накачки. С помощью излучения гранатового лазера
мощностью несколько ватт в волоконном световоде длиной
в несколько сот метров удается получить излучение в диа-
пазоне 1,08—1,13 мкм для первого стоксового компонента
и 1,15—1,175 мкм для второго [12]. В СССР выпускаются
волоконно-оптические многоволновые источники дискрет-
ного по спектру когерентного излучения «Гамма-А» и
«Гамма-С», которые возбуждаются излучением любых им-
пульсных лазеров с %=400—1100 нм* ти<1 нс, Ри=0,01—
—1МВт *).
ВКР лазеры относятся к большому многообразию ла-
зерных систем, использующих разнообразные метода не-
линейного оптического смешения, к которым также отно-
сятся генераторы второй гармоники, генераторы суммар-
ных и разностных частот, параметрические генераторы..
Эти системы перекрывают весь диапазон от вакуумного
УФ до далекого ИК, имеют вполне удовлетворительную для
целей диагностики интенсивность когерентного излучения.
Для генерации второй гармоники обычно используют
кристаллы LiNbOs (длина волны накачки Хн=1,06 мкм) и
KDP (Хн=500—600 нм). Эффективность преобразования
обычно не превышает 10—50 %. Таким образом можно
преобразовать не только лазерное излучение с фиксиро-
ванной частотой, но и перестраиваемое, однако для этого
необходимо обеспечить синхронную угловую или темпера-
турную перестройку нелинейного кристалла для обеспе-
чения фазового синхронизма взаимодействующих волн.
' ГРИ использовании лазеров на красителях с удвоением
частоты удается перекрыть диапазон от 217 до 450 нм.
*) Рекламный проспект ГОИ им. С. И. Вавилова»
43
Для генерации излучения суммарных частот и высших
гармоник можно, помимо кристаллов, использовать од-
нородные смеси инертных газов и паров металлов — это
позволяет расширить диапазон перестраиваемого коге-
рентного излучения вплоть до вакуумного УФ. Например,
утроение четвертой гармоники гранатового лазера с ?.=
=266 нм в смеси Хе — Аг позволяет генерировать излу-
чение с А=88,7 нм.
Нелинейное смешение излучения двух лазеров види-
мого диапазона, один из которых перестраиваемый, позво-
ляет генерировать разностные частоты в ИК области спектра
и на этой основе создавать спектрометры разностной ча-
стоты. Например, с помощью Аг лазера и лазера на краси-
телях, излучения которых смешиваются в кристалле LiNbO3,
удается получить перестраиваемое когерентное излучение
в диапазоне 2,2—4,2 мкм.
Важное место среди устройств нелинейной оптики за-
нимает параметрический генератор света (ПГС), который
представляет собой нелинейный кристалл, расположенный
внутри оптического резонатора и накачиваемый излуче-
нием внешнего лазера, работающего на фиксированной
частоте. Перестройка ПГС осуществляется или вращением
кристалла, или изменением его температуры. При накачке
кристалла LiNbO3 излучением второй гармоники гранато-
вого лазера удается получить параметрическую генерацию
в диапазоне 550 нм — 4 мкм. При этом поворот кристалла
на 4° изменяет его длину волны от 1,4 до 4,0 мкм.
Лазеры и лазерные системы с короткой и сверхкороткой
длительностью импульсов. Одно из наиболее важных
свойств лазеров заключается в возможности получения с их
помощью чрезвычайно коротких световых импульсов. Не-
возможно в рамках краткого введения рассмотреть извест-
ные методы и устройства, реализующие световые импульсы
короткой и сверхкороткой длительности, этому посвящена
оэширная литература (см., например, [П. 1 — П. 3, П. 40,
10—13, 15, 35, 36]). Здесь мы обсудим лишь основные
принципы получения коротких и сверхкоротких импульсов
и приведем некоторые цифры, характеризующие возмож-
ности отдельных типов лазеров, уже рассмотренных выше.
Для получения так называемых гигантских импульсов
применяют режим модуляции добротности резонатора,
который осуществляют путем включения и быстрого по
сравнению со временем накачки выключения потерь в
резонаторе. Этот режим характеризуется более короткими
и существенно более мощными по сравнению с режимом
44
свободной генерации импульсами. В качестве модуляторов,
или, как их называют, оптических затворов, наиболее часто
используют электрооптические или акустооптические моду-
ляторы, пассивные затворы на просветляющихся краси-
телях и щелочно-галоидных кристаллах с центрами окраски
или нелинейно поглощающие газы внутри резонатора.
Режим модуляции добротности осуществлен для всех ти-
пов лазеров, однако наиболее часто он используется для
получения коротких и мощных импульсов в твердотельных
или СО2 лазерах. Типичные значения длительности гигант-
ских импульсов составляют 10—100 нс.
Существенно более короткие длительности можно по-
лучить в режиме синхронизации многих продольных (ТЕМ00)
мод. Если между модами лазера устанавливаются опреде-
ленные фазовые соотношения, т. е. излучение отдельных
мод происходит синхронно, то говорят о существовании
режима вынужденной или спонтанной синхронизации мод.
Для осуществления вынужденной синхронизации мод ис-
пользуют модуляцию потерь или оптической длины резо-
натора с помощью электрооптических и акустооптических
модуляторов на частотах, близких к межмодовому частот-
ному интервалу сГ2пЪ (рис. 1.3).
В режиме синхронизации моды лазера интерферируют
между собой с образованием коротких световых импульсов
длительностью, определяемой шириной спектра мод или
шириной линии генерации t„«1/Av, и разделенных вре-
менным интервалом, определяемым межмодовым частотным
интервалом, \t=2nL!c. Для газовых лазеров Av«109—
10го Гц, поэтому можно получить импульсы лишь нано-
секундной и субнаносекундной длительности; для твердо-
тельных лазеров Дт«1012—10“ Гц и тк<1 пс; для лазеров
на красителях Av«1014 Гц, следовательно, в принципе
можно достичь фемтосекундной области длительностей.
Наиболее эффективным способом получения сверхко-
ротких перестраиваемых по длине волны импульсов дли-
тельностью 10"11—10-13 с является метод синхронной оп-
тической накачки, который заключается в модуляции
усиления активной среды лазера на частотах, равных или
кратных обратному времени обхода резонатора [36]. Такой
лазер генерирует последовательность импульсов, следую-
щих синхронно с импульсами накачки. Если в качестве
источника накачки выбран лазер с синхронизированными
модами, то оптические длины лазера-накачки и перестраи-
ваемого лазера должны быть согласованы с необходимой
точностью.
45
Практически для всех перестраиваемых лазеров и л:
зерных систем, которые мы рассмотрели, реализован
синхронная накачка — это и лазеры на центрах окраска
полупроводниковые и ВКР лазеры, параметрические п
нераторы и, конечно, лазеры на органических красителям
получившие наибольшее распространение и уже выпускг
емые промышленностью. Для этих лазеров характерным:
являются сравнительно низкий порог возбуждения, ши
рокая область перестройки, значительная эффективност
и способность генерировать импульсы существенно мень
шей длительности, чем импульсы накачки. Это импульсь
высокого спектрального качества (без дополнительно!
модуляции частоты), поэтому они представляют особы!
интерес для прецизионной кинетической спектроскопа
и возбуждения оптоволоконных систем, служащих для ком-
прессии (сжатия) во времени импульсов [15].
Обычно методом синхронной накачки удается получить
импульсы длительностью единицы пикосекунд — сотни
фемтосекунд. Для лазеров на красителях с синхронной
накачкой типичными являются импульсы длительностью
2,5—10 пс, средней мощностью 80—100 мВт, частотой по-
вторения от одиночных импульсов до 100 МГц, энергией
одиночного импульса 1—20 нДж, пиковой мощностью
0,5—2 кВт.
Наиболее короткие импульсы, полученные в лазерах на
красителях, имеют длительность около 40 фс. Их усиление
до 250 кВт и последующая компрессия в одномодовом во-
локонном световоде длиной 0,7 см позволяют получить
импульсы длительностью 8 фс, что составляет примерно
четыре периода оптического колебания и близко к теоре-
тическому пределу [15].
Отметим, что лазеры с синхронизацией мод имеют вы-
сокую частоту повторения импульсов от нескольких кило-
герц до нескольких гигагерц, а также характеризуются
умеренной энергией импульсов. Такой режим интересен
для биологии с точки зрения развития высокочувствитель-
ных, неразрушающих и быстродействующих средств ди-
агностики.
1.3. Техника безопасности при работе с лазерами
Физиологические эффекты воздействия лазерного из-
лучения. Знания характера физиологических изменений
и их связи с энергетическими, спектральными, временными
и пространственными характеристиками излучения, а также
с оптическими, теплофизическими и фотохимическими свой-
46
ствами облучаемых тканей и органов дают основу для
выработки определенных норм для допустимых интенсив-
ностей и доз облучения, которые не наносят вреда здоро-
вью человека. Очевидно, что по мере получения новых
знаний в этой области и накопления опыта клинических
исследований эти нормы могут существенно изменяться
как в сторону меньших, так и больших уровней интенсив-
ности и доз облучения, могут смещаться и спектральные
границы вредного для человека излучения.
Широкое применение лазеров в биологии и медицине
стимулирует развитие фундаментальных исследований по
взаимодействию лазерного излучения с биологическими
средами, и это является основой для определения безо-
пасных норм облучения и создания безопасных условий
работы медицинского и исследовательского персонала.
В такой постановке физиологическое действие лазерного
излучения сводится к тем изменениям, которые происходят
в зрительном органе и на коже человека, а требования к
нормированное™ излучения и правила техники безопас-
ности остаются примерно такими же, как, например, при
работе с лазерами в промышленности [П. 35, 6, 11].
Однако применение лазеров в медицине ставит и другую
проблему, а именно разработку правил техники безопас-
ности для пациентов, когда «паразитному» облучению
лазерным излучением может быть подвергнуты не только
глаза и кожа человека, но и любой внутренний орган, на-
пример стенки кровеносного сосуда при лазерной ангио-
пластике. Это большая и сложная проблема, которая
может быть решена только на основе всей совокупности
знаний взаимодействия лазерного излучения с биосисте-
мами. Пока эта глобальная проблема находится в стадии
решения, остается использовать те правила безопасности,
которые отработаны в промышленности. При этом следует
отметить, что диагностическое применение лазеров в био-
логии и медицине предъявляет к технике безопасности
примерно такие же требования, как и лазерная техноло-
гия в промышленности. Поэтому при обсуждении этих
вопросов мы будем следовать работам [П. 35, 6, 11, 20],
имея всегда в виду обстоятельный труд [П. 19] по безопас-
ной работе с лазерами и другими источниками оптического
излучения.
В обычных условиях наибольшую опасность лазерное
излучение представляет для сетчатки и роговой оболочки
глаза, а также кожного покрова. Сетчатка защищена от УФ
и далекого ИК излучения, только излучение с длинами
47
волн 400—1400 нм может достигать сетчатки. Из рис. 1.4
следует, что излучение большинства как непрерывных,
так и импульсных лазеров с довольно значительной мощ-
ностью и энергией попадает в этот диапазон и представляет
серьезную опасность для глаза. Излучение многих пере-
страиваемых лазеров также лежит в области пропускания
оптических сред глаза.
Сетчатка является самой поражаемой частью глаза
из-за фокусирующих свойств хрусталика и значительного
коэффициента поглощения зрительного пигмента сетчатки
(табл. 1.1). Порог повреждения сетчатки по уровню ин-
тенсивности зависит от длительности облучения, размера
пятна на сетчатке и длины волны. Например, при времени
облучения 1 с, размере пятна 100—300 мкм пороговая
интенсивность уменьшается от 20 Вт/см2 (Х=630 нм) до
1 Вт/см2 (Х=440 нм), в ИК области (800—1100 нм) этот
параметр изменяется в пределах 30—50 Вт/см2. Таким
образом, наиболее опасной является коротковолновая
часть спектра, где должно проявлять себя не только теп-
ловое, но и фотохимическое действие излучения. Сокращение
времени облучения существенно повышает допустимую
интенсивность /д (при ти=10-3си Х=630 нм /д« 100 Вт/см2).
Излучение на других длинах волн (кроме диапазона
400—1400 нм) эффективно поглощается роговой оболочкой
глаза и хрусталиком, кроме того, оптические среды глаза
сильно рассеивают УФ излучение. Поэтому излучение в
ИК и УФ диапазонах представляет собой опасность для
этих сред глаза. Особенно опасно излучение СО и СОг
лазеров, которое очень эффективно поглощается биологи-
ческими тканями (рис. 1.1).
Применение мощного излучения может вызвать ожог
кожи, конечно, это не так опасно, как ожоги сетчатки или
роговицы, однако желательно избегать и его. Пороговые
значения интенсивности в этом случае определяются до-
вольно сильным отражением кожи в видимой области (10—
60 % на отдельных длинах волн) и сильным поглощением
в ИК области (1>2 мкм). Поэтому наибольшую опасность
также представляют СО и СО2 лазеры, поскольку они
обладают значительной мощностью и их излучение эф-
фективно поглощается в тонком слое кожи. С другой сто-
роны, значительную опасность для внутренних органов
представляет видимая и особенно ближняя ИК области.
Проникающая способность этого излучения может состав-
лять несколько сантиметров, а при условии сдавливания
ткани пропускание может увеличиваться в 40 раз [7].
48
Нормирование лазерного излучения. При нормировании
лазерного излучения, представляющего опасность для
человека, существуют два основных подхода. Один из них
изложен в стандарте ANSI-Z-136-1 (США), другой —
в санитарных нормах и правилах устройства и эксплуа-
тации лазеров N 2392—81 (СССР) [П. 19, П. 35, 6].
Стандарт США представляет предельно допустимые
уровни (ПДУ) излучения в виде таблиц и графиков, охва-
тывающих спектральный диапазон излучения лазеров
200 нм — 103 мкм, диапазон длительностей воздействия от
10"8 до 10е с при облучении глаз и кожи. ПДУ определя-
ются, исходя из наблюдаемых повреждений в 50 % случаев
облучения, с коэффициентом запаса до 10 относительно
этого уровня. ПДУ облучения в УФ и ИК областях спектра
составляют 10"3—1 Дж/см2 в зависимости от длительности
облучения. В видимой области спектра стандарт нормирует
облученность роговицы коллимированным пучком света, со-
ответствующую поражению сетчатки. При импульсном облу-
чении предельные нормы составляют 5-10"’—1,0 Дж/см2,
а при непрерывном—10"4—10"8 Вт/см2. Нормы для
облучения кожи находятся в пределах 10"3—1 Дж/см2,
дня интегральной энергетической яркости в видимой об-
ласти спектра — в пределах 10"3—103 Дж/(см2-ср).
Санитарные нормы СССР предусматривают в УФ об-
ласти ПДУ суммарной энергетической экспозиции рого-
вицы глаза, получаемой персоналом за общее время облуче-
ния в течение рабочего дня, в пределах 10-8—2 -10"8 Дж/см2,
что значительно ниже ПДУ стандарта США. Для види-
мого и ИК излучения ПДУ энергетической экспозиции
роговицы глаза при диаметре зрачка 7 мм для одиночных
импульсов излучения длительностью от 10"9 до 1,0 с лежат
в пределах 2,2 •10"8—1,2-10"2 Дж/см2. Для сетчатки-
санитарные нормы предусматривают суммарную энергети-
ческую экспозицию в диапазоне длин волн 400—750 нм,-
получаемую персоналом за рабочий день, не выше 4-Ю"5—
3-104 Дж при фоновой освещенности роговицы в пределах-
Ю"2—Ю5 лк. Согласно [П. 351, пересчет на роговицу глаза-
дает соответствующий минимальный ПДУ 2,7 -10"11 Вт/см2,.
что существенно ниже значения, даваемого стандартом'
США. Для кожи при облучении в течение времени 3*104 с
в УФ и видимой областях спектра ПДУ изменяется в пре-
делах 2-10-3—8-Ю3 Дж/см2.
Основные правила техники безопасности. При работе
с лазерами необходимо обеспечить такие условия работы,
при которых не превышаются предельно допустимые уровни
4 А. В, Приезжее 49!
облучения глаз’и кожи. Меры безопасности заключаются в
создании защитных экранов, канализации лазерного из-
лучения по световодам, использовании защитных очков
и пр. Защитные очки должны быть тщательно подобраны
в зависимости от рабочей длины волны лазерного света, и их
спектр пропускания проверен. Очки должны эффективно
подавлять излучение на лазерной длине волны, однако по
возможности не быть слишком темными.
Большую опасность представляет отраженное и рас-
сеянное излучение, особенно невидимое (УФ и ИК), по-
скольку направление отраженного излучения (например,
от металлических деталей установки) может быть совер-
шенно произвольным и изменяться в процессе измерений
неконтролируемым образом. Диффузное отражение (на-
пример, от стен помещения) и рассеяние света самим изу-
чаемым телом, что характерно для биологических объектов
дает излучение по всем направлениям, и в принципе в
помещении могут отсутствовать безопасные зоны. Для
диффузного отражения и рассеяния характерно, что на
расстояниях порядка размеров лабораторной комнаты
тотность мощности на сетчатке не зависит от расстояния
до объекта рассеяния. Это связано с тем, что плотность
мощности на сетчатке уменьшается с увеличением рас-
стояния от объекта, однако фокальное пятно на сетчатке
при этом также уменьшается. Для устранения рассмот-
ренных эффектов необходимо чернить детали эксперимен-
тальных установок, по возможности ограждать их непро-
зрачными экранами, делать специальную покраску или
обработку стен лаборатории.
При использовании лазеров видимого диапазона малой
мощности требуются предупредительные световые табло
или надписи о работе с лазерами. Для непрерывных ла-
зеров мощностью 1—5 мВт желательно выполнение ряда
мер, среди которых защита глаз, работа в специальном
помещении, ограничение пути луча, предупредительные
надписи, обучение операторов и пр. Для лазеров средней
мощности эти меры уже обязательны. При применении
мощных лазеров, кроме перечисленных выше мер, необходимо
контролировать помещение и систему предупреждения,
обеспечивать дистанционное включение, управление ра-
ботой и блокировку питания.
Рекомендуется обучение правилам техники безопасности
и периодическое медицинское обследование персонала,
обслуживающего лазерные установки.
Глава 2
ДИАГНОСТИЧЕСКИЕ МЕТОДЫ, ИСПОЛЬЗУЮЩИЕ
УПРУГОЕ РАССЕЯНИЕ СВЕТА
В данной главе основное внимание уделено методам диаг-
ностики параметров биологических частиц и тканей с по-
мощью исследования угловых и поляризационных харак-
теристик упруго рассеянного излучения. Причем если
исследование угловой зависимости интенсивности рассеян-
ного света (так называемая нефелометрия) имеет длитель-
ную историю и широко применяется в самых различных
областях медицины и биологии [П. 20, 1], то анализ поля-
ризационных эффектов при рассеянии света используется
значительно реже, хотя именно он позволяет получить зна-
чительно больше информации о рассеивающем объекте.
Поэтому в данной главе подробно рассмотрены вопросы ла-
зерной поляризационной нефелометрии, методы автомати-
зированного измерения индикатрис элементов матрицы
рассеяния света и открывающиеся при этом диагностические
возможности. Рассмотрение проведено в основном на при-
мере тканей глаза, в то же время оно позволяет охватить
различные аспекты, касающиеся большинства других сла-
бопоглощающих биологических объектов. Обсуждены так-
же прикладные вопросы использования упругого рассеяния
при анализе концентраций рассеивающих частиц и иммуно-
логических реакций.
2.1 Лазерная нефелометрия
Рассеяние, наряду с поглощением, является основным
процессом, определяющим распространение света в газо-
образных, жидких и твердых телах, в том числе и в биоло-
гических объектах. Методы упругого рассеяния обычно
используют для исследования бактерий, форменных эле-
ментов крови, тканей глаза и т. д. Эти биообъекты харак-
теризуются разнообразием форм (сферы, цилиндры, диски»
4* И
эллипсоиды и пр.) и размеров (0,1—100 мкм). В видимой об-
ласти спектра чаще всего исследуемые частицы, взвешенные
в базовом веществе, имеют малое значение как действи-
тельной части относительного показателя преломления т
(1,02—1,2), так и мнимой части х (10-6—10-2), n=/n+ix
11, 2].
Решение задачи о рассеянии света с учетом формы, мик-
роструктуры, полидисперсности, спектральной зависимости
показателей поглощения отдельной частицы дает теория Ми,
однако это решение достаточно громоздко [3]. В простейшем
случае дифракции плоской электромагнитной волны на од-
нородной сферической частице радиуса а решение Ми для
интенсивности светорассеяния под уголом 0 определяется
выражением
7(0)=/’W(f'1+l’2)’ (2Л)
где /о — интенсивность света, падающего на объект, р=
= (2ла/1), R — расстояние от точки наблюдения до части-
цы, и — коэффициенты Ми, содержащие функции Бес-
селя и полиномы Лежандра, их явный вид приведен в [3].
Поэтому обычно при анализе рассеяния света на «мягких»
частицах, т. е. на частицах с /п«1, удовлетворяющих ус-
.ловию р<^1, используют приближение Рэлея — Ганса, а
при р> 500 — формулы геометрической оптики [4]. В про-
межуточных случаях обычно используют приближение
Хюлста [3], при котором фактор эффективности рассеяния Q,
т. е. коэффициент рассеяния, отнесенный к геометрическо-
му поперечному сечению рассеивающей частицы, опреде-
ляется по формуле
Q = 2—4 (sin х)/х + 4(1 —cos х)/Ха, (2.2)
где x=2p(?n—1).
Итак процесс рассеяния приводит к изменениям в про-
странственном распределении интенсивности света, поэто-
му одной из основных характеристик при изучении свето-
рассеяния является индикатриса, определяющая интен-
сивность света как функцию угла рассеяния. Измерение ин-
дикатрисы рассеяния заключается в освещении объекта
пучком света и регистрации интенсивности рассеянного ве-
ществом света под различными углами. Поэтому основой
нефелометра — прибора для измерения интенсивности рас-
сеянного света — является источник света с малой угловой
расходимостью и приемник излучения с определенным уг-
лом зрения. Благодаря значительной направленности и вы-
52
сокой интенсивности лазерных пучков лазеры оказываются
наиболее подходящими источниками света в этом случае.
В настоящее время разработано довольно много типов
нефелометров. При «рутинных» измерениях обычно исполь-
зуют приборы с фиксированным углом, чаще всего выбира-
ют углы, равные 45 или 90°. Для расширения возможностей
нефелометра, особенно в научных исследованиях с малоизу-
ченными объектами, используют, как правило, приборы с
переменным углом регистрации рассеянного света [5, 61.
В качестве примера применения упругого рассеяния ла-
зерного излучения в диагностических целях рассмотрим ме-
тод измерения деформируемости эритроцитов. Этот метод,
получивший название экмацитометрии, используется для
диагностики ряда заболеваний [7]. При экмацитометрии
лазерный луч пропускают через суспензию эритроцитов,
помещенных между вращающимися прозрачными цилинд-
рами, и наблюдают на экране дифракционную картину,
вид которой зависит от формы эритроцитов. При этом неде-
формированные эритроциты дают картину рассеяния в
виде концентрических окружностей, деформированные —
в виде эллипсов. Если в образцах содержится достаточное
количество недеформированных эритроцитов, то наблюдает-
ся наложение этих картин, и для оценки концентрации
используется так называемый индекс недеформированных
эритроцитов, представляющий собой отношение числа де-
формированных (N) к числу недеформированных (No)
эритроцитов:
In = NIN0 = 1/'(I0-I), (2.3)
где /о, 7 — интенсивности рассеянного излучения на краю
круговой дифракционной картины от покоящихся эритро-
цитов и при действии напряжения сдвига соответственно.
Измерения индекса недеформированных эритроцитов при
анемии плазматических клеток (ПК), наследственном сфе-
розе (НС) показывают увеличение концентрации деформи-
рованных эритроцитов по сравнению с нормальными об-
разцами (НО): ПК — 7Л = 1,3—2,35; НС — 2,7 и НО—
0,7—1,4 17].
Большая работа по применению методов светорассеяния
для определения геометрических параметров отдельных ком-
понентов крови проведена А. Я. Хайруллиной с соавторами
18—10]. В результате был разработан ряд физически обос-
нованных методов исследования крови в условиях, близ-
ких к нативному. В частности, сильная зависимость инди-
катрис рассеяния от размеров эритроцитов, выявленная в
53
диапазонах углов 0,5—35°, позволяет получить функцию
их распределения по размерам. В то же время неровности
поверхности («городчатость») патологических эритроцитов,
с высокой точностью определяются по значительному воз-
растанию интенсивности рассеяния лазерного излучения в.
углах, больших 90°.
Лазерная нефелометрия широко применяется в иммуно-
логии, где она используется для количественной оценки
реакции антиген — антитело и определения концентрации
участвующих в реакции компонентов. В частности, изу-
чено влияние различных факторов (температура, pH сре-
ды, концентрация и др.) на скорость протекания реакции
и образования комплексов антиген — антитело [И, 12].
Проведенное сравнение метода обнаружения реакции ан-
тиген — антитело (система глобулин человека — кроличья
сыворотка против глобулина человека) показало выигрыш
в чувствительности не менее 10 раз по сравнению с тради-
ционными методиками при наличии феномена, отсутствие
последнего позволило получить выигрыш во времени до
24 часов [13, 14]. Метод лазерной нефелометрии белков кро-
ви и мочи является также более чувствительным методом
(в 4—8 раз), чем традиционные методы [15].
Следует отметить, что использование в нефелометрах
лазеров позволило упростить оптические устройства, умень-
шить необходимое количество исследуемого образца, по-
высить чувствительность.
В настоящее время лазерная нефелометрия является од-
ним из наиболее распространенных методов оптического
исследования биологических объектов. Для определения
размеров частиц в диапазоне 0,02—0,2 мкм используются
метод асимметрии индикатрис, который заключается в ре-
гистрации отклонения индикатрисы рассеяния от рэлеев-
ской при увеличении размера частицы; метод полной инди-
катрисы применяется для измерения размеров частиц в
диапазоне 0,1—10 мкм, а метод исследования рассеяния
света на малые углы — для измерения размеров и распре-
деления частиц по размерам в интервале 1—300 мкм [16].
Некоторые из лазерных нефелометров, основанные на этих
методах, будут описаны ниже.
2.2. Лазерная поляризационная нефелометрия
Общие сведения. Распространение света в рассеивающей
и поглощающей среде сопровождается как ослаблением мощ-
ности зондирующего пучка, так и появлением рассеянного
света. Количественно эти явления характеризуются с по-
54
мощью коэффициента поглощения а, сечения рассеяния <т
и индикатрисы рассеяния I (0). Однако эта система является
неполной. В ней не учитываются изменения состояния по-
ляризации при рассеянии.
Наиболее полное упругое рассеяние света отдельными
частицами или ансамблями частиц описывается с помощью
матрицы рассеяния света (МРС) — матрицы Мюллера, каж-
дый из 16 элементов которой является функцией длины вол-
ны, размера, формы и состава частиц 117]. Хотя полная
МРС содержит в себе значительную информацию, свойства
всех ее элементов еще не исследованы в достаточной сте-
пени. Остановимся на поляризационных характеристиках
рассеянного излучения и возможностях их использования
для диагностических целей.
Как известно, биологические объекты имеют весьма слож-
ное строение, и поэтому для описания их свойств необходи-
мо проводить измерения многих параметров, и в то же время
измерения должны производиться достаточно быстро, до
наступления необратимых изменений в объектах in vitro *),
или за время наступления сенсорно-моторной реакции на
объектах in vivo. В связи с этим в основу устройств для ис-
следования угловых и поляризационных характеристик
могут быть положены быстродействующие методы и сред-
ства, используемые в современной эллипсометрии [18].
Однако в связи с ограниченностью априорных знаний об
исследуемых биологических объектах автоматические нуль-
эллипсометры с ячейками Фарадея [19], имеющие большую
точность, высокое быстродействие и значительные перспек-
тивы в эллипсометрии поверхности твердых тел, не могут
быть широко использованы в биологии и медицине. В биоло-
гических исследованиях универсальность метода важна,
даже если это дается ценой некоторых уступок в точности
и быстродействии, т. е. необходимы измерения полной МРС.
Измерения полной МРС сопряжены с определенными
трудностями. Вероятно, простейшим способом измерения
всех элементов МРС является использование оптических
элементов, помещаемых перед и за рассеивающей средой
[2и]. В качестве оптических элементов используются линей-
ные поляризаторы и фазовые пластинки — компенсаторы,
оптические оси которых можно выставлять определенным
образом относительно горизонтальной плоскости. Измеряя
интенсивности света при определенных наборе и положе-
ниях оптических элементов нефелометра, можно определить
*) В пробирке (лат.).
55
все 16 элементов МРС с помощью соответствующих вычисле-
ний [17]. Основным недостатком метода измерения МРС яв-
ляется возможность возникновения больших относитель-
ных погрешностей при измерениях малых интенсивностей,
получаемых в виде разностей больших сигналов.
Поляризационный нефелометр. К настоящему времени
разработано несколько типов поляризационных нефеломет-
ров для измерения МРС, в том числе и основанных на
модуляции поляризации, в которых основным элементом
является поляризационно-оптический модулятор [17]. Рас-
смотрим один из вариантов поляризационного нефелометра,
хорошо себя зарекомендовавшего при исследовании био-
логических тканей [21]. Главным его принципом является
модуляция светового пучка посредством вращения поляри-
зационных элементов вокруг оси луча с последующим фо-
тоэлектронным детектированием сигнала, аналого-цифровым
преобразованием значений фототока и расчетом по получен-
ным данным оптических характеристик объекта с помощью
сопряженной с нефелометром микро-ЭВМ. В установке была
реализована схема с вращающимися компенсаторами, кото-
рая имеет сравнительно простой алгоритм обработки и не-
высокие требования к электронному обеспечению [18]-
Оптическая схема установки для измерения всех 16 эле-
ментов МРС представлена на рис. 2.1. Установка содержит
фиксированные поляризатор Р и анализатор А и две вра-
щающиеся фазовые пластинки F и F', расположенные перед
и за исследуемым объектом. Поляризатор и анализатор
ориентированы параллельно друг другу, и их плоскости
пропускания перпендикулярны плоскости рассеяния; быст-
рые оси фазовых пластинок F и F' составляют с плоскостью
рассеяния углы <р и <р', а вносимые ими разности фаз равны
6 и 6' соответственно. Тогда если S0{/0, Qo, Uo, Vc} — век-
тор-параметр Стокса на входе системы, a S{7, Q, U, У} —
вектор-параметр Стокса на ее выходе, то матричное урав-
нение, связывающее между собой эти векторы, имеет вид
S = 4xF'xAlxfxPxS, (2.4)
где Л, F', М, F, Р — матрицы Мюллера анализатора, фа-
зовой пластинки, расположенной за объектом, самого объек-
та, фазовой пластинки, расположенной перед объектом, и
поляризатора соответственно, явный вид которых можно
найти, например, в [22]. Соотношение скоростей вращения
фазовых пластинок F и F' было выбрано равным 1 : 5, т. е.
ф'=5ср, так как в этом случае однозначно определяются
все 16 элементов МРС [23].
56
Перемножая матрицы Мюллера в уравнении (2.4) и
проводя соответствующие тригонометрические преобразо-
Рис. 2.1. Блок-схема поляризационного нефелометра
вания, можно показать, что интенсивность I на выходе систе-
мы можно представить в виде ряда Фурье:
12
I = а0 + 2 (a2k cos 2£ф + b2k sin 2Лср). (2.5)
Л=1
Коэффициенты ряда могут быть рассчитаны по формулам
дискретного преобразования Фурье:
N N
= 2 7 (ф/)cos 2йф;> b2k = 2 I (ф<)sin 2^Ф/> (2-6)
i=l i=l
если известны / (<рг) — значения интенсивности излучения,
регистрируемые фотодетектором при ориентации быстрой
оси фазовой пластинки под углом <рг к плоскости рассеяния.
Значения коэффициентов Фурье a2h и определяются
параметрами исследуемого объекта и используемых поля-
ризационных устройств. Их явные выражения имеют наи-
более простой вид, если 6=6'=л/2, однако на практике точ-
ное изготовление таких пластинок представляет собой до-
вольно сложную задачу и отклонение реально полученных
значений 6 от я/2 нельзя считать пренебрежимо малым. По-
57
этому обычно используются общие выражения для коэффи-
циентов a2k и Ь2ь, полученные при произвольных 6 и б'. Не»-
трудно показать, что в этом случае элементы МРС исследуе-
мого объекта выражаются через коэффициенты Фурье
и Ь2ь, явный вид которых приведен в 121].
Таким образом, для определения всех 16 элементов МРС
необходимо провести измерения интенсивности / света на
выходе системы при различных угловых положениях фа-
зовых пластинок F и F', причем, как указано выше, ско-
рость вращения фазовой пластинки F' в пять раз больше
скорости вращения пластинки F. Определив затем коэф-
фициенты а2л и Ь2н по формулам (2.6), где N для эффектив-
ной реализации быстрых преобразований Фурье выбрано
равным 256, можно определить элементы МРС М^.
В качестве источника света в поляризационном нефело-
метре [211 используется Не—Ne лазер 1 типа ЛГН-207А
(Х=632,8 нм) (рис. 2.1). На плечах гониометра ГС-5 вместо
коллиматора и зрительной трубы смонтированы оптические
угломерные головки с точностью визуального отсчета углов
поворота Г, по которым можно контролировать углы пово-
роты поляризатора 2, анализатора 3 и компенсаторов 4 и 5.
Вращение угломерных головок поляризационных элементов
осуществляется с помощью шаговых двигателей 11 и 12
соответственно. Управляющие импульсы подаются на ша-
говые двигатели через усилители мощности 14 и 15 посред-
ством устройства сопряжения 10 по команде с микро-ЭВМ 6.
Поворот узла анализатора с дискретностью 4' осуществляет-
ся шаговым двигателем 13 и усилителем мощности 16 по
команде с микро-ЭВМ.
Наибольшая точность и чувствительность при измере-
нии слабых световых потоков может быть достигнута при-
менением метода счета фотонов. Поэтому в качестве фото-
приемника 7 используется ФЭУ-79, имеющий удовлетво-
рительный участок счетной характеристики и малое коли-
чество темновых импульсов. Сигнал с ФЭУ поступает на
амплитудный дискриминатор 8 — пороговое устройство с
усилителем. Дискриминатор частично отсекает шумовые
импульсы с ФЭУ, а также усиливает и стандартизирует сиг-
нальные импульсы. Сигнал постоянной амплитуды с дискри-
минатора, частота которого пропорциональна интенсив-
ности падающего на ФЭУ света, регистрируется частотоме-
ром 9. Взаимодействие всех элементов схемы и микро-ЭВМ
обеспечивается устройством сопряжения 10.
Микро-ЭВМ выдает серию импульсов, которые через
устройство сопряжения поступают нг шаговые двигатели,
58
। при повороте фазовых пластинок на заданный угол изме-
няемый сигнал с ФЭУ регистрируется частотомером. Зна-
чения интенсивности света, регистрируемые частотомером
при заданных угловых положениях фазовых пластинок,
подвергается затем фурье-анализу для определении поля-
ризационных характеристик рассеянного излучения.
Методы калибровки установки достаточно подробно
жисаны в [21]. Оценка аппаратных погрешностей и анализ-
Рис. 2.2. Индикатрисы элементов МРС нормального (а) и мутного
(о) хрусталиков глаза человека
соответствующих искажений, вносимых нефелометром в
структуру и угловые зависимости компонентов МРС, про-
веденные с помощью экспериментов на суспензиях поли-
стироловых латексов, показали, что наибольшие отклоне-
ния значений элементов матрицы от теоретических значений
59
не превышают 3 %, а для компонентов четвертой строки и
четвертого столбца — 5 %.
Матрицы рассеяния света прозрачного и мутного хрус-
таликов. Измерения МРС проводились на интактных хрус-'
таликах трупных глаз человека, причем время после смерти
до начала измерений в среднем не превышало 8 часов. Мут-'
ные хрусталики были получены непосредственно после опе-
раций по поводу катаракты. Проведенные исследования по-
казали, что наблюдается хорошая воспроизводимость ре-
зультатов измерений, выполненных с интервалом времени
не более 2 часов, при этом ошибка определения любого мат-
ричного элемента не превышает аппаратурной погрешности.
Индивидуальные различия прозрачных хрусталиков на-
ходятся в пределах 5—10 %, в то время как вариации
свойств мутных хрусталиков выражены более заметно, что
объясняется различной степенью зрелости катаракты.
Измерения угловых зависимостей элементов МРС проз-
рачного и мутного (зрелая ядерная катаракта) хрусталиков
глаза проводились в диапазоне углов от 20 до 140°. На
рис. 2.2 представлены результаты соответствующих изме-
рений. Анализ всех компонентов МРС различных хрустали-
ков показывает, что с точностью до погрешностей измерений
приведенная МРС (т. е. все элементы МРС нормированы на
первый элемент) имеет следующую структуру:
“1 М12 A*is 0 -
М12 ^22 М23 0 (2.7)
^13 ТИгз M33 М34
<-0 0 -М34 ^44-
При этом различия элементов М33 и Мм не превышают 10 %.
Наличие ненулевых значений элементов Л413 и УИ23 свиде-
тельствует о том, что рассеивающим частицам хрусталика
свойствен отличный от нуля коэффициент перекрестной
поляризации [17]. Возможным объяснением этого может
быть оптическая активность вещества хрусталика или, что
более вероятно, рассеяние на структурах хрусталика, оси
симметрии которых наклонены к плоскости симметрии.
Сглаженный характер всех полученных кривых объясня-
ется полидисперсностью рассеивающих частиц. Отметим,
что во всем диапазоне углов элементы МРС прозрачного
хрусталика удовлетворяют неравенству
М > Мг12 + Л433 + М2з4, (2.8)
справедливому для скопления сферических частиц, неодно-
родных по размеру или составу [24].
60
Как видно из рис. 2.2, угловые характеристики МРС мут-
ного хрусталика существенно изменены по сравнению с
прозрачным хрусталиком. Значения элементов Afi2 и М21,
оставаясь отрицательными, уменьшаются по абсолютной
величине, и точка экстремума смещается в сторону больших
углов рассеяния. Характер угловой зависимости элемента
М22 указывает на появление в среде крупных несферических
рассеивающих частиц. Частицы крупных размеров обус-
ловливают и смещение точки пересечения кривой Л4з3 с
осью абсцисс в сторону углов, больших 100°. Следует так-
же заметить, что при малых углах рассеяния (<20°) мат-
ричные элементы мутного хрусталика не удовлетворяют не-
равенству (2.8).
Для сравнения рассеивающих свойств локальных участ-
ков хрусталиков были проведены измерения МРС при пере-
мещении его вдоль луча для нескольких фиксированных
углов рассеяния. При этом визируемый объем смещался
па 4 мм в обе стороны от центра. Было получено, что сме-
щение хрусталика в пределах ±2 мм не приводит к замет-
ным изменениям элементов МРС. Это свидетельствует об'
однородности рассеивающих свойств в пределах ядра хрус-
талика, что позволяет проводить измерения МРС на объек-
тах in vivo, не накладывая жестких ограничений на ста-
бильность положения хрусталика глаза.
Таким образом, проведенные исследования показывают,
что элементы МРС прозрачного и катарактального хруста-
ликов имеют ярко выраженные различия по абсолютному
значению и их угловым зависимостям. Однако для ранней
диагностики катаракты необходимы исследования МРС на
всех стадиях зарождения и развития катаракты. В связи с
этим на животных изучались характерные изменения эле-
ментов МРС в зависимости от степени помутнения хруста-
лика. Хрусталики с разной степенью помутнений получали
от кроликов, которые подвергались ежедневным затравкам
нафталина в течение 5 суток (1,5 грамма нафталина на 1 кг
массы животного в сутки) [25]. Сравнение результатов для
нормальных хрусталиков глаза кроликов и человека свиде-
тельствует о почти полном совпадении их рассеивающих
свойств. Это соответствует выводам, полученным на осно-
вании биохимических исследований, о большой специфич-
ности органа и малой специфичности вида для состава и
строения хрусталика [26].
На рис. 2.3 представлены угловые зависимости элемен-
тов МРС хрусталиков кроликов, подвергавшихся затрав-
кам нафталина в течение 2 и 5 суток соответственно. Тра-
61<
диционные методы клинических исследований не позволи-
ли в этом случае диагностировать наличие помутнений, в
то время как в угловых зависимостях элементов МРС от-
четливо прослеживаются отличия от соответствующих ха-
рактеристик прозрачного хрусталика. После 5 суток затрави
ки в большинстве случаев наблюдалось выраженное помут*
нение хрусталика. Качественное изменение характеристик
Рис. 2.3. Индикатрисы элементов МРС хрусталика глаза кролика
при сроке нафталиновой затравки 2 суток (а) и 5 суток (б)
рассеяния сходно с соответствующей картиной для зрелой
катаракты глаза человека, однако имеется ряд отличий,
связанных с тем, что нафталиновая катаракта моделирует
несколько иной типа катаракты, чем бурая ядерная ката-
ракта [27].
62
Выявление элементов МРС, наиболее чувствительных к
конкретным изменениям параметров рассеивающей среды,
является основной задачей интерпретации эксперименталь-
ных результатов светорассеяния [17]. Такими критериями
могут быть значения углов рассеяния, при которых индикат-
рисы того или иного элемента МРС пересекают нулевую
линию. Состояние среды может также характеризовать-
ся экстремальным значением некоторых элементов
МРС или их относительным соотношением. Подробный ана-
лиз характера изменений элементов МРС приведен в [21].
Следует только подчеркнуть, что срок затравки не может
однозначно характеризовать степень помутнения. Послед-
няя зависит от целого ряда факторов, таких как общее со-
стояние организма животного, индивидуальные особенно-
сти его тканей и даже особенности поведения.
Однако наблюдается общая тенденция развития помут-
нения по мере увеличения сроков затравки. На основании
закономерностей поведения элементов МРС можно заклю-
чить, что на ранней стадии развития помутнений увеличе-
ние размеров рассеивателей незначительно сказывается на
характеристиках светорассеяния. Возможно, процесс раз-
вития помутнений начинается с незначительного увеличе-
ния размеров большого числа рассеивателей или с появле-
нием крупных рассеивателей, слабо меняющих поляриза-
ционные характеристики рассеянного света. Это приводит
к нарушению в расположении частиц нормального хруста-
лика. Следует также заметить, что нафталиновая катарак-
та — это модель, хотя и не полно описывающая бурую ядер-
ную катаракту. Очевидно, в каждом конкретном случае
характеристики меняются в зависимости от этиологии по-
мутнения среды.
Поляризационные характеристики роговой оболочки гла-
за. Наиболее полно из всех оптических сред глаза изучены
свойства его роговой оболочки. Первоначально для объясне-
ния высокой прозрачности роговицы было предложено, что
рассеивающие свет коллагеновые волокна стромального
слоя роговицы, окруженные базовым веществом, разме-
щаются в узлах «идеальной решетки» [28]. Однако иссле-
дования строения роговой оболочки, проведенные с помо-
щью электронного микроскопа, показали наличие неупоря-
доченности в расположении волокон. Согласно модели Хар-
та — Фарреля (ХФ), в расположении коллагеновых во-
локон роговицы существует упорядоченность ближнего
порядка, описываемая функцией радиального распределе-
ния g(R), представляющей собой отношение локальной
плотности к средней плотности центров волокон в зависи-
мости от расстояния между волокнами [29]. Такая упо-
рядоченность в расположении центров волокон обусловлена
макромолекулами базового вещества, образующими мос-
тики между волокнами [30].
Модель ХФ позволила объяснить гидрофильные свой-
ства роговичной стромы [31], потерю прозрачности при по-
явлении в роговице участков, лишенных коллагеновых
волокон [32], и некоторые другие свойства роговицы. На
основании модели ХФ было объяснено также появление
картин рассеяния света под малыми углами на объектах
in vivo, получены выражения для поляризационных и уг-
ловых зависимостей оптических свойств роговицы [33—35].
Мягкость рассеивающих частиц роговицы позволяет при
расчетах рассеяния пренебречь явлениями многократного
рассеяния. Далее, считая, что прямо прошедшее излучение
• совпадает с ослабленной когерентной составляющей [21],
можно определить коэффициент ослабления, проинтегриро-
вав интенсивность расеянного по всем направлениям света
Рис. 2.4. Спектры пропускания ро-
говой оболочки глаза при нормаль-
ном падении света: 1 — вертикаль-
ная поляризация, 2 — горизонталь-
ная поляризация, 3 — неполяризо-
ванный свет, 4 —экспериментальные
данные для неполяризованного света
из[36]
с, учетом интерференции волн от отдельных волокон. Пос-
леднее описывается статистически с помощью упоминавшей-
ся выше функции радиального распределения g(R). Ха-
рактеристики светорассеяния отдельного волокна рассчи-
тываются с использованием хорошо разработанных методов
расчета, развитых для длинных цилиндров, причем наибо-
лее точного соответствия результатов расчета с эксперимен-
том удается достичь с помощью теории Ми [17].
"64
На рис. 2.4 представлены результаты расчета спектров
пропускания роговицы в диапазоне длин волн от 200 до
800 нм при нормальном падении световых пучков, поляри-
зованных параллельно (/) и перпендикулярно (2) направле-
нию осей коллагеновых волокон, а также приведены спектр
пропускания неполяризованного света (5) и эксперименталь-
ный спектр (4) из 136]. Следует сразу заметить, что резкое
уменьшение пропускания, наблюдаемое экспериментально
при 400 нм, вызывается рассеянием света, а не поглощением.
Увеличение или уменьшение упорядоченности в расположе-
нии волокон роговицы должно привести к смещению ниж-
ней границы спектра пропускания влево или вправо соот-
ветственно. В пользу этого утверждения говорит тот факт,
чго у людей с нарушенной упорядоченностью волокон (на-
пример, после операции кератомии) ухудшается сумеречное
зрение [37], которое в соответствии с эффектом Пуркинье
осуществляется в коротковолновой области спектра.
Из рис. 2.4 видно, что при Х=632,8 нм разница в про-
пускании света двух ортогональных поляризаций Д/=
= (/j.—/ц)//0 (где /и, /д_ — интенсивности прошедшего ро-
говицу света, поляризованного параллельно и перпенди-
кулярно направлению волокон соответственно, 1п — ин-
тенсивность падающего на роговицу света) составляет приб-
лизительно 15 %, что подтверждено экспериментально [38].
В видимой области спектра величина Д/ линейно убывает
с ростом длины волны от 25 % при Х=400 нм до 11 % при
7=700 нм, т. е. в коротковолновой области спектра поляри-
зационная чувствительность роговицы в 2,5 раза выше, чем
в длинноволновой. Возможно, этим объясняется тот факт, что
энтоптическое явление «щеток» Гайдингера наблюдается
именно в сине-зеленой области спектра.
Исследование свойств роговой оболочки глаза представ-
ляет интерес как в связи с необходимостью определения
структуры самой роговицы, так и потому, что ее характе-
ристики оказывают существенное влияние на результаты
измерения параметров внутренних структур глаза в усло-
виях in vivo, особенно поляризационные характеристики
локальных участков роговицы. Очевидно, особый интерес
представляют измерения МРС роговой оболочки в прямом
направлении, так как именно эти характеристики необхо-
димы дл/Т введения соответствующих поправок при измере-
ниях параметров рассеяния внутренних структур глаза.
Эксперименты проводились на роговицах энуклеирован-
ных глаз кролика и роговицах трупных глаз человека, при-
чем время до начала эксперимента обычно не превышало
5 А. В. Приезжее 6$
30 минут и 8 часов соответственно. Выделенные роговицы
закреплялись в специальной кювете, позволяющей ими-
тировать нормальное внутриглазное давление. Тем самым
исключались искажения за счет дополнительных напряже-
ний при фиксации.
Диаметр облучающего пучка света, определяющий раз-<
мер исследуемого локального участка роговицы, составлял
не более 0,2 мм. Каждому участку роговой оболочки соот-
ветствует значение координат согласно схеме, при которой
точке с координатой (12,3) соответствует точка роговицы,
расположенная в вертикальной плоскости на расстоянии
3 мм выше центра, точка (3,1) расположена в горизонталь-
ной плоскости на расстоянии 1 мм правее центра и т. п.
Роговица устанавливалась таким образом, чтобы ее пе-
редняя поверхность была перпендикулярна падающему
Таблица 2.1
Значения элементов МРС роговой оболочки глаза человека
Координа- ты точек роговицы Af12 м1я Л/ 22 М2з М 24 Л1зз М,4 Л144
угловые радиаль- ные
3 1 0,01 0,00 0,99 0,00 0,07 0,99 —0,12 0,98
3 2 0,00 —0,05 0,88 —0,02 0,47 0,99 0,08 0,87
3 3 0,05 —0,09 0,56 —0,23 0,78 0,87 0,41 0,44
6 1 —0,04 0,04 0,62 —0,36 0,69 0,64 0,66 0,26
6 2 0,01 0,00 0,98 0,05 0,15 0,77 —0,63 0,75
6 3 0,02 0,03 0,73 0,17 0,05 0,87 —0,44 0,61
9 1 0,01 0,03 0,79 0,08 -0,59 0,96 0,24 0,76
9 2 0,08 0,00 0,99 0,00 0,00 0,49 0,86 0,49
9 3 0,09 —0,06 0,67 —0,44 0,59 0,39 0,80 0,07
12 1 0,00 —0,03 0,75 0,00 0,65 0.99 0,02 0,75
12 2 0,02 —0,01 0,89 —0,15 0,41 0,76 0,62 0,65
12 3 0,04 0,00 0,99 -0,05 0,11 0,58 0,80 0,58
лучу, и измерялись МРС роговой оболочки в направлении
вперед. Результаты измерений для роговой оболочки глаза
человека представлены в табл. 2.1. Аналогичные результа-
ты представлены в табл. 2.2 для участков роговой оболочки
глаза кролика, расположенных вдоль горизонтального
меридиана.
66
Необходимость ориентации поверхности роговицы нор-
мально к падающему лучу приводит к тому, что измеряемый
участок располагается на горизонтальной линии, проходя-
щей через центр роговицы. Поэтому при использовании дан-
ных табл. 2.1 необходимо учитывать, что матрицы всех
Таблица 2.2
Значения элементов МРС роговой оболочки глаза кролика
Координа-' ты точек роговицы Mlt м1в м„ Мм м„ Мм । Мм ।
угловые радиаль- ные
3 1 0,07 —0,07 0,99 0,00 —0,09 0,99 —0,09 0,98
3 2 —0,01 —0,02 0,98 0,00 0,14 0,99 —0,08 0,98
3 3 —0,02 —0,02 0,99 0,00 0,10 0,99 —0,12 0,98
9 1 0,03 —0,03 0,99 0,00 —0,11 0,99 —0,12 0,98
9 2 0,01 0,02 0,98 0,00 0,17 0,99 —0,09 0,97
9 3 0,01 0,01 0,91 0,12 0,37 0,79 —0,59 0,71
участков, кроме расположенных вдоль меридиана 3—9 ча-
сов, повернуты на угол, пропорциональный угловой коор-
динате данного участка. В табл. 2.1 приведены значения,
усредненные для 10 объектов. Индивидуальные различия
роговиц и разное время хранения приводят к разбросу' из-
меренных значений, в 2—3 раза превышающему погреш-
ность эксперимента. Тем не менее для каждой отдельной
роговицы в пределах погрешности эксперимента выполня-
ются соотношения симметрии, справедливые для неидеаль-
ной фазовой пластинки, т. е. М12=М21, Afi3=M3i, М23=
= Л433, Л434 =-ЛЦг, Л134=-^43> ^И14 = Л^41Л?0.
Общей закономерностью для всех роговиц является
также наличие более выраженных анизотропных свойств на
периферических участках вдоль вертикального и горизон-
тального меридианов для человека и по линии от уха к
носу для кролика. Центр роговицы представляет собой прак-
тически изотропную пластинку. Локальные оптические оси,
Рассчитанные для эквивалентных фазовых пластинок с уче-
том поправок на угол поворота, имеют тенденцию к ради-
альной симметрии. Дихроизм роговой оболочки максимален
на периферических участках 3 и 9 часов.
5* 67
Методы диагностики катаракты. Для решения задач
диагностики в офтальмологии необходимо построение адек-
ватных моделей прозрачных сред глаза. Поэтому скажем
несколько слов о поляризационных свойствах таких сред,
как водянистая влага и стекловидное тело. Водянистая
влага — прозрачная бесцветная жидкость с показателем
преломления около 1,33 содержит соли, следы белка, ас-
корбиновую кислоту [39]. Стекловидное тело представляет
собой гелеобразную среду, по химическому составу сход-
ную с водянистой влагой. На долю воды приходится 99 %
всего состава стекловидного тела, гелеобразную структуру
ему придают содержащиеся в нем белки [39].
Общая структура МРС водянистой влаги соответствует
матрице изотропной среды, она является практически про-
зрачной средой, незначительное рассеяние света происхо-
дит на растворенных в ней компонентах органического про-
исхождения. Полная интенсивность рассеянного света не
превышает 1,5—2,0 %, и водянистая влага не меняет поля-
ризационные характеристики прошедшего через нее излу-
чения. МРС же стекловидного тела по своим характерис-
тикам близка к матрице прозрачного хрусталика, однако
рассеивающие частицы стекловидного тела несколько круп-
нее и их показатель преломления меньше. И кроме того,
наличие ненулевых членов в левом верхнем и правом
верхнем углах матрицы указывает на аморфное строение
объекта.
Таким образом, водянистая влага и стекловидное тело
практически не изменяют поляризационных характеристик
прямо прошедшего излучения, и, следовательно, их влия-
нием на результаты измерений объектов in vivo можно пре-
небречь.
Как уже отмечалось выше, измерения угловых зависи-
мостей элементов МРС оптических сред глаза проводились
при нормировании всех элементов МРС на значение эле-
мента Л4ц. Однако при этом может быть потеряна информа-
ция о структуре среды, обусловленная высокой концент-
рацией рассеивающих частиц исследуемых тканей [40].
Ниже представлены результаты измерений индикатрис рас-
сеяния оптических сред глаза, проведенные при постоян-
ном значении интенсивности падающего света.
Измерения проведены при горизонтальной и вертикаль-
ной ориентации поляризации падающего света. Соответст-
вующие результаты для прозрачного и мутного хрустали-
ков, а также для стекловидного тела представлены на
рис. 2.5. Видно, что индикатрисы различных сред мало от-
68
дпчаются друг от друга, однако следует учитывать, что каж-
дая из них нормирована к единице при угле рассеяния,
равном 90°. Таким образом, представленные индикатрисы
не позволяют сравнить значения интенсивности рассеян-
ного в данном направлении света каждой из сред и эти кри-
вые характеризуют только относительное угловое распре-
деление интенсивности рассеянного излучения. В качестве
Рис. 2.5. Индикатрисы рассеяния нормального хрусталика (л),
катарактального хрусталика (б), стекловидного тела (в): 1 — вер-
тикальная поляризация, 2 — горизонтальная поляризация
примера абсолютных различий можно отметить, что зна-
чения интенсивности света, рассеянного прозрачным и
мутным хрусталиками под углом 90°, относятся как 1:5.
Как показывают расчеты [21], эффекты несферичности
формы реальных рассеивателей проявляются незначитель-
но. Следует также заметить, что для прозрачного хруста-
лика в области углов рассеяния, меньших 30°, наблюдаются
отличия экспериментальных значений от расчетных. Эти
различия вызваны, по-видимому, интерференционными яв-
лениями, возникающими вследствие высокой концентрации
рассеивающих частиц, поскольку, как показано в [40],
высокая концентрация частиц приводит к возникновению
упорядоченности в их расположении и к появлению интер-
69
ференции волн, рассеянных отдельными частицами. Соглас-
но результатам расчетов [41] и экспериментов с модельными
средами [42], интерференция света, рассеянного в среде с
высокой концентрацией рассеивающих частиц, приводит к
уменьшению полной энергии рассеянного излучения и уве-
личению коэффициента направленного пропускания све-
та. Именно это имеет место в случае нормального хрустали-
ка и обусловливает его высокую прозрачность.
Развитие помутнений хрусталика обусловлено образо-.
ванием рассеивающих частиц, размеры которых изменяются
в широких пределах. Поэтому, даже при относительно плот-
ной упаковке, упорядоченное расположение рассеивающих
частиц мутного хрусталика невозможно. Это подтвержда-
ется отсутствием осцилляций па индикатрисе рассеяния
мутного хрусталика в отличие от прозрачного. Неупоря-
доченное расположение частиц мутного хрусталика при-
водит к увеличению энергии рассеянного излучения. Кро-
ме того, рассеивающие частицы мутного хрусталика имеют
более крупные размеры, что увеличивает асимметрию ин-
дикатрисы рассеяния, т. е. возрастает доля интенсивности
излучения, рассеянного под углом, меньшим 90°.
Сглаженный характер индикатрисы стекловидного тела,
показанной на рис. 2.5, свидетельствует об отсутствии ин-
терференционных эффектов в данной среде. Это связано,
вероятно, с тем, что плотность основных рассеивателей стек-
ловидного тела значительно ниже плотности рассеивающих
частиц прозрачного хрусталика; расстояние между рассеи-
вающими центрами в этом случае значительно превосходит
их диаметр, поэтому упорядоченность в их расположении не
наблюдается. Общий вид угловой зависимости индикатрисы
аналогичен индикатрисе прозрачного хрусталика, однако
теоретически он моделируется более мягкими частицами
(что подтверждается данными биохимических исследований
139]).
Рассмотрим модель хрусталика из сферических частиц и
проанализируем, какую информацию о строении объекта
можно получить на ее основе. Будем считать, чго элемент
объема хрусталика освещается параллельным световым пуч-
ком, многократное рассеяние отсутствует. Очевидно, слож-
ность строения хрусталика, как и любой биологической
ткани, обусловливает наличие совокупности рассеивающих
частиц, различающихся как размерами, так и оптическими
константами. Значения элементов МРС систем полидисперс-
ных частиц определяются соответствующими суммами, при-
чем каждое слагаемое входит с определенным весовым мно-
70
жителем, зависящим от концентрации частиц в каждом
диапазоне размеров и оптических констант. Ткани хруста-
лика не обнаруживают пиков поглощения в видимой об-
ласти [П. 231, поэтому оптические характеристики рассеи-
вающих частиц хрусталика определяются в основном дей-
ствительной частью относительного показателя преломле-
ния т.
Численный расчет значений соответствующих элементов
.МРС может быть проведен согласно [43]; в результате по-
лучим
J J f (а, т) Л4,у(0, a, mjdtnda. (2.9)
mmin amin
Уравнение (2.9) является линейным интегральным уравне-
нием Фредгольма первого рода. Функция f(a, tri) — функ-
ция концентрации частиц в единице объема при единичном
приращении радиуса а и показателя преломления tn, amin
11 flmax — граничные радиусы рассеивающих частиц, mmln
и mmax — граничные значения относительного показателя
преломления. Ядро этого уравнения Л4г;(0, а, tri) представ-
ляет собой элемент МРС для отдельной частицы радиуса а.
Размер частиц исследуемых тканей глаза сравним с дли-
ной волны в видимой области, поэтому использование раз-
личных упрощающих предположений при расчете рассея-
ния на отдельной частице приводит к большим погрешно-
стям и строгое решение должно проводиться в рамках
теории Ми. Задача диагностики параметров исследуемой
ткани состоит в определении вида функции f(a, т).
В такой полной постановке обращение уравнения (2.9)
вызывает большие трудности. Использование дополнитель-
ных условий и ограничений, полученных на основе других
методов исследований, позволяет упростить решение об-
ратной задачи.
В качестве таких дополнительных условий можно ис-
пользовать оценки размеров частиц, полученные с помощью
электронной микроскопии и других методов [44]. Резуль-
таты биохимических исследований свидетельствуют, что
диапазон изменения относительного показателя преломле-
ния белков достаточно узок. В целях упрощения задачи
ограничим вид функции f (а, tri) гамма-распределением по
размерам при каждом фиксированном значении т:
f(a, tri) = a'lexp(—ра/аа), (2.10)
71
где а0 — наиболее вероятный радиус частицы, параметр ц
определяется из соотношения Да/а0=2,35/Ир, Да — полу,
ширина f(a, т) [1.4]. Такой вид распределения получил ши-
рокое распространение при описании свойств рассеиваю-
щих частиц органического происхождения [45]. Существен-
ной особенностью гамма-распределения является его не-
симметричный вид, что позволяет учесть вклад не только
от отдельных частиц, но и от более крупных конгломера-
тов этих частиц, образующихся в биологических средах.
Частицы прозрачного хрусталика имеют очень узкое рас-
пределение по размерам, которое целесообразно модели-
ровать нормальным распределением [21].
Ограничения, накладываемые на вид функции f(a, tri),
позволяют определить значения параметров гамма-распре-
деления р, а0 и значение относительного показателя пре-
ломления т основной фракции рассеивающих частиц. Для
этого рассчитывается набор индикатрис элементов МРС мо-
дельных систем и определяются значения параметров р,
а0 и т, при которых расчетные кривые наилучшим образом
совпадают с экспериментально полученными индикатриса-
ми элементов МРС реального объекта. Моделируя рассеи-
вающие центры хрусталика системой сферических частиц,
можно использовать для анализа только индикатрисы эле-
ментов Mi2(M2i), Л433 (Л444) и Л434(Л443). Значения осталь-
ных элементов МРС обусловлены несферичностью рассеи-
вающих частиц.
Численные расчеты проводились в рамках теории Ми,
по алгоритму, предложенному в [17]. Как показывают ре-
зультаты расчетов [21], экспериментальные индикатрисы
элементов МРС прозрачного хрусталика достаточно хорошо
соответствуют кривым, полученным в предположении нор-
мального распределения рассеивающих частиц, вида [1, 17]:
/(а) = “7^"ехр (2л1)
У 2л о о J
при /0=1,03, ао=250 нм и о0=20 нм. Эти значения следу-
ет считать приближенной оценкой наиболее вероятного ра-
диуса рассеивающих частиц хрусталика, и, кроме того, они
подтверждают, что распределение по размерам имеет не-
большую ширину, так что в первом приближении рассеи-
вающие частицы прозрачного хрусталика можно считать
однородными по размеру. Для мутного хрусталика наилуч-
шего соответствия расчетных и экспериментальных кривых
удается достичь при условии, что f(a, tri) описывается выра-
жением (2.10) со следующими параметрами: р=20, а<>=
72
==1700 нм. Относительный показатель преломления в дан-
ном случае равен 1,07.
Следует заметить, что при наличии значительных по-
мутнений кривую /(а, т) можно считать одновершинной,
так как относительное значение вклада крупных частиц в
интенсивность рассеянного излучения значительно превы-
шает вклад фракции с размерами около 600 нм. Использо-
вание при расчетах двухвершинной кривой требуется толь-
ко в тех случаях, когда общая потеря прозрачности не пре-
вышает 20 %.
Указанные выше параметры рассеивающих частиц соот-
ветствуют двум предельным случаям: прозрачного и мутно-
го хрусталика. Проследить детали помутнения в рамках
указанной модели не представляется возможным, так как
эти детали затушевываются эффектами несферичности.
Тем не менее проведенные оценки позволяют сделать опре-
деленные выводы.
На ранних стадиях помутнения экспериментальные ха-
рактеристики удовлетворительно моделируются система-
ми сферических частиц с постоянным относительным пока-
зателем преломления. Функция распределения по разме-
рам в данном случае представляет собой двухвершинную
.0 1 2 ъ ajfKM
Рис. 2.6. Кривые распределения по размерам сферических частиц,
моделирующих поляризационные характеристики хрусталиков гла-
за кролика с различной степенью помутнения (номер кривой со-
ответствует сроку нафталиновой затравки в сутках)
кривую, причем положение первой вершины остается неиз-
менным и соответствует 250 нм, а положение второй вер-
шины смещается в пределах от 700 до 1300 нм по мере умень-
шения прозрачности. Одновременно с этим наблюдается
увеличение относительной доли крупнодисперсной фракции.
При интерпретации экспериментальных результатов,
полученных для поздних стадий помутнения, необходимо
учитывать постепенное увеличение относительного показа-
теля преломления от 1,03 до 1,07. Вклад в характеристики
рассеяния мелкодисперсной фракции становится прене-
73
брежимо малым и при расчетах его можно не учитывать.
Наиболее вероятный радиус частиц крупнодисперсной фрак*
ции увеличивается до 1700 нм.
На рис. 2.6 показаны кривые распределения по разме-
рам частиц крупнодисперсной фракции, найденные подбо-
ром параметров системы сферических рассеивателей таким
образом, чюбы рассчитанные поляризационные характе-
ристики наиболее полно соответствовали эксперименталь-
ным результатам, полученным для хрусталиков глаз кроли-
ков с различными сроками нафталиновой затравки. Из ри-
сунка видно, что на ранних (/, 2) и средних (3) стадиях про-
цесса помутнений изменения претерпевают как положение
максимума кривой распределения, так и ширина распреде-
ления частиц по размерам. Изменение поляризационных
характеристик на поздних стадиях развития процесса по-
мутнения становится менее выраженным. На основании это-
го можно заключить, что в данном случае рост интенсивно-
сти рассеяния обусловлен увеличением числа рассеивающих
частиц крупной фракции при слабо меняющихся харак-
теристиках распределения.
Исследования форменных элементов крови. Методы поля-
ризационной нефелометрии используются и для исследо-
вания форменных элементов крови (ФЭК)—эритроцитов,
лейкоцитов и тромбоцитов. Нормальный эритроцит в плаз-
ме имеет форму двояковогнутого диска диаметром 7,1—
9,2 мкм, толщиной в центре 0,9—1,2 мкм и по краю — 1,7—
2,4 мкм. Действительная часть показателя преломления от-
носительно плазмы т= 1,041—1,067 (А.=600 нм) [2], мни-
мая часть показателя преломления изменяется в пределах
10"8—10-5 (А.=350—1000 нм) 11]. Лейкоциты имеют форму
сфер диаметрами 8—22 мкм [40], а тромбоциты — тонких
дисков диаметрами 2—4 мкм. Оптические параметры тром-
боцитов и лейкоцитов мало изучены, однако их относят к
слабопоглощающим мягким частицам (для областей длин
волн, больших 600 нм).
Из представленных в 146] результатов измерений инди-
катрис МРС нормальных и сферулированных эритроцитов
видно, что максимальные различия между рассеивающими
характеристиками двух форм для компонента THi2 дости-
гают 0,12, для Л422— 0,17, Л433— 0,20. Таким образом,
изучение МРС позволяет проследить влияние деформации
рассеивающих частиц (особенно это справедливо в области
углов рассеяния, больших 90°).
В работе [47] на основании исследования угловой структу-
ры ненулевых компонентов МРС описана методика определе-
74
ния действительной части показателя преломления ФЭК.
Отмечается, что описанная методика пригодна как для
гамма-, так и нормального распределений частиц полидис-
персных сред, причем не требуются данные о концентрации
частиц, а необходимым является лишь соблюдение условия
однократного рассеяния. Методика определения действитель-
ной части показателя преломления т сводится к определе-
нию угла рассеяния, при котором элемент МРС в диапазо-
не 80—120° равен нулю, и далее по номограммам, приве-
денным в [47], определяется показатель преломления т
(если т лежит в диапазоне 1,02—1,07). Если же элемент
не равен нулю в диапазоне углов 80—120°, то, значит,
•п>1,07, и необходимо определить угол рассеяния, при
котором компонент Л13, также равен нулю.
Следует заметить, что проведенная апробация разрабо-
танной методики на тканях глаза, показала ее перспектив-
ность и высокую чувствительность для экспрессного опреде-
ления действительной части относительного показателя пре-
ломления рассеивающих частиц катарактального и нор-
мального хрусталиков глаза.
2.3. Индикатор иммунологических реакций
Одной из важных медицинских проблем является повы-
шение надежности диагностических методов, основанных на
явлении специфического взаимодействия антигенов и анти-
тел. Как известно, широкое распространение в практической
иммунологии получили методы, основанные на контакте
препаратов антигенов и антител, и наблюдения тем или
иным способом образовавшихся комплексов антиген — ан-
титело. Однако традиционные методы обнаружения имму-
нологической реакции требуют значительного времени и
большого расхода исходных компонентов, что зачастую не-
приемлемо. Поэтому был разработан лазерный индикатор
иммунологических реакций, основанный на измерении ин-
тегральной интенсивности рассеянного света [48]. В при-
боре последовательно измеряется интенсивность рассеянно-
го под углом 90° света от пробирок с суспензиями антиге-
на, антител и со смесью антиген — антитело, полученной
слиянием содержимого первой и второй пробирок. При-
нято, что реакция антиген — антитело произошла, если
величина
К=10(/1+/!)//,
75
лежит в интервале 0—8, где 71( /2, /3 — интенсивности рас-
сеянного света антигена, антитела и смеси антиген — ан-
титело соответственно.
Для проведения массовых эпидемиологических обсле-
дований был разработан лазерный (Х=632,8 нм) индикатор
иммунологических реакций ИРЛ-010 с углом наблюдения
рассеянного света, равным 90° [49]. В приборе предусмотре-
на работа в двух режимах — кинетическом и сравнения,
используемых для регистрации реакций с различными ско-
ростями. При временах реакций до 6 минут применяется ки-
нетический режим, при котором индикатор ИРЛ-010 из-
меряет интенсивность через заданный интервал времени
(15 или 30 с) и сравнивает ее с первоначальной интенсив-
ностью. Регистрация реакции происходит при превышении
интенсивности над исходной более чем на 50 %, в против-
ном случае после проведения 11 измерений фиксируется
отсутствие реакции. Для более медленных реакций исполь-
зуется режим сравнения, при котором предварительно осу-
ществляется измерение интенсивности рассеянного света от
каждого из компонент, их сложение и запоминание. Про-
верку условия наличия реакции производят через необхо-
димое время.
Индикатор ИРЛ-010 состоит из оптико-механического
блока и блока наблюдения и управления. Предусмотрено
управление по жесткой программе микронасосом для взя-
тия пробы, запись информации, промывка измерительной
кюветы. Объем исследуемых суспензий 80 мкл. Прибор пред-
назначен для использования в санитарно-эпидемиологиче-
ской службе, судебно-медицинской экспертизе и клинико-
диагностических лабораториях медицинских учреждений.
2.4. Проточные анализаторы микрочастиц
Общие сведения. В лабораторно-диагностической прак-
тике при работе с биологическими жидкостями, содержа-
щими частицы неорганического или органического проис-
хождения, исследователей обычно в первую очередь инте-
ресуют концентрация, состав и размеры частиц. Эти воп-
росы, как правило, возникают при анализе крови, семенной
жидкости, осадков мочи и т. п. К медицинскому анализа-
тору микрочастиц предъявляются специфические требова-
ния, основные из которых — малый объем пробы, высокие
концентрации и полидисперсность размеров анализируемых
частиц. В настоящее время выпускается значительное чис-
ло приборов для определения концентрации микрочастиц в
76
жидкостях [П. 48, 50]. Однако приборов, пригодных для
применения в медицинской практике, известно сравнитель-
но немного.
Оптические методы исследования биологических жидко-
стей могут основываться на явлениях дифракции, ослаб-
ления света, на основе изображающей техники и др. Чаще
всего на основе ослабления света строятся анализаторы,
существенные достоинства которых — широкий диапазон
регистрируемых размеров, отсутствие предваритель-
ной обработки изучаемой пробы. Для этого определя-
ется отклик фотоприемника, регистрирующего микро-
частицы по интенсивности светорассеяния, с учетом
углов сходимости падающего и приемного световых
пучков. В зависимости от значения угла наблюдения 0
реализуются различные способы измерений: при 0=0°
говорят о фотометрических методах исследования,
если углы наблюдения близки к нулю, ио прямой свет не
учитывается, то реализуются малоугловые или дифракци-
онные методы, при 180° имеем лидарные методы. Для био-
логических исследований используется чаще всего малоуг-
ловой способ регистрации излучения.
Характеристики лазерных анализаторов частиц. В СССР
разработан и серийно выпускается прибор АМПЛ-1 (анали-
затор микрочастиц проточный лазерный), основанный на
методе определения размеров микрочастиц по интенсивности
малоуглового светорассеяния [511. Прибор предназначен
для определения концентрации микрочастиц в суспензиях,
построения и анализа гистограмм распределения микрочас-
тиц по размерам при помощи микро-ЭВМ.
Функциональная схема прибора приведена на рис. 2.7,
где изображены устройства ввода буферной жидкости (БЖ),
ввода пробы (П), оптико-электронного блока (ОЭ) и систе-
мы электронной обработки информации (ЭО). Исследуемый
препарат подается из шприца 13 устройства П вместе с бу-
ферной жидкостью из емкости 1 устройства БЖ в проточ-
ную камеру 2 с плоскими окнами блока ОЭ. Луч Не—Ne
лазера (Х=632,8 нм) 9 фокусируется линзой 10 в измери-
тельный счетный объем 11 диаметром 100 мкм, через кото-
рый последовательно пролетают частицы, генерируя им-
пульсы светорассеяния. Прямое нерассеянное излучение
подавляется фильтром-ножом Фуко/2. Сигнал с фотоприем-
ника 5 поступает на многоканальный анализатор амплиту-
ды импульсов 7 и далее на микро-ЭВМ 8 системы электрон-
ной обработки информации ЭО. Управление режимом ана-
лиза пробы осуществляется с помощью блока сопряжения 6,
77
сигнал с которого управляет двигателем привода 3 дозатора
13 с помощью специальной электронной схемы 4 блока И.
Объем анализируемой пробы составляет 20—500 мм3 при
расходе буферной жидкости 1 см3/с.
Рис. 2.7. Блок-схема анализатора АМПЛ-1 [П. 51]
Большое внимание уделено конструкции проточной ка-
меры с гидродинамической фокусировкой потока с иссле-
дуемой жидкостью и анализом ее в воздухе. Плоские окна
проточной камеры позволяют избежать нежелательной реф-
ракции от стеклянных трубок, обычно используемых в по-
добных системах. Наибольшие ошибки в определении гис-
тограмм распределений микрочастиц вызываются неравно-
мерностью интенсивности лазерного излучения, смещением
зонда относительно центра струи с пробой вследствие тоге,
что частицы, проскакивающие через различные области
измерительного объема, находятся в различных условиях
освещения. Диапазон размеров измеряемых частиц от 0,5
до 100 мкм, максимальная скорость счета — 10 с.
Погрешность измерения прибором концентрации поли-
стиролового латекса диаметром 4,1 мкм составляет 10—
15 %. Тем не менее следует отметить, что данному прибору
присущ ряд недостатков, которые характерны для методов
регистрации интенсивности с помощью малоуглового све-
торассеяния. Основной из них — это зависимость резуль-
татов измерений от показателя преломления исследуемого
объекта, что особенно имеет место при где рабочие
характеристики счетчиков частиц максимально подвержен
78
tibi осцилляциям (появление участков типа плато или впа-
дин) [501. Это может приводить к тому, что рабочие харак-
теристики могут быть неоднозначными (особенно в диапа-
зоне 0,5—2,0 мкм). Поэтому в этих случаях необходимо
иметь априорную информацию об исследуемом объекте и
использовать калибровочные кривые.
В работе [52] описан лазерный анализатор биологических
жидкостей, также построенный на основе регистрации све-
1 а, рассеянного объектами. Однако в отличие от вышеописан-
ного прибора свет регистрируется в узком угле, равном 20°,
а угол наблюдения 0=30°. Такая схема позволяет уверен-
но регистрировать частицы с относительным показателем
преломления в диапазоне 1,01—1,50. Сигнал с фотоприем-
пика регистрируется также анализатором амплитуды. Для
гидродинамической фокусировки исследуемой жидкости
используется камера со стеклянной трубкой, которая хотя
и является наиболее простой из известных камер, но об-
ладает повышенными требованиями к качеству изготовле-
ния малого внутреннего диаметра и оптическим характе-
ристикам материала. Размер измерительного объема со-
ставляет 200 мкм. Проведенные экспериментальные иссле-
дования прибора показали, что надежно можно регистри-
ровать частицы с размерами, большими 1 мкм, при диапазо-
не измеряемых концентраций 102—5-Ю6 мл-1. Проведены
исследования на разведенных суспензиях биологических
объектов размерами 3—10 мкм.
Следует заметить, что для данного типа счетчиков час-
тиц показания прибора будут сильно зависеть от показателя
преломления исследуемого объекта и в диапазоне 1—2 мкм
возможно появление на рабочих характеристиках участ-
ков типа плато или впадин, т. е. также необходимо иметь
априорную информацию об исследуемых объектах.
Многопараметрическая пролетная цитометрия. В серии
работ [53] развивается многопараметрический подход к ла-
зерной пролетной цитометрии, основанный на светорассея-
нии, иногда в сочетании с микрофлуориметрией. Одновре-
менно измеряется ряд сигналов от отдельной клетки, напри-
мер интенсивности рассеяния вперед и под углом 90°;
полная интенсивность ортогонального рассеяния и интенсив-
ность его компонента, поляризованного в плоскости, пер-
пендикулярной плоскости поляризации падающего излу-
чения и направлению пролета клеток, так называемого
деполяризованного компонента, /х; интенсивности рассея-
ния в диапазонах углов 1,0—2,6° и 3,0—11,0°; интенсивно-
го
сти бокового рассеяния излучения двух длин волн. Возмож-
ны и другие комбинации сигналов.
Такой подход позволяет довольно эффективно дифферен-
цировать клетки крови по их морфологии. Например, эози-
нофильные гранулоциты могут быть отделены от нейтро-
фильных гранулоцитов. Такая возможность важна как для
практики, так и для теоретических исследований в области;
иммунологии. В этом случае информация о типе клетки
определяется соотношением интенсивности ортогонального
рассеяния и ее деполяризованного компонента. При этом
абсолютные значения коэффициента деполяризации
/j./(/j.+/|j) при большом разбросе углов приема рассеянного
излучения (14,5°) имеют следующие значения: 0,044 (эози-
нофильные гранулоциты); 0,013 (нейтрофильные грануло-
циты); 0,007 (моноциты); 0,008 (лимфоциты). Важно, что
эозинофилы, имеющие большое число малых внутрикле-
точных частиц (гранул), дают относительно большие коэф-
фициенты деполяризации. Это подтверждает тот факт, что
в процессе деполяризации излучения не последнюю роль
играет многократное рассеяние.
С точки зрения аппаратурной реализации многопара-
метрическая цитометрия может быть осуществлена с по-
мощью стандартных пролетных цитометров с прямоуголь-
ным кварцевым капилляром или струей на воздухе при
облучении светом лазеров небольшой интенсивности (напри-
мер, Не—Ne, Аг (100 мВт)), включая многоволновые лазе-
ры, или светом спектральных ламп (ртутная лампа) при не-
большой модификации цитометра для приема рассеянного
излучения.
Важно, что результаты измерений представляются в
виде двухпараметрических карт на экране дисплея микро-
ЭВМ, отражающих плотность пространственно разделенных
областей зафиксированных клеток различных типов. Оче-
видно, что возможно и трехмерное представление резуль-
татов при одновременном измерении трех параметров рас-
сеяния. В этом случае следует ожидать еще большей диф-
ференциации клеток.
Двухпараметрические карты интенсивности ортогональ-
ного рассеяния и рассеяния вперед растворенных клеток
крови человека показывают с хорошим разрешением об-
ласти рассеяния гранулоцитами, моноцитами, лимфоцита-
ми и эритроцитами с остатками клеток. Аналогичное разде-
ление возможно при одновременном наблюдении бокового
рассеяния на длинах волн 405 и 577 нм. В данном случае
разделение области отклика цитометра на лимфоциты и
80
моноциты от области отклика на эритроциты обусловлено
малой интенсивностью рассеяния излучения с %=405 нм
эритроцитами.
Построенный авторами [531 простой пролетный цитометр
на базе Не—Ne лазера мощностью 5 мВт с одновременной
регистрацией четырех параметров рассеяния оказался впол-
не надежным прибором для дифференциального счета четы-
рех типов белых клеток крови. Сравнение результатов сче-
та, выполненных на этом приборе, и с помощью выпускаемо-
го промышленностью пролетного цитометра «Technicon
Н-6000», показало хорошую их корреляцию. Коэффициент
корреляции оказался равным: 0,99 для лимфоцитов, 0,76
для моноцитов, 0,99 для нейтрофильных гранулоцитов и
0,98 для эозинофильных гранулоцитов. Отметим, что про-
мышленные цитометры являются довольно сложными при-
борами, требующими предварительной цитохимической под-
готовки объекта исследования.
В [531 показана перспективность развитой методики из-
мерений и анализа результатов для экспресс-диагностики
различных видов лейкемии. При этом наибольшая информа-
ция может быть получена из одновременных измерений ха-
рактеристик светорассеяния и иммунофлуоресценции.
6 А. В. Приезжев
Глава 3
ЛАЗЕРНАЯ СПЕКТРОСКОПИЯ
КВАЗИУПРУГ0Г0 РАССЕЯНИЯ
В этой главе рассмотрены возможности использования
лазерного светорассеяния для изучения динамических ха-
рактеристик биологических микрообъектов: коэффициен-
тов диффузии, скоростей направленного транспорта и миг-
рационного движения, параметров внутримолекулярной и
внутриклеточной подвижности. По этим измеряемым ха-
рактеристикам можно рассчитывать размеры, массу и ряд
других характеристик рассеивателей. Это область так на-
зываемого квазиупругого светорассеяния, при котором не
происходит существенного изменения длины волны зон-
дирующего излучения в отличие от комбинационного рас-
сеяния, которое будет рассмотрено в гл. 6.
3.1. Физические основы метода. Основные типы
спектрометров
Физические основы. Пусть на среду, содержащую под-
вижные рассеивающие частицы, падает монохроматическая
линейно поляризованная световая зондирующая волна Е3
с волновым вектором q3 (рис. 3.1). Так же, как в эксперимен-
те по упругому светорассеянию, рассеянная волна регист-
рируется в удаленной точке под углом 0. Она характеризу-
ется волновым вектором qv. Если пренебречь возможностью
многократного рассеяния и взаимодействием частиц друг
с другом, то рассеянный свет можно представить как сумму
независимых вкладов от N одновременно рассеивающих
частиц:
N
Ер == 2 Ерл/ exp [I (Фу—©оО].
82
где Fpoj — амплитуда световой волны, рассеянной на /-й
частице с зависящей от времени координатой г,(/), Фу —
фаза z-й рассеянной волны, определяемая через разностный
волновой вектор рассеяния q=qv—q3 как <^j=qrj(t).
Как уже говорилось, при квазиупругом рассеянии
=2лп/Х. Следовательно, чисто геометрически из
Рис. 3.1. Геометрия экспе-
римента по квазиупругому
светорассеянию
рис. 3.1 можно получить для модуля волнового вектора
рассеяния выражение
IЯ | = I Я9—q31 = (4лпД) sin (0/2). (3.1)
Следует заметить, что кроме координаты центра масс
частицы от времени могут зависеть и амплитуды EvOj,
например, при изменении в процессе измерения рассеиваю-
щих свойств, конфигурации или конформации частиц, при
вращательном движении несферических частиц и в ряде дру-
гих случаев. В результате для рассеянной волны получаем
выражение
Ev = 2 (0 exp [i (qrj (/) — coo/)]. (3.2)
Отсюда видно, что, регистрируя временные изменения
(динамику) амплитуды и фазы (частоты) рассеянного излу-
чения, можно в принципе получить большую информацию
о динамических параметрах рассеивателей. Еще раз под-
черкнем, что квазиупругое рассеяние определяется срав-
нительно медленными динамическими процессами с харак-
терными временами в диапазоне 10-6—1 с, что существенно
больше характерных времен быстрых внутримолекулярных
колебаний, определяющих неупругое взаимодействие излу-
чения с биомакромолекулами (см. гл. 6).
Временные изменения параметров квазиупруго рассеян-
ного излучения проявляются в изменении его корреляцион-
ной функции или, что то же самое, в изменении его частот-
ного спектра. В зависимости от характера движения рассеи-
вателей оптический спектр либо только уширяется, либо
у него появляются дополнительные максимумы на сдвину-
6*
83
тых частотах. Однако эти уширения и сдвиги, составляю-
щие в зависимости от исследуемого объекта, как правило, от
10 Гц до 10 МГц, настолько малы по сравнению с частотами
оптического диапазона (около 5-1014 Гц), что зарегистриро-
вать их традиционными методами оптической спектроскопии
не представляется возможным — даже самые лучшие опти-
ческие спектрометры с интерферометрами Фабри — Перо
не позволяют различить в оптическом спектре компонент,
расположенный ближе 10 МГц. Следовательно, для реше-
ния поставленных задач необходимо осуществлять спект-
ральный анализ со сверхвысоким разрешением.
Это стало возможным после разработки в 60-х годах
метода оптическосо смешения (ОС), вошедшего в широкую
практику только с появлением лазеров. Суть этого метода
состоит в том, что при смешении на квадратичном фото-
приемнике (фотодиоде, фотоумножителе) световых волн
разных частот на выходе этого фотоприемника образуется
электрический сигнал, промодулированный разностными
частотами. Так как в рассматриваемом нами случае эти
частоты близки, то сигнал имеет характер биений, спектр
которых однозначно связан со спектром рассеянного света.
При этом, как уже говорилось, он расположен в диапазоне
низких частот и может быть подвергнут анализу уже не
оптическими, а радиотехническими средствами, дающими
вполне достаточное спектральное разрешение (вплоть до
долей герца). Теория и методы практической реализации
ОС при регистрации квазиупругого светорассеяния опи-
саны во многих книгах и обзорах (см., например, [1—15]).
Типы спектрометров ОС. Рассмотрим принципы действия
двух основных разновидностей этих спектрометров. Моно-
данные спектрометры (МС), называемые также иногда
гомодинными, работают по принципу выделения частот
самобиений различных спектральных компонентов рассеян-
ного света. Схема МС изображена на рис. 3.2. В МС на фо-
топриемник подается только рассеянное исследуемыми час-
тицами поле Ер. Фотоприемник, как говорилось выше, ре-
гистрирует не напряженность, а квадрат напряженности
поля. Поэтому выходной ток /фП оказывается пропорцио-
нальным величине |ЕР|2. Коэффициент пропорциональности
зависит от квантовой эффективности приемника и от ко-
герентных свойств рассеянного света. Именно для того,
чтобы весь свет, регистрируемый приемником, был коге-
рентным, т. е. чтобы все волны, рассеянные различными
частицами исследуемого объекта, попадали на фоточувстви-
тельную поверхность приемника в фазе, телесный угол
64
сбора 0 рассеянного излучения в спектрометрах ОС обыч-
но ограничивается диафрагмами. В случае МС угол коге-
рентности удобно оценивать выражением 0К ~l/(qL)2, где
L — характерный размер зондируемой области [9].
Выполняя операцию возведения в квадрат выражения
(3.2) и вычисляя спектр мощности фототока, можно показать,
Рис. 3.2. Схема лазерного МС: 1—лазер, 2 — аппаратура обра-
ботки сигнала, 3 — лилфрагмы, 4 — линзы, 5 — фотоприемник
что этот спектр состоит из трех компонентов: постоянной
составляющей, дробового шума и спектра флуктуаций ин-
тенсивности регистрируемого поля, как раз и несущего по-
лезную информацию. Заметим, однако, что в МС оптический
спектр без искажений повторяется в спектре фототока толь-
ко в случае гауссовой статистики рассеянного поля. Это,
как правило, выполняется, если число одновременно рас-
сеивающих частиц, дающих вклад в регистрируемое поле,
Принципиальным отличием гетеродинных спектромет-
ров (ГС) оптического смешения от МС является то, что на
фотоприемник кроме рассеянного исследуемым объектом
излучения подается опорная (гетеродинная) волна ЕГ с фик-
сированной частотой. Интенсивность этой волны должна
быть во много раз больше интенсивности рассеянного поля.
В качестве опорного, как правило, используется часть из-
лучения того же лазера, который возбуждает рассеяние.
Оно может подводиться на фотоприемник либо с помощью
системы зеркал, как на рис. 3.3, либо это может быть излу-
чение, рассеянное на неподвижных рассеивателях, распо-
ложенных вблизи измерительного объема, например, на
стенках кюветы. В некоторых случаях для получения опор-
ного излучения может использоваться второй лазер, син-
хронизованный с первым.
Эффективное оптическое смешение рассеянной и опор-
ной волн на фотоприемнике в ГС происходит только при
согласовании их волновых фронтов. Это означает, что гео-
85
метрия расположения элементов установки, определяющая
углы сбора и падения на фотоприемник рассеянной и опор*
ной волн, должна быть такой, чтобы эти волны были коге-
рентными. Это обстоятельство создает определенные труд-
ности в настройке ГС. Однако трудности окупаются преиму-
ществами ГС по сравнению с МС, которые в некоторых слу-
чаях оказываются принципиально важными.
Одно из преимуществ вытекает из того, что при условии
|ЕГ|^>|ЕР| и высокой эффективности смешения этих волн
Рис. 3.3. Схема лазерного ГС: обозначения те же, что и на рис. 3.2,
6 — зеркала
полезная составляющая сигнала ;'фП оказывается пропор-
циональной интенсивности опорного пучка. Это обстоя-
тельство позволяет добиться выигрыша в величине полез-
ного сигнала.
Принципиально важным также является то, что у ГС
информативная составляющая спектра мощности фототока,
также включающего в себя постоянный и шумовой компо-
нент, повторяет оптический спектр независимо от статистики
рассеянного поля. Кроме того, ГС в отличие от МС чувст-
вительны не только к движениям рассеивателей типа рав-
новесной диффузии, рассасывающихся флуктуаций п слу-
чайных миграций, но и к направленным движениям. Эта
особенность ГС выявляет их близкое родство с лазерными
доплеровским анемометрами (ЛДА)— приборами, пред-
назначенными специально для измерения скоростей пото-
ков жидкостей и газов 113, 14].
Как уже видно из названия, принцип работы этих при-
боров основан на регистрации сдвигов частоты излучения,
рассеянного движущимися частичками. Появление этих
сдвигов в рассеянном свете в простейшем случае, когда
рассеиватели движутся в одном направлении с постоянными
скоростями, видно из анализа выражения (3.2). Действи-
86
'ельно, если /'/(0=7'<ц(0+®оЛ то
Ф/ = ^Г/(0 = ^о/ + <7с/,
'. е. фазы рассеянных волн изменяются линейно по време-
1и. Так как частота волны есть производная по времени от
;е фазы, то это и означает, что в данном случае рассеянный
звет приобретает постоянные сдвиги частоты
= = ®/|cos<p, (3.3)
имеющие доплеровское происхождение. Здесь <р — угол
между направлениями векторов q и V. Все множество допле-
ровских сдвигов частоты, содержащихся в рассеянном све-
те, называется доплеровским спектром. Обращает на себя
Рис. 3.4. Схема дифференциального ЛДА: обозначения те же,
что на рис. 3.2 и 3.3
внимание линейная зависимость доплеровских сдвигов час-
тоты от скоростей движения рассеивающих частиц.
В качестве одного из примеров, взятых из большого раз-
нообразия схем ЛДА, разработанных к настоящему вре-
мени [141, рассмотрим изображенную на рис. 3.4 так назы-
ваемую дифференциален у'о схему, применяющуюся в био-
медицинской диагностике [7]. В этой схеме область измере-
ния (или, как часто говорят, измерительный объем) форми-
руется пересечением двух зондирующих пучков одинаковой
интенсивности и элементами приемной системы, включаю-
щей в себя в простейшем случае линзу и две диафрагмы. Вы-
ходной сигнал фотоприемника так же, как в ГС, образуется
в результате оптического смешения на его фотокатоде двух
полей. Однако в данном случае смешиваются поля, рассеян-
ные от обоих зондирующих пучков. Особенностью диффе-
ренциальной схемы ЛДА является то, что согласование вол-
новых фронтов двух рассеянных волн достигается автомати-
чески в широком телесном угле. Благодаря большой прием-
ной апертуре дифференциальных ЛДА, они часто исполь-
зуются при измерениях в слабо рассеивающих средах. Ви-
зуализация измерительного объема в области пересечения
зондирующих пучков также дает дополнительные удобства.
Из сказанного выше ясно, что ЛДА и ГС представляют
собой приборы одного типа. Различие в названиях носит
87
исторический характер и подчеркивает разные стороны од-
ного и того же принципа измерения: ЛДА предназначены
исключительно для исследования направленных ламинар-
ных и турбулентных потоков, в то время как ГС часто ис-
пользуются также и для изучения ненаправленных (диффу-
зионных) процессов переноса. В обоих типах приборов
искомая информация получается, как правило, из корреля-
ционных функций или спектров мощности сигналов фото-
приемника. Поэтому в литературе используются и такие
названия, как корреляционные или доплеровские спектро-
метры.
На практике обработка выходного электрического сиг-
нала каждого из этих спектрометров выполняется аналого-
выми или цифровыми методами, которые мы обсудим в сле-
дующем параграфе, а сейчас рассмотрим требования,
предъявляемые к основному элементу всех спектрометров
ОС — лазеру. Именно благодаря монохроматичности, ко-
герентности и высокой направленности лазерного излучения
стало возможным эффективно осуществлять ОС. В абсо-
лютном большинстве случаев в спектрометрах ОС, предна-
значенных для исследования биологических объектов, ис-
пользуются непрерывные одномодовые Не—Ne лазеры.
Мощности серийно выпускаемых Не—Ne лазеров (1—
50 мВт) вполне хватает для получения достаточной для ре-
гистрации интенсивности рассеянного света.
Основная проблема выбора мощности зондирующего пуч-
ка состоит в том, чтобы не внести возмущений в исследуемый
объект. Особенно это касается живых объектов — клеток,
а также других объектов, сильно поглощающих свет. Ис-
пользование многомодовых лазеров может привести к по-
грешностям в измерениях в связи тем, что расстояние по
частоте между соседними поперечными модами может быть
сравнимо с характерными изменениями в спектрах, имею-
щими место при рассеянии на биологических объектах.
Если говорить о выборе длины волны, то здесь важно, что
чем она меньше, тем сильнее рассеивается свет. Кроме того,
диффузионное уширение спектров обратно пропорциональ-
но квадрату длины волны. Следовательно, чем меньше X,
тем шире спектр и тем мягче требования к системе обработ-
ки сигнала. Поэтому в ряде случаев в спектрометрах ОС
используются непрерывные аргоновые лазеры, генерирую-
щие в сине-зеленой области длин волн. При выборе длины
волны, конечно, следует учитывать спектр поглощения ис-
следуемого объекта. На практике Не—Ne лазеры оказыва-
ются предпочтительней в силу меньшей стоимости и боль-
88
шей компактности. Конкретный тип лазера выбирается так-
же из соображений стабильности излучения, так как тех-
нические флуктуации уменьшают отношение сигнал/шум.
3.2. Методы обработки сигнала и анализа результатов
Обработка сигнала. В связи со статистическим характе-
ром рассеянного поля выходной сигнал фотоприемника яв-
ляется случайной функцией времени. Для его обработки
применяются статистические методы, из которых наиболее
распространенными являются корреляционный и спект-
ральный.
В первом случае сигнал после предварительной аналого-
вой обработки подается на коррелятор. Результатом корре-
ляционной обработки является автокорреляционная функ-
ция фототока Gz(t), связанная с автокорреляционной
функцией рассеянного поля. Благодаря появлению быстро-
действующих цифровых корреляторов и развитию техники
счета фотонов [1—3,9,10, 15, 16] широкое распространение
в биологических исследованиях получила фотон-корреля-
ционная спектроскопия, позволяющая работать с очень
слабыми световыми потоками, когда регистрируются лишь
отдельные кванты рассеянного излучения.
Во втором случае усиленный и отфильтрованный сигнал
фотоприемника подается на анализатор спектра. Резуль-
татом обработки является энергетический спектр, связан-
ный с автокорреляционной функцией преобразованием
Фурье. В настоящее время серийно выпускаются анализа-
торы спектра реального времени. Так же, как и фотонные
корреляторы, они производят обработку сигнала парал-
лельно с его накоплением без дополнительных временных
затрат.
Иногда для обработки сигнала используют ЭВМ, реа-
лизующие быстрые цифровые методы спектрального и кор-
реляционного анализа и позволяющие оперативно прово-
дить последующую обработку.
Анализируя полученные корреляционные функции или
спектры, необходимо иметь в виду, что их измеренные зна-
чения всегда имеют статистическую ошибку, связанную не с
погрешностью измерения фототока или с шумами регистри-
рующего тракта, а со стохастической природой самого сиг-
нала [9]. Относительная погрешность определения спектра
мощности гауссова случайного сигнала по одной реализации
составляет 100 %. Увеличение длительности одной реализа-
ции приводит к повышению разрешения спектральных ком-
89
понентов по частоте, но не дает уменьшения погрешности
определения спектральной плотности мощности на фикси-
рованных частотах. Для уменьшения этой погрешности не-
обходимо провести измерения по Л4>1 независимым реали-
зациям и усреднить полученные спектры. В результате по-
грешность (среднеквадратическое отклонение) будет умень-
шаться пропорционально 1/ИЛ1. Таким образом, относи-
тельная погрешность измерения энергетического спектра
сигнала зависит только от требуемого разрешения и време-
ни накопления и не зависит от частоты.
Так, например, если мы хотим измерить спектр с разре-
шением 10 Гц при относительной погрешности не более 5 %,
то нужно провести усреднение не менее, чем по 400 спект-
рам, построенным по выборкам сигнала длительностью 0,1 с
каждая. Общее время измерения, таким образом, должно
быть не менее 40 с. Увеличение числа усреднений и, следо-
вательно, общего времени измерения приведет к дальней-
шему уменьшению погрешности, если динамические пара-
метры исследуемого объекта сами не изменяются во времени.
Модельные представления. Получение спектра фото-
тока, пусть даже с высокой статистической точностью, со-
ставляет лишь часть проблемы. Для того чтобы определить
искомые динамические характеристики исследуемого объ-
екта, необходимо на основе той или иной его модели и расче-
та светорассеяния построить математическое выражение
для спектра, включающее искомые характеристики как
параметры, и методом подгонки найти такие их значения,
при которых измеренный и теоретический спектры совпа-
дают.
Для большого числа случаев такие модели уже построе-
ны. Рассмотрим простейший случай идеальной трансля-
ционной диффузии малых по сравнению с величиной l/q не-
взаимодействующих одинаковых сферических частиц в
растворе. Можно показать, что в этом случае спектр мощ-
ности фототока представляет собой лоренцевскую кривую с
полушириной
Г = №, (3.4)
а корреляционная функция — экспоненту с временем релак-
сации трел = 1/Г. Таким образом, по спектру легко опреде-
ляется коэффициент трансляционной диффузии Dr, а из
него в силу соотношения Эйнштейна — Стокса — гидроди-
намический радиус диффундирующих частиц:
гГд = £б77(6л11Рт),
90
где kE — постоянная Больцмана, Т — термодинамическая
температура раствора, т] — его вязкость. Кроме того, ис-
пользуя результаты независимых измерений постоянной
седиментации S и парциального удельного объема частиц
V, с помощью формулы Сведберга
m = SRT/[Dt(\-Vp)]
можно определить молекулярную массу частиц m (р —
плотность растворителя, R — универсальная газовая по-
стоянная).
Полидисперсность раствора, т. е. наличие в растворе
различающихся по размерам частиц, уже приводит к зна-
чительным трудностям. Спектр фототока в этом случае
представляет собой непрерывное множество (интеграл) ло-
ренцевских кривых с разными полуширинами. Следова-
тельно, для нахождения распределения частиц по размерам
(коэффициентам диффузии) необходимо решать обратную
спектральную задачу в виде интегрального уравнения с ло-
ренцевым ядром. Основная проблема в решении обратных
задач — их некорректность, т. е. принципиальное отсут-
ствие алгоритма нахождения точного решения. В этой свя-
зи разрабатываются различные приближенные методы ре-
шения, многие из которых дают весьма хорошие резуль-
таты 19].
В последнее время спектроскопия квазиупругого рас-
сеяния успешно применяется также для исследования кон-
центрированных растворов взаимодействующих частиц с
выраженной внутренней конформационной и ориентацион-
ной динамикой в диапазоне характерных времен от 1 с до
1 мкс. В основе этих исследований также лежат регулярные
методы анализа спектров.
3.3. Диагностика биологических объектов
на основе измерения коэффициентов диффузии
Трансляционная диффузия. К настоящему времени наи-
большее число работ по применению лазерной спектроско-
пии квазиупругого рассеяния в биологии относится к диаг-
ностике макромолекул: белков, нуклеиновых кислот, их
фрагментов и комплексов, а также различных надмолекуляр-
ных и клеточных структур, вирусов, фагов. В табл. 3.1
приведены некоторые характерные примеры результатов
значений гидродинамического радиуса некоторых биологи-
ческих частиц, взятых из работ [1, 3, 9]. Все измерения про-
водились с помощью монодинных спектрометров. Обращает
91
на себя внимание малая погрешность измерений, состав-
ляющая около 1%. Случаи большей погрешности при ис-
следовании стационарных объектов связаны, как правило,
не с ошибкой метода, а с недостаточной очисткой образца.
Наличие в нем посторонних частиц (например, пылинок) или.
агрегатов приводит к увеличению погрешности.
Таблица 3.1
Коэффициент трансляционной диффузии и гидродинамический
радиус некоторых биологических макромолекул
Объект £>т, Ю-7 см2/с ггд’ нм
Фибриноген (бычий) 2,02; 2,40 10,6; 8,9
а-кристаллин 2,20±0,02 9,8±0,1
РНК-полимераза 2,70±0,15 7,9
Каталаза 3,60±0,20 5,9±0,3
у-глобулин 3,80±0,20 5,6 ЬО,3
Гемоглобин 6,70±0,20 3,2; 3,1
Лизоцим 10,60±0,10 2,02
Коллаген (мономер) 7,20±0,16 3,0i0,2
Бычий сывороточный альбумин 5,76±0,05 3,7
G-актин 5,28; 6,10 4,06; 3,52
а-химотрипсин 6,11 3,5
Измерение стационарных значений коэффициентов диф-
фузии, гидродинамических радиусов и даже массы не яв-
ляется конечной целью диагностики. Эти параметры очень
чувствительны к изменениям условий окружающей среды
(раствора). Поэтому в большинстве работ регистрируются
изменения параметров DT и ггд в целях диагностики раз-
личных изменений свойств частиц под действием внешних
факторов. К таким изменениям относятся: денатурация,
агрегация, иммунные реакции, конформационная подвиж-
ность и др.
Изменение DT частиц в растворе может происходить
даже под действием зондирующего пучка [17]. Это относит-
ся главным образом к сильно поглощающим свет растворам,
примером которых является раствор гемоглобина. Измере-
ния, проводившиеся на монодинном спектрометре при угле
рассеяния 9=90° с обработкой сигнала на 20-канальном
анализаторе спектра реального времени с погрешностью
определения £>т не выше 0,5 %, позволили получить мето-
дически важные зависимости полуширины лоренцевского
спектра от мощности зондирующего пучка для молекул ге-
92
моглобина с разной степенью оксигенации (рис. 3.5). Вид-
но, что, экстраполируя полученные зависимости в сторону
меньших интенсивностей зондирующего пучка, получают
такое значение интенсивности, при котором можно прово-
дить измерения, не внося изменений в исследуемый объект.
Рис. 3.5. Зависимость ширины спектра сигнала МС от мощности
зондирующего пучка при измерении в растворах деоксигемогло-
бина (/) и оксигемоглобина (2) [17]
Кинетику обратимых изменений коэффициента диффузии
молекул гемоглобина при их агрегации в комплексы вслед-
ствие деоксигенации удается регистрировать даже не в раст-
воре, а внутри интактных красных клеток крови — эри-
троцитов [18]. Для этого используется спектрометр, вы-
полненный на базе серийного микроскопа, позволяющий
осуществлять корреляционную спектроскопию флуктуаций
интенсивности в объеме около 8 мкм3. На таком микроскопе-
спектрометре наблюдалась агрегация гемоглобина в эритро-
цитах крови больных серповидной анемией, движение про-
топлазмы внутри очень маленьких (около 10 мкм) живых
клеток (об этом подробнее см. 3.5). Подобная аппаратура
может быть с успехом использована, например, при изуче-
нии процессов, происходящих с изменением размеров бел-
ков в процессе биосинтеза и при дифференциации клеток.
Представляет интерес изучение зависимости агрегации
молекул от температуры. Сильная температурная зависи-
мость скорости роста агрегатов была показана, например,
при исследовании процессов агрегации мономеров иммуно-
глобулина [19]. При 39 °C никакого изменения радиуса-
мономеров (5,8 нм при концентрации 15,4 мг/мл) не наблю-
далось даже в течение 60 часов. В то же время радиус агре-
гатов достигал 100 нм за 4 часа при нагревании раствора
до 62 °C.
Измерение кинетики полимеризации тубулина и само-
сборки микротрубочек in vitro при квазистатическом изме-
93
нении температуры показало [20], что при концентрации
тубулина в растворе 1,1 мг/мл средний коэффициент диф-
фузии £>т начинает резко, но обратимо уменьшаться при
температуре 20—25 °C. При этом начинает обратимо уве-
личиваться полидисперсность. Существенные и уже необра-
тимые изменения раствора начинаются в диапазоне темпера-
тур 45—60 °C, что, по-видимому, свидетельствует о денату-
рации белка. Скачкообразное повышение температуры с 7
до 37 °C приводит к изменению и степени полидисперс-
ности более чем в три раза за 20 минут. Добавление в раст-
вор 100 мкмоль колхицина, препятствующего полимериза-
ции, делает раствор не чувствительным к температуре.
Другим примером применения метода для исследования
реакции полимеризации, имеющим большое значение в био-
медицинской диагностике, является переход фибриногена в
Рис. 3.6. Временные зависимости интенсивности светорассеяния (1)
и гидродинамического радиуса молекул фибриногена (2) после
добавления в раствор тромбина (в момент времени 1=0)
фибрин и агрегация фибрина. При появлении на теле~раны
устойчивые молекулы фибриногена при участии фермента
тромбина переходят в неустойчивую форму, называемую
фибрином. Фибрин начинает полимеризоваться с образова-
нием плотной сетки агрегатов, способствующей заживле-
нию раны.
На рис. 3.6 в полулогарифмическом масштабе изобра-
жена временная эволюция средней интенсивности рассеян-
94
ного света lp(f) и среднего гидродинамического радиуса
ггд (0 молекул фибриногена в растворе с концентрацией
1 мг/мл после добавления 0,0033 ед/мл тромбина. Измере-
ния проводились на МС с 60-канальным фотонным корреля-
тором, сопряженным с ЭВМ, при 0=90°, Т=37 °C. Иссле-
дование кинетики этой реакции вплоть до перехода в гель-
состояние (через 6 часов) позволило построить модель взаи-
модействия молекул и всего процесса полимеризации [21].
Еще один немаловажный пример относится к диагности-
ке глазных заболеваний. На основе теории упругого свето-
рассеяния было показано, что помутнение хрусталика гла-
за происходит из-за рассеяния света на конгломератах вы-
сокомолекулярных протеинов [22, 23]. К настоящему вре-
мени с помощью спектроскопии квазиупругого рассеяния
проведены многочисленные исследования диффузионной
подвижности протеинов в хрусталиках человека и живот-
ных как in vitro, так и in vivo [24, 25]. При исследованиях
на объектах in vitro рассеянный свет Не—Ne лазера (Х=
=632,8 нм) мощностью 1—5 мВт собирался под углами 45
или 90° на ФЭУ, откуда поступал на цифровой коррелятор,
содержащий не менее 100 каналов, и далее на ЭВМ для по-
следующей обработки корреляционной функции.
Обнаружено, что в нормальном хрусталике глаза чело-
века основными рассеивателями являются конгломераты
протеинов диаметром около 0,5 мкм и полидисперсным на-
бором частиц с диаметрами от 1 до 6 мкм [26, 27]. В работе
[28] проведено изучение распределения конгломератов про-
теинов в хрусталиках свиньи. Показано, что средний диа-
метр частиц первого компонента распределения составляет
15—23 нм, второго — около 0,1 мкм, третьего — около
1 мкм и, наконец, четвертого — 30—70 мкм. При этом рас-
пределение каждого типа конгломератов по объему хруста-
лика носит довольно сложный характер.
Таким образом, методом динамической спектроскопии
можно наблюдать за изменением структурного состава
хрусталика, проявляющегося в изменении его светорассеи-
вающих свойств. Однако следует заметить, что для получе-
ния надежных результатов при мощности зондирующего
излучения около 1 мВт время измерения во всех экспери-
ментах составляло от нескольких до десятков минут, что
является совершенно неприемлемым в клинической практи-
ке. Поэтому необходимы дальнейшие исследования с целью,
повышения чувствительности метода.
В качестве примера исследования кинетики агрегации
в процессе иммунологической реакции можно привести
95
изучение реакции агглютинации, проводимое для экспресс-
ного определения содержания бактерий [29]. Если при ви-
зуальном контроле первое наблюдение этой реакции регист-
рируется через 18 часов, то с помощью фотон-корреляцион-
ного спектрометра уже через несколько минут можно
увидеть начало прогрессирующего уменьшения крутизны
спадания корреляционной функции, свидетельствующего
об увеличении среднего размера частиц и, следовательно,
о протекании реакции.
Использование фотон-корреляционной спектроскопии
позволяет также измерять распределения по размерам обра-
зующихся агрегатов бактерий, в том числе и при разведе-
ниях, больших титра, уже на первичных стадиях реакции,
т. е. при агрегации всего двух или нескольких бактерий.
Очевидна важность прикладного аспекта этих работ. По-
добные исследования проводятся также при изучении и та-
ких иммунологических реакций, как реакция преципита-
ции [30] и реакции антиген — антитело [31].
Вращательная диффузия. Во всех рассмотренных при-
мерах речь шла об измерении коэффициента трансляцион-
ной диффузии. Однако в тех случаях, когда форма рассеи-
вающих частиц ближе не к сферической, а к аксиально
симметричной или же сферические частички сильно анизотро-
пны, в спектр флуктуаций рассеянного поля, как уже гово-
рилось, вносит вклад также ориентационная, или вращатель-
ная, динамика. Это отражается на корреляционной функции
таким образом, что она раскладывается в ряд экспонент, в
показатели которых кроме DT входит также DB — коэф-
фициент вращательной диффузии. При определенном выборе
угла рассеяния число значащих членов ряда можно реду-
цировать до двух, что дает возможность вычислить по экс-
периментальной кривой коэффициентов [1, 9].
Другой способ измерения DB состоит в регистрации
спектра флуктуаций интенсивности деполяризованного ком-
понента рассеянного света [32]. Это связано с тем, что
именно при рассеянии на анизотропных частицах возникает
этот компонент. Регистрируя деполяризованный свет при
малых углах рассеяния, когда вклад трансляционной диф-
фузии ничтожно мал (выражение (3.4)), можно измерить
Ьъ с большой точностью. Естественной трудностью в этом
подходе является то, что интенсивность деполяризованного
компонента рассеянного света обычно на несколько поряд-
ков ниже интенсивности поляризованного компонента.
Однако применение техники счета фотонов делает это об-
стоятельство не очень важным. Совместные измерения
.96
Dr и DB дают дополнительную информацию о форме рас-
сеивающих частиц.
Кроме вращения анизотропных макромолекул опреде-
ленный вклад в спектр сигнала вносят быстрые конфигу-
рационные внутримолекулярные движения: изгибные коле-
бания длинных молекул или филаментов, динамика поли-
мерных клубков и т. д. Методы расчета спектров рассеян-
ного света, учитывающие эти движения, в настоящее время
усиленно развиваются (9]. Получаемые параллельно экс-
периментальные данные используются для проверки раз-
личных гипотез и моделей.
3.4. Диагностика биологических объектов
на основе регистрации скоростей
направленного движения
Электрофорез. Одним из ярких примеров применения
спектроскопии квазиупругого рассеяния в биологии и меди-
цине является электрофоретическое светорассеяние (ЭФС),
используемое для измерения подвижности заряженных све-
торассеивающих частиц в электрическом поле. В однолуче-
вой или двухлучевой ЛДА, снабженный низкочастотной
системой обработки сигнала, вставляется электрофорети-
ческая кювета с гомогенным раствором или суспензией ис-
следуемых частиц. Простейший тип кюветы представляет
собой спектрофотометрическую ячейку, в которую вводят-
ся близко расположенные электроды (чаще всего платино-
вые или палладиевые). При наложении разности потенциа-
лов в растворе возникает направленное движение частиц
со скоростью
v = е£Е/(4лт]) = рЕ,
где р — электрофоретическая подвижность (ЭФП), е и г] —
диэлектрическая проницаемость и вязкость среды, £ — по-
верхностный потенциал частиц. Соответствующий допле-
ровский сдвиг частоты согласно формулам (3.1) и (3.3)
f д = (2npE/X) sin (0/2) cos <р. (3.5)
Следовательно, зная напряженность поля в кювете и
измерив доплеровский сдвиг частоты, можно прямо опреде-
лить ЭФП и из нее — поверхностный потенциал частиц.
Наглядную информацию об ЭФС несут доплеровские спект-
ры. На рис. 3.7 представлен доплеровский спектр, полу-
ченный с помощью однолучевого ЛДА (угол рассеяния
0=11,7°) от популяции форменных элементов крови — сме-
7 А. В. Приезжее 97
си лимфоцитов и эритроцитов в буферном растворе [33].
Амплитуда доплеровских пиков пропорциональна кон-
центрации клеток, которые, как видно, хорошо различают-
ся в этом эксперименте. Если в соответствии с выражением
Рис. 3.7. Спектр ЭФС, полу-
ченный от суспензии лимфоци-
тов (/) и эритроцитов (2)
Рис. 3.8. Спектры ЭФП тром-
боцитов (/) и эритроцитов (2)
человека
(3.5) пересчитать доплеровские частоты в подвижность, то
можно построить спектры ЭФП в соответствующих едини-
цах. Пример спектров ЭФП тромбоцитов и эритроцитов
человека показан на рис. 3.8 [34].
Широкое распространение ЭФС в биологии и медицине
как высокочувствительного и оперативного аналитического
метода определяется большим разнообразием частиц, кото-
рые могут быть исследованы: от субмикронных макромоле-
кул до крупных эукариотических клеток, а также широким
спектром решаемых задач. Это и анализ состава смеси час-
тиц (форменных элементов и белков плазмы крови, популя-
ций вирусов и бактерий и т. д.), и анализ иммунологиче-
ских реакций, проводимый при диагностике заболеваний,
связанных с изменением иммунного статуса организма (по-
явлением злокачественных опухолей, иммунодефицитного
состояния и т. д.). ЭФС используется для изучения процес-
сов агрегации и полимеризации белковых молекул (напри-
мер, переходов тетрамер — димер гемоглобина), наблюдае-
мых при высоких значениях pH, самосборки актиновых
филаментов (F-актина) из глобулярных мономеров (G-ак-
тина).
На рис. 3.9 изображены три спектра ЭФС актина в раст-
воре с разным содержанием ионов Mg2.+ [35]. Спектр, изо-
98
браженный на рис. 3.9а, получен при угле рассеяния 9° в
растворе 8,3 ммоль G-актина при температуре 20 °C и на-
пряженности электрического поля 104 В/см. Характерно,
что спектр содержит один узкий пик, ширина которого опре-
деляется диффузией мономеров G-актина (аппаратное уши-
рение в этом случае существенно меньше). Доплеровский
Рис. 3.9. Три спектра ЭФС, полученные от раствора белка актина
с разным содержанием ионов магния
сдвиг на 139 Гц соответствуетЭФП р=2,4 см2/(В-с) в стан-
дартном стабилизирующем буфере. Следующий спектр
(рис. 3.96) получен через 30 минут после добавления в раст-
вор MgCl2 с соответствующим повышением концентрации
Mg2+ до 0,5 ммоль. Видно, что это приводит к образованию
частиц с меньшей ЭФП и к расширению диапазона значений
ЭФП. С течением времени спектр приобретает вид двух уз-
ких пиков, соответствующих меньшим частотным сдвигам.
Спектр, изображенный на рис. 3.9в, получен через 12 ча-
сов после первого. Правый пик дают медленно движущиеся
филаменты F-актина. Левый пик можно отнести к актино-
вым филаментам, прикрепляющимся к стенкам кюветы.
Методом лазерного ЭФС в настоящее время пользуются
во многих лабораториях медико-биологического профиля.
7* 99
Специфические трудности применения этого метода, свя-
занные с нагреванием раствора, с необходимостью учета
электроосмотических явлений и ряда других, уже частично
преодолены. Исследования, направленные на совершенст-
вование метода и на расширение сферы его применений»
продолжаются.
Гемодинамика. Другим направлением работ, связанных
с регистрацией направленного движения частиц в медицин-
ской диагностике, является измерение скоростных характе-
ристик потоков крови: средней интенсивности кровотока,
распределения скоростей по сечению сосуда, интенсивности
турбулентных пульсаций и пр. Эти работы важны для раз-
вития исследований по физиологии и реологии крови и кро-
веносных сосудов в связи с задачами создания их искусст-
венных заменителей и с задачами диагностики заболеваний.
ЛДА находит в этих работах все большее применение [36].
Первые измерения скорости кровотока in vivo с по-
мощью ЛДА были проведены в начале 70-х годов на арте-
риях сетчатки глаза кролика [37]. Экспериментальная уста-
новка позволила оценить скорость кровотока, которая ока-
залась порядка 1,1—1,8 см/с, что находится в хорошем со-
ответствии с результатами, полученными традиционными
методами. Однако наобходимость сравнительно большого
уровня мощности лазерного излучения (около 10 мВт) при
длительности измерений около 2 минут, а также анестези-
рования и расширения зрачка не позволили сразу исполь-
зовать этот метод в клинической практике и потребовали его
значительной модернизации [38—40].
Для получения значений скоростей кровотока и упроще-
ния юстировки системы стали использовать схемы с опор-
ным пучком. Конструктивно все элементы оптической схемы
располагают в модернизированной фундус-камере, что поз-
воляет проводить независимые измерения скорости крово-
тока с использованием обычной флуоресцентной ангиогра-
фии при экспериментальных исследованиях. Подобным сис-
темам присущ общий недостаток: смещение кровеносного
сосуда от точки фокусировки во время измерений. Поэтому
обычно стараются или сократить время измерения до 0,5 с
и менее [40], или использовать специальные компенсацион-
ные схемы, позволяющие в автоматическом режиме следить
за положением лучей на кровеносном сосуде с их последую-
щей корректировкой [41].
В офтальмологии ЛДА может с успехом использоваться
для изучения относительной закупорки вен и артериальной
недостаточности при заболеваниях сосудов сетчатки, влия-
100
ния фотокоагуляции на сосудистую циркуляцию и для дру-
гих диагностических целей.
Необходимо заметить, что точность измерения скорости
кровотока достаточно высока только в случае очень тонких
Рис. 3.10. Доплеровские спектры, полученные от потока разбав-
ленной (/) и цельной (2) крови в стеклянном капилляре
капилляров диаметром менее 100 мкм, имеющих прозрач»
ные стенки, когда выполняется условие однократного рас-
сеяния. В более крупных капиллярах начинают сказывать-
ся эффекты многократного рассеяния [42].
На рис. 3.10 показан характерный вид доплеровских
спектров, зарегистрированных с помощью дифференциаль-
ного ЛДА в модельном эксперименте на стеклянном капил-
ляре диаметром 210 мкм, по которому с одной и той же ско-
ростью, оцененной по объемному расходу, протекала раз-
бавленная (/) и цельная (2) кровь. Разбавление было та-
ким, что обеспечивался режим однократного рассеяния.
Обращает на себя внимание асимметричная форма спектра
во втором случае. Однако, несмотря на многократное
рассеяние, доплеровский спектр от цельной крови содер-
жит хорошо выраженный максимум, по которому, вообще
говоря, можно судить о скорости течения. Это объясняется
тем, что эритроциты, вносящие основной вклад в рассея-
ние, по своим размерам более чем на порядок превышают
длину волны излучения лазера, и их индикатриса рассея-
ния резко вытянута вперед. Однако многократное рассея-
ние приводит к смещению спектра. Если не учитывать это
смещение при измерениях, то можно получить искаженные
результаты [36].
101
Большая объемная концентрация эритроцитов в цельной
крови и наличие непрозрачных стенок у крупных одиноч-
ных сосудов делают невозможными невозмущающие опти-
ческие измерения скорости in vivo. Поэтому в таких слу-
чаях излучение вводят внутрь сосуда с помощью волоконно-
оптических катетеров диаметром 100—500 мкм [43, 44].
Эти же катетеры служат и для выведения рассеянного
излучения из потока. При этом основной вклад в регистри-
руемый сигнал вносят эритроциты, движущиеся вблизи
торца световода, что дает пространственное разрешение
измерений около 100 мкм. Очевидным недостатком такого
метода измерений является возмущение потока, так что
реально измеряется не истинная скорость, а скорость об-
текания. Ее отклонение от истинного значения зависит от
относительных размеров световода и сосуда, а также от
формы торца световода. Тем не менее подобные системы
успешно применяются для измерения не только стационар-
ных, но и пульсирующих потоков [45].
Диагностику ряда сердечно-сосудистых, эндокринных,
кожных и других заболеваний можно проводить, измеряя
нарушения микроциркуляции — кровотока в микрососу-
дах приповерхностного слоя органов. Такие измерения мож-
но проводить бесконтактно, регистрируя свет, рассеянный
на эритроцитах, которые движутся в разных направлениях
в слое ткани толщиной 0,5—2 мм [46, 47]. В зондируемой
лазерным пучком области имеются капилляры, ориентиро-
ванные в разных направлениях и имеющие, следовательно,
различные проекции на вектор рассеяния. Поэтому сигнал,
возникающий в результате оптического смешения света,
рассеянного на движущихся эритроцитах и на относительно
неподвижных тканях, имеет характерный низкочастотный
спектр, центрированный около нулевой частоты, без выра-
женных максимумов. Полуширина такого спектра, как было
показано в модельных экспериментах [46], пропорци-
ональна интенсивности микроциркуляции в исследуемой
области.
К настоящему времени разработано несколько модифи-
каций фотон-корреляционных волоконно-оптических изме-
рителей микроциркуляции, применение которых в усло-
виях клиники показало их высокую эффективность [47, 48].
Разрабатываются также действующие по такому же прин-
ципу компактные приборы, использующие в качестве из-
лучателя малогабаритные диодные лазеры, интегрирован-
ные в один блок с детекторами [49].
102
3.5. Лазерная доплеровская спектроскопия живых
клеток и диагностика внутриклеточной подвижности
t Общие сведения. К настоящему времени выполнено
большое число исследований по разработке методов и прак-
тической регистрации подвижности живых клеток в суспен-
зиях: бактерий, сперматозоидов животных и человека, во-
дорослей и др. (см., например, [50—54]). Эта подвижность
шмеет характер не тепловой диффузии, а случайных блуж-
даний с элементами прямолинейного, вращательного и спи-
рального движений. Каждое из этих видов движений вносит
свою лепту в доплеровское уширение спектров. Поэтому
точное описание светорассеяния выливается в сложные мно-
гопараметрические математические модели. Тем не менее
разработанные процедуры позволяют получать из экспери-
ментально измеренных спектров распределения скоростей,
относительное число подвижных и неподвижных клеток и
ряд других параметров.
Учитывая, что по этому вопросу опубликовано большое
число обзорных работ (см., например, [53, 54]), мы не бу-
дем останавливаться на нем подробно, а перейдем к обсуж-
дению исследований внутриклеточной подвижности, в ко-
торых применение лазерной доплеровской спектроскопии
(ЛДС) является весьма многообещающим [55, 56].
Первое использование этого метода для решения задач
регистрации направленной внутриклеточной подвиж-
ности в крупных растительных клетках относится к 1974 г.
[57]. Были получены четкие доплеровские спектры, харак-
теризующие распределение скоростей стационарного дви-
жения светорассеивающих частиц, составляющих прото-
плазму этих клеток (ядер, митохондрий и др.). В последую-
щей серии работ [58—64] была продемонстрирована высо-
кая эффективность ЛДС как регулярного метода решения
задач биофизики подвижности, позволяющего осуществ-
лять регистрацию нестационарных откликов клетки на внеш-
нее воздействие, что важно при изучении механизмов про-
странственно-временной организации клеточной подвиж-
ности, ее регуляции и пр.
Особенностью лазерного зондирования одиночных не-
подвижных живых клеток является то, что свет рассеивает-
ся не только движущимися внутриклеточными органоида-
ми, но также и неподвижными клеточными стенками. В пер-
вом случае в рассеянном свете появляются доплеровские
сдвиги частоты, в то время как во втором частота рассеян-
ного света не изменяется. Этот второй компонент рассеян-
103
ного света неизбежно попадает на фотоприемник, что поз-
воляет использовать этот компонент в качестве опорного
излучения для переноса доплеровских сдвигов частоты в
низкочастотную область путем гетеродинирования. Таким
образом, однолучевой схемой зондирования можно в прин-
ципе обеспечить гетеродинный режим измерения скоростей
движения внутриклеточных частиц. При этом, конечно,
должны выполняться условия эффективного ОС и гетеро-
динирования, что в некоторых случаях происходит автома-
тически, а в некоторых требует дополнительных усилий.
Рис. 3.11. Блок-схема измерительно-вычислительного комплекса
на базе однолучевого ЛДС
Описание установки. На рис. 3.11 изображена схема
измерительно-вычислительного комплекса, созданного для
изучения внутриклеточной подвижности [65]. Излучение
Не—Ne лазера типа ЛГ-38 (/), ослабленное набором фильт-
ров (2), фокусируется линзой (5) на клетку (4), закреплен-
ную в кювете (5) в специальных держателях (6). Рассеян-
ный свет поступает через систему линз и диафрагм (7) на
ФЭУ (8), работающий в токовом режиме. Сигнал после уси-
ления и фильтрации в НЧ усилителе (9) поступает парал-
лельно на осциллограф (10) для визуального контроля, на
анализатор спектра реального времени типа СК4-72 (11),
имеющий кроме электронно-лучевого индикатора цифровой
выход, и на аналого-цифровой преобразователь (АЦП)
(12), преобразующий аналоговый сигнал в дискретные вы-
борки с программно устанавливаемой частотой дискретиза-
ции и длительностью. Эти выборки поступают на ЭВМ (13)
104
для спектральной обработки, которая выполняется по ходу
пли после записи выборки в память.
Все приведенные ниже результаты получены путем об-
работки сигнала на ЭВМ ЕС-1010, хотя вместо пее могла
быть использована любая другая машина того же класса.
На эту же машину могут подаваться оцифрованные спект-
ры с выхода анализатора и выходные сигналы других дат-
чиков (например, измерителей температуры, мембранного
потенциала или др.) (14). ЭВМ снабжена внешними уст-
ройствами: алфавитно-цифровым (15) и графическим (16)
дисплеями, графопостроителем (17) и печатью (18). Состав-
ной частью комплекса является пакет программ для сбора
и обработки данных, а также для управления экспери-
ментом.
В качестве основных характеристик комплекса, опреде-
ляемых во многом спецификой решаемых задач и свойства-
исследуемых объектов, можно назвать: время получения
усредненного доплеровского спектра с удовлетворительной
^.отн.ед. 32 64 96 V, мкн/с
’М
1 - V
О 50 100 150 ЪГЦ
Рис. 3.12. Доплеровский спектр, полученный от живой клетки
харовой водоросли со стационарным течением протоплазмы; 0=45°,
т= Ю с, 7=20 °C
погрешностью (обычно в пределах Ю %) т=1—6 с; преде-
лы измерения скоростей направленного движения и=10—
—1000 мкм/с; аппаратное уширение спектра А/а=0,5—
—2 Гц; локальность измерения L=100—500 мкм; возмож-
ное число каналов доплеровских измерений п=4 (кроме это-
го, возможен ввод в ЭВМ нескольких медленно меняющихся
сигналов от других датчиков); плотность мощности излуче-
ния в зондируемой области клетки 1Г=1—100 Вт/см2. Точ-
105
ное значение порога невозмущающего воздействия устанав-
ливается для каждого вида клеток до начала эксперимента о,
учетом продолжительности измерений, коэффициента по-
глощения и ряда других факторов.
Результаты измерений. На рис. 3.12 изображен в полу-:
логарифмическом масштабе характерный вид доплеровского
спектра, получаемого при измерениях на крупных клетках
харовой водоросли Nitella, не подвергаемых внешним воз-
действиям. Форма этого спектра определяется главным об-
разом распределением скоростей в измерительном объеме и
свидетельствует о том, что большинство частиц движется
со скоростью о=40 мкм/с, соответствующей частоте макси-
мума в спектре. В стационарном состоянии флуктуации
скорости течения протоплазмы в этих клетках малы, так
что усреднение спектра можно проводить в течение длитель-
ного времени (порядка нескольких минут), что приведет к
уменьшению разброса спектральных компонентов. Однако
такие измерения имеют чисто методический интерес, так
как оценку скорости стационарного движения можно сде-
лать и посредством визуального наблюдения через опти-
ческий микроскоп.
Существенно больший интерес с учетом перечисленных
выше биофизических задач представляет наблюдение пере-
ходных режимов с характерным временем квазистационар-
ности не менее 1 с. Однако при этом приходится довольство-
ваться значительным разбросом значений спектральной
плотности мощности сигнала, приводящим к большим по-
грешностям в измерении.
В живых клетках Nitella нестационарные внутриклеточ-
ные движения имеют место при внешних воздействиях:
световых, механических, электрических, химических и
пр. Так, например, электрическая стимуляция путем пода-
чи электрического импульса напряжением ии=100 мВ,
длительностью ти=1 с на внешнюю возбудимую мембрану
приводит к генерации потенциала действия и к последую-
щей быстрой остановке потока протоплазмы с дальнейшим
его восстановлением [64]. Соответствующее этому процессу
изменение формы доплеровских спектров изображено на
рис. 3.13.
При остановке движения (рис. 3.13а) доплеровский ком-
понент спектра исчезает и остается лишь уширенная линия,
отражающая наличие диффузионного и другого ненаправ-
ленного движения в клетке. Со временем по мере восстанов-
ления течения протоплазмы восстанавливается и доплеров-
ский компонент спектра (рис. 3.136 — г). В зависимости
106
от параметров внешнего воздействия время достижения ис-
ходного значения скорости потока может составлять 5—
Рис. 3.13. Кинетика восстановления формы доплеровского спектра
после временной остановки течения протоплазмы
v,hkm/g
00
60
60
*
' Ю 20 30 Ъмин
Рис. 3.14. Три примера процесса восстановления направленного
течения протоплазмы в клетке после быстрой остановки (момент
остановки обсзначен стрелкой)
Ю минут и более, причем в ряде случаев возможны длитель-
ные процессы установления, имеющие колебательный ха-
рактер.
Различные кинетики восстановления направленной
внутриклеточной подвижности представлены на рис.3.14.
107
Следует заметить, что наблюдаемые колебания скорости не
являются проявлением патологического состояния клетки.
Периоды колебаний, постоянные для каждой конкретной
клетки, принимают значения в интервале от 5 до 10 минут,
причем форма колебаний может быть как квазигармониче-
ской, так и близкой к релаксационной. Интересно, что коле-
бания скорости сопровождаются колебаниями мембранного
потенциала, однако их периоды отличаются в два раза [641.
Характер восстановления скорости зависит от условий ос-
вещенности в период, предшествующий стимуляции.
Предпринимались попытки выделения на общем фоне
всего рассеянного света сигнала от определенных частиц,
играющих важную роль в механизме генерации движущей
силы. В частности, такими частицами в соответствии с не-
которыми гипотезами являются сферосомы — сферические
частицы, содержащие миозин и имеющие диаметр 0,2—
0,8 мкм. Предполагается, что эти частицы совершают ко-
лебательные движения в плоскости, ортогональной на-
правлению основного потока протоплазмы. Такие их дви-
жения должны приводить к возникновению в спектре сигна-
ла ЛДС эквидистантных максимумов шириной, пропорцио-
нальной времени регистрации каждого спектра. Расстоя-
ние между ними по оси частот в соответствии с расчетом
должно равняться средней частоте колебаний частиц. Для
того чтобы отстроиться от сильного доплеровского сигнала,
связанного с направленным движением протоплазмы вдоль
клетки, измерения проводились так, чтобы вектор рассея-
ния q был ориентирован ортогонально основному потоку.
Таким образом, в спектр сигнала кроме искомых компонен-
тов вносили вклад ортогональные составляющие скорости,
возникающие, возможно, при соударениях движущихся
частиц, а также составляющие диффузионного дви-
жения.
На рис. 3.15 приведен доплеровский спектр, полученный
по этой схеме в том же эксперименте и из того же измеритель-
ного объема, что и спектр, изображенный на рис. 3.12.
Спектр построен численным методом с помощью алгоритма
быстрого преобразования Фурье по дискретным выборкам
сигнала, прошедшего предварительную цифровую фильтра-
цию для устранения более высокочастотных компонентов,
которые могли бы исказить искомые компоненты вследствие
эффекта наложения частот. Разрешение по частоте состав-
ляет 0,1 Гц, время получения одного спектра — 55 с, что
не превышает времени квазистационарного движения частиц
в клетке.
J08
После обработки и запоминания 90 спектров строились
гистограммы значений частот, соответствующих хорошо
различимым максимумам. Статистическая обработка полу-
ченных результатов, проводившаяся методами проверки
Рис. 3.15. Доплеровский спектр,
полученный при регистрации рас-
сеянного света в плоскости, ор-
тогональной направлению основ-
ного потока протоплазмы
гипотез, показала, что зарегистрированные максимумы ста-
тистически достоверны, причем обнаруженная дискретность
в спектре со средним расстоянием между гармониками
3,6±0,6 Гц соответствует теоретическому расчету.
В то же время из полученных результатов пока не выте-
кает их явная связь с колебательным движением сферосом.
Для получения такой связи необходимо было бы выделить
свет, рассеянный только сферосомами, что не представля-
ется возможным, или же исключить периодические движе-
ния других рассеивающих структур. Исследования в этом
направлении продолжаются.
На основе большого экспериментального материала,
полученного с помощью ЛДС, построен ряд моделей меха-
низма генерации движущей силы, приводящей в движение
протоплазму харовых водорослей [66].
Другой пример применения ЛДС для исследования не-
стационарной внутриклеточной подвижности относится к
регистрации движения протоплазмы в слизевом грибе Phy-
sarum polycephalum [56, 59, 61, 67—70]. Этот объект су-
щественно отличается от рассмотренного выше по морфоло-
гии, характеру подвижности и оптическим свойствам. В тя-
жах, представляющих собой тонкие (100—500 мкм) и длин-
ные (1—2 см) трубочки, вследствие периодической сократи-
тельной активности стенок имеет место знакопеременное
течение протоплазмы с квазипериодом 7\,= 1—2 с.
На рис. 3.16 приведены три спектра, полученные от
тяжей при разной скорости течения протоплазмы. Спектр 1
получен при; минимальной скорости течения, спектр 3 —
109
при максимальной. Обращает на себя внимание существен-
ное отличие спектров, характерных для этого объекта, от
спектров, регистрируемых от клеток водоросли. Как пока-
зали расчеты и измерения на модельных капиллярах [71],
форма спектров определяется не только профилем скоростей
Рис. 3.16. Три доплеровских
спектра, полученные от плазмо-
дия миксомицета и соответствую-
щие разным скоростям течения
протоплазмы: и(/)<и (2)<ц (3)
в^измерительном объеме, но и статистическими парамет-
рами оптических светорассеивающих неоднородностей стен-
ки, ограничивающей поток. Применительно к данному
объекту второй из этих факторов оказывает превалирующее
влияние.
Понятно, что, судя по такому спектру, можно говорить
не о преимущественной или наиболее вероятной скорости
1Щф(±)1,ММ/С
2 4 О 8 10 t,MUH
Рис. 3.17. Временная зависимость ширины доплеровского спектра,
полученная от плазмодия миксомицета с челночным течением
протоплазмы
движения протоплазмы, а о некоторой эффективной ско-
рости иЭф или о средней интенсивности потока, опреде-
ляемой путем пересчета по формуле (3.3) полуширины
спектра на некотором фиксированном уровне. Тем не менее
изменение во времени этого параметра отражает кинетику
внутриклеточного транспорта протоплазмы.
На рис. 3.17 приведена типичная временная зависимость
модуля функции уэф(0, регистрируемая на однолучевом
по
спектрометре. Каждая точка этой кривой соответствует
полуширине спектра, полученного в результате усредне-
ния по 64 «мгновенным» спектрам, с общим временем изме-
рения 5 с.
Заметим, что подобные кривые, получаемые методом
ЛДС, и качественно, и количественно соответствуют дан-
ным, получаемым путем визуальных измерений и кино-
съемки через оптический микроскоп, однако отличаются
большим разрешением и не содержат элементов субъектив-
ности. Важным является также то, что обработка и пред-
ставление данных осуществляются в реальном масштабе вре-
мени и по окончании эксперимента кривые хранятся в па-
мяти ЭВМ в виде массивов чисел, готовых к последующей
дополнительной обработке.
Анализ подобных кривых, полученных при различных
условиях проведения эксперимента, в том числе в резуль-
тате многоточечного зондирования на многоканальном
варианте спектрометра [8, 56], дал большую информацию,
которая использована при построении моделей внутрикле-
точной подвижности [66, 68, 72, 731. В частности, исследо-
вано влияние квазистационарных и импульсных темпера-
турных воздействий, изменяющих период колебаний ско-
рости потоков Tv, показаны возможности синхронизации
этих колебаний внешним воздействием [2, 69], получены дан-
ные о возможной природе фактора, синхронизующего внут-
риклеточные осцилляторы (задатчики ритма) [8, 67], пока-
зано наличие активной сократительной работы тяжей, при-
водящей в движение протоплазму, [681 и т. д.
Лазерная доплеровская микроскопия. В приведенных
выше примерах применявшийся для измерений спектрометр
обеспечивал локальность зондирования около 100 мкм, что
было достаточно в связи со сравнительно большими раз-
мерами исследованных объектов. При работе с маленькими
клетками необходимо более высокое пространственное раз-
решение — порядка нескольких микрометров. Этого уда-
ется достичь в так называемых лазерных доплеровских мик-
роскопах (ЛДМ) благодаря использованию короткофокус-
ной оптики и специальной геометрии расположения эле-
ментов [74—84]. В большинстве случаев ЛДМ выполняют на
базе серийных оптических микроскопов, что делает их ком-
пактными, легко настраиваемыми приборами.
|На рис. 3.18 приведена блок-схема ЛДМ, выполненного
на основе микроскопа «Люмам» (/), сопряженного с микро-
ЭВМ (2) и снабженного для удобства настройки телекаме-
рой (3) и телемонитором (4) [84]. Конструкция микроскопа
111
позволила реализовать как дифференциальную, так и од-
нолучевую схемы (путем перекрытия одного из пучков) с
подведением зондирующих пучков к объекту либо снизу
(/), либо сверху (II). В первом случае фотоприемник (5)
регистрирует свет, рассеянный вперед, во втором — назад-
Рис. 3.18. Блок-схема лазерного доплеровского микроскопа
Измерительный объем формируется фокусирующим (б)
и приемным (7) объективами и точечной диафрагмой (8),
расположенной перед фотоприемником в плоскости изоб-
ражения. Так, при увеличении объективов 15 х и ЗОх и
размере диафрагмы 150 мкм продольный размер измери-
тельного объема ALi=7,5 мкм, а поперечный Д£г=2,5 мкм.
Масштабный коэффициент, связывающий измеряемую
скорость с доплеровским сдвигом частоты, составляет
1,3 мкм/(с-Гц).
До попадания на фокусирующий объектив оба пучка про-
ходят через управляемые акустооптические модуляторы (9),
112
в результате чего они приобретают относительный сдвиг
частоты А/, который может регулироваться в пределах от
102 до 105 Гц. Наличие разности частот у зондирующих пуч-
ков делает ЛДМ чувствительным к направлению исследуе-
мого потока и позволяет отстроится от малоинформативных
низкочастотных компонентов доплеровского сигнала [14].
Схема обработки фототока после усилителя (12) включает
в себя анализатор реального времени типа С4-72 (13) и/или
ЭВМ (2), снабженную дисплеем (15), дисководами с гибки-
ми магнитными дисками (16) и плоттером (17). Сигнал на
ЭВМ подается после дискретизации через интерфейсные бло-
ки (14), выполненные в стандарте КАМАК- Микроскоп снаб-
жен также видеомагнитофоном (18) для записи телеизобра-
жений объекта.
Описанный ЛДМ предназначен главным образом для
исследования направленных движений в клетках, однако
он имеет более широкую область применений.
С помощью лазерных доплеровских микроскопов получен
целый ряд уникальных результатов. В частности, зарегист-
рировано направленное движение частиц внутри одиночных
соматических клеток [82], проведено прямое наблюдение
накопления б-кристаллина в хрусталиках эмбриона цып-
ленка [83]. На фоне интенсивного направленного течения
протоплазмы в клетках водоросли обнаружена анизотро-
пия коэффициента трансляционной диффузии частиц по
разным направлениям внутри клетки [80, 81].
Эти и целый ряд других результатов показывают, что
ЛДС и ЛДМ уже стали эффективным средством, способным
решать широкий круг задач клеточной биофизики.
8
А. В. Приезжее
Глава 4
ИНТЕРФЕРОМЕТРИЧЕСКИЕ И ГОЛОГРАФИЧЕСКИЕ
МЕТОДЫ ДИАГНОСТИКИ
Рассматриваемые в данной главе методы применимы глав-
ным образом к практически прозрачным биологическим
объектам, к которым относятся в первую очередь оптиче-
ские ткани глаза. Кроме того, для интерферометрических
методов, в частности лазерной интерферометрии и спекл-
интерферометрии, одной из принципиальных особенностей
является использование их в качестве анализатора сетчат-
ки глаза человека.
4.1* Лазерная интерферометрия
Лазерная ретинометрия. Классические методы исследо-
вания функции зрения человека сводятся к определению
остроты зрения и поля зрения, которые в значительной сте-
пени зависят от состояния прозрачных сред глаза. От этого
избавлен метод определения ретинальной остроты зрения
(РОЗ), позволяющий определять разрешающую способ-
ность сетчатки. При ретинометрии лазерный пучок делят на
два пучка приблизительно равной интенсивности и направ-
ляют их в глаз таким образом, чтобы они перекрывались
на сетчатке. В результате наложения когерентных пучков
на сетчатке образуется интерференционная картина в виде
полос. Влияние рефракции глаза на число полос в значи-
тельной мере исключается, если оба пучка фокусируются в
узловой плоскости глаза (рис. 4.1). Расстояние между дву-
мя соседними максимумами интерференционной картины
на сетчатке определяется по формуле
L=DX/21, (4.1)
где'2/ — расстояние между двумя источниками в узловой
плоскости глаза, D — среднее расстояние от угловой плос-
114
кости глаза до сетчатки, % — длина волны лазерного излу-
чения.
Нормальная острота зрения определяется как угловая
разрешающая способность глаза. В данном случае она
Рис. 4.1. Фокусировка лазерных пучков при ретинометрии для
двух случаев ширины интерференционных полос на глазном дне:
1 — объектив, 2 — роговая оболочка глаза, 3 — хрусталик, 4 —
сетчатка, 5 — изображение на глазном дне
характеризуется плотностью интерференционных линий на
градус угла зрения:
W=[arcsin(Z/2Z)]-\ (4.2)
Плотность линий не зависит от расстояния между узловой
плоскостью глаза и сетчаткой, поэтому она одинакова для
глаз как с соразмерной, так и несоразмерной рефракцией.
Для глаз с соразмерной рефракцией наложение пучков
будет полным, в то время как при несоразмерной рефракции
пучки на сетчатке расходятся и наблюдается лишь частич-
ное перекрытие. Однако на практике этим эффектом обыч-
но пренебрегают, так как даже при аметропии ±-15 дптр
область перекрытия пучков, в которой возникают полосы,
уменьшается всего на 2° [1]. Этот факт определяет неоспо-
римое достоинство метода ретинометрии, поскольку про-
цедура определения РОЗ неизменна для любых глаз. Сле-
дует также отметить, что метод определения РОЗ достаточно
эффективно можно применять и при наличии непрозрачных
оптических сред глаза, в частности при катарактальном
хрусталике.
При сопоставлении РОЗ с остротой зрения, определяемой
по таблице оптотипов, необходимо иметь в виду в основном
8*
115
угловую ширину полос. При этом учитывается, что угловое
разрешение глаза в 1 угл. мин считается остротой зрения,
равной единице [2]. Пусть — угловое расстояние между
полосами, 3 — угловая ширина полосы, тогда плотность
полос на градус угла зрения N=\/alt а острота зрения в
предположении одинаковой ширины светлых и темных по-
лос V=\/S=2ai. Таким образом, при остроте зрения,
равной единице, 3=1, плотность полос на угол зрения со-
ставляет одну линию на 2 угл. мин или 30 полос на градус,
что соответствует нормальной остроте зрения, определяемой
по таблице оптотипов. Обычно, при ретинометрии пациент
способен различить полосы с угловой шириной, меньшей
единицы, что объясняется прежде всего тем, что определить
направление полос легче, чем различить оптотип таблицы,
имеющей более сложную конфигурацию. Поэтому в лите-
ратуре за единицу РОЗ чаще всего принимается величина,
равная 33 полосам на градус поля зрения [3].
Как показали проведенные экспериментальные иссле-
дования и анализ литературных данных, прибор для оп-
ределения РОЗ — ретинометр должен удовлетворять сле-
дующим требованиям. Во-первых, при определении РОЗ
должна быть обеспечена четкая и стабильная картина ин-
терференционных полос на глазном дне, во-вторых, должно
быть предусмотрено устройство для контроля за восприя-
тием” пациентом направления интерференционных полос,
для чего обычно применяется устройство, позволяющее ме-
нять направление полос на 180°. Фокусировку лазерного
излучения, очевидно, удобнее всего производить под конт-
ролем щелевой лампы, что особенно важно при наличии
помутнений в хрусталике глаза для поиска в нем микро-
скопических просветов. Диапазон измерения РОЗ должен
быть в пределах 0,01—1,5, поле зрения — 5—6°.
Различные схемы лазерных ретинометров, использую-
щиеся как в экспериментальной, так и в клинической прак-
тике, детально описаны в [5]. Прибор для определения
РОЗ, получивший распространение и в СССР, выпускает
фирма Rodenstock (ФРГ) [3]. Он построен на основе набора
плоскопараллельных пластин, выполняющих роль интер-
ференционных элементов (рис. 4.2). Свет от лазера 1 фо-
кусируется на поверхности плоскопараллельной пласти-
ны 3 линзой 2. Линзы 2 и 6 образуют телескопическую си-
стему с 20-кратным увеличением, позволяющим получить
поле зрения прибора не менее 5°. Плоскопараллельные плас-
тины 3 различной толщины расположены на диске, при вра-
щении которого регулируется диапазон измерения РОЗ.
116
Призма Дове 4 служит для изменения направления интер-
ференционных полос.
Ретинометр конструктивно расположен на микроскопе 5
щелевой лампы, фокусировка излучения происходит с по-
мощью выходного объектива
микроскопа. Достоинства при-
бора — простота конструкции,
малые габаритные размеры
и масса, а также его располо-
жение на щелевой лампе, опре-
Рис. 4.2. Схема ретинометра Рис. 4.3.J Схема анализатора
фирмы Rodenstock (ФРГ) [31 АРОЛ-1
деляют широкое распространение такого ретинометра в ме-
дицинской практике. Однако возможность только дискрет-
ного измерения РОЗ и технологические трудности получе-
ния тонких пластин для определения РОЗ ниже 0,1 огра-
ничивают его использование, особенно для научных иссле-
дований.
Применение бипризмы Френеля для разделения ла-
зерного луча позволило создать устройство, широко исполь-
зуемое в первых опытно-клинических исследованиях для
отработки методик определения РОЗ [4].
Лазерный ретинометр АРЛ-1 (анализатор ретины лазер-
ный) позволяет плавно менять ширину интерференционных
полос с помощью набора клиновидных пластин, размещен-
ных на поворотном диске [5]. Этот прибор обеспечивает ши-
117
рокий диапазон измерения РОЗ в пределах 0,03—1,2, боль-
шое поле зрения — до 8°. Большое поле зрения позволило
использовать анализатор АРЛ-1 для стимуляции тканей
сетчатки путем непрерывного изменения ширины интерфе-
ренционных полос, т. е. рекомендовать прибор и как тера-
певтический. Следует отметить, что отсутствие надежной
возможности визуального контроля точки входа лучей в
глаз пациента и сравнительно большие габариты являются
недостатками прибора.
Анализатор ретинальной остроты АРОЛ-1 свободен от
недостатков, присущих описанным выше приборам. Во-
первых, он выполнен как приставка к стандартной щелевой
лампе без ее модернизации; во-вторых, в отличие от рети-
нометра фирмы Rodenstock, прибор позволяет плавно ме-
нять ширину интерференционных полос в пределах 1,8—
60 угл. мин, что соответствует изменению остроты зрения,
определяемому по таблице оптотипов, 0,01—1,2 соответст-
венно. Наличие манипулятора позволяет эффективно ис-
пользовать прибор для определения РОЗ и при значитель-
ных помутнениях глазных тканей путем поиска под контро-
лем микроскопа щелевой лампы прозрачных участков.
Оптическая схема анализатора АРОЛ-1 представлена на
рис. 4.3. На оптической оси прибора последовательно рас-
положены: Не — Ne лазер 1 типа ЛГ-66; телескоп, образо-
ванный линзами 2 и 3; интерферометр Жамена (плоскопа-
раллельные пластины) 5. В одной из ветвей интерферометра
установлен оптический клин с переменным преломляющим
углом, образованный двумя линзами: плоско-вогнутой 6
и плоско-выпуклой 7, составляющих в сумме плоскопарал-
лельную пластинку. Линза 7 может перемещаться относи-
тельно линзы 6 в плоскости, перпендикулярной плоскости
чертежа. Далее вдоль оптической оси расположены: объек-
тив, образованный линзами 8 и 9, и поворотное зеркало ма-
нипулятора 10. Все элементы оптической схемы ретинометра
установлены в одном корпусе и закреплены на микроско-
пе щелевой лампы 11. В плоскости предметов микроскопа
щелевой лампы располагается входной зрачок пациента 13.
Для ослабления мощности лазерного излучения до безопас-
ного уровня служит ослабитель 4. Призма Дове 12 позволя-
ет менять направление интерференционных полос на 180°.
Отклонение ах одного из лазерных пучков зависит от
перемещения Д линзы 7 от оси и определяется выражением
ax=arctg (Д//7), где F — фокусное расстояние линзы. Та-
ким образом, перемещением линзы 7 относительно линзы 6
можно менять расстояние между вторичными источниками
118
на роговице глаза и, следовательно, ширину интерферен-
ционных полос на сетчатке глаза.
К настоящему времени определение РОЗ превратилось в
«рутинный» метод дифференциальной диагностики функ-
циональной способности глаза, причем получаемая с по-
мощью ретинометров информация недоступна другим диаг-
ностическим методам. Определение РОЗ позволяет прогно-
зировать результаты хирургического и консервативного
лечения при аномалиях рефракции, дефектах оптического
аппарата глаза и заболеваниях сетчатки, в том числе при
острых нарушениях кровообращения в ретинальных ар-
териях, а также при начальных и незрелых катарактах. И
только при плотных травматических катарактах и зрелых
старческих катарактах, а также при интенсивных тоталь-
ных помутнениях роговицы проводить измерения РОЗ обыч-
но не представляется возможным из-за значительного рас-
сеяния лазерного излучения.
Измерение толщины роговой оболочки глаза. Развитие
лазерных интерферометрических методов измерения толщи-
ны роговой оболочки глаза особенно актуально в связи с
широким внедрением в медицинскую практику операции
кератомии, с помощью которой изменяют кривизну рого-
вицы и соответственно рефракцию глаза, так как по сравне-
нию с используемыми в настоящее время методами они
обеспечивают более высокую точность, значительное про-
странственное разрешение и дистанционность измерений.
Рассмотрим один из таких методов, при котором сфоку-
сированный пучок Не—Ne лазера (Л=632,8 нм) отражается
от передней и задней поверхностей объекта. Регистрируя,
например, на фотопластинке ширину полос интерференцион-
ной картины, формируемой за счет отражения лазерных
пучков от задней и передней поверхностей роговой обо-
лочки, можно определить толщину роговицы. Пусть на рого-
вицу падает лазерный пучок интенсивности /0, а от перед-
ней и задней ее поверхности отражаются пучки интенсивно-
сти It и /2 (рис. 4.4). Тогда, считая роговицу сферическим
слоем, ее толщину можно представить в виде [8]
d = tRv/(t + Rf), (4.3)
где Rp — радиус кривизны роговицы»
(л2—sin8 ап)1/2
Г-М° s sin (2а а)
п — показатель преломления роговицы, /0 — расстояние
от роговой оболочки до экрана, s — ширина интерферен-
119
ционнои полосы, ап — угол падения лазерного излучения на
внешнюю поверхность роговицы.
На рис. 4.5 представлена схема прибора для определе-
ния толщины роговицы. Световой пучок Не—Ne лазера 1
после расширения до диамет-
ра 10 мм телескопом 2 фокуси-
руется с помощью объектива 3
на внешней поверхности рого-
вицы под углом 45° к оси ро-
говицы 4. От внешней и задней
поверхности отражаются два
луча, которые интерферируют
друг с другом, и интерферен-
ционная картина проецируется
Рис. 4.5. Схема прибора для
измерения толщины роговицы
Рис. 4.4. Схема отражения света
от поверхности роговицы
объективом 8 на видикон телекамеры 9. Интерференционный
фильтр 6 и поляризатор 7 служат для устранения фоновой
засветки и посторонних бликов, призма Дове 5 и объектив
8 — для ориентации и фокусировки интерференционных
полос на видиконе. Вся конструкция прибора монтируется
как приставка к щелевой лампе, под контролем микрос-
копа 1G которой осуществляется точная фокусировка из-
лучения на роговице глаза и выбор необходимой точки из-
мерений.
Сигнал с видеоусилителя телемонитора поступает на
блок обработки сигнала, состоящий из блоков выбора теле-
визионной строки и индикации, и далее в микро-ЭВМ. Мик-
ро-ЭВМ выдает информацию о координатах и результатах
измерений на печатающее устройство. Проведенные испы-
тания прибора показали перспективность его применения в
клинической практике, причем диапазон измерений тол-
120
щины роговицы составил 0,5—1 мм с погрешностью измере-
ний не хуже 0,5—1,0 %.
Спекл-интерферометрия. Наиболее чувствительным из
известных методов определения рефракции является метод
лазерной рефрактометрии, основанный на наблюдении
спекл-картины на движущемся экране. Принцип метода по-
ясняется рис. 4.6. С помощью оптической системы лазерное
Рис. 4.6. Схема лазерной рефрактометрии
пятно проецируется на экран, который перемещается от-
носительно глаза пациента. Направление движения спекл-
картины зависит от рефракции глаза: при гиперметропии
направление движения картины совпадает с направлением
движения экрана (положение /), при миопии — не совпадает
(положение ///), а при эмметропии пациент не различает
направления перемещения (положение //). Нейтрализуя
движение спекл-картины с помощью коррегирующих линз,
устанавливают степень рефракции глаза.
В качестве экрана обычно используется вращающийся
барабан с металлизированной поверхностью 1101, причем
угловая скорость со вращения барабана радиуса R6 связана
с линейной скоростью v выражением [11]
со = v cos2 Ф//?б cos р, (4.4)
где Ф и Р — углы падения на экран и наблюдения лазерно-
го пучка. Экспериментально установлено, что для получе-
ния максимальной чувствительности и повторяемости
результатов при определении остроты зрения с помощью ла-
зерной рефрактометрии угловая скорость со должна изме-
няться в пределах 1/8—1/12 мин-1. Чувствительность ме-
тода не хуже 0,125 дптр, хотя при этих исследованиях иногда
не полностью исключаются аккомодационные механизмы.
При помощи наблюдения спекл-картины можно изучать
Динамику кровотока в кровесносных сосудах сетчатки
121
[П. 33]. В этом случае для регистрации спекл-поля отражен-
ного от глазного дна пучка света Не — Ne лазера (Х=
=632,8 нм) используют кинокамеру (12]. Когерентная про-
странственная фильтрация изображений на кинопленке
позволяет выделить области со смазанными спеклами. При
этом по разности контрастов областей со смазанными
спеклами определяют распределение скоростей крово-
тока в сосудах сетчатки в широком диапазоне скоро-
стей [13].
Локальный кровоток в пальцах рук определялся в [141
с помощью изменяющейся во времени спекл-структуры (ди-
намическая спекл-структура). Очевидно, метод доплеров-
ского измерения скорости потока крови ограничен случая-
ми, когда кровеносный сосуд можно экспонировать лазер-
ным пучком, как это имеет место в случае сетчатки глаза,
или когда в него можно ввести соответствующий зонд. Од-
нако при измерениях'потока крови у поверхности кожи про-
исходит полное усреднение распределения фаз светового
поля, поэтому в подобных случаях можно говорить о динами-
ческой спекл-структуре. Было замечено, что при регистра-
ции спекл-структуры от освещенной фаланги пальца кар-
тина флуктуировала случайным образом, однако при уве-
личении времени экспозиции до 1 с она размывалась (умень-
шался контраст) и стабилизировалась, если не происходило
никаких внешних изменений. При наличии возмущений
контрастность становится функцией этих возмущений. При
этом при исследованиях локального кровотока быстрый
компонент составляющей спекл-картины обусловлен дви-
жением крови в капиллярах, медленный — деформацией
или колебаниями внешней поверхности кожи.
Клинические опыты проводились на установке, в которой
участок кожи освещался пучком света Не — Ne лазера
(Х=632,8 нм) с помощью многомодового оптического воло-
конного световода с диаметром сердцевины 80 мкм, а рас-
сеянный световой сигнал собирался одномодовььм волокон-
ным световодом с диаметром сердцевины 5—7 мкм. Исполь-
зование двух типов волокон давало высокую мощность
освещения, большое отношение сигнал/шум за счет устране-
ния колебаний волокна в отличие от применения многомо-
довых световодов [15]. Анализ рассеянного света спектроана-
лизатором для различных участков кожи человека пока-
зал, что спектральная плотность монотонно спадала при
увеличении частоты, а по наклону спектральной кривой
определялся относительный поток крови в различных
экспериментальных условиях.
122
4.2. Голографические методы диагностики
Так же как и интерферометрические, голографические
методы наиболее широко используются в офтальмологии,
хотя и здесь трудно говорить о разработке приборов — боль-
шинство исследований относятся пока к развитию принци-
пов голографирования биообъектов и соответствующих
методик измерений. Очевидно, наиболее перспективны сле-
дующие основные направления использования голографи-
ческих методов в офтальмологии: получение трехмерных
изображений всего глаза или его частей, исследование оп-
тических постоянных глаза и измерение внутренних струк-
тур глаза с высоким разрешением [16, 17].
Наибольшее число известных исследований относится к
получению изображения внутреннего объема глаза, раз-
работке оптических схем для широкоугольной голографи-
ческой фотографии. Одна из голограмм глаза животного
in vivo получена в [18] при использовании излучения Не —
Не лазера (Х=632,8 нм) мощностью 58 мВт при экспозиции
1/250 с. Авторы работы применили роговичную контактную
линзу для предотвращения высушивания роговицы и исклю-
чили «паразитные» зеркальные отражения от структур гла-
за и контактной линзы благодаря ортогональным поляри-
зациям «паразитных» и интерферирующих пучков. Были
получены фотографии кровеносных сосудов, однако основ-
ное преимущество голографических методов исследования—
трехмерное изображение объектов — не было реализовано.
Это связано в основном с тем, что при записи голограмм ав-
торы не использовали стандартную офтальмологическую
аппаратуру с достаточным разрешением, и поэтому наблю-
дались значительные аберрационные искажения получен-
ных изображений.
Для получения голограмм глазного дна с помощью двух-
лучевой схемы в [19, 20] применялась стандартная фундус-
камера с заменой ксеноновой лампы аргоновым лазером, из-
лучение которого использовалось для освещения тканей
глазного дна и получения опорного пучка. Проведенные ис-
следования на животных показали, что голографические
методы обладают сравнительно низкой разрешающей спо-
собностью (около 100 мкм) и невысокой контрастностью по-
лучаемых изображений (2 : 1), что объясняется присутст-
вием спекл-структуры, замазывающей микроструктуру ос-
новного изображения.
Для получения голографического изображения тканей
глазного дна использовался также импульсный лазер на
123
стекле с неодимом с преобразованием длины волны во
вторую гармонику (Х=530 нм) [21]. Восстановление голо-
грамм осуществлялось с помощью аргонового лазера (%=
=514,5 нм). Оптическая схема установки представлена на
рис. 4.7. Излучение лазера 1 (степень пространственной ко-
герентности которого близка к единице, длина когерент-
ности больше 30 см, выходная энергия до 2 Дж при дли-
тельности импульса 3-10-8 с) после прохождения телеско-
пической системы, образованной линзами 2 и 3, направляет-
Рис. 4.7. Схема установки для голографического исследования
тканей глазного дна
цилиндрических волокон, из которой излучение выходит
двумя коническими поверхностями с углом при вершине
2ф. Объектив 7 офтальмоскопа проецирует кольцевое от-
верстие диафрагмы 5 на роговицу глаза 11. Отраженное от
исследуемых тканей глаза излучение попадает на фотоплас-
тинку 6, опорный пучок также направляется на фотоплас-
тинку 6 с помощью светоделительного клина 8, блока призм
9 и зеркала 10.
В этом устройстве угол зрения составляет 85°, что яв-
ляется существенным прогрессом для аналогичных уст-
ройств, и, как отмечают авторы, может быть увеличен. Как
показали проведенные исследования на глазах кроликов
in vivo, используемые уровни энергии (от 0,3 до 1,3 Дж на
входе в офтальмоскоп) не вносят органических измене-
ний в облучаемые ткани, несмотря на то что они значи-
тельно превышают ПДУ (гл. 1). Хотя контраст картины
был пока недостаточным, тем не менее метод особенно пер-
спективен при локализации внутриглазных инородных тел,
а также при изучении различных объемных процессов,
таких как опухоли, отеки, отслойки и др.
В 117] существенное повышение качества объемных изоб-
ражений было достигнуто также с использованием одно-
124
проходной голографической регистрации, в качестве базо-
вого метода которой использовался метод флуоресцентной
ангиографии, состоящий в возбуждении люминесценции
красителя (раствор флюоресцеина-Na), введенного в кровь,
и фоторегистрации изображения глазного дна. В результате
были получены голографические изображения сосудов диа-
метром до 10 мкм и с контрастом 25 : 1. По-видимому, пред-
ложенный метод является одним из наиболее перспектив-
ных.
Таким образом, полезность использования методов оп-
тической голографии для биомедицинской диагностики, в
частности в офтальмологии, не вызывает сомнений, однако
имеется целый ряд трудностей, препятствующих переходу
от экспериментов на животных к клиническому их приме-
нению. Преодоление этих трудностей связано с дальнейшей
оптимизацией параметров лазерного излучения и схем ре-
гистрации голограмм.
Глава 5
АБСОРБЦИОННЫЕ И КАЛОРИМЕТРИЧЕСКИЕ МЕТОДЫ
ДИАГНОСТИКИ
При решении целого ряда диагностических задач в био-
логии и медицине хорошо себя зарекомендовали абсорбцион-
ные методы, которые обычно применяются в лазерной ана-
литической спектроскопии или спектроскопии ультрабыст-
рых процессов, [П. 1 — П. 3, П. 40 — П. 43, 1.12, 1]. Эти
методы относятся к методам микродиагностики, поскольку
в них используется информация об атомной и молекуляр-
ной структуре исследуемого вещества биообъекта. Схемати-
ческое представление некоторых методов микродиагности-
ки дано на рис. 5.1. В общем случае к абсорбционным ме-
тодам относятся как абсорбционно-трансмиссионные, ос-
нованные на измерении интенсивности падающего /а и
прошедшего / света разных длин волн, так и методы, осно-
ванные на регистрации поглощенной энергии путем измере-
ния температуры АТ нагрева биообъекта (оптико-калори-
метрические методы) или интенсивности /ф его флуорес-
ценции (лазерный флуоресцентный анализ).
Поскольку лазерный флуоресцентный анализ в примене-
нии к биологии получил весьма широкое распространение и
имеет самостоятельное значение, он будет рассмотрен в от-
дельной главе, а здесь будут обсуждены возможности аб-
сорбционно-трансмиссионных методов, а также перспекти-
вы применения оптико-калориметрических методов. Класси-
фикация абсорбционных методов диагностики и некоторые
их модификации даны на схеме 2.
5.1. Абсорбционно-трансмиссионный анализ
с использованием перестраиваемых лазеров
Методика измерений, предельная чувствительность. Из-
мерение спектра пропускания вещества в различных агре-
гатных состояниях является основой спектрофотометриче-
126
127
2. Классификация абсорбционных методов диагностики и некоторые их модификации
окого способа, который успешно применяется на протяже-
нии многих лет в различных областях науки, в том числе в
биологии и медицине. Его отличает чрезвычайная простота,
универсальность, сравнительно высокая чувствительность
М+,е~,(М+сЛ
л Фотоионизация
(а томно - ионизационные
и масс-спектрометри-
ческие методы
Фотохимические процессы
hvf
Поглощение
(абсорбционно -
трансмисси -
онные
методы)
Флуор ecu, енция
(лазерный „
флуоресцентный
безызлуча-
тельная
релаксация
Нагреб Образца
(оптико-ка'лори -
метрические
методы)
М
?Рис. 5.1 • Схематическое представление ряда методов микродиаг-
ностики
анализ)
и точность анализа, вполне достаточные при решении мно-
гих задач биомедицины.
Измерение спектра пропускания основано на регистра-
ции интенсивности падающего (/0) и интенсивности прошед-
шего в поглощающей среде путь z света (/) в зависимости
от длины волны X:
/(X, z) = /0(X)exp[—a(X)z], (5.1)
a(X) = o(X)W, (5.2)
где a(X) — коэффициент поглощения; о(Х) — эффективное
сечение поглощающих частиц (см2); N — их концентрация
(см“3). Предполагается, что интенсивность падающего све-
та очень мала. Для небольших коэффициентов поглощения,
когда ехр(—az)«l—az, легко найти, что
a(X)«[/0(X)-/(X, z)]//0(%)z = AZ(X, z)//0(X)z. (5.3)
В нелазерных спектрофотометрах используются широ-
кополосные источники света, а перестройку по длинам волн
осуществляют с помощью призм или дифракционных реше-
ток. Для узких линий поглощения чувствительность зависит
128
не только от способности прибора зарегистрировать малые
изменения А/ на фоне значительного прошедшего сигнала,
но и от разрешающей способности прибора. Обычно пре-
дельная чувствительность достигается при A//ZZ>10-4—
10-?.
Использование лазеров позволяет: 1) существенно повы-
сить спектральную разрешающую способность метода, оп-
ределить форму и структуру линий поглощения молекул;
2) для узких линий поглощения несколько повысить чувст-
вительность; 3) в некоторых случаях упростить и удеше-
вить экспериментальную установку, поскольку монохрома-
гор (обычно составляющий наиболее объемную и дорогую
часть установки) при наличии лазера оказывается ненуж-
ным (следует помнить, что некоторые перестраиваемые лазе-
ры также представляют собой технически сложные и доро-
гие устройства); 4) за счет высокой спектральной плотно-
сти излучения лазеров снизить влияние шумов фотоприем-
ного устройства (сам лазер за счет нестабильности выходной
мощности и частоты может внести погрешности в результа-
ты измерений, поэтому необходим контроль или стабилиза-
ция параметров лазера, что довольно просто реализуется на
практике); 5) за счет высокой направленности и простран-
ственной когерентности лазерного излучения осуществить
дистанционные и трассовые измерения поглощения. В слу-
чае измерения слабых поглощений в газах и жидкостях
можно применять многоходовые кюветы, насчитывающие
до 30—100 проходов [П. 42], а также полые стеклянные и
кварцевые оптические волокна длиной до 150 м [П. 43].
Преимущества лазерных источников света особенно про-
являются в ИК области спектра при исследованиях от-
дельных вращательных линий колебательных полос, кото-
рые обычными спектральными приборами не разрешаются.
Итак, пороговая чувствительность абсорбционного мето-
да определяется способностью регистрирующей аппарату-
ры определять наименьшее значение отношения AZmin/Z.
Чувствительность метода может быть охарактеризована по-
Разному [П. 42]. Пороговая чувствительность по оптической
плотности
Hmin = («Omin ~ Д/min//
или по коэффициенту поглощения
amin = (VO Д/min//»
где I — длина образца. Обычно система регистрации с ис-
пользованием лазеров обеспечивает значение A/min/Z=10~\
’ А. в. Приезжее 129
Минимальное число детектируемых на пути лазерного пуч-
ка радиуса w молекул
их концентрация
Mnln “ (1/^0 Ы min/Л
а также минимально обнаруживаемая концентрация при-
месных молекул
Сщ’ш ~ (l/oW0)A/min//.
При 10=0,6 см, сг=10~17 см2, /=10 см, Af0=1018 см-3 (пол-
ное число молекул) и Д/т1п//=1и-6 имеем Afmln«1012;
A^mta«10“ см"3; amin «10"» см'1; Cmin «10"7 (100 ppb)
[П. 42]. Это характеристика следовых количеств одного ве-
щества в другом: ррш (млн-1, частей на миллион, мкг/г);
ppb (млрд-1, частей на миллиард, нг/г); ppt (трлн-1, час-
тей на триллион, пг/г).
Применения многоходовых кювет, модуляционных и диф-
ференциальных методик измерения полезного сигнала, поз-
воляют существенно повысить чувствительность метода.
Если амплитудная модуляция интенсивности зондирующего
излучения и модуляция поглощения могут быть реализова-
ны для любых источников света, то многократное прохож-
дение среды (до 100 раз) и частотную модуляцию зондирую-
щего излучения можно получить только при использовании
лазеров. Таким образом была реализована рекордная для
ИК спектрометров на инжекционных лазерах пороговая
чувствительность amln «3-10-10 см-1. Для лазерных спек-
трометров из-за высокой когерентности света сильным ме-
шающим фактором являются интерференционные эффек-
ты в оптической схеме устройства. Этим в основном и опре-
деляются достигнутые значения amln [П. 42].
Существенно повысить чувствительность метода (в 102—
10Б раз) можно при использовании внутрирезонаторного
поглощения, когда кювета с исследуемым веществом раз-
мещается внутри резонатора [П. 42, П. 43, 1.12]. Это повы-
шение происходит по трем главным причинам. Во-первых,
автоматически реализуется большое число проходов (до
нескольких сотен, если исследуемый объект не вносит зна-
чительных потерь). Во-вторых, благодаря характерной для
лазеров зависимости выходной мощности от потерь в резо-
наторе устраняется основная причина малой чувствитель-
ности абсорбционного метода, поскольку фактически изме-
ряется не отношение Д///, а само значение Д/. И в-третьих,
в режимах генерации связанных волн (многомодовый двух-
130
зеркальный лазер или кольцевой лазер) эффекты конку-
ренции связанных волн существенно повышают чувстви-
тельность лазеров к изменениям потерь внутри резона-
тора.
Внутрирезонаторный метод перспективен для регистра-
ции очень слабых линий поглощения веществ, загрязняю-
щих атмосферу, короткоживущих продуктов химических
(биохимических) реакций, радикалов и нестабильных моле-
кул. Для создания высокочувствительных спектрометров,
работающих на принципе измерения внутрирезонаторного
поглощения, в большей степени подходят перестраиваемые
лазеры с широкими линиями и значительным запасом по
усилению. В видимой области — это лазеры на красителях,
в ИК области — лазеры на центрах окраски.
Основные области применения в биологии и медицине.
Абсорбционно-трансмиссионный анализ весьма универса-
лен и может быть с успехом применен при исследовании га-
зов, жидкостей и твердых тел. Исследование сред в различ-
ных агрегатных состояниях является предметом биомеди-
цинской диагностики. Газовый анализ, например, необхо-
дим при определении газообразных компонентов жизнедея-
тельности живых организмов, определении следовых кон-
центраций загрязняющих веществ (задачи санитарии
и профпатологии) и пр.
Для лазерного контроля загрязнений атмосферы раз-
работаны многочисленные средства, многие из которых ос-
нованы на измерении поглощения Ш. 40, П. 42]. Контроль
осуществляют путем отбора проб с последующим абсорб-
ционным анализом в многоходовых кюветах пониженного
давления. Проводят трассовые измерения поглощения за-
грязняющих компонентов с применением разнесенных ис-
точника света и фотоприемника, удаленных зеркального
отражателя или естественного рассеивателя, используя при
этом дифференциальные методики измерений. Применяют
также гетеродинные измерения.
Обычно загрязнители имеют характерные линии по-
глощения в ИК области спектра, поэтому наиболее часто
используются лазерные спектрометры на основе инжекцион-
ных и молекулярных СО и СО2 лазеров, обеспечивающих
необходимую перестройку в диапазоне 2,5—46,2 мкм.
С инжекционным лазером порог обнаружения таких за-
грязнителей воздуха, какЗО2, N2O, NH3 и NO2, находится
в пределах от 1 ррЬдо 10 ppt, а для НС! — 0,1 ppm, HF —
0>5 ppm. Можно определять содержание HCN, Н2О, СН4,
С2Н0 в сигаретном дыме, а также содержание токсических
9*
131
примесей в выхлопных газах автомобилей, например бен-
зола, на уровне 1 ppm [П. 42]. Для СО2 лазера с дискретной
перестройкой частоты измерения при атмосферном давле-
нии методом дифференциального поглощения (зондирование
атмосферы на двух длинах волн) дают порог обнаружения
типичных органических молекул загрязнителей порядка
2,5-10"’—5,5-10“6% на одном километре [П. 40].
Биологические объекты по большей части представляют
собой конденсированные среды — жидкости или твердые
тела. Линии поглощения таких сред значительно уширены,
поэтому в принципе не требуется высокая степень монохро-
матичности лазерного излучения. Однако лазеры и в этих
случаях оказываются весьма полезными. Во-первых, уз-
кая линия их излучения позволяет отстраиваться от цент-
ра линии поглощения сред с высокой оптической плот-
ностью и тем самым обеспечивать линейную зависимость
поглощения от концентрации. Во-вторых, высокая спект-
ральная яркость лазеров позволяет проводить измерения
поглощения в оптически плотных образцах. Например, для
инжекционных лазеров Dmax = (a/)max«12 [П. 42].
Биологические среды — это оптически неоднородные
среды, поэтому они, как правило, сильно рассеивают свет.
Это обстоятельство в значительной мере усложняет или даже
делает невозможным измерение спектров пропускания, вы-
зывает необходимость переходить к другим способам изме-
рения спектров поглощения. При наличии рассеяния коэф-
фициент а (%) из (5.1), (5.2) имеет уже смысл коэффициен-
та ослабления и определяется концентрацией не только
поглотителей, но и рассеивателей на пути лазерного пучка.
Выражения (5.1) и (5.2) сохраняют свою форму, однако
<т=о0. Эффективное сечение ослабления учитывает как по-
глощение, так и рассеяние:
сто = ап + ®р*
Для сферических частиц радиуса а
Oo = (Qn + Qp)na,!.
коэффициенты Qn и Qp в общем случае определяются на ос-
новании теории Ми. Максимальное значение этих коэффи-
циентов достигается при и составляет 1—5 [П. 40].
При наличии многих компонентов, поглощающих и рассеи-
вающих свет, что также характерно для биосистем, (5.2)
имеет вид
a0(M=2oo,-W^,
i
132
где Оо^^пг+^рь Nt — концентрация частиц Z-ro компо-
нента.
Очевидно, что в таких условиях в рамках спектрофото-
метрической методики поглощение уже не может быть опре-
делено без привлечения характеристик рассеяния. Для
сравнительно прозрачных сред используют комбинирован-
ные методики, в основе которых лежит измерение спектров
диффузного отражения биообъектов и спектров пропуска-
ния. Например, при исследованиях параметров крови (оп-
ределении процентного содержания кислорода в цельной
крови, концентрации общего (тотального) гемоглобина кро-
ви, концентрации метагемоглобинов) представляет большой
интерес метод, использующий измерение диффузного ко-
эффициента отражения /?д и относительного пропускания
слоев крови двух толщин т12 [2, 3]. В этом случае показа-
тель поглощения единичной толщины
о'п (*) = У (*•) In т12 (X)/(Z2 — ZJ,
где Z2 и li — толщины двух слоев; у — параметр, опреде-
ляемый по измеряемому коэффициенту отражения
/?д (X) = 0,51 ехр {—5,2t/ (%)}/[! —0,48 ехр {—4у (%)}].
Лазеры довольно успешно используются для диагности-
ки различных заболеваний, хотя пока лазерные методы не
приобрели должной популярности. В [П. 39] представлен
краткий обзор методов медицинской диагностики, написан-
ный в основном по материалам зарубежных патентов, мно-
гие из которых используют абсорбционные или комбини-
рованные методики измерений. Например, предлагается
простой и быстрый способ подсчета эритроцитов и тромбо-
цитов, основанный на измерении интенсивности прошедше-
го и рассеянного света на длинах волн сильного поглощения
эритроцитов (415 или 540 нм). Частицы крови проходят по
одной через область, освещаемую излучением. В качестве
источников света может быть взят либо лазер на красителях,
либо Аг лазер с А=413,1 нм. Перспективен для этих целей
и Не — Ne лазер с Х=543,3 нм.
Можно реализовать подсчет и классификацию частиц
крови по размеру и их жизнеспособности при измерениях
интенсивности поглощенного частицей излучения Не —
Ne лазера с Х=632,8 нм. С использованием этого лазера мож-
но также определять концентрацию жизнеспособных тром-
боцитов в пробе крови, предназначенной для переливания.
Обзор оптических методов и устройств для счета частиц, в
том числе и биологического происхождения, взвешенных
133
в жидких средах, дан в [П. 48]. Рассмотрены методы, осно-
ванные на поглощении и рассеянии света, а также теневые
и дифракционные.
Содержание кислорода, углекислого газа, окиси угле-
рода и других веществ, включая различные продукты ме-
таболизма (мочевина, глюкоза, этиловый спирт, полипеп-
тиды и пр.), растворенных в крови человека, является
важнейшей информацией о жизненно важных процессах,
происходящих в организме. Измерение степени насыщения
крови кислородом основано на значительных изменениях
в спектрах поглощения насыщенной и не насыщенной кис-
лородом крови.
Из данных табл. 1.1 вытекает, что уменьшение насыщен-
ности крови кислородом приводит к почти трехкратному
возрастанию коэффициента поглощения вблизи Л=620 нм.
Отсюда следует простой метод оценки содержания кисло-
рода в крови при использовании самого доступного Не —
Ne лазера с %=632,8 нм. Однако точные измерения с по-
грешностью 1—5 % могут обеспечить только более сложные
методики [2, 3], использующие измерение как прошедшего,
так и диффузно отраженного света на нескольких длинах
волн, включая изобестическую длину волны Х=805 нм,
для которой коэффициенты поглощения насыщенной и не
насыщенной кислородом крови совпадают (табл. 1.1).
Преимущества лазеров в полной мере раскрываются при
измерении концентрации растворенных в крови газов и про-
дуктов метаболизма непосредственно через кожу человека
[П. 39]. Метод основан на том, что окись углерода, кислород,
углекислый газ и разнообразные органические вещества
хорошо поглощают в ИК области спектра, где работают
перестраиваемые СО, СО2 и инжекционные лазеры. На-
пример, для крови с большим содержанием СО, СО2 и О2
максимумы поглощения наблюдаются на длинах волн 4,3;
5,13 и 9 мкм. Для глюкозы характерные линии поглоще-
ния находятся на 2,8; 4,8 и 6,1 мкм.
Техника измерений может быть различной. Можно из-
мерять коэффициент пропускания тонкого слоя ткани в об-
ласти между большим и указательным пальцами человека,
в ушной раковине и т. д. либо использовать пластинку пол-
ного внутреннего отражения, по которой пропускается свет
(5 отражений) и которая прикладывается к исследуемому
объекту (кожа, язык и пр.). При исследовании внутренних
органов можно использовать волоконно-оптический кате-
тер. Для определения количественного содержания ука-
занных веществ в крови необходима предварительная ка-
134
чибровка устройств с помощью эталонных проб. Точность
определения существенно зависит от стабильности излуче-
ния лазеров. Многие из предлагаемых устройств могут быть
использованы и в лабораторной диагностике проб крови и
других биологических жидкостей, например мочи.
Измерение коэффициентов отражения биотканей в про-
цессе их коагуляции необходимо для контроля термохими-
ческих процессов в очаге коагуляции, определяющих ко-
нечный результат воздействия. Такой контроль, в частно-
сти, применяют в офтальмологии для коагуляции тканей
глазного дна [4]. Обнаружено, например, сильное увели-
чение отражения излучения на %=441,6 нм от тканей глаз-
ного дна при коагуляции сетчатки излучением аргонового
лазера (514,5 нм).
Специально для медицинских применений разработаны
лазерные биофотометры, предназначенные для определения
отраженной, поглощенной и прошедшей энергии биотканя-
ми поверхностных и внутренних органов [П. 28, П. 37].
В сочетании с перестраиваемыми лазерами (или набором
лазеров разных длин волн), волоконно-оптическими устрой-
ствами канализации излучения и обработкой результатов
измерений на ЭВМ такие фотометры окажутся полезными
для диагностики патологических тканей во многих разделах
медицины (например, стоматологии, офтальмологии и пр.).
При исследовании оптически плотных биологических об-
разцов единственным информативным параметром остает-
ся коэффициент диффузного отражения, который несет
информацию о спектре поглощения вещества. Примерами
таких исследований являются экспрессные методы анализа
биологической ценности зерна различных сельскохозяйст-
венных культур, успешно реализованные в устройствах с
тепловыми источниками, в которых селекция по длинам
волн осуществляется с помощью набора узкополосных
фильтров [5]. Зондирование образца (целого, размолотого
зерна (шрота или муки)) на характерных длинах волн в диа-
пазоне 1,5—2,5 мкм при соответствующей калибровке и ма-
тематической обработке результатов на ЭВМ позволяет оп-
ределять содержание в нем белка, жира и влаги.
Калибровка, являющаяся наиболее трудоемкой частью
методики, заключается в установлении корреляционной за-
писимости между спектром анализируемого компонента и
спектром отражения целого и размолотого зерна с после-
дующим нахождением функциональной зависимости содер-
жания компонента, определяемого химическим путем и из
спектров отражения на отдельных длинах волн. Калибров-
135
ка проводится на большом массиве образцов (30—60).
Типичные значения коэффициентов корреляции на рабочих
длинах волн для разных культур лежат в диапазоне 0,78—
0,99. Среднеквадратическая погрешность спектрофотомет-
рического анализа обычно составляет 10—25 % при досто-
верности 90—98 %. Аналогичные исследования в видимой
области (410—500 нм) позволяют определять содержание
каротиноидов в крупке пшеницы (среднеквадратическая
погрешность 24 % при достоверности 90 %, коэффициент
корреляции 0,9).
Применение лазеров в рамках рассматриваемой методи-
ки, помимо увеличения отношения сигнал/шум, должно
обеспечить высокую локальность анализа, вплоть до иссле-
дования отдельного зерна и даже отдельных малых областей
целого зерна, что можно использовать в селекционной ра-
боте при разбраковке семян.
5.2. Абсорбционная спектроскопия быстропротекающих
процессов
Методы ультрабыстрой лазерной спектроскопии позво-
ляют проводить исследования динамики внутреннего дви-
жения биомолекул. Во многом именно потребности иссле-
дований структурной динамики биомолекул стимулировали
развитие пико- и субпикосекундной спектроскопии, в том
числе и абсорбционной спектроскопии быстропротекающих
процессов [П. 1 — П.З]. С помощью этих методов исследу-
ются сверхбыстрые процессы колебательного и электронного
возбуждения биомолекул, а также динамика химических
реакций с их участием.
Абсорбционные методы позволяют определять полное
время релаксации биомолекул в основное состояние, время
их колебательной релаксации, скорость передачи возбуж-
дения в смеси биомолекул, скорость передачи заряда между
биомолекулами в смеси акцепторов и доноров, динамику
фотодиссоциации биомолекул в растворе, скорость конформа-
ционных изменений и пр. Исследуются первичные процес-
сы фотосинтеза организмов — пурпурных и зеленых бакте-
рий; динамика фотосистем I и II в зеленых растениях и
водорослях; первичные стадии преобразования энергии света
родопсинами при изучении фотохимии зрения и биоэнерге-
тики галофильных бактерий (бактериородопсин); фотообра-
тимые фотохромные пигменты (фитохром), выполняющие
биорегуляторные функции в клетках многих простейших и
растений; динамика фотодиссоциации гемопротеинов (ге-
136
моглобина и миоглобина) и др. Характерные времена рас-
сматриваемых процессов лежат в довольно широком диапа-
зоне: 0,6—200 пс, требуемый диапазон длин волн лазерного
излучения для их исследования составляет 460—880 нм.
Основная идея абсорбционной спектроскопии с исполь-
зованием сверхкоротких импульсов заключается в том,
чтобы «уйти» от прямых измерений длительности импульса,
прошедшего поглощающую среду. Поэтому применяют два
последовательных световых импульса, первый из которых
переводит биомолекулы из основного в возбужденное со-
стояние, а второй, задержанный на пико- или субпикосе-
кундный интервал времени, так называемый измерительный
импульс, регистрирует изменение спектра поглощения ис-
следуемого объекта. В данном случае инерционный фотоде-
тектор фиксирует те изменения в спектре поглощения, ко-
торые [произошли за время, определяемое временной за-
держкой.
Возможны самые разнообразные схемы, реализующие
эту идею, см., например, [П. 1 — П. 3, 1.35]. При этом воз-
буждающий и пробный импульсы могут иметь одинаковые
и разные длины волн, возбуждающий и зондирующий ла-
зерные пучки могут быть взаимно перпендикулярны и почти
коллинеарны, в качестве регистрирующего элемента могут
быть использованы: фотопленка, фотодиодные матрицы, ви-
деокамеры, оптические многоканальные анализаторы, и от-
дельные фотодетекторы. Могут быть реализованы схемы с
одиночными возбуждающим и пробными импульсами и с
многократным их повторением, с широким спектром зон-
дирующего излучения и пр.
При исследованиях скоростей ориентационной и вра-
щательной релаксации, а также скорости передачи элект-
ронной энергии молекул в жидкостях используется одна из
модификаций метода, которая основана на анализе наведен-
ной поляризованным возбуждающим импульсом анизотро-
пии в среде с помощью измерения поглощения пробного им-
пульса для различных взаимных ориентаций поляризации
возбуждающего и пробного импульсов [П. 1].
Наибольшее распространение при изучении фотохими-
ческих процессов перестройки структуры биомолекул полу-
чил так называемый метод дифференциальной абсорбцион-
ной спектроскопии, который основан на регистрации диф-
ференциальных спектров поглощения, представляющих со-
бой разность между спектрами поглощения до возбуждения и
спектрами, зарегистрированными в различные промежутки
времени после возбуждения. Изменение оптической плот-,
137!
ности исследуемого объекта ДО(Х, f) определятся соотно-
шением [6, 71
ДР(%, 0=----lg(£/£0),
где Ё—Еа/Еоп и Ё0=Е^/Еоп — отношение энергий проб-
ного и опорного импульсов, прошедших через исследуемый
образец при возбуждении и без возбуждения.
В качестве примера на рис. 5.2 и 5.3 представлены схемы
двух типичных субпико- и пикосекундных абсорбционных
Рис. 5.3. Схема пикосекундного абсорбционного спектрометра на
базе параметрических генераторов света [7]
спектрометров, реализующих дифференциальную методику,
измерения спектров поглощения, почти коллинеарное рас-
пространение возбуждающего и пробного световых пучков,
переменную оптическую линию задержки импульсов.
В первой схеме импульс света гигаваттной мощности дли-
тельностью ти=100 фс на длине волны %=615 нм делится
между каналами возбуждения и зондирования. В канале
возбуждения импульс через оптическую линию задержки /,
138
нейтральный светофильтр 2 попадает на образец 3 и далее
на монохроматор 4. В канале зондирования происходит
преобразование излучения в субпикосекундный континуум
(ВКР преобразование в сантиметровой кювете с водой, 5,
6 — красные светофильтры). Этот пучок далее делится на
два: пробный и опорный. Пробный совмещается с возбуж-
дающим пучком, а опорный после фильтрации с помощью
сине-зеленого светофильтра 7 используется для получения
информации о спектре поглощения среды в отсутствие воз-
буждения. Изменение временной задержки импульсов по-
зволяет изучать кинетику процессов, а перестройка моно-
хроматора — изменения в спектре наведенного поглощения
на выбранных длинах волн. Сигналы после монохроматора
принимаются фотоприемниками 8, 9, оцифровываются с
помощью цифровых вольтметров 10 и вводятся через ин-
терфейс 11 в управляющую ЭВМ 12, которая осуществляет
накопление данных по многим лазерным вспышкам, их
усреднение и вычисление среднеквадратической погрешно-
сти, а также управление работой всего спектрометра.
Вторая схема построена на основе параметрических гене-
раторов света (ПГС), отличается высокой степенью автома-
тизации измерений и обработки данных (рис. 5.3). Это по-
зволяет проводить исследования широкого класса биообъек-
тов с малой погрешностью измерения оптической плотно-
сти, вплоть до 2-10-4. Источником накачки является
АИГ : Nd лазер 1 с системой выделения моноимпульса 2
и усилителем 3, что определяет высокую надежность и ста-
бильность работы спектрометра. Возможна замена задаю-
щего лазера на лазерную систему на фосфатном стекле, что
позволяет на порядок увеличить временное разрешение
спектрометра. Источником возбуждающего излучения яв-
ляется пикосекундный ПГС на кристалле KDP 5, накачи-
ваемый второй гармоникой лазера на АИГ : Nd. При ис-
пользовании удвоителя и сумматора частот 4 такая система
позволяет перекрывать довольно широкий диапазон от
330 до 1400 нм и получать довольно значительный уровень
энергии £^0,1 мДж.
В канале зондирования можно использовать два источ-
ника света: ПГС — на кристалле LiNbO3 6 с удвоителем
частоты или источник пикосекундного континуума (ВКР
преобразователь на тяжелой воде 7). При измерениях кине-
тических характеристик поглощения в отдельных участках
спектра применение ПГС дает возможность повысить на-
дежность и расширить диапазон измерений за счет высокой
стабильности энергетических, спектральных и временных
139
характеристик, широкого диапазона длин волн, включая
УФ и ИК области спектра, высокой спектральной яркости
и монохроматичности излучения. Последнее позволяет ра-
ботать без монохроматора и использовать фотодиоды для ре-
гистрации сигнала. При снятии дифференциальных спект-
ров нестационарного поглощения более удобным оказыва-
ется ВКР преобразователь на D2O в сочетании с перестраи-
ваемым монохроматором 12. Неназванные параметры схемы,
на рис. 5.3: 8 — оптическая линия задержки, .9 — био-
объект, 10 — фотодатчик, 11 — электромагнитный затвор,
13 — автоматизированная система управления спектро-
метром.
Принципиальным является тот факт, что импульсы, по-
лучаемые от ПГС, имеют более крутые фронты, чем импуль-
сы лазеров с синхронизацией мод. Это позволяет увеличить
временное разрешение за счет уменьшения временной об-
ласти перекрытия возбуждающего и зондирующего импуль-
сов. Рассматриваемый спектрометр допускает применение
схемы с зондированием во встречном направлении по от-
ношению к пучку возбуждения, что дает возможность зна-
чительно снизить попадание рассеянного света возбуждаю-
щего пучка в канал зондирования. Эта возможность особен-
но важна при исследованиях сильно рассеивающих биоло-
гических объектов.
Для более детального ознакомления с методами лазер-
ной пико- и субпикосекундной абсорбционной спектроско-
пии биомолекул, с лазерными спектрометрами сверхвысо-
кого временного разрешения, а также с конкретными ис-
следованиями динамики биомолекул можно рекомендовать
литературу, вышедшую в последние годы [П. 1 — П. 3,
1.35].
5.3. Классификация и основы калориметрических
методов диагностики
Классификация. В основе калориметрических методов
микродиагностики или спектроскопии лежат поглощение
света с возбуждением уровней энергии молекул вещества
биообъекта, последующая безызлучательная релаксация
этих уровней и нагрев объекта. Информационным парамет-
ром является изменение температуры образца ДТ. Очевидно,
что степень нагрева определяется поглощательной способ-
ностью вещества, интенсивностью света и эффективностью
конкурирующих процессов (флуоресценция, фотохимиче-
ские и фотоэлектрические эффекты). Все это и определяет
140
достоинства калориметрических методов, главным из кото-
рых является возможность исследования поглощения светв
сильно рассеивающими средами, применительно ко мно-
гИм областям науки и техники, но особенно к биологиче-
ским и медицинским задачам. Эти методы позволяют иссле-
довать непрозрачные (оптически плотные) и слабо флуорес-
цирующие объекты, контролировать протекание фотохими-
ческих и фотоэлектрических процессов. Поскольку изме-
ряемым параметром является изменение температуры, то в
качестве детекторов применяются неселективные приемни-
ки, отсутствует ограничение по используемым в эксперимен-
те длинам волн со стороны приемника.
Оптико-калориметрические (или, как их иногда назы-
вают, оптико-термические) методы имеют много модифика-
ций, отражающих способы регистрации изменения темпе-
ратуры [П. 23, П. 41—П. 46, 1.26, 1, 8—24]. Возможны не-
посредственные измерения температуры с помощью кон-
тактных датчиков и сопутствующих изменений объема
образца. Эти методы не получили очень широкого распрост-
ранения. Перспективным, особенно при исследованиях
объектов in vivo, представляется метод оптико-термиче-
ской радиометрии, основанный на измерении интенсивности
теплового излучения нагретого лазерным светом тела. В по-
следние годы этот метод становится все более популярным.
Благодаря своей простоте, надежности, высокой чувств-
вительности и универсальности наиболее широкое распрост-
ранение получил оптико-акустический (ОА) метод, который
заключается в преобразовании тепловых колебаний в
акустические и последующей их регистрации микрофоном
или любым другим приемником акустических колебаний.
Для детального знакомства с ОА методом и его широкими
возможностями можно рекомендовать монографию [П. 41],
а также обзоры и труды конференций по ОА спектроско-
пии [П. 23, П. 42 — П. 46, 1, 81. Сравнительно широкое
распространение получили также безконтактный оптико-
термический способ, когда измеряемым параметром явля-
ется температура окружающего объект газа, и оптико-
рефракционные методы, в которых измеряются вариации
показателя преломления среды, вызванные температурны-
ми изменениями,— это метод тепловой линзы, тепловой деф-
лекции дополнительного (измерительного) лазерного пуч-
ка и разнообразные интерферометрические методы.
Импульсный метод. Пусть пучок лазерного излучения
Радиуса w проходит через кювету, заполненную жидкостью.
Длительность импульса света равна ти, частота повторения
141
импульсов f, длина столба жидкости, освещаемая импуль-
сом, I. Приемник ОА сигнала расположен на расстоянии
R от оси лазерного пучка. Предположим, что длительность-
импульса значительно больше времени безызлучательной'
релаксации, времени распространения акустического им-
пульса поперек освещаемого столба жидкости и постоянной,
времени акустического детектора тд. При условии, что
безызлучательная релаксация является основным процес-
сом, определяющим ослабление светового пучка, а само
ослабление не слишком велико, выделяющаяся при
поглощении энергия находится на основании закона Бу-*
гера:
Ех=ЕяаЛ,
где £и — энергия импульса света, а — коэффициент по-
глощения. Поглощение энергии сопровождается локальным
повышением температуры ДУ, которое находится из соот-
ношения
ДУ = £т/с/,Ур = £иа//с/,Ур, (5.4>
где ср — удельная теплоемкость при постоянном давле-
нии, V=nw2l — освещаемый объем, р — плотность среды.
Предполагая, что процесс расширения освещаемого
объема происходит адиабатически при; постоянном давле-
нии, можно подсчитать изменение этого объема:
ДУ = л (ау + Дау)21—nw4 — (ЗУДУ = $Е„а,1/срр, (5.5)
где Р — температурный коэффициент объемного расшире-
ния вещества. Такое расширение создает волну, распро-
страняющуюся в радиальном направлении со скоростью
звука va. Соответствующее изменение давления Др про-
порционально амплитуде механических колебаний Дх~Дау:
Др = 2л/>арДх — /лрДау,
где /а — частота акустических колебаний. Используя (5.5).
при условии, что До*фе», окончательно получим
&Р~(М™)№а/ср)Еяа.
Эти соотношения дают представление о принципах ра-
боты калориметрических методов. Непосредственную ин-
формацию о коэффициенте поглощения среды а на опреде-
ленной длине волны можно получить на основе измерений
ДУ (оптико-термическийэффект), ДУ (оптико-геометрический
эффект) или Др (ОА эффект). Используя связь фокусного
расстояния F «тепловой линзы», угла отклонения <р проб-
142
лого лазерного луча и сдвига фазы волны Дф в измеритель-
ном интерферометре с изменениями температуры ДТ об-
разна, получим приближенные соотношения и для других
методов [П. 41, П. 43].
Метод «термолинзы»:
(l/F)«/(dn/dT)(AT/te>2).
Дефлекционный метод:
Ф «(1/л) (dti/dT) LT.
Интерферометрический метод:
Дф «(2л/' Дп) (dti/dT) LT,
где dnldT — температурный градиент показателя прелом-
ления среды п, Г — длина области пространственного сов-
мещения возбуждающего и пробного пучков света, %п —
длина волны пробного пучка.
Чувствительность калориметрических методов и ос-
новные области применения представлены в табл. 5.1.
Дальнейшее обсуждение проведем в основном на примере
ОА метода. Важным параметром, который необходимо учи-
тывать при практической реализации импульсного ОА ме-
тода, является временная задержка тд между световым и
акустическими импульсами. В простейшем случае тд оп-
ределяется очевидным соотношением
тд=^/оа, (5.6)
где R — радиус ячейки. Эта временная задержка опреде-
чяет период времени, в течение которого полезный сигнал
регистрируется без помех.
В случае газообразных сред, в частности молекулярных
газов, для которых скорость столкновительной релакса-
ции возбужденных состояний существенно превышает ско-
рость излучательной релаксации, ОА сигнал имеет следую-
щий вид:
6р(0 « (у—1) (£иа/л£2)ехр (— //тт), (5.7)
где у—Ср/су, тт — время тепловой релаксации ячейки:
тт« (R/2,4)a/<2T, «т = k/pcv, (5.8)
где а,. — температуропроводность, р — плотность газа, k —
теплопроводность газа. Эти соотношения получены на ос-
нове газокинетических представлений для ячейки, запол-
ненной молекулами одного сорта, равномерно распределен-
ными в объеме. Для газовой смеси поглощающих молекул
143
Таблица 5.1
Чувствительность и основные области применения '
калориметрических методов »
Предельный коэффициент поглощения, см-1 Основные области применения
Газ Жидк. Тверд, тело
Оптико-акустический метод
10-8— 10-8— 10-Б— Локальный анализ слабопоглощаю-
10-» 10-7 10-’ Оптика- щих и сильнорассеивающих биоло- гических сред, следовые концентра- ции токсических веществ, газовый анализ, аэрозоли, порошки, тонкие пленки, газовая, жидкостная и тон- кослойная хроматография, анализ биотканей, фотохимических процес- сов, микроскопия, профилирование вглубь и пр. термический метод
10-’— 10-’— IO-»— Локальный анализ, измерения в по-
ю-7 10-® 10-’ токах, капиллярная хроматография, измерения при низких температурах» в вакууме и пр.
Метод оптико-термической радиометрии
10-2— 10-1— 10-1— Сильнопоглощающие и сильнорассеи-
IO-3 10-2 ю-2 вающие биообъекты, дистанционные и бесконтактные измерения, нет огра- ничений на размеры (от очень боль- ших до мельчайших), анализ биотка- ней, отдельных органов, возмож- ность исследований in vivo и пр.
Оптико-геометрический метод
- 1 10-’— 1 10-« 1 ю-2 | Метод Исследование медленно протекающих процессов в биообъектах тепловой линзы
ю-«— 1 ю-7 1 10~7 | IO"6 Анализ сильнорассеивающих биообъ- ектов, следовых концентраций ве-
Дефлекционный метод ществ, возможность исследований in vivo, измерения в потоках, дистанци-
ю-7 | IO”8 । 10-7 онные измерения, тонкие ^пленки» порошки и пр.
Интерферометрический метод
ю-*— 10-6— 10-’— Следовые концентрации веществ,^ви-
IO"8 10“’ 10-’ зуализация тепловых и акустических полей, фотохимические исследования в вязких и твердых средах и пр.
144
разного сорта общее изменение давления в ячейке склады-
вается из соответствующих парциальных изменений дав-
ления с учетом временных задержек, обусловленных раз-
личиями скоростей тепловой релаксации.
Важным параметром среды является термодиффузион-
пая (тепловая) длина, которая для импульсного возбужде-
ния оценивается как [П. 43]
/т«(4атт„)>/». (5.9)
Импульсный нагрев биообъекта приводит также к из-
менению характера собственного теплового излучения те-
ла — это явление лежит в основе импульсной оптико-тер-
мической радиометрии (ОТР) [18, 21]. Максимум теплового
излучения живых биообъектов лежит в области 10 мкм.
Детальный анализ ОТР сигнала требует знания распреде-
ления температуры по объекту, скорости тепловой диффузии
среды, коэффициентов поглощения на длинах волн зонди-
рования а (обычно УФ или видимый диапазон) и теплового
излучения а' (10 мкм). И обратно, знание некоторых из
указанных параметров позволяет по измеренному ОТР сиг-
налу определять другие параметры, например а.
В простейшем случае сравнительно слабого поглощения
зондирующего излучения (а<^а') и воздействия короткими
импульсами света (значительно меньшими по длительности
времени термодиффузии) сигнал ОТР определяется соот-
ношением 118, 21]
S(Z) = S(rB)exp (z2)
Z
1 — (2/Ил) $ exp (—£2)
о
где S (ти) ~ WEua — значение сигнала в начальный момент
времени после прекращения действия импульса света дли-
тельностью ти, W — коэффициент, пропорциональный ши-
рине спектральной области регистрации ИК излучения
биообъекта, z=a[aT(f—ти)],/2.
В данном случае имеет место поверхностное тепловое
излучение тел, поскольку зондирующее излучение прони-
кает внутрь тела довольно глубоко, а тепловое излучение
°т глубинных его слоев эффективно поглощается при вы-
ходе наружу. В связи с тем, что для большинства биообъек-
тов коэффициент поглощения в ИК области определяется
содержащейся в них водой и лежит в диапазоне
(1—2)-10» см-1, представленное соотношение может быть
использовано при исследовании широкого класса биотканей.
А. в. Приезжев 145
Метод, использующий непрерывное модулированное из-
лучение. Отличительной особенностью применения лазе-
ров непрерывного действия по сравнению с импульсными
является получение дополнительной информации о харак-
тере поглощения исследуемого вещества за счет сигнала,
пропорционального сдвигу фаз между переменными со-
ставляющими мощности лазера и давления. Для газооб-
разных сред при гармонической модуляции мощности излу-
чения Р на частоте со амплитуда ОА сигнала 8р и сдвиг фаз
Ф имеют вид
М®)«(/2/2)(у-1) (PaW) тД1 + (сот,)*]
Ф(а>)«—arctgcoT,, ' ’ '
где тт определяется соотношением (5.8). Эти выражения по-
лучены при тех же предположениях, что и (5.7). Термодиф-
фузионная длина равна
4= (20,/®)^. (5.11)
Изучение оптических и тепловых свойств жидкостей
и твердых тел с помощью газовой ОА ячейки (косвенный
метод) является довольно распространенным методом иссле-
дования. Модулированный свет поглощается конденсиро-
ванной средой и частично преобразуется в тепло. Это тепло
созд1ет возмущения давления в окружающем газе, которые
регистрируются микрофоном. При описании ОА сигнала
используют три характерные длины образца: геометриче-
скую Z, длину пробега фотона /ф=1/а и «тепловую» ZT.
В зависимости от соотношения этих длин возможны шесть
различных вариантов газомикрофонного метода. Различают
оптически и термически толстые и тонкие среды. Очевидно,
что для возможны эффекты насыщения амплитуды
ОА сигнала, которых следует избегать. Для данного об-
разца величина ZT определяется длительностью импульса
или частотой модуляции со. Разделение сигналов, возбуж-
даемых в объеме образца и в тонком слое на границе ве-
щество — окно (или подложка), возможно при использо-
вании фазового метода, когда регистрируется не только
амплитуда, но и фаза ОА сигнала.
5.4. Особенности экспериментальных исследований
оптико-акустическим методом
Схемы экспериментальных установок. Типичные схемы
экспериментальных установок для исследования оптико-
акустических (ОА) спектров веществ в различных агрегат-
146
ных состояниях представлены на рис. 5.4 и 5.5. При ис-
следовании спектров поглощения газов и жидкостей может
быть использована схема, показанная на рис. 5.4 [П. 43].
Область перестройки импульсного лазера на красителях с
♦
ср
I « I Г7з
чЛ №
-----1 ! М| ।
А/вч
/5 |
Рис. 5.5. Схема экспериментальной установки для исследования
твердых тел£и жидкостей ОА методом
ламповой накачкой 1 450—750 нм, длительность импульсов
тп=2«10-в с, максимальная энергия £и=10“8 Дж, частота
повторения /=10—20 Гц. ОА ячейка 4 с термопарой 3 и
пьезоэлектрическим преобразователем 7 находится внутри
термостабилизированной кюветы 6 с кварцевыми окнами 2.
ОА сигнал после усиления (10,11) усредняется во времени о
10* 14Г
помощью стробируемого вольтметра 12. Такое усреднение
позволяет устранять влияние помех.
Опорный сигнал формируется в канале: пучок света,
прошедший ОА ячейку 4, пироэлектрический детектор 5,
стробируемый вольтметр 13. Оба сигнала — ОА и опорный—
преобразовываются в цифровую форму и поступают на
мини-ЭВМ 14 для дальнейшей обработки и получения нор-
мированного ОА сигнала (15). Информация о частоте гене-
рации лазера от сканирующего устройства также поступает
на ЭВМ. Окончательно с помощью ЭВМ получают график
зависимости амплитуды нормированного ОА сигнала от
частоты генерации лазера. Небольшая часть излучения на-
правляется на спектрометр 9, с помощью которого осуществ-
ляется калибровка частоты излучения лазера.
Исследование поглощения в твердых телах возможно
путем регистрации возбуждаемого ОА сигнала как при не-
посредственном контакте образца с детектором, так и с по-
мощью упомянутого выше газомикрофонного метода, а
также при размещении объекта в открытой ячейке, запол-
ненной жидкостью (рис. 5.5) [П. 231. АИГ : Nd лазер 1 из-
лучает импульсы на %=1,06 мкм (Еи=6-10-4 Дж, ти=
= 10-7 с и /=8 Гц). В первом случае возбуждающийся в
образце 3 акустический импульс через тонкую пленку гли-
церина, служащую элементом связи по акустическому ка-
налу, попадает на пьезоэлектрический детектор 4, выход-
ной сигнал которого усиливается (5), фильтруется в поло-
се 80—600 кГц (6), а затем поступает на аналого-цифровой
преобразователь (АЦП) 7, который открывается сигналом
с фотодиода 2 только на период действия лазерного импуль-
са. Данные с АЦП поступают на ЭВМ 8, где ОА сигнал ус-
редняется по большому числу лазерных импульсов.
При реализации жидкостного метода исследуемый об-
разец наносится на подложку, которая является задним ок-
ном 9 жидкостной открытой ячейки; ОА детектор располо-
жен в жидкости (10) вблизи поверхности образца. Жид-
кость, так же как и газ, может служить генератором акус-
тических колебаний, обусловленных тепловыми процес-
сами, возникающими при поглощении света в тонкой плен-
ке на поверхности образца. Таким образом, в отличие от
первого случая, в котором глицерин является всего лишь
передатчиком акустических колебаний, здесь жидкость яв-
ляется как генератором, так и передатчиком этих колеба-
ний. Чувствительность жидкостного метода оказывается
выше как по сравнению с контактным, так и газомикрофон-
ным методами.
148
Промышленные образцы лазерных ОА спектрометров
представляют имеющие близкие характеристики разработ-
ки ЦКБ уникального приборостроения АН СССР и L-1400
фирмы Gilford (США) [1]. Диапазон длин волн отечествен-
ного спектрометра 9,25—10,75 мкм обеспечивается дискрет-
но перестраиваемым СО2 лазером (всего 45 линий генера-
ции). Перестройка длин волн автоматическая с управлением
от ЭВМ. Используется дифференциальная схема с двумя
ячейками, для привязки по длинам волн используется тре-
тья О А ячейка с эталонными газами. Минимально регист-
рируемый коэффициент поглощения 1 • 10-7 см-1, погреш-
ность измерений 20 %, динамический диапазон 10*. Объем
газовой пробы равен 0,044 м3. Основные медицинские при-
менения — это анализ состава выдыхаемого воздуха с це-
лью диагностики некоторых заболеваний, а также конт-
роль технологических процессов в фармакологии.
Калибровка ОА детектора. В принципе существует воз-
можность прямого определения абсолютного значения коэф-
фициента поглощения вещества, если известны все значе-
ния коэффициентов передачи в системе источник света —
поглощающее вещество — ОА ячейка — преобразователь
акустических колебаний — электронная схема. Однако это
весьма трудная задача, поэтому обычно для определения
абсолютных значений коэффициентов поглощения приме-
няют калибровку ОА детектора.
При исследовании жидкостей процесс калибровки за-
ключается в сравнении ОА сигналов, полученных от иссле-
дуемой жидкости и жидкости с растворенным в ней красите-
лем. Таким способом можно определить коэффициент по-
глощения с погрешностью ±10 %. Калибровка одной жид-
кости по другой с учетом коэффициента объемного расши-
рения, теплоемкости и скорости распространения звука в
различных жидкостях дает погрешность ±30 %. При ис-
следовании поглощения в газах обычно применяется ана-
логичная методика калибровки с использованием эталон-
ных газов с известным коэффициентом поглощения, а в
твердых телах для эталонирования можно использовать
калориметрический метод, обладающий высокой чувстви-
тельностью вплоть до значений а=5-10“* см"1. Калибров-
ка ОА спектров твердых тел и жидкостей может быть про-
изведена также с помощью стандартных образцов, например
задымленной кварцевой пластины.
Факторы, влияющие на чувствительность метода. Ос-
новными причинами, снижающими реальную чувствитель-
ность ОА метода, являются: поглощение света в окнах
149
ячейки, рассеяние света с последующим его поглощением
стенками ячейки или непосредственно элементами прием-
ника акустических сигналов. Эти причины вызывают фо-
новые сигналы. Для снижения влияния фоновых сигна-
лов в газовой или жидкостной ячейке необходимо уменьшить
поглощение в тонком поверхностном слое окон, что дости-
гается соответствующей обработкой поверхности (поли-
ровка, очистка), а также взаимным подбором материала
ячейки и исследуемого вещества. Необходимо по возможно-
сти устранить образования, рассеивающие свет (частицы-
пыли, дефекты, неоднородности и т. п.).
При импульсном режиме работы хороших результатов
можно достичь стробированием измеряемого сигнала, так
как рассеянный свет поглощается в элементах преобразо-
вателя практически мгновенно после действия лазерного
импульса, а полезный акустический сигнал задерживается
на время тд, определяемое выражением (5.6). В свою оче-
редь ОА сигнал от окна приходит несколько позже основ-
ного сигнала от жидкости (газа). В этом и заключается ос-
новное достоинство метода при использовании его для ана-
лиза конденсированных сред. Хорошие результаты дают
фазовые измерения, применение частотной модуляции излу-
чения непрерывных лазеров или переключение их длин
волн вблизи линии поглощения исследуемого вещества,
поскольку благодаря сравнительно слабой дисперсии мате-
риала окон и стенок ячейки они дают малый вклад в полез-
ный ОА сигнал.
Таким образом, реальная чувствительность ОА метода
составляет 10"6—10"’ см-1. В то же время применение спе-
циальных мер по устранению фоновых сигналов в газах
позволяет получить чувствительность метода на уровне
а«10"8 см"1. Данные по чувствительности ОА метода и
других калориметрических методов и их модификаций пред-
ставлены в табл. 5.1 ]П. 41].
5.5. Конструкции спектрофонов и зондов
Нерезонансные спектрофоны и зонды. Под нерезонанс-
ным спектрофоном понимают такую ОА ячейку, которая не
обладает заметными акустическими резонансными свойст-
вами. Наиболее простой и самой распространенной кон-
струкцией спектрофонов, используемых при исследовании
газов, является цилиндр с прозрачными для лазерного излу-
чения окнами на торцах и с микрофоном в боковой стенке
цилиндра (рис. 5.6а).
150
Увеличения чувствительности можно добиться оптими-
зацией формы ячейки или многократным пропусканием ла-
зерного пучка через ячейку. Насколько это возможно, стре-
мятся уменьшить эффективное сечение ячейки, так как, сог-
ласно (5.7) и (5.10), амплитуда ОА сигнала обратно пропор-
2
ж з и
Рис. 5.6. Спектрофоны и зонды, используемые при исследовании
газообразных веществ (а, б), жидкостей (в — д'), порошков, тонких
пленок и биотканей (е — и): 1 — пучок света, 2 — ОА детектор,
микрофон или пьезоэлектрический преобразователь, 3 — окошко,
4 — исследуемый биообъект, 5 — кварц, 6 — липкая лента
циональна сечению (А?2). Однако для снижения влияния сте-
нок отношение радиусов светового пучка и ячейки, как пра-
вило, не должно превышать 0,2.
Поскольку реальная чувствительность спектрофона оп-
ределяется уровнем фоновых сигналов, то конструирование
ОА ячеек идет по пути максимального снижения влияния
151
этих сигналов. Один из возможных путей — это сравнение
сигналов от двух идентичных ячеек, заполненных газами с
близкими термодинамическими параметрами и освещаемых
одинаковыми пучками света. Возможно как параллельное,
так и последовательное расположение ячеек. В общем слу-
чае при равных объемах камер их длины и соответственно
диаметры могут быть различными, поскольку, согласно
(5.7) и (5.10), полезные сигналы от таких камер сильно раз-
личаются по амплитуде, а фоновые остаются одинаковыми
и «вычитаются» на дифференциальном микрофоне.
Хороших результатов можно достигнуть, существенно
уменьшая объем ячейки, используя, например, явление пол-
ного внутреннего отражения на границе измерительная
призма — исследуемый газ (или жидкость). Оптимизация
размеров такой ячейки позволяет снизить ее объем до
0,25 мкл и обеспечить чувствительность на уровне
5 пг.
Важным преимуществом миниатюрных ячеек является
возможность работы на сравнительно высоких частотах мо-
дуляции 0,1—1,3 кГц, так как время тепловой релаксации
ячейки уменьшается пропорционально площади ее попереч-
ного сечения R2 (5.8). Это обеспечивает низкий уровень
шумов электронной схемы и возрастание быстродействия
всего устройства в целом.
При исследовании паров различных веществ можно ис-
пользовать простую ячейку, изготовленную из цилиндри-
ческой кварцевой 1-миллиметровой кюветы, соединенной с
кварцевой трубкой (длиной 60 мм, внутренним диаметром
2 мм), открытый конец которой закрывается тефлоновой проб-
кой, внутри которой расположен микрофон (рис. 5.66).
Изменение давления паров передается микрофону по уз-
кому каналу диаметром 0,2 мм, высверленному внутри
пробки. С целью устранения попадания паров в полость
микрофона соединительный канал перегорожен тефлоно-
вой диафрагмой.
Для регистрации ОА сигнала в жидкости используют
три основных типа спектрофонов: газомикрофонные, жид-
костные открытого и закрытого типов. В газомикрофонных
ячейках в качестве измерителя амплитуды акустического
сигнала используют обычные микрофоны, а передатчиком
акустических колебаний, возникающих при поглощении
света в жидкости, является газ. Устройство закрытых жид-
костных спектрофонов аналогично устройству газомикро-
фонных. Однако в качестве датчика ОА сигнала (гидрофо-
на) обычно применяют пьезоэлектрический преобразователь,
152
находящийся в непосредственном контакте с жидкостью
или связанный с ней через согласующие или защитные
элементы.
Благодаря простоте конструкции довольно широкое
распространение получила жидкостная ячейка, выполнен-
ная на основе пьезокерамического цилиндра, который одно-
временно является и боковой стенкой ячейки, и приемни-
ком ОА сигнала (рис. 5.бе). С помощью такой ячейки была
достигнута пороговая чувствительность устройства по по-
глощению а=2,2- 1о-5 см-1. Одна из схем открытой ячейки
показана на рис. 5.5. При определенных условиях, напри-
мер при расположении преобразователя на достаточном
удалении от окон (переднего и заднего), фоновые сигналы
будут ослаблены и преобразователь должен регистриро-
вать в основном сигнал от жидкости.
Часто бывают необходимы проточные ячейки, в кото-
рых исследуемая жидкость омывает окно рабочей камеры.
В данном случае окно не только пропускает излучение в
ячейку, но и служит приемником оптического сигнала, ко-
торый преобразуется в электрический с помощью плотно
контактирующих с окном одного или нескольких пьезо-
электрических преобразователей. Материал окна должен
обладать'необходимыми акустическими свойствами, поэтому
часто используют сапфир. Объем исследуемой жидкости
существенно меньше объема рабочей камеры и может со-
ставлять 1 мкл, так как при таком способе регистрации ОА
сигнала основное влияние оказывает поглощение в тонкой
пленке вблизи окна.
Наиболее удобны в биологических исследованиях такие
спектрофоны, которые допускают быструю смену иссле-
дуемой жидкости и работу со стандартными кюветами. Одна
из таких конструкций представлена на рис. 5.6г. Кварце-
вая кювета с исследуемой жидкостью плотно прилегает к
кварцевому цилиндру, что обеспечивается с помощью тон-
кой пленки смазки (например, капли глицерина). Между
кварцевым цилиндром и опорным металлическим цилинд-
ром с помощью винта закрепляется пьезоэлектрический
преобразователь. Для уменьшения фоновых сигналов от
окон применяется дифференциальное включение двух пос-
ледовательно расположенных ячеек. Для повышения от-
ношения сигнал/шум кварцевый цилиндр между кюветой и
пьезопреобразователем иногда заменяют на зеркало, отра-
жающее рассеянный в жидкости свет, а металлическое ос-
нование размещают в среде, поглощающей акустические
колебания.
153
Для спектроскопических исследований конденсирован-
ных, сред удобными в эксплуатации оказываются ОА зонды,
один из которых показан на рис. 5.6<?. Основной элемент —
стержень из плавленого кварца (диаметр 8 мм, длина
20 см) является акустическим волноводом. К стержню с по-
мощью клея прикреплен пьезоэлектрический преобразова-
тель (диаметр 12,7 мм, толщина 3 мм), который фиксируется
диэлектрическим винтом. Эта часть устройства размещена
в металлической коробке, являющейся электрическим эк-
раном. Резиновая прокладка уменьшает акустическую
связь коробки и стержня. Стержень опущен в кювету с
жидкостью, через которую на 3 мм ниже нижнего среза зон-
да пропускается лазерный луч. Такой зонд удобен для при-
менения в биологии и медицине. Его достоинства заключа-
ются в том, что импульсы света и звука сдвинуты во вре-
мени, преобразователь акустических колебаний удален от
источника колебаний, его устройство допускает охлажде-
ние и работу с коррозирующими жидкостями.
При исследовании порошков, тонких пленок и биологи-
ческих тканей возможно применение различных типов
спектрофонов. Их можно разделить на три группы.
К первой относятся спектрофоны, в которых использу-
ется непосредственный контакт либо преобразователя, либо
кварцевого звукопровода с исследуемым объектом с по-
мощью акустически связующей тонкой пленки жидкости
(рис. 5.5) или струбцины (рис. 5.6е). Спектрофоны, пред-
ставленные на рис. 5.5, удобны для измерения коэффици-
ентов поглощения в объемных телах, а устройство, показан-
ное на рис. 5.6е,— в порошках и тонких пленках. В этих
схемах ослабление влияния рассеянного света на датчик,
вызывающего фоновый сигнал, обусловленный пироэлект-
рическим эффектом, достигается за счет сложной конфигу-
рации звукопровода. Устранить влияние рассеянного света
можно либо напылением зеркального слоя в месте контакта
звукопровода с пьезоэлектрическим элементом, либо ис-
пользованием дифференциальной схемы с двумя пьезоэле-
ментами, один из которых механически не связан со зву-
копроводом, но облучается рассеянным излучением той
же интенсивности, что и рабочий.
Удобным для исследования спектров в условиях низких
температур оказывается датчик, представленный на
рис. 5.6»с. Основой датчика является кварцевый блок раз-
мером 2,5x1,2x0,18 см, который зажимается между мед-
ной скобкой и пьезоэлектрическим преобразователем. Ма-
лые габариты датчика позволяют размещать его в криоста-
154
те целиком. Датчик был использован для исследования ОА
спектров порошков, растворенных в глицерине при 10 К.
Он прост в изготовлении и может найти применение в
биологических исследованиях при низких температурах.
Ко второй группе спектрофонов относятся газомикро-
фонные ячейки. В настоящее время это наиболее распрост-
раненный тип спектрофонов, используемых в биологии и ме-
дицине. Подстройка объема рабочей камеры, давления газа,
его состава и частоты модуляции необходимы для оптимиза-
ции ОА сигнала как по амплитуде, так и по фазовому сдви-
гу. Интересный вариант спектрофона представлен на
рис. 5.6з. Дифференциальный микрофон смонтирован меж-
ду двумя идентичными ячейками. В одну из них введен све-
товод для освещения объекта, а в другую — винт, который
позволяет изменять объем ячейки и добиваться минимума
влияния фоновых сигналов. Такой детектор приклеивается
липкой лентой к исследуемому объекту, например к по-
верхности кожи человека, листа растения.
Наконец, к третьей группе следует отнести конструкции,
в которых жидкость используется в качестве преобразова-
теля тепловых колебаний образца в акустические. Пример
такой ячейки показан на врезке рис. 5.5.
Резонансные спектрофоны [П. 23, П. 41]. В резонансных
спектрофонах реализуется значительное отношение объема
ячейки к ее поверхности, что позволяет с большой надеж-
ностью работать с газами, поглощаемыми стенками ячейки.
Пространственное распределение акустических полей в
соответствии с установившимися типами колебаний позво-
ляет вводить необходимые конструктивные элементы (не-
однородности), например трубки для ввода и вывода газа,
в те места ячейки, где находится узел стоячей акустической
волны, не искажая ее. Более того, одним из важнейших на-
правлений конструирования резонансных ОА ячеек явля-
ется устранение фоновых сигналов от окон и других эле-
ментов конструкции. Прием тот же самый: в акустическом
резонаторе необходимо возбудить такой тип колебаний,
чтобы в области локализации окон и этих элементов стоя-
чая волна имела узел.
Типичные значения частоты и добротности акустических
резонаторов соответственно равны /р=102—10* Гц, Q=
==102—10:‘. Сравнительно высокая частота колебаний сни-
жает амплитуду ОА сигнала. При этом уменьшение ампли-
туды не может быть полностью скомпенсировано увеличе-
нием добротности Q резонатора (для резонансных ячеек в
формулу (5.10) необходимо подставить частоту рабочего ре-
155
зонатора и домножить на параметр Q). С другой стороны,
увеличение частоты способствует повышению быстродейст-
вия и увеличению отношения сигнал/шум измерительного,
устройства. В принципе любая из конструкций, представ-
ленных на рис. 5.6, будет проявлять резонансные свойства
на определенных частотах; однако эти ячейки не оптимизи-
рованы по своим резонансным свойствам, и поэтому акус-
тические резонансы, возникающие в системе, как правило,
являются мешающими факторами.
Сравнительно низкие резонансные частоты, возмож-
ность управления параметрами имеют так называемые ре-
зонаторы Гельмгольца (рис. 5.6и). Они успешно применяют-
ся при исследовании как газообразных, так и конденсиро-
ванных сред, в том числе при исследованиях биологических
тканей in vivo [П. 46]. Особенно полезными они оказываются
при исследованиях поглощения в твердых телах и жидко-
стях при низких температурах. В таких случаях использу-
ются протяженные ячейки, т. е. микрофонный отсек, содер-
жащийся при комнатной температуре, соединяется узким
длинным каналом с рабочим отсеком, находящимся в кри-
остате. Чем длиннее соединительный канал, тем отчетли-
вее резонанс. Снижение температуры образца позволяет
существенно (более чем на три порядка) увеличить чувст-
вительность метода. При этом частота резонанса /р~Т1/2,
где Т — температура буферного газа, а добротность
~1/Т.
Приемники акустических сигналов. В качестве прием-
ников акустического сигнала наибольшее распространение
получили микрофоны различных конструкций: цилиндри-
ческие, плоские, конденсаторные, а также электретные.
Неравномерность частотной характеристики и уровень шу-
мов электретных микрофонов несколько выше, чем у кон-
денсаторных, однако электретные микрофоны имеют малые
размеры и не требуют источника напряжения поляризации.
Чувствительность лучших микрофонов составляет 50—
100 мВ/Па.
Наряду с микрофонами для приема акустических коле-
баний непосредственно от жидкостей и твердых тел приме-
няются разнообразные пьезоэлектрические преобразователи,
чувствительность которых составляет 0,01—1 мВ/Па. На
рис. 5.5 схематически показана одна из конструкций таких
преобразователей. Она состоит из куска плавленого квар-
ца Т-образной формы диаметром 0,63 см и длиной каждого
плеча 2,5 см. На нижнюю часть вертикального отростка на-
несено отражающее покрытие, на которое наклеен пьезо-
156
керамический цилиндр. Эта часть приемника защищена ла-
тунным стаканом, который выполняет также функции
электрической экранировки. Кварцевый блок сделан таким,
чтобы, являясь хорошим проводником для звуковых волн,
мог свести к минимуму влияние рассеянного лазерного из-
лучения на работу пьезопреобразователя. Собственная ре-
зонансная частота ОА детектора составляет 250 кГц.
Применяются и другие типы универсальных пьезоэлект-
рических ОА детекторов, изготовленных в виде болта, ввин-
чивающегося в боковую стенку закрытой ячейки или со-
прикасающегося со стандартной кюветой (кварцевым зву-
копроводом, рис. 5.бе) с помощью струбцины [П. 43], а
также изготовленных в виде параллелепипеда, на грани ко-
торого напылены электроды (одной из этих граней детектор,
приклеивается к образцу). Рассмотренные приемники яв-
ляются резонансными и используются для приема импульс-
ных сигналов длительностью от 1 мкс до 80 нс. Применение
тонких (9 мкм) поливинилиденфторидных пьезоэлектри-
ческих пленок позволяет повысить быстродействие до,
4 нс [9].
По сравнению с традиционными микрофонами и пьезо-
преобразователями лазерные и волоконно-оптические при-
емники ОА сигналов имеют ряд преимуществ: отсутствие
собственных колебаний, возможность снизить шумы элект-
ронной аппаратуры за счет перехода на высокие частоты
(отсюда и быстродействие), а также возможность работы с
агрессивными средами в условиях высоких температур при
наличии значительных электрических и магнитных полей
[П. 23, П. 41, П. 43].
В качестве «приемника» акустической волны можно, на-
пример, использовать пробный лазерный пучок, отклоняю-
щийся за счет изменения показателя преломления (концент-
рации частиц) в области прохождения акустической волны
1П. 43]. Отклонение лазерного пучка регистрируется с по-
мощью позиционно-чувствительного фотоприемника. Из-
меняя расстояние между рабочим и пробным лазерными
пучками и регулируя длительность импульса возбуждения,
можно выделить акустический сигнал и измерить скорость
распространения звука в различных средах.
Динамические калориметрические системы. Важным
классом диагностических задач в биологии и медицине яв-
ляется анализ перемещающихся газовых и жидкостных по-
токов, например газовая и жидкостная хроматография,
исследование кровотока, счет одиночных биочастиц (био-
молекулы, клетки) и пр. В потоках изменяется характер
157
-тепловой диффузии. Время теплозой релаксации вместо
(5.8) определяется соотношением [10]
тт«(/?/2,4)Ж4-«?), (5.12)'
где a”=av*d — «потоковый» коэффициент диффузии, а —
экспериментально определяемый коэффициент ((3—4)- 10~а),
а I)
Рис. 5.7. Примеры динамических калориметрических систем [10]
v* — сдвиговая скорость, d — диаметр потока. Для ти-
пичных условий а"=7,7- 10"3иг (о — скорость потока, г —
его радиус).
Некоторые примеры динамических калориметрических
систем схематически показаны на рис. 5.7, где 1 — поток,
2 — возбуждающий лазерный пучок. Для динамических
измерений в потоках можно использовать традиционные
схемы (рис. 5.6а, в). Выбор оптимального соотношения меж-
ду скоростью потока, частотой модуляции света и расстоя-
нием между зонами возбуждения и регистрации позволяет
в схеме рис. 5.7а достичь пороговой чувствительности по
поглощению на уровне 10“’ см"1. Дифференциальный пи-
роприемник 3 в данной схеме исключает влияние рассеян-
ного излучения.
Схема рис. 5.76 перспективна для применения в жид-
костной капиллярной хроматографии. Здесь 3 — пьезо-
датчик. Еще одна схема (рис. 5.7s) предназначена для де-
тектирования одиночных частиц, которые, попадая при
своем движении в область жесткой фокусировки лазерного
пучка, скачком сильно увеличивают амплитуду ОА сигна-
.158
ла (<? — микрофон или пьзодатчик). Схема рис. 5.7г реали-
зует бесконтактный дефлекционный метод. Эта схема имеет
высокое пространственное разрешение, высокую чувстви-
тельность и возможность одновременного измерения ско-
рости потока, концентрации поглощающих частиц и темпе-
ратуры среды. Она обладает значительным динамическим
диапазоном (0,1—100 см/с) и возможностью определения
профиля скоростей в сечении потока. Здесь 3 — позиционно-
чувствительный фотоприемник, 4 — пробный лазерный
пучок.
5.6. Области применения калориметрических методов
Общие сведения. Высокая чувствительность, возмож-
ность получения значительного разрешения при использо-
вании лазеров в качестве источников излучения, локаль-
ность анализа, применимость для исследования веществ
в различных агрегатных состояниях и в малых объемах,
простота обработки результатов и возможность автомати-
зации делают ОА метод и другие калориметрические методы
исследования уникальными с точки зрения диапазона их
применений в биологии и медицине. Они применяются:
при газовом анализе, необходимом для контроля процессов
дыхания и питания животного мира, микроорганизмов и
растений; анализе загрязнений атмосферы и гидросферы,
необходимом для санитарного контроля окружающей сре-
ды; анализе лекарственных препаратов и биологических
сред в виде порошков и тонких пленок; контроле фотохими-
ческих и биохимических реакций; изучении фотохромных
биологических сред; изучении эффективности фотосинтеза
с целью ранней диагностики урожайности сельскохозяй-
ственных культур; в лабораторной медицинской диагности-
ке; оптико-акустической микроскопии; в офтальмологии
и дерматологии.
Газовый анализ. Выделение разнообразных газов в про-
Чессе жизнедеятельности человека, микроорганизмов и рас-
тений является важнейшим показателем характера проте-
кания соответствующих биохимических реакций. Поэтому
контроль состава и концентрации выделяющихся газов
представляет важную задачу в биохимических исследова-
ниях, а также в диагностике некоторых заболеваний. За-
дача газового анализа сводится к анализу многокомпонент-
ной смеси газов, имеющих, как правило, малые коэффициен-
ты поглощения в видимой и ближней ИК областях спектра.
Применение метода абсорбционной спектроскопии в данном
159
случае требует длины столба газа в несколько десятков и со-
тен метров, что в биологическом эксперименте обеспечить
трудно. Требуется также высокое спектральное разрешение
для разделения вклада отдельных компонентов в спектры
поглощения.
Эти проблемы исключаются при использовании ОА мето-
да, в котором в качестве источников света применяют пере-
страиваемые лазеры. В ИК области спектры поглощения
паров воды, окиси азота, метана регистрируются с помощью,
дискретно перестраиваемых DF (3,5—4 мкм) и СО2 (9,1—
11,3 мкм) лазеров. При исследовании многоатомных моле-
кул видимая область спектра интересна с точки зрения опре-
деления их концентрации в многокомпонентной смеси. Она
формируется за счет колебательных обертонов высокого по-
рядка, и поэтому интенсивность поглощения чрезвычайно
мала. Методом внутрирезонаторной ОА спектроскопии,
обеспечивающим частичное разрешение вращательной
структуры полос колебательного поглощения (1 см”1), при
использовании лазеров на красителях удается получить
наиболее полные спектры обертонного колебательного по-
глощения (вплоть до 7—9 порядков) таких многоатомных
молекул, как НС1, небольших органических молекул типа
СОНП, модификаций метанола СН3ОН, CH3OD и SiHD3 в га-
зовой фазе.
Показана возможность исследования паров азулена с
помощью ОА кюветы, которая показана на рис. 5.66, с вы-
сокой точностью, определяемой шириной линии генерации
импульсного лазера на красителях с ламповой накачкой, и
высокой чувствительностью, позволяющей регистрировать
ОА спектры даже при комнатной температуре при длине
пути поглощения всего 1 мм. Ранее для получения спектра
поглощения азулена в паровой фазе с той же чувствитель-
ностью и меньшим разрешением требовалась длина пути
поглощения, равная 4 м.
В ОА спектроскопии существуют и другие подходы к ре-
шению задачи газового анализа. Например, перспективным'
является сочетание О А метода и метода газовой хромато-
графии, обеспечивающего предварительное разделение ком-
понентов исследуемой смеси на отдельные фракции. Высокая
эффективность ОА детектирования в газовой хроматографии
продемонстрирована на примерах селективного анализа
изомеров бутилового спирта и ксилолов, определения со-
держания трансизомеров жирных кислот в образцах пище-
вых жиров, детектирования гербицидов и пр. [П. 42].
В другом подходе используются специфические особен-
но
ности ОА метода, заключающиеся в изменении ОА сигнала
в зависимости от параметров буферных газов (непоглощаю-
щих газов): их молекулярного веса, изотопного состава,
теплоемкости, теплопроводности и вязкости. Обычно для
этих целей применяют резонансные спектрофоны, для кото-
рых свойства буферных газов проявляются в смещении ре-
зонансной частоты, обусловленном изменением скорости
звука в смеси, и изменении добротности акустического ре-
зонатора за счет различных механизмов затухания в буфер-
ных газах.
Анализ загрязнений атмосферы и микропримесей в жид-
костях. При анализе загрязнений атмосферы в полной мере
реализуются такие достоинства ОА метода, как высокая
чувствительность и чрезвычайно широкий динамический
диапазон. Для газов, присутствующих в атмосфере, дина-
мический диапазон составляет 10-’—10-1 при длине кюве-
ты 10 см. Нижний предел определяется чувствительностью
спектрофона, а верхний — процессами насыщения. Такой
динамический диапазон позволяет с помощью одного и того
же устройства регистрировать как следы веществ, загряз-
няющих атмосферу (малые уровни), так и источники за-
грязнения (большие уровни).
Поскольку ОА метод позволяет регистрировать загряз-
нения в ограниченном объеме (локально) и в реальном мас-
штабе времени, то обеспечивается возможность анализа
динамики поступления и ухода примесей в исследуемом
объеме. Например, многоволновой газоанализатор на осно-
ве внутрирезонаторной ОА спектроскопии с использовани-
ем СО, СО2 и Не — Ne (Х=3,39 мкм) лазеров и модуляцией
длины волны (для устранения фоновых сигналов) имеет
пределы обнаружения примесей индустриальных загряз-
нений атмосферы (NO, NO2, NH3, С2Н4, ]£СпН2„+2) в пре-
делах 0,1—103 ppb, динамический диапазон 102—106 [11].
С помощью компактного волноводного СО2 лазера с попе-
речной ВЧ накачкой можно обеспечить диагностику за-
грязнений от гидразивного топлива и токсичных индуст-
риальных веществ на уровне 1—100 ppb [П. 46].
Отсутствие плавно перестраиваемых лазеров с достаточ-
ной выходной мощностью в ИК области спектра (2—15 мкм)
несколько сдерживает широкое внедрение в практику ОА
метода анализа загрязнений атмосферы. В связи с этим перс-
пективными считаются методы нелинейной фотоакустиче-
ской спектроскопии. Этими методами определены пороги
обнаружения газов: СН4, СО2, NO2 и С2Н3С13 в атмосфере;
они находятся в пределах 1—Юррш.
11 А. В. Приезжее
161
Применение ОА метода перспективно также и для опре-
деления микропримесей в жидкостях. Используются лазе-
ры как непрерывного, так и импульсного действия. При ра-
боте двухволнового Аг лазера и жидкостной ячейки (типа
представленной на рис. 5.6в) удалось зарегистрировать сле-
ды 0-каротина в хлороформе на уровне 12 ppt (0,08 нг/мл).
Аналогичная ячейка и Аг лазер (514,5 нм) мощностью 0,5 Вт
использовались для детектирования малых концентраций
на уровне 14 ppt (0,02 нг/мл) Cd в пенициллине после его
экстракции в хлороформ, а также для анализа малых кон-
центраций канцерогенных пищевых красителей в воде,
2,75-10-8моль/л (0,7 ppb). Предел обнаружения витамина
А в экстрактах из крови при использовании импульсного
азотного лазера (337,1 нм) составляет около 1 ppt (2 пг/мл).
Импульсный метод в принципе имеет более высокую
чувствительность. Однако, чтобы ее реализовать, необхо-
дим специальный растворитель. Вода оказывается не луч-
шим растворителем, поскольку довольно значительно по-
глощает свет даже в видимом диапазоне длин волн. Импульс-
ные азотные лазеры, а также лазеры на красителях, успеш-
но применяются для определения малых концентраций
различных порфиринов, красителей, лекарственных пре-
паратов, включая наркотики и витамины, на уровне 0,09—
1 ppb. В качестве растворителей используется вода, этанол,
гексан, СС14 и др., а в качестве детекторов — наиболее прос-
тые кюветы (рис. 5.6г) или акустический зонд (рис. 5.65).
Результаты измерений в виде предельных концентраций
анализируемых веществ представлены в табл. 5.2 (см.
|П. 23]).
С помощью ОА ячейки, изображенной на рис. 5.6г,
удается обеспечить предельно обнаружимые концентрации
ионов актиноидов в водных растворах на уровне 8-10“7—
7• 10-8 моль/л. Эта задача возникает в связи с проблемой за-
хоронения ядерных отходов.
Высокоэффективная колончатая жидкостная хромато-
графия в сочетании с лазерной ОА спектроскопией позволя-
ет получать чувствительность на уровне 1 ppt при обнару-
жении витамина А в биообразцах [П. 42].
Анализ аэрозолей, мутных и коллоидных растворов. ОА
диагностика аэрозолей, мутных и коллоидных растворов
важна для качественного и количественного анализов за-
грязнений атмосферы и гидросферы микрочастицами при-
родного и промышленного происхождения, для контроля
за ходом разнообразных биохимических реакций, поскольку
по сравнению с традиционно используемым для этих целей
162
абсорбционным методом она дает возможность определять
малые концентрации микрочастиц, обеспечивает локаль-
ность измерений и высокую точность за счет малого влияния
эффектов светорассеяния [П. 41, П. 43].
Таблица 5.2
Предельные концентрации различных красителей,
лекарственных препаратов и витаминов, регистрируемых
ОА методом с помощью импульсного N2 лазера (337,1 нм)
при температуре 298 К
Вещество Раствори- тель Чувстви- тельность, нг/мл
Бактериохлорофилл-а этанол 1,0
Билирубин » 20
Биливердин вода 0,9
Хлорофилл-а этанол 0,9
Хлорофилл-6 » 0,3
Хлорофилл (водный золь) вода 5,0
Хлорофиллин » 3,0
Копропорфирин III тетроэтил эфир этанол 2,0
Кумарин 120 » 1,0
Цитохром С вода 30
Эозин » 4,0
Флуоресцеин двунатриевый 3,0
Гематин 1,0
Гематопорфирин этанол 0,3
Гемоглобин вода 70
Мезопорфирин IX диметиловый эфир этанол 0,5
Оксазин перхлорат 3,0
Протопорфирин IX диметиловый эфир 0,09
Протопорфирин двунатриевый вода 1,0
Родамин-бЖ » 2,0
Рибофлавин » 10
Тетрафенилпорфин любой 6,0
Уропорфирин I этиловый эфир Витамин В12 этанол вода 2,0 4,0
Анализ атмосферных аэрозолей ОА методом можно про-
водить непосредственно в газовом потоке или с предвари-
тельной их концентрацией на специальных фильтрах. В
качестве источников излучения используют СО2, Аг, Не —
Ne, AHF:Nd и HF лазеры, а также лазеры на красителях.
Применяют резонансные и нерезонансные спектрофоны,
дифференциальные схемы с двумя спектрофонами, калиб-
ровку осуществляют по эталонному молекулярному погло-
щению в газе. Исследовались аэрозоли в виде атмосфер-
ной, асбестовой и кварцевой пыли, ацетиленовых, дизель-
11* 163
ных и сигаретных дымов, выхлопов автомобильных двига-
телей. Характерные размеры частиц 0,15—3 мкм, порог
обнаружения составляет 10-в г/м8 на Х=514,5 нм (ацети-
леновые и дизельные дымы).
Анализ коллоидных растворов на примере количествен-
ного определения частиц BaSO4 в воде показывает значи-
тельный динамический диапазон ОА метода (почти три по-
рядка величины) и его высокую чувствительность 5 нг/мл
(30 ppb). Применение ОА зонда, подобного представленному
на рис. 5.6д, при импульсном его возбуждении излучением
лазера на красителях позволяет изучать седиментацию час-
тиц молекулярных или макроскопических размеров в гра-
витационном поле или в центрифуге. Например, при иссле-
довании седиментации гуминовых кислот удается опреде-
лять динамику осаждения частиц разных размеров (0,08—
0,5 мкм) [12]. С помощью спектрофона, изображенного на
рис. 5.7в, можно регистрировать отдельные частицы пыли
в сверхчистых растворителях.
Анализ лекарственных препаратов и биологических сред
в виде порошков и тонких пленок. Основные достоинства ОА
метода — высокая чувствительность и возможность работы
в условиях значительного рассеяния света — реализуются
при изучении поглощения света в средах в виде порошков
твердых тел и тонких пленок жидкостей. Наиболее чувстви-
тельные из рассмотренных выше методов регистрации ОА
сигнала позволяют измерять поглощение света на уровне
10-8—10-в, следовательно, для веществ с коэффициентом
поглощения порядкаа^Ю3—102см-1 можно регистрировать
молекулярный монослой поглощающего вещества (/л?
«10-8 см).
Для анализа порошков необходим тщательный выбор тех-
нических условий эксперимента, способствующих устра-
нению влияния рассеянного излучения. Желательно, чтобы
исследуемый образец был оптически достаточно тонким и не
поглощал весь падающий на него свет, в противном случае
появляется неопределенность в характере зависимости ин-
тенсивности света от глубины его проникновения в образец,
обусловленная как эффектом сильного рассеяния (увели-
чение интенсивности в верхних слоях образца), так и эф-
фектом насыщения и влиянием частоты модуляции.
Указанные недостатки устраняются при использовании
ОА детектора (рис. 5.бе), допускающего размещение по-
рошка в виде тонкого слоя толщиной несколько ми-
крометров между двумя кварцевыми пластинами.
Для уменьшения рассеяния порошок предварительно раз-
164
мешивают в капле вязкой жидкости, имеющей показатель
преломления, близкий к показателю преломления вещест-
ва порошка, масса освещаемого порошка менее 0,1 мкг.
Фазовый метод в сочетании с жидкостной ячейкой от-
крытого типа позволяет раздельно измерять объемное и по-
верхностное поглощение в жидкостях на границе с поверх-
ностью твердого тела. В частности, изучать кинетику
процессов абсорбции и десорбции молекул на поверхно-
сти, а также исследовать характер протекания фотохими-
ческих реакций, если они сопровождаются изменением
поглощения жидкости твердым телом (подложкой). Такая
возможность была продемонстрирована на примере моле-
кул S-2160 (трипептид), используемых при измерениях
ферментативной активности веществ (см. [П. 23]).
ОА метод используется для получения ИК спектров по-
глощения фармацевтических таблеток, в том числе аспири-
на различного производства. Так же как и спектры диффуз-
ного отражения, ОА спектры в ближней ИК области приме-
няются для определения содержания белка, жира и влаги в
семенах подсолнечника и соевых бобах. С помощью газо-
микрофонной ячейки, Аг и Кг лазеров, работающих на ли-
ниях с Л=457,9; 488,0; 514,5 и 647,1 нм, удалось надежно
определить примеси различных веществ в кофейном порош-
ке: измельченного обожженного пергамента (13,8 %), яч-
меня (16,6 %) и кукурузы (15,1 %) [13].
Перспективно применение ОА метода в тонкослойной
хроматографии [П. 41, П. 43]. Для исключения фоновых
сигналов от хроматографической пластины обычно исполь-
зуется одновременное облучение на двух длинах волн. Ока-
зывается возможным обеспечить измерения количественно-
го состава разделенных веществ in situ *). Чувствительность
анализа в значительной мере определяется материалом под-
ложки (алюминий, стекло, кремний) и составляет 3—100 нг.
Такая методика полезна, например, для контроля качества
пищевых продуктов, в частности для определения содержа-
ния синтетических красителей в кондитерских изделиях.
Сочетание пространственного (по поверхности хроматогра-
фической пластинки) и спектрального (при использовании
лазеров на красителях) сканирования позволяет осуществ-
лять двумерный ОА анализ индивидуальных соединений
при их неполном разделении [П. 41 — П. 43].
Интересно применение ОА метода для количественного
определения концентрации глюкозы в растворе крови с по-
*) В естественных условиях (лат.).
165
мощью специальной многослойной окрашенной пленки тол-
щиной 400 мкм. Диапазон измерений метода 0—2 г/л ока-
зывается достаточным для быстрого и точного диагноза
диабета [14].
Изучение структуры листьев растений и эффективности
фотосинтеза. Изучение структуры листьев растений яв-
ляется одним из наиболее наглядных применений ОА мето-
да в биологических исследованиях. На ОА спектре зеленого
200 400 000 AjHM
Рис. 5.8. ОА спектр интактно-
го зеленого листа [П. 44]
листа (рис. 5.8) отчетливо
видны все характеристические
полосы поглощения хлоропла-
стов, присутствующих в тка-
ни листа: полоса Соре вбли-
зи 420 нм, полоса поглощения
каротиноидов в области 450—
550 нм и полоса, принадлежа-
щая хлорофиллу, между 600
и 700 нм. В УФ диапазоне на-
ходится полоса поглощения
воскообразного слоя листа.
Применение фазового ОА мето-
да и изменение частоты моду-
ляции позволяют осуществ-
лять зондирование листьев
растений, определяя тем самым глубину залегания отдельных
хромофоров [П. 46].
В интактных листьях под действием модулированного
света происходит выделение кислорода, что изменяет ха-
рактер регистрируемого сигнала. Дополнительная фоновая
засветка интенсивным немодулированным белым или крас-
ным светом может привести к насыщению процессов фото-
синтеза и также изменить ОА сигнал. Эти явления исполь-
зуются для определения квантового выхода выделения
кислорода и запасенной фотохимической энергии, исследо-
вания фотосинтезирующих хроматических переходов и эф-
фектов усиления Эмерсона (увеличения выделения О2 и
тушения флуоресценции) в интактных листьях, выявления
сложных переходных процессов, зависящих от режима осве-
щения листа.
Например, определение квантового выхода выделения
кислорода листьями фасоли с помощью ОА техники может
служить в качестве экспресс-метода отбора генотипов фасо-
ли по признаку их теплоустойчивости [22].
Процессы фотосинтеза исследуются ОА методом не толь-
ко в листьях или выделенных из них хлоропластных препа-
166
ратах, но и в водорослях. В частности, для зеленых водорос-
лей Briopsis maxima обнаружено, что вклад кислорода,
выделяющегося под действием модулированного света, в
ОА сигнал незначителен. Это обусловлено структурой во-
дорослей.
Метод ОА спектроскопии применяется также для ана-
лиза содержания свободного хлорофилла в листьях капус-
ты, подвергнутых воздействию солей металла. Взаимодей-
ствие хлорофилла с ионами металлов контролируют по пику
вблизи Х=685 нм, активность взаимодействия падает в
ряду Си, Pb. Ni, Cd. С помощью ОА анализа листьев можно
определять степень их токсикации металлами. С помощью
излучения Кг лазера (Х=647 нм) с псевдослучайной после-
довательностью импульсов удается изучать динамику воз-
действия гербицидов на хлоропласты листьев салата [П. 46].
В ферментативных реакциях окисления в живых клет-
ках участвует сложное органическое соединение НАДН
(восстановленный никотинамид-дениндинуклеотид). ОА
спектроскопия НАДН является очень чувствительным мето-
дом как для обычных биохимических анализов, так и для
исследования сложных процессов с участием НАДН (диа-
пазон концентраций НАДН: 5-10-7—1-Ю-5 моль/л, ис-
точник света — импульсный азотный лазер, ОА ячейка с
пьезоэлектрическим гидрофоном).
Можно использовать ОА метод для прогнозирования
урожайности сельскохозяйственных культур. Спектры по-
глощения листьев для этого снимаются в диапазоне погло-
щения хлорофилла. Их можно использовать для поиска
образца с наибольшей фотохимической активностью (мень-
ший ОА сигнал) в наборе сходных образцов. Растение, кото-
рое имеет большую фотохимическую активность, в том чис-
ле и на ранних стадиях роста, способно дать больший уро-
жай.
Исследование бактерий, клеток, микроорганизмов
[П. 23, П. 44 — П. 46]. Метод ОА спектроскопии применя-
ют для исследования сине-зеленых водорослей. Микробио-
логи относят их к бактериям и называют цианобактериями.
В спектре водной суспензии сине-зеленых бактерий Synec-
hococcus Sp проявляются полосы поглощения хлорофилла
(Z«660 нм), фикоцианина (Х=615 нм), полоса Соре (около
Х=420 нм) и протеинов (Х=280 нм). Объектом изучения
были также осажденные на нитроцеллюлозные фильтры
цианобактерии Anacystis nidulans. Сравнение фотосинте-
зирующей эффективности пигментов показывает, что она
убывает в ряду: фикоцианин, хлорофилл, каротиноиды.
167
Имеется возможность обнаружения бактерий и определе-
ния различных состояний в их развитии. Так в спектре Ba-
cillus subtilis наблюдается сильно поглощающая область
около Л=410 нм, когда бактерии существуют в виде спор,
и она отсутствует, когда бактерии находятся в вегетатив-
ном состоянии. В специальных клетках, выделенных из
цианобактерий Anabaema 7120, ОА методом изучены: цик-
лический транспорт электрона в фотосистеме I, фиксация
азота и дыхание.
ОА метод позволяет изучать воздействие медикаментов
на микроорганизмы, например действие антималярийного
препарата на лиофильные клетки малярийных паразитов.
Метод не требует специальной подготовки таких образцов
и позволяет проводить исследования in vivo. Еще одно ус-
пешное применение ОА спектроскопии — это исследование
фотоцикла бактериородопсина. Материалом для изучения
служат суспензии пурпурных мембран Halobacterium Halo-
biutn. Исследования возможны в широком интервале тем-
ператур (90—300 К). С помощью частотной зависимости амп-
литуды ОА сигнала можно различать модели энергетики
фотоцикла бактериородопсина.
Эти исследования с бактериородопсином можно прово-
дить и методом температурного скачка, который заклю-
чается в быстром импульсном лазерном разогреве водных
суспензий и растворов биообъектов и наблюдении кинети-
ки фотохимических процессов [151. Наилучшим образом
для этих целей подходит излучение АИГ : Ег лазера с
Х=2,94 мкм, попадающее в полосу поглощения воды (а«
«104 см-1). Длительности импульсов лежат в пико- и нано-
секундном диапазонах, разогрев биообъекта составляет от
нескольких до десятков градусов, толщина разогреваемого
слоя от нескольких до десятков микрометров.
Исследование крови. Абсорбционно-трансмиссионная
спектроскопия при исследовании крови не дает удовлетво-
рительных результатов из-за светорассеяния, обусловлен-
ного наличием в плазме липидных материалов и красных
кровяных клеток. Такие исследования возможны лишь при
значительном усложнении методики измерений, учитываю-
щей эффекты рассеяния. В ОА спектроскопии рассеяние
света не играет решающей роли. Исследование цельной кро-
ви, в том числе и с добавлением токсических веществ, ОА
методом позволяет изучать процесс осаждения и судить о
химических реакциях в образцах [16]. В качестве источника
света использовались Аг лазер (мощностью 30—300 мВт)
или ксеноновая лампа (300 Вт). ОА ячейка имела сапфиро-
168
вое окно, через которое осуществлялось освещение и кото-
рое служило звукопроводом. На одной кромке этого окна
монтировался пьезоэлектрический кристалл.
В ОА спектре крови легко регистрируются изменения,
вызванные разной степенью насыщения ее кислородом
|П. 44, 16]. С помощью ОА спектроскопии цельной крови и
выделенных из нее эритроцитов показана возможность ди-
агностики лейкемии и ряда сердечно-сосудистых заболева-
ний (рис. 5.9) [17].
Анализ биотканей, определение влажности [П. 23,
П. 41, П. 44 — П. 46]. Первые исследования в дерматоло-
гии ОА методом были выполнены в основном на вырезан-
ных эпидермических образцах тканей человека и живот-
ных. В этих исследованиях была обнаружена полоса погло-
щения протеинов в области 280—290 нм, а также получена
Рис. 5.9. ОА спектры цельной крови здорового человека (/) и боль-
ных лейкемией (2, 3) [17]
зависимость амплитуды ОА сигнала от содержания воды в
образце. Интересны эксперименты по обнаружению меди-
каментов в тканях, изучению их действия на кожу, опреде-
лению скорости их диффузии.
Удалось зафиксировать изменения гидратации тонкого
рогового слоя (9—13 мкм). Изменения гидратации рогового
слоя изменяют характер УФ поглощения пробы за счет
изменения его тепловых свойств. Для определения влаж-
ности можно ограничиться только одной длиной волны,
например в максимуме поглощения (1=280 нм), поскольку
увеличение влажности приводит к снижению амплитуды ОА
сигнала во всем спектре.
16»
Другой подход к определению водного содержания в тка-
нях связан с использованием спектра поглощения воды в
ближней ИК области. Методика определения влажности
твердых материалов апробирована на примере синтетиче-
ского протеина, бумаги, порошка молочного суррогата. С
помощью ОА спектрометра оказывается возможным опре-
делять наличие свободной воды, связанной или то и другое
при измерении поглощения на Х= 1,9; 2,2 или 1,4 мкм. Эта
методика определения влажности отличается быстротой
проведения анализа, нечувствительностью к изменениям в
массе образца и в размерах частиц.
Главная трудность кожных ОА измерений in vivo —
чувствительность микрофона к движениям тела (мускуль-
ная активность, ток крови, нервные импульсы). Для пре-
одоления этих трудностей разработан спектрометр с диф-
ференциальной ОА ячейкой с открытым концом для изме-
рения in situ (рис. 5.6з). Свет на образец поступает по свето-
воду, поэтому можно прикреплять ячейку к исследуемому
образцу в любом удобном месте. Получены ОА спектры кожи
брюшной полости крысы, кожи предплечья добровольца,
обработанной мербромином. Эти эксперименты показали,
что ОА сигналы могут быть зарегистрированы с удовлетво-
рительным отношением сигнал/шум. Измерения глубины
Рис. 5.10. ОА спектры нормального (/) и пораженного катарактой
(2) хрусталиков [П. 44]
проникновения светозащитных лекарственных препаратов
в кожу человека in vivo и in situ можно осуществить с по-
мощью резонансного спектрофона открытого типа (рис. 5.6и)
путем изменения частоты модуляции света в широких пре-
делах 0,18—1,2 кГц [П. 46].
ОА спектроскопия может быть особенно полезной в оф-
тальмологии. С помощью ОА методики можно получить
спектр поглощения хрусталика, не разрушая его (рис. 5.10).
Максимум поглощения при Х=280 нм обусловлен поглоще-
нием тирозина и триптофана. Хрусталик, пораженный
170
катарактой, имеет более сильное поглощение не только в об-
ласти 280 нм, но и в видимой и ИК областях спектра. Одна-
ко это поглощение не определяет прозрачность хрусталика,
которая в видимой области зависит главным образом от све-
торассеивающих свойств хрусталика, пораженного катарак-
той (гл. 2).
Импульсная ОА спектроскопия с большим временным
разрешением (порядка 4 нс) на трех длинах волн (эксимер-
ные лазеры: KrF (Х=248 нм) и ХеС1 (Х=308 нм), вторая
гармоника АИГ : Nd лазера (Х=532 нм)) позволяют эффек-
тивно исследовать оптические, теплофизические и акусти-
ческие свойства нормальной и перерожденной ткани аорты
человека, определять порог разрушения ткани по энергии
и временной экспозиции [1.26,9]. Эти исследования важны
для реализации методов лазерной ангиопластики, а также
выявления механизмов абляции биотканей под действием
импульсного УФ излучения [23]. Так, в [23] на примере
изучения тонких (порядка 30 мкм) срезов роговицы глаз
кролика при облучении излучением ArF лазера (Л=193 нм)
определена длительность процесса абляции (порядка 30 нс).
Малая длительность процесса указывает на то, что меха-
низм абляции биоткани под действием импульсного УФ из-
лучения имеет не тепловую, а фотохимическую природу.
Значительные возможности в изучении оптических и теп-
лофизических параметров биотканей имеет метод импульс-
ной оптико-термической радиометрии [18, 21]. Этот метод
также оказался достаточно эффективным при измерениях
коэффициентов поглощения здоровой и патологической
ткани артериальной стенки и атеросклеротических бляшек
[21]. Частично данные [21] представлены в табл. 1.1. При
возбуждении таких биотканей, как дентина зуба, срезы
картофеля и кожи пальца человека, излучением АИГ : Ег
лазера (Л=2,94 мкм) и регистрации их теплового излучения
в диапазоне 4—9 мкм оказывается возможным определять
коэффициенты поглощения света на длине волны лазера и в
спектральном диапазоне излучения ткани, а также темпе-
ратуропроводность и объемную теплоемкость указанных
тканей [18].
Фотоакустическая микроскопия и визуализация. Основ-
ные принципы фотоакустической микроскопии (ФАМ) до-
статочно просты [П. 41]. Сканирование сфокусированного
лазерного пучка по поверхности объекта и регистрация
с помощью микрофона или пьезодатчика акустического
сигнала позволяют получать локальную информацию
об оптических, тепловых и акустических свойствах био-
171
объекта. Так как амплитуда ОА сигнала зависит от ин-
тенсивности поглощенного света, то ФАМ должна да-
вать информацию не только о характере поглощения
света веществом, но и о локальной структуре, качестве по-
верхности и других параметрах объекта, получаемых с по-
мощью обычной оптической микроскопии. Одновременное
сканирование длины волны излучения позволяет получать
локальные спектры поглощения. Поскольку амплитуда ОА
сигнала связана обратной зависимостью с интенсивностью
люминесценции исследуемого вещества, то существует воз-
можность построения аналога люминесцентного микроско-
па, а также возможность изучения локализованных в прост-
ранстве фотовольтаического и фотохимического процессов.
С помощью ФАМ можно обеспечить сканирование объек-
та по его глубине. Изменяя длину волны лазера, можно
регулировать глубину проникновения света в вещество и
возбуждать ОА сигнал на разных глубинах. Другой путь —
изменение частоты модуляции лазерного пучка. Это свой-
ство является уникальным и выделяем ФАМ из други х спо- ч
собов микроскопии. Глубина зондирования определяется'
термодиффузионной длиной для данной частоты модуляции.
Например, для непрозрачного образца (а«10в см-1) ОА
сигнал можно возбудить на глубинах от 0,1 до 103 мкм,
если изменить частоту модуляции от 100 МГц до 1 Гц.
Технические решения в области применения ФАМ про-
анализированы в [П. 41]. Достигнутая разрешающая спо-
собность ФАМ в видимой области спектра не превышает
7—15 мкм. Однако по информативности ФАМ существенно
превосходит оптическую микроскопию, поскольку позволяет
визуализировать детали микроструктуры непрозрачных
для света объектов, тем самым дополняет и расширяет
традиционные методы микроспектрального анализа и имеет
перспективы применения в биологии и медицине.
Например, эффекты возбуждения акустических волн
мощным лазерным импульсом короткой длительности мож-
но использовать для диагностики катаракты, а также внут-
риглазных новообразований (П. 14, 20]. Промышленный
лазерный фотоакустический микроскоп типа ФМ-ЗМ, пред-
назначенный для изучения широкого класса биообъектов
и биотканей (визуализации структурных дефектов и особен-
ностей строения), описан в [20]. Данные по визуализации
и определению теплофизических параметров тонких срезов
(порядка 5 мкм) некоторых биотканей (ткани глаза и почек
животных), полученные фазовым методом при облучении
обратной поверхности объекта, представлены в [24].
Глава 6
ЛАЗЕРНАЯ СПЕКТРОСКОПИЯ КОМБИНАЦИОННОГО
РАССЕЯНИЯ
В этой главе рассматриваются методы микродиагностики,
основанные на неупругом (комбинационном) рассеянии
(КР) света биологическими молекулами. Так как биологи-
ческие объекты в большинстве случаев исследуются в вод-
ных растворах или содержат в себе большое количество
воды, то методы спектроскопии КР имеют важные преиму-
щества перед другими методами микродиагностики, приме-
нение которых к изучению биомолекул в естественной среде
затруднено вследствие поглощения водой.
К настоящему времени накоплен большой эксперимен-
тальный материал по спектроскопии КР биологических мо-
лекул, в частности белков и нуклеиновых кислот. Некото-
рые примеры таких исследований представлены в этой главе.
Кроме биомолекул и их комплексов объектами спектро-
скопии КР все чаще становятся живые клетки и многокле-
точные структуры. Большие перспективы здесь открываются
в связи с развитием техники микроскопии КР.
Кроме методов спектроскопии спонтанного КР, даны
основные сведения о сравнительно новых и наиболее перс-
пективных методах: спектроскопии гигантского КР и актив-
ной спектроскопии КР.
6.1. Физические основы спектроскопии КР
и ее разновидностей
Спонтанное комбинационное рассеяние. Одним из ре-
зультатов взаимодействия света с биологическими объекта-
ми является его неупругое рассеяние, вследствие которого
изменяется не только направление, но и частота излучения.
На рис. 6.1 показаны возможные варианты и следствия
взаимодействия кванта света с молекулой. Здесь основное
173
и первое электронно-возбужденное состояния обозначены
через So и S, соответственно. Каждый из этих уровней энер-
гии состоит из множества колебательных подуровней 1, 2, 3
и т. д. Переходы между различными уровнями и подуров-
нями показаны стрелками, причем длины стрелок, направ-
ленных вверх, пропорциональны частоте падающего света.
i
1
Стокс Антистокс
О кол
к°л
*2.
=
==}*
Обычное КР Резонансное КР
Рис. 6.1. Возможные энергетические переходы в молекуле, неуп-'
руго взаимодействующей с квантом света
Длины стрелок, направленных вниз, пропорциональны
частоте рассеянного света.
В результате взаимодействия за время порядка периода
световых колебаний, т. е. примерно за 10~15 с, молекула,
переходит в более высокое энергетическое состояние. Далее
через интервал времени порядка 10”11 с может произойти
высвобождение кванта света, но уже с частотой, которая
является комбинацией частоты падающего света и частоты
колебательного перехода. При этом если высвобожденный
квант имеет частоту, меньшую частоты падающего света, а
именно v0 — укол (стрелка заканчивается на колебательном
уровне, расположенном выше исходного), то наблюдается
так называемый стоксов компонент комбинационного рас-
сеяния света. Если же происходит энергетический переход
в состояние ниже исходного уровня, т. е. энергия высвобож-
денного кванта больше энергии падающего (v04-vKOn), то
такой компонент КР называется антистоксовым. В обоих
случаях разность частот падающего и рассеянного света
Vo—(v0±vKOJI) равна частоте молекулярного колебания.
Вероятность спонтанного КР существенно меньше ве- ,
роятности рэлеевского (упругого) рассеяния, поэтому ин-
тенсивность сигнала весьма низкая. При этом в нормальных
условиях интенсивность антистоксова компонента рассеян-
ного света значительно меньше интенсивности стоксова ком-
понента. Интенсивность сигнала зависит от частоты падаю-
щего света: вдали от области электронного поглощения она
пропорциональна vj, при приближении к полосе поглоще-
174
ния наблюдается более быстрый рост интенсивности КР.
При попадании частоты v0 в область полосы поглощения
исследуемого вещества наблюдается так называемое резо-
нансное комбинационное рассеяние (РКР).
Интенсивность линий РКР может на несколько порядков
превышать интенсивность обычного КР. Благодаря этому,
используя РКР, можно селективно регистрировать свет,
рассеянный отдельными соединениями в многокомпонент-
ных биологических системах. Интенсивность обычного КР
от остальных компонентов системы при этом настолько
мала, что практически не отличается от фона.
Так как любая биомолекула состоит из большого числа
атомов и атомных групп, то интенсивный падающий свет,
600 575 550 525 500 К, нм
Рис. 6.2. КР-спектр жид«
кой воды, получаемый при
возбуждении Аг лазером (Х=
=488 нм, 1-!=20 492 см”1).
По оси абсцисс отложены
абсолютные и относитель-
ные единицы (волновые
числа)
16500 17500 18500 19500 20500
Абсолютная шкала 7-~1,см 1
взаимодействуя одновременно со многими атомами, дает
целый спектр линий КР. При этом положение линий в
спектре определяется только частотами колебаний основ-
ных электронных состояний (значениями vK0JI J. Поэтому
спектроскопия КР — это вариант колебательной спектро-
скопии. Аналогично ИК спектроскопии смысл применения
спектроскопии КР при исследовании биологических объек-
тов состоит в том, чтобы связать КР-спектры с химическими
свойствами составляющих эти объекты биомолекул и их
ближайшего окружения, хорошо характеризуемыми коле-
бательными спектрами.
На рис. 6.2 изображен в качестве простейшего примера
КР-спектр жидкой воды — естественного физиологического
растворителя биологических соединений. Спектр получен
путем возбуждения воды излучением Аг лазера (Х=488 нм).
По горизонтальной оси отложены длины волн в нанометрах,
соответствующие им волновые числа, а также сдвиги относи-
175
тельно волнового числа возбуждающего излучения (1-1=
=20 492 см-1). Наиболее интенсивная линия в спектре
(3415 см-1) появляется в результате обмена энергии падаю-
щего света с энергией валентных колебательных движений,
соответствующих растяжению связи О—Н. Колебания,,
происходящие при деформации угла Н—О—Н в молекуле
воды, проявляются в КР-спектре существенно слабее (ли-
ния 1619 см-1).
Важной особенностью КР-спектра воды является то, что
за исключением линии валентного колебания интенсивность
этого спектра мала. Это позволяет на его фоне получать
четкие линии КР-спектров растворенных в воде веществ.
Этим спектроскопия КР принципиально отличается от ИК
спектроскопии, так как вода очень сильно поглощает ИК
излучение.
Сравнение интенсивности линий в КР-спектрах, полу-
ченных от большого числа различных молекул, позволило
сформулировать некоторые обобщенные правила [1, П. 8].
Так, например, валентные колебания проявляются в
КР-спектрах сильнее деформационных колебаний (мы уже
видели это на примере воды); линии колебаний кратных
связей должны быть более интенсивными, чем линии коле-
баний простых связей; линии, обусловленные синфазными
колебаниями валентных связей, более интенсивны, чем ли-
нии, обусловленные противофазными колебаниями этих
связей.
Как правило, в КР-спектры многоатомных молекул пре-
обладающий вклад вносят колебания некоторых групп ато-
мов. Это такие часто встречающиеся в органических моле-
кулах группы, как С—Н, О—Н, N—Н, S—Н, С=С, С=О
и др. Точное положение в спектрах линий, соответствую-
щих этим групповым колебаниям, зависит от типа связи с
другими атомами. Так, в спектрах молекул, имеющих груп-
пу =С—Н, имеется линия 3300 см-1, группе ~?С— Н соот-
ветствует линия 2960 см-1, а группе \с—Н— линия
3020 см-1.
Примером более сложной группы атомов, выступающей
в качестве независимого осциллятора в молекулах всех
полипептидов и белков, является так называемая амидная
группа
°)c-n( ,
7 ХН
476
образующаяся при связывании аминокислот друг с другом,
различные типы колебаний этой группы проявляются в
КР-спектрах в виде так называемых полос амид-1, амид-2,
амид-3. Наиболее сильные полосы амид-1 и амид-3 располо-
жены вблизи волновых чисел 1660 см-1 и 1250 см-1 соответ-
ственно. Полоса амид-2 в КР-спектрах белков проявляется
слабо. Точное положение максимумов полос и форма их
контуров определяются вторичной структурой белка.
Аналогично, колебания фосфатных групп
С—Ок /0
>Р<
с—си х>
основной цепи молекул ДНК и РНК обусловливают появле-
ние в КР-спектрах этих макромолекул двух сильных харак-
терных линий вблизи 800 и 1100 см-х. Интенсивность и по-
ложение первой из них зависит от конформации и упорядо-
ченности вторичной структуры.
Характерные линии имеются в КР-спектрах и других
биологических макромолекул. Кроме этих характерных ли-
ний КР-спектры биологических макромолекул и систем со-
держат большое число других линий, приписка которых
определенным внутримолекулярным колебаниям состав-
ляет одну из задач спектроскопии КР биологических объек-
тов.
Общие сведения о технике эксперимента. На рис. 6.3
представлены основные оптические элементы, необходимые
для регистрации спонтанных КР-спектров в обычном экс-
перименте. Использование лазера в качестве источника ин-
тенсивного монохроматического излучения в эксперимен-
тах по возбуждению и регистрации КР было необходимым
Рис. 6.3. Блок-схема установки
для регистрации КР-спектров
в обычном эксперименте: 1 —
лазер, 2 — фокусирующая лин-
за, 3 — кювета с исследуемым
образцом, 4 — конденсор,
5 — входная щель, 6 — моно-
хроматор, 7 — фотоумножитель
или многоканальный анализа-
тор
условием быстрого развития этого метода и широкого внед-
рения его в химию и биологию. Лазеры сняли большинство
12 А. В. Приезжее 177
казавшихся ранее непреодолимыми трудностей и ограни-
чений, связанных с исследуемыми объектами и, как уже го-
ворилось выше, их водными растворами. Чаще всего ис-
пользуются непрерывные Аг и Кг лазеры с дискретной пере-
стройкой длины волны, а также лазеры на красителях и па-
раметрические генераторы света с плавной перестройкой
длины волны. Импульсные лазеры позволяют получать'
высокую импульсную мощность зондирующего излучения
при сравнительно низкой средней мощности и, что особен-
но важно, высокое временное разрешение регистрируемых
спектров.
Регистрация КР-спектра осуществляется либо с по-
мощью фотоумножителя, соединенного со сканирующим
монохроматором (как правило, двойным для надежной от-
стройки от упруго рассеянного света), либо с помощью оп-
тического многоканального анализатора. Этот анализатор
представляет собой линейку из нескольких сотен миниа-
тюрных фотоприемников или высокочувствительную теле-
камеру. В сканирующем спектрометре линии спектра ре-
гистрируются последовательно, причем весь спектр в диа-
пазоне от десятков до тысяч обратных сантиметров с раз-
решением до нескольких обратных сантиметров получают
за время порядка нескольких секунд.
Использование оптического многоканального анализа-
тора позволяет регистрировать все линии спектра одновре-
менно, на что требуется существенно меньше времени вплоть
до нано- и пикосекунд.
Одним из препятствий при регистрации КР-спектров
выступает фоновая люминесценция образцов — более ве-
роятный процесс, чем КР (см. гл. 7). Источниками люминес-
ценции являются примеси или эндогенные хромофоры.
Уменьшения нежелательного люминесцентного фона, пере-
крывающего иногда слабые линии КР, добиваются тщатель-
ной очисткой образца, подбором оптимальной длины волны
возбуждающего излучения или добавлением в раствор ис-
следуемого вещества специальных тушителей. В некоторых
случаях возможно выжигание люминесцирующих примесей
путем длительного облучения образца интенсивным лазер-
ным излучением. Последний способ, правда, может приве-
сти к фотохимической модификации и даже разрушению
образца.
Более перспективным путем отделения КР-спектров от
люминесценции является использование для возбуждения
КР лазерных импульсов пикосекундной длительности. Так
как времена жизни даже быстрой люминесценции (флуорес-
178
ненции) лежат в наносекундном диапазоне (см. гл. 7) в от-
личие от пикосекундного диапазона у КР, то, используя
быстродействующую систему регистрации, отключающуюся
после приема КР-излучения до прихода квантов люминес-
ценции, можно устранить фоновые линии из спектра.
Активная спектроскопия комбинационного рассеяния
(АСКР). Принципиально иным методом регистрации КР-
спектров от объектов с высоким уровнем флуоресценции
является АСКР (2]. Для реализации этого метода исполь-
зуют два перестраиваемых лазера с частотой излучения
vt и v2. Пересекаясь в образце, пучки излучения этих лазе-
ров наводят в нем дипольный момент, характеризуемый не-
линейной восприимчивостью третьего порядка. В резуль-
тате происходит когерентное антистоксово рассеяние с час-
тотой va=2vj—v2. Направление распространения сигнала
определяется выполнением условия фазового синхронизма
для волновых векторов взаимодействующих волн и отли-
чается от направления распространения излучений накачки.
Интенсивность этого рассеянного излучения существенно
возрастает, если разностная частота —v2 совпадает с час-
тотой исследуемого внутримолекулярного колебания.
Варьируя Vj—v2 путем перестройки частоты лазеров, мож-
но прописывать КР-спектры в широком диапазоне и при
этом эффективно отстраиваться от флуоресценции в более
коротковолновую антистоксову область.
Другим достоинством АСКР является возможность раз-
решать близко расположенные и перекрывающиеся спект-
ральные линии, связанная с тем, что спектральное разре-
шение спектрометра АСКР определяется не монохромато-
ром, а шириной линий используемых лазеров [2].
Получению качественных спектров АСКР препятствует
наличие нерезонансного нелинейно-оптического сигнала,
обусловленного вкладом молекул растворителя. Подавле-
ние его осуществляют с помощью поляризационных элемен-
тов, используя различия поляризационных характеристик
резонансного и нерезонансного вкладов [3, 4].
Гигантское комбинационное рассеяние (ГКР). В послед-
ние годы в молекулярной биологии и биохимии начали ис-
пользовать другую разновидность колебательной спектро-
скопии, оснозанную на явлениях ГКР света [5—7]. Суть
этого явления состоит в огромном (до 105—10е раз) увеличе-
нии сечения КР молекулами, адсорбированными на поверх-
ности металла. Вследствие этого ГКР-спектры удается ре-
гистрировать при концентрациях, на несколько порядков
меньших, чем в обычной спектроскопии КР.
12*
179
В основе явления ГКР лежат два механизма: электро-
магнитный, связанный с увеличением локального электро-
магнитного поля вблизи поверхности, и молекулярный, свя-
занный с образованием возбужденных состояний комплек-
сов молекул с металлом [8]. Интенсивное ГКР наблюдается
чаще всего на специально приготовленных металлических
поверхностях с сильной шероховатостью. ГКР-спектры
биологических молекул, как правило, получают в электро-
химических ячейках, в гидрозолях металлов и на металли-
ческих пленках с регулярными неоднородностями. Для ре-
гистрации спектров используется та же аппаратура, что и
для получения обычных КР-спектров. Для возбуждения
применяют лазерное излучение видимого диапазона, мощ-
ность которого обычно не превышает нескольких десятков
милливатт.
6.2 Применение спектроскопии КР
в биохимических исследованиях
Изучение белков. Классическими объектами для при-
менения спектроскопии КР к биомолекулам являются бел-
ки и их компоненты. Причем если первые КР-спектры бел-
ков были получены в конце 50-х годов с помощью ламп,
то в последние два десятилетия в качестве источников воз-
буждения применяют исключительно лазеры.
Целью большинства исследований, проводимых метода-
ми КР, является изучение структуры молекул и изучение
отдельных функциональных групп, определяющих их био-
химическую активность [9, 10].
Из обычного (спонтанного) КР-спектра белка можно по-
лучить информацию о его структурных характеристиках,
например о средней конформации основной полипептидной
цепи [П. 8]. В частности, такая информация содержится в
положении и форме контуров полос амид-1 и амид-3. Дей-
ствительно, каждая амидная группа в молекуле белка имеет
интенсивную.линию амид-1, положение которой в спектре
зависит от конформации данного участка молекулы. Боль-
шинство амидных групп в составе, например, а-спиральной
конформации испытывает примерно одинаковое влияние со
стороны соседних атомов и, таким образом, имеет прибли-
зительно одинаковую частоту линии амид-1 (1645—
1657 см-1).
Амидные группы, находящиеся в составе Р-структурного
фрагмента молекулы, имеют несколько отличающуюся час-
тоту этой линии (1665—1672 см-1). Поскольку вторичная
180
структура реальной молекулы белка сложна, то наблюдае-
мая в КР-спектре этого белка полоса амид-1 представляет
собой суперпозицию отдельных линий.
То же относится к полосе амид-3, в которой в разной сте-
пени проявляются линии: 1260—1295 см-1 (слабая), 1230—
1240 см-1 (сильная) и 1245±3 см-1 (широкая), относящиеся
соответственно ка-спиральной, 0-структурной и неупорядо-
ченной конформациям.
Отсюда видно, что, анализируя положение максимума и
форму контура полосы (например, разлагая эксперимен-
тальную полосу по спектрам отдельных структур), можно
получать количественные оценки содержания отдельных
типов структуры в исследуемом белке.
Обширный материал, накопленный к настоящему време-
ни по установлению вторичной структуры различных бел-
ков, во многом основан на исследовании КР-спектров моде-
лей полипептидов с известной структурой [9, П. 8].
Продемонстрируем возможности спектроскопии КР при
исследовании конформации белков и полипептидов в вод-
ных растворах и в твердом состоянии на примере изучения
структуры и взаимодействия С-протеина и миозина [И].
Эти белки с молекулярным весом 140 000 и 460 000 соот-
ветственно выделяли из скелетных мышц кролика. Рассея-
ние возбуждали Аг лазером (1=488,0 нм), регистрацию про-
водили с разрешением 5 см-1.
На рис. 6.4 приведены КР-спектры С-протеина, миозина
и их комплекса. Для спектра С-протеина (рис. 6.4а) харак-
терны сильная линия амид-1 (1668 см-1) и сравнительно хо-
рошо выраженная полоса амид-3 (1242 см-1). Такое их по-
ложение и соотношение свидетельствуют о том, что молеку-
лы С-протеина находятся в конформациях 0-структуры и
статистического клубка примерно в равной пропорции.
Для миозина (рис. 6.46) характерно слабое рассеяние
в области линии амид-3, в то время как колебание амид-1
проявляется сильной линией 1653 см-1. Наблюдается также
значительная линия на 939 см-1, соответствующая продоль-
ным колебаниям основной полипептидной цепи молекулы.
Это свидетельствует о том, что большинство молекул мио-
зина находится в а-спиральной конформации и незначи-
тельная их часть — в 0-структурной конформации.
При образовании комплекса миозин — С-протеин моле-
кулы последнего присоединяются к молекуле миозина в
нескольких местах, в частности в области легкой цепи меро-
миозина и в области субфрагмента-2 хвоста этой молекулы.
Такое взаимодействие, казалось бы, могло существенно ска-
181
—1___I__1__I___I__L__I___I__1__I________
/600 7400 7200 7000 800
Рис. 6.4. КР-спектры: a — С-протеина (3 %-ный раствор), б —
белка миозина (6 % в таблетке), в — комплекса миозин—С-
протеин (6 % в таблетке). Измерения проводились при одинаковых
условиях: в присутствии 0,09 моль КС! и 5И0-3моль К3РО4
<оН=7,0) [И]
заться на конформациях обеих молекул. Однако анализ
КР-спектра комплекса (рис. 6.4в) показывает, что конфор-
мационных изменений молекул не происходит ни в водном
растворе, ни в твердом состоянии.
182
Используя методы РКР, можно во многих случаях ис-
следовать отдельные атомные группы и их функции в био-
молекуле. Так, резонансный вариант АСКР использовался
для изучения сложных молекул 0-каротина, витамина В12,
металлопорфирина [12]. Представляет интерес исследование
взаимодействия кофермента флавинадениндинуклеотида
(ФАД) с белком-ферментом глюкозоксидазой [13, 14]. Ин-
тересной особенностью проведенных экспериментов являет-
ся то, что в максимум полосы поглощения ФАД попадает
длина волны антистоксового сигнала, а не длина волны из-
лучений накачки. В том же случае когда резонансной яв-
ляется длина волны накачки, качество полученных спектров
существенно ухудшается. В работе [14] экспериментально
подтверждено наличие водородной связи ФАД — фермент.
Рассмотрим более подробно пример исследования мето-
дом АСКР механизма каталитической активности белка-
фермента а-химотрипсина [15—17]. Активный центр этой
молекулы включает имидазольную группу остатка Гис 57,
связанную водородными связями с остатками Асп 102 и
Сер 195, в результате чего образуется система с переносом
заряда. Возможность детального описания процесса, проис-
ходящего в активном центре а-химотрипсина, предполагает
наличие информации о степени протонизации группы
Гис 57: процесс переноса протона в водородных связях при-
водит к изменению протонизации имидазольной группы,
что должно найти отражение в изменении ее колебательного
спектра.
Действительно, АСКР-спектры позволяют по соотноше-
нию интенсивностей определенных линий (в частности, ли-
нии 1164 см-1) получать информацию о содержании той или
иной (протонированной или непротонированной) формы
имидазола. Использование АСКР позволяет регистриро-
вать линии имидазола, не проявляющиеся в спектрах спон-
танного КР.
На рис. 6.5 приведена схема АСКР-спектрометра, по-
строенного специально для исследования биомолекул, для
чего в нем использованы лазеры с высокой импульсной и
сравнительно низкой средней мощностью [4]. Основой
спектрометра является лазер на АИГ : Nd, работающий в
режиме акустооптической модуляции добротности и синх-
ронизации мод. Выходное излучение представляет собой
Цуги импульсов, следующие с частотой 5 кГц. Длительность
отдельного импульса в цуге составляет 80—85 пс, импульс-
ная мощность 0,7 МВт. Излучение задающего генератора
(1060 нм) после удвоения по частоте в кристаллах LiIO3 ис-
183
пользуется в «сигнальном» канале и в канале синхронной
накачки лазера на красителе. Плавная перестройка длины
волны генерации этого лазера производится в диапазоне
0,56—0,60 мкм, что соответствует диапазону разности час-
тот vt—v2=950—2100 см-1. Ширина линии генерации состав-,
ляет 0,5 см-1, длительность импульса 50—60 пс, импульс-
ная мощность 20 кВт. Для уменьшения средней мощности
Рис. 6.5. Блок-схема спектрометра АСКР [4]: 1 — АИГ: Nd лазер,
2 — кристаллы LiIO3, 3 — камера «Агат», 4 — зеркала, 5 — лазер
на красителях, 6 — схема выделения одиночного импульса, 7 —
ромб Френеля, 8— линия задержки, 9— дихроичное зеркало,
10 — кювета, 11 — линзы, 12 — диафрагма, 13 — призма Глана,
14 — интерференционный фильтр, 15—двойной монохроматор,
16 — ФЭУ, 17 — многоканальный анализатор, 18 — модули
КАМАК, 19 — графопостроитель, 20 — ЭВМ
излучения второй гармоники (530 нм), падающего на обра-
зец, из цуга выделяется одиночный импульс. При этом в
«сигнальном» канале излучение имеет среднюю мощность
30—40 мВт, импульсную — 15 кВт, длительность импульса
50—60 пс.
Излучение второй гармоники vx и лазера на красителе
v2 фокусируется линзой на кювету с образцом. Генерируе-
мый антистоксов сигнал коллимируется и фокусируется
линзами на входную щель монохроматора. Для подавления
нерезонансного фона линейные поляризации излучений на-
качки vt и v2 разводятся при помощи ромба Френеля.
Вращением анализатора (призмы Глана) вблизи положения
максимального подавления нерезонансного сигнала доби-
ваются существенного видоизменения спектра. Это дает
возможность управлять формой спектра за счет изменения
184
условий интерференции нерезонансной и резонансной со-
ставляющих сигнала.
Сигнал АСКР, спектрально отфильтрованный от засве-
ток с помощью двойного монохроматора, попадает на ФЗУ,
работающий в режиме счета фотонов. Далее информация
накапливается в многоканальном анализаторе. Регистра-
ция, обработка сигнала и перестройка лазера на красите-
ле производятся при помощи микро-ЭВМ.
Осуществляя амплитудно-поляризационное подавле-
ние нерезонансного фона, с помощью описанной установки
Рис. 6.6. АСКР-спектр водного раствора а-химотрипсина при раз-
личных углах между осью поляризационного анализатора и век-
тором поляризации нерезонансного сигнала ш: — 1,0° (а), 1,5° (б),
0°(е) [4]
удалось, в частности, установить гидрофобность окруже-
ния имидазольного кольца в промежутке между субглобу-
лами молекулы а-химотрипсина, где расположен ее актив-
ный центр. На рис. 6.6 приведены спектры амплитудно-по-
ляризационной АСКР а-химотрипсина в диапазоне 960—
185
1060 см-1. В этом диапазоне лежат частоты колебаний, ха-
рактерных для аминокислотных остатков фенилаланина
(1004 см-1), триптофана (1014 см-1), а также валентных коле-
баний связи С—N (1033 см-1). Интересно отметить, что все
шесть остатков фенилаланина, входящих в состав белка,
находятся в непосредственной близости от активного
центра.
Все спектры были получены при одинаковых условиях
и отличаются друг от друга углом между осью поляриза-
ционного анализатора и вектором поляризации нерезонанс-
ного сигнала (<р). Помимо подавления нерезонансного фона
поляризационная методика позволяет управлять формой
спектра, выделяя или ослабляя в нем те или иные линии.
В частности, в эксперименте выявлена линия 1010 см-1, ко-
торая совсем не проявляется в спектрах спонтанного КР.
Вопрос о соответствии этой линии определенным элементам
вторичной структуры белка является предметом будущего
исследования.
Уникальную возможность изучать состояние отдельных
атомных групп, расположенных на поверхности макромоле-
кул, дает также спектроскопия ГКР 17, 18, 19]. За послед-
ние годы с помощью этого метода исследовано большое чис-
ло белков и составляющих их аминокислот. В частности,
для водорастворимых белков было показано [19], что уси-
ление КР наблюдается только для групп атомов, которые
находятся на поверхности белковой глобулы и взаимодей-
ствуют с металлом. В то же время линии амид-1 и амид-3 в
спектрах ГКР не обнаруживаются. По-видимому, это свя-
зано с эффектом экранировки пептидных групп боковыми
цепями аминокислотных остатков, что отдаляет их от по-
верхности металла и препятствует эффективному усилению
соответствующих колебаний.
Возможности ГКР при изучении белков продемонстри-
руем на примере светочувствительного мембранного бел-
ка — бактериального родопсина (БР). Молекулы этого
белка осуществляют трансмембранный перенос протонов.
Для понимания молекулярного механизма функционирова-
ния БР необходимо определить топографию его хромофор-
ного центра (положение остатка ретиналя). Метод спектро-
скопии ГКР был использован для установления расположе-
ния ретиналя относительно поверхности мембран [20].
При адсорбции на гидрозоле серебра пурпурная мембра-
на, содержащая БР, может взаимодействовать с серебром
как наружной, так и внутренней стороной (рис. 6.7). На-
личие в спектре полос колебаний хромофора подтвержда-
ло
\
ет вывод -о сближенности ретиналя с поверхностью мебра-
ны. Отметим, что сходство спектров РКР и ГКР в области
1000—1400 см-1 свидетельствует о том, что при адсорбции
белка полиеновая цепь ретиналя полностью сохраняет
трансконфигурацию, характерную для БР в водной суспен-
зии.
Изучение нуклеиновых кислот. Первый КР-спектр ДНК
был получен в 1968 г. [21]. Начиная с этого момента прове-
дено большое число исследований методом спектроскопии
1700 1500 1300 11OO 900 ЗОО 1ОО
к1см~1
Рис. 6.7. РКР-спектры водной суспензии пурпурных мембран раз-
ной концентрации: а — 10“6, в — 10“7 моль/л, б — ГКР-спектр
пурпурных мембран, адсорбированных на серебряном гидрозоле,
концентрация 10“7 моль/л; в нижнем спектре чувствительность
увеличена в два раза [20]
КР свободных оснований и нуклеотидов, комплексов их с
белками [22], тяжелыми металлами и другими элементами
и соединениями. Были получены КР-спектры растворов
природных вирусов [23] и хромосом [24].
Возможности спектроскопии КР для исследования раз-
личных особенностей нуклеиновых кислот можно проде-
монстрировать экспериментом по плавлению ДНК [25].
На рис. 6.8 приведены полученные при разных температу-
рах КР-спектры ДНК, выделенной из тимуса теленка. Так
187
как температура плавления ДНК лежит в интервале SO-
85 °C, то по КР-спектрам можно судить, что /Происходит
с молекулами в процессе плавления. 7
Изучение температурной зависимости КР-спектров по-
мазывает, что по температурным профилям интенсивностей
в
а
1600 1400 1200 1ООО 800
Рис. 6.8. КР-спектры водного раствора ДНК, выделенной из ти-
муса теленка при температуре 98 (а), 84 (б) и 25 °C (в); рН=7,0 [25]
и частотам линий разные внутримолекулярные связи мож-
но отнести к разным категориям: 1) связи оснований, кото-
рым соответствует обратимое уменьшение интенсивностей
линий, предшествующее точке плавления, т. е. определен-
ное явление предплавления; 2) связи оснований, для кото-
рых температурная зависимость выражена слабо или вооб-
ще отсутствует; 3) дезоксирибозофосфатные связи основной
цепи, для колебаний которых характерно отсутствие тем-
188
пературнрй зависимости ниже точки плавления и сильное
падение интенсивности в этой точке.
Некоторые линии, соответствующие всем 4 основаниям
(аденину (А)/тимину (Т), цитозину (С) и гуанину (G)), пре-
терпевают постепенное возрастание в интенсивности с рос-
том температуры ниже точки плавления. При достижении
этой точки происходит резкое увеличение интенсивности
этих линий (например, линии Т 1240 см-1 на рис. 6.8). Это
говорит о том, что некоторые изменения в расположении
оснований относительно друг друга (вертикальный стэ-
кинг) начинают происходить, начиная с температуры 50 °C,
т. е. существенно ниже точки плавления. При достижении
точки плавления молекулы ДНК меняют свою конформа-
цию, переходя из Б-формы в форму случайно неупорядочен-
ного клубка.
Высокочувствительным методом регистрации тонких
конформационных изменений в ДНК стала спектроскопия
ГКР. В частности, регистрируются тонкие эс]х|)екты деста-
билизации двойной спирали ДНК, вызванные действием
даже низких доз ионизирующих излучений [27] и мутаген-
ных факторов [28].
6.3. КР-микроскопия биологических структур
и живых клеток
Методы микроскопии КР дают большие возможности для
исследований in situ на клеточном уровне. Объединение
спектрометра КР с обычным оптическим микроскопом в один
прибор позволяет использовать все способы наблюдения
клетки, разработанные в оптической микроскопии, без ка-
кой-либо специальной подготовки объекта. Можно выде-
лить две основных методики измерений: точечное освещение
объекта с одноканальной регистрацией и общее его осве-
щение с многоканальной регистрацией.
В первой методике пучок лазерного излучения фокуси-
руется оптической системой микроскопа в пятно, размеры
которого определяются дифракционным пределом (менее
1 мкм в перетяжке). Рассеянный назад исследуемым образ-
цом свет собирается тем же объективом и направляется на
входную щель спектрометра.
Во второй методике частично расфокусированным пуч-
ком освещается большая область (150—300 мкм в диамет-
ре). Из всего КР-спектра выделяется одна составляющая,
соответствующая какому-либо волновому числу и отражаю-
щая наличие некоторого специфического компонента образ-
189
ца. Далее строится микрографическое изображение, ото*
бражающее распределение этого компонента по освещенной
области. Получение такого КР-изображения/постигается
путем передачи через спектрометр оптическогоизображения,
формируемого объективом микроскопа, на фотокатод мно-
гоканального детектора.
Можно также получать изображение объекта сканиро-
ванием по нему сфокусированным пучком.
Были получены КР-изображения малых объемов натив-
ной древесной ткани 129]. При этом экспериментальные
спектры соответствовали двум основным компонентам этой
ткани: целлюлозе (линии 330, 380, 1098, 2890 и 2940 см-1) и
лигнину (линии 1120, 1150, 1340, 1380 и 1450 см-1).
Микроскопия КР используется также и в резонансном
варианте. Например, были получены КР-изображения
хромобактерий [30] и различных видов морских водорослей
[31 ] как в суспензии, так и одиночных клеток. Так, РКР-
спектры в диапазоне 900—1600 см-1 были получены для
14 типов содержащих каротин бактерий и 9 клонов морско-
го планктона. Было показано, что имеются четкие разли-
чия в спектрах клеток разных типов. При этом индивидуаль-
ные клетки могут быть детектированы на фоне суспензии
других клеток без необходимости их предварительного раз-
деления [32].
По сравнению с КР-микроскопами, использующими
спонтанное КР света, АСКР-микроскопы дают существенно
более сильный сигнал [33]. Их пространственное разреше-
ние определяется главным образом параметрами системы
получения изображения, а не диаметром сфокусированного
пучка. Так как монохроматор не нужен, то пространствен-
ное разрешение не ограничивается параметрами дифрак-
ционных решеток.
В [33] описан АСКР-микроскоп с пространственным раз-
решением 0,7 мкм, которое потенциально может быть дове-
дено до 0,35 мкм. Изображение клеток кожицы лука в диа-
пазоне 1900—2700 см-1 получали сканированием в преде-
лах 300 х 300 мкм. Выбор этого диапазона волновых чисел
определяется тем, что он сравнительно свободен от линий,
соответствующих большинству колебаний молекул, но
включает линии дейтерированных связей С—Н и О—Н.
Клетки предварительно выдерживали в D2O в течение
4 часов. Общее изображение клетки при настройке на ли-
нию 2450 см-1, соответствующую колебанию О—D, в целом
повторяло ее обычное изображение в белом свете, однако
не содержало ядер как составных частей. Это говорит о том,
190
что за 4\часа D2O проникает во все области внутри клетки,
кроме ядар.
Этот эксперимент показывает возможности АСКР-мик-
роскопии для\ изучения динамики обмена веществ на кле-
точном уровнел
6.4. Применение спектроскопии КР в офтальмологии
В последнее время спектроскопия КР как неразрушаю-
щий неинвазивный метод лазерной диагностики, дающий
информацию об объекте на молекулярном уровне и имею-
щий значительные перспективы для проведения анализа
in vivo и in situ, все больше проникает в область медицин-
ских исследований. Первым и остающимся одним из основ-
ных применений спектроскопии КР в медицине является
Рис. 6.9. Блок-схема спект-
рометра для измерений in
vivo [38]: 1 — лазер на кра-
сителях, 2 — эксимерный
лазер, 3 — непрерывный Аг
лазер (Х=488 нм), 4 — об-
разец, 5 — дифракционный
спектрограф, 6 — синхрон-
ный импульсный генера-
тор, 7 — охлаждаемый мно-
гоканальный детектор, 8 —
графопостроитель, 9—ЭВМ,
10 — дисплей, 11 — магнит-
ная память. Штриховыми
линиями показана часть ус-
тановки для импульсной
КР-Диагностики, которая
пока не реализована
офтальмология, а именно изучение интактных хрустали-
ков животных и человека [34—40]. Разработка КР-микро-
спектрометров с многоканальной регистрацией спектров,
обеспечивающих высокое быстродействие и пространствен-
ное разрешение (локальность) при значительной чувстви-
тельности, открывает возможность проведения ранней
диагностики такого серьезного и массового заболевания, как
катаракта [35, 37, 39, 40].
Блок-схема одного из таких спектрометров представле-
на на рис. 6.9. Главным элементом спектрометра является
высокочувствительный охлаждаемый многоканальный де-
тектор, который в сочетании с Аг лазером (Х=488 нм) не-
большой мощности (2—30 мВт) позволяет получать КР-
191
спектры в довольно широкой полосе частот за очрнь малое
время (0,5 с). Эти обстоятельства определяют возможность
снятия КР-спектров in vivo, что и демонстрируют изобра-
женные на рис. 6.10 КР-спектры хрусталика^аза кролика
/
Рис. 6.10. КР-спектры хрусталика глаза кролика в области ядра
[39]: 1 — измерения in vivo, мощность излучения лазера Р=2 мВт;
2 — измерения на изолированном хрусталике (Р=30 мВт). Время
экспозиции для каждого из трех фрагментов спектра порядка 0,5 с
в области ядра [39]. Заметим, что мощность излучения ла-
зера 2 мВт при времени облучения 0,5 с является предель-
ной, при которой не происходит повреждения сетчатки
глаза.
Дальнейшие усовершенствования спектрометра в плане
возбуждения импульсных КР-спектров с помощью пере-
192
страиваемого лазера на красителях, накачиваемого экси-
мерным лазером, должно позволить с еще большей гаран-
тией реализовать измерения in vivo за счет оптимизации
возбуждениячспектров (подстройка частоты лазера) и умень-
шения экспозиции (импульсный режим).
Микроспектрометр КР на базе аргонового лазера (1=
=514,5 нм) с мощностью 60 мВт и диаметром пятна на объ-
екте 2 мкм описан в [37]. Спектры хрусталика снимались в
Таблица 6.1
Характерные полосы спектра КР свежеприготовленного целого
хрусталика глаза кролика, полученного от поверхностного слоя
под ядром хрусталика.
Значения КР-сдвиюв частоты приведены без учета нелинейности шкалы длин
волн спектрографа (фенилаланин — Ф, тирозин — ТРЗ, триптофан — ТРФ) [37]
КР-сДвиг частоты, см”1 Отнесение частоты КР-сдвиг частоты, см”1 Отнесение частоты
622 Ф 1256 Амид-3
644 ТРЗ 1268 Амид-3
697 С—S-колеб. 1322 С—Н-колеб.
725 С—S-колеб. 1342 ТРФ
760 ТРФ 1404 —СО2-колеб.
829 ТРЗ 1450 СН2-колеб.
855 ТРЗ 1550 ТРФ
880 ТРФ 1586 ТРЗ, Ф
936 С—С-колеб. 1606 Ф
961 С—С-колеб. 1617 ТРЗ
1005 Ф 1670 Амид-1
1032 Ф 2568 S—Н-колеб.
1075 С—N-колеб. 2877 С—Н (неароматич.)
1129 С—N-колеб. 2939 С—Н (неароматич.)
1159 С—N-колеб. 3062 С—Н (ароматич.)
1177 ТРЗ, Ф 3287 Н2О, N —Н-колеб.
1209 ТРЗ 3390 Н2О
1240 Амид-3
диапазонах 200—1400, 700—1900, 2400—3600 и 2800—
4000 см-1 с помощью дифракционного спектрометра и много-
канального анализатора с линейкой из 1024 фотодиодов.
Время измерения полного спектра составляло 5—30 мин.
Данные по КР-сдвигам частоты характерных полос в спект-
ре и результаты их отнесения, приведенные авторами [37],
представлены в табл. 6.1.
КР-спектр нормального хрусталика образуется перекры-
вающимися спектрами так называемых а-, 0- и у-кристал-
13 А В. Приезжее 1®®
линов — структурных протеинов, общий вес которых в
хрусталике млекопитающих составляет приблизительно
33 % от общего веса хрусталика, спектрами их/производ-
ных (в основном агрегатов протеинов) и воды,Содержащей-
ся в хрусталике [34]. С помощью спектроскопии КР изу-
чается молекулярная структура нормальных, состарив-
шихся и катарактальных хрусталиков животных и челове-
ка, в том числе и хрусталиков, подвергнутых воздействию
лекарственных препаратов [34—40]. Наиболее интересные
результаты получены для вторичной структуры протеинов
хрусталика и для микроокружения боковых групп протеи-
нов, таких как триптофан, тирозин и сульфидные группы.
<2 точки зрения ранней диагностики катаракты представля-
ют интерес следующие полосы [38, 39]: полоса в диапазо-
не 3600—3100 см-1, определяемая наличием воды в хрус-
талике; полоса с частотой 2580 см-1 (2568 см-1 по данным
[37], табл. 6.1), отнесенная к валентным колебаниям суль-
фидных групп цистеинового остатка; дублетные полосы
тирозина на 855 и 831 см-1; конформационные полосы поли-
пептидного основания на 1672 см-1 амида-1 и 1240 см-1 ами-
да-3; полосы триптофана на 644 см-1 и фенилаланина на
624 см-1 (622 см-1 [37], табл. 6.1).
Отношение интенсивности полосы 3390 см-1 (ОН-валент-
ные колебания) к интенсивности полосы 2935 см-1 (СН-ва-
лентные колебания) изменяется от 0,40 для прозрачного
хрусталика до 0,50 для катарактального хрусталика глаза
кролика (табл. 6.2). При обработке хрусталика антиката-
рактальным лекарственным препаратом это соотношение
устанавливается на уровне 0,43. Обратные процессы
происходят в ядре хрусталика глаза мыши при старении,
когда это отношение уменьшается от 0,33 до 0,18 [34]. Эти •
изменения свидетельствуют о потере воды в процессе старе-
ния. В то же время исследование трех типов катаракт у
мышей показывает, что интенсивность ОН-валентных коле-
баний (3390 см-1) существенно возрастает по мере помут-
нения хрусталика. Например, отношение интенсивностей
для катарактального и нормального хрусталиков при оди-
наковом возрасте, равном 4 месяцам, составляет 1,1—1,4.
Таким образом, относительная интенсивность характе-
ристических колебаний Н2О может служить в качестве
теста при диагностике катаракты. Однако необходимы со-
ответствующие исследования на хрусталиках человека.
Отношения интенсивностей наиболее характерных КР-
полос хрусталика глаза кролика, чувствительных к ис-
194
кусствёцно вызванной за счет соответствующей диеты ката-
ракте, представлены в табл. 6.2 (38]. Эти изменения в поло-
сах, соответствующих воде, сульфидным группам, тирози-
ну, триптофану и фенилаланину, а также амиду-1 и амиду-3,
предполагают ряд структурных модификаций, возникаю-
щих при формировании катаракты, которые приводят к
Таблица 6.2
Отношение интенсивностей КР-полос хрусталика глаза кролика
Катаракта вызвана искусственно за счет диеты. Лекарственный препарат —
Dcndalina [38]
Отношение частот КР-полос Отношение интенсивностей КР-полос
Нормальный хрусталик Катарактальный хрусталик
без лекарст. преп. с лекарст. преп.
3390/2935 0,40 0,50 0,43
2580/2730 1,53 1,38 1,43
831/855 0,92 0,96 0,94
880/760 0,78 0,66 0,71
644/624 1,77 1,44 1,55
частичному преобразованию триптофановых остатков про-
теинов хрусталика из «закрытой» в «открытую» форму, воз-
можности вовлечения тирозиновых остатков в предпола-
гаемый процесс «агрегации протеинов», одновременному
частичному превращению SH-групп цистеина в S—S связи.
При исследовании структурных изменений катарак-
тальных хрусталиков человека возникают определенные
трудности из-за их сильной флуоресценции, которая уси-
ливается с возрастом. Отношение интенсивности флуорес-
ценции к интенсивности отдельных полос в КР-спектре яв-
ляется мерой патологии хрусталика, что связано с его по-
мутнением за счет флуорофоров (высокомолекулярных агре-
гатов протеинов) [34—40]. Воздействие антикатарактальных
препаратов значительно снижает фон флуоресценции в
КР-спектрах. Этот эффект может служить мерой действия
препаратов [38]. С другой стороны, увеличение длины вол-
ны возбуждающего лазера от 406,7 нм до 514,5 нм и далее
До 647,1 нм позволяет сильно уменьшить фон флуоресцен-
ции и надежно регистрировать КР спектры [34].
С помощью разработанного в [37] многоканального мик-
роспектрометра оказалось возможным получать КР-спект-
13* 195
ры микрообъемов хрусталиков глаз кролика и человека,
соизмеримых с размерами локальных помутнении в ката-
рактальном хрусталике, которые были определены с по-
мощью электронной микроскопии. В прозрачном хруста-
лике были замечены изменения КР-спектров протеинов при
сканировании сфокусированного лазерного пучка от центра
к периферии хрусталика. Однако не было замечено изме-
нений в спектрах двух соседних участков хрусталика —
прозрачного и замутненного. Это может быть связано с
трудностями настройки перетяжки сфокусированного пуч-
ка света на замутненное микровключение или, действи-
тельно, с очень малыми изменениями КР-спектров сосед-
них участков. Замутнение хрусталика в этом случае может
быть связано с флуктуациями дальнодействующего порядка
ориентации протеинов, вызванного очень малыми измене-
ниями пептидных цепей, и может быть исследовано с по-
мощью поляризационной спектроскопии КР [37] и спектро-
скопии упругого светорассеяния (гл. 2).
Определенную надежду на решение в ближайшее время
проблемы ранней диагностики катаракты методом спектро-
скопии КР вселяют успешно проведенные in vivo измере-
ния КР-спектров хрусталика глаза кролика в области ядра
(см. рис. 6.10). Это оказалось возможным благодаря разви-
тию техники спектроскопии КР с применением многока-
нальных оптических анализаторов, позволяющих с высокой
чувствительностью регистрировать широкую полосу КР-
спектра за время порядка 0,5 с [36,38,39]. В [39] исполь-
зован многоканальный детектор типа Tracor TN-6500, а в
[37] — EG & GPA ОМА 111 с линейной из 1024 диодов,
позволяющий снимать КР-спектры за несколько минут.
Фирма Жобен Ивон (Франция) выпускает универсальные
полностью автоматизированные микроспектрометры КР
типа V1000 и S3000, оснащенные многоканальными опти-
ческими детекторами.
Глава 7
ЛАЗЕРНЫЙ ФЛУОРЕСЦЕНТНЫЙ АНАЛИЗ
Хорошо известны большие возможности, которые от-
крыло в медико-биологических исследованиях применение
люминесцентного анализа [1—5]. Благодаря высокой чув-
ствительности к малым количествам биологического мате-
риала и хорошей воспроизводимости результатов, этот ме-
тод стал использоваться для решения широкого круга задач
в области молекулярной и клеточной биологии, вирусоло-
гии, биофизики мембран. В медицине люминесценция ис-
пользуется для диагностики важнейших физиологических
процессов, для контроля за поступлением, превращением и
выводом из организма лекарств, для диагностики большого
числа заболеваний от гриппа до рака, для контроля каче-
ства пищевых продуктов и чистоты окружающей среды и
т. д.
В этой главе показано, что применение лазерной техни-
ки в одних случаях придает люминесцентному анализу ка-
чественно новые возможности, в других — использование
лазеров позволяет существенно повысить эффективность ис-
следований.
После краткого описания физических основ лазерного
люминесцентного анализа рассмотрены разработанные к
настоящему времени технические средства, позволяющие,
в частности, проводить кинетические измерения с большим
пространственным и временным разрешением и с цифровой
обработкой информации. Возможности метода продемонст-
рированы на ряде примеров от изучения свойств макромо-
лекул, отдельных живых клеток и микроорганизмов до
диагностики злокачественных опухолей и атеросклероти-
ческих изменений сосудов.
В заключительной части приведены примеры дистанци-
онной флуоресцентной диагностики фотосинтезирующих
биологических объектов с борта самолета или судна.
197
7.1. Физические основы метода
Общие сведения. В основе лазерного флуоресцентного
анализа лежит регистрация фотонов, испускаемых молеку-
лами при переходе из электронно-возбужденного в основ-
ное состояние (см. рис. 5.1, 7.1). На рис. 7.1 основное
и первое возбужденное
синглетные состояния обозначе-
ны через So и Sv Каждый из
этих уровней энергии может
состоять из множества колеба-
тельных подуровней 1,2,3 и т. д.
Переходы между различными по-
дуровнями показаны стрелками.
Возбуждение атомов и моле-
кул при лазерном флуоресцент-
ном анализе обычно происходит
Рис. 7.1. Схема расположе- путем поглощения ими квантов
ния энергетических уров- лазерного излучения ближнего
ней и переходов молекулы ультрафиолетового или видимого
диапазонов. Этот процесс проис-
ходит за время порядка периода световых колебаний,т. е. при-
мерно за 10-15 с. При этом молекула, как правило, оказывает-
ся на некотором высшем колебательном уровне Sx или S2.
Далее для молекул в конденсированной фазе характерна
быстрая безызлучательная релаксация на самый нижний
колебательный подуровень соответствующий термически
равновесному состоянию. Эгот процесс заканчивается, как
правило, за время 10-12—10"11 с. Дальнейший переход в
состояние So сопровождается спонтанным процессом вы-
свечивания квантов света. При этом если переход осущест-
вляется непосредственно из состояния St в состояние So без
изменения спинов электронов, то такой переход относится к
квантовомеханически разрешенным переходам. Типичное
значение времени жизни этого возбужденного состояния
составляет 10~® с. Этот процесс и называют собственно
флуоресценцией.
Если, однако, перед испусканием фотона в результате
некоторого внутреннего энергетического перехода один из
электронов молекулы изменит свой спин, то молекула ока-
зывается в триплетном состоянии 7\, переход из которого
в основное синглетное состояние квантовомеханически не
разрешен, т. е. его вероятность очень мала. Диапазон вре-
мени жизни этого состояния от 10-8 до 102 с. Такое испус-
кание фотонов называется фосфоресценцией. Эю излучение
обычно сдвинуто в сторону больших длин волн (меньших
198
энергий) по сравнению с флуоресценцией и имеет сущест-
венно большую длительность при импульсном возбуж-
дении.
Предметом нашего дальнейшего рассмотрения будет ис-
ключительно флуоресценция. Подчеркнем, что спонтанная
эмиссия флуоресценции представляет собой случайный про-
цесс и спонтанное излучение является некогерентным, в от-
личие, например, от упруго рассеянного излучения.
Многие важные биологические объекты характеризуются
собственной флуоресценцией или имеют флуоресцирующие
компоненты — флуорофоры. Так, около 90 % всей флуо-
ресценции белков обусловлено наличием в них ароматиче-
ской аминокислоты триптофана. Белки поглощают свет
вблизи 1=280 нм, а наиболее сильно флуоресцируют в об-
ласти 1=300—350 нм. Время жизни флуоресценции трип-
тофана в белках лежит в диапазоне 1—7 нс и зависит от типа
белка и его третичной структуры. Также флуоресцируют в
белках такие аминокислоты, как тирозин, фенилаланин,
цистеин и цистин. Общая характеристика флуоресценции
белков приведена в работах [6—8].
В синей и желто-зеленой областях спектра флуоресци-
руют восстановленные пиридин-нуклеотиды НАДН и
НАДФН (1=440—480 нм) и окисленные флавопротеиды
(ФП) (1=510—540 нм). Эти вещества участвуют в таких
важнейших внутриклеточных процессах, как гликолиз,
цикл Кребса, дыхание. Поэтому практически любые сдвиги
в клеточном метаболизме отображаются на динамике
свойств НАДН и ФП, а она в свою очередь может быть вы-
явлена при флуоресцентном анализе живых клеток и тка-
ней. Один из таких примеров будет рассмотрен ниже.
Естественной флуоресценцией обладают также и другие
кофакторы, ферменты, витамины, стероиды и гормоны. Нук-
леотиды и нуклеиновые кислоты обычно сами не флуорес-
цируют. Однако имеются некоторые исключения. Так,
tRNA-Phe из дрожжей содержит интенсивно флуоресцирую-
щее основание, известное как Y-основание, которое имеет
максимум испускания вблизи 1=470 нм, а время жизни
около 6 нс. В ближней УФ и видимой частях спектра флуо-
ресцируют искусственно выращиваемые кристаллы основа-
ний нуклеиновых кислот.
Собственной флуоресценцией в УФ диапазоне обладает
сократительный аппарат, митохондрии и некоторые другие
внутриклеточные структуры, причем интенсивность их
флуоресценции зависит от физиологического состояния кле-
ток и меняется при различных воздействиях на клетки.
199
Флуоресценция в красной части спектра обусловлена при-
сутствием в живых клетках порфиринов. /
Однако естественные флуоресцентные свойства многих
биологических объектов выражены слабо и часто не дают
возможности получить из эксперимента искомую информа-
цию. В таких случаях в качестве меток, или зондов, исполь-
зуют другие естественные или искусственно синтезирован-
ные флуорофоры, которые хотя и являются посторонними по
отношению к исследуемому объекту, но имеют лучшие
флуоресцентные свойства. Флуоресцентные зонды позволя-
ют, например, количественно характеризовать такие физи-
ческие свойства мембран, как поверхностный заряд, транс-
мембранный потенциал, микровязкость, расстояние между
белками и липидами, концентрация воды в мембранах, из-
менение конформации белков и др. [7].
Использование флуоресцентных зондов позволяет про-
водить диагностику многих заболеваний, в частности им-
мунных, включая аллергию, токсикозы и атеросклероз. Ре-
гистрация флуоресценции искусственно вводимых в живые
клетки и организмы флуоресцирующих красителей, напри-
мер порфиринов и тетрациклинов, проводится также при
диагностике раковых опухолей (см. ниже).
Параметры флуоресценции. К основным параметрам
флуоресценции относятся:
— интенсивность флуоресценции — число излучаемых
за секунду фотонов сМф в полосе </1ф на длине волны 1Ф при
данной интенсивности возбуждения: I^=dN^/dX^;
— спектр возбуждения — зависимость интенсивности
флуоресценции /ф на длине волны %ф от длины волны
возбуждающего излучения %в: /Ф(ХВ)=<2МФЖВ, Хф=соп$1;
— спектр флуоресценции — зависимость интенсивности
флуоресценции /ф при данной длине волны возбуждения
%в от длины волны Хф: /ф (Хф)=(/Л^ф/^1ф, lB=const;
— квантовый выход флуоресценции — отношение
числа излучаемых за секунду квантов Мф к числу погло-
щенных за секунду квантов Nn: k^—N^/Nn;
— время жизни (затухания) флуоресценции — время, в
течение которого интенсивность флуоресценции уменьшает-
ся до уровня 1/е начальной величины; связь между интен-
сивностью флуоресценции /ф и временем жизни т опреде-
ляется выражением: 7ф=7фое_'/т, где /ф0 — максимальная
интенсивность флуоресценции во время возбуждения;
— степень поляризации р и степень анизотропии г флу-
оресценции определяются распределением электромагнит-
ных колебаний относительно направления наблюдения.
200
Флуоресценция всегда частично поляризована. Анизо-
тропное световое возбуждение позволяет выделить из хао-
тической совокупности атомов или молекул определенную
группу.
Поляризация флуоресценции несет информацию о
поведении молекул между поглощением и испусканием фото-
нов, об ориентации молекул, их подвижности и взаимодей-
ствии с окружением.
Любой эксперимент с использованием лазерного флуо-
ресцентного анализа сводится к селективному возбужде-
нию флуоресценции исследуемого объекта или какой-либо
его части лазерным излучением, измерению одного или не-
скольких из перечисленных выше параметров и оценке свя-
зи полученных результатов с изучаемым явлением в рамках
той или иной модели.
Временной диапазон между поглощением излучения и его
последующим испусканием достаточен для протекания це-
лого ряда процессов, каждый из которых ведет к изменению
наблюдаемой характеристики флуоресценции. К таким про-
цессам относятся: столкновения с тушителями флуорес-
ценции (например, с молекулами кислорода), вращатель-
ная и поступательная диффузия, образование комплексов
с растворителем или с растворенными веществами и т. д.
В результате регистрация спектров, времен жизни, кванто-
вых выходов и анизотропии флуоресценции дает большую
информацию о таких динамических процессах.
7.2. Лазерная флуоресцентная микроскопия
и микроспектрофлуориметрия
Общие сведения. Применение лазеров и цифровых мето-
дов обработки информации существенно продвинуло воз-
можности микрофлуоримегрической диагностики. С одной
стороны, лазеры обеспечивают высокую спектральную
плотность мощности возбуждающего излучения, которое
с малыми потерями может быть сфокусировано в пятно диа-
метром около одного микрометра. С другой стороны, ис-
пользование наряду с другими устройствами сопряженных
с ЭВМ современных видеодетекторов, регистрирующих
ультранизкие интенсивности, позволяет достичь сверхчув-
ствительной регистрации пространственного распределения
флуорофоров в клетках, мембранах, а также эффективно
решать другие задачи, связанные с измерением малых коли-
честв исследуемых веществ в различных модельных средах
и биологических структурах.
201
Количественный микроспектрофлуориметрический ана-
лиз биологически активных молекул. Схема достаточно
простого лазерного флуоресцентного микроскопа, постро-
енного на базе люминесцентного микроскопа «Люмам-ИЗ»,
изображена на рис. 7.2 [9]. Для возбуждения флуоресцен-
ции используется непрерывный Не—Cd лазер (Л.х=441,6 нм,
Рис. 7.2. Схема импульсного
флуоресцентного микроскопа: 1 —
лазер, 2 — модулятор, 3, 10 —
ФЭУ, 4 — телескоп, 5 — полевая
диафрагма, 6 — селективное зер-
кало, 7 — объектив, 8 — иссле-
дуемый объект, 9 — светофильтр,
11 — усилители-дискриминаторы,
12 — блок сопряжения с ЭВМ,
13 — ЭВМ «Искра-226», 14 — мо-
нокулярная насадка [9]
1г=325 нм). Регистрация флуоресценции проводится с по-
мощью фотоэлектронного умножителя (ФЭУ) в режиме
счета фотонов на одноэлектронном уровне с автоматическим
вычитанием окружающего фона и собственных шумов ФЭУ.
Диапазон длин волн — 360 — 800 нм, динамический диа-
пазон измеряемых световых потоков — 10s, погрешность
измерения минимально регистрируемого потока—10 %,
диаметр пучка возбуждающего излучения в области зон-
дирования 1 — 100 мкм.
Микрофлуориметр использовался для количественного
аминокислотного анализа и для определения содержания
ДНК в клетках бактерий. В частности, при сканировании
хроматографических пятен, полученных при разделении
ДНС-производных аминокислот ДНС-Phe, ДНС-Gly и
ДНС-Не на пластинках с полиакридным покрытием, уда-
лось достоверно зарегистрировать количества вещества в
хроматографическом пятне 5-10-14 моль. Это на 1,5 порядка
лучше достигнутых в настоящее время результатов по ко-
личественному детектированию производных аминокислот,
разделенных методом тонкослойной хроматографии, полу-
ченных при возбуждении флуоресценции излучением ксе-
ноновой лампы.
Одной из важнейших задач современной клеточной био-
логии является определение концентрации ионов свобод*
202
ного кальция [Са2*] внутри живых клеток. Эта задача
успешно решается с помощью лазерных микрофлуоримет-
ров с применением флуоресцентных зондов. Для примера
рассмотрим методику измерения [Са2+] в изолированных мы-
шечных клетках 110]. В качестве зонда использовался кра-
ситель индо-1 с максимумом поглощения в комплексе с
Са2+ на 331 нм, максимумом флуоресценции на 398 нм и
квантовой эффективностью флуоресценции 0,56. Флуорес-
ценция возбуждалась излучением Не—Cd лазера (1=
=325 нм) с мощностью зондирующего пучка менее 1 мкВт.
Процедура измерения состоит в определении отношения
интенсивностей флуоресценции на двух длинах волн
=422 и Х2=468 нм: Т?=/(%1)//(%2) и дальнейшего вычисления
по формуле [Са2+]==САгд (Ят1П—Я)/(Я—Ятах)> где Яты и
/?,пач — это значения R при нулевой и насыщающей кон-
центрациях Са2+ соответственно, С=0,972 — константа про-
порциональности, &д=250 нмоль/л — константа диссоциа-
ции. Значения 7?min, 7?1пах и R определялись на калибро-
ванном 6 мкмоль растворе красителя.
Использование такой установки впервые позволило опре-
делять характерные значения [Са2+] в диапазоне 100 —
300 нмоль/л в живых клетках с точностью не хуже
±10 нмоль/л с пространственным разрешением 2 мкм за
время менее 0,5 с.
Одним из направлений практического применения ла-
зерной микроспектрофлуориметрии является идентифика-
ция и изучение свойств пигментов и красителей внутри жи-
вых клеток. Примером таких работ являются эксперименты
по изучению фотоповедения одноклеточных водорослей, в
которых с помощью этого метода были определены органел-
ла, выполняющая роль фоторецептора, и ^молекула фото-
пигмента [П. 7].
Другой пример — регистрация в живых клетках спект-
ров флуоресценции фотосенсибилизирующих красителей
типа гематопорфирина, широкое использование которых в
медицине начинается в связи с разработкой эффективных
методов лазерной диагностики и терапии злокачественных
опухолей. Более подробно этот пример будет рассмотрен
в 7.3. jg 1
Общим для этих работ является использование импульс-
ных перестраиваемых лазеров и проведение кинетических
измерений с высоким временным разрешением.
Инструментальная база современной флуоресцентной
микроскопии кроме лазеров и ФЭУ в режиме счета фотонов
включает видеодетекторы, работающие при очень низких
203
уровнях интенсивности флуоресценции с дискретизацией
видеокадров, их последующим вводом в ЭВМ и цифровой
обработкой. Видеомикрофлуориметры обладают рядом осо-
бенностей, важных для проведения биомедицинских иссле-
дований: быстрой обработкой информации, крайне чувст-
вительным детектированием, цифровым форматированием
и анализом данных, сохранением и накоплением информа-
ции о пространственных соотношениях. Эти особенности
позволяют проводить регистрацию пространственно-вре-
менных распределений флуоресцирующих компонентов в
исследуемом объекте со скоростью и точностью, ранее недо-
стижимой другими методами. Хранение видеоизображе-
ний на магнитных дисках не только обеспечивает 100 % -ную
надежность их повторного использования, но и позволяет
исследователю многократно обращаться к ним с целью ма-
тематической обработки по различным алгоритмам.
Микрофлуоресцентный анализ внутриклеточного тран-
спорта. Цифровое представление изображений флуорес-
цирующего объекта особенно важно при исследовании рас-
пределения молекул на клеточных мембранах, движения
внутриклеточных частиц, компартментализации специфиче-
ских зондов внутри клетки, а также клеточной подвижности.
Например, в настоящее время ведутся работы по изуче-
нию взаимодействия гормонов и факторов роста с мембран-
ными рецепторами клетки и их последующей интернализа-
ции. Одной из целей этой работы является выяснения ме-
ханизмов нарушения регуляции роста в раковых клетках.
Большинство макромолекулярных лигандов связывается
с клеткой в процессе эндоцитоза через посредство рецепто-
ров. Комплексы лиганд — рецептор обволакиваются об-
щей мембраной, образованной из отдельных участков плаз-
матической мембраны клетки. Образовавшиеся закрытые
везикулы транспортируются внутрь клетки по определен-
ным адресам, например к ядру. Этот-то транспорт в живых
клетках и удается визуализировать с помощью флуоресци-
рующих антител, присоединяемых к везикулам. Процедуры
цифрового усреднения изображений позволяют изучать ха-
рактер движения закрытых везикул при таких низких уров-
нях возбуждения, при которых визуально в микроскоп
флуоресцирующие везикулы просто неотличимы от фона.
В качестве другой важной задачи можно назвать изме-
рение трансляционной диффузии в плоскости мембран и в
сравнительно тонких объемных объектах. Эта задача ре-
шается с помощью методов фотообесцвечивания. В основе
этих методов лежит фотообесцвечивание локальных облас-
204
тей исследуемого объекта, несущих флуоресцентные моле-
кулы, с целью нарушения их флуоресценции и последующе-
го измерения кинетики восстановления флуоресценции
вследствие диффузного притока необесцвеченных флуорофо-
ров из окружающей среды в засвеченную лазерным пучком
область. Эта область может иметь вид пятна, полоски или
другую форму.
Кинетика восстановления флуоресценции связана с ко-
эффициентом диффузии или скоростью потока меченых мо-
лекул [11]. Например, в случае восстановления флуорес-
ценции в двухмерном диффузионно ограниченном объекте
коэффициент диффузии прямо пропорционален квадрату
радиуса лазерного пятна в плоскости объекта и обратно
пропорционален времени восстановления флуоресценции
до половины исходного уровня. Конечный уровень, до ко-
торого восстанавливается флуоресценция, связан с подвиж-
ной фракцией меченых молекул.
В настоящее время никакой другой метод не дает срав-
нимой информации о трансляционной подвижности молекул
в определенных областях мембран единичных клеток или
клеточных органоидов. Основными этапами эксперимента
являются:
— регистрация флуоресценции из заранее выделенной
области мембраны, поверхности или тонкой пленки объекта
размером в несколько микрометров;
— импульсное облучение этой области пучком лазера
(как правило, Не—Cd или Аг), быстро разрушающим боль-
шую часть флуорофоров за время 5—50 мкс, вследствие
чего интенсивность флуоресценции из этой области резко
падает;
— измерение кинетики восстановления флуоресценции,
начиная с момента окончания обесцвечивающего импульса,
для чего на исследуемую область направляется маломощный
«измерительный» пучок лазерного излучения (обычно в
10s—105 раз более слабый), возбуждающий флуоресценцию
так же, как и на первом этапе.
При проведении подобных экспериментов регистрация
флуоресценции может осуществляться с помощью ФЭУ.
Однако применение видеосистем может дать возможность
изучения пространственных деталей процесса восстановле-
ния, что позволяет в принципе рассчитывать локальные
значения коэффициентов диффузии или скорости потока в
исследуемой области, например внутри клетки.
Метод измерения кинетики восстановления флуорес-
ценции после фотообесцвечивания используется для иссле-
205
дования процессов агрегирования макромолекул и само»
сборки клеточных органоидов. Например, этим методом
были изучены направление и механизм полимеризации мик-
ротрубочек. В качестве флуорофора использовался флуо-
ресцеин. Измерения позволили исключить гипотезу, в со-
ответствии с которой мономеры тубулина включаются в
микротрубочку в средней части и теряются на концевых
участка х.
Исследовалась кинетика полимеризации глобулярного
актина в водном растворе в присутствии соли КС1 или ди-
валентных катионов Са2+ и Mg2+. В процессе полимериза-
ции образуются длинные (10 — 100 мкм) филаменты F-
актина. Было впервые доказано, что остающаяся неполиме-
ризованной фракция актина в присутствии растущих
филаментов представляет собой мономерную форму
G-актина.
Данная методика позволяет точно проследить влияние
различных реагентов на процесс самосборки. Например,
добавление цитохалазина Б приводит к укорачиванию фила-
ментов, а добавление в раствор алдолазы — белка, связы-
вающегося с актиновыми филаментами,— приводит к уве-
личению слабо подвижной фракции актина. Вероятнее все-
го, это происходит из-за образования алдолазных сшивок
между нитями F-актина.
Наиболее интересными представляются опыты с живыми
амебами. Путем микроинъекций в клетку впрыскивались
меченые флуоресцеином белки: G-актин, бычий сывороточ-
ный альбумин (БСА), овальбумин и рибонуклеаза А. Изме-
ренные значения коэффициентов диффузии этих белковых
молекул в клетке оказались в 2—3 раза ниже, чем в воде.
Более того, оказалось, что молекулы G-актина, хотя их мо-
лекулярный вес на 50 % меньше, чем у молекул БСА, диф-
фундируют медленнее, чем молекулы БСА. Это подтверж-
дает выдвигавшиеся ранее предположения о том, что в клет-
ке G-актин находится в комплексе с другими молекулами
значительного размера типа профилина.
Кроме того, наблюдение кинетики восстановления флуо-
ресценции после обесцвечивания показало, что неподвиж-
ная фракция F-актина составляет в среднем около 10 % от
общего содержания актина в клетке. В разных частях клет-
ки это соотношение разное: в хвостовой части — больше, в
более подвижной головной части — меньше. В области
плазмалеммы содержится до 50—80 % малоподвижных
филаментов. Эти и другие исследования (например, по само-
сборке микротрубочек) показывают, что метод фотообесцве-
206
чивания является очень эффективным не только при изме-
рении подвижности мембран, но и при изучении транспорта
макромолекул в растворах и во внутриклеточном*матриксе.
7.3. Примеры применения лазерной
флуоресцентной диагностики в медицине
Диагностика рака. Накопленный к настоящему времени
опыт лечения онкологических заболеваний дает основание
считать, что ранняя диагностика рака с последующим хи-
рургическим или терапевтическим (возможно, лазерным)
лечением могут существенно повысить вероятность выздо-
ровления. В связи с этим в разных научных центрах, в том
числе и в нашей стране, ведется поиск новых, более эффек-
тивных методов диагностики. Еще до применения лазеров
было установлено, что спектры флуоресценции в видимом
диапазоне, получаемые от нормальных и опухолевых тка-
ней, отличаются. Применение лазерных флуоресцентных
спектрометров с высокой спектральной плотностью мощ-
ности возбуждения позволило повысить скорость и качества
получения спектров и поднять общий уровень исследова-
ний в этом направлении.
На рис. 7.3 показаны спектры флуоресценции, получен-
ные от здоровых и опухолевых почки и предстательной же-
лезы крысы [12, 13]. Видно, что основные максимумы спект-
ров от опухолевых тканей (%=521—522 нм) существенно
сдвинуты в синюю область по сравнению со здоровыми (Х=
=531—533 нм). Да и сама форма спектров достоверно отли-
чается. Подобные отличия спектров флуоресценции, по-
видимому, должны наблюдаться и при исследовании тка-
ней и органов человека. Эти отличия объясняются либо
изменениями среды, окружающей флуорофоры, либо про-
изводством новых флуорсфоров, индуцированным биохими-
ческими изменениями в клетках или в окружающей их сре-
де. В области длин волн Х=520—530 нм флуоресцируют
флавины, причем максимумы спектров флуоресценции мо-
гут несколько смещаться в зависимости от условий среды.
Следовательно, если не говорить о производстве новых
флуорофоров, то можно предположить, что в данном слу-
чае флуоресцируют флавины. Общие пики в спектрах в об-
ласти А=590—640 нм можно приписать порфиринам, со-
держащимся в цитохроме митохондрий. Их флуоресценция
многократно усиливается при удалении ионов Fe и Си.
Схема установки, на которой были получены приведен-
ные выше спектры, изображена на рис. 7.4. Непрерывное
207
208
Рис. 7.3. Спектры флуоресценции от почки (а) и предстательной
железы (б) крысы: 1 — здоровый орган, 2 — опухолевый
Рис. 7.4. Схема лазерного флуориметра: 1 — Аг лазер, 2 — пре-
рыватель, 3 — объект, 4 — фокусирующая система, 5 — монохро-
матор, 6 — ФЭУ, 7 — усилитель, 8 — самописец [121
излучение Аг лазера (Х=488 нм), промодулированное с по-
мощью прерывателя с частотой 200 Гц, фокусировалось на
поверхность исследуемой ткани. Флуоресцентный сигнал с
помощью системы линз направлялся на входную щель
двойного монохроматора, который осуществлял развертку
спектра с разрешением ДХ=1,8 нм в диапазоне А,=500—
800 нм, так что рассеянный свет не попадал на фотоумножи-
тель. Сигнал ФЭУ синхронно с прерывателем усиливался
п регистрировался на самописце. Мощность зондирующего
лазерного излучения составляла 100 мВт, диаметр пятна
в области измерения — 100 мкм. Спектры снимались по
нескольку раз, и при этом наблюдалась их полная воспроиз-
водимость.
Заметим в качестве отступления, что такая же установка
может, быть использована для диагностики кариеса зубов.
Показано, что существуют достоверные различия в спект-
рах флуоресценции и упругого рассеяния в видимой облас-
ти от пораженных кариесом и здоровых участков зуба. Бо-
лее подробную информацию заинтересованный читатель
найдет в 114].
Другой перспективный метод лазерной флуоресцентной
диагностики рака основан на способности злокачествен-
пыхГклеток и тканей накапливать повышенную по сравне-
нию с обычными клетками и тканями концентрацию флуо-
ресцирующих красителей [15, П. 36]. Проведение оптиче-
ского обследования тканей в спектральном диапазоне флуо-
ресценции красителя дает возможность оперативно выяв-
лять места его повышенной концентрации и, следовательно,
локализации опухоли.
Использование лазеров в этой методике является прин-
ципиальным не только с точки зрения необходимости вы-
сокой спектральной плотности мощности излучения, но
также с точки зрения необходимости использования свето-
волоконных трактов для подведения возбуждающего из-
лучения к внутренним органам и отведения оттуда флуорес-
ценции.
Выбор оптимального красителя для флуоресцентной ди-
агностики опухолей проводится в соответствии с рядом тре-
бований. Красителю должны быть свойственны: высокая
селективность накопления в злокачественных клетках и
тканях (по сравнению с нормальными), высокий квантовый
выход флуоресценции, быстрое выведение из организма, от-
сутствие побочных эффектов на ткани и организм в целом.
Не должен быть высоким квантовый выход фотоиндуциро-
ванной генерации синглетного кислорода или каких-либо
14 А. В. Приезжее 209
других цитотоксических агентов в отличие от противопо-
ложного требования к красителям, используемым для фото
динамической терапии опухолей [151.
В настоящее время в лабораториях, разрабатывающих
методику лазерной флуоресцентной диагностики рака, чаще
всего используются в качестве красителей гематопорфирин
(ГП), производные гематопорфирина (ПГП) [П. 36, 16, 17J
и флюренат (динатриевая соль флюоресцеина) [15, 18]. В то
время как первые два красителя используются также и для
фотодинамической терапии, флюренат оказывается более
подходящим именно для диагностики. Так, он обеспечива-
ет контрастность наблюдения опухоли в свете флуоресцен-
ции на фоне нормальных тканей не менее 50 : 1 по сравне-
нию с 5 : 1 у ПГП.
Для возбуждения флуоресценции флюрената больше
всего подходит излучение Не—Cd лазера (Х=441,6 нм), по-
падающее в полосу его поглощения. При наличии у больно-
го, в кровь которого введен флюренат, злокачественной
опухоли, например желудочно-кишечного тракта, эта опу-
холь светится салатовым светом на темно-синем фоне непо-
раженной слизистой. Это свечение с достоверностью 98 %
соответствует месту нахождения опухоли. Некротическая
ткань дает несветящиеся участки. Такие участки часто на-
блюдаются на крупных опухолях, которые в целом светятся
слабее.
В ряде случаев площадь свечения при лазерном возбуж-
дении значительно превышает область опухоли, видимую
при обычном освещении. Это означает высокую инфильтра-
цию злокачественной ткани в стенку органа. Такое наблю-
дение позволяет правильно спланировать операцию.
Метастазы светятся так же, как и опухоли. Применение
флуоресцентной диагностики существенно увеличивает про-
цент их выявления. В некоторых случаях только благодаря
флуоресценции обнаруживается внутриорганное метаста-
зирование в виде просовидных высыпаний вдали от опухоли.
Интересно отметить имевшиеся в практике случаи [15],
когда у больных с диагнозами рака, например, толстой
кишки, поставленными пальпаторно и рентгенологически,
не наблюдалось флуоресцентного свечения. Даже во время
операции диагноз рака не вызывал сомнения. Однако по-
следующее гистологическое исследование этот диагноз не
подтвердило: за опухоль были приняты воспалительные
инфильтраты. Эго показывает высокую надежность лазер-
ной флуоресцентной диагностики.
В настоящее время продолжаются работы по клиниче-
210
скому испытанию этого метода и по исследованию механиз-
мов избирательного накопления красителей в раковых
клетках [17, 19], а также по изучению механизмов фотоди-
намического повреждения биомолекул, клеток и биострук-
тур тканей [20, 21]. Важным этапом этих работ является
изучение стационарных и разрешенных во времени спектров
флуоресценции красителей в растворах и в живых клет-
ках, которое проводится с помощью лазерных пикосекунд-
ных спектрометров и микроспектрофлуориметров.
В работах [22, 23] регистрировались флуоресцентные
спектры ГП, диацетата ГП (ДГП) и дигематопорфиринэфи-
ра (фотофрина 2) в водных растворах (рН=4,0—11,0), в
Рис. 7.5. Схема пикосекундного флуоресцентного микроскопа:
1 — фокусирующий объектив, 2 — объект, 3 — монохроматор,
4 — ФЭУ, 5 — счетчик фотонов, 6 — микро-ЭВМ [22]
фосфатном буферном растворе (pH=7,4) и в растворе ди-
метилформамида в модельных системах: искусственных ли-
пидных пузырьках — липосомах и тенях эритроцитов, а
также в культивируемых клетках почки свиньи и фибро-
бластов человека.
Схема установки, на которой были получены эти спект-
ры, изображена на рис. 7.5. Флуоресценция возбуждалась
одиночными импульсами либо второй гармоники АИГ : Nd
лазера, либо импульсами лазера на красителе длитель-
ностью 70±10 пс. Короткофокусный объектив фокусировал
возбуждающий лазерный луч на объект и собирал флуорес-
ценцию. Диаметр пучка в области зондирования был мень-
ше 1 мкм. Флуоресцентное излучение направлялось сквозь
54* 211
прозрачное в диапазоне 600—700 нм дихроичное зеркало
на монохроматор и далее на ФЭУ, работающий в режиме
счета фогонов. Вся система функционировала под управле-
нием микро-ЭВМ.
В клетках главный максимум флуоресцентного спектра
приходится на 635 нм. Стационарные спектры имеют мак-
симумы на 612 нм для водных растворов и на 625 нм — для
Рис. 7.6. Распределение интенсивности флуоресценции по раковой
клетке человека, сенсибилизированной ПГП [25]
органического растворителя. Это говорит о том, что харак-
тер флуоресценции молекул красителя существенно зави-
сит от их непосредственного окружения (молекул воды,
растворителя, липидов и др.).
Кинетические измерения показали, что характер за-
тухания флуоресценции зависит от того, находятся молеку-
лы красителя в форме мономеров или имеет место их агре-
гация и комплексообразование с другими, например внут-
риклеточными, структурами. Так, кинетика затухания
флуоресценции от раствора мономеров ГП в воде в области
максимума с хорошей точностью моделируется одной экс-
понентой с временем т=15—16 нс. Появление в растворе
агрегатов (олигомеров) красителя влечет за собой появле-
ние еще одной «быстрой» экспоненты с т=0,5 нс. Быстрая
кинетика появляется также в полосе главного максимума
спектров флуоресценции молекул красителя в клетках, что
указывает на то, что эти молекулы образуют комплексы с
внутриклеточными структурами, скорее всего с мембранами.
212
При повышении дозы светового воздействия в растворах
красителей возникают устойчивые фотопродукты, дающие
в кинетических и стационарных спектрах флуоресценции
боковые полосы с пикосекундным затуханием (для ГП
7тах=644 нм, т=100 пс) [24]. На рис. 7.6 приведен пример
измерения распределения интенсивности флуоресценции
по раковой клетке человека после 1-часового содержания
ее в растворе ПГП [25]. Концентрация красителя составля-
ла 50 мкг/см3, плотность мощности излучения аргонового
лазера на поверхности клетки — около 0,4 мВт/см2. Отно-
шение сигнал/шум составляло несколько десятков в облас-
ти максимальной флуоресценции. Измерения проводились
на лазерном флуоресцентном микроскопе, оборудованном
высокочувствительной системой регистрации, цифровой об-
работки и представления изображений.
Видно, что интенсивность флуоресценции меньше в
центральной части, чем в периферийных областях. Этот ре-
зультат означает, что ПГП накапливается главным образом
в области внешней мембраны культивируемых раковых
клеток, что соответствует результатам других авторов
[26]. Учитывая этот факт, а также представления о комп-
лексообразовании молекул красителей с мембранами, мож-
но предположить, что разрушение раковых клеток при фото-
динамической терапии опухолей развивается в основном
в мембранах клеток.
На приведенном рисунке размеры минимального эле-
мента изображения соответствуют области в 0,25 мкм на
исследуемом объекте, что находится на грани пространствен-
ного разрешения оптической системы. Время получения
флуоресцентного изображения составляет 1 с в отличие от
нескольких десятков секунд, необходимых при использо-
вании обычной техники, дающей к тому же недостаточное
пространственное разрешение.
Увеличивающееся с каждым годом число работ в облас-
ти развития и испытания методик лазерной флуоресцентной
диагностики злокачественных образований позволяет на-
деяться на то, что в недалеком будущем эти методики вместе
с лазерной фотодинамической терапией рака займут проч-
ное место в клиниках.
Диагностика ишемии сердечной мышцы. Многие флуо-
риметрические исследования живых клеток основаны на
регистрации отношения концентраций восстановленной и
окисленной форм пиридин-нуклеотидов [НАДН]/[НАД+],
являющихся коферментами многих внутриклеточных реак-
ций. Это отношение несет важную информацию о состоянии
213
клеток и состоящих из них тканей и органов. Возможность
ее флуоресцентной регистрации определяется свойствами
НАДН поглощать свет на длине волны %j=340 нм и высве-
чивать флуоресценцию с максимумом на длине волны А2==
=480 нм. НАД+ на длине волны не поглощает, а его флуо-
ресценция в области Л2 существенно слабее.
Одним из интересных примеров применения этого под-
хода является регистрация ишемии сердечной мышцы в
нормальных физиологических условиях [13]. Характерной
особенностью работы с перфузируемыми кровью органами
Рис. 7.7. Схема лазерного волоконного флуориметра [13]
является сильное возмущение, вносимое в сигнал флуорес-
ценции тканевой циркуляцией крови. Компенсировать это
возмущение оказалось возможным путем одновременной
регистрации интенсивности флуоресценции на длине волны
X, и интенсивности отраженного тканью излучения в макси-
муме'полосы поглощения гемоглобина (Xs=805 нм).
i,Ha рис. 7.7 изображена схема лазерного волоконного
флуориметра, созданного для подобных измерений. Устрой-
ство включает в себя два лазера: азотный (/) и на красителе
(2), как источники УФ и ИК излучения, два фотодиода (3),
регистрирующих отношение выходных мощностей лазеров,
два ФЭУ (4), измеряющих интенсивность флуоресценции,
индуцированной УФ излучением, и интенсивность отражен-
ного ИК излучения. Эта схема, естественно, снабжена
электронным блоком и микро-ЭВМ. Параметры азотного
лазера: частота повторения импульсов 140 Гц, энергия в
импульсе 150 мкДж, пиковая мощность 30 кВт, средняя
мощность при частоте повторения импульсов 100 Гц —
214
15 мВт. Длительность импульса лазера на красителе при
той же частоте повторения — 6 нс.
В качестве иллюстрации результата применения описан-
ного прибора для регистрации ишемии сердечной мышцы
на рис. 7.8 приведена временная зависимость интенсивности
отраженного света (/) и флуоресценции (2) во время при-
ступа ишемии (остановки перфузии) изолированной перфу-
зируемой модели сердца крысы. Уменьшение отражения
। 1 ।____।_____I_____।____I__
40 80 120 t,c
Рис. 7.8. Кинетика изменения отражения (?) и флуоресценции (2)
во время приступа ишемии, вызванной остановкой перфузии сердца
крысы_(момент 4) и возобновленной через 50 с (момент t2) [13J
происходит за счет уменьшения концентрации внутритка-
невых красных кровяных телец, в то время как увеличение
интенсивности флуоресценции происходит за счет увеличе-
ния внутриклеточного отношения [НАДН]/[НАД+].
Лазерный волоконный флуориметр может с успехом
применяться при операциях на сердце для изучения метабо-
лизма сердечной мышцы через световодный катетер. Более
того, очевидно, что любой орган, доступный для фиброскопа
или катетера, может быть объектом изучения с помощью
такого флуориметра. Заметим, что нелазерный флуориметр,
построенный ранее на базе ртутной лампы, монохроматора,
фильтров и УФ микроскопа, не позволял получать досто-
верные результаты главным образом из-за недостатка чув-
ствительности.
Диагностика атеросклероза. Еще одним перспективным
применением флуоресцентной диагностики в медицине ста-
новится диагностика атеросклеротических бляшек и, в част-
ности, фиброзных бляшек, являющихся первой стадией
атеросклеротического поражения сосудов.
215
500 ООО 700
Рис. 7.9. Спектры флуоресцен-
ции от нормальной (/) и пора-
женной атеросклерозом (2) ар-
терий [26]
Как показано в работе [26], наличие в сосуде атероскле-
ротической бляшки может быть определено путем сравне-
ния интенсивности флуоресценции на длинах волн 580 и
600 нм при возбуждении на длине волны 480 нм. На рис. 7.9
представлены характерные
спектры флуоресценции, по-
лученные от нормальной и
пораженной атероскл ерозом
артерий. Видно, что они силь-,
по отличаются.
Используя тот факт, что
высота пика на 600 нм относи-
тельно минимума, приходяще-
гося на 580 нм, намного боль-
ше в случае здоровых артерий
по сравнению с пораженными,
можно составить отношение
контраста /(600)//(580). Значе-
ние этого отношения, получен-
ное в экспериментах, под-
твержденных соответствующим гистологическим анализом,
равно примерно 2 для нормальных артерий и примерно 1 для
атеросклеротических.
Многочисленные эксперименты показывают, что можно
достоверно различать нормальную артерию и артерию,
имеющую бляшку толщиной 0,5 мм и более. И хотя к настоя-
щему времени результаты получены юлько на трупных ар-
териях, можно рассчитывать, что прямая лазерная диагно-
стика атеросклероза in vivo через световодный катетер скоро
станет возможной. При этом в случае положительного диаг-
ноза можно будет по тому же катетеру передавать большие
дозы лазерного излучения в область поражения сосуда ате-
росклерозом с целью разрушения бляшек.
7.4. Дистанционная флуоресцентная диагностика
растений
Общие сведения. Лазерные флуоресцентные методы за-
нимают все большее место в дистанционной диагностике
растений [П. 17]. Они позволяют проводить исследования
на популяционном, клеточном и организменном уровнях
на суше и в воде с борта самолета, вертолета или судна и
получать оперативную оценку функционального состояния
объектов, осуществлять их количественное определение и
идентификацию. Изменение физических условий окружаю-
216
щей среды (состава минерального питания, количества вла-
ги и пр.), загрязнение среды промышленными отходами
сказываются на процессах дыхания и фотосинтеза растений,
чго отражается в изменении их спектров флуоресценции,
которые могут быть получены дистанционно.
Дистанционное зондирование наземной растительности.
Одной из наиболее важных прикладных задач дистанцион-
ной флуоресцентной диагностики растений является прогно-
зирование их физиологического состояния в зависимости от
внешних условий. Так, эксперименты с зерновыми культу-
рами, например с кукурузой, показали [27], что спектры
флуоресценции, возбуждаемой УФ азотным лазером (Х=
==337 нм), имеют три характерных максимума: на 440, 690
и 740 нм. При этом недостаток калия приводит к увеличе-
нию более чем втрое интенсивности флуоресценции на 690
п 740 нм при некотором ее ослаблении на 440 нм. В случае
дефицита азота и железа имеет место слабое уменьшение
интенсивности флуоресценции на 440 нм и ее ослабление
/ уртн. ед, /фртн. ев,-
600 - - 2-~0 "
Рис. 7.10. Спектры флуо- Рис. 7.11. Спектры флуо-
ресценции растений при до- ресценции растений в нор-
статке (/) и недостатке (2) ме (/) и при обработке гер-
влаги в почве [28] бицидом (2) [28]
более чем в три раза на 690 и 740 нм. Недостаток фосфора
ослабляет флуоресценцию на 690 и 740 нм в два раза, в то
время как недостаток кальция, серы и магния не приводит
к существенным изменениям в спектре флуоресценции.
Достоверные изменения в интенсивности флуоресцен-
ции растений показаны также при изменении влагосодер-
жания почвы (рис. 7.10) и в результате действия гербицидов
(рис. 7.11) [28].
Другой задачей является количественное определение
биомассы растительности. При использовании летательных
аппаратов оно проводится обычно путем измерения отноше-
ния интенсивности флуоресценции хлорофилла на двух
217
главных максимумах (для листьев озимой пшеницы, напри,
мер, это 685 и 735 нм при возбуждении на 441,6 нм). Это де.
лает результаты измерений не зависящими от эффектов,
связанных с колебаниями мощности лазера и изменениями
геометрической структуры растительности.
На рис. 7.12 представлена зависимость этого отноше-
ния от суммарной концентрации хлорофилла-а (Хл-а) и
хлорофилла-^ (Хл-&) в озимой пшенице, выращиваемой^на
7ф (685 нм)
/ф (735 нм)
О
40 - °
о
о О о
35 -
° о
о
о О
25_______l_i________।________।________
2 3 А 5
[Хл],мг/(г сухого беса)
Рис. 7.12. Зависимость отношения интенсивностей’флуоресценции,.
измеренных с борта самолета на двух длинах волн, от суммарного
содержания хлорофилла в озимой пшенице ДП. 17]
16‘опытных участках. Параллельно с дистанционными из-
мерениями проводились лабораторные измерения концент-
рации по методу Годнева [П. 17].
Предварительные исследования показали принципиаль-
ную возможность решения еще одной важной задачи, а
именно — идентификации типов растений по спектрам
флуоресценции. Так, при возбуждении флуоресценции
азотным лазером (1=337 нм) в спектрах пяти групп расте-
ний: травянистых однодольных, травянистых двудольных,
древесных хвойных, древесных лиственных и водорослей
наблюдались 4 характерных максимума: 440, 525, 685 и
740 нм (хотя не все они присутствуют у всех растений).
При этом все без исключения растения демонстрируют флуо-
ресценцию на длине волны 440 нм. Только древесные расте-
ния имеют характерный максимум на 525 нм. Хвойные от-
личаются отсутствием максимума на 685 нм. Все растения
имеют)максимум на 740 нм. Водоросли имеют ярко выра-
женный максимум на 440 и 740 нм. Максимум на 440 нм у
218
травянистых однодольных значительно больше, чем у дву-
дольных.
Дальнейшая отработка методик идентификации растений
по спектрам их флуоресценции предполагает изучение ва-
риабельности спектральных флуоресцентных характеристик
растений в зависимости от экологических условий роста,
различия в возрасте, виде и т. п.
Дистанционное зондирование фотосинтезирующих ор-
ганизмов в естественных водоемах. Одним из основных ин-
дикаторов биологической продуктивности водоемов, с одной
стороны, и их загрязненности — с другой, является фито-
планктон (ФП) — семейство фотосинтезирующих водорос-
лей, характеризующихся сложной сезонной, географической
п климатологической динамикой. Оптические свойства ФП
в основном определяются содержащимися в клетках пиг-
ментами: хлорофиллом, каротиноидами, флавинами и др.
Спектры поглощения и флуоресценции этих пигментов хо-
рошо изучены для экстрагированных форм. Для каждого
индивидуального пигмента характерны четкие, хорошо вы-
раженные полосы. Однако в спектрах клеток вклад различ-
ных пигментов выделить трудно. Фотосинтетическая актив-
ность всех клеток водорослей невозможна без наличия в
них Хл-а. Поэтому так же, как и при зондировании наземной
растительности, этот пигмент обычно выбирают за индика-
тор биомассы ФП.
Существуют методики пассивного дистанционного опре-
деления концентрации Хл по яркости диффузно отраженно-
го толщей воды солнечного света. Однако они недостаточно
эффективны, так как очень чувствительны к погодным ус-
ловиям и к состоянию поверхности.
В этой связи все большее внимание привлекает флуорес-
центный метод индикации Хл [29—33]. Он основан на том,
что при лазерном возбуждении в зависимости от сочетания
пигментов различные представители ФП характеризуются
различными спектрами флуоресценции. В несколько упро-
щенном виде спектр излучения в зависимости от типа ФП
может быть представлен либо одной полосой (при 685 нм
или 560—580 нм), либо двумя (при 685 нм и 560—580 нм).
Составляя отношение интенсивностей тех или иных компо-
нентов спектров и используя при этом разное возбуждение,
можно получать различную диагностическую информацию.
Количественное определение ФП с помощью лазерного-
зондирования сталкивается с определенными трудностями.
Действительно, лазерное излучение при взаимодействии с
водной средой сильно рассеивается. Кроме флуоресценции
219
в эхо-сигнале существенно присутствуют излучение, упру-
го рассеянное на гидрозоле, и излучение, неупруго рассеян-
ное на молекулах воды. Это обстоятельство осложняет зада-
чу оценки сигнала от флуоресцирующего ФП. На рис. 7.13
представлена в качестве примера типичная спектрограмма,
получаемая на ходу судном с помощью лидара, в состав ко-
торого входил АИГ : Nd лазер (1в=532 нм) и оптический
многоканальный анализатор [34]. Расстояние от лидара до
/ф,отн.ед.
Рис. 7.13. Спектрограмма сум-
марного эхо-сигнала, регистриру-
емого на ходу судном с помощью
лидара [341
поверхности океана равнялось 15 м. Концентрация Хл в
районе эксперимента составляла около 2 мкг/л. Пик с мак-
симумом на 651 нм соответствует стоксову компоненту не-
упругого рассеяния воды, полосы на 580 и 685 нм — флуо-
ресценции фикоэритрина и Хл-л.
Ситуация существенно упрощается, если стоксов компо-
нент неупруго рассеянного излучения использовать как
нормализующий фактор, т. е. как своеобразный внутрен-
ний репер [34]. Компоненты сигнала, обусловленные рас-
сеянием на гидрозоле и флуоресценцией ФП, после нормали-
зации уже не зависят ни от мощности зондирующего излу-
чения, ни от высоты лидара над поверхностью воды, ни от
ряда других параметров.
Исследования, проведенные на разных объектах, позво-
лили выделить параметры флуоресценции, пропорциональ-
ные концентрации Хл-л даже при насыщении флуоресцен-
ции, которое наблюдается при работе с мощными импульс-
ными лидарами [35]. Ошибка определения концентрации ФП
при этом еще достаточно велика — порядка 10—15 %. По-
вышения точности, возможно, удастся добиться путем при-
менения перестраиваемых лазеров и проведения измерений
на разных длинах волн. Необходим также более точный
учет контура эмиссионной полосы растворенных органиче-
ских веществ. Требуют проработки многие методические
вопросы. Однако высокая эффективность и перспективность
использования лазерного флуоресцентного анализа для дис-
танционной диагностики ФП уже не вызывает сомнения.
ЗАКЛЮЧЕНИЕ
При написании данной книги авторы ставили перед со-
бой задачу познакомить широкого читателя с новой бурно
развивающейся и увлекательной областью исследований,
заключающейся в разработке методов лазерной диагностики
применительно к задачам, решаемым в биологии и медици-
не. В книге представлены самые разнообразные методы
диагностики. Некоторые из этих методов уже хорошо себя
зарекомендовали при использовании в клиниках и лабора-
ториях, налажен промышленный выпуск соответствующей
диагностической аппаратуры. Другие методы находятся в
стадии разработки и с их помощью получены лишь самые
первые результаты.
На сегодняшний день ситуация такова, что практически
каждый новый метод или методика лазерной макро- или
микродиагностики апробируются на исследовании био-
объектов, и нет возможности даже перечислить все эти мето-
ды. Поэтому ряд методов и конкретных примеров их при-
менения в биологии и медицине остался вне поля зрения
авторов. Однако нельзя не сказать хотя бы в заключении
о целом большом классе лазерных методов диагностики, ко-
торый вообще не затрагивался в книге,— это методы раз-
рушающей диагностики.
Из-за сложности биообъектов с помощью неразрушаю-
щих методов микродиагностики зачастую удается получить
лишь качественную информацию о составе вещества, нали-
чии примесей и пр. В связи с этим интенсивно развиваются
методы лазерной аналитической спектроскопии, основан-
ные на эффектах лазерного фотовозбуждения и фотоиони-
зации предварительно подготовленных проб биообъектов
путем локального испарения или распыления лазерным,
электронным или ионным пучками, их атомизации в пламе-
ни, термической атомизации в вакууме или инертном газе.
Эти методы обладают высокой чувствительностью и позво-
221
ляют получить количественную информацию о содержании
различных, например токсических, примесей в биообъек-
тах [П. 40, П. 42, П. 47, 1].
Условно лазерные методы разрушающей диагностики
можно разделить на две группы.
К первой группе относятся методы лазерно-ионизацион-
ной спектроскопии, в которых, как правило, не требуется
обеспечение локальности диагностики. В этих методах био-
объект предварительно тем или иным способом атомизи-
руется или обеспечивается десорбция молекул с его поверх-
ности. После подготовки образца, применяя различные мето-
ды однофотонной или многофотонной ионизации лазерным
излучением, получают поток ионов (Л4+, е~, (М+С)+)
(рис. 5.1), который анализируют путем измерения электро-
проводности плазмы, или регистрации вторичных электро-
нов, или использования пропорциональных счетчиков
ионов, или спектрометрии подвижности ионов, или масс-
спектрометрии образовавшихся ионов.
Ко второй группе относятся методы лазерного микро-
спектрального анализа, которые, как правило, обеспечи-
вают высокое пространственное разрешение анализа за счет
локального испарения чрезвычайно малых объемов био-
объекта (микропроб) сфокусированным лазерным пучком.
Далее используют традиционные методы анализа испарен-
ного вещества: эмиссионную спектроскопию (при дополни-
тельном возбуждении плазмы в дуговом разряде), абсорб-
ционно-трансмиссионную спектроскопию или флуорес-
центную спектроскопию, а также масс-спектрометрию.
Современные задачи диагностики (токсикология, загряз-
нение окружающей среды) требуют развития методов,
позволяющих контролировать содержание примесей в
веществев пределах 10"8—10-и %. Такая чувствительность
реализуется в схемах ступенчатой лазерной фотоионизации
при атомизации за счет нагрева вещества в тиглях (до
3000 °C) в атмосфере инертных газов или в вакууме, нагре-
ва, испарения и распыления вещества мощными лазерными,
электронными или ионными пучками [П. 42, 1].
Термическая атомизация в вакууме является наиболее
универсальным и достаточно простым методом, позволяю-
щим обеспечить чувствительность, близкую к предельной.
Он применим для широкого класса веществ, в том числе и
биологического происхождения. Для его реализации доста-
точно иметь вакуум в рабочей камере на уровне 10"* Торр.
Для осуществления многофотонной ступенчатой иониза-
ции атомно-молекулярных пучков в наибольшей степени
222
подходят лазеры на красителях с накачкой от эксимерных
лазеров, которые излучают в диапазоне 217—970 нм. В эту
область длин волн попадают атомные переходы большинства
элементов периодической таблицы (80 %). Более простые
системыТмогут использовать в качестве накачки азотный
или медный лазеры.
Фотоионизационный метод наиболее интересен для ис-
следования биологических объектов, поскольку дает воз-
можность анализировать следовые концентрации примесей
определенного элемента без предварительного разделения
пробы. Известными примерами такой диагностики являются
анализ следов А1 в крови и в морской воде, а также следов
Ru в'морской воде, в породах ;дна океана и костях рыб
[П. 42, 1]. При использовании двух- и трехступенчатой
схем возбуждения ридберговских состояний пределы обна-
ружения составили (1—2) 40-7 ат. % А1 и 3 -К)-18 ат. % Ru.
Значительное место среди разрушающих методов диаг-
ностики занимает лазерная масс-спектрометрия [П. 42,
П. 47]. Использование лазерной фотоионизации обеспечи-
вает повышенную селективность анализа, высокий выход
ионов (до 100 %) и возможность исследования коротко-
живущих продуктов. Масс-спектр представляет собой рас-
пределение массовых пиков по интенсивности и является
характеристикой исследуемого биообъекта. В лазерной
масс-спектрометрии наиболее широкое применение нашли
времяпролетные системы с селекцией ионов в секторных
электрических или магнитных полях, статические системы с
двойной фокусировкой и динамические масс-спектрометры
типа «масс-рефлектон».
Лазерная масс-спектрометрия используется для детек-
тирования атомарных и молекулярных кластеров, примес-
ных молекул и радикалов в газах, с ее помощью исследуют-
ся различные соединения, важные для биологии, медицины,
фармакологии. Например, близкая к 100 % эффективность
двухступенчатой фотоионизации молекул нафталина излу-
чением KrF лазера (Х=248 нм) позволяет детектировать
одиночные молекулы в объеме облучения за один лазерный
импульс. В результате чувствительность анализа соответ-
ствует регистрации молекул нафталина при их парциаль-
ном давлении на уровне 10-14Торр или относительной кон-
центрации в воздухе 10-8 [П. 42].
Достоинства лазерной мэсс-спектрометрии’проявляются
при изучении труднолетучих и неустойчивых к нагреванию
органических и биоорганических молекул, которые трудно
перевести в газовую фазу. Масс-спектры молекулярных
223
кристаллов аденина, антрацена, гуанина, тимина, урацила,
цитозина и трипептида представлены в [П. 42]. Там же даны
результаты обширных исследований по масс-спектрометрии,
выполненных для различных классов органических биоло-
гически активных нелетучих соединений: олигосахаридов,
гликозидов, нуклеотидов, аминокислот и олигопептидов
и др. Для уверенной записи масс-спектра достаточно, на-
пример, образца сахарозы массой 5 нг.
Эмиссионный спектр излучения плазмы исследуется
разными способами в зависимости от решаемых задач. На-
пример, выпускаемый промышленностью ГДР прибор
LMA-10 использует дифракционный спектрограф с фотогра-
фической регистрацией спектра [2J. Этот прибор обеспечи-
вает минимальные размеры проб 10x10 мкм при аналити-
ческой чувствительности 10-11—10-13 г. В качестве лазер-
ного источника применяется рубиновый лазер с модуляцией
добротности.
Совмещение лазерного испарения вещества с последую-
щим абсорбционно-трансмиссионным анализом этих паров
позволяет сочетать достоинства обоих методов, т. е. полу-
чать высокую степень локальности и значительную чувстви-
тельность. Такой спектрометр был использован при иссле-
дованиях распределения содержания Cd в корковом веще-
стве почки человека [П. 40, 3]. При измерениях диаметр
лазерного кратера в образце толщиной 4 мкм составлял
50 мкм, чувствительность детектирования достаточная при
анализе меньше 0,1 пг вещества, погрешности измерений
содержания Cd порядка 6—30 ppm.
Получил развитие метод лазерной микроаналитической
масс-спектрометрии, или ЛАММА-метод, обеспечивающий
разрешение на микронном или субмикронном уровнях
[П. 42, П. 47]. Этот метод и соответствующая аппаратура
разрабатывались специально для элементного анализа в
биообъектах. ЛАММА-метод позволяет исследовать содер-
жание любого элемента периодической таблицы в биологи-
ческих веществах. Он не требует эталонов и позволяет про-
водить одновременный анализ многих элементов. Объекты
исследования самые разнообразные: лекарственные препа-
раты, сухая цельная кровь и ее компоненты (сыворотка,
плазма, эритроциты), сетчатка глаза, ткани печени, ткани
мышц и другие ткани органов животных, почечные камни,
кормовые дрожжи, ткани растений (листья, корни, ветви
и пр.) и др. [П. 42, П. 47, 4—8].
Пространственное разрешение метода достигает 1—
0,5 мкм, абсолютный предел обнаружения многих элементов
224
10-1’ г, а концентрационный предел обнаружения 10-4—
10-8%. Расход количества вещества при анализе составля-
ет всего 1 пг и даже меньше. Метод позволяет проводить
анализ на клеточном и субклеточном уровнях разрешения,
на единичных бактериях и частичках пыли.
Кроме элементного анализа ЛАММА-меюд оказался
полезным при изучении масс-спектров многих классов орга-
нических и биоорганических соединений: углеводов (олиго-
сахаридов, гликозидов и др.), органических кислот (аскор-
биновой, барбиталовой и др.), аминокислот и микропепти-
дов (глицина, эланина, валина, лейцина, изолейцина, тиро-
зина и фенилаланина), органических солей, ароматических
соединений (антрацена, фенантрена, дибензотиофена, ди-
бензофурана, карбазола, трифенила фосфора), металлоорга-
нических комплексов, соединений с большим молекуляр-
ным весом (кобаламинов, гликозидадигитонина и синтети-
ческого липида при добавлении в образец хлоридов натрия,
калия и цезия) [П. 42].
ЛАММА-метод реализован в разнообразных промышлен-
ных лазерных масс-спектрометрах чипа LAMMA-1000
(ФРГ), LIMA (Англия), ЭМАЛ, ЭМАЛ-2 (СССР) [П. 42,
П. 47].
Итак, как неразрушающие, так и разрушающие методы
лазерной диагностики являются эффективным средством
изучения биологических систем различной степени органи-
зации — от биомолекул до клеток, биотканей и отдельных
органов животных и человека. В настоящее время еще труд-
но оценить все перспективы, открывающиеся перед биомеди-
цинской диагностикой в связи с широким проникновением
лазеров в эту область исследований. Однако нет сомнения
в том, что впереди самые удивительные и неожиданные от-
крытия, приближающие внедрение методов и средств ла-
зерной диагностики в практическую медицину и биологию.
15 д. в. Приезжее
СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ
К предисловию
1. Лазерная пикосекундная спектроскопия и фотохимия биомоле-
кул/Под ред. В. С. Летохова.—М.: Наука, 1987.
2. Лазеры и фотосинтез/Под ред. М. Г. Гольдфэльда // Итоги
наукидИ техники. Биофизика. Т. 19.— М.: ВИНИТИ, 1986.
3. Молекулярные механизмы трансформации энергии в первич-
ных процессах фотосинтеза/А. Б. Рубин, А. А. Кононенко,
В. 3. Пащенко и др.; Под ред. М. Г. Гольдфэльца // Итоги пауки
и техники. Биофизика. Т. 20.—М.: ВИНИТИ, 1987.
4. Biological Events Probed by Ultrafast Laser Spectroscopy/
Ed. R. R. Alfano.— N.Y.: Academic, 1982.
5. Исследование структуры, физических свойств и энергетики
биологически активных молекул // Под ред. С. А. Ахманова,1
А. С. Пискарскаса.— Вильнюс: Мокслас, 1986. 1
6. Лазеры и наследственность растений/В. Г. Володин, В. А, Мэс-
товников, Б. И. Авраменко и'др.— Минск.: Наука и техника,
1984; Крюк А. С., Мостовников В. А., Хохлов И. В.,\Сердю-
ков Н. С. Терапевтическая эффективность низкоинтенсивного
лазерного "излучения.— Минск: Наука и техника, 1986.
7. Посудин Ю. И. Лазерная микрофлуориметрия биологических
объектов.— Киев: Вица школа, 1985.
8. Кэри П. Применение спектроскопии КР и РКР в биохи-
мии.— М.: Мир, 1985.
9. Laser Scattering Spectroscopy of Biological Objects // Studies
in Phys, and Theor. Chem. V. 45/Eds J. Stepanek, P. Auzen-
bacher, B. Sedlacek.— Amsterdam: JElsevier, 1937.
10. Spectroscopy and the Dynamics of Molecular Biological ^Systems
/Eds P. M. Bayley, R. E. Dale.— L.: Acad. Press, 1985.
11. Biomedical Applications of Laser Light Scattering/Eds D.5B. Sat-
telle, W. I. Lee, B. R. Ware.—Amsterdam: Elsevier, ^1982.
12. Молекулярные механизмы биологического действия ^оптичес-
кого излучения/Под ред. А. Б. Рубина.— М : Наука, : 1988.
13. Материалы I Всесоюз. школы «Применение лаззрэз ^в биоло-
гии» Ц Квант, электроника.—1978. Т. 5. С. 2196—2281. 4
14. Материалы II Всесоюз. школы «Применение лазероз в биоло-
гии» Ц Квант, электроника.—1981. Т. 8. С. 2569—2683. й
15. Материалы Всесоюз. совещ. «Применение лазероз в биологии».—
М., 1983. 1
16. Тез. докл. IV Всесоюз. школы «Применение лазеров в ^биоло-
гии».— Кишинев, 1986.
226
17. Лазерное дистанционное зондирование растительности/К. Я* Кон-
дратьев, В. А. Каневский, Ю. К. Росс и др.— Л.: Изд-во Гл.
астроном, обсерв. АН СССР, 1987.
18. Современные методы биофизических исследований. Практи-
кум по биофизике: Учеб. пособие/А. А. Булычев, В. Н. Верхоту-
ров, Б. А. Гуляев и др.; Под ред. А. Б. Рубина.— М.: Высшая
школа, 1988.
19. Sliney D.t Wolbarsht М. Safety with Laser and other Optical
Sources.— N.Y.: Plenum, 1980; Sliney D.//Photonics Spectra.—
1986. V. 20, № 4. P.83.
20. Optics in Biomedical Sciences.— Berlin: Springer-Verlag, 1982.
21. Лазеры в клинической медицине///. Д. Девятков, В. П. Беляев,
Н. Ф, Гамалея и др.—М.: Медицина, 1981.
22. Лазеры в офтальмологии/П. И. Сапрыкин, Л. П. Шубочкин,
Е. С. Сумарокова и др.— Саратов: Изд-во Сарат. ун-та, 1982.
23. Тучин В. В., Миронычев А. П. // Зарубеж. радиоэлектроника.
1986. №9. С. 51.
24. Hochstrasser Д. М., Johnson С. К. // Laser Focus/Electr. Opt.—
1985. V. 21. Р. 100.
25. Кошелев В. Н. Лазертерапия гастродуоденальных язв.— Са-
ратов: Изд-во Сарат. ун-та, 1986.
26. Special Issue on Lasers in Biology and Medicine Ц IEEE J. Qu-
antum Electr.— 1984. V. 20. P. 1342—1532; 1987. V. 23. P. 1701 —
1855.
27. Электроника и медицина // Электронная промышленность.—
1984. № 10. С. 5—65.
28. Электроника и медицина // Там же.— 1987. № 1. С. 3—30,
46-52, 56—58.
29. Berns М. W. // Laser Focus.— 1983. V. 19. Р. 66—71.
30. Медицинская техника.—1986. № 4.
31. Прохончуков А. А., Жигина Н. А. Лазеры в стоматологии.—
М.: Медицина, 1986.
З9.. Тучин В. В., Шубочкин Л. П. Применение лазеров в офтальмо-
логии. Ч. 1. Взаимодействие оптического излучения с тканями
глаза. 1984; Ч. 2. Лазерные офтальмологические установки.—
М.: ЦНИИ «Электроника», 1985.
33. Letokhov V. S. // Nature.— 1985. V. 316. Р. 325.
34. Greguss Р. // Opt. and Laser Technol. —1985. V. 17. P. 151.
35. Кириллов А. И., Морское В. Ф., Устинов Н. Д. Дозиметрия
лазерного излучения.— М.: Радио и связь, 1983.
36. Камалов В. Ф., Степанова Н. В., Черняева Е. Б., Чикишев А. Ю.
// Квант, электроника.— 1985. Т. 12. С. 1997.
37. Применение лазеров в медицине/М. Т. Александров, А. С. Фе-
доров, Р. И. Ваграмов и др.— М.: ЦНИИ «Электроника»,
1986.
38. Hitz В. С. // Laser Focus/Electr. Opt.— 1986. V. 22. № 9. Р. 100.
39. Симонова Г. А., Швалб П. Г. Применение лазеров для диагно-
стики заболеваний.— М.: ЦНИИ «Электроника», 1987.
40. Дьюли У. Лазерная технология и анализ материалов.—М.:
Мир, 1986.
41. Жаров В. П., Летохов В. С. Лазерная оптико-акустическая
спектроскопия.— М.: Наука, 1984.
42. Лазерная аналитическая спектроскопия/Под ред. В. С. Лето-
хова.— М.: Наука, 1986.
43. Сверхчувствительная лазерная спектроскопия/Под ред. Д. Клай-
джера.— М.: Мир, 1986.
15*
227
44. Rosencwaig A. Photoacoustics and Photoacoustic Spectroscopy.—
N.Y.: Wiley, 1980.
45. Third Intern. Topical Meet, on Photoacoustic and Photothermal
Spectroscopy // J. Phys. (Fr.).— 1983. V. 44. P. 333—426.
46. Proc. 4th Intern. Topical Meet, of Photoacoustic, Thermal, and
Related Sciences // Can. J. Phys.— 1986. V. 64. P. 1124—1149.
47. Быковский Ю. А., Неволин В. H. Лазерная масс-спектромет-
рия.— М: Энергоатомиздат, 1985.
48. Кулаков Б. П., Никитюк Н, В., Тищенко А. А. // Зарубеж.
радиоэлектроника.—1985. № 11. С. 50.
К главе 1
1. Рубин А. Б. Биофизика.— М.: Высшая школа, 1987. Кн. 1, 2.
2. Алейников В. С., Беляев В, П., Девятков Н.Д., Масычев В.И,
// [П. 27]. С. 5.
3. McCord R. С. // Laser and Appl. —1986. V. 11. Р. 61.
4. Бакуткин В. В., Максимова И. Л.9 Сапрыкин П. И. и др. //
ЖПС.— 1987. Т. 46. С. 104;
Максимова И. Л., Тучин В. В., Шубочкин Л. П. Лазерные
пучки.— Хабаровск: Изд-во Хабар, политехи, ин-та, 1985,
С. 91.
5. Yoon (?., Welch A. J., Motamedi М., Van Gemert M. C. J. //
[П. 26].— 1987. Р. 1721; Bolin F. P.t Preuss L. E., Taylor R. C.t
Sandu T. S. // P. 1734; Van Gemert M. С. // Ned. Tijdschrift
Naturkunde. —1987. V. A53. P. 18.
6. Реди Дж. Промышленное применение лазеров.— М.: Мир,
1981.
7. Аскарьян Г. А. // Квант, электроника.— 1982. Т. 9. С. 1379.
8. Parrish J. A., Deutsch Т. F. // [П. 26].— 1984. Р. 1386.
9. Конев С. В., Болотовский И. Д. Фотобиология.— Минск: Изд-
во Белорус, ун-та, 1974.
10. Карлов Н. В. Лекции по квантовой электронике.— М.: Наука,
1988.
11. Справочник по лазерам/Под ред. А. М. Прохорова.—М.: Сов.
радио, 1978. Т. 1, 2.
12. Демтредер В. Лазерная спектроскопия. Основные принципы
и техника эксперимента.— М.: Наука, 1985.
13. Звелто О. Принципы лазеров.— М.: Мир, 1984.
14. Тучин В. В. Флуктуации в газовых лазерах.— Саратов: Изд-
во Сарат. ун-та, 1981. Ч. 1, 2.
15. Ахманов С. А., Выслоух В. А., Чиркин А. С. Оптика фемтосе-
кундных импульсов.— М.: Наука, 1988.
16. Новые физические методы в биологических исследованиях.—
М.: Наука, 1987. С. 65—79.
17. Tuchin V. V., Shubochkin L. P.t Maksimova I. L. Ц [П. 9]. C.
611—620.
18/ Кару T. Й. // ДАН СССР. —1986. T. 291. С. 1245.
19. Karu Т. I. // [П. 26].— 1987. Р. 1703; Жаров \ В. П. и др.Ц
Квант, электроника.—1987. Т. 14. С. 2135.
20. Улащик В. С. Новые методы и методики физической терапии.—
Минск: Беларусь, 1986.
21. Абакумов А. О., Алейников В. С., Артюшенко В. Г. и др. //
Квант, электроника.— 1985. Т. 12.ГС. 2476.
22. Акопян В. С., Данилейко Ю. K.t Нау миди Л. П., Прохоров А. М.
// Там же.— 1987. Т. 14. С. 1291.
228
23. Абильсиитов Г. A,t Беляев А, Л., Брагин М. А. и др, // Там же.
— 1985. Т. 12. С. 1991.
24. Furzikov N. Р, // [П. 26].— 1987. Р. 1751.
25. Вертепа И, Л., Дмитриев А. К., Фурзиков Н. П, Ц Квант,
электроника,— 1987. Т. 14. С. 2377.
26. Singleton D. L.t Paraskevopoulos G.t Taylor R, S., Higginson
L, A. J. // [П. 26].—1987. P. 1772.
27. Тучин В. В. Динамические процессы в газоразрядных лазе-
рах.— М.: Энергоатомиздат, 1989.
28. Привалов В, Е. Газоразрядные лазеры в измерительных ком-
плексах.— Л.: Судостроение, 1989.
29. Тучин В. В, Флуктуации в лазерах на парах металлов.— М.:
ЦНИИ «Электроника», 1985.
30. Алексеев В, А,, Тринчук Б. Ф, Лазеры на растворах органиче-
ских соединений с ламповой накачкой.— М.: ЦНИИ «Элек-
троника», 1985.
31. Басаев Т, Т,, Карпушко Ф, В., Кулащик С, М, и др, Ц Квант,
электроника. —1987. Т. 14. С. 1726.
32. Борников Н, В. Инжекционные гетеролазеры видимого диапа-
зона.— М.: ЦНИИ «Электроника», 1987.
33. Тучин В, В, Флуктуации в инжекционных полупроводниковых
лазерах.— М.: ЦНИИ «Электроника», 1986.
34. Pratesi R, // [П. 26].—1984. Р. 1433.
35. Херман И,, Вильгельма Б, Лазеры ультракоротких импуль-
сов.—М.: Мир, 1987.
36. Нехаенко В, Л., Першин С. М,, Подшивалов Л. Л. Ц Квант,
электроника. —1986. Т. 13. С. 453.
37. Баранов В, Ю,, Борисов В, M,t Степанов Ю. Ю. Электрораз-
рядные эксимерные лазеры на галогенидах инертных газов.—
М.: Энергоатомиздат, 1988.
К главе 2
1. Эскин В. Е. Рассеяние света растворами полимеров и свойства
макромолекул. — Л.: Наука, 1986.
2. Хайруллина А. Я. // Распространение света в дисперсной сре-
де.— Минск: Наука и техника, 1982. С. 275;
Сидько Ф, Я-, Терское И. А., Ерошин Н. С. и ^.//Теоретиче-
ские и прикладные проблемы рассеяния света. — Минск: Нау-
ка и техника, 1971. С. 361.
3. Хюлст Г. Рассеяние света малыми частицами. — М.: ИЛ, 1961.
4. Leader J. С. Ц Proc. Photo-Optical Instrum. Eng.— 1982. V. 358.
P. 17.
5. Holland A. C., Gagne G. // Appl. Opt. — 1970. V. 9. P. 1113.
6. Beaton C. D., Maxwell R. S. S., Creveling R. L. // Clin. Chem. —
1976. V. 22. P. 1465.
7. Плашек Я», Маржик T. // [П. 5]. — С. 57.
8. Хайруллина А. Я., Шумилина С, Ф. //ЖПС. —1973. Т. 19,
С. 538.
9. Дубова Г. С,, Королевич А. Н., Хайруллина А. Я. // Там же. —
1984. Т. 40. С. 630.
10. Дубова Г, С„ Хайруллина Л. Я., Шумилина С. Ф. // Там же.—
1977. Т. 27. С. 871.
11. Mappack J. R., Richard С, В, // J. Immunol. — 1970. V. 20.
Р. 1019.
229
12. Buffone G. J.t Savory J.t Hermans J. // Clin. Chem.—1975. V. 21.
P. 1735.
13. Арефьев И. M.t БарсетянцЛ. O.t ВерещакаМ. Ф., Еськов А, П.//
Лаборат. дело.—1979. № 12. С. 716.
14. Арефьев И. М., Еськов А. П., Козлов Г. Г. // Б юл. экспер.
биол. и мед. —1978. № 2. С. 240.
15. Михлин Н. В., Городецкая С. Б., Арефьев И. М. и др. Ц Уро-
логия и нефрология. —1984. № 6. С. 61.
16. Клочков В. П., Козлов Л. Ф., Потыкевич И. В., Соскин М. С.
Лазерная анемометрия, дистанционная спектроскопия и интер-
ферометрия.— Киев: Наукова думка, 1985.
17. Борен К., Хафмен Д. Поглощение и рассеяние света малыми
частицами.—М.: Мир, 1986.
18. Александров М. Л., Асиновский Л. И., Мельцин А. Л., Толо-
конников В. А. // ЖПС.— 1986. Т. 44. С. 887.
19. Блюмкина Ю. А. // Эллипсометрия — метод исследования
поверхности.— Новосибирск: Наука, 1983. С. 103.
20. Кадышевич Е. А., Любовцева Ю. С., Розенберг Г. В. // Изв. АН
СССР. Сер. физика атмосферы и океана. —1976. № 2. С. 186.
21. Шубочкин Л. П. Светорассеивающие свойства биологических
структур применительно к задачам лазерной диагностики
в офтальмологии: Канд. дис.— Саратов, 1987.
22. Джеррард А., Берч Дж. М. Введение в матричную оптику.—
М.: Мир, 1978.
23. Hauge Р. S. // Surface Sci. —1980. V. 96. Р. 108.
24. Fry Е. S., KattawarG. W. // Appl. Opt. —1981. V. 20. P. 2811.
25. Линник Л. А., Усов H. И., Чечин П. П., Пелепчук О. С. // Оф-
тальм. журн. —1982. № 4. С. 193.
26. Masayasu B.t Akir N.t Kenshi S. // Exp. Eye Res. —1975. V. 20.
P. 489.
27. Мальцев Э. В. // Офтальм. журн, —1986. № 5. С. 306.
28. Maurice D. М. // J. Physiology. —1957. V. 136. P. 263.
29. Hart R. W., Farrell R. A. // J. Opt. Soc. Am.—1969. V. 59.
P. 766.
30. Farrell R. A., Hart R. W. // Bull. Math. Bio-Phys. —1969. V. 31.
P. 727.
31. Hart R. №., Farrell R. A. // Ibid. —1971. V. 33. P. 165.
32. Benedek G. B. // Appl. Opt. —1971. V. 10. P. 459.
33. Andreo R. H., Farrell R. А. Ц J. Opt. Soc. Am. —1982. V. 72.
P. 1479.
34. Bettelheim F. A., Marill R. // Invest. Ophthalm. Vis. Sci.—
1977. V. 16. P. 236.
35. Максимова И. Л., Тучин В. В., Шубочкин Л. П. // Оптика и
спектроскопия. —1986. Т. 60. С. 801; 1988. Т. 65. С. 615.
36. Boettner Е. A., Wolter J. R. // Invest. Ophthalm. —1962. V. 1.
Р. 776.
37. Мяло Н. М. // Научн. тр. кафедры офтальмологии ВМА им.
С. М. Кирова.—Л.: 1984. С. 97.
38. Максимов В. Ю., Цуканов В. А., Шубочкин Л. П. // 4-й Всерос-
сийский съезд офтальмологов.—М., 1982. С. 145.
39. Hogan М. J., Alvarado J. A., Weddell J. Е. Histology of the
human eye: An atlas and textbook.— L.: Academic, 1971.
40. Иванов А. П., Хайруллина А. Д., Харькова T. H. Ц Оптика и
спектроскопия.—1970. T. 28. С. 380.
41. Верещагин В, Г. // Распространение света в дисперсной сре-
де.— Минск: Наука и техника, 1982. С. 135.
230
42. Дик В. П.9 Иванов А. П.9 Лойко В. А. // ЖПС.—1986. Т. 45
С. 297.
43. Дейрменджан Д. Рассеяние электромагнитного излучения сфе’
рическими полидисперсными частицами.— М.: Мир, 1971.
44. Jedziniak /. А., Nicoli D. F.9 Benedek G. В. Ц Invest. Ophthalm.
Vis. Sci.—1978. V. 17. P. 51.
45. Королевич A. H.9 Хайруллина А. Д. // Оптика и спектроскопия.—
1982. T. 52. С. 864.
46. Плахина И. Н. Влияние формы и ориентации рассеивающих
частиц на матрицы рассеяния света средами типа природных
аэро- и гидрозолей: Канд, дис.—М., 1975.
47. Науменко Е. К.9 Олейник Т. В.9 Хайруллина А. Д. // Оптика и
спетроскопия.—1982. Т. 53. С. 489.
48. Арефьев И. М."Еськов А. П.9 Кияченко Ю. Ф. и др. Ц Меди-
цинская техника.—1979. №’3. С. 17.
49. ЗамлынскийЛ. П.9 Матвеев Г. П.9 Папаев В. А. //*Электрон-
ная промышленность.—1985. Вып. 1. С. 48.
50. Беляев С. П.9 Никифорова Н. К.9 Смирнов В. В.9 Щелчков Г. И.
Оптико-электрэнные методы изучения аэрозолей.—’М.: Энер-
гоатомиздат, 1981.
51. Арефьев И. М.9 Добровольски й Н. А., Пешков А. В. Ц Медицин-
ская техника.—1984. № 5. С. 28.
52. Лапытов 3. 3.9 Скворцова Н. О. # Ibid.—1983. №6. С. 11.
53. De’Grooth В. G.t van Dam М.9 Swart N. C. et al. // Cytometry.—
1987. V. 8. P. 445; de Grooth B. G., Terstappen L. W. M. M.9
Puppets G. J.9 Greve J. /7?Ibid.— P. 539; Terstappen L. W. M. M.9
de^Grooth^B. G.^Vlsscher K. et al. //'Ibid.—1988. V. 9. P. 39;
Terstappen L. W. M. M.9 de Grooth B. G.t van Berkel W. et al. //
Blut.—1988. V. 56. P. 201.
К главе 3
1. ’’Спектроскопия оптического смешения и корреляция фотонов/
Под ред. Г. Камминса, Е. Пайка/Пер. с англ, под ред. Ф. В.
Бункина.— М.: Мир, 1978.
2. Photon Correlation Spectroscopy and Velocimetry/Eds H. Cum-
mins, E. Pike.— N.Y.: Plenum, 1977.
3. The Application of Laser Light Scattering to the Study of Biolo-
gical Motion/Ed. J. C. Earnshaw.— N.Y.: Plenum, 1983.
4. LighCScattering in Liquids and Macromolecular Solutions/Eds
V. Degiorgio et al.— N.Y.: Plenum, 1980.
5. Scattering Techniques Applied to Supramolecular and Nonequi-
librium Systems./Eds S.-H. Chen et al.— N.Y.: Plenum, 1981.
6. Штокман M. И. Ц Автометрия.—1980. № 1. C. 85;’ № 2. C. 102.
7. Приезжее A. B.y Романовский Ю. M. Ц Квант, электроника.—
1978. T. 5. С. 2237.
8. Приезжее А. В., Евдокимов М. В., Романовский Ю. М. // Квант,
электроника.—1981. Т. 8. С. 2600.
9. Лебедев А. Д., Левчук Ю. Н.9 Ломакин А. В., Носкин В. А.
Лазерная корреляционная спектроскопия в биологии.— Киев:
Наукова думка, 1987.
10. Chu В. Laser Light Scattering.—N. Y., L.: Academic^ Press,
1974.
11. Свищев Г. M. // Цитология.—1984. Т. 26. С. 477.
12. Посудин Ю. И. // Биол. науки.—1983. №7. С. 29.
13. Ринкевичюс Б. С. Лазерная’анемометрия.— М.; Энергия, 1978.
14. Дубнащев Ю. Н., Ринкевичюс Б. С. Методы лазерной доплеров-
ской анемометрии.— М.: Наука, 1982.
15. Ерш И. Г. Разработка и некоторые применения фотон-корре-
ляционных спектрометров: Канд. дис.— Новосибирск, 1986.
16. Буркитбаев С. Л4., Кушнир В. 77., Кияченко Ю. Ф. и др. //
Письма в ЖТФ. —1983. Т.9. С. 98.
17. Sanders А. Н., Cannell D. S. // [4].— Р. 173.
18. Nishio /., Peetermans J., Tanaka T. // Cell Biophys. —1985.
V. 7. P. 91.
19. Jossang T.t Feder J. // [5].— P. 831.
20. Palmer G. R.t Sattelle D. B. // [5].— P. 839.
21. Cumminz H. Z. // [3].—P. 171.
22. Benedek G. B. // Appl. Opt. —1971. V. 10. P. 459.
23. Tuchin V. V., Shubochkin L. P., Maksimova I. L. // [П. 9].—
P. 611.
24. Tanaka T.t Benedek G. B. // Invest. Ophthalm. —1977. V. 14.
P. 449.
25. Tanaka T.t Ishimoto C. // Invest. Ophthalm. Visual Sci. —1977.
V. 16. P. 135.
26. Sato H.t Suzuki N., Nakatani H. // Jap. J. Appl. Phys. —1981.
V. 20. P. 1289.
27. Weiss J. N.t Rond L. /., Gleasson R. E., Soddner I. S. // Invest.
Ophthalm. Visual Sci.—1984. V. 25. P. 594.
28. Yoshimura T., Nishima H., Nakatani H., Suzuki N. // Appl.
Opt. —1986. V. 25. P. 1470.
29. Ерш И. Г., Муратов Л. С., Новожилов С. Ю. и др. // ДАН
СССР.-—1986. Т. 287. С. 1239.
30. Арефьев И. М., Еськов А. П., Корн М. Д., Чибисова В. А. //
Бюл. эксп. биол. и мед. —1978. № 3. С. 376.
31. Арефьев И. М., Еськов А. П., Колесникова В. ТО., Корн М. Я. Ц
Бюл. экспер. биол. и мед. —1983. № 1. С. 112.
32. Хайруллина А. Я- // ЖПС.—1983. Т. 39. С. 299.
33. UzjirisE. Е., Kaplan J. Н. // Analyt. Biochem.—1974. V. 60. Р. 455.
34. Steiner R., Ottomann 0., Kaufmann R. et al. // Electrophore-
sis.—1985. V. 6. P. 82.
35. Ware B. R., Klein J. W. // Biophys. J.—1986. V. 49. P. 147;
Ware B. R. // [3]. P. 99.
36. Приезжее А. В., Степанян А. С., Денисов Ю. А.//Вестн. Моск,
ун-та. Сер. физ. и астроном.—1989. Т. 30. С. 62.
37. Riva С., Ross B.t Benedek G. В. // Invest. Ophthalm.— 1972.
V. 11. P. 936.
38. Tanaka T., Riva C. E.t Benedek G. B. // Science. —1974. V. 186.
P. 830.
39. Feke G. T.t Riva С. E. // JOSA. —1978. V. 68. P. 526.
40. Hill O., Pice E., Gardner К. H Trans. Ophthalm. Soc. United King-
dom.—1981. V. 101. P. 152.
41. Riva C. E., Grundwald J. E.t Sinclair S. H., O'Keefe К. И Appl.
Opt. —1981. V. 20. P. 117.
42. Глонти В. H.t Денисов Ю. А., Приезжее А. В. Ц Материалы
конф. «Лазеры в народном хозяйстве».— М.: Изд. МДНТП
им. Ф. Э. Дзержинского, 1986. С. 59.
43. Tanaka T.t Benedek G. // Appl. Opt. —1975. V. 14. P. 189.
44. Лисицын В. H.t Орлов В. А., Ревякин С. В. и др. Ц Автомет-
рия.—1984. № 1. С. 86.
45. Nishihara Н., Коуата J., Hoki N. Ц Appl. Opt.—1982. V. 21.
Р. 1785.
232
46. Nilsson G. E., Tenland T., Oberg P. A. // IEEE Trans. Bio-
Med. Eng. —1980. V. 27. P. 12, 597.
47. Арефьев И, M., Шевченко P. A. // Мед. техника. —1983. № 6.
С. 6.
48. Утямышев Р. И., Арефьев И, М., Мазовецкий А, Г., Шевчен-
ко Р. А. // Терапевт, архив. —1985. №9. С. 120.
49. De Mui F. F. M., van Spijher J., van der Plas et al. // Appl.
Opt. —1984. V. 23. P. 2970.
50. Арефьев И. M., Еськов А. П., Козлов Г. Г. // Бюл. экспер.
биол. и мед. —1978. №2. С. 240.
51. Craig Т., Racey Т. J., Hallette F. R. // [4].—P. 631.
52. Wang P. C., Chen S.-H. // [4].— P. 609.
53. Boon J. P. // [4].— P. 561.
54. Chen S.-H., Hallette F. R. // Quart. Revs. Biophys. —1982. V. 15.
P. 131.
55. Приезжее А. В.//Изв. АН СССР. Сер. физ. —1986. T. 50. С. 1134.
56. Priezzhev A. V., Romanovsky Y. M., CherniaevaE. В. // [П. 9].—
P. 503.
57. Mustacich R. V., Ware B. R. // Phys. Rev. Lett. —1974. V. 33.
P. 617.
58. Mustacich R. V., Ware B. R. // Biophys. J. —1976. V. 16. P. 373;
1977. V. 17. P. 229.
59. Mustacich R. V., Ware B. R.//Protoplasma.—1977. V. 91. P. 351.
60. Langley К. H., Piddington R. W., Ross D., Sattelle D. B. //
BBA.—1976. V. 444. P. 893.
6 1. Newton S. A., Ford N. C., Langley К. H., SattelleD. B. // BBA.—
1977. V. 496. P. 212.
62. Earnshaw J. C. // [2].— P. 196.
63. Евдокимов M. В., Приезжее А. В., Романовский Ю. M., Черняе-
ва Е. Б. // Биофизика. —1982. Т. 27. С. 918.
64. Черняева Е. Б. Ц Вест. Моск, ун-та. Сер. физ. и астрон.— 1984.
Т. 25. С. 48.
65. Евдокимов М. В., Приезжее А. В., Романовский Ю. М. // Ав-
тометрия.—1982. Вып. 3. С. 61.
66. Романовский Ю. М., Черняева Е. Б., Колинько В. Г., Хоре Н. П.
С. 202; Теплое В. А., Бейлина С. И., Евдокимов М. В. и др.
С. 190.// Автоволновые процессы в системах с диффузией/Отв.
ред. М. Т. Грехова.— Горький: ИПФ АН СССР, 1981.
67. Beilina S. /., Matveeva N. В., Priezzhev А. V. et al. Ц Selforgani-
zation, autowaves and structures far from equilibrium./Ed.
V. I. Krinsky.— Berlin etc: Springer-Verlag, 1984. P. 218.
68. Ермаков В. Б., Приезжее А. В. // Биофизика. —1984. Т. 29.
С. 100.
69. Колинько В. Г., Архангельская Т. А., Романовский Ю. М. //
Stud. Biophys. —1985. Т. 106. С. 215.
70. Приезжее А. В., Колинько В. Г., Романовский Ю. М., Черняе-
ва Е. Б. // [П. 5].—С. 75.
71. Евдокимов М. В., Колинько В. Г., Порошина М. Ю., Приез-
жее А. В. // Квант, электроника. —1985. Т. 12. С. 2052.
72. Васильев В. А., Романовский Ю. М., Яхно В. Г. Автоволновые
процессы/Под ред. Д. С. Чернавского—М.: Наука, 1987.
73. Теплое В. А., Романовский Ю. М. Механохимические распреде-
ленные автоколебания в клеточной подвижности: Препринт /
ИБФ АН СССР.— Пущино, 1987.
74. Ринкевичюс Б. С., Толкачев А. В., Суторшин В. Н. и др. И
Радиотехн. и электрон.—1979. Т. 24. С. 594.
233
75. Maeda T., Fujime S. // Rev. Sci. Instrum. —1972. V. 43. P.4566„
76. Mishina H.t Asakura T.t Nagai S, // Opt. Commun."—1974. V. 11.
P. 99.
77. Cochrane T., Earnshaw J. C. // J. Phys. E.—1978. V. 11. P. 196.
78. Herbert T. J., Acton J. D. // Appl. Opt.—1979. V. 18. P. 588.
79. Blank P. S., Tishler R. B., Carlson F. D. // Ibid.—1987. V. 26.
P. 351.
80. Johnson R. P. C.t Dunbar G. R. A., Ross D. A. // [П. 9].— P.
531.
81. Johnson R. P. С. Ц [3].— P. 147.
82. Peetermans J. A., Matthews E. K., Nishio I., Tanaka T. // Eur.
Biophys. J. —1987. V. 15. P. 65.
83. Sun S.-T.t Tanaka T.t Nishio /. et al. Ц Proc. Natl. Acad. Sci.
USA. —1984. V. 81. P. 785.
84. Глонти В. H.t Приезжее A. B.t Романовский Ю. M. // Мате*
риалы конф. «Лазеры в народном хозяйстве».— М.: Изд.
МДНТП им. Ф. Э. Дзержинского, 1988. С. 92.
f J К главе 4
1. Rassow №., Wolf D. // Laser + Electro-Optik.—19/6. № 3.
P. 19.
2. Изотова В. Ф., Сапрыкин П. И., Тучин В. В., Шубочкин Л. П. Ц
Зарубеж. радиоэлектроника.—1985. № 1. С. 91.
3. Rassow W.t Wolf D. // Adv. Ophthalm. (Basel).—1977. V. 34. >
P. 116.
4. Аветисов Э. C.t Урмахер Л. С., Шапиро E. Ш., Аникина E. Б. Ц
Вести, офтальм.—1975. № 2. C. 50.
5. Урмахер Л. C.t Айзенштат Л. И. Офтальмологические при*
боры.—М.: Медицина, 1988.
6. Аветисов Э. C.t Шапиро Е. Ш., Бееишвили Д. Г. и др. // Оф-
тальм. журн.—1982. № 1. С. 32.
7. Сапрыкин П. И., Сумарокова Е. С., Решникова Л. Б. и др. //
Там же.—1984. № 5. С. 281.
8. Green D. G.t Fruch В. R.t Shapiro J. M. H J. Opt. Soc. Am.—
1975. V. 65. P. 119.
9. Fercher A. F.t Hu H. Z.t Steiger P. F.t Briers J. D. // Opt. Acta.— t
1982. V. 2. P. 1401.
10. Аветисов Э. C.t Розенблюм Ю. 3. Оптическая коррекция зре-
ния.— М.: Медицина, 1981.
11. Bahuguna R. D. // J. Opt. Soc. Am. —1984. V. 1. P. 1085.
12. Ферхер А. Ц Автометрия.—1983. №2. С. 10.
13. Fercher A. F., Briers J. D. // Opt. Commun. —1981. V. 37. P. 326.
14. Fujii H.t Asakura T. A., Hohira K. et al. // Opt. Lett. —1985.
V. 10. P. 104.
15. Арефьев И. M., Шевченко P. A. // Медицинская техника.—‘
1983. №6. C. 6.
16. Копейко Л. F.t Хухлаев К. К. // Зарубеж. радиоэлектроника.—
1976. №7. С. 100.
17. Бейлин Е. Н., Лехцнер Е. Н. // Лазерные методы лечения и
ангиографические исследования в офтальмологии.— М.: Изд-
во МНИИ микрохирургии глаза, 1983. С. 192.
18. Calkins J. E.t Leonord С. D. // Invest Ophthalm. —1970. V. 9.
P. 458.
19. Wiggins R. L.t Vaughan R. D. // Arch. Ophthalm.—1972. V. 88;
P. 75.
234
20. Wiggins R. L.y Vaughan K. D., Friedmann G. B. // Appl. Opt.—
1972. V. 11. P. 179.
21. Смирнов В. В., Беспалов В. Г., Гудаковский Ю. П. и др. // Оп-
тика и спектроскопия.—1983. Т. 54. С. 1072.
К главе 5
1. Буткевич В. И., Привалов В. Е. // ЖПС. —1988. Т. 48. С. 7.
2. Хайруллина А. Я. Ц Вести. АН БССР. Сер. физ.-мат. наук.—
1984. №6. С. 72.
3. Дубова Г. С., Мишу ров Э. А., Хайруллина А. Я. // ЖПС.—
1986. Т. 44. С. 446.
4. Пустовалов В. К., Хорунжий И. А. // Квант, электроника.—
1987. Т. 14. С. 1718.
5. Williams Р. С., Norris К. Н., Gehrke С. W., Bernstein К. // Cereal
Foods World. —1983. V. 28. Р. 149.
6. Матвеец Ю. А., Шарков А. В. // [П. 1]. С. 47.
7. Пискарскас А. С., Ротомскис Р. И. // [П. 2]. С. 173—236.
8. Braslavsky S. Е. // Primary Photo-Processens Biol, and Med.
Proc. NATO Adv. Study Inst. Bressanone.—N. Y.; London,
1985. P. 147.
9. Cross F. M., Al-Dhahir R. K., Dyer P. E., MacRobert A. J. Ц
Appl. Phys. Lett.—1987. V. 50. C. 1019.
10. Жаров В. П., Амер Н. М. // Изв. АН СССР. Сер. физ. —1986.
Т. 50. С. 820.
11. Гандурин А. Л., Герасимов С. Б., Желтухин А. А. и др. //
ЖПС. —1986. Т. 45. С. 337.
12. Уайли, Лей // ПНИ.—1986. № 6. С. 127.
13. Cesar С. C.t Vargas Н., Lima С. A. S. et al. Ц J. Agric. Food
Chem. —1984. V. 32. P. 1355.
14. Яэеаси M., Итого Ф., Сучитани E. // Jap. Analyst.—1985.
V. 34. P. 771.
15. Зубов E. В., Чижов И. В. // [П. 5). С. 195.
16. Helander P.t Lundsrom I. // J. Photoacoustic.—1982. V. 1.
P. 203.
17. Sugi Miisutane // J. Soc. Non-Traditional Technol. —1986.
№ 200. P. 8.
18. Жаров В. П., Зубов Б. В., Лощилов В. Н. и др. Исследование
оптических и теплофизических свойств биоткани методом им-
пульсной фототермической радиометрии: Препринт ИОФАН
СССР. №146.—М., 1987.
19. Бейлин Е. Н., Буянов-Уздальский А. Ю., Жаров В. П. и др. //
Акуст. журн. —1987. Т. 33. С. 194.
20. Алейников В. С., Гапонов С. C.t Масычев В. И., Рабод-
зей Н. В. // [П. 28]. С. 51.
21. Long И., Deutsch Т. F. // [П. 26].—1987. Р. 1821.
22. Navaux М., Izuchi М. // Jap. J. Appl. Phys. —1988. V. 27.
Р. L423.
23. Srinivasan R., Dyer P. E.t Braren B. // Laser Surgery and Medi-
cine.—1987. V. 6. P. 514.
К^главе в
1. Грассели Д.' Снейвили M.t Балкин^Б. Применение спектроско-
пии КР в химии.—М.: Мир, 1984.
2. Ахманов С. А., Коротеев Н. И. Методы нелинейной оптики в
спектроскопии рассеяния света.— М.: Наука, 1981.
235
3. Akhmanov S. A., Kamalov V. F., Koroteev N. I. И [П. 9]. Р» 67*
4. Камалов В. Ф., Коротеев Н. И., Толеутаев Б. Н. и др. II Изв.
АН СССР. Сер. физ. —1986. Т. 50. С. 1197.
5. Kubota К. Ц Srectrochim. Acta. —1982. V. А38. Р. 617.
6. Koglin Е., Sequaris J.-M. // Topics in Current Chem. V. 134.
P. 1.— Springer, 1986.
7. Набиев И. P.t Ефремов P. Г., Чуманов Г. Д. // УФН.—1988.
Т. 154. С. 459.
8. Емельянов В. И., Коротеев Н. И. // УФН — 1987. Т. 135. С. 345.
9. Biological applications of Raman spectroscopy/Ed. T. G. Spiro.—
N.Y.: Wiley, V. 1, 2. 1987; V. 3. 1988.
10. Carey P. R. // Quart. Rev. Biophys. —1978. V. 11. P. J309.
11. Kishi K., Noda H. // J. Biochem. —1983. V. 94. P. 353.
12. Апанасевич П. А., Квач В. В., Орлович В. А. Актуальные про-
блемы спектроскопии.—М.: Изд-во АН СССР, 1985. С. ,|167.
13. Dutta Р. К., Nestor J. R., Spiro Т. G. // Proc. Natl. Acad?Sci.
USA. —1977. V. 74. P. 4146.
14. Dutta P. K., Spiro T. G. // J. Chem. Phys.—1978. V. 69. P. 3119.
15. Бункин А. Ф., Романовский Ю. M., Филатова Т. Н. и др. //
Тез. докл. 1-го Всесоюзн. биофизич. съезда.— М.: Изд-во АН
СССР, 1982. Т. 1. С. 146.
16. Бункин А. Ф., Ху рейн Ю. И., Чикишев А. Ю. И ЖПС.— 1984.
Т. 40. С. 480.
17. Чикишев А. Ю. // [П. 15].—С. 143.
18. Otto С., De Mui F. F. M., Huizinga A., Greve J. // J.~Phys.
Chem. —1988. V. 92. P. 1239.
19. Набиев И. P., Чуманов Г. Д. // Биофизика. —1986. Т. 31. С. 183.
20. Набиев И. Р., Ефремов Р. Г., Чуманов Г. Д., Курятов А. Б. Ц
Биол. мембраны.—1985. Т. 2. С. 1003.
21. Tobin М. С. // Spectrochim. Acta. Part А. —1968. V. 25. Р. 1855.
22. Otto С., De М ul F. F. M., Harmsen B. J. M., Greve J. // Nucleic
Acids Res. —1987. V. 15. P. 7605.
23. Tomas G. J., Jr, Prescott B., Day L. A. // J. Molec. Biol. —1983.
V. 165. P. 321.
24. De Mui F. F. M., Van Welie A. G. M., Otto C. et al. // J. Raman-
Spectrosc.—1984. V. 15. P. 268.
25. S. C., Peticolas Ц7. L. // Biopolymers. —1975. V. 14.
26. Nishimura Y., Hirakawa А. У., Tsuboi M. // Adv. Infrared Ra-
man Spectrosc. —1978. V. 5. P. 173.
27. Koglin E., Sequaris J. M. // J. De Phys. —1983. V. 44.
P. 487.
28. Koglin E., Sequaris J. M. // J. Molec. Struct. —1986. V. 141.
P. 405.
29. Atalla R. H., Agarwal U. P. // J. Raman Spectrosc. —1986.
V. 17. P. 229.
30. Howard W. F., Jr., Nelson W. H., Sperry J. F. // Appl. Spect-
rosc.—1980. V. 34. P. 72.
31. Wrahma S. K., Hargraves P. E., Howard W. F., Jr., Nel-
son W. H. // Ibid.—1983. V. 37. P. 55.
32. Dalterio R. A., Back M., Nelson W. H. et al. // Ibid. —1987,
V. 41. P. 241.
33. Duncan M. D. // Opt. Commun. —1984. V. 50. P. 307.
34. Ozaki Y., Iriyama К. // [П. 9].— P. 559.
35. Ozaki Y., Iriyama K., ItohK.etal. // Appl. Spectrosc. —1987,
V. 41. P. 597. P. 1245.
236
36. Ozaki У., Iriyatna К., Itoh К. et al. Ц J. Biol. Chem.—1987.
V. 262. P. 1545.
37. Gijsbers, G. Vrensen, W. Willekens et al. // [П. 9].— P. 583.
38. Bertoluzza A., Fagnano C., Tinti A. // Ibid.— P. 605.
39. Bertoluzza A., Fagnano C.t Monti P. et al. Ц J. Raman Spect-
rose.—1986. V. 17. P. 133.
40. Yu N.-T.t Cai M. Z., Ho D. J.-Y., Kuck J. F. R.//Proc. Natl.
Acad.£Sci. USA.—1988. V. 85. P. 103.
К главе 7
1. Карнаухов В. Н. Люминесцентный спектральный анализ клет-
ки.—М.: Наука, 1978.
2. Люминесцентный анализ в медико-биологических исследова-
ниях: Сб. науч. статей./Риж. мед. ин-т. Отв. ред. В. Н. Сомин-
ский,— Рига, 1981, 1983, 1986.
3. Люминесцентный анализ в гастроэнтерологии/Лисовский В. А.,
Щедрунов В. В., Барский И. Я. и др.— Л.: Наука, 1984.
4. Барашков Н. Н. Люминесцентный анализ на службе здоровья.—
М.: Наука, 1985.
5. Полянский Б. А., Бородин Ю. И., Хрячков В. В. Люминесцент-
ное исследование органов и систем.— Новосибирск: Наука,
1983.
6. Бурштейн Э. А. Люминесценция белка. Природа и примене-
ние. // Итоги науки и техники. Сер. Молек. биология. Т. 3.—
М.: ВИНИТИ, 1973. С. 127; Бусел Е. П. Люминесцентные свой-
ства основных хромофоров белка //Там же. С. 85.
7. Владимиров Ю. А., Добрецов Г. Е. Флуоресцентные зонды в ис-
следовании биологических мембран.—М.: Наука, 1980.
8. Лакович Дж. Основы флуоресцентной спектроскопии / Пер.
с англ, под ред. М. Г. Кузьмина.— М.: Мир, 1986.
9. Лобазов А. Ф., Мостовников В. А., Нечаев С. В. и др. Ц ЖПС.—
1987. Т. 47. С. 162.
10. Urabe Н., Tsukakoshi М., Sugiyama Т. et al. Ц Jap. J. AppL
Phys. Part 2. —1986. V. 25. P. L. 937.
11. Koppel D. E. // Biochem. Soc. Trans. —1986. V. 14. P. 842.
12. Alfano R. R., Tata D. B., Cordero J. et al. // [П. 26]. P. 1507.
13. Alfano R. R.t Alfano M. А. Ц Photonics Spectra. —1985. V. 19.
P. 55—58, 60.
14. Alfano R. R., Lam W., Zarrabi H. J. et al. // [П. 26]. P. 1512.
15. Рубин Л. Б., Дзбановский H. H., Полсачев В. И. и др. //
[П. 16]. С. 187.
16. Dougherty Т. /.//Photochem. Photobiol.—1987. V. 45. Р. 879.
17. Камалов В. Ф., Толеутаев Б. Н., Черняева Е. Б., Хуршило-
ва 3. А. // [П. 5].—С. 19.
18. Полсачев В. И., Дзбановский Н. Н., Рахимов А. Т. и др. //
[П. 16].—С. 166.
19. Калайдзидис О. В., Петров К. В., Дзбановский Н. Н., Ру-
бин Л. Б. // [П. 16]. С. 86.
20. Воробей А. В., Вадецкая Т. Н., Тутов В. В., Черницкий Е. А. //
21. Гуринович Г. П., Лосев А. П. // [П. 16].— С. 50.
22. Akhmanov S. A., Kamalov V. F.t Koroteev N. I. // [П. 9]. P. 67.
23. Камалов В. Ф., Толеутаев Б. Н., Черняева Е. Б., ХурШи-
лова 3. А. // Изв. АН СССР. Сер. физ.—1987. Т. 51.
С. 238.
237
24. Roder B.t Wabnitz H. // Proc. 4-th Intern. Symp. Ultrafast Phe-
nomena. Teubner-Text sur Physik. B. 10. S. 294./Eds E. Klose,
B. Wilhelmi.— Leipzig, 1986.
25. Sato S.-I., Ito M., Inaba H. et al. // Opt. and Quant. Electron.-
1986. V. 18. P. 81.
26. KittrelC., WillettR.L.,delosSantos-Pacheo C. etal. Ц Appl. Opt.—
1985. V. 24. P. 2280, Oraevsky A. A., Letokhov V. S., Ragi-
mov S. E. et al.I/Lasers in the Life Sciences.—1988. № 2(4). P. 257.
27. Chappelle E. W., Wood F. M., Games Gr. // Appl. Opt.— 1984.
V. 23. P. 134; Chappelle E. W., Frank M. W.t Newcomb J. W. //
Ibid. P. 139.
28. Mcfarlane J. C., Watson R. D., Iteisen A. F. // Ibid.— 1980;'
V. 19. P. 3287.
29. Фадеев В. В. // [П. 13]. С. 2221.
30. Фадеев В. В., Клышко Д. Н., Рубин Л. Б. и др. Ц Оптические
методы изучения океанов и внутренних водоемов.— Новоси-
бирск: Наука, 1979.
31. Бункин А. Ф., Власов Д. В., Галумян А. С. и др. Ц ЖТФ.—
1984. Т. 54. С. 2190.
32. Бункин А. Ф., Суровегин А. Л. // Океанология. —1986. Т. 26.
С 532
33. Hoge F. E.t Swift R. N. // Appl. Opt.—1983. V. 22. P. 2272.
34. Клышко Д. H., Фадеев В. B+// ДАН СССР.—1978. Т. 238.
С. 320.
35. Иванов И. Г., Фадеев В. В. Ц Квант, электроника.—1988. Т. 15.
С. 191.
К заключению
1. Летохов В. С. Лазерная фотоионизационная спектроскопия.—
М.: Наука, 1987.
2. Дитце У., Хайденрайх А., Мау ль В. // Йенское обозрение.—
1983. №3. С. 144.
3. Sumino К., Yamanoto R.t Hatayama F. Ц Anal. Chem.—1980.
V. 52. P. 1064.
4. Быковский Ю. А., Тимошин В. T., Шамонов И. И. Ц Лазеры
в народном хозяйстве: Материалы конф.—М.: Изд. МДНТП
им. Ф. Э. Дзержинского, 1986. С. 104.
5. Shmidt Р. F., Zumkley Н. // J. Phys. (Fr).—1984. Т. 45. Р. 569.
6. Charnel A., Eley J. F. // Ibid. Р. 573.
7. Комлева А. А., Беняев Н. Е., Арефьев И. М. // Медицинская
техника.—1985. № 1. С. 25.
8. Арефьев И. М., Беняев Н. Е., Комлева А. А. и др. Ц Журн.
аналит. химии,—1986. Т. 41. С. 50.
Научное издание
ПРИЕЗЖЕВ Александр Васильевич
ТУЧИН Валерий Викторович
ШУ БОЧКИН Лев Петрович
ЛАЗЕРНАЯ ДИАГНОСТИКА
В БИОЛОГИИ И МЕДИЦИНЕ
Серия «Проблемы науки и технического
прогресса»
Заведующий редакцией Л. И. Гладнева
Редактор Н. А, Михалина
Младший редактор В, А. Кузнецова
Художественный редактор Т. Н. Кольченко
Технический редактор С. Д. Шкляр
Корректоры Е. Ю. Рычагова, Н. Д, Дорохова
ИБ № 32805
Сдано в набор 27.02.89. Подписано к печати
04.08.89. Формат 84X108/32.
Бумага тип. № 1. Гарнитура литературная.
Печать высокая. Усл. печ. л. 12.6.
Усл. кр.-отт. 13,02. Уч.-изд. л. 14,04.
Тираж 7000 экз. Заказ № 1168. Цена 1 р. 60 к.
Ордена Трудового Красного Знамени
издательство «Наука»
Главная редакция
физико-математической литературы
117071 Москва В-71, Ленинский проспект, 15
Ордена Октябрьской Революции и ордена
Трудового Красного Знамени МПО
«Первая Образцовая типография»
Государственного комитета СССР по печати
113054 Москва М-54, Валовая, 28
Отпечатано в тип. № 11
Госкомпечати СССР.
113105, Москва, Нагатинская ул., д. 1,
зак. 1371
Лазерная диагностика в биологии и медицине —
новое перспективное направление в фотобиологии, яв-
ляющееся эффективным средством изучения биологи-
ческих систем различной степени организации — от био-
молекул до клеток, биотканей и отдельных органов
животных и человека.
Методы лазерной макро- и микродиагностики обла-
дают высокой чувствительностью, значительным про-
странственным разрешением и универсальностью. Они
перспективны для ранней диагностики рака, катаракты,
различных заболеваний крови и др. Их используют для
анализа загрязнений окружающей среды токсическими
и патогенными веществами. С их помощью изучают
сверхбыстрые процессы фотосинтеза и фотобиохимиче-
ских реакций, а также определяют малые скорости
кровотока в сосудах, подвижность бактерий и пр.