О. н ЕЛИЗАРОВА, Л. В. ЖИДКОВА, Т. А. КОЧЕТКОВА
ПОСОБИЕ ПО ТОКСИКОЛОГИИ ДЛЯ ЛАБОРАНТОВ

Библиотека среднего медицинского работника
О. Н. Елизарова, Л. В. Жидкова, Т. А. Кочеткова
Пособие по токсикологии для лаборантов
Москва «Медицина» 1974
УДК 615.9:658.382.3
РЕФЕРАТ
Настоящее пособие содержит основные сведения о технике работ лаборанта в специальных токсикологических лабораториях или работающих по проведению токсикологического эксперимента в других научных и практических учреждениях, в том числе в санитарно-эпидемиологических станциях. В книге приводятся требования, предъявляемые к лаборантам-токсикологам, излагаются их обязанности, а также меры безопасности при работе с ядовитыми веществами и лабораторными животными. Книга состоит из трех частей: 1) санитарно-токсикологические исследования, 2) лабораторная техника при химических и биохимических исследованиях, 3) техника патологоана-томнческого вскрытия животных и обработка материалов. В части 1 изложены уход и обращение с лабораторными животными, описываются методы введения ядовитых веществ различными путями (ингаляционно, перорально, накожно, внутрибрюшинно и т. п.), дается понятие, как определить токсическое действие веществ в опытах на животных, перечисляются наиболее простые методы, применяемые в санитарно-токсикологическом эксперименте (взятие крови и призмы клинического анализа крови, определение суммаци-онной способности центральной нервной системы и др.). В части 2 даются сведения, необходимые лаборанту при проведении химических и биохимических анализов (виды лабораторной посуды и обращение с ней, реактивы, их очистка, общие приемы биохимического анализа — приготовление растворов, реактивов, техника титрования). В части 3 приводится техника патологоанатомического вскрытия. Даются краткие сведения об анатомо-физиологических особенностях лабораторных животных, методы умерщвления и подготовка животных к вскрытию. Указывается, как подготовляется материал к гистологической обработке. В книге освещены только те приемы и методики, проведение которых входит в обязанности лаборанта.
Пособие рассчитано на лаборантов со средним медицинским образованием, работающих в соответствующих учреждениях по проведению токсикологического эксперимента.
Елизарова Ольга Николаевна, Жидкова Любовь Вильгельмовна, Кочеткова Тамара Александровна.
ПОСОБИЕ ПО ТОКСИКОЛОГИИ ДЛЯ ЛАБОРАНТОВ
Редактор Н. В. Климкина Художественный редактор Н. И. Гурова Корректор И. С. Парфенова Техн, редактор Л, Н. Вязьмина
Сдано в набор 7/XII 1973 г. Подписано к печати 28/Ш 1974 г. Формат бумаги 84X108’/32, печ. л, 5,25 (условных 8,82 л.) 8,85 уч.-изд. л. Бум. тип. № 2. Тираж 15000 экз. Т06729. МБ-53. Цена 24 коп.
Издательство «Медицина». Москва, Петроверигский пер., 6/8.
г. Куйбышев, пр, Карла Маркса, 201. Тип. изд-ва «Волжская коммуна». Заказ № 8178.
50200 -109
Е 039(01)-74	357'74
© Издательство «Медицина» Москва, 1974
Введение
В настоящее время химия бурно развивается и вторгается во вое области народного хозяйства, во все стороны жизни и быта. Синтезируется много новых химических соединений. Но раньше, чем внедрить их в практику, необходимо выяснить, не будут ли они оказывать вредное воздействие на организм человека непосредственно или через какой-то промежуток времени.
Оценкой степени вредности химических веществ, находящихся во внешней среде, занимается санитарная токсикология. Она изучает свойства токсических (ядовитых) веществ и вызываемые ими патологические изменения в организме человека и животных. Ее целью является распознавание ранних признаков отравления, ближайших и отдаленных последствий вредного действия тех или иных химических соединений на человека и его потомство. Для этого надо выяснить, какие количества химиката являются смертельными (т. е. вызывающими смерть), какие вызывают отравление и, наконец, установить недействующие на организм количества, которые могут быть приняты как предельно допустимые. Для выяснения всего этого проводят токсикологические эксперименты (опыты) на лабораторных животных. Все полученные в опыте сведения составляют токсикологическую характеристику вещества. Зная ее, можно предложить те или иные меры предупреждения (профилактики) и не допустить вредного влияния веществ на организм человека.
Токсикологические исследования проводит врач-токси-колог с помощью лаборанта. Работа лаборанта-токсиколога ответственна и требует определенных навыков и знаний.
Эта книга ставит своей целью дать лаборанту основные сведения, необходимые для выполнения им токсикологических исследований.
1.	ТРЕБОВАНИЯ, ПРЕДЪЯВЛЯЕМЫЕ К ЛАБОРАНТУ-ТОКСИКОЛОГУ
О. Н. Елизарова
1.1.	Обязанности лвборанта
Специфика работы при проведении токсикологического эксперимента требует участия двух работников: врача и лаборанта. Часть работы лаборант выполняет самостоятельно. Лаборант должен приносить нужных животных в комнату, где производится опыт, а затем относить их в виварий, правильно рассадить по клеткам, взвешивать животных, определять у них физиологические показатели (константы): температуру тела, число дыханий и ударов сердца в минуту, вводить разными способами изучаемое вещество, брать у лабораторных животных кровь, собирать мочу и т. д., вместе с врачом проводить различные биохимические и физиологические исследования, помогать при забое животных и их вскрытии.
Лаборант должен знать основные принципы постановки токсикологического опыта и хорошо усвоить, что от его точной и аккуратной работы часто зависит исход опыта. Любая небрежность может погубить даже хорошо поставленный эксперимент.
В токсикологии нет «неважных» и «второстепенных» дел. Даже такое простое дело, как принести из вивария лабораторных животных, требует большого внимания: 1) нельзя перепутать животных, взять надо именно тех животных, которые идут в опыт; 2) при переноске не причинить животным какого-либо вреда, предупредить возможность простуды; 3) при возвращении животных в виварий правильно рассадить их по клеткам и т. д.
Во всех затруднительных или непонятных случаях лаборант обязан немедленно обращаться за разъяснением к врачам-экспериментаторам. Нужно спрашивать о непонятном — лучше несколько раз задать вопрос,
4
чем испортить опыт. Если лаборант допустил какую-либо ошибку в исследованиях, испортил прибор, то он должен сообщить о случившемся. При своевременном сообщении о происшедшем в ряде случаев опыт еще можно спасти: не работать на неисправном приборе, ввести поправки в полученные данные. В крайнем случае исследователь будет знать, что на результаты данного опыта опираться нельзя, а отсюда не будут приняты ошибочные выводы, что имеет гораздо более серьезное значение, чем даже погибший опыт. Опыт можно повторить, прибор исправить, а неправильная оценка опыта может привести к неверным выводам.
Во время работы лаборант должен быть внимательным и наблюдательным. Только внимательно наблюдая за животными, можно заметить самые первоначальные признаки их отравления или заболевания. О всех наблюдениях, даже как будто маловажных, следует сразу же сообщить врачу-экспериментатору.
От каждого опыта мы ждем каких-то, иногда заранее в какой-то степени предугадываемых результатов. Но никогда нельзя принимать желаемое за действительное. Если опыт не дал тех результатов, которых мы ожидали, это не так уж плохо. Следует помнить, что правильно проведенный опыт, хотя и не давший желаемых результатов, представляет ценность для дальнейшей работы.
Лаборант должен быть внимателен и ко всему окружающему. Например, наличие постороннего запаха в комнате может сигнализировать о том, что газообразное вещество каким-то образом проникает в воздух помещения. iB этих случаях необходимо принять срочные меры во избежание отравления находящихся в комнате.
От лаборанта требуется аккуратность во всех проводимых работах. Особенно аккуратно и бережно надо обращаться с приборами, аппаратами, специальным оборудованием, часто очень дорогостоящим. Следует аккуратно, умело и бережно обращаться с лабораторными животными (о правилах обращения с лабораторными животными будет сказано дальше). Аккуратность лаборанта проявляется и в том, как он содержит свое рабочее место, и во всем внешнем его облике. Об этом будет подробно сказано в разделе 3.
5
1.2.	Возможность ошибок и как их избежать
Чаще всего ошибки возникают от неумения. Лаборанту необходимо хорошо освоить технику работы на приборах, аппаратах, технику выполнения главнейших лабораторных работ. Следует всегда строго и пунктуально выполнять правила работы, какими бы малозначительными они не казались. Работать надо только на исправных приборах, с правильно приготовленными реактивами. Следует учитывать ряд факторов, имеющих значение для всех исследований, например биологические особенности лабораторных животных, условия нормального их существования в виварии и др.
Лаборант должен стремиться повышать свою квалификацию, читать и изучать специальную литературу. Знание своего дела — вот то главное, _что прежде всего помогает избежать ошибок в работе.
Лаборант должен рационально использовать свое время, стремиться быстрее -и лучше выполнить порученную ему работу, не отвлекаться от работы по неслужебным делам. В результате невнимательного отношения к работе может быть упущено время исследования, не зафиксированы вовремя показания прибора и др.
2.	МЕРЫ БЕЗОПАСНОСТИ В ЛАБОРАТОРНОЙ РАБОТЕ
Лаборант обязан знать меры безопасности в лабораторной работе и неукоснительно их выполнять.
При проведении токсикологических исследований необходимо защитить одежду и кожу от воздействия химических соединений, реактивов, от непосредственного соприкосновения с животными.
Лаборант должен работать в медицинском хлопчатобумажном халате, желательно с завязками сзади. Такой халат лучше предохраняет одежду от загрязнения. Цвет халата белый или синий. Рекомендуется поверх халата надевать нарукавники.
При попадании на халат химических веществ, особенно ядовитых, а также щелочей и кислот следует немедленно его снять, тщательно замыть водой с мылом. При попадании даже разбавленных кислот или щелочей на платье или чулки их необходимо также снять и замыть водой с мылом. Следует помнить, что кислоты
6
разрушают ткань из растительных волокон, а едкие щелочи — ткани из шерсти и натурального шелка. Выносить спецодежду для стирки запрещается.
При работе с животными, а также с едкими или ядовитыми веществами, при мытье посуды, вскрытии животных поверх халата надевают фартук — резиновый, клеенчатый или пластиковый, нарукавники и в случае надобности — резиновые перчатки. Фартук легко вымыть и продезинфицировать.
Нельзя допускать попадания химических веществ, кислот и щелочей на кожу рук. Для предотвращения этого служат резиновые перчатки. Резиновые перчатки необходимы также при общей уборке лаборатории, клеток животных или камер, мытье посуды. Обычно с животными можно работать без перчаток и только в отдельных случаях (например, агрессивные или очень грязные животные) приходится ими пользоваться. Более грубые работы выполняются в толстых анатомических перчатках. При работе с реактивами, мытье посуды и т. п. требуются тонкие хирургические перчатки для сохранения чувства осязания. После работы перчатки, не снимая с рук, хорошо моют с мылом, насухо вытирают полотенцем, обсыпают мелом или тальком. После этого перчатки снимают, выворачивают наизнанку, а руки моют с мылом и смазывают кремом.
Если производилось вскрытие животных, перчатки перед мытьем дезинфицируют 0,5% раствором хлорамина или другим дезинфицирующим раствором. В случае попадания на перчатки сильно ядовитых веществ перчатки тотчас же дегазируют (обезвреживают) специальным дегазатором или промывают обильной струей воды. При попадании химических веществ, кислот и щелочей на кожу рук их немедленно снимают ватным тампоном, затем обильно промывают большим количеством воды, если нужно — прибегают к помощи дегазатора.
На голову лаборант надевает косынку или медицинский колпак для защиты волос и кожи. Особенно это важно при непосредственной работе с животными или ядовитыми веществами. Недопустимо в лабораторных условиях носить длинные волосы распущенными.
При работе в лаборатории следует беречь глаза от попадания в них химических веществ. Для этого пользуются защитными очками. При всех работах, связан-
7
них с возможным повреждением глаз (например, засорение при растирании или просеивании твердых веществ, при переливании горючих, едких, ядовитых, летучих жидкостей и т. п.), надевают очки. Очки должны плотно прилегать к лицу. Целесообразны очки из оргстекла, которые не дают осколков при их повреждении. При случайном попадании в глаз вещества или посторонних предметов необходимо немедленно промыть глаз большим количеством воды и обратиться к врачу-специалисту.
Настоятельно рекомендуется для работы в лаборатории иметь специальное хлопчатобумажное платье с короткими рукавами и удобную обувь. Туфли для работы в лаборатории должны быть на устойчивом небольшом каблуке. Туфли на высоких и тонких каблуках вызывают неуверенность в движениях, шаткую походку, что может привести к неприятным неожиданностям.
Лаборант, работая с животными, должен стремиться не загрязнять свое платье и другие предметы. Так, не разрешается держать руки в карманах халата. Грязные руки, которыми только что брали животных, опущенные в карманы, загрязняют халат. Затем уже вымытые руки, вновь опущенные в карманы, снова загрязняются. Нельзя трогать руками, не вымытыми после работы с животными, лицо, волосы и т. п. Карандаши, ручки, с которыми работали во время опытов с животными, по окончании работы протирают дезинфицирующими растворами (например, этиловым спиртом).
Категорически запрещается на рабочем месте принимать пищу. Есть и пить можно только в специально отведенном помещении после того, как будут сняты фартук, перчатки и тщательно вымыты руки.
Во время работы курить запрещается. Особенно это касается рабочих помещений. Запах табака маскирует запах химических соединений, в том числе и высокотоксичных. Курение притупляет обоняние, что также нежелательно для токсикологов.
Если приходится работать с весьма ядовитыми веществами, особенно когда количества их значительны (например, при переливании яда из одной склянки в другую), следует надевать противогаз. Противогаз всегда должен висеть около вытяжного шкафа, им пользуются в аварийных случаях.
8
Лаборанта осведомляют о токсичности, взрыво- и огнеопасности всех веществ, с которыми работают в лаборатории. Он должен твердо знать правила работы с ними и ликвидации возможных аварий. При отсутствии этих сведений следует обращаться с веществом, как с ядовитым, принимая все меры предосторожности при работе с ним. Первые опыты следует проводить с минимальными количествами, вещества.
Следует учитывать, что многие вещества в смеси приобретают взрыво- и огнеопасные свойства. Например, марганцовокислый калий в смеси с органическими веществами становится взрывоопасным; пикриновая кислота, раствор которой часто применяется при маркировке животных, находясь в сухом виде при соединении с некоторыми веществами, взрывоопасна. Малоядовитые слаболетучие вещества при повышении тем-ратуры могут стать летучими и резко повысить свою токсичность.
Лаборант должен всегда помнить некоторые правила, которые обеспечивают безопасность работы. Так, запрещается натягивать ртом в пипетку токсические вещества, кислоты и щелочи. Для этого используют резиновые груши, соединенные с пипеткой, резиновой трубкой. Постепенное ослабление сжатой до этого резиновой груши заставляет жидкость поступать в пипетку, конец которой опущен в нее. В самый верх пипетки следует вложить небольшой рыхлый комочек ваты, чтобы вещество не вышло за пределы пипетки.
В помещении, где производится работа с особо опасными веществами, лаборант не может работать один, в комнате должен находиться и второй сотрудник.
Запрещается работать с большим количеством яда. Для работы следует под тягой отлить небольшое количество токсического вещества, нужное для работы, а остальное поставить в место, где предусмотрено хранение ядов.
Место, где ведется работа с легковоспламеняющимися веществами, должно быть очищено от всех горючих материалов, а вблизи размещают средства для тушения огня (сухой чистый песок, асбестовый картон и т. п.).
При работе с легковоспламеняющимися летучими веществами не допускается в помещении зажигание
9
спичек, горелок, электрических плиток с открытой спиралью и т. п.
Ткань, на которую попали капли растворов окислителей, легко воспламеняется от малейшего нагрева, поэтому нельзя допускать попадания их на одежду. Нужно следить за тем, чтобы струя из кислородного баллона также не попадала на одежду, так как может произойти самовоспламенение даже незагрязненной одежды. Легколетучие и огнеопасные вещества подогревают только на водяной бане, при этом колбу с веществом опускают в холодную воду, а затем уже включают подогрев.
В лаборатории часто используют баллоны со сжатым газом, находящимся иногда под давлением до 150 атм. С баллонами следует обращаться осторожно, так как они взрывоопасны. В помещении разрешается ставить только один баллон вдали от нагревательных или отопительных приборов. Нельзя устанавливать баллон в местах, освещаемых прямыми солнечными лучами. Баллон не должен соприкасаться с электрическими проводами. Переносят баллоны на специальных носилках или тележках. Нельзя подвергать баллоны толчкам или ударам. Подобрав удобное место, баллон нужно надежно закрепить, чтобы он не мог упасть. Подача газа из баллонов должна производиться через исправный редуктор, предназначенный для данного газа. Открывать вентиль баллона следует постепенно. Слишком быстрый выпуск газа также может вызвать взрыв.
Обычно в каждой токсикологической лаборатории имеются правила по соблюдению мер безопасности, составленные с учетом местных условий. Лаборант должен хорошо знать эти правила и неукоснительно их выполнять.
3.	РАБОЧЕЕ МЕСТО ЛАБОРАНТА
Рабочих мест у лаборанта может быть несколько — это зависит от характера выполняемой работы. Так, взвешивание, маркировка животных, взятие у них крови, вскрытие обычно проводят в специальных комнатах, чаще всего в помещении вивария. Обработка полученного материала, постановка биохимических реакций могут проводиться в лабораторных комнатах, где у лаборанта имеется постоянное рабочее место.
10
Лаборант должен уметь правильно оборудовать и организовать свое рабочее место. Рабочее место, его содержание характеризуют работу лаборанта. Прежде всего рабочее место нужно содержать в полной чистоте и порядке. Поверхность лабораторного стола покрывают пластиком или линолеумом. Не следует ставить непосредственно на поверхности стола склянки с крепкими кислотами и щелочами —даже небольшие их количества разъедают поверхность стола. Нагретые колбы и другую лабораторную посуду можно ставить только на подкладки из асбеста или пластика.
Нельзя класть на поверхность стола стекло или другое твердое покрытие, так как в этом случае посуда легко бьется, что может привести к порче опыта и несчастному случаю. Все манипуляции с химическими веществами производят только над поверхностью лабораторного стола или вытяжного шкафа. Следует работать аккуратно, не рассыпать и не разливать химикаты по столу, избегать попадания химических соединений на стол и окружающие предметы. Если вещество все же разлито, то жидкость нужно быстро собрать асбестом, засыпать песком или вытереть ватой, тряпкой, а затем промыть поверхность стола водой или соответствующим нейтрализатором и дегазатором. Так же поступают и при просыпании твердых веществ. Следует знать, что именно нужно применить в каждом случае. Лучше, если соответствующие указания будут вывешены около лабораторного стола. Дегазирующие и нейтрализующие вещества, а также противопожарные средства хранят в определенном месте, вблизи лабораторного стола.
При ликвидации последствий разливания вещества надо или работать в толстых резиновых перчатках, или прибегать к помощи инструментов, например держать тряпку пинцетом, не прикасаясь к ней руками.
Грязь не допустима на лабораторном столе. Если на столе работают с животными, необходимо поверхность стола покрывать клеенкой, полиэтиленовой пленкой или в крайнем случае бумагой, чтобы животные не запачкали стол кровью или испражнениями. На столе, где проводят обработку материалов и стоят точные приборы, с животными не работают.
Рабочее место не должно быть загромождено посторонними предметами. На нем должно находиться только то оборудование, которое нужно в данный момент. Все
11
остальное убирают со стола на полки, в ящики, в шкафы. В лабораторных столах обычно имеются полки и ящики. В них хранят инструменты, мелкие приборы, реактивы и др. На каждой склянке с реактивом, которая находится на полках лабораторного стола, должна быть наклейка с четкой надписью, указывающей наименование вещества, его крепость, дату приготовления, фамилию лаборанта, приготовившего реактив. Наклейки можно делать бумажные или, что удобнее, из кусочков лейкопластыря. Надписи делают тушью или цветными карандашами. Нельзя писать чернилами или чернильным карандашом, потому что такие надписи растекаются при попадании на них влаги. Надписи непосредственно на стеклянной посуде делают специальным карандашом — стеклографом, но лишь на короткое время. Постоянных надписей карандашом делать нельзя, так как они при работе постепенно стираются. Смываются надписи со стекла теплой водой с содой.
Около каждого рабочего стола ставят склянки для слива и нейтрализации отработанных жидких материалов и ящики или лотки для использованной посуды. Посуду перед тем, как ее мыть или сдать на мойку, предварительно промывают водой или дегазируют (если в этом есть необходимость). Кроме того, в лаборатории должны быть ведра с крышками, открывающимися при нажиме на педаль ногой.
На верх полки ставят бутыль с дистиллированной водой. У бутыли должен быть тубус внизу, около дна. На тубус надевают резиновую трубку с зажимом, что позволяет удобно пользоваться водой.
В раковину нельзя выливать растворы кислот и щелочей, хромовую смесь, пахнущие, ядовитые вещества и др.
Растворы кислот и щелочей необходимо предварительно разбавить водой или нейтрализовать с тем, чтобы не разрушать канализационную сеть. Ядовитые вещества обезвреживают путем заливания их дегазатором. Дурно пахнущие вещества выливают только в раковину, которая находится в вытяжном шкафу.
На лабораторном столе нельзя работать с легковоспламеняющимися, ядовитыми и газообразными веществами — во всех этих случаях надо использовать вытяжной шкаф. Вытяжной шкаф имеет вентиляционную установку, благодаря которой воздух из шкафа вытягивается наружу на уровне крыши дома. Пуск вентилятора обыч
12
но производится нажатием кнопки. Нельзя оставлять вытяжной шкаф включенным на длительное время — могут перегореть моторы вентиляторов. Уходя, лаборант должен обязательно проверить, выключен ли шкаф. Если по каким-либо причинам тягу нельзя выключить, необходимо довести до сведения об этом руководителя лаборатории.
Вытяжной шкаф имеет задвижки, которыми можно открыть или закрыть доступ воздуха в шкаф. Перед началом работы надо проверить, не закрыты ли задвижки. Передняя застекленная стенка вытяжного шкафа подвижна. При работе с опасными веществами следует опустить стенку на такую высоту, чтобы можно было только просунуть под нее руки. Не разрешается в вытяжной шкаф засовывать голову. Полностью стеклянную стенку вытяжного шкафа опускать не следует, так как это затруднит поступление воздуха. Перед началом' работы следует проверить, имеется ли тяга. Для этого зажигают спичку и подносят близко к дверце шкафа. Если тяга работает, огонь отклонится в сторону двери. Часто можно выявить движение воздуха в вытяжной шкаф по ощущению дуновения ветра на руке, поднесенной к шкафу. Дым от сгоревшей бумажки должен втягиваться внутрь шкафа. Около вытяжного шкафа, как уже говорилось, вешают противогаз.
Около рабочего места помещают аптечку с необходимыми медикаментами, например настойку йода, соду питьевую, марганцово-кислый калий, «зеленку», нашатырный спирт, борную кислоту, лейкопластырь, стерильный бинт, раствор альбуцида для закапывания в глаза, чистый вазелин, смесь для рук и др.
Смесь для рук готовят следующим образом: 27 мл глицерина смешивают с 3 мл дистиллированной воды, добавляют 10 мл 3% раствора перекиси водорода и 10 мл 10% раствора аммиака. Можно добавить несколько капель одеколона.
Можно приготовить 3% раствор перекиси водорода нз пергидроля, который является 30% перекисью водорода; 10% раствор аммиака — из раствора водного аммиака (25% раствор). Нужно знать, что нашатырным спиртом называют 10% водный раствор аммиака. Для дезинфекции рук применяют 5% раствор хлорамина, 70% раствор этилового спирта и др.
13
часть
Санитарно-токсикологические исследования
О. Н. Елизарова
4.	УХОД И ОБРАЩЕНИЕ С ЛАБОРАТОРНЫМИ ЖИВОТНЫМИ
4.1.	Виды лабораторных животных
Токсикологические исследования проводят на мелких лабораторных животных: мышах, крысах, морских свинках, кроликах, кошках, собаках. В последнее время начали применять для опытов хомячков. Мышей, крыс, морских свинок, разводят в специальных питомниках. У мышей и крыс может быть различная окраска шерсти. Чаще работу проводят на белых беспородных мышах и крысах. Но есть мыши и крысы, выведенные для специальных целей. Таких мышей называют линейными. Есть высокораковые линии мышей, которые очень чувствительны к раковым заболеваниям, есть, наоборот, низкораковые линии — они устойчивы к заболеванию раком. Линейные мыши бывают различной расцветки — черные, коричневые, серые и др. Животных каждой линии содержат отдельно.
Морские свинки также бывают различных пород. Для эксперимента используют короткошерстных животных.
Породы кроликов делятся на мясных, которые обладают большим весом — до 5 кг и больше, и пуховых — с длинной шерстью. В лабораториях чаще используют кроликов породы шиншилла. Цвет шерсти серый, вес взрослых животных в возрасте одного года 3—3,5 кг.
Кошек и собак обычно поставляют в лаборатории ветеринарные пункты. В работе используют беспородных собак, так называемых дворняжек: породистые собаки более прихотливы, плохо переносят содержание в клетке, менее устойчивы к заболеваниям.
14
4.2.	Содержание животных и уход за ними
В научно-исследовательских и практических учреждениях, где ведутся работы на животных, обычно последних содержат в виварии, обслуживаемом специальными лицами. Но в некоторых случаях, когда виварий отсутствует или если по ходу опыта необходимо повседневное наблюдение за животными, заботы о содержании и кормлении животных переходят на лаборанта.
Опыты проводят только на здоровых животных. Поэтому правильному содержанию и кормлению животных придается большое значение. Непорядки в содержании и кормлении животных отражаются на состоянии их здоровья, животные хуже переносят те химические ядовитые вещества, которые им вводят в эксперименте, в результате получаются недостоверные данные. Для правильного проведения опыта обязательным является постоянство условий содержания животных на протяжении всего эксперимента.
Как было сказано, животных обычно помещают в специальное помещение — виварий. Однако в ряде случаев их содержат в комнатах или в затравочных камерах (например, при круглосуточном воздействии ядов в течение нескольких суток или месяцев подряд). Желательно для Животных выделить специальную комнату. Помещение должно быть светлым, сухим, с равномерной температурой воздуха, хорошо вентилироваться, без сквозняков, которые мелкие животные особенно плохо переносят.
В одной и той же комнате не следует держать животных разных видов — это может способствовать распространению заболеваний. Нельзя размещать животных скученно, особенно мелких грызунов.
В помещениях, где находятся животные, должно быть тихо. При работе с животными не следует слишком громко разговаривать, кричать, петь, включать радио и т. п. Сильный шум может вызвать у кроликов резкие движения, которые ведут к перелому позвоночника и гибели животного.
Лабораторных животных обычно содержат в деревянных и металлических клетках. В стандартных клетках обычно содержат мышей по 20—25, мышат по 25—30, крыс взрослых по 8—10, крысят по 15—20, морских свинок по 5—6.
15
Лучше сразу размещать животных в клетку в таком количестве, какое требуется для опыта. Пересадки и подсадки животных из одной клетки в другую нежелательны, так как при этом животные дерутся и могут себя покалечить. Не разрешается (кроме специально поставленных опытов) помещать в клетку самцов и самок— беременность изменяет состояние организма жи-вотных и может испортить весь эксперимент. Только в опытах с размножением в определенные сроки к самкам подсаживают самцов. Как проводить эти опыты, будет сказано ниже.
Клетки надо ежедневно чистить. Для каждой клетки желательно иметь свой скребок, которым чистят клетки. Если скребки общие, то после уборки каждой клетки необходимо их дезинфицировать. В качестве подстилки используют опилки, бумагу, особенно для мышей.
Мышей можно содержать в высоких стеклянных банках или металлических коробках, закрывающихся крышками с проделанными отверстиями для прохождения воздуха. Стеклянные банки и металлические коробки ежедневно не чистят, а через 3—4 дня их заменяют на чистые, использованные же моют и дезинфицируют.
Желательно, чтобы кормушки и поилки были закреплены каждая за определенной клеткой. Масляной краской на кормушках пишут номер клетки. О поилках более подробно будет сказано ниже.
Раз в 10—15 дней все клетки меняют, использованные дезинфицируют. Для этого металлические клетки можно обжечь пламенем паяльной лампы или газовой горелки, облить кипятком. Чаще для обработки клеток, кормушек и инвентаря применяют химические способы— обработку 3—5% раствором хлорной извести, фенола, лизола, креолина, формалина, хлорамина. Дезинфицировать клетки в том же помещении, где находятся животные, не разрешается. Клетки выносят, обрабатывают и вносят обратно только после того, как полностью исчезнет запах дезинфицирующего вещества. Нельзя посыпать клетки с животными инсектицидами — ДДТ, гексахлораном, пиретрумом, хлорофосом и др. Даже малые количества этих препаратов могут оказать вредное влияние на животных. Нельзя, борясь с блохами и клопами, посыпать шкурку животных инсектицидами — это обычно приводит к отравлению и гибели животных.
16
Помещение, где находятся животные, надо хорошо убирать, проветривать (не допуская сквозняков), мыть ' пол слабыми дезинфицирующими растворами.
Большое внимание обращают на кормление животных. Только полноценное, нормированное питание может обеспечить правильное развитие животных, а отсюда и правильное проведение опыта. Для достижения единообразного питания всех животных следует руководствоваться нормами, разработанными Министерством здравоохранения СССР. Корм животным дают 2 раза в день. В клетке всегда должна быть свежая вода. Мышам дают только кипяченое молоко и кипяченую воду.
Животные могут болеть различными инфекционными заболеваниями. Инфекция быстро распространяется, могут погибнуть все животные, которые находятся в данном помещении. Чтобы не занести инфекцию в виварий, всех вновь поступающих животных помещают в отдельное помещение и они проходят 2-недельный карантин. За состоянием животных тщательно наблюдают. Только здоровых животных после карантина можно помещать в общие помещения вивария.
Следует помнить, что и человек может заразиться некоторыми болезнями от животных. Особенно опасны грибковые заболевания. Поэтому необходимо строго соблюдать все правила личной гигиены, о которых было сказано выше.
Человек может заразить животных вирусными заболеваниями (грипп и др.), туберкулезом и др. Поэтому в период вспышек гриппа работать с животными следует в масках. Маски делают из марли, широкого бинта или, хлопчатобумажной ткани. Марлю складывают в 6—8 слоев, ткань предварительно стирают, гладят и складывают вдвое. Размер маски 10X15 см. К углам маски пришивают тесемки, которые завязывают сзади на затылке и шее. Маска должна закрывать не только рот, но и нос.
Если есть подозрение, что животные заболели (плохо едят или совсем отказываются от еды, сидят или лежат неподвижно, шерсть взъерошена, имеются изменения стула, например понос, и т. п.), надо срочно вызвать ветеринарного врача, чтобы поставить диагноз заболевания и прлаесхи соответствующее лечение. До
17
прихода ветеринарного врача заболевших животных нужно изолировать от здоровых.
О каждом изменении во внешнем виде и поведении подопытных животных следует немедленно сообщать экспериментатору, с которым работает лаборант.
4.3.	Как брать животных
С лабораторными животными надо обращаться бережно, по мере возможности не причинять им боли. Следует помнить, что сильные болевые ощущения вызывают ряд изменений в организме животных.
Мышей обычно берут за хвост рукой. Во избежание ранений рук с мышами лучше работать в хирургических перчатках.
Крыс и морских свинок берут за туловище одной рукой сразу под передними лапами, другой — ближе к задним лапам, не сдавливая их сильно (рис. 1). Только животных с ярко выраженным агрессивным поведением (вследствие действия вводимого яда или причиненной им ранее боли) берут корнцангом за шкурку между ушами, в это время другой рукой придерживают животное за хвост, слегка растягивая его. С этими животными лаборант может работать в толстых перчатках (резиновых анатомических, шерстяных или кожаных).
Кроликов берут за шкурку одной рукой на уровне тазового пояса, другой на уровне плечевого пояса вместе с ушами (рис. 2). Нельзя допускать, чтобы кролики делали резкие движения. Такие движения легко вызывают у животных перелом позвоночника.
Кошек берут так же, как кроликов, только не захватывают ушей. Посадив кошку на стол, прижимают ее к поверхности стола и забинтовывают лапки или надевают на них кожаные или матерчатые мешочки, затянув их выше сустава. Этим лаборант обезопасит себя от когтей кошки.
Обращаться с животными надо ласково. И кошки, и собаки это прекрасно понимают. Крысы привыкают к экспериментатору и, если не причинять им боли, делаются ручными.
Очень часто по ходу работы надо животное обездвижить (иммобилизировать). Для этого мышей сажают в широкую короткую пробирку с вырезанным в дне отверстием для дыхания и закрывают пробкой с отвер-
18
Рис. 1. Как надо держать крысу.
стаем для хвоста. Можно шкурку мыши между ушами захватить корнцангом или просто деревянной держалкой для пробирок, конец которых закрепляется в штативе. Мышь при этом придерживают за хвост.
Для обездвиживания крыс широко применяются станки (домики) из жести или пластмассы. С одной стороны «домик» заканчивается дверцей с отверстием для хвоста, а с другой — подвижной конусообразной вставкой, куда помещают голову крысы. На верхнем конце «домика» имеется прорезь, по которой движется винт с гайкой, прикрепленной к конусу. Так как вставка движется, всегда возможно подогнать домик к величине крысы и закрепить гайкой. Размер станка 19,5X7X6,5 см. Станки надо держать в чистоте, мыть их после каждого использования. Иногда по бокам «домика» делают отверстия с тем, чтобы можно было бы производить инъекции, не вынимая животное.
Для обездвиживания и переноски кроликов и кошек имеются специальные ящики с овальным отверстием в Передней стенке для головы. Ящики тоже надо периодически промывать, обливать кипятком и дезинфицировать.
Животных можно иммобилизировать, привязывая их к доске для лабораторных животных. Для этого на лапки надевают петли-удавки: для мышей берут суровые толстые нитки, для крыс, морских свинок — шнурки, тонкие бечевки и т. п., для кроликов и кошек лучше всего подходят марлевые бинты.
Петли-удавки, которые накладывают на конечности животных, должны быть размещены выше первых су-
19
Рис. 2. Как надо держать кролика.
ставов, иначе резкое движение может вызвать перелом лапки.
Привязывают животных к доске обычно два сотрудника— один фиксирует животное руками, другой надевает на лапки животного петли-удавки. Пока животное не будет полностью привязано, выпускать его из рук нельзя. Мышей, крыс, морских свинок держат за шкурку около ушей (рис. 3). Животных нужно хорошо растянуть на доске, иначе мыши и крысы могут перегрызть завязки, а кролики начинают сильно биться.
Привязывая кролика, один сотрудник переворачивает животное на спину и удерживает туловище руками, положенными на грудной и брюшной областях, второй в это время привязывает лапки кролика к концам доски.
Можно привязать кролика и одному лаборанту. Надо взять животное за шкурку одной рукой в области плечевого пояса, а другой рукой в области тазового пояса приподнять вверх, поднести к краю стола и осторожно положить кролика на бок, фиксируя его туловище и задние лапки между своими плечом и грудью. Руки лаборанта остаются свободными, и он привязывает передние лапки, затягивая заранее наложенные на них петли-удавки. Затем, придерживая туловище кролика одной рукой, поворачивается лицом к задним конечностям животного и вновь зажимает его туловище между своим
20
Рис. 3. Как привязывают крысу к доске. Один сотрудник привязывает лапки, другой держит животное за шкурку между ушами.
Рис. 4. Кролик, правильно привязанный к доске для лабораторных животных.
Рис. 5. Станок для собак.
плечом и грудью. Освободившимися руками лаборант привязывает задние лапки кролика.
У привязанного кролика лапки должны быть выпрямлены. Доска для привязывания экспериментальных животных имеет обычно несколько колышков (гвоздей, зажимов или вырезок); следует подобрать такие, чтобы животное оказалось растянутым (рис. 4). Нельзя оставлять привязанных животных без присмотра — во время бурных движений они вместе с доской могут упасть на пол.
к головному концу доски часто прикреплен голово-держатель — круг из толстой проволоки с наголовником, который надевают на морду животного. Голово-держатель закрепляют в штативе в нужном положении. Доски для привязывания животных можно сделать или в мастерской, или даже самому.
Собак также привязывают к доске для экспериментальных животных, только значительно большего размера. Передние лапы привязывают не непосредственно к колышкам, а сначала концы веревочных петель-удавок пропускают под спиной животного и затем уже
22
привязывают веревку от правой лапы на левую сторону доски, а от левой лапы на правую сторону доски. Лапы у собаки должны быть выпрямлены.
Собак можно фиксировать в станке. Станок представляет собой стол длиной 120 см, шириной 47—50 см, высотой 75—80 см. Над столом укреплена перекладина на высоте от поверхности стола 96 см. В перекладине провернуты отверстия, через которые вставляют четыре лямки-веревки, пропущенные в резиновые трубки. Лямки подводят под лапы собаки. Это, с одной стороны, обездвиживает животное, а с другой, — если собака долго стоит в станке, помогает ей стоять, опираясь на лямки (рис. 5).
4.4.	Маркировка животных
Каждое животное должно иметь свой номер, так как изменения, получаемые в результате воздействия ядов, изучают и фиксируют у каждого животного отдельно.
Собак и кошек не маркируют — достаточно описания внешнего вида животного (цвет шерсти и т. п.). Морских свинок обычно также не маркируют: перед началом опыта в тетради зарисовывают расположение и цвет пятен на теле животного. Если попадутся животные одинаковой расцветки, их маркируют так же, как кроликов.
Если эксперимент проводят на кроликах одинакового цвета, то их маркируют, делая наколки очередного номера на ушах. Выбирают место на внутренней поверхности уха ближе к корню. В иглу средней величины шприцем набирают черную тушь (или просто обмакивают в тушь) и накалывают очертания номера, прокалывая только самый поверхностный слой кожи.
Имеются готовые колющие номера на створке. При захлопывании обеих створок острия, предварительно смазанные тушью, вонзаются в кожу, фиксируя сразу весь номер. Не следует делать глубокие проколы, так как резкая боль, испытываемая кроликом, может повести к заболеванию.
Мышей и крыс обычно маркируют краской. Водорастворимые краски смываются быстро, поэтому лучше пользоваться спиртовыми растворами бриллиянтлппй зелени, пикриновой кислоты. С последней необходимо обращаться осторожно, так как, соединяясь с металла
23
ми и солями кальция, она в сухом виде образует взрывоопасные соединения. Раствор пикриновой кислоты безопасен. Можно применять краски, употребляемые в парикмахерских для окраски волос, с условием, чтобы они не содержали вредный для животных урсол. Метки делают небольших размеров, втирая краску против шерсти кисточкой, стеклянной палочкой и др. После нанесения краски фильтровальной бумагой прижимают окрашенное пятно, удаляя излишек краски, чтобы животное не слизало, а также не испачкало других.
Как правило, у каждого животного должна быть своя метка. Если даже животные рассажены в разные клетки, нельзя, чтобы метки повторялись в каждой клетке. Одинаковая маркировка не позволяет выяснить, из какой клетки взято данное животное. Маркировка всегда должна иметь определенную систему. Каждая метка соответствует определенному номеру, под этим номером животное и записывают. Наиболее удобный способ маркировки, когда единицы отмечают одним образом, а десятки— другим. Например, метка на левой передней лапке соответствует номеру 1, на правой передней —номеру 2, левой задней — номеру 3, правой задней — номеру 4; если помечены две передние лапки, то это номер 5, а две задние — номер 6, левые передняя и задняя — номер 7, правые передняя и задняя'—номер 8, все четыре лапки — номер 9, отметка на голове означает номер 10. Для получения следующих номеров метку на голове объединяют с метками на лапках. Так, метка на голове и на левой передней лапке будет означать номер 11, на голове и правой передней лапке — номер 12 и т. д. Для обозначения второго десятка ставят метку на спине; третьего десятка— у хвоста; на голове и спине — четвертого десятка; на спине и у хвоста — пятого десятка; на голове и у хвоста—шестого десятка; на голове, спине и у хвоста — седьмого десятка; отметка на левом боку обозначает восьмой десяток; на правом боку — девятый десяток; на обоих боках — сотню. Таким образом можно отмаркиро-вать ПО животных. Если в опыте их больше, то следующую сотню отмечают краской другого цвета. Можно применять и другие методы маркировки краской.
Некоторые маркируют мышей и крыс, делая надрезы на ушах или отрезая ногтевые фаланги пальцев. Для того чтобы узнать, как маркировано животное, его надо взять в руки, что замедляет работу, но зато метки эти
24
остаются на все время, а окраску надо периодически возобновлять.
При описании животных используют цифровой метод, метод словесного описания метки (например, «голова — хвост» и т. п.) или условного обозначения. Для этого животное изображают схематично в виде решетки из двух горизонтальных и двух вертикальных черточек. Левая сторона решетки соответствует левой стороне тела животного, правая сторона — правой, а середина обозначает среднюю часть тела животного. Верхняя часть решетки изображает передние лапки и голову животного, средняя часть — середину туловища, а нижняя часть — задние лапки и область хвоста. Метку животного наносят на соответствующие места решетки. Например, метку «голова— хвост» изображают двумя точками — одна в середине верхнего ряда, другая в середине нижнего ряда; метку «левая передняя — правая задняя» — одну точку наносят в левом верхнем углу решетки, а другую в правом нижнем углу.
5.	ПУТИ ПРОНИКНОВЕНИЯ ЯДОВИТЫХ ВЕЩЕСТВ В ОРГАНИЗМ
Химические соединения могут попадать в организм человека и животных различными путями: при вдыхании с воздухом —• ингаляционно (ингаляция — вдыхание), введении в желудок — перорально (per os — через рот), при нанесении на кожу — перкутанно (кутис — кожа). Это наиболее встречающиеся в практике пути внедрения ядовитых веществ в организм. Но есть и другие пути, например введение в вены, в брюшную полость, под кожу, внутрь мышцы, на слизистые оболочки, в частности в глаз, и т. п. Эти пути введения ядов нередко применяют в. эксперименте. '
Каждый путь введения ядов имеет свои характерные особенности. Скорость всасывания ядовитых веществ при различных способах введения неодинакова, неодинаковой может быть и картина отравления одним и тем же химическим соединением, но попавшим в организм различными путями.
При вдыхании вещество непосредственно соприкасается с очень большой поверхностью легких. Между клетками легочных пузырьков и кровеносными сосудами слой-
25.
в ряде мест имеет только две клетки, поэтому всасывание ядов в кровь из легких происходит очень быстро. Кровь при этом минует такой важный барьер, как печень.
При попадании в желудок химическое соединение соприкасается с различной средой и многочисленными ферментами в разных отрезках кишечника. Пища, находящаяся в желудке и кишечнике, уменьшает всасывание ядов. Многие яды в желудочном соке растворяются лучше, чем в воде, тогда яд действует сильнее. Другие же яды, попав в желудок, теряют свою ядовитость или она резко уменьшается. Так как на всасываемость химических веществ из желудка влияет степень наполнения желудка пищевой кашицей, опыты на животных всегда ставят натощак. У мышей корм отбирают за 4 часа до начала опыта, а другим животным на ночь оставляют только воду.
При попадании на кожу вещество может оставаться на ее поверхности, но может и всасываться, что приводит к общему отравлению (резорбтивное действие).
Химические соединения могут поражать кожу, вызывая раздражение, воспаление и гибель клеток. Это местное кожное действие. При попадании на слизистые оболочки глаз химические соединения могут вызывать как местное, так и резорбтивное действие. При введении веществ внутривенно или в брюшную полость действие веществ наступает наиболее быстро. Такие способы введения, как подкожный, внутримышечный, внутривенный, внутрибрюшинный, имеют свои особенности. Так, внутривенно вводят только водные растворы. При других способах возможно вводить не только водные, но также и масляные растворы, взвеси и эмульсии. Путь и метод введения изучаемых веществ определяются врачом и не меняются в течение всего эксперимента.
5.1.	Ингаляционный путь введения токсических веществ
Для изучения ингаляционного воздействия ядов необходима специальная аппаратура, так называемые камеры, куда помещают лабораторных животных. Камеры бывают самые разнообразные — от простейших (бутыли и эксикаторы с тубусом) до весьма сложных с подачей кондиционированного воздуха. Некоторые камеры механизированы. Лаборант должен быть хорошо знаком
26
с устройством и правилами работы с камерами. Следует помнить, что в камеру вводят часто большое количество-ядовитых веществ и неумелое обращение с камерами может вызвать проникновение отравленного воздуха в рабочее помещение. При работе с особо опасными веществами камеры ставят в вытяжной шкаф.
5.1.1.	Общие принципы устройства камер
Все многообразие камер, которые используются в токсикологии, в зависимости от целей эксперимента могут быть разделены на две группы: 1) камеры для ингаляции паров, газов, аэрозолей и 2) камеры для ингаляции пылей, дымов. Но принципы устройства всех камер, несмотря на различия в форме, примерно одинаковы, воздух с находящимся ядовитым веществом так или иначе должен соприкасаться с органами дыхания животных.
Форма камер первой группы бывает различной: в виде кубического прямоугольника, шестигранника, реже— круглая. Каркас камеры чаще делают из металлических листов (лучше всего из нержавеющей стали), боковые стенки — из таких же листов или стекла. Теперь все чаще применяют пластмассовые камеры из оргстекла. В каждой камере в боковых стенках, в верхней и нижней крышках имеется ряд отверстий — штуцера. Они служат для введения ядовитого вещества и чистого воздуха, для вытяжки воздуха из камеры, для термометра и других приборов, которые вводят в камеры, для забора проб и т. д. Наружные отверстия закрываются хорошо подогнанными резиновыми пробками. Корковые пробки пропускают воздух, поэтому если приходится ими пользоваться, то верхний конец и стенки пробки, выходящие наружу, заливают слоем парафина или воска. Камера должна быть надежно герметизирована. Все соединения промазывают какой-либо замазкой, например восковым пластилином. Он удобен тем, что может быть всегда снят без повреждения стенок камеры. Для сообщения с внутренней частью камеры в пробки вводят стеклянные трубопроводы, к которым присоединяются нужные части.
Животных помещают в камеру через дверцу, находящуюся в боковой стенке. Иногда дверцей служит одна из боковых стенок или съемный верх камеры. Надо следить, чтобы резиновые прокладки плотно прилегали к
27
краям дверцы или крышки камеры. Для герметизации обычно применяются винтовые барашковые затворы с резиновыми прокладками. Во избежание перекоса затворы завинчивают сначала не полностью и не подряд, а парами с противоположных сторон. Когда все затворы будут завинчены наполовину, следует затянуть винты до конца. В некоторых камерах применяются рычажные затворы.
В камерах второй группы животных обычно размещают в специальных «домиках» снаружи камеры, только передний конец «домика», имеющий отверстие для морды животного, вводят внутрь камеры. Камера представляет собой круглую трубу, по которой протягивается испытуемое вещество. «Домик» должен быть подогнан к отверстию в камере, чтобы морда животного высовывалась в камеру. В камере системы Латушкиной крыс помещают в верхней части трубы в круглой камере, разделенной на отсеки и прикрытой сверху листом оргстекла. При работе с камерой этого типа следует особенно внимательно следить, чтобы воздух подавался бесперебойно, так как количество воздуха в индивидуальных отсеках камеры для каждой крысы очень мало. При высокой температуре окружающего воздуха в таких камерах возможно перегревание животных.
Для ингаляции применяют два метода: 1) статический и 2) динамический.
5.1.2.	Статический метод ингаляционного введения
При статическом методе воздух в хорошо загерметизированной камере не меняется — в камеру помещают животных, затем герметизируют ее и вводят вещество. Обычно статический метод применяется при установлении смертельных концентраций вещества в остром опыте. Для применения статического метода могут быть использованы не только специальные камеры, но и простейшие приборы — большие бутыли с широким горлом (чтобы через него можно было в бутыль опустить мышь), эксикаторы (желательно с тубусом), стеклянные колокола или бутыли с обрезанным дном. Нижний конец колокола или бутыли помещают на деревянную подставку в паз, вырезанный точно по окружности сосуда и заполненный вазелином или водой — в зависимости от того, в чем меньше растворяются пары
28
Рис. 6. Камера-бутыль с обрезанным дном, вставленным в деревянную подставку.
исследуемого вещества. Иногда стеклянный колпак может быть поставлен прямо на резиновый лист (рис. 6).
Основные требования при статическом методе — полнейшая герметизация. Для проверки камеры на герметичность в нее вводят небольшое количество аммиака. Утечку аммиака обнаруживают по запаху пли с помощью красной лакмусовой бумаги, которая при соприкосновении с аммиаком синеет.
Для создания нужных концентраций в камерах можно применить различные способы в зависимости от физико-химических свойств исследуемого вещества. Летучие вещества наносят на фильтровальную бумажку, сложенную в виде зонтика и подвешенную за нитку в камере. Вещества, легко испаряющиеся из растворов, наливают в чашку Петри или другой какой-либо сосуд, который ставят внутрь камеры или подвешивают. В этом случае учитывают величину поверхности: чем она больше, тем больше испарение и тем большая концентрация создается в камере,
29
Концентрация паров вещества часто определяется расчетным путем, поэтому надо точно знать, сколько вещества было нанесено на бумажку или налито в сосуд. Убыль вещества определяют взвешиванием бумажки или сосуда до и после опыта. Например, на фильтровальную бумажку весом 2 г нанесено 1 г вещества. После опыта бумажку вновь взвешивают — вес тот же, что до внесения с веществом в камеру. Это означает, что все вещество испарилось. Объем камеры 20 л. Расчет концентрации: 1 г разделить на 20 л, получается 0,05 г в 1 л, или 50 мг/л.
Вследствие того что воздух в камере не меняется, создается ряд неблагоприятных моментов для животных: может не хватать кислорода, в воздух поступают избыточное количество углекислоты, водяные пары и другие продукты жизнедеятельности животного. Поэтому в камеры типа бутылей емкостью 15—20 л помещают не более 3 мышей при экспозиции (время опыта) 2 часа. В камеры объемом 100 л и более можно помещать более крупных животных — крыс, морских свинок, но также в небольшом количестве. Показателем вредного сдвига микроклимата в камере может служить запотевание стеклянных стенок камеры.
Необходимый объем воздуха можно рассчитать математически: по формуле V=2,10-W */4 вычисляется легочная вентиляция (V — объем легочной вентиляции в мл/мин; W — вес животных в граммах). Найденную величину легочной вентиляции умножают на срок (в минутах) данного опыта и на 3. Тогда воздух будет разбавлен в 3 раза, увеличение концентрации углекислоты в камере не превысит 1 % и она не будет влиять на дыхание. Убыль кислорода невелика и не вызовет изменений дыхания.
Для того чтобы газ распределялся по камере равномерно, в пробку, закрывающую камеру типа бутылки, вставляют резиновый баллон емкостью 250—300 мл. Сжимая и разжимая баллон, производят перемешивание воздуха в камере.
Камеры типа бутылей следует помещать под вытяжным шкафом для того, чтобы можно было безопасно их проветрить. По окончании срока ингаляции включают шкаф на вытяжку, открывают пробку или приподнимают край бутыли (если она вставлена в паз подставки), дверцы вытяжного шкафа закрывают. Через 30
10—15 минут, когда концентрация вещества в камере резко уменьшится, можно вынимать животных, но опять-таки это проделывается в вытяжном шкафу. Желательно использовать переносную воздуходувку, трубовод которой вводят внутрь камеры, тогда проветривание пойдет быстрее.
5.1.3.	Динамический метод ингаляционного воздействия
Динамический метод характеризуется тем, что воздух в камерах непрерывно меняется, что обеспечивается соответствующим вентиляционным оборудованием.
Динамический метод имеет ряд преимуществ. Так, возможно поддерживать все время заданную концентрацию, возможно держать животных в камере неограниченное количество времени, даже круглосуточно, в течение нескольких месяцев. Однако динамический метод требует специальных устройств, специальной аппаратуры и умения обращаться с довольно сложной системой подачи воздуха.
Принцип динамического метода заключается в том, что в камеру должно поступать столько же воздуха, сколько его будет выходить. В противном случае в камере создастся разреженное или повышенное давление, каркас камеры прогнется, стекла вылетят (рис. 7).
Для подачи и вытяжки воздуха из камер используют воздуходувки. В хорошо оборудованных лабораториях подача и вытяжка воздуха осуществляются централизованно. Вдали от камер стоят большие мощные воздуходувки. По одним трубопроводам от них поступает воздух в камеры, по другим трубопроводам воздух отсасывается из камер. Воздуходувки бывают различных систем. Надзор за ними осуществляют обычно специально выделенные технические сотрудники, но лаборанты, получив соответствующий инструктаж, должны регулярно смазывать воздуходувки, иначе возможен их полом. Для каждой системы воздуходувок есть определенное количество времени, в течение которого они могут работать беспрерывно. Превышать установленные сроки работы нельзя, воздуходувки перегреваются и портятся. Если переключение с одной воздуходувки на другую не производится автоматически, то это должен делать лаборант.
31
Рис. 7. Схема камерного устройства.
1а — реометр, через который проходит поступающий в камеоу воздух;
16 — реометр, стоящий на выходе из камеры; 2 — гусек с химическим веществом; 3 — манометр; 4 — бутыль с поглотителем; 5 — двеоца камеры.
Целесообразно на рукоятку включенной воздуходувки вешать табличку с указанием, кем и когда включена воздуходувка.
Если нет централизованной подачи, воздух можно подавать различными приборами, например пылесосами, небольшими компрессорами, центробежными вентиляторами, небольшими воздуходувками и т. п.
От приборов, подающих или отсасывающих воздух, к камерам проложены воздуховоды. Для них используют толстостенные резиновые трубки или гофрированные трубки от противогазов. Легко сжимаемые, тонкостенные резиновые трубки дают большое сопротивление воздуха и для работы не пригодны. Воздуховоды соединяются между собой в стык стеклянными переходами. Если диаметры трубок, которые надо соединить, различны, их соединяют стеклянными переходами с постепенно сужающимися концами. Однако следует помнить, что всякое сужение увеличивает сопротивление воздуха. Воздуховоды заканчиваются в камере. В качестве воздуховодов можно использовать и стеклянные трубки, соединяемые стык в стык резиновыми трубками.
Для большей надежности резиновые трубки притягивают к стеклянным скобами с винтом.
32
Динамический способ ингаляции можно проводить тремя способами: 1) воздуходувку поставить на подачу воздуха, который из камеры будет выходить самотеком; 2) воздуходувку поставить на отсос, тогда воздух в камеру будет поступать самотеком; 3) одна воздуходувка работает на подачу, другая — на отсос. Выбор способа зависит от ряда моментов, однако во всех случаях количество поданного и отсосанного воздуха должно быть одинаковым. Если через прибор, подающий исследуемое вещество, по условиям опыта проходит воздуха меньше, чем должно отсасываться, открывают один из штуцеров.
Следует заметить, что первый способ требует хорошей герметизации камеры, так как подаваемый воздуходувкой воздух может просачиваться наружу через незаметные щели в камере.
Чтобы учесть, какое количество воздуха проходит через камеру, используют специальные приборы — реометры и ротаметры, показывающие количество воздуха, проходящего через прибор в минуту. Каждый прибор рассчитан на определенный литраж, поэтому подбирать реометры и ротаметры следует в зависимости от условий опыта.
Реометр представляет собой горизонтальную трубку с двумя шарообразными расширениями, между которыми расположено сужение — диафрагма. От ширины диафрагмы зависит скорость, с которой проходит через нее воздух. Горизонтальная трубка с двух концов соединена с манометром, который имеет два расширения. Нижнее служит резервуаром для жидкости (чаще подкрашенный керосин определенного удельного веса), верхнее является предохранителем в случае, если керосин поднимется слишком высоко. Вертикальная трубка, расположенная между двумя расширениями, имеет шкалу с указанием количества воздуха, который проходит в данный момент через реометр. Реометр подключают в систему воздуховодов так, чтобы по ходу воздуха было сначала нижнее расширение для керосина. Воздух, проходящий через трубку, разрежается. Вследствие разницы давления по обе стороны, диафрагмы уровень жидкости в левом колене манометра поднимается тем выше, чем больше воздуха проходит через реометр в единицу времени (обычно в минуту). Если воздух не поступает, уровень керосина должен быть одинаковым
2—8178
33
в расширении и левом колене и находиться на нулевой черте. Если необходимо долить керосин, то надо брать его такого же удельного веса, который указан на приборе, иначе показания реометра будут неправильными.
Ротаметр представляет собой коническую трубку. Через нижнее, более узкое отверстие трубки воздух проходит вверх и поднимает на определенную высоту шарик из бузины или другого легкого дерева. Направление воздуха снизу вверх. Сбоку имеется шкала. Шарик в каждом приборе имеет определенный вес, заменить его другим нельзя, так как показания ротаметра будут неверными.
Для введения исследуемого вещества в камеру имеется много разнообразных приборов. Газообразные вещества вводят из газометров или газовых бюреток. Если газ в воде не растворяется, то его вытесняют из прибора, приливая туда воду. Если газ в воде растворяется, то обычно для вытеснения газа используют ртуть. Пары жидких веществ вводят в камеру, испаряя их при помощи так называемых гуськов. Гусек — это небольшой стеклянный сосуд той или иной формы. В него наливают исследуемое вещество. Одно отверстие гуська вводят в камеру, другое присоединяют к воздуховоду, идущему от воздуходувки, которая работает на подачу. Воздух, проходя через гусек, насыщается парами вещества и увлекает их в камеру. Гуськи бывают горизонтальными и вертикальными. В последних приводящая трубка иногда заканчивается шариком с маленькими отверстиями, через которые воздух проходит мелкими пузырьками. Чтобы в камеру не попадали капли жидкости, перед отводящей трубкой делают расширение или ставят каплеуловитель.
Если в камеру надо подавать вещество в виде аэрозоля (т. е. в мелкодисперсном состоянии), то применяют гуськи-пульверизаторы. Воздух, выходящий из воздуховода под давлением 1—2 атм., проходит через муфту пульверизатора и создает разрежение у выхода узкого отверстия. К этому отверстию подведена трубка-капилляр, которая другим своим концом опущена в жидкое вещество. Разрежение воздуха засасывает жидкость в подающую трубку, превращая ее в аэрозоль. Последняя поступает в камеру. Обычно при давлении воздуха 1—2 атм. диаметр трубки капилляра должен быть 34
1 —1,5 мм, отверстие муфты — 2,5—3,5 мм, выдвигается из муфты трубка капилляра на 2—3 мм.
Для пыли имеются особые распылители различной формы.
Лаборант должен очень внимательно следить за работой воздуходувок. Если почему-либо (например, прекращение подачи электроэнергии) воздуходувка перестанет работать, а следовательно, воздух не будет поступать, резко изменяются условия внутри камеры. Накопление больших количеств углекислоты и снижение содержания кислорода может привести к гибели животных. Показателем неблагополучия в .воздушной среде камеры, как уже говорилось, может служить запотевание стенок камеры. В этих случаях надо увеличить обмен воздуха. Можно воспользоваться влагопоглощающими средствами (например, прокаленный медный купорос), которые помещаются внутри камеры.
Для измерения концентрации вещества в камере отбирают пробы воздуха, в которых и определяют химическим путем содержание исследуемого вещества. Отбор проб из камеры производят с помощью аспираторов, которые вытягивают воздух из камеры со скоростью 0,5—1 л в минуту. Резиновую трубку, по которой воздух будет поступать из камеры, прикрепляют на стеклянную трубочку, вдетую в пробку, которая находится в одном из отверстий камеры. Нижний конец трубки должен находиться на уровне дыхания животных. Воздух из камеры проводится через специальные поглотители, в которых находятся химические реактивы, поглощающие исследуемое вещество. Таким поглотителем могут быть жидкие или твердые вещества. Время взятия пробы различно и зависит от чувствительности химического метода определения вещества. Чем менее чувствителен метод, тем дольше протягивается воздух через поглотитель.
Обычно в начале эксперимента отбор проб производится каждый день по 2—3 раза в течение опыта с тем, чтобы выяснить, какие колебания в концентрации вещества имеют место. Затем, когда режим камеры устанавливается, отбор проб в ряде случаев делают через 1—2—3 дня в зависимости от условий опыта.
Животных помещают в камеру непосредственно или, если необходимо проводить ингаляцию одновременно двух видов животных, в маленьких клетках. Клетки для
2*
35
мышей должны быть обтянуты сеткой с мелкими отверстиями, так как крысы могут откусывать хвосты и лапы мышей через отверстия клетки.
При работе с камерами очень важно установить определенный режим (размер вентиляции, температура) для того, чтобы концентрации были постоянными. Режим работы камеры отрабатывает обычно токсиколог или химик, лаборант ему помогает, а за^ем следит за точным выполнением режима.
Камера может быть оборудована различными приборами и аппаратурой, обеспечивающими постоянную автоматическую регулировку и контроль (с регистрацией) за состоянием микроклимата (температура, влажность воздуха, содержание кислорода и углекислоты и др.). Лаборант обязан выучиться обращаться со всей этой аппаратурой.
Чтобы ядовитые вещества не попадали из камеры наружу, отводимый воздух пропускают через бутыль с активированным углем и химическим поглотителем. В некоторых случаях воздух из камеры предварительно пропускают через жидкий поглотитель.
Чтобы контролировать давление внутри камеры, снаружи к камере присоединяют манометр. По колебанию воды в нем можно судить о давлении в камере. Если камера загерметизирована, а давление изменилось, то вода из манометра выльется наружу (если давление в камере повышено) или втянется в камеру (если давление в ней снижено). Через манометр в камеру войдет воздух и давление выровняется.
После ингаляции камеру нужно сначала проветрить, отключив гусек с веществом и соединив камеру на прямую с подачей чистого воздуха или, оставив вытяжку, увеличить ее до 40—45 л в минуту, дать доступ воздуху, открыв одно из отверстий в камере. Через 5—10 минут после того, как через камеру будет проведен не менее чем троекратный объем воздуха, дверцы или крышку открывают и извлекают из камеры животных.
После извлечения животных камеру проветривают еще в течение 10—15 минут, после чего приступают к уборке. Если животные размещены в камере непосредственно, то вынимают деревянную решетку, на которой были помещены животные, промывают ее горячей водой с мылом и ставят на просушку. Если животные были размещены в клетках, то моют клетки. При
36
2—4-часовых экспозициях (время воздействия) животным корм и воду не ставят. Если животных помещают в камерах на круглые сутки, то уборку производят каждый день с соблюдением тех же правил, которые указаны выше. Вымытые решетки заменяют чистыми, сухими. Животным ставят корм и воду. Чтобы животные не проливали воду, лучше ее размещать в специальных поилках, о которых говорится в разделе «Введение химических веществ вместе с питьевой водой или пищей».
Особенно тщательно протирают внутреннюю часть камеры. Время от времени ее моют с мылом.
Если в одной и той же камере производится по очереди ингаляция двумя веществами, то после опыта с каждым из них нужна специальная дегазация камеры.
5.2.	Введение химических веществ
в желудочно-кишечный тракт
Химические соединения можно вводить в желудочно-кишечный тракт (перорально, per os) в чистом виде, в растворах, эмульсиях или с пищей и питьевой водой. Выбор способа введения животным химического соединения зависит от многих причин, самовольно изменять способ введения ядов лаборант не должен, так же как заменять один растворитель каким-либо другим.
Если вещество не растворяется в воде или масле, его можно вводить в виде эмульсии. Для этого наиболее удобен гель 1—2°/о крахмала. Исследуемое вещество смешивают с остывшим крахмальным раствором, хорошо растирая и размешивая до получения однородной массы.
Соотношения вещества и крахмального раствора зависят от физико-химических свойств исследуемого вещества и могут быть, например, 1 : 1, 1 : 5, 1 : 10.
5.2.1.	Введение в ротовую полость
Вещество можно вводить непосредственно в ротовую полость. Для этого применяют различные приборы: шприц, пипетки, капельницы и т. п. Со стеклянными приборами надо обращаться с осторожностью, чтобы не отломился кончик. Мыши в рот можно ввести 2—3 капли, крысам до 1 —1,5 мл, кроликам до 2—3 мл. жидкости, а при определенных навыках и больше. Кошкам
37
вводить в рот затруднительно, так как обычно эти животные сильно сопротивляются. Собакам в рот можно вводить довольно большие количества жидкости, особенно если приучить животное к этой процедуре.
Твердые химические вещества в виде порошка также можно вводить непосредственно в ротовую полость животным, высыпая порошок в рот, или оттянув кожу в боковой части мордочки, вводят вещество на тонком шпателе или маленькой лопаточке.
Чтобы ввести животным испытуемое вещество, нужно знать некоторые приемы. Мышь берут большим и указательным пальцами левой руки за шкурку на затылке между ушей (натягивание шкурки заставляет ее открыть рот), в это же время безымянным пальцем и мизинцем придерживают животное за хвост. В открытый рот вводят вещество.
При введении вещества крысам опытные лаборанты сажают крысу себе на колени или на грудь (лаборант должен быть одетым в резиновый или брезентовый фартук поверх халата), левой рукой захватывают шкурку на затылке, отводят голову вверх, прижимая спинку предплечьем к себе, и вводят в рот крысы вещество. Можно завертывать крысу в тряпку, как это будет сказано ниже.
Кроликам можно вводить исследуемое вещество непосредственно в той же клетке, где живет животное. Лаборант придвигает кролика к углу клетки, левой рукой захватывает его шкурку на затылке вместе с ушами и поднимает голову животного немного вверх. Правой рукой пипетку или конец шприца вводят в свободное от зубов пространство, которое находится сразу же за передними резцами (рис. 8).
Можно вводить исследуемое вещество кролику вместе с помощником, который перевертывает животное на спину и удерживает его в таком положении за передние и задние лапки.
Введение вещества кошке в рот производится следующим образом. Кошку с забинтованными предварительно лапками (или с надетыми на них мешочками из кожи или толстой ткани) кладут на живот. Одной рукой экспериментатор поднимает голову животного вверх, другой рукой вводит в рот за передними зубами конец пипетки, шприца или другого прибора. Кошку надо
38
Рис- 8. Введение вещества кролику в рот.
предварительно успокоить, погладить, чтобы она лежала спокойно. Если этого достигнуть не удается, один из работников придерживает туловище кошки на уровне плечевого и тазового пояса, а другой приподнимает голову животному и вводит вещество. Собакам, стоящим в станке, вводят наконечник зонда для введения вещества также за передними зубами.
5.2.2.	Введение в желудок
Для введения непосредственно в желудок применяют зонды — для мышей и крыс металлические или стеклянные, для более крупных животных — резиновые.
Техника введения вещества мышам и крысам одинакова. Мышь фиксируют в руке, как было указано выше. Держать ее надо вертикально. Зонд вводят горизонтально в ротовую полость до задней стенки глотки, затем конец зонда поворачивают вниз. Если зонд введен правильно, он легко соскальзывает в пищевод. Никогда нельзя применять насилие — стенки пищевода мышей и крыс очень тонки и их легко проколоть. Если изо рта показалась кровь, это является свидетельством того, что зонд введен неправильно. Обычно это приводит к гибели животного.
39
Рис. 9. Введение вещества крысе в желудок.
Крысу завертывают в тряпку, оставляя свободной только голову. Затем, прижав крысу к груди, захватывают, как в описанном ранее приеме, шкурку на затылке и вводят вещество. Можно вводить зонд, не завертывая животное (рис. 9).
Введение крысам производят так же, как мышам. Сначала зонд вводят в рот, направление его должно соответствовать положению ротовой полости. Дойдя до конца ротовой полости, зонд поворачивают вниз, в пищевод. Можно не доводить до самого конца пищевода, останавливаясь несколько выше. Вещество нельзя вводить быстро, иначе оно может попасть не в желудок, а подняться по пищеводу вверх, попасть в дыхательные пути и вызвать удушение животного.
Морским свинкам вводить вещество можно так же, как крысам, с помощью металлического или стеклянного зонда, или как кроликам, с помощью резинового зонда или резиновой трубки, но диаметр должен быть маленьким, иначе зонд не войдет в пищевод.
Если кролику нужно ввести вещество через зонд, то животное привязывают на доску для экспериментальных животных. Для введения в желудок кроликам (так же, как собакам и кошкам) применяют резиновый зонд, в качестве которого служит катетер. Чтобы животное не перекусило зонд, в рот вставляют роторас
40
ширитель. Роторасширитель — это деревянная или металлическая пластинка с отверстием посередине. Через это отверстие проводят зонд. Для того чтобы вставить роторасширитель, следует, нажимая на кожу углов рта, заставить кролика открыть рот. Роторасширитель вставляют сзади передних зубов так, чтобы отверстие было прямо посередине.
Доске с привязанным кроликом придают вертикальное положение (например, ставят передние ножки на спинку стула). Помощник хорошо фиксирует голову кролика и роторасширитель обеими руками, как коробочкой охватывая голову кролика. Экспериментатор левой рукой’ берет за морду кролика, несколько выдвигая нижнюю челюсть вперед, а правой рукой вводит предварительно смоченный зонд. Обычно зонд проходит легко, но если у кролика появится спазм пищевода, то зонд не проходит. Тогда надо зонд вынуть и через 2 минуты повторить попытку. Ни в коем случае нельзя и здесь применять силу.
Перед тем как вводить вещество, следует проверить, правильно ли введен зонд. Для этого лаборант подносит к концу зонда смоченную водой руку. Ощущение похолодания, зависящее от попадания воздуха, говорит о том, что зонд введен неправильно, попал в трахею. Тогда надо срочно зонд вынуть.
Если зонд введен правильно, к нему присоединяют воронку или шприц, через которые и вводят исследуемое вещество. Стержень шприца нужно извлечь, жидкость должна проходить свободно, без нажима.
Кошкам, как уже указано выше, перед началом введения надо завязывать лапы. Затем животное завертывают в большую тряпку. Помощник удерживает кошку в вертикальном положении одной рукой, а другой, захватив за шкурку, оттягивает голову животного назад. Таким образом можно вводить вещество в ротовую полость. Для введения в желудок также используют роторасширитель. Другие приемы такие же, как при введении кроликам.
Собак ставят в обычный станок, закрепляют лямки. Зонд собакам вводят так же, как кроликам и кошкам, только зонд берут обычный, желудочный, употребляемый в клинической практике.
При внутрижелудочном введении желудок животных должен быть освобожден от пищи, поэтому им не дают
41
Таблица
Максимальное количество жидкости, которое допускается вводить за один прием (по литературным данным и собственным наблюдениям)
Вид животного	Вес, г	Количество жидкости, мл	Примечание
Мыши	.30 и выше	1—1,5	
	25—30	"0,8-1	
	20—25	0,5—0,7	
	18—20	0,3—0,4	
Крысы	30 и выше	До 8	
	250—300	До 6	
	200—290	4—5	
	100—190	3	
Морские свинки	300 и выше	6	
	250—290	4—5	
Кролики	3500 и выше	200	
	2500—3400	150	
	2000—2400	100	
Кошки	3000 и выше	100	Некоторые авторы
	2500—3000	50—80	рекомендуют вво-
			дить не более
			40 мл вещества
Собаки	В зависимости от	от 50 до	
	величины	500—800	
на ночь корма, а мышей лишают корма за 4 часа до опыта. Каждому животному можно ввести без вреда для него только определенное количество жидкости. Количество жидкости зависит от величины желудка животного. Приводим табл. 1, которой следует руководствоваться при введении ядов в желудок животным.
Очень молодые животные часто плохо переносят введение зонда. Переполнение желудка может вызвать у них рефлекторную остановку дыхания. В таких случаях нужно сразу же вынуть зонд и начать производить искусственное дыхание, ритмично, но не сильно сжимая с боков грудную клетку животного. При этом нельзя надавливать на желудок, так как иначе жидкость пойдет вверх в дыхательные пути и животное может задохнуться.
42
5.2.3.	Введение химических веществ вместе с питьевой водой или пищей
В длительных хронических опытах часто применяют введение химических веществ вместе с питьевой водой или пищей.
Мышам и крысам исследуемое вещество в виде водного раствора дают вместо питьевой воды. Для этого служат специальные поилки, которые прикрепляют к стенке клетки (рис. 10). Поилка представляет собой трубку диаметром 3—4 см и длиной 10—15 см с нанесенной градуировкой, чтобы можно было судить, сколько воды выпивают животные в сутки. Верхний конец трубки закрывают стеклянной пробкой со шлифом. Нижний конец имеет отросток, изогнутый под тупым углом. Иногда верхний конец трубки запаян, а внизу имеется два отростка. Один служит для наливания жидкости и закрывается пробкой, другой, изогнутый, вводят в клетку. С его открытой поверхности животные слизывают воду. В обязанности лаборанта входит содержать в чистоте поилки, промывать и дезинфицировать их. Каждый день выливают оставшийся раствор, наливают новый. Необходимо вести запись количества выпитой воды за сутки. Так как потребление воды зависит от внешней температуры воздуха, то записывают и этот показатель.
Кроме водного раствора исследуемого вещества, животным не дают другой жидкости. Молоко, которое входит в рацион животных, ставят один раз в день на 10—15 минут.
Обычно мышь выпивает в сутки от 1,5 до 3 мл, а крыса — от 8 до 15 мл.
Вводить испытуемое вещество с питьевой водой кроликам и кошкам трудно, так как эти животные воды пьют обычно мало.
Исследуемое вещество можно подмешивать в пищу животным, взвесив предварительно ту порцию еды, в которую внесено вещество.
Можно небольшое количество токсических веществ давать крысам на кусочке хлеба или сахара. Надо проследить, чтобы животные съели всю пищу, не разбрасывая ее по клетке. Если будут выявлены остатки, следует их собрать и взвесить.
43
Рис. 10. Поилки, закрепленные на клетке.
5.3.	Нанесение химических соединений на кожу
Нанесение вещества (аппликация) на кожу имеет целью выяснить, обладает ли вещество местно раздражающим или кожно-резорбтивным действием. Если имеется только местнораздражающее действие, то наблюдаются изменения только на коже. Если вещество обладает кожно-резорбтивным действием, то оно всасывается через неповрежденные кожные покровы, вызывая общее отравление организма. Опыты проводят на мышах, крысах, кроликах, морских свинках. Существует несколько' приемов для изучения кожного действия вещества. Часто применяют метод с изучением действия химических соединений на кожу хвостов мышей и крыс.
Животных фиксируют: мышей помещают в стеклянные пробирки с отверстием на конце для того, чтобы животное могло свободно дышать. Хвост пропускают наружу через отверстие в пробке. Пробирку закрепляют в штативе в вертикальном или наклонном положении. Крыс помещают в описанные выше станки-домики, хвосты их выводят наружу. Домикам тоже лучше придавать наклонное положение, но можно ставить их и горизонтально.
Испытуемое вещество наливают в пробирки, которые ставят в штатив. Для каждого животного предназначается своя пробирка, в которую и опускают хвост животного на % его длины. Необходимо точно подобрать
44
нужное расстояние между пробиркой и прибором, в котором Помещено животное.
Чтобы животное не подвергалось воздействию паров исследуемого вещества через дыхательные пути, опыт проводят под вытяжным шкафом, голова животного должна быть снаружи.
Пробирки помещают в водяную баню, в которой поддерживается температура 28—30° или другая заданная температура, если по ходу опыта требуется исследовать действие вещества при повышенной или сниженной температуре.
Если вещество твердое, то его предварительно растворяют в воде, масле или приготовляют эмульсию (см. выше).
Время экспозиции 4 часа. После эксперимента отставляют в сторону пробирки с веществом, опускают хвосты животных в пробирки с теплой водой и прополаскивают их, затем обмывают водой с мылом, используя кусочек ваты, который держат пинцетом. Затем вновь обильно обмывают водой. Поскольку многие вещества обладают кожным действием, лаборант обязательно должен работать в тонких резиновых перчатках.
Изучаемые вещества можно непосредственно наносить на кожу.
Эти опыты производятся обычно на крысах, морских свинках, кроликах. Перед опытом у животных выстригают шерсть на коже спины, живота или задней лапки, применяя для этого ножницы с загнутыми концами. Шерсть следует выстригать полностью, чтобы не оставалось даже коротких волосков, но при этом не допускать ранений кожи, царапин. Обычно кожу подготовляют накануне дня опыта с тем, чтобы нанесенные при стрижке незначительные, часто невидимые глазом ранения кожи могли зажить.
Как для выстригания шерсти, так и для опыта с нанесением вещества животных фиксируют — привязывают к доске для экспериментальных животных брюшком или спинкой вверх в зависимости от условий опыта. Крыс иногда сажают в домики, вытягивают наружу одну из задних лап, на которую будет нанесено вещество, и привязывают ее к поставленному штативу.
Участки выстригаемой кожи обычно имеют следующие размеры: у кроликов на спине, сбоку от позвоноч-
45
I
Рис. 11. Кролик с щитком-ошейником.
ника или на животе — 4x5 см, у морских свинок и крыс на животе или задней лапке — 2X2 см.
Если вещество наносят кроликам на спину, то их можно не фиксировать к доске, а посадить в ящик с отверстием для головы, о котором уже было сказано выше, выведя голову наружу. Можно оставить животных и на свободе. Тогда им надевают на шею щиток-ошейник, вырезанный из картона с отверстием для головы. Такие щитки лишают возможности кроликов поворачивать голову и слизывать нанесенное вещество (рис. 11).
Привязывать животных более чем на 4 часа нельзя, животные с трудом переносят длительное фиксирование на доске.
Жидкие вещества наносят на кожу в неразбавленном виде, твердые вещества — в концентрированных водных или масляных растворах, суспензиях, эмульсиях или мазях. Последние готовят на вазелине, примешивая к нему вещество и тщательно растирая, чтобы получилась однородная смесь.
При нанесении летучих веществ работа ведется под вытяжным шкафом. Чтобы вещество не улетучивалось, после нанесения на кожу над этим местом прикрепляют с помощью бинта или липкого пластыря небольшую воронку с закрытым пробкой концом. Можно также предварительно на место нанесения приклеить короткую трубочку с отогнутым со стороны кожи краем. Приклеивают
4fi
трубочку клеем БФ-2 или клеолом лиоо укрепляют липким пластырем. После нанесения веществ на кожу верхний конец трубочки закрывают пробкой. Вещество с кожи не смывают, если не будет специальных указаний смыть его. Если вещество обладает местнораздражающим действием, на месте аппликации наблюдаются покраснение (гиперемия), отек, расчесы. Об отечности судят по толщине кожной складки, которую захватывают двумя пальцами у концов видимой границы отека. Для сравнения толщину такой же кожной складки проверяют у контрольного кролика. Для объективной регистрации кожной складки применяют микрометр типа МК. О болезненности можно судить по мелким складкам кожи, которые образуются в месте нанесения; при до-трагивании к нему животные проявляют беспокойство. При кожном нанесении в ряде опытов изменяют температуру кожи электротермометром.
Если вещество вызывает сильное местное действие, на месте нанесения впоследствии образуются кровяные (геморрагические) корки. После того как они отойдут, остаются глубокие язвы, трещины, резкий отек, гиперемия. Иногда, особенно на хвосте у животных, отмечается некроз: часть хвоста чернеет, высыхает и отваливается.
Для выявления кожно-резорбтивного действия надо следить за общим состоянием животного, подсчитывать число дыханий в минуту. Вещество, всасываясь, может вызвать гибель животного, иногда даже во время опыта.
5.4.	Нанесение химических соединений на слизистые оболочки глаза
Для внесения химических соединений на слизистые оболочки глаза чаще йспользуют кроликов. Испытуемое вещество вносят в один глаз, другой остается для контроля, в него закапывают воду. Жидкое вещество можно вводить в количестве 1—2 капель, твердых веществ, обязательно хорошо растертых, не более 50 мг.
Оттягивая немного нижнее веко, наносят вещество на слизистую оболочку глаза. Затем на одну минуту прижимают палец к внутреннему углу глаза, зажимая этим слезно-носовой канал. Это дает уверенность, что вещество останется только на слизистой оболочке глаза.
Если химическое соединение обладает раздражающим действием, животное закрывает глаза и долго их
47
не открывает. Вещество может вызвать покраснение (гиперемию) слизистых оболочек глаза, отечность век, у некоторых животных наблюдается обильное отделяемое — прозрачное или гнойное. Зрачки в зависимости от действия ядов в одних случаях расширяются, а в других, наоборот, суживаются. При резко выраженном действии яда могут образоваться язвы с гнойным отделяемым, помутнение роговицы, рубцовые изменения век.
5.5	Подкожное введение
Перед подкожным введением (инъекцией) выстригают шерсть в месте будущего укола и протирают кожу спиртом. Пальцами левой руки берут кожу в складку и прокалывают ее у основания, ведя иглу параллельно складке. Кролику обычно производят подкожные инъекции в область бока или спины. Под кожу можно вводить не более 30 мл жидкости. Морским свинкам подкожное введение производят в области бока или живота. Можно делать инъекцию и в области спины, но кожа там очень толстая и поэтому приходится брать толстую прочную иглу. Под кожу морским свинкам разрешают вводить не более 15 мл жидкости. Крысам вводят вещество в области спины или бока. Можно вводить под кожу до 10 мл, меняя направление иглы несколько раз, чтобы жидкость разместилась более равномерно и не в одном месте.
Мышам подкожное введение производят в области спины или живота сбоку; вводить можно не больше 1 мл жидкости. После инъекции у всех животных смазывают место укола йодной настойкой.
5.6.	Внутримышечное введение
Место укола готовят, как и для подкожной инъекции. Иглу вводят не под кожу, а в толщу мышцы, поэтому направление иглы не параллельно коже, а несколько наклоненное.
Чаще для внутримышечного введения используют мышцы бедра, как наиболее мощные. Кроликам можно вводить до 8 мл жидкости, морским свинкам — до 3 мл раствора, крысам — до 5 мл жидкости, мышам — не больше 0,5 мл жидкости.
48
5.7.	Внутрибрюшинное введение
Место прокола выстригают, протирают спиртом. Для того чтобы внутренности брюшной полости сместились к диафрагме, разделяющей брюшную и грудную полости, животных наклоняют головой и передний концом туловища вниз так, чтобы задняя часть туловища была выше передней.
Пальцами левой руки захватывают всю брюшную стенку в складку и у основания ее делают прокол, направляя иглу параллельно складке. Когда игла попадает внутрь брюшной полости, появляется ощущение провала, отсутствия препятствий.
Внутрибрюшинное введение обычно производят в задней трети живота, несколько отступив от срединной линии. Кроликам можно вводить внутрибрюшинно до 30 мл раствора, морским свинкам — до 8—10 мл, крысам — до 5 мл, мышам — не более 2 мл.
5.8.	Внутривенное введение
При внутривенном введении пользуются очень тонкими иглами с хорошо заостренными концами. На месте, где будет произведена инъекция, стремятся расширить сосуды растиранием, массированием (у кроликов ухо) или применением тепла (обработка ваткой, смоченной теплой водой, опускание хвоста в сосуд с теплой водой, воздействие подогретым воздухом) (более подробно см. раздел «Взятие крови у животных»), У кроликов инъекцию делают в краевую вену уха, проходящую по тонкому краю уха на наружной его поверхности. Выщипав шерсть и продезинфицировав ухо, помощник пережимает вену у основания уха, экспериментатор держит левой рукой ухо кролика, а правой вводит иглу шприца в полость вены. После прокола вены следует убедиться в том, что игла находится в ее полости. Для этого поршень шприца двигают назад, производя втягивание. Если игла находится в вене, в шприце появится кровь. Если крови нет, значит, игла не в вене. Тогда, не вынимая шприца, следует сделать попытку ввести иглу точно в вену. Затем иглу фиксируют между большим и указательным пальцами левой руки. Помощник прекращает сдавливание вены у основания уха, эк-
49
спериментатор производит инъекцию. Взрослым кроликам можно вводить до 20 мл жидкости, но необходимо следить за дыханием и работой сердца.
Морским свинкам внутривенное введение делать трудно, поэтому данную работу производят, как правило, врачи-экспериментаторы.
Крысам и мышам внутривенное введение обычно производят в боковые вены хвоста, применяя очень тонкую иглу. Хвост держат пальцами левой руки, в правой руке находится шприц. Помощник сдавливает вены у корня хвоста. Прокол делают ближе к концу хвоста, игла должна идти по ходу вены. Крысам можно вводить до 6 мл жидкости, мышам — 0,5—1 мл. Перед введением хвост следует хорошо протереть спиртом.
При внутривенном введении следует остерегаться попадания в вены воздуха, который может находиться в шприце. Для этого предварительно воздух тщательно удаляют из шприца, поднимая его иглой вверх и выпуская до тех пор, пока в отверстии иглы не покажется капля жидкости. Первую каплю также спускают.
У мышей внутривенное введение затруднено весьма тонкими венами хвоста, поэтому обычно эту процедуру также производит врач-экспериментатор.
Производя внутривенное введение, внимательно следят за тем, не появится ли припухлость по ходу вены. Она означет, что игла находится не в вене, а в подкожной клетчатке.
6.	ОПРЕДЕЛЕНИЕ ТОКСИЧНОСТИ
ХИМИЧЕСКИХ СОЕДИНЕНИЙ В ОПЫТАХ НА ЖИВОТНЫХ
Как уже было сказано выше, токсикология занимается изучением токсических (ядовитых) веществ, выяснением, какие их количества могут оказать вредное воздействие на лабораторных животных. Полученные данные помогают оценить вредность того или иного вещества для человека.
Как же определить токсичность химического соединения? Токсичность вещества зависит от многих причин. К ним относятся химическое строение вещества, его физико-химические свойства, например, растворяется ли оно в воде или в жирах, летучее или, наоборот, 50
малолетучее. Имеет большое значение и количество вещества, которое вводят животному. В больших и очень больших количествах почти все химические соединения вызывают отравление и гибель животных. В зависимости от того, от какого количества яда или при какой концентрации его в воздухе животные погибают, определяют токсичность вещества по градации: весьма токсичное, высокотоксичное, умеренно токсичное, малотоксичное.
Поэтому, приступая к работе с животными и имея целью дать токсикологическую характеристику химического соединения, его вводят животным в желудок в различных количествах, воздействуют ингаляционным путем, создавая в камере различные концентрации газов или паров вещества. Надо точно придерживаться указаний экспериментатора и вводить те количества, которые юн указывает.
Лаборант должен внимательно следить за проявлениями отравления. Яд может действовать сразу же после введения (например, крепкие кислоты и щелочи и др.), а в других случаях отравление наступает постепенно. В этих случаях различают несколько стадий интоксикации. Первая стадия — это скрытая стадия. Никаких проявлений отравления не видно, животное сидит спокойно. Затем наступает продромальная стадия, появляются первые неясные и нетипичные явления. Часто наступает возбуждение, когда животное беспокойно передвигается, дыхание у него учащается. В следующей стадии явления отравления нарастают и переходят в высшую стадию отравления, когда видны все симптомы, характерные для действия данного яда. Эта стадия переходит в одних случаях в стадию разрешения. Тогда у животного клиническая картина отравления стихает и животное постепенно выздоравливает, в других случаях опыт заканчивается гибелью животного.
Нужно сказать, что продолжительность стадий может быть самой различной. Даже гибель животного наступает не в одно и то же время; при введении больших доз животное погибает быстро, при ингаляции даже непосредственно в камере, при введении меньших доз смерть отодвигается на последующие сутки. Лаборант должен фиксировать время смерти животного, так как это дает возможность судить о силе действия яда и его характерных проявлениях.
51
Всех погибших животных вскрывают. За оставшимися в живых проводится наблюдение в течение 10—14 дней, после чего обычно животных умерщвляют. О способах умерщвления будет сказано в части 3.
Для выяснения влияния введенных различных количеств веществ на животных, оставшихся в живых, во время периода наблюдения их взвешивают, определяют изменения тех или иных функций организма. Какие методы при этом применяются, будет сказано ниже. Все сказанное относится в равной мере и к ингаляционному воздействию.
Опыт, когда веществом в больших количествах действуют однократно и при этом животные, как правило, погибают, называют острым опытом. В опыте с однократным воздействием могут быть применены и малые количества, когда надо установить порог действия.
В других экспериментах вещество в течение определенного времени вводят в желудок ежедневно или ежедневно животное подвергают ингаляционному воздействию яда. Этот опыт называют подострым, или опытом с повторным или многократным введением. В длительном хроническом опыте введение яда производится в течение нескольких месяцев.
6.1.	Наблюдение за внешним видом животного
Наблюдение за внешним видом животного может дать ценные показания. У здорового животного правильное телосложение, область живота в объеме не увеличена, шерсть мягкая, блестящая, плотно прилегает к поверхности тела. По состоянию шерстяного покрова можно выявить первые признаки отравления. При этом шерсть у животного делается взъерошенной, часто не свойственного ей цвета, без блеска, иногда появляются пролысины, шерсть легко выдергивается. Здоровые животные обычно очень аккуратно содержат свои кожные покровы — моются, вылизывают шерсть. Отравленные животные часто имеют неопрятный вид. Загрязненная шерсть в области заднего прохода говорит о расстройствах пищеварения, чаще о поносах. Около носовых отверстий могут появиться пена, кровянистые выделения. Если вещество обладает раздражающим действием,
52
животные чихают, трут мордочку передними лапами, встряхивают головой, трутся ею о пол камеры или клетки, отмечается слюнотечение. При раздражении желудочно-кишечного тракта животные часто ползают по полу клетки.
Следующим этапом является наблюдение за тем, как животные двигаются. Токсические вещества в начале своего действия чаще вызывают явления возбуждения. Животные усиленно двигаются, часто беспорядочно, прыгают, бросаются на стены клетки и камеры. На незначительное внешнее раздражение (например, постукивание по стенке камеры, прикосновение каким-либо предметом и т. п.) животные отвечают резко повышенной реакцией. Походка у животных может становиться шаткой, движение некоординированными. В ряде случаев действие ядов вызывает судороги. Судороги бывают клоническими, когда отмечается подергивание лапок, хвоста, туловища или отдельных групп мышц, и тоническими, когда отдельные части тела резко выпрямлены или, наоборот, неестественно согнуты. При тонических судорогах корпуса животные изгибаются в виде моста.
Явления возбуждения обычно сменяются явлениями угнетения. Животные сбиваются в кучку, лежат не двигаясь. Реакция на раздражители вначале понижена, а затем животные вообще перестают реагировать на какие-либо раздражители, даже если причинить им боль. Характерно так называемое боковое положение. При этом животные лежат чаще на боку (но могут быть и в другом положении), не реагируют ни на какие раздражения: дыхание при этом замедлено. При перевертывании животных на спину они так и остаются лежать.
Такие выраженные проявления действия ядов чаще наблюдаются при действии сравнительно больших количеств яда в остром опыте. При введении меньших количеств в течение ряда дней или месяцев все эти проявления могут быть сглажены. Только по одному внешнему виду трудно судить о состоянии организма животных, приходится применять ряд приемов, позволяющих оценить его состояние. Сюда в первую очередь относится определение таких физиологический показателей, как изменения веса животных, частоты и ритма дыхания, частоты сердцебиений.
53
6.2.	Наблюдение за изменением веса животных
Животные на действие вещества очень быстро отвечают задержкой или иногда, наоборот, бурным приростом веса. Все здоровые животные постепенно набирают вес. У молодых вес нарастает быстро, чем старше животные, тем медленнее они прибавляют в весе. Вес животных должен соответствовать их возрасту. Нормальные показатели веса для представителей отдельных видов лабораторных животных приведены в табл. 2.
Таблица 2
Средний вес лабораторных животных в граммах в зависимости от возраста
Возраст, дни	Мыши		Крысы		Морские свинки		Кролики	
	самцы	самки	самцы	самки	самцы	самки	самцы	самки
При								
рож-де-								
НИИ	1,5	1,4	5,3	5,0	73	74	50—54	50—54
2					76	77		
4					79	81		
7	3,7	3,5	9,1	8,8				
9					87	86		
14	5,8	5,5	17,2	16,1	110	108		
20	8,3	7,3			153	148	309—402	309—342
25—28 30	11,3	10,7	49,1	45,1	187	179	450	450
35	12,9	11,9	50,5	47,2	246	248		
42-49	17,2	15,8			274	272		
58—63			90,4	79,9	400	365	820—950	790—900
70 84 90—91	21,0	18,9 21,5	153,3	137,1	510	488		
	23,9							
120			215,4	170,3			2100-2300	1700—2000
140-150	26,3	25,0	238,6	189,4			2855—3000	2100—2500
180			257,9	199,4			3150—3500	2900 -3100
У кроликов и особенно у собак вес зависит от породы. В табл. 2 приведен вес для кроликов породы шиншилла, которые главным образом используются в опытах.
54
Если животные содержатся плохо, то вес у них будет меньше. Перед началом опыта необходимо 2—3 раза с промежутком в 3—5 дней животных взвешивать, чтобы выяснить, как быстро они прибавляют в весе в нормальном состоянии. Животных взвешивают всегда в одно и то же время — утром перед кормлением.
Для взвешивания мышей, морских свинок и крыс применяют небольшие технохимические чашечные весы типа Беранже или гастрономические весы особой чувствительности (ВНЦ10). Животных помещают в коробку или под стеклянную воронку, заранее взвешенные. При некоторой сноровке животных удается взвешивать и без этих приспособлений.
Кроликов и кошек обычно взвешивают на одночашечных, так называемых детских весах. Голова животного всегда должна быть обращена в сторону более широкой части, а все четыре конечности занимать середину весов. Чтобы вес был правильным, животных надо размещать на весах всегда одинаково. Можно очертить мелом или краской тот участок площади весов, на который при взвешивании нужно размещать конечности животных.
Собак взвешивают на напольных медицинских весах. Если площадка весов мала, следует положить на нее дополнительно деревянный щит.
Во время хронического опыта животных взвешивают один раз в 7—10 дней. В кратковременных опытах вес определяют более часто, иногда каждый день или через день. Изменение веса очень важный показатель, поэтому лаборант должен со всей серьезностью отнестись к этой работе.
6.3.	Наблюдения за частотой и ритмом дыхания
Частота и ритм дыхания у животных, особенно у мелких грызунов, весьма непостоянны. Это затрудняет подсчет числа вдохов. Перед началом подсчета надо дать животному успокоиться, а подсчет производить за короткий промежуток времени — за 10—15 секунд, пока животное находится в спокойном состоянии. Затем, умножив полученное число на 6 или 4, устанавливают число дыханий в минуту.
Крыс можно посадить к себе на колени, закрыть как переднюю часть с головой, так и заднюю часть туловища тряпкой, положить на животное свои руки. Крыса
55
обычно сидит спокойно, в это время можно подсчитать число дыханий по движению шерстинок на спине животного, свободной от тряпки.
У более крупных животных (собаки, кошки, кролики) число дыханий подсчитывают по движениям грудной клетки или крыльев носа.
При подсчете во всех случаях пользуются секундомером. Если дыхание очень частое, целесообразно дублировать темп дыхания на каком-либо счетном приборе (например, для подсчета лейкоцитарной формулы), ударяя по клавишам в ритм дыхания.
Имеется несколько методов объективной регистрации дыхания животных. При этом надевают резиновую манжетку на грудь животного и присоединяют ее с записывающим прибором, например скимографом. Для собак, кошек, кроликов используют манжетку от тонометра, для мышей и крыс — тонкостенный резиновый баллон. Манжетку надо надевать так, чтобы захватить нижнюю часть грудной клетки и верхнюю часть живота.
Есть и другие, более сложные приборы' для записи дыхания. К каждому прибору прилагается описание и руководство,. указывающее, как работать с прибором. Надо с ними ознакомиться заранее.
Лаборанту следует выяснить, насколько равномерно происходит дыхание животных, какова глубина дыхания, не сопровождается ли дыхание какими-либо посторонними звуками, например хрипением, у крыс так называемым чирликанием, т. е. звуками, напоминающими быстрое тихое щелканье зубами. Если легочная вентиляция при частом и поверхностном дыхании недостаточна, животное дышит напряженно, в дыхании участвуют мышцы груди и живота, крылья носа резко движутся.
6.4.	Наблюдения за частотой сердцебиения
Пульс у животных разных видов различается по количеству ударов. Наиболее частый пульс у мышей. Так же как дыхание, пульс весьма непостоянен, поэтому при подсчете пульса применяются те же приемы, что и и при подсчете дыхания.
Пульс у собак, кроликов, кошек подсчитывают на бедренной или плечевой артерии. У кроликов и кошек можно сосчитать сердечные сокращения, положив руку
56
на грудную клетку в области сердечного толчка и слегка сжав грудную клетку. Животное при этом фиксируют другой рукой. При подсчете пульса можно использовать также какой-либо счетный регистрирующий прибор, как и при подсчете дыхания. Пульс подсчитывают за короткий промежуток времени — за 10—15 секунд, а затем пересчитывают на минуту.
Для подсчета пульса у мышей и крыс можно воспользоваться электрокардиографом. Так как это прибор довольно сложный, то нужно руководствоваться его описанием, приложенным к каждому экземпляру.
У мелких животных (мыши, крысы) изменение кровообращения можно выявить по изменению цвета мордочки и особенно ушей. Появляется покраснение или побледнение их, синеватый (цианотичный) оттенок. Хвост и лапки также могут изменять свой нормальный цвет. Лаборант должен обращать внимание на эти признаки.
6.5.	Измерение температуры тела животных
Температура тела лабораторных животных колеблется на протяжении суток, поэтому измерять ее следует всегда в одно и то же время дня, лучше утром до кормления. На температуру влияет время года (например, летом у кроликов она несколько повышается) и возраст животных. До месячного возраста у мышей, крыс, кроликов температура тела соответствует температуре внешнего воздуха — с понижением температуры воздуха снижается и температура тела у детенышей. Измерять температуру тела надо в один день у подопытных и у контрольных животных, чередуя их. В тетради отмечают температуру внешнего воздуха.
Термометрирование животных производят при помощи электротермометра (например, типа ТЭМП-60) или аппарата Мищука. Температуру тела у животных чаще всего измеряют в прямой кишке.
Можно использовать и обычные максимальные медицинские или ветеринарные термометры, для мышей — детский термометр.
Перед началом измерения температура и по окончании измерения термометр или датчик электротермометра дезинфицируют путем протирания спиртом, перед введением слегка смазывают вазелином. Термометр
57
вводят медленно, слегка вращая его, всегда на одинаковое расстояние. Чем глубже вводят термометр, тем более высокую температуру он показывает. Поэтому на термометр надевают резиновое кольцо, которое служит меткой, до какого расстояния надо вводить. Мышам и крысам вводят термометр на глубину 13—15 мм, кошкам, собакам, кроликам на глубину 3—5 см.
В табл. 3 приведены средние данные по температуре, количеству дыханий и сердцебиений в минуту у животных.
Таблица 3
Показателя числа дыхания и пульса в минуту, а также температуры тела у лабораторных животных
Вид ЖИВОТНОГО	Число дыханий Частота пульса		Температура тела
		в минуту	
Белые мыши	140—210	520—780	37,0—39°
Белые крысы	60—80	180—250	38,5—39,5°
Морские сзинки	80—100	240-300	37,5-39,5°
Кролики	50—60	120—140	37,7—38,8°
Кошки	20—30	100—120	37,5—39,5°
Собаки	12—24	70—150	37,5—39°
Г олуби	50—70	244	41,5—42,5°
Примечание. В табл. 3 приведены физиологические колебания показателей, но даже у некоторых нормальных животных могут быть более высокие и более низкие показатели, что зависит от самых различных причин.
7.	МЕТОДИКИ, ПРИМЕНЯЕМЫЕ ДЛЯ ВЫЯВЛЕНИЯ ДЕЙСТВИЯ ЯДОВИТЫХ ВЕЩЕСТВ НА ЖИВОТНЫХ
Для обнаружения первоначальных проявлений отравления применяют ряд методов, с помощью которых можно уловить изменения в организме животных.
Приводим некоторые методики, которые обычно выполняют лаборанты.
7.1.	Взятие крови и приемы клинического анализа крови
Кровь является важнейшей частью внутренней среды организма.
Из крови клетки тканей получают все необходимое для жизнедеятельности организма. В кровь поступают
58
также продукты клеточного и тканевого обмена. Все изменения в функциях отдельных органов и систем организма отражаются на составе крови. Поэтому изучение физиологических и морфологических особенностей крови имеет большое значение при токсикологических исследованиях.
Кровь состоит из жидкой части (плазмы) и взвешенных в ней форменных элементов: эритроцитов (красные кровяные тельца), лейкоцитов (белые кровяные тельца) и тромбоцитов (кровяные пластинки или бляшки).
Количество форменных элементов в крови колеблется не только у различных видов лабораторных животных, но и у Животных одного вида. Оно зависит от возраста, пола, породы животного, а также от способа и времени взятия крови, пищевого режима, времени года.
В токсикологическом эксперименте изучение морфологического состава крови применяется в большинстве подострых и хронических опытов для выявления состояния организма животных. Кроме того, многие яды действуют на форменные элементы крови специфически и вызывают те или иные характерные изменения.
Эритроциты составляют основную массу кровяных элементов. Они образуются в ткани красного костного мозга плоских костей (грудина, ребра, позвонки, а также в концах трубчатых костей) из специальных молодых клеток. В зрелом состоянии в периферической крови в норме они являются безъядерными клетками. Эритроциты состоят из бесцветной части (стромы), образующей их структурную основу, и особого пигмента — гемоглобина. Благодаря присутствию гемоглобина эритроциты хорошо окрашиваются в красный цвет азур-эо-зиновыми красками (смесь Романовского и др.). Эритроциты очень нежны и легко разрушаются от малейших внешних воздействий. Поэтому кровь надо брать очень осторожно, чтобы не было гемолиза, т. е. выхож-дения гемоглобина из эритроцитов. Естественное разрушение эритроцитов происходит в селезенке. Одна из главных функций эритроцитов — это перенос кислорода, осуществляемый в них гемоглобином, который имеет в своем составе железо.
Гемоглобин обладает способностью легко соединяться с газами: кислородом, окисью углерода, окислами азота.
59
Оксигемоглобин — соединение гемоглобина с кислородом. Это непрочное соединение, легко отдает кислород клеткам тканей, превращаясь в восстановленный гемоглобин. Чем полнее насыщение гемоглобина кислородом, тем цвет крови более алый, более светлый. Это является нормальным физиологическим процессом. При соединении гемоглобина с окисью углерода, окислами азота кровь теряет свою способность переносить кислород, наступают удушье и гибель животного.
Лейкоциты — бесцветные клетки крови с ядрами. Они делятся на зернистые (гранулоциты) и незернистые (агранулоциты). Гранулоциты при окраске по-разному воспринимают краски и по этому признаку подразделяются на базофилы, эозинофилы и нейтрофилы. Нейтрофилы по степени зрелости разделяются на юные, палочкоядерные и сегментоядерные. У кроликов нейтрофилы называют специальными гранулоцитами. К незернистым формам относятся лимфоциты и моноциты. Каждая форма лейкоцитов имеет свои особенности и назначения. Так, нейтрофилы и лимфоциты поглощают и внутриклеточно переваривают микробы, мертвые клетки организма и т. п. Количество и виды лейкоцитов резко колеблются в связи с состоянием организма, отражая реакцию его на различные вредные воздействия. Увеличение количества лейкоцитов называется лейкоцитозом, а уменьшение — лейкопенией.
Значение имеет не только количество лейкоцитов, но и процентное соотношение между различными формами. Это соотношение называется лейкоцитарной формулой. .
У каждого вида животных имеются определенное количество лейкоцитов и своя лейкоцитарная формула. Но колебания часто бывают весьма значительными. Приводим показатели красной и белой крови у различных видов лабораторных животных (табл. 4).
7.1.1.	Техника взятия крови для анализа
Для клинического анализа требуется небольшое количество крови, гораздо большее — для биохимического анализа.
Кровь берут два сотрудника. Животных иммобилизируют: крыс помещают в домики-станки, кошек — в деревянные ящики с круглыми отверстиями для головы.
60
Таблица 4
Показатели периферической крови лабораторных животных (по литературным и собственным данным)
Вид животного	Гемоглобин, %		Количество эритроцитов, млн.		Количество лейкоцитов, тыс.	
	среднее	колебания	среднее	колебания	среднее	колебания
Мыши Крысы Морские свинки Кролики Кошки Собаки	100 105—110 100 65 75 58—70	94—106 65-115 82—125 63—79,3 60—90 70—80	9,0 8,0 5,5 5,0	7,89—11,7 6,0 г- 9,3 3,6 — 6,0 3,1 — 6,0 7,0 — 8,0 6,5 — 6,0	7,5 15,0 12,0 9,8	7,5—13,0 4,8—15,2 5,0—16,0 7,0—11,3 12,0—18,0 9,0—10,0
Лейкоцитарная формула (в процентах)
Вид животного	Базофилы	Эозинофилы	Нейтрофилы (специальные гранулоциты)	Лимфоциты	Моноциты	Переходные фор- мы
Мыши	0,5	0,5—2,5	3,8—45,5	27—68, иногда 98	0,5	2—5,5
Крысы Морские	0,5	0,2—2,0	22,4	53-75	0—1	0—2
СВИНКИ	0,1—0,7	6,0—7,5	35,5—44,5	43,7—53,4	5-9,7	
Кролики	4,4—5,0	1—1,4	30,0—42,9	42,2—60,0	4-5,5	
Кошки	0,1—0,5	4,0	58,0—68,5	37,7—40,0	1,5—2,5	
Собаки	0,5—1,0	3—6,0	61,0—70,0	20,0-25,0	4,0—7,0	
Кроликов и морских свинок лаборант сажает к себе на колени, подложив клеенчатый фартук или завернув животное в клеенку.
Небольшое количество крови у кроликов, кошек и собак берут из вены, проходящей по тонкому краю уха. На месте взятия крови подрезают или выщипывают шерсть. Чтобы кровй' вытекала лучше, предварительно ухо животного слегка массируют пальцами, а затем протирают спиртом. Зажав пальцем центральный конец вены, прокалывают ее ниже зажатого места инъекционной иглой. Так как кровь приходится брать неоднократно, начинать надо с вен, находящихся на конце уха, а затем постепенно можно переходить ближе к кор
61
ню уха. Обычно в месте укола образуется тромб, вена зарастает и кровь из этого места уже не идет. У мышей и крыс кровь берут из хвостовых вен (прокалывают их иглой, а чаще отрезают кончик хвоста бритвой или острыми, тонкими ножницами). После взятия крови ранку смазывают йодной настойкой. Для расширения вен перед взятием крови хвост подогревают теплым воздухом, идущим от включенной электроплитки. Над плиткой на расстоянии 40—50 см помещают животных, которые находятся в домиках-станках со спущенными хвостами. Следует-' быть очень внимательными, чтобы животные не перегрелись, это может вызвать их гибель.
7.1.2.	Определение количества гемоглобина
Количество гемоглобина определяют чаще в гемометре Сали (ГС-2 и ГС-3). Он представляет собой штатив с тремя гнездами для узких пробирок. В крайние гнезда вставлены запаянные стеклянные пробирки со стандартной жидкостью бурого цвета или палочки бурого цвета. В среднее гнездо вставляют пробирку с раствором исследуемой крови. Количество гемоглобина обычно выражается в граммах на 100 мл крови, т. е. расчет идет в грамм-процентах.
На пробирках гемометра нанесены деления, соответствующие количеству гемоглобина (в процентах или в грамм-процентах). Для каждого комплекта эти расстояния строго одинаковы. Замена пробирок не рекомендуется.
К прибору Сали приложена пипетка с отметкой на 20 мм3. На конец пипетки надевают резиновую трубочку со стеклянным наконечником, который перед работой необходимо протирать спиртом. Первую каплю крови, которая появилась из вены, снимают ватным тампоном. Затем осторожно насасывают кровь в пипетку до метки. При быстром всасывании кровь может попасть в резиновую трубку. Если крови набралось больше чем нужно, к отверстию пипетки прикладывают кусочек фильтровальной бумажки или ваты и промокающим движением убирают излишнее количество крови. Вытирают также наружные стенки пипетки. После этого пипетку с кровью опускают в пробирку гемометра Сали. Предварительно в нее следует налить до нижней
62
метки 0,1 N (или 1,5%) раствор соляной кислоты. Кровь осторожно выдувают на дно пробирки, а оставшейся прозрачной жидкостью, насасывая ее и вновь выпуская, промывают пипетку. Легким постукиванием пальца по пробирке смешивают кровь с раствором соляной кислоты и оставляют стоять в течение 5 минут. Затем пробирку вставляют в штатив и доливают дистиллированной водой (или соляной кислотой), все время перемешивая тонкой стеклянной палочкой, которая входит в комплект прибора. Сравнивают цвет с имеющимися стандартами. Когда цвет всех трех пробирок будет одинаковым, пробирку с кровью вынимают и отмечают уровень жидкости. Цифра, соответствующая этому уровню, выражает количество гемоглобина в данной крови.
Количество гемоглобина также можно определять с помощью эритрогемометра, о котором будет сказано ниже.	,
7.1.3.	Определение количества эритроцитов и лейкоцитов
Подсчет количества эритроцитов и лейкоцитов крови требует точного отмеривания количества крови, разводящей жидкости, а также равномерного распределения в ней форменных элементов. Эритроциты и лейкоциты можно брать в специальные смесители-меланжеры.
Меланжер — это капиллярная трубка с метками 0,5 и 1. Трубка заканчивается расширением. За ним снова начинается капиллярная трубка с отметкой для красной крови 101, для белой крови 11. До этой метки надо набирать разводящую жидкость. Красная бусинка внутри расширения показывает, что это меланжер для красной крови, т. е. для эритроцитов, а белая бусинка — для белой крови, т. е. для лейкоцитов.
На короткий конец меланжера надевают резиновую трубку со стеклянным наконечником, через который ртом натягивают кровь и разводящую жидкость. Кровь в каждом случае набирают до метки 0,5. Для этого меланжер в горизонтальном положении подносят к основанию капли крови, слегка касаются ее и осторожно набирают кровь. Если набрана лишняя кровь или конец меланжера запачкан кровью, ее удаляют, прикасаясь кусочком ватки. Затем в меланжер набирают разводящую жидкость: для подсчета эритроцитов — 3%
63
раствор хлористого натрия, для лейкоцитов — свежеприготовленный 0,5% раствор уксусной кислоты. Большим и безымянным пальцами закрывают оба отверстия смесителя и встряхивают его, перемешивая содержимое. Наполненные меланжеры нужно держать в горизонт-тальном положении. Нельзя допускать попадания в них капелек воздуха. Меланжеры требуют большой затраты времени для мытья и обработки. Более удобно кровь брать в пробирки (по Борисовой). Для подсчета эритроцитов кровь набирают пипеткой от гемометра точно 20 мм3 (до отметки), затем опускают в пробирку, в которую налито 4 мл (отмерить точно!) 3% раствора хлористого натрия (иногда его заменяют жидкостью Гай-ема). Раствор хлористого натрия отмеривают градуированными или моровскими пипетками. Выдувают кровь на дно пробирки, промывают пипетку прозрачной жидкостью, которая находится над кровью, а затем перемешивают легким постукиванием пальца по пробирке.
Для подсчета лейкоцитов лучше взять пробирки меньшего диаметра. В пробирки вливают по 0,4 мл 0,5% раствора уксусной кислоты. Для большего удобства при подсчете раствор подкрашивают 1—2 каплями раствора метил- или генцианвиолета. Кровь также набирают пипеткой от гемометра до отметки, опускают в раствор уксусной кислоты, промывают ею пипетку.
Разведение крови как в меланжерах, так и в пробирках одинаково.
Подсчет эритроцитов и лейкоцитов производится в счетных камерах под микроскопом. Счетная камера — это пластинка из толстого стекла с небольшим углублением в центре. В этом углублении нанесена сетка. Середина камеры прикрывается плотным шлифованным покровным стеклом. Его надо плотно притереть. Прижимая пальцами концы стекла, делают легкие вращательные движения. Если стекло притерто, появляются радужные круги на концах покровного стекла там, где находились пальцы.
Меланжеры или пробирки, в которых имеется раствор крови, хорошо перемешивают, первые 1—2 капли сбрасывают, затем по одной капле впускают в камеру с обеих сторон между двумя желобками. После этого надо дать постоять камере одну минуту, чтобы эритроциты или лейкоциты осели на дно камеры.
64
Счетные камеры бывают разных типов, но в последнее время наиболее широко распространены камеры Горяева. Сетка состоит из 225 больших квадратов. Часть больших квадратов расчерчена на 16 малых квадратов. Подсчет форменных элементов крови (эритроцитов и лейкоцитов) производят под микроскопом с малым увеличением (объектив 8х, окуляр 10Х пли 15Х) 11 при несколько затемненном поле зрения.
Эритроциты считают в 5 больших квадратах, разделенных каждый на 16 малых квадратов. Для подсчета берут квадраты, расположенные по диагонали, так как эритроциты в камере распределены, как правило, неоднородно. Счету подлежат эритроциты, находящиеся внутри всех маленьких квадратов, и те, которые находятся на двух наружных сторонах большого квадрата, на левой и верхней линиях его или касаются их с той и другой стороны. Эритроциты, расположенные на правой и нижней линиях или касающиеся их с обеих сторон, не считаются. Результаты подсчета в каждом большом квадрате записывают в столбик п суммируют. Сумму умножают на 10 000 — полученное число показывает количество эритроцитов в 1 мл крови.
Лейкоциты считают в 100 больших квадратах, т. е. во всех неразграфленных больших квадратах. После подсчета полученное число нужно умножить на 50, что и будет показывать число лейкоцитов в 1 мл крови.
После подсчета одного меланжера камеру сейчас же моют водой и осторожно, чтобы не поцарапать сетку, вытирают насухо тонким полотенцем без ворса, кусочком бинта или марли.
В настоящее время в камерах ведут подсчет лишь лейкоцитов, для эритроцитов чаще используют фотоэлектрические эритрогемометры. К этим приборам всегда приложены методики работы с ними. Раньше, чем начинать работать с прибором, следует тщательно изучить описание прибора, усвоить, как надо с ним работать. Кровь берут пипеткой от гемометра Сали в количестве 20 мм3.
Есть и другие приборы для определения количества гемоглобина, эритроцитов, лейкоцитов, но они встречаются реже.
Определяются и другие показатели крови: осмотическая стойкость эритроцитов, количество тромбоцитов и
3—8178
65
Рис. 12. Приготовление мазков крови. I шлифованное стекло двигают по направлению вправо: 2 — шлифованное стекло двигают по направлению влево; 3 — правильно приготовленный мазок; 4 — неправильно приготовленный мазок крови.
др. Эти показатели не являются повседневными в практике токсикологического эксперимента.
Мазки крови нужны для подсчета лейкоцитарной формулы и изучения особенностей морфологии крови. Мазки крови делают на предметных стеклах с помощью более узкого шлифованного предметного стекла. Стекла промывают в горячей воде и насухо вытирают. Затем их опускают в широкогорлые банки с крышкой, где они и хранятся в смеси Никифорова (равные количества этилового спирта и серного эфира, т. е. эфира для наркоза). Перед употреблением стекла насухо вытирают.
Для приготовления мазка стекло берут за длинные края и прикасаются к капле крови на расстоянии 0,5— 1 см от узкого края стекла. Затем стекло кладут на стол, придерживая левой рукой. В правую руку берут стекло со шлифованным краем, приставляют его узким концом к капле крови под углом 45°. Когда кровь расплывается по всему ребру шлифованного стекла, легким быстрым движением ведут его к левому концу стекла. Капля крови должна быть небольшой, чтобы мазок не доходил до конца стекла на 1 —1,5 см. Сильно нажимать на стекло не следует. Оканчиваться мазок должен «метелочкой». Мазок сушат на воздухе до исчезновения влажного блеска, а затем подписывают на одном из углов простым карандашом номер животного и дату взятия крови (рис. 12).
Мазок следует зафиксировать, опустив его в метиловый спирт (на 5—10 минут), этиловый спирт или смесь Никифорова (на 30 минут). Для фиксации употребляется стаканы высотой 6—6,5 см, заполненные фиксатором
66
до определенной высоты. Стекла ставят в стаканы попарно, свободными поверхностями друг к другу, чтобы не смазать мазки. По окончании фиксации стекла извлекают из фиксатора с помощью пинцета, сушат на воздухе и укладывают мазками кверху на мостик, сделанный из двух стеклянных палочек, соединенных резинкой, для окраски. Мостик кладут над каким-либо плоским стеклянным или металлическим сосудом, куда сливается излишек краски.
Имеется несколько методов окраски мазков. Выбор метода представляется врачу-экспериментатору.
7.2.	Работа с микроскопом
Лаборанту часто приходится иметь дело с микроскопом, поэтому приводим краткое его описание. Как известно, микроскоп — это система оптических стекол, которая позволяет получать увеличенное изображение малых предметов и их частей, недоступных непосредственному рассматриванию невооруженным глазом.
Основанием и опорой микроскопа служит подковообразная площадка — башмак. На нем расположены коробка с микромеханизм-ом и тубусодержатель. В тубусе (чаще он укреплен наклонно, но может быть и вертикальным) расположена оптическая система. На верхнюю часть тубуса надевают окуляры. На нижнем конце тубуса находится движущийся круг с гнездами — револьвер.
На коробке укреплен также предметный столик, обычно снабженный зажимами и водителем для препаратов. В предметном столике под объективом имеется круглое сквозное отверстие, через которое проходят лучи света, освещающие препарат. Под предметным столиком укреплены конденсор, который можно перемещать вверх и вниз, и диафрагма; ниже крепится вилка зеркала. Зеркало имеет две поверхности — плоскую, которая применяется при работе с естественным светом (например, из окна), и вогнутую для работы с искусственным светом. Обычно для освещения зеркала применяется специальный осветитель, но можно использовать и настольную лампу. Конденсор сосредоточивает лучи света, отраженные зеркалом, на препарате. На верхней части его имеется одна или несколько линз, а в нижней части вмонтирована диафрагма. Отверстие ее
3*
67
можно суживать или расширять. При сужении отверстия диафрагмы достигается большая четкость изображения.
Увеличительная система микроскопа состоит из объектива и окуляра, вставленного в тубус.
Обычно при микроскопе имеется несколько объективов, например 8Х40Х и 90Х- Для работы с иммерсионной системой есть отдельный объектив с отметкой «им». Эта система применяется для рассматривания самых мелких частиц. При этом на предметное стекло наносят иммерсионное масло, соединяющее препарат с объективом.
Объективы ввинчиваются в револьвер и легко сменяются.
Окуляры также имеют разное увеличение — в 7; 10 и 15 раз.
При микроскопировании прежде всего необходимо добиться хорошей освещенности поля зрения. Для этого конденсатор поднимают, диафрагму открывают. Объектив 8Х> окуляр вынимают. Поворачивают зеркало так, чтобы в поле зрения попал источник света (окно, лампа и т. п.). Затем вставляют нужный окуляр.
Препарат кладут на предметный столик, прижимают его клеммами (зажимами), которые закрепляют его, и рассматривают под малым увеличением (объектив 8Х, окуляр 7, 10). Поворачивают макровинт, который находится обычно внизу микроскопа около коробки с микромеханизмом, с тем чтобы найти нужное расстояние между препаратом и линзой объектива, примерно 10—12 мм. Лучше поднимать тубус микроскопа, а не опускать. Когда появится изображение, начинают пользоваться микровинтом, который укреплен выше макровинта, и доводят изображение до четкости. Следует очень осторожно обращаться с винтами. Доводя до четкости, надо вращать микровинт очень медленно, подвигая его в одну и другую сторону. Неосторожным движением можно раздавить препарат и поцарапать линзу объектива. Установив четкое изображение, можно увеличить изображение, повернув револьвер и переместив объектив, например, на 40, усилить свет, открыв диафрагму, приподнять конденсор.
Если насадка микроскопа предназначена для одного глаза (монокулярна), то микроскопию следует вести поочередно то правым, то левым глазом. Оба глаза
68
должны быть при этом открыты. Для облегчения работы с монокулярным микроскопом на тубус надевают кусок черной плотной бумаги. Если микроскоп имеет бинокулярную насадку, то смотреть в микроскоп надо сразу обоими глазами.
В нерабочее время микроскоп хранят в специальном ящике или накрывают футляром, стеклянным колпаком. После работы микроскоп надо обтереть мягкой тряпкой. Если работа шла с эмульсией, то в первую очередь следует снять ее, протереть объектив спиртом или эфиром. Нельзя трогать пальцами поверхности линз объективов и окуляров, так как они от этого портятся.
В приложение к каждому микроскопу имеется книжечка с подробным описанием конструкции микроскопа, правил работы и ухода за ним. Эти правила лаборант должен выполнять неукоснительно.
7.3.	Определение суммационной способности центральной нервной системы
Изменение центральной нервной системы является одним из наиболее чувствительных показателей отравления ядовитыми веществами.
Из большого количества разработанных методик приводим один из обычно применяемых в токсикологическом эксперименте методов — определения суммаци-онно-порогового показателя. Для проведения опыта нужна установка, состоящая из прибора, при помощи которого получается прерывистый электрический ток (например, аппарат АСМ.-2 или АСМ-3, ИСЭ-01 и др.). К выходным клеммам прибора (аноду и катоду) присоединена приставка с прикрепленными на ней металлическими пластинками, на которые кладут кусочки ткани, смоченной физиологическим раствором. Эти кусочки не должны соприкасаться друг с другом. Верхнюю часть туловища животного вместе с головой можно завертывать в тряпку. Задние лапки крысы ставят на электроды, придерживая тело рукой в вертикальном положении (рис. 13).
По методике Розина на электроды подается элек-троимпульсный ток. Электрический ток напряжением 16В не влияет на животных при однократном воздействии, но повторение импульсов может вызывать
69
Рис. 13. Проведение исследования суммационно-порогового показателя к крысе.
реакцию и тогда животное отдергивает лапку. Отсчитывают, на каком импульсе это получилось. Показателем служит суммационное число, т. е. количество импульсов, требующееся для вызова рефлекторного движения.
Методика Сперанского отличается тем, что животное помещают на электроды при нулевом напряжении. Как только животное успокаивается, включают подачу прерывистого тока и одновременно начинают равномерно увеличивать подаваемое напряжение. Скорость передвижения тумблера 1 — 2В/сек. Лаборант следит за животным, одновременно вращая ручки плавной регулировки напряжения с заданной скоростью. Как только животное поднимает лапку, движение ручки останавливают, переводят ручной ток на показание «постоянный» и записывают напряжение в вольтах. В некоторых аппаратах предусмотрено автоматическое включение тока при остановке ручки. Существуют также приборы с автоматическим увеличением напряжения тока.
Перед началом работы следует включить прибор на 20 минут, чтобы он прогрелся.
В качестве прибора для импульсного электротока применяют различные аппараты, поэтому, прежде чем начать работать, необходимо установить шкалу. Это делает врач-экспериментатор. Для успешной работы следует внимательно прочитать описание, приложенное к прибору.
70
7.4.	Определение потребления кислорода
По количеству кислорода, который потребляется организмом, можно судить об интенсивности происходящих в нем окислительных процессов. Окислительные процессы изменяются при воздействии ядов.
Одним из наиболее распространенных приборов для определения потребления кислорода является прибор Миропольского (рис. 14).
Прибор имеет градуированную бюретку с трехходовым краном. В бюретку вводят кислород. С одной стороны бюретка соединена с камерой, куда помещают животных, с другой — с баллоном, наполненным водой. Камерой для животных может служить любой небольшой сосуд, закрытый пробкой. Для поглощения углекислоты в камеру кладут натронную известь, которую надо регулярно сменять, иначе она перестанет действовать.
Начиная работать с прибором, в первую очередь заполняют бюретку водой, открывают кран у баллона с водой. Затем переключают трехходовой кран так, чтобы отверстие, сообщающееся с баллоном, было закрыто, а открылось отверстие, через которое будет поступать кислород из кислородной подушки, присоединенной к трехходовому крану резиновой трубкой. Обычно подушка находится за доской. Нижний кран бюретки открывают, поступающий кислород вытесняет из бюретки воду наружу. Как только вода доходит до нижнего конца бюретки, кран закрывают. Теперь вся бюретка заполнена кислородом. Трехходовой кран переключают так, чтобы отверстие, через которое поступал кислород, оказалось бы перекрытым, а открылось отверстие, ведущее в систему бюретка — камера. Таким образом приготовляют прибор к работе.
В камеру помещают животное и оставляют его там на 3—5 минут, чтобы животное успокоилось и привыкло к обстановке. Крышка камеры должна быть на это время открыта. Затем крышку камеры закрывают, открывают кран, дающий доступ кислороду. Кислород поступает в камеру и поглощается животным при дыхании. Отмечают первоначальный уровень воды в бюретке, а затем по прошествии 3—5 минут (в зависимости от условий опыта). Количество кислорода можно рассчитывать на одну минуту или на 100 г веса животного.
71
Рис. 14. Прибор Миропольского для учета потребления кислорода.
Необходимо следить за водным манометром, который прикреплен около трехходового крана. Если прибор работает правильно, то уровень воды в манометре в обоих трубочках стоит на одном уровне.
В среднем за минуту потребляют кислорода мыши-самцы 1,8-4-2,7 мл, мыши-самки 1,6-И ,9 мл, крысы в среднем 6,3-4-9,7 мл. Но при проведении опыта даже у здоровых животных показатели могут значительно колебаться. Поэтому потребление кислорода обычно определяют 2—3 раза подряд, а затем выводят средние показатели.
72
На потребление кислорода животными влияют самые разнообразные факторы — время года, температура и влажность воздуха, даже освещенность.
Место, где стоит прибор, менять не нужно. Не следует ставить вблизи отопительных приборов. Обязательно фиксируют температуру наружного воздуха в тот момент, когда проводится опыт. Термометр должен находиться вблизи прибора.
В некоторых случаях производят определение потребления кислорода сразу у группы мышей, помещая животных в небольшой эксикатор. Все остальное проведение опыта остается таким же.
7.5.	Определение мышечной работоспособности
Изменение работоспособности является тонким показателем функционального состояния организма. При действии токсических веществ изменяются биохимические процессы в организме, нарушаются функции отдельных органов и тканей, ухудшается способность организма сопротивляться вредному воздействию. Поэтому изменение мышечной работоспособности постоянно применяется в токсикологическом эксперименте для выяснения действия исследуемых ядов.
Для определения мышечной работоспособности применяют ряд методик. Приводим наиболее употребительные.
7.5.1.	Проба с плаванием (по М. Л. Рыловой)
Для опыта используют какой-либо сосуд: ведро, бак или цинковый ящик. Столб воды для мышей должен быть 18—20 см, а для крыс — 30—35 см, чтобы животные не доставали хвостами дна сосуда. Температура воды должна быть 38—39°. В некоторых случаях используют воду с пониженной температурой — до 10—12°. Пониженная температура уменьшает время плавания животных. Условия опыта у подопытных и контрольных животных всегда должны быть совершенно одинаковыми.
Опыты проводят на мышах или крысах. Каждому животному дают нагрузку: мышам в 5% от веса тела, а крысам — в 10% от веса тела. Груз может быть различным — металлические трубочки, стеклянные бусинки или дробинки, привязанные к резиновым трубочкам,
73
которые надевают на хвост животного ближе к его основанию. Все грузики должны иметь определенный вес и храниться в ящиках, разобранные повесу. Перед началом опыта животных взвешивают и надевают им на хвост соответствующий его весу грузик. Затем пускают плавать одновременно подопытных и контрольных животных, примерно одинакового веса. Количество животных, которые могут плавать одновременно, зависит от величины поверхности воды. Нельзя, чтобы животным было тесно, они будут цепляться друг за друга и данные получатся неверными. Необходимо следить, чтобы животные все время плавали. Некоторые из них быстро приспособляются, набирают воздух в легкие и лежат на воде неподвижно. В таких случаях надо палочкой заставить животных снова плавать.
В зависимости от задач опыта животных можно вынимать или после первого погружения в воду, или когда они окончательно опустятся на дно. Если желательно, чтобы животные остались живы, то после первого погружения их извлекают, обсушивают тряпкой и помещают в теплое помещение, под теплую подстилку. Количество животных, оставшихся в живых, также является показателем действия исследуемого препарата. Но чаще животные плавают до окончательного погружения в воду на дно, поэтому опыт с плаванием проводится в конце эксперимента. Показателем работоспособности является время, которое животное может продержаться на воде.
7.5.2.	Проба с подзисаниэм
Сущность этой пробы заключается в том, что животные должны удерживаться на металлическом стержне, на который их сажают. В некоторых случаях используют горизонтальный стержень, и тогда животные должны удерживаться в висячем положении только передними лапами, в других — вертикальный (по Ю. И. Василенко), тогда животные могут удерживаться всеми четырьмя лапами. Учитывается время падения животных со стержня. Обычно под стержень ставят сосуд с теплой водой, иначе животные, не опасаясь падения, очень быстро бросают стержень. Часто пробу проводят 3 раза подряд с промежутками между каждым подвешиванием в 3—5 минут. Такой прием позволяет выявить, насколь
74
ко быстро восстанавливается работоспособность животного. Учитывается среднее время всех трех проб. Так как работоспособность в какой-то мере может зависеть и от веса животного, перед опытом необходимо определить их вес.
7.5.3.	Проба с поднятием грузиков (по С. В. Сперанскому)
К пластинке, сделанной из мелкой металлической сетки, крепкой ниткой привязана цепь грузиков. Вес первого из них вместе с сеткой составляет 40 г, вес каждого из последующих грузиков — 3 г. В цепочке 40 грузиков, общая длина цепочки 50 см.
Мышь сажают на сетчатую пластинку. Затем лаборант поднимает животное за хвост вверх. Мышь, стремясь удержаться на пластинке, цепляется за нее всеми четырьмя лапками и тянет нитку с грузиками и до тех пор, пока тяжесть их не заставляет выпустить пластинку из лапок (рис. 15). Учитывается вес грузиков, которые смогла поднять и удержать мышь. Для получения более точных результатов мышь следует поднимать вверх с одинаковой скоростью, например за 2 секунды такой отрезок нитки, на котором укреплено 10 грузиков.
Опыт повторяют 2 раза, из двух показателей берут только больший результат.
7.6.	Функциональные нагрузки
Известно, что организм может привыкать к действию небольших количеств ядов и тогда каких-либо проявлений вредного действия не будет видно. Для того чтобы нарушить сложившееся равновесие, прибегают к так называемым функциональным нагрузкам. Новые, непривычные для организма факторы нарушают сложившееся в организме привыкание и ядовитое действие вещества проявляется.
Функциональных нагрузок предложено довольно много. Приводим наиболее употребительные из них.
7.6.1.	Изменение режима питания
Изменение режима питания можно проводить различными способами: например, уменьшают количество кор
ма или отдельные компоненты в пище животных. Чаще проводят следующую нагрузку. Крыс лишают пищи полностью на 2 суток, оставляя им только воду в достаточном количестве. Через 2 суток им дают обычный рацион. Перед началом опыта всех животных взвешивают, затем взвешивают через 2 дня, сразу же после окончания голодания. Повторяют взвешивание ежедневно до тех пор, пока крысы наберут первоначальный вес, который был до голодания.
Кроликов лишают пищи на 3 суток. В последующие 3 суток они получают половинный рацион и только на 7-й день — обычный рацион. Взвешивают животных до опыта, через 3 дня, на 7-й день и затем через каждые 3 дня до восстановления веса.
iwH	Рис. 15. Поднятие мышью грузиков.
76
Учитывается как абсолютная величина падения веса, так и время его восстановления.
7.6.2.	Холодовая проба
Крысам измеряют ректальную температуру, затем подвергают их охлаждению, помещая в холодильник в станках-домиках на 10 минут при температуре +5°. Затем вновь измеряют им температуру. При помещении животных в холодильник следует позаботиться, чтобы там поддерживалась чистота: животных располагают в станках-домиках на специальных подстилках.
7.6.3.	Гексеналовая проба
Гексеналовая (или тиопенталовая) проба применяется для выявления нарушений антитоксической функции печени. Опыты чаще проводят на мышах, но можно использовать и крыс. Приготовляют 2% водный раствор гексенала и сразу же вводят мышам внутрибрюшинно из расчета 80 мг/кг веса. Гексенал обладает снотворным действием, и мыши засыпают. Скорость наступления и длительность гексеналового сна зависят от функционального состояния печени, так как гексенал разрушается в основном в печени. Если антитоксическая функция печени нарушена, продолжительность сна увеличивается. Время наркозного сна выражается в минутах. Подопытных и контрольных животных подбирают парами по весу и гексенал им вводят одновременно.
7.6.4.	Спиртовая проба
Этиловый спирт вызывает изменение функционального состояния коры головного мозга и как следствие этого — нарушение защитно-приспособительных механизмов организма животных. Поэтому введение этилового спирта применяют в качестве физиологической нагрузки для выявления скрытого действия ядов. Опыт проводится следующим образом.
В острых опытах с однократным введением сначала перорально вводят исследуемое вещество, затем через 10 минут так же вводят 0,003—0,004 мл/г 40% раствора этилового спирта. Введение этих количеств само по се
77
бе не вызывает каких-либо изменений в состоянии животных, но при этом обнаруживается скрытое действие яда. Функциональное состояние организма животных проверяют по любому выбранному тесту до введения спирта и через 30 минут после его введения. Полученные материалы сравнивают как между собой у каждого животного, так и с данными контрольных животных.
Спиртовую пробу можно проводить в подострых и хронических опытах.
7.7.	Проведение опытов на размножение
В настоящее время часто изучают действие химических соединений не только на взрослых животных, но и на их потомство. Для этого нужно знать правила обращения с детенышами.
Опыты с размножением обычно проводят на мышах и крысах, так как продолжительность беременности у них невелика: у крыс она составляет чаще 18—22, иногда до 26 дней, у мышей — от 18 до 25 дней. Детенышей в окоте бывает до 7—8.
Для размножения ссаживают самцов и самок в одну клетку. В некоторых случаях берут 1 самца на 2 самок, но лучше посадить 1 самца на 5 самок-мышей или 1 самца крысы — на 4 самки. Каждой «семье» предоставляется отдельная клетка. Когда у самок появляются видимые признаки беременности (увеличенный живот, хорошо видные соски — эти признаки особенно ясно видны при поднимании животных за хвост вниз головой), самцов отсаживают в другие клетки. Окот в большинстве случаев происходит ночью и продолжается 20—30 минут. Крысята и мышата рождаются слепыми, с закрытыми ушами и коротким хвостом.
В первый же день после окота необходимо осмотреть гнездо, установить количество родившихся детенышей, отметить число мертвых и какие-либо видимые пороки развития. Взвешивая всех детенышей сразу и разделив полученный вес на число родившихся, вычисляют средний вес детенышей. Взвешивают также самого маленького и самого крупного детеныша — этим устанавливают отклонения в весе. С детенышами надо обращаться очень осторожно. Руками их лучше не брать, а применять хирургический пинцет. Если животное приходится взять руками, то руки предварительно хорошо обти
78
рают подстилкой гнезда, где лежат животные. Это отобьет запах человека. Если детеныши будут «пахнуть человеком», самки могут их загрызть. Так же поступают в случаях, когда нужно переместить детенышей от одной самки к другой. Самок удаляют, делят детенышей, как это нужно по опыту, затем хорошо вытирают их подстилкой и перемешивают. Через некоторое время можно подпустить самку к детенышам. Можно смазывать спинку детенышей мочой матери-самки.
Надо следить за развитием детенышей. Приводим показатели развития мышат и крысят.
Открытие ушей
Открытие глаз
Прорезывание резцов
Покрытие шерстью
Крысята
2—4-п день реже 5-й день 1С—14-й день, реже до 17-го дня
8—10-й день 8—16-й »
Мышата
С—7-й день
12—17-й
Е— 14-й 8—12-й
день »
»
Как видно, сроки развития мышат и крысят колеблются в довольно больших пределах, поэтому полученные у подопытных животных данные надо сравнивать с контрольными. Колебания в сроках развития зависят от внешних факторов (время года, условия содержания, возраст родителей) и от индивидуальных особенностей детенышей. Очень важно уловить изменения, зависящие от вредного воздействия токсических веществ.
За беременными и кормящими самками следует установить хороший уход. Встречаются мыши мало-молочные, тогда детеныши их развиваются плохо. Детеныши, получающие молоко матери в недостаточном количестве, по внешнему виду отличаются от нормально питающихся животных. Такие детеныши плохо упитаны, кожа у них не блестит, собирается складками. Через кожные покровы видно, что желудок совсем не заполнен молоком или заполнен только частично. Голодные детеныши выползают из гнезда, в то время как сытые лежат спокойно в гнезде.
В теплое время года животные размножаются лучше и детеныши у них более крепкие и крупные.
Когда детеныши подрастают, они выходят из гнезда и постепенно переходят к самостоятельному питанию. У крысят это бывает начиная с 17-го и до 21-го дня, у мышат — с 24-го дня. Месячных животных можно отсаживать от маток в отдельную клетку.
79
Следует помнить, что у мышат и крысят ранних возрастных периодов еще нет постоянной температуры тела, она зависит от температуры внешнего воздуха. Поэтому, производя какие-либо манипуляции с детенышами, не следует долго держать их вне гнезда. Лучше помещать их в специальное ватное гнездо. Температуру детенышам измеряют кожным электротермометром, не вынимая животных из гнезда. Датчик вставляют в рот.
У детенышей крыс можно подсчитать число дыханий в минуту. Для этого надо их взять на руку и еле-  дить за колебаниями грудной клетки.
7.8.	Определение веса внутренних органов животных и весовых коэффициентов
Вес внутренних органов животных может изменяться под влиянием токсических веществ. Благодаря чувствительности этого показателя обычно каждый эксперимент заканчивается определением веса внутренних органов животных. Естественно, что взвешивание производят после того, как животные будут забиты. *-.yi
Способ >^боя особого значения не имеет, однако органы, извлеченные из тела животного, не должны находиться на столе, так как они постепенно высыхают и уменьшаются в весе.
Перед |^боем животных взвешивают. После вскрытия выделяют органы. Все органы, которые подлежат взвешиванию, должны быть освобождены от связанных с ними органов и тканей. Так, от сердца отсекают крупные сосуды, из полостей удаляют свернувшуюся кровь. Печень взвешивают без желчного пузыря, а почки— без капсулы. Парные органы взвешивают каждый в отдельности. Для удаления крови органы сначала промывают в физиологическом растворе, а затем хорошо осушивают фильтровальной бумагой.
Взвешивание маленьких органов производят на торсионных весах, а более крупных — на аптекарских чашечных весах или технических (например, при определении веса органов кролика).
Выбор вида органов для взвешивания зависит от целей опыта, но чаще определяют вес паренхиматозных органов (печень, селезенка, почки); желез внутренней секреции (щитовидная железа, надпочечники). Уделя
80
ют внимание также определению веса половых органов (семенников и др.).
Получив абсолютные показатели веса органов, определяют их весовые коэффициенты. Этот коэффициент определяет отношение веса органа в граммах к весу тела животного, выраженного в килограммах (М. Л. Рылова). Данные, полученные у подопытных животных, сравнивают с таковыми у контрольных животных.
8.	ПРОВЕДЕНИЕ ТОКСИКОЛОГИЧЕСКОГО ОПЫТА
Необходимым условием является правильное комплектование групп животных. Все группы как подопытных, так и контрольных животных должны быть равноценными. Из животных, привезенных из одного и того же питомника в одно и то же время, отбирают наиболее близких между собой по весу. Животных, резко отличающихся по весу от остальных, в опыт брать не следует. В каждую группу должны войти животные с большим весом, со средним и с меньшим, так, чтобы средний вес был равен или близок во всех группах. В каждой группе колебания в весе мышей могут быть в пределах 1—2 г, крыс — 5—10 г, морских свинок—15—20 г, кроликов—200—300 г.
Подострые и хронические опыты должны быть обеспечены контролем. В контрольные группы животных подбирают в таком же количестве, как и в опытные, — одинаковых кондиций, одного привоза и т. д. Контрольных животных содержат в таких же условиях, как и подопытных. При введении химических веществ в желудок подопытным животным, контрольным вводят такое же количество воды. Если идет ингаляционное воздействие, то в одну из камер, куда не поступает испытуемое вещество, помещают контрольных животных. Если по требованиям опыта условия существования животных резко изменены (например, длительное пребывание в камере), то делают еще один контроль, так называемый чистый, который помещают в нормальных условиях вивария. Тогда можно будет более точно сравнить полученные данные.
На камере или на клетке, где содержатся животные, должна быть повешена бирка. На ней указывают
81
номер группы, пол животных, чем произведено их отравление, сроки опыта. Часто при этом указывают и фамилию врача-экспериментатора.
Показатели применяемых методик надо снимать у животных опытных и контрольных групп в один день. При этом берут поочередно из каждой группы по одному животному. Так будут соблюдены равные условия для всех животных. По той же причине не разрешается производить исследование подопытных и контрольных животных в разные дни.
Каждый лаборант должен вести записи о проведенной работе в особой тетради. Не следует записывать сначала на листке, а затем переписывать в тетрадь. На это уходит лишнее время, возможны утеря листка или неправильный перенос данных в тетрадь.
В тетради должны быть записаны следующие показатели: название опыта, характеристика животных (вид, вес, дата получения партии, состояние животных и др.). Каждый раз, когда проводят взятие показателей, записывают не только полученные данные, но и обязательно указывают время (часе минутами, день, месяц, год), ; температуру воздуха, краткую характеристику погоды- -Особенно это важно при исследовании центральной нервной системы, так как животные реагируют на изменение погоды. При проведении ингаляционного эксперимента в тетрадь заносят схему оборудования камеры, данные о скорости подачи вещества в камеру, температуре, влажности, давлении в камере в течение опыта и такие же сведения о наружном воздухе, времени отбора проб, методе определения количества вещества, полученные результаты.
Желательно обработку полученных результатов производить по ходу работы.
Результаты проведенных исследований оформляют в таблицы. Данные, полученные для каждого животного, суммируют, затем выводят средние величины. После этого производят статистическую обработку. Метод статистической обработки избирает руководитель. Поскольку этих методов существует довольно много, то останавливаться на проведении их в данном пособии невозможно; в каждом отдельном случае лаборант получит инструктаж от своего руководителя.
Большое применение имеет графический метод обработки полученных данных. Принцип всего много
82
образия диаграмм и кривых основан на размещении геометрических фигур (прямоугольники, квадраты, треугольники ит. п.) или отдельных точек на оси абсциссе учетом шкалы показателей, отмеченных на оси ординат. При построении плоскостных диаграмм ось абсцисс делят на равные отрезки и на них размещают избранные фигуры. Этот вид диаграмм применяют для изображения каких-либо отдельных значений, например, гибели животных и т. п. Для изображения показателя в динамике прибегают к кривым линиям, которыми соединяют точки, полученные в те или иные периоды времени. В данном случае необходимо учитывать время, поэтому на оси абсцисс откладывают отрезки, соответствующие отрезкам времени. Так, если первое исследование было через неделю, второе — через месяц, третье — еще через 2 месяца, то сначала отмечают точку, соответствующую 3 месяцам. Разделив отрезок на три равные части, отмечают вторую точку на первой трети отрезка. Наконец, разделив первый месячный отрезок на четыре части, ставят точку, соответствующую первой неделе.
Размеры масштабов, применяемых на оси абсцисс и оси ординат должны находиться в строгом сочетании между собой, т. е. в таком соотношении друг с другом, которое лучше всего отражало бы характер явлений.
Если рассчитаны колебания показателей, уместно отметить их на соответствующем месте, указав верхнюю и нижнюю границы колебаний.
2 часть
Лабораторная техника химии и биохимии
Л. В. Жидкова
9.	ЛАБОРАТОРНЫЕ МАТЕРИАЛЫ
9.1.	Стекло и обращение с ним
Большинство химических лабораторных работ производят в стеклянной посуде и в стеклянных приборах, которые легко бьются. В связи с этим стеклянные предметы рекомендуется закреплять в зажимах, снабженных прокладками из пробки или кусочками резиновых шлангов. Много стеклянной посуды бьется вследствие нарушения правил в условиях температурных перепадов. Необходимо помнить, что круглую колбу или колбу с вогнутым дном можно нагревать открытым пламенем, а колбу с плоским дном так нагревать нельзя. Стеклянная посуда теряет стойкость к перепадам температуры и к механическому удару при нарушении по-верхностого слоя. В связи с этим стеклянную посуду не следует чистить песком или ставить на песчаную баню.
В лабораторной работе часто появляется потребность в элементарных стеклодувных работах (отрезать кусочек трубки, согнуть или вытянуть стеклянную трубку). Разрезать стеклянные трубки можно трехгранным или плоским напильником. Для этого на трубке делают один глубокий надрез, после чего трубку берут двумя руками и осторожно сгибают ее в сторону, противоположную надрезу. С целью безопасности части трубки, которые держат в руках, обертывают полотенцем и ломают, держа ее дальше от глаз. Можно разрезать трубку и под водой обыкновенными ножницами. Для этого стеклянную трубку и ножницы погружают под воду; разрезание трубки ножницами исключает появление трещин, возможное при других приемах. Таким способом можно разрезать трубки диаметром до 8—10 мм.
84
Концы трубки оплавляют путем введения их на короткое время в верхнюю часть пламени.
Для разрезания трубок большего диаметра можно использовать раскаленную стеклянную палочку или проволоку. Раскаленным докрасна и оттянутым концом палочки касаются трубки; при небольшом нажиме этим раскаленным концом на трубке образуется трещина. Повторным прикосновением по тому же месту трещину увеличивают. Такую операцию проделывают по всей окружности трубки.
Можно использовать также проволоку, которую сгибают так, чтобы она охватывала третью часть окружности трубки. Согнутый конец проволоки накаляют докрасна и прикладывают к трубке, которую при этом вращают вокруг продольной оси.
Сгибание стеклянных трубок производится довольно-просто — при постоянном вращении подогревается достаточно длинный участок трубки на широком пламени газовой горелки. Равномерно подогретую трубку плавно сгибают вне пламени.
Таким способом красиво и правильно можно согнуть трубки диаметром до 8 мм. Трубки большего диаметра сгибают при поддувании, что требует специального приспособления.
Трубку или палочку, нагретую до полного размягчения, можно вытянуть. Таким путем изготавливают пастеровские пипетки и капилляры. Для этого разогревают возможно больший отрезок средней части трубки до-размягчения стекла и быстро, но плавно растягивают. Образуется капилляр, из которого, разрезав его посередине, можно получить две пастеровские пипетки, а если отсечь от обоих концов трубки — капилляр.
9.2.	Пробки
В лабораторной работе чаще всего применяются корковые, резиновые, стеклянные и полиэтиленовые* пробки.
Корковые пробки подбирают немного большего диаметра, чем горлышко сосуда, а затем их обжимают при помощи пробочного жома («крокодила»).
Корковая пробка мало устойчива к действию галогенов (хлора, брома, йода), концентрированной азот
85-
ной кислоты, серной кислоты, щелочей и ко многим органическим растворителям. Для повышения устойчивости к действию химических веществ корковые пробки покрывают парафином, коллодиевым или ацетоновым лаком.
Резиновые пробки дают возможность создать более полную герметичность сосудов, но вместе с тем их не всегда можно применять. От одних веществ резина набухает, другие же экстрагируют из нее примеси — смолу, серу и пр. Нельзя закрывать резиновыми пробками сосуды с органическими растворителями (бензин, ацетон, хлороформ, сероуглерод, хлорированные углеводороды, петролейный эфир, нитробензол и др.), неорганическими кислотами, особенно серной и азотной. Резиновые пробки поступают в продажу присыпанные тальком или другими минеральными веществами, поэтому перед употреблением их следует вымыть водой с мылом, а затем несколько раз ополоснуть дистиллированной водой. Резиновые пробки имеют помер, соответствующий диаметру в миллиметрах.
Полиэтиленовые пробки также широко используются в лабораторной практике. Они имеют ряд преимуществ перед стеклянными пробками, так как при закрывании сосудов не происходит их заедания. Однако эти пробки нельзя использовать при монтаже аппаратуры, нельзя закрывать ими сосуды с такими веществами, как галоиды, концентрированные кислоты (серная, азотная, хлорная, хлорсульфоновая, хромовая), трехокись хрома, перекись водорода, четыреххлористый углерод и сероуглерод.
Допускается их соприкосновение с 50% серной и 30% соляной кислотами. С появлением новых полимерных материалов возможности использования пробок из них возрастут.
Стеклянные пробки. Вещества, действующие на корковые, резиновые и полиэтиленовые пробки, хранят в склянках с притертыми стеклянными пробками. Щелочь как в твердом, так и в жидком виде хранить в последних нельзя.
Часто при монтаже приборов бывает нужна пробка с отверстиями. Для сверления пробок применяют ручные и механические сверла. Пробку сверлят с ее нижнего узкого конца. При сверлении резиновых пробок применяют вещества, облегчающие сверление (кон
.86
центрированную щелочь, вазелиновое масло, глицерин) .
9.3.	Работа с резиновыми трубками и шлангами
При монтаже аппаратуры широко используются резиновые шланги. Конец шланга должен иметь гладкие, ровно обрезанные края. Края металлической трубки следует тщательно опилить, а концы стеклянных трубок оплавить. Перед надеванием шлангов на трубку в большинстве случаев целесообразно смочить их изнутри, а трубки снаружи — водой. Можно использовать для смазки касторовое масло или вазелин. Чтобы надетый шланг не соскальзывал, его прижимают к трубке металлической скобой и затягивают винтом. Нельзя укреплять шланги проволокой.
9.4.	Смазки
В лаборатории часто используются стеклянная посуда и приборы с пробками и кранами со шлифом. Для герметичности и уменьшения трения шлифованную поверхность этих деталей смазывают. Чаще всего для этой цели используют чистый вазелин. Такая смазка предупреждает подтекание и заедание шлифов. Смазка, состоящая из смеси чистого вазелина с безводным ланолином в отношении 1:1, по качеству превосходит вазелин. Очень распространена так называемая смазка Рамзая, представляющая собой смесь вазелина, парафина или ланолина и сырого каучука. Они отличаются от других смазок большой вязкостью. Эту смазку можно приготовить путем растворения 10—30 г мелко раскрошенного сырого каучука в 50 г вазелина и 10 г парафина при температуре 100—120°.
10.	ЛАБОРАТОРНАЯ ПОСУДА
В токсикологической лаборатории при выполнении биохимических анализов могут использоваться стеклянная и фарфоровая посуда, а также изделия из кварцевого стекла. Приводим описание и условия применения основных видов лабораторной посуды.
87
10.1.	Стеклянная посуда
Наиболее широко в лаборатории пользуются пробирками (рис. 16). Пробирки (обычные, градуированные— с пробкой и без пробки), центрифужные (обычные и градуированные).
Для удобства в проведении работы пробирки размещают в штативе. Для перемешивания налитых в пробирку реактивов ее берут в левую руку за верхний конец и указательным пальцем правой руки ударяют косым ударом по низу пробирки (отверстие пробирки следует направить от себя). Недопустимо закрывать пробирку пальцем при встряхивании, так как при этом не только можно внести постороннее вещество, но и повредить кожу пальца. Если пробирка заполнена более чем наполовину, ее содержимое перемешивают стеклянной палочкой.
При нагревании пробирки следует зажать ее в держателе, открытый конец пробирки должен быть обращен от работающего. Можно сделать держатель для пробирки самому. Для этого берут лист бумаги (лучше фильтровальной) и складывают его несколько раз. Получается полоска, которой и можно плотно охватить верхнюю часть пробирки..
Химические воронки выпускаются различных размеров верхнего диаметра (от 35 до 300 мм) и разной длины (рис. 17). Воронки с коротким концом служат для переливания жидкостей, при этом не следует заполнять воронку до краев. Если воронка прилегает плотно к горлу сосуда, в который наливают жидкость, то переливание затрудняется и даже возможен выброс жидкости, так как внутри сосуда создается повышенное давление. В этих случаях необходимо время от времени приподнимать воронку. Для фильтрования лучше использовать воронку с удлиненным срезанным концом.
Делительные воронки применяют для разделения несмешивающихся жидкостей. Они бывают различной формы и емкости и имеют верхнее отверстие, снабженное притертой стеклянной пробкой, и более узкий носик внизу со стеклянным притертым краном.
Перед работой шлиф стеклянного крана воронки нужно смазать вазелином или специальной смазкой (см. выше). Смазку наносят очень тонким слоем, так, .88
Рис. 16. Пробирки.
1 — простая; 2 — градуированная; 3 — градуированная с притертой пробкой; 4 — центрифужная обычная: 5 — центрифужная
градуированная.
Рис. 17. Воронки.
1 — фильтровальные; 2 — делительная; 3 — воронка Бюхнера (фарфоровая).
чтобы при поворачивании крана она не попадала в трубку воронки или в отверстие крана.
В лаборатории широко используют круглые и конические колбы (рис. 18). Круглые колбы бывают круглодонные и плоскодонные. Конические колбы (колбы
89
Рис. 18. Колбы.
I - плоскодонная; 2 — круглодонная; 3 — конические (колба Эрленмейера);
4 — колба Бунзена; 5 — колба Кьельдаля.
Эрленмейера) находят широкое применение при титровании. Для фильтрования под вакуумом используют специальные колбы Бунзена. Эти колбы имеют в верхней части тубус; изготовлены они из толстого стекла.
Химические стаканы изготовляют из тугоплавкого тонкого стекла, их можно нагревать, но только на бане или на асбестовой сетке (помни о плоском дне!). Толстостенные (батарейные) стаканы предназначены для работ без нагрева.
Холодильники — приборы, предназначенные для охлаждения и конденсации паров. Холодильники, предназначенные для собирания конденсата, называют прямыми, а холодильники, из которых конденсат возвращается в сосуд, называют обратными. В лаборатории очень распространены прямые холодильники Либиха.
Необходимыми приборами в лаборатории являются водоструйные насосы. Их применяют для ускорения фильтрования. При помощи этих насосов можно создать разряжение до 5—12 мм рт. ст.
Эксикаторы применяются для медленного высушивания и хранения веществ, которые легко поглощают влагу из воздуха. Существует два типа эксикаторов: обыкновенные и вакуум-эксикаторы (рис.19). Последние имеют специальный кран на крышке, позволяющий соединять эксикатор с вакуум-насосом. В качестве водопоглощающих средств в нижнюю часть эксикатора можно помещать хлористый кальций (прокаленный), серную кислоту концентрированную (кислоту меняют,
90
Рис. 19. Эксикаторы. 1 — обыкновенный: 2 — вакуум-эксикатор.
суда.
Рис. 20. Мерная по-
I — цилиндр; 2 — мензурка; 3 -- колба.
когда она потемнеет), силикагель и окись алюминия (безводная), пятиокись фосфора. Эксикатор имеет крышку с пришлифованным краем. Для создания герметичности шлифованные края эксикатора и крышки слегка смазывают и хорошо притирают. Особенно тщательно следует притереть эксикатор при работе с вакуум-экси-катором.
Для измерения объема жидкости в лаборатории используют мерную посуду: мерные цилиндры, мензурки, пипетки, бюретки, мерные колбы (рис. 20 и 21). С мерной посудой следует работать особенно осторожно и аккуратно. Каждая колба имеет свою притертую пробку. Нельзя менять пробки от одной колбы к другой. Налитую колбу не следует брать за удлиненную шейку, она не выдерживает тяжести и отваливается. Такие колбы следует снизу поддерживать за круглую часть рукой. Градуированные цилиндры, стаканы и др. часто
91
1	2
Рис. 21. Мерные пипетки.
1 — пипетка Мора; 2 — градуированная пипетка: 3 — бюретка.
делают из толстостенного стекла. Эта посуда не выдерживает нагревания или наливания горячих растворов.
Поверхность налитой в сосуд жидкости образует мениск — чуть вогнутый круг, в котором можно различить верхний и нижний край. Отсчет, как правило, ведут по нижнему мениску и лишь растворы, окрашенные в темный цвет, отмеривают по верхнему мениску.
10.2.	Фарфоровая и кварцевая посуда
В лаборатории широко применяются различные изделия из фарфора: выпарительные чашки, ступки, воронки Бюхнера, шпатели. Особенностью кварцевой и фарфоровой посуды является ее устойчивость к нагреванию и воздействию большинства химических веществ. Кварцевую посуду можно нагревать на голом огне и сразу охлаждать. Однако изделия нельзя употреблять при работе с фтористоводородной кислотой и щелочами, так как кремнезем с ними взаимодействует. Из
92
кварцевого стекла изготовляют колбы всех видов, пробирки, стаканы и др.
10.3.	Мытье и сушка химической посуды
Каждый лабораторный работник должен обязательно уметь правильно мыть химическую посуду. От степени чистоты посуды зависит результат химического анализа. Стеклянная посуда считается чистой, если при ополаскивании на стенках ее не образуется отдельных капель, а вода оставляет равномерную тончайшую пленку. Стеклянную посуду следует мыть сразу после ее употребления.
Посуду моют различными способами в зависимости от того, чем она загрязнена. В тех случаях, когда химическая посуда не загрязнена смолой, жировыми и другими не растворяющимися в воде веществами, посуду можно мыть теплой водой. Если на стенках посуды имеется налет каких-либо солей или осадок, то применяют ерш, а затем окончательно моют водой. При работе с ершом необходимо следить, чтобы металлическая его часть не касалась дна и стенок посуды, так как при этом повреждается поверхностный слой и посуда теряет прочность.
Если посуда загрязнена смолистыми и другими органическими веществами, которые не растворяются в воде, то для ее мытья применяют органические растворители.
К органическим растворителям относятся спирты, ацетон, эфир (серный), петролейный эфир, бензин, четыреххлористый углерод и др. Еще лучший эффект получается при применении изопропилового спирта. Органический растворитель после обработки им посуды не выбрасывают, а очищают перегонкой и снова употребляют.
Прекрасными моющими свойствами обладает 10% раствор тринатрийфосфата. Для мытья посуды может быть использовано мыло. Для этого посуду погружают в горячий мыльный раствор, в который добавляют соду или тринатрийфосфат. При такой обработке посуды необходимо, чтобы она была предварительно вымыта водой. Хороший обезжиривающий эффект может быть получен при мытье горячим раствором сухой горчицы.
93
Наиболее распространенным способом мытья посуды является применение хромовой смеси. Хромовую смесь готовят из двухромовокислого калия путем растворения его в концентрированной серной кислоте. Соли вносят столько, чтобы после растворения на дне оставался ее избыток. Правильно приготовленная смесь темно-коричневого цвета.
При использовании для приготовления смеси двухромовокислого натрия его предварительно растворяют в воде, а затем в раствор осторожно добавляют концентрированную серную кислоту (100 мл воды, 6 г двухромовокислого натрия и 100 мл серной кислоты). При мытье хромовой смесью посуду сначала ополаскивают водой, а затем наливают слегка подогретую хромовую смесь и осторожно смачивают ею всю поверхность стенок. Слив смесь в специальную емкость, посуду оставляют стоять несколько минут, после чего моют теплой водой. Для удаления загрязнения на горлышках колб хромовую смесь наливают в стакан и опускают в него горло колбы.
Пипетки, бюретки и длинные трубки помещают для мытья в толстостенный цилиндр и заливают почти до верха хромовой смесью, затем их переворачивают, опуская противоположными концами в цилиндр.
Хромовую смесь используют обычно многократно; признаком непригодности смеси является переход цвета из темно-коричневого в темно-зеленый.
Хромовую смесь нельзя применять, если посуда загрязнена парафином, керосином, воском, минеральными маслами. Если посуда загрязнена солями бария, ее также нельзя мыть хромовой смесью, так как при этом образуется сернокислый барий, который трудно удаляется.
Хорошим средством для мытья посуды является 5% раствор марганцовокислого калия, подогретый и подкисленный серной кислотой (на 100 мл раствора добавляют 3—5 мл концентрированной серной кислоты).
В отдельных случаях посуду можно мыть просто концентрированными кислотами и щелочами, которые, в частности, хорошо отмывают жирные и смолистые загрязнения. Вымытую посуду обязательно споласкивают 2—3 раза дистиллированной водой.
Когда требуется особенно чистая посуда, ее предварительно моют каким-либо обычным методом, а затем
9+
обрабатывают паром. При мытье посуды необходимо соблюдать правила техники безопасности, рекомендуемые при работе с кислотами и щелочами.
Стеклянную посуду можно сушить методами холодной сушки и при нагревании. Самый распространенный способ сушки посуды — сушка на колышках. Вымытую посуду надевают на колышки (доску с колышками обычно помещают над раковиной) и оставляют на них до полного высыхания. Колышки должны быть чистыми, их необходимо протирать перед надеванием посуды или каждый раз обертывать чистой фильтровальной бумагой.
Если вымытую посуду необходимо использовать сразу, то можно высушить ее струей воздуха, для чего используют сжатый воздух (если есть его проводка), меха, электрические воздуходувки или, что всегда имеется в лаборатории, резиновые груши. Грушу через резиновую трубку надевают на стеклянную трубку, длина которой должна быть на 10 см больше высушиваемого сосуда. В месте соединения резиновой трубки со стеклянной необходимо положить кусочек ваты для фильтрования воздуха. При использовании сжатого воздуха его вначале фильтруют через слой чистой ваты, помещенной в поглотительную воронку.
Для быстрого высушивания посуды используют легко испаряющиеся органические растворители. В этом случае, обтерев сосуд снаружи чистым полотенцем, ополаскивают его сначала чистым этиловым спиртом, а затем чистым серным эфиром. Пары эфира удаляют путем продувания холодным воздухом.
Быстро высушить посуду можно также в сушильном шкафу. Сушку проводят при температуре 80—100°. На полки шкафа должна быть положена фильтровальная бумага. Прежде чем вынимать посуду из шкафа, его следует охладить.
11.	ВЕСЫ И ПРИЕМЫ ВЗВЕШИВАНИЯ
В токсикологической лаборатории весы применяют для взвешивания животных и для приготовления навесок реактивов. О весах, употребляемых для взвешивания животных, указано в части 1.
95
11.1.	Виды весов
Для взвешивания реактивов используют аптечные, технохимическне и аналитические весы.
Аптечные весы являются простейшим типом весов для точного взвешивания. Максимальная нагрузка их составляет 100 г. На аптечных весах, как правило, делают навески, не требующие большой точности.
Технохимическне весы снабжены арретир-ным устройством и балансировочными гайками. Для регулировки положения служат передние винтовые ножки, о правильности установки весов на поверхности стола судят по положению острия отвеса, которое должно совпадать с вершиной конуса, находящегося у подножки колонки. Если при опускании арретира весы не будут находиться в равновесии, его добиваются при помощи балансировочных гаек.
Прежде чем начать взвешивание, необходимо проверить правильность работы весов. Если стрелка весов отклоняется от нуля на одно и то же число делений вправо и влево, то это означает, что весы работают правильно. В противном случае необходимо их настроить, используя для этого описанные выше приспособления.
При взвешивании на технохимических весах пользуются разновесом, представляющим набор гирь, расположенных в определенном порядке в гнездах ящика. Граммовые гири, как правило, никелированные, миллиграммовые—пластинки из алюминия или никеля. На каждой гирьке поставлено число, обозначающее ее вес. Вес взвешиваемого предмета принято записывать в граммах, обозначая миллиграммы в виде долей грамма. Так, вес предмета в 9 г45 мг записывают — 9,045 г, а вес в 9 г 450 мг — 9,45 г.
Аналитические весы. По конструкции аналитические весы делятся на весы периодического качания и демпферные, по точности — на весы первого и второго класса.
Аналитические весы позволяют взвешивать с точностью до 0,00002—0,00001 г. Максимальная нагрузка 200 г.
Для взвешивания на аналитических весах применяют специальный аналитический разновес — набор очень точных гирь, собранных в футляре, предохраняющем 96
гири от повреждения. Брать гири можно только пинцетом, имеющим роговой, костяной или пластмассовый наконечник. Руками гири брать нельзя. Периодически разновес необходимо протирать спиртом или эфиром.
При помощи аналитического разновеса можно взвесить вещество только до второго знака после запятой; третий и четвертый знаки находят при помощи рейтера. В нерабочем положении рейтер должен находиться на нулевом делении шкалы. У аналитических весов периодического качания затухание колебаний коромысла происходит медленно, поэтому взвешивание занимает много времени. Наиболее совершенными считаются весы с апериодическим качанием стрелки, на которых взвешивание производится быстрее, так как они имеют приспособление для воздушного или магнитного торможения колебаний коромысла и стрелки. Весы такой конструкции бывают обычные и полуавтоматические, с верхним и нижним размещением демпферов.
Все системы полуавтоматических весов снабжены приспособлениями для механической нагрузки гирь. Наиболее совершенной моделью полуавтоматических весов являются весы с вейтографом АВД-200. При помощи вейтографа работающий за весами видит не перемещение стрелки вдоль делений шкалы, а перемещение микрошкалы около неподвижной отсчетной линии.
Разновес к весам АВД-200 не имеет миллиграммовых гирек, так как весы снабжены встроенным в них миллиграммовыми гирями от 10 до 990 мг, навешенными на планку. Управление гирями производится с помощью вращающихся лимбов, расположенных справа витрины весов. При вращении большого лимба происходит накладывание или снятие сотен миллиграммов, при вращении малого лимба — десятков миллиграммов, отсчет от 0 до 10 мг в обе стороны производят на микрошкале. Настройка и наблюдение за точностью работы аналитических весов ведется специальной службой.
11.2.	Приемы взвешивания
Перед каждым, взвешиванием необходимо проверить, правильно ли установлены весы и не загрязнены ли они. К весам прилагается специальная мягкая щетка или кисть, которыми и очищают весы. После этого оп
Ч2 4—8178
97
ределяют нулевую точку весов. Определение ее ведут по-разному в зависимости от системы весов. Для весов периодического качания это делается так: опускают арретир и наблюдают за стрелкой; пропускают 2—3 первых качания и отмечают крайние показания шкалы при последующем колебании. Взвешивание можно начинать, если стрелка весов отклоняется вправо и влево на одинаковое число делений, отсчет принято начинать с левой стороны.
Определение нулевой точки у демпферных весов проводят следующим образом: снимают рейтер с коромысла, опускают арретир и ожидают, пока стрелка остановится. В хорошо установленных весах нулевая точка лежит в пределах одного деления поту или другую сторону от нуля шкалы. Если смещение нулевой точки будет больше, чем на одно деление, то весы необходимо настроить при помощи балансировочных гаек, расположенных на коромысле.
После установления нулевой точки приступают к взвешиванию. Открывают боковые дверки, взвешиваемый предмет ставят на левую чашку весов, а разновески — на правую.
Во время взвешивания все дверки должны быть закрыты. Взвешиваемое вещество должно находиться в таре (часовое стекло, бюкс, тигель, стакан и др.); тара должна быть обязательно чистой. Вещества, выделяющие газы, необходимо взвешивать в закрытой таре. Взвешивание веществ следует производить лишь после того, как они приняли температуру окружающей среды. Для этого их выдерживают 20—30 минут в комнате, где стоят весы. Взвешивать на аналитических весах грузы, тяжелее предельной нагрузки весов (200 г), нельзя.
Для ускорения взвешивания рекомендуется предварительно взвесить навески (с точностью до 0,1г) на технохимических весах.
Торсионные весы предназначены для взвешивания малых количеств материалов (до 50 мг). Взвешивание производится быстро и точно. Весы снабжены арретирным приспособлением. Перед взвешиванием, как обычно, стрелку устанавливают на нуль. Затем открывают дверцу и помещают на подвесную чашечку взвешиваемый предмет. Дверцу закрывают, открывают арретир и передвигают указатель веса до тех пор, пока
98
указатель равновесия не совместится с чертой равновесия. Арретир закрывают и записывают показания шкалы.
12.	РЕАКТИВЫ, ОБРАЩЕНИЕ С НИМИ И ОЧИСТКА
В каждо# лаборатории имеется определенный запас реактивов. По чистоте реактивы делятся на химически чистые (х. ч.), чистые для анализа (ч. д. а.), чистые (ч.) и технические.
Приобретаются реактивы в различной расфасовке— от нескольких килограммов до миллиграммов, в зависимости от степени их потребления, распространенности и стоимости.
Реактивы поступают в лабораторию в соответствующей таре: тведрые реактивы в банках, жидкие в бутылях; вещества, чувствительные к действию света, в темных склянках; гигроскопичные (легко поглощающие воду) в герметичной таре; отдельные реактивы в ампулах.
На каждом реактиве, поступающем в лабораторию, должна быть этикетка с обозначением названия реактива, его веса, чистоты, даты приготовления и т. д.
12.1.	Хранение реактивов
При хранении реактивов в лаборатории необходимо учитывать следующее.
1.	Вещества, обладающие неприятным запахом, а также выделяющие ядовитые пары, хранят в вытяжном шкафу или в хорошо проветриваемом помещении.
2.	Огнеопасные вещества размещают в местах, удаленных от открытого пламени.
3.	Гигроскопические вещества, которые изменяют свои свойства при соприкосновении с воздухом, должны храниться в герметической таре.
Герметичность достигается различными путями. Пробку и место соединения ее с горлышком сосуда можно заливать парафином, который предварительно расплавляют в металлической посуде. Парафин удобнее наносить из нагретой пипетки каплями. Можно погружать пробку с горлышком сосуда на 2—3 секунды в расплавленный парафин. Горлышко сосуда погружают не больше чем на 1 см. Можно также приме
41 4:!
99
нять воск. Для корковых пробок используют нитро- или ацетилцеллюлозные лаки, менделеевскую замазку, сургуч, хотя последние по ряду причин применяются редко. Герметичность создается и с помощью хорошо притертых стеклянных пробок. Пока сосуд ничем не заполнен, между пробкой и горлышком следует^ проложить кусочек чистой бумаги.
В практике очень часты случаи «заедания» пробок. Открыть их можно несколькими способами: можно осторожно постучать деревянной дошечкой снизу вверх со всех сторон или подогреть горлышко сосуда (пробка не должна нагреваться); если вещество в сосуде не огнеопасно, греют на коптящем пламени горелки, а если огнеопасно, то обвязывают горлышко волокнистым материалом и льют на него горячую воду. Можно нагреть стекло и трением. Нагревать следует быстро и сразу пытаться повернуть пробку.
12.2.	Обращение с реактивами
Главным правилом при работе с реактивами является сохранение их от загрязнения. Просыпавшийся на стол реактив нельзя высыпать обратно в банку; тара, в которую пересыпают или переливают вещество, должна быть чисто вымыта и высушена. Нельзя хранить реактивы открытыми. Нельзя путать пробки и пипетки от разных реактивов. При открывании тары необходимо следить, чтобы парафин (если им была залита пробка) или грязь с пробки не попали внутрь сосуда. Щелочь и дистиллированную воду необходимо предохранять от попадания углекислого газа из воздуха. Для этого щелочь закрывают резиновой пробкой, в которую вставлена хлоркальциевая трубка.
Для заполнения простой хлоркальциевой трубки в ее шарообразную часть кладут чистую вату, которая должна заполнить шарик не менее чем наполовину. Насыпают поглотительное вещество так, чтобы столбик его не доходил до края трубки на 1 —1,5 см. Сверху кладут небольшой слой ваты и вставляют пробку со стеклянной трубочкой. В качестве поглотителя углекислого газа используют натронную известь, для предохранения от попадания водных паров — прокаленный хлористый кальций.
100
На всех банках с реактивами обязательно должны быть этикетки, на которых обозначаются наименования реактивов, находящихся в банке. Если приготовлен раствор реактива, то необходимо указать дату его приготовления, так как срок годности растворов различный. Последнее следует особенно учитывать при приготовлении особенно ценных и дорогих реактивов, т. е. приготовлять реактивы в минимальном, необходимом для работы количестве.
При пересыпании или переливании реактивов в дру-' гую тару, а также при приготовлении растворов следует учесть, какой пробкой можно закрыть тот или иной реактив (см. раздел 9.2). При взятии твердого реактива из тары пользуются роговыми или фарфоровыми шпателями, ложечками, совочками или пробирками. Часто твердые реактивы при хранении слеживаются в комки и их трудно извлечь из банки. В таком случае нужно потрясти банку, и если комки не разбились, то их следует разрыхлить стеклянной палочкой или чистым металлическим штапелем, а затем растереть в ступке (если необходимо, иметь его в порошке). Сухие реактивы лучше пересыпать через воронку, чтобы не рассыпать.
Для переливания реактива используют пипетки, сифон или воронки в зависимости от размера и объема тары, а также от ширины горла посуды, в которую переливают жидкость.
Некоторые реактивы продают или заготавливают в лаборатории в ампулах. Чтобы вскрыть ампулу, в узкой ее части (на расстоянии 1 см от конца) делают надрез напильником, предварительно смочив водой место надреза, а затем правой рукой быстро отламывают конец ампулы.
При работе с реактивами необходимо соблюдать осторожность: нельзя пробовать их на вкус, нельзя подносить реактив близко к носу, а если необходимо его понюхать, то нужно ладонью направить струю воздуха от склянки с реактивом. При работе с кислотами следует помнить, что кислоту всегда надо наливать в воду (реакция идет с выделением тепла), а не наоборот.
С вредными летучими веществами нужно работать в вытяжном шкафу.
101
12. 3. Очистка реактивов
Некоторые реактивы при хранении разлагаются, теряют свои свойства, и их перед употреблением обязательно очищают. Очистить реактивы можно различными путями в зависимости от свойств вещества. В одних случаях применяют фильтрование, в других — перекристаллизацию или перегонку.
12.4.	Фильтрование
Принцип фильтрования состоит в отделении твердых частиц от жидкости с помощью фильтра. Для фильтрования необходимы воронка, фильтр и приемник, в котором собирается фильтрат. Чаще всего используются обычные гладкие воронки с суживающимся концом.
Для фильтрования большинства органических веществ и горячих насыщенных растворов твердых веществ применяют широкие фарфоровые воронки с укороченным концом.
В качестве фильтрующего материала используют различные сорта фильтров и фильтровальной бумаги. Какими фильтрами пользоваться, указывается в методе, по которому проводится исследование.
Форма фильтра определяется свойствами фильтруемых жидкостей и другими факторами. Простой фильтр употребляют в тех случаях, когда отделяемый осадок нужен для дальнейшей работы. Размер фильтра в этих случаях зависит от количества осадка. Осадок должен занимать не более */з фильтра. Изготавливают такой фильтр путем складывания вчетверо круглого фильтра. Если фильтр делают из фильтровальной бумаги, то квадратный лист складывают вчетверо и срезают края, округляя их.
Складчатый фильтр применяют для ускорения фильтрования, но тогда осадок не используется. Размер фильтра определяют количеством фильтруемой жидкости. Получают складчатый фильтр путем сгибаний простого фильтра так, чтобы каждая долька составляла Ve четвертушки обычного фильтра.
Воронку с фильтром помещают в металлическое или деревянное кольцо, укрепляемое на штативе, или вставляют ее непосредственно в горло колбы.
102
Фильтрование является обычно вспомогательной операцией, которая предшествует дальнейшей обработке фильтрата. Выбор приемника, т. е. сосуда, в котором собирается фильтрат, определяется тем, что предполагается делать с фильтратом по окончании фильтрования. В зависимости от этого в качестве приемника употребляют кристаллизаторы, стаканы, колбы Эрленмейера и т. п.
12.4.1.	Обычное фильтрование при комнатной температуре
В воронку вставляют фильтр такого размера, чтобы его края были ниже краев воронки на 0,5—1 см. Фильтр смачивают водой и плотно прижимают к стеклу. Жидкость льют на фильтр по стеклянной палочке, не касаясь ею фильтра, до уровня, . недоходящего на 0,5 см края фильтра. Если жидкость проходит свободно через фильтр, то ее льют непрерывно, если же медленно, то очередную порцию вливают только тогда, когда большая часть жидкости пройдет через фильтр. Когда жидкость полностью слита с осадка, последний промывают либо сначала декантацией, а затем на фильтре, либо только на фильтре.
Промывание декантацией заключается в следующем: приливают промывную жидкость к осадку в сосуде, смывая его со стенок, тщательно перемешивают стеклянной палочкой и дают осадку отстояться. Когда жидкость станет прозрачной, ее по палочке осторожно выливают на фильтр (рис. 22). Эту процедуру повторяют 3—4 раза, а затем переносят на фильтр весь осадок. Для этого снова приливают к осадку промывную жидкость, взбалтывают и сразу переливают жидкость вместе с осадком на фильтр. Эту процедуру проделывают до тех пор, пока весь осадок не перенесут на фильтр. После этого подставляют под воронку чистый стакан и промывают осадок на фильтре; промывание начинают с верхного края фильтра. Когда фильтр наполнится наполовину, жидкости дают полностью стечь. Промывание на фильтре повторяют 8—10 раз. После этого проверяют в промывных водах наличие примесей, от которых отмывали осадок. Для этого фильтруют 1—2 мл промывной жидкости в пробирку, куда добав-
103
Рис. 22. Промывание осадка на фильтре.
Рис. 23. Фильтрование с отсасыванием.
1 — водоструйный насос, подсоединенный к водопроводному крану;
2 — предохранительная склянка;
3 — колба Бунзена с воронкой Бюхнера.
2‘
ляют соответствующие реактивы. Если реакция отрицательная, то промывание прекращают, если реакция положительная, то промывание повторяют еще 2—3 раза и снова проверяют на полноту промывания. Если осадок промывают дистиллированной водой, можно пользоваться специальными колбами для промывания.
104
Они имеют длинный носик, через который вода поступает на фильтр тонкой струей.
12.4.2.	Фильтрование с отсасыванием
Фильтрование с отсасыванием позволяет достигнуть хорошего отделения твердого вещества от жидкости и применяют его в основном в тех случаях, когда стремятся к выделению твердого вещества после очистки его перекристаллизацией. Наиболее часто для отсасывания применяют воронку Бюхнера с дырчатой фарфоровой пластинкой, на которую помещают обычный круглый фильтр. Диаметр фильтра должен быть равен диаметру дна воронки. Если фильтр больше, то его обрезают, но ни в коем случае не загибают. Воронку вставляют в резиновую пробку, подобранную к колбе Бунзена. Колбу подключают к водоструйному насосу через предохранительную склянку. После этого включают водоструйный насос, наливают на фильтр немного дистиллированной воды и прижимают фильтр ко дну воронки; отсутствие свистящего звука указывает на то, что фильтр прилегает плотно (рис. 23).
При фильтровании через воронку Бюхнера также следует соблюдать все правила фильтрования, описанные выше. По окончании фильтрования осторожно отсоединяют колбу Бунзера от предохранительной склянки и только затем выключают водоструйный насос. Воронку вынимают из колбы, перевертывают ее на чистую фильтровальную бумагу и, осторожно постукивая по стенкам воронки, высыпают на нее осадок из воронки.
12.4.3.	Горячее фильтрование
Способы горячего фильтрования заслуживают особого внимания. Такое фильтрование употребляется перед кристаллизацией, когда горячие насыщенные растворы твердых веществ очищают от нерастворимых примесей. В этих случаях чаще всего работают с обычным приспособлением для фильтрования, состоящим из воронки и складчатого фильтра. Во избежание потери вещества при фильтровании, прежде чем налить горячий раствор на фильтр, все оборудование подогревают, пропуская через него небольшое количество чистого
105
горячего растворителя, который затем выливают. В процессе фильтрования необходимо поддерживать высокий уровень жидкости на фильтре, чтобы фильтрование протекало возможно быстрее и во избежание охлаждения жидкости. Иногда в процессе фильтрования приходится подогревать фильтруемый раствор. Имеются специальные устройства для горячего фильтрования, выпускаемые серийно. Они обычно снабжены рубашкой с электроподогревом и имеют круглое отверстие для воронки.
12.4.4.	Фильтрование через слой адсорбента
Этот вид фильтрования применяется для очистки реактивов от примесей. В качестве адсорбента можно использовать активированный уголь или окись алюминия. При очистке небольших количеств веществ адсорбент помещают в трубку, в нижнем суженном конце которой находится комочек ваты. При работе с большим количеством адсорбент помещают на фильтр в обычную воронку или в воронку Бюхнера.
12.5.	Перекристаллизация
Принцип перекристаллизации основан на различной степени растворимости веществ при различных температурах. Чтобы перекристаллизовать вещество, его необходимо сначала растворить. Растворение проводят при нагревании, стараясь получить максимально концентрированный раствор. Если раствор содержит примеси или муть, его фильтруют, применяя горячее фильтрование (см. выше). Если раствор прозрачный и не содержит никаких включений, фильтрование излишне и даже вредно, так как вещество при этой процедуре теряется. Следующим этапом является концентрирование раствора (упаривание). Его проводят в тех случаях, когда в растворе имеются малые количества вещества. Для упаривания раствор помещают в фарфоровую чашку и ставят на водяную или песчаную баню. Упаривают раствор на V2, '/з и т. д. исходного объема на медленном огне. Затем раствор охлаждают, добиваясь выпадения кристаллов. Выпавшее при кристаллизации вещество отделяют путем фильтрования с отсосом (см. выше).
106
12.6. Перегонка
Перегонка является одним из основных приемов очистки жидких реактивов. Перегонку применяют в тех случаях, когда необходимо очистить жидкость от растворимых в ней твердых или жидких примесей. Для этой цели собирают прибор, состоящий из колбы Вюрца, холодильника и приемника. Жидкость в колбе не должна занимать более 2/з объема колбы. Для создания равномерного кипения в колбу бросают несколько стеклянных капилляров, запаянных с одного конца. Можно пользоваться кусочками пемзы или мрамора, которые предварительно кипятят в дистиллированной воде.
Перегонка воды. В токсикологической лаборатории широко используется дистиллированная вода. Она идет для приготовления реактивов при проведении биохимических анализов, споласкивания посуды и т. д. Дистиллированной считается вода, почти не содержащая неорганических и органических веществ. Ее получают путем перегонки водопроводной воды. Для получения дистиллированной воды, как правило, используют перегонный куб (дистиллятор). Перегнанную воду собирают в чистые, промытые дистиллированной водой стеклянные бутыли. Для предохранения воды от попадания в нее пыли в горло бутыли вставляют уплотненную вату. Бутыли с запасом дистиллированной воды лучше хранить в склянках с притертыми стеклянными пробками.
В дистиллированной воде всегда содержатся незначительные примеси (аммиак, двуокись углерода, органические соединения). Для проведения некоторых анализов в воде не должно содержаться указанных примесей. В этих случаях дистиллированную воду дополнительно очищают. Чтобы очистить дистиллированную воду от остатков органических веществ, ее подвергают вторичной перегонке, добавляя в воду около 100 мг/л марганцовокислого калия и несколько капель серной кислоты. Очищенную таким образом воду называют бидистиллированной или апирогенной. Для вторичной перегонки дистиллированной воды в лаборатории, как правило, монтируют стеклянную установку (рис. 24) .
Для освобождения дистиллированной воды от углекислого газа (последнее требуется при приготовлении
107
Рис. 24. Прибор для перегонки:
) — колба для перегоняемой воды; 2 — холодильник Либиха; 3 — приемная колба.
растворов щелочей) ее кипятят и горячую переливают в сосуд, снабженный хлоркальциевой трубкой, во избежание попадания углекислого газа из воздуха.
Качество дистиллированной воды можно проверить путем определения pH воды и -ее солевого состава. Для определения pH 25 мл воды наливают в стакан и добавляют 2—3 капли 0,1% раствора метилового оранжевого (индикатор). Если реакция воды нейтральная, то окраска будет желтой; прибавление одной капли 0,4N раствора серной или соляной кислоты должно вызвать появление розового оттенка.
Для испытания на наличие солевых примесей выпаривают 5—10 капель воды на чистом часовом стекле. Хорошо очищенная вода после выпаривания не цает налета.
108
12.7. Центрифугирование
Помимо фильтрования, для отделения осадка от раствора применяют центрифугирирование. Для этой цели используют центрифугу: ее действие основано на использовании центробежной силы, когда более тяжелые, твердые частицы отбрасываются к внешнему краю.
Для проведения биохимических анализов чаще всего пользуются пробирочными центрифугами. В этом случае разделение жидкой и твердой фаз зависит от разности их удельных весов. Скорость разделения возрастает с увеличением разности удельных весов и с увеличением центробежной силы. Обычные лабораторные центрифуги достигают скорости 3000—8000 об/мин. Большинство центрифуг снабжено включающим реостатом, который позволяет осуществлять плавный пуск центрифуг и постепенное увеличение скорости. Резкое ускорение вредно отражается на работе центрифуги. Кроме того, при этом содержимое пробирок может выплеснуться. Многие центрифуги снабжены часами, которые выключают центрифугу по истечении определенного времени работы, а также автоматическим тормозом, который уменьшает время остановки центрифуги.
Для обеспечения безопасности работы и увеличения срока службы центрифуги следует соблюдать следующие правила.
I.	Необходимо точно уравновешивать пробирки с содержимым между собой, что производится с помощью специальных центрифужных весов.
2.	Центрифугировать можно только четное число пробирок.
3.	Недопустимо приводить в движение центрифугу при открытой крышке или открывать крышку до остановки центрифуги.
4.	Центрифугу необходимо содержать в чистоте.
Полученный в результате центрифугирования раствор (он должен быть прозрачным) отделяют от осадка пипеткой с грушей или сливают. Удобно пользоваться пастеровскими пипетками, особенно для отделения сыворотки. Отбор раствора пипеткой нужно производить очень осторожно: предварительно выгоняют воздух из пипетки, а затем осторожно вводят пипетку в жидкость и всасывают ее в пипетку, не взмучивая осадка.
109
13.	ОБЩИЕ ПРИЕМЫ БИОХИМИЧЕСКОГО АНАЛИЗА
13.1.	Единицы измерения
Согласно международным нормам, единицами изме-
рения в биохимии являются следующие: Для веса:	грамм (г)
	миллиграмм (мг) микрограмм (мкг)
Для емкостей:	литр (л) миллилитр (мл) или кубический сантиметр (см3) микролитр (мкл) или кубический миллиметр (мм3)
Для времени:	час (ч) минуты (мин.) секунда (сек.)
Для температуры:	градус (С°)
абсолютный градус (К0).
Результаты анализов крови выражаются в миллиграммах на 100 мл (мг%), за исключением белков крови, выражающихся в граммах на 100 миллилитров-(г/100 мл). Если в крови содержится 7 процентов белка, то это означает, что в 100 мл крови содержится 7 г белка.
Результаты, полученные при анализе мочи, выражаются в граммах на литр (г/1000 мл), в граммах в суточной моче (г/сутки) или в миллиграммах на миллилитр (мг/мл). В отдельных случаях (определение гормонов) количество выражается в микрограммах на 100 мл мочи (мкг/100 мл) или суточной мочи (мкг/сутки).
13.2.	Приготовление растворов
При выполнении биохимических анализов постоянно приходится сталкиваться с необходимостью приготовления растворов различных веществ.
Растворяемым веществом могут быть твердое вещество, жидкость или газ. В качестве растворителя используют воду и различные органические жидкости. В биохимической практике чаще всего приходится готовить водные растворы твердых веществ (растворы солей, кислот, щелочей). Не все вещества растворяются одинаково хорошо. Для твердых веществ существует предел
НО
растворимости, зависящий от свойств веществ и от тех условий, в которых происходит растворение. Когда достигается предел растворения, получается насыщенный р а с т в о р. Количество растворившегося вещества является показателем его растворимости. Концентрация насыщенного раствора не обязательно должна быть высокой, так как растворимость некоторых веществ очень маленькая. Пределы растворимости отдельных веществ указаны в химических справочниках.
Растворимость многих твердых веществ можно повысить нагреванием раствора. Каждой температуре соответствует определенная растворимость данного вещества. Если при медленном охлаждении насыщенного при нагревании раствора вещество в осадок не выпадет, то получится перенасыщенный раствор. Однако это состояние очень неустойчиво. Достаточно добавить в такой раствор несколько кристаллов соли и перемешать или потереть палочкой о стенку сосуда, чтобы избыток соли выпал в осадок.
При растворении твердых веществ удобнее сначала налить в колбу немного растворителя, а затем всыпать через воронку вещество и тщательно взболтать. Оставшуюся часть растворителя вносят после того, как пересыпано все количество твердого вещества.
При растворении жидкости в жидкости необходимо учитывать следующее: 1) есть жидкости, практически не растворяющиеся одна в другой (вода и масло); 2) растворение жидкости в жидкости ограничено (вода и эфир); 3) многие жидкости, такие, как вода и спирт, вода и большинство кислот, растворяются друг в друге в неограниченном количестве. Растворение веществ может протекать как с выделением тепла, так и с поглощение тепла.
Растворы по своим свойствам отличаются от свойств растворителя: температура кипения раствора выше, чем растворителя, а температура замерзания, наоборот, ниже у растворов, чем у растворителя. Известен целый ряд выражения концентрации растворов. К весовым способам выражения концентрации растворов относится процентная концентрация, к объемным — молярная и нормальная, а также выражение концентрации через титр.
Процентная концентрация показывает, сколько граммов вещества содержится в 100 граммах
111
раствора. Процентные растворы считаются 'приблизительными. Для их приготовления вещество отвешивают на технохимических весах, а воду и кислоты отмеривают .мерными цилиндрами.
Для приготовления растворов используют чистые реактивы (ч, хч и чда); применять технические реактивы для биохимического анализа нельзя.
При приготовлении растворов солей, прежде чем отвешивать соль, производят расчет.
Пример: необходимо приготовить 0,5 кг 10% раствора хлористого натрия. Составляют пропорцию:
100 г —10 г
500-10
500 г — х г х = ----= 50 г
100
Следовательно, соли необходимо взять 50 г, а воды 500 г — 50 г=450 г, или 450 мл.
Если готовят раствор соли, содержащей кристаллизационную воду, расчет (производится иной.
Пример: необходимо приготовить 1 кг 5% раствора Na2CO3, исходя из состава Na2CO3-10 Н2О. Для этого сначала производят расчет для безводной соли:
100 г — 5 г
1000-5 г
1000 г — хг х =-----= 50 г
100
Следовательно, для приготовления данного раствора необходимо взять 50 г безводной Na2CO3. Молекулярный вес Na2CO3 равен 106, а молекулярный вес Na2CO3-10H2O равен 286,17. Это означает, что 286,17 г Na2CO3-10H2O содержат 106 г Na2CO3. Снова составляем пропорцию:
286,2— 106
286,2 • 50
х — 50 х =---------= 133,1 г
106
Следовательно, для получения 5% раствора углекислого натрия необходимо отвесить 133,1 г соли Na2CO3-ЮН2О. Количество воды будет равно 1000— 133,1=866,9 г; отмерить следует 867 мл.
Приготовление растворов щелочей в отличие от солей требует соблюдения особых правил: 1) щелочь нельзя взвешивать на бумаге, а обязательно в стеклянной или фарфоровой посуде. В эту же посуду наливают такое количество воды, чтобы получился 35—40% раствор,
112
содержимое перемешивают стеклянной палочкой. Раствор оставляют стоять до тех пор, пока он не остынет и не осядет осадок. Затем осторожно переливают щелочь (без осадка) в другую посуду, куда и доливают необходимое количество воды. Если раствор щелочи (крепкий) предполагается хранить продолжительное время, то его наливают в бутыль, покрытую изнутри тонким слоем парафина для предохранения стекла; 2) щелочь нельзя растворять в толстостенной посуде, так .как при растворении происходит сильное разогревание и посуда может лопнуть.
При приготовлении процентных растворов кислот расчет производят иной, чем для растворов солей и щелочей, так как концентрация кислоты не является 100%, а также и потому, что кислоты не отвешивают, а отмеривают по объему.
Пример: необходимо приготовить 100 мл 10% раствор серной кислоты. По таблицам, имеющимся в справочниках, находим, что 10% раствор серной кислоты при комнатной температуре имеет удельный вес 1,066, а в 1 л такого раствора должно содержаться 106,6 г H2SO4. Концентрированная кислота имеет удельный вес 1,84 и является 95,6%; в 1 л этой кислоты содержится 1766,4 г. Делаем расчет;
1000 мг раствора содержит 1766,4 г
х мг— 106,6 г
106,6-1000 *—
Следовательно, необходимо взять 60,3 мл концентрированной H2SO4 и 1000—60,3 = 939,7 мл воды (можно 940 мл).
При приготовлении растворов кислот, особенно серной, происходит сильное разогревание, поэтому их необходимо готовить в колбах. При разбавлении нельзя лить воду в кислоту, как. как вследствие выделения большого количества тепла возможно разбрызгивание раствора кислоты и попадание его на работающего. В колбу сначала наливают рассчитанное количество воды, а затем постепенно при перемешивании добавляют нужное количество кислоты.
Молярная концентрация раствора показывает, сколько грамм-молекул вещества содержится в 1000 мл раствора. Если в 1000 мл раствора содер
'/< 5—8178	ИЗ
Жится I; 0,1; 0,01; 0,001 моля, то раствор соответственно будет: молярным, децимолярным, сантимолярным, миллимолярным.
Грамм-молекулой вещества называется количество его, выраженное в граммах и численно равное его молекулярному весу. Например: молекулярный вес Na2CO3 равен 106. Требуется приготовить 1 л 1 м раствора. Для этого следует 106 г этой соли растворить сначала в небольшом количестве воды в мерной колбе на 1000 мл и затем довести до метки растворителем. Отсчет ведут по нижнему мениску жидкости.
Нормальная концентрация раствора показывает, сколько грамм-эквивалентов (э) растворенного вещества содержится в 1000 мл раствора. Грамм-эквивалентом называется количество вещества, выраженное в граммах, которое в данной реакции соответствует одному грамм-иону водорода, принимаемому за единицу.
Для вычисления грамм-эквивалента кислоты ее молекулярный вес делят на число атомов водорода,содержащихся в одной ее молекуле. Например:
М 98, 3H2SO4 = — = —!= 49 г.
Для вычисления грамм-эквивалента основания его молекулярный вес делят на число гидроксильных групп, содержащихся в его молекуле. Например:
ЭА1(ОНз) =	= - = 26 г
О о
74,09
ЭСа (ОН)2 = -у- = 37,045 г
Для вычисления грамм-эквивалента соли ее молекулярный вес делят на произведение числа катионов в соли на валентность катиона. Например:
ЭСз3(РО4)2 = ^- =^=51,6
О , Z	О
142,06
Э Na2SO4 = —= 71,03
Для приготовления 1 N раствора Na2CO4 растворяют 71,03 г соли в 1 л раствора.
При приготовлении нормальных растворов кислот, помимо учета основности кислоты, в. расчет входит и удельный вес.
114
Пример: чтобы изготовить 1 л 1 N раствора H2SO4, сначала рассчитывают грамм-эквивалент кислоты:
М 98,016
3H2SO4 = — - —— = 49,008
Затем подсчитывают, какой объем концентрированной кислоты нужно взять для приготовления этого раствора. Серная кислота с удельным весом 1,84 содержит 95,6% кислоты. Отсюда:
100 — 95,6 х—49,008
100-49,008
Х 95/5
= 51,26 г
Переводим вес в объем, для чего ’8= 27,8 мл — это количество кислоты необходимо для приготовления 1 л 1 N раствора.
Концентрация раствора, выраженная через титр (Т). Титром называется количество граммов вещества, содержащееся в 1 мл раствора.
Зная точную нормальность  раствора, всегда легко вычислить титр данного раствора. Например, если мы имеем 0,lN раствор NaOH, то это означает, что в 1 л раствора содержится 4,001 г NaOH. Следовательно, титр раствора будет равен
4.001
----= 0,004 г/мл
1000
Для выражения концентрации через титр можно пользоваться формулой:
3  N
Т = 1000 ’
где Т — титр, Э — грамм-эквивалент вещества, N — нормальность раствора.
Нормальные, молярные и титрованные растворы являются точными. Их готовят всегда в мерных колбах; навески отвешивают на аналитических весах с максимально возможной точностью.
13.2.1.	Техника приготовления точных реактивов из фиксаналов
Фиксаналами пользуются для быстрого приготовления точных растворов. Фиксапалы представляют собой
‘А 5*	И5
запаянные стеклянные ампулы с точными навесками реактивов.
Для приготовления раствора из фиксанала требуется проделать следующее: в мерную колбу вставляют воронку, в которую в свою очередь вставляют буек. Ампулу (предварительно протертую спиртом и промытую дистиллированной водой) тонким изогнутым внутрь дном ударяют о конец буйка. Сбоку в ампуле или на другом конце имеется второе углубление, которое .пробивают стеклянной палочкой с заостренным концом (буек и палочка прилагаются к фиксаналам). Через это отверстие несколько раз промывают стенки ампулы, после чего обмывают наружные стенки ампулы растворителем.
Ополаскивают воронку, буек, верхнюю часть шейки колбы, затем дистиллированной водой доводят содержимое колбы до метки. Чтобы не перелить воду выше метки, ее наливают на 1 см ниже метки, а затем добавляют воду до метки по каплям.
14.	ТЕХНИКА ТИТРОВАНИЯ
Титрование применяют для определения точной концентрации раствора, так как не из всех веществ можно приготовить точные растворы. В частности, точный раствор нельзя приготовить из гигроскопичной соли, селей, теряющих на воздухе кристаллизационную воду, и т. д. В таких случаях точную концентрацию устанавливают путем титрования этих растворов точными растворами.
Титрование также применяется как один из методов определения количества вещества в пробе. Методом титрования определяют целый ряд биохимических показателей в крови и моче.
При титровании имеется два раствора: раствор, которым титруют, и раствор, который следует титровать. Раствор, которым титруют, помещают в бюретку, микробюретку . или пипетку, которые укрепляют в штативе Бунзена. При титровании пипетками используют специальное приспособление.
Титрование лучше производить в конических колбах (колбы Эрленмейера) без притертой пробки. Размер колбы подбирают так, чтобы общий объем жидкости в конце титрования был не более половины объем? колбы.
116
Титрование малых количеств производят в маленьких стаканчиках (объемом 20—30 мл) или в пробирках. Титрование производят с индикатором или без него. Индикаторы применяют при титровании, чтобы определить конец реакции, т. е. момент, когда анализируемое вещество полностью прореагирует. Индикатор добавляют в количестве от одной до нескольких капель.
Колбу с титруемым раствором подставляют под бюретку так, чтобы кончик бюретки не находился слишком высоко над колбой, но и не опускался слишком низко. Обычно его опускают в колбу на 2 см ниже верхнего края колбы. Под колбу подкладывают лист белой бумаги. Колбу следует держать в правой руке, а левой рукой открывают кран или зажим. Раствор из бюретки должен вытекать равномерными каплями сначала быстро, а к концу титрования по одной капле. Во время титрования раствор в колбе нужно постепенно перемешивать. Часто при титровании трудно уловить конечный момент; в этом случае записывают показания бюретки и добавляют еще одну каплю раствора. Если происходит резкое изменение в окраске или в другом состоянии (помутнение, выпадение хлопьев, и т. д.), по которым судят о конце титрования, то предыдущие показания считают достоверными. Если резких изменений нет, прибавляют еще раствор из бюретки.
Каждый раз для титрования новой пробы снова заполняют бюретку до нулевого деления.
По окончании титрования нельзя оставшийся в бюретке раствор выливать в склянку, где хранится титрованный.раствор. Раствор из бюретки выливают, бюретку ополаскивают дистиллированной водой и закрывают пробиркой для предохранения от пыли. Если бюретка долго не понадобится, ее тщательно моют и убирают. Для того чтобы кран не «заело», между пришлифованными частями вставляют полоску фильтровальной бумаги.
14.1.	Расчеты результатов титрования
Пример. Допустим, что на 5 мл раствора щавелевокислого натрия пошло 15 мл 0,1N раствора КМпС>4. Как рассчитать, сколько NaaCzCU содержится в этом растворе? Установлено, что 5 мл раствора Na2C2C>4 соответствуют 15 мл 0.1N раствора КМ11О4, а следовательно, со
Ч2 5—8178
I 17
держат столько Na2C2O4, сколько 15 мл 0,1 N раствора последнего. Узнаем по таблице, что 1 л 1N раствора NC2C2O4 содержит 67 г вещества, отсюда 15 мл 1N раствора содержат 1,005 г, а 15 мл O,1N раствора— 0,1005 г. Такое количество Na2C2O4 содержится в 5 мл исследуемого раствора. Отсюда легко рассчитать концентрацию Na2C2O4 в этом растворе.
Определение коэффициента поправки (фактора) раствора производят для установления точной нормальности раствора. Под коэффициентом поправки подразумевают число, на которое надо умножить количество миллилитров, пошедших на титрование неточного нормального раствора, чтобы узнать, какому количеству миллилитров точного нормального раствора оно соответствует.
Коэффициент поправки вычисляют путем титрования неточным раствором точно приготовленного раствора или, наоборот, титрования определенного количества неточного раствора точным раствором.
Пример 1. Титрование неточного раствора точным раствором. Если на титрование 10 мл неточного раствора НС1 пошло 9,5 мл точного раствора NaOH, то коэффициент поправки будет равен:
К = у-= 0,95
10
Пример 2. Титрование точного раствора неточным раствором. Предположим, что имеем неточно приготовленный 0,1 N раствор NaOH. Для определения поправки берем 10 мл точно приготовленного 0,lN раствора щавелевой кислоты и титруем щелочью. Если щелочи пошло 8,5 мл, то:
14.2.	Индикаторы
Индикаторами называют такие химические соединения, с помощью которых улавливают изменения в составе раствора. Использование индикаторов основано на способности этих веществ резко менять свой цвет или вызывать появление мути в зависимости от изменений условий среды.
118
Существует много разных видов индикаторов. Одни из них служат для определения изменений концентрации водородных ионов, другие указывают на появление в растворе какого-либо иона. Многие индикаторы являются органическими веществами, чаще всего красители. Их используют для определения изменения концентрации водородных ионов. Такие индикаторы употребляют при объемных определениях, основанных на реакции нейтрализации. Индикаторами могут являться растворы солей, которые дают с веществом (титрованного раствора) окрашенное соединение. Их используют также в объемных определениях, основанных на реакции осаждения. Наиболее часто применяются следующие индикаторы: 1) 1% спиртовой раствор фенолфталеина, 2) 1%водный раствор лакмуса, 3) 0,1% водный раствор метилового оранжевого, 4) 0,2% раствор метилового красного в 70% спирте. Иногда используется смесь нескольких индикаторов; их называют универсальными индикаторами.
15.	ОПРЕДЕЛЕНИЕ КОНЦЕНТРАЦИИ ВОДОРОДНЫХ ИОНОВ
Концентрацию водородных ионов (pH) можно определять колориметрическим методом при помощи индикаторов и потенциометрическим методом.
Колориметрический метод. Для быстрого определения pH применяют индикаторные бумажки — кусочки фильтровальной бумаги, пропитанные раствором индикатора и высушенные. Употребляют два вида индикаторных бумажек: пропитанные одним индикатором (лакмусовая) и пропитанная иесколькими индикаторами (универсальная). Универсальная индикаторная бумажка позволяет получить непрерывную шкалу перехода в очень большом интервале pH. Есть бумажки, изготовленные в виде книжечек, снабженных цветной шкалой, в которой указывается величина pH. При определении pH растворов каплю его наносят на кусочек индикаторной бумажки и полученную окраску сравнивают со шкалой. Другой вид универсальной индикаторной бумажки — полоска бумаги с нанесенными на нее цветными полосами, каждая из которых соответствует определенной pH (цветная шкала). Средняя полоса, являясь индикаторной, меняет свою окраску в зави
/2 5*	119
симости от pH. Такую бумажку опускают в испытуемую жидкость, быстро вынимают и сравнивают цвет индикаторной полосы с полосками цветной шкалы. Тождественность окраски индикатора с одной из полос шкалы указывает величину pH. Метод дает ошибку в пределах 0,1—0,2 единицы pH.
Потенциометрический метод. Сущность этого метода сводится к измерению электродвижущей силы гальванического элемента, для которого потенциал одного электрода известен, а потенциал другого зависит от pH среды.
В современных приборах разница потенциалов прокалибрована в единицах pH. Техника работы на потенциометре подробно изложена в прилагаемых к ним инструкциях.
16.	БУФЕРНЫЕ РАСТВОРЫ
Растворы, содержащие слабую кислоту и ее соль от сильного основания или слабое основание и его соль от сильной кислоты, которые при разбавлении или добавлении небольших количеств кислоты пли щелочи незначительно изменяют свой pH, получили название буферных растворов. Эти растворы широко используются при выполнении биохимических анализов, когда необходимо проводить реакцию в определенном диапазоне pH. Буферные растворы готовят согласно рецептам, которые приводятся в соответствующих справочниках. Отвешивание и растворение реактивов производят по правилам приготовления точных растворов для химического анализа. При любых работах с буферными растворами следует соблюдать предосторожности против попадания в них углекислоты из воздуха и щелочи из стекла. Поэтому сосуды с растворами должны быть тщательно закупорены, а воздух, который соприкасается с растворами, должен предварительно проходить через хлоркальциевую трубку с натронной известью. Для приготовления буферных растворов используют дистиллированную воду (иногда и бидистиллирован-ную), из которой углекислоту удаляют путем кипячения. Для определения pH буферных растворов используется как колориметрический, так и потенциометрически" методы.
120
17.	ПОДГОТОВКА БИОЛОГИЧЕСКОГО МАТЕРИАЛА К БИОХИМИЧЕСКОМУ АНАЛИЗУ
17.1.	Биохимический анализ крови
Наиболее часто в качестве биологической среды для биохимического анализа используют кровь. Кровь — основная жидкость организма, на долю которой приходится примерно Via веса тела. Через кровь клетки тела получают необходимое питание, в нее они отдают многочисленные продукты обмена. Состав крови отражает нормальные и патологические процессы, происходящие в организме животного. Кровь выполняет разнообразные функции: дыхательную — доставка к тканям кислорода и удаление из них углекислоты; питательную — транспорт к органам и тканям продуктов, поступающих из пищеварительного тракта; выделительную— перенос продуктов обмена веществ к выделительным органам (легким, почкам, кишечнику); регуляторную— доставка к органам и тканям гормонов и витаминов, регуляция осмотического давления, поддержание постоянной концентрации ионов водорода, регуляция тепла в организме; защитную — транспортировка защитных веществ, например антител; механическую — создание необходимого давления в полостях, и органах.	• ’
Кровь состоит из плазмы и взвешенных в ней форменных элементов. Если удалить из крови форменные элементы, то остается густая прозрачная жидкость соломенного цвета, которую называют плазмой. В плазме содержится от 90 до 93% воды; 7—10% составляют минеральные соединения, белки, углеводы, жиры, продукты распада белков, жиров и углеводов, ферменты, гормоны, витамины, иммунные тела, пигменты, газы. После удаления из плазмы фибриногена остается жидкость, называемая сывороткой.
Для многих биохимических анализов можно использовать как сыворотку, так и плазму крови. В частности, для определения калия, активности некоторых ферментов (кислой фосфатазы, аргиназы, лактатдегидрогеназы, аланинаминотрансферазы, аспартатаминотрансферазы, альдолазы, фруктозодифосфата и Др.), содержащихся в значительных количествах в тромбоцитах и эритроцитах и освобождающихся из них в процессе свер
121
тывания крови, рекомендуется пользоваться плазмой крови.
17.1.1.	Получение плазмы
При обычных условиях плазма быстро свертывается, что обусловлено наличием в ней белка фибриногена.
Таблица 5
Антикоагулянты
Названий антикоагулянта	Приготовление и применение	Благоприятствует определению веществ	Не благоприятствует определению веществ
Оксалат нат-	300 мт в 20 'мл бидистилли-	Фибриноген	Кальций
рия	роваиной воды. Берут 0.1 мл раствора на 2 мл крови. Желательно использовать пробирки, высушенные при 37°	Метаболиты	Ферменты Электролиты рн
Цитрат нат-	1 часть 3,8% цитрата нат-	Фибриноген	Кальций
рия	рия+9 частей крови	Реакция осаждения крови	Ферменты Электролиты pH
ЭДТА нат-	300 мг натрия этилендиамин-	Фибриноген	Калий
рия	тетраацетата в 200 мл би-дистиллированной воды. Берут 0,1 мл раствора на 2 мл крови. Проводить в пробирках, нагретых до 37°	Метаболиты	Электролиты Остаточный азот
Гепаринат натрия или калия	60 мг геперината натрия или калия в 20 мл дистиллированной воды. Берут 0,1мл раствора на 2 мл крови. Проводить в пробирках, нагретых до 37“	Матаболиты Ферменты	Электролиты
Гепаринат лития	60 мг гепарината лития в 20 мл бидистиллирсванной воды. Берут 0,1 мл крови йа 2 мл крови. Проводить в пробирках, нагретых до 37“	Электролиты Метаболиты Ферменты	Аммиак
Цитрат но-	4,7 г лимонной кислоты, 16 г	Ферменты	Электролиты
глюкозная смесь	трехзамещенного цитрата натрия, 25 г глюкозы в 1000 мл бидистиллнрэван-ной воды. Берут 1 часть раствора на 4 части хрови	эритроцитов Кислая фосфатаза	Метаболиты
Примечание. Таблица заимствована из книги А. А. Покровского «Биохимические методы исследования в клинике». /VI., 1969.
122
Для получения плазмы кровь предохраняют от свертывания, для чего к ней добавляют антикоагулянты. В табл. 5 приведены наиболее часто используемые антикоагулянты, их приготовление и применение.
Антикоагулянты вносят в пробирки в указанных в таблице соотношениях. Необходимо следить, чтобы пробирки были сухими. Антикоагулянтом смачивают стенки пробирки и кровь забирают в последние при легком встряхивании.
17.1.2.	Получение сыворотки
Для получения сыворотки кровь собирают в центрифужную пробирку и оставляют стоять до образования сгустка. Иногда для ускорения свертывания кровь выдерживают в термостате при температуре 37° в течение 30—60 минут. Затем осторожно тонкой стеклянной палочкой или кончиком запаянной пастеровской пипетки обводят стенки для отведения от них сгустка. После этого кровь центрифугируют в течение 5—10 минут при 1500—3000 об/мин. Сыворотку переносят в чистые центрифужные пробирки и снова центрифугируют.
В результате неправильного забора крови или иных причин, приводящих к разрушению эритроцитов получается гемолизированная сыворотка или плазма. Такая сыворотка или плазма приобретает розовый или красный цвет в зависимости от степени гемолиза и не может быть использована для биохимического анализа. Это обусловлено тем, что при разрушении эритроцитов соединения, содержащиеся в них в концентрациях, больших, чем они содержатся в сыворотке, поступают в нее, в связи с чем искажается результат. Ошибка возникает и при фотомет-рировании в области наибольшего поглощения гемоглобина (400—500 нм). Постановка контрольного исследования этой же сыворотки позволяет в некоторой степени избежать ошибки. Следующая вероятность ошибки основывается на возможном взаимодействии гемоглобина с исследуемым веществом. Это касается методов определения активности некоторых ферментов. Если избежать гемолиза нельзя, то необходимо указать в протоколе, какая сыворотка гемолизированная. Последнее необходимо для того, чтобы при анализе учесть возможные ошибки в определении того или иного биохимического показателя за счет гемолиза.
123
Хранение сыворотки. Обычно сыворотку хранят в холодильнике при температуре 0—4°. Срок хранения определяется условиями метода, используемого для определения биохимического показателя. Хранение сыворотки можно продлить, если ее законсервировать, т. е. предохранить от развития микроорганизмов. Для консервирования используют фтористый натрий (5 мг на 10 мл) или тимол (3 мг на 10 мл). Для определения активности большинства ферментов следует использовать только свежую сыворотку.
17.1.3.	Осаждение белков
При проведении биохимических анализов часто требуется предварительно осадить белки. Для осаждения белков используются разнообразные вещества: соли тяжелых металлов (ртуть, свинец, уран), гидраты окисей (цинка, железа), минеральные кислоты (азотная, мета-фосфорная), органические кислоты (уксусная, трихлоруксусная, пикриновая, сульфасалициловая), спирты и кетоны (метиловый спирт, этиловый спирт, ацетон). Для осаждения белков крови одним из наиболее удобных осадителей является трихлоруксусная кислота. Осаждение проводят 10% или 20% раствором. При этом сыворотку следует предварительно разводить дистиллированной водой (2 части сыворотки + 1 часть воды). Конечная концентрация трехлоруксусной кислоты должна быть 4—8%. После осаждения смесь ставят в холодильник на 15—30 минут, затем фильтруют или центрифугируют. При использовании разведенных растворов крови или сыворотки хороший результат получают, если в качестве осадителя белка берут гидрат окиси цинка. В биохимии этот способ нашел широкое применение при определении сахара и хлоридов крови. Для получения коллоидального раствора гидрата окиси цинка смешивают 1 мл 0,1 N раствора NaOH и 5 мл 0,45% раствора сернокислого цинка. После внесения в пробирку крови ее ставят на кипящую баню на 3 минуты. После охлаждения осадок отделяют фильтрованием через вату, предварительно обработанную кипячением.
17.2.	Биохимический анализ мочи
Моча представляет собой прозрачную жидкость, у животных она может быть окрашена от светло-желтого до
124
насыщенно-желтого и темного цвета. Окраска мочи зависит от присутствующих в ней пигментов (урохрома, уробилина и др.). С мочой выводятся из организма вода и растворенные в ней конечные продукты обмена белков, жиров и углеводов, витаминов и др. С мочой выделяются и различные ядовитые продукты, всасывающиеся из кишечника (фенол, индол и др.).
Суточное количество мочи у животных колеблется в зависимости от возраста, количества выпитой воды и др. Суточное количество мочи составляет: у кроликов 50—200 мл, у собак 500—2000 мл, у кошек 200—500 мл, у крыс 1,5—2,5 мл.
Моча очень быстро изменяется на воздухе; она становится темной, приобретает аммиачный запах, в ней выпадают осадки солей. Для большинства биохимических исследований используют свежую мочу. Сохранить мочу можно путем быстрого замораживания при температуре —20°; такую мочу можно использовать для большинства биохимических анализов.
Мочу можно консервировать путем добавления к ней соляной, серной, уксусной кислоты, тимола.
Соляную кислоту добавляют из расчета 30 мл 10N раствора на 100 мл мочи, а серную кислоту — 10 мл 2N раствора на 100 мл мочи. Такая моча пригодна для определения стероидов и катехоламидов.
Для консервирования мочи при определении витаминов применяют 40% раствор уксусной кислоты из расчета 10 мл на 100 мл мочи. Тимол добавляют из расчета 0,3 мл 10% раствора его в изопропиловом спирте на 100 мл мочи. Обработанная этим путем моча пригодна для большинства анализов (исключая 17-кето-стероиды и желчные кислоты).
17.2.1.	Сбор мочи у лабораторных животных
Для сбора суточной мочи животное помещают в обменную клетку. Для разделения кала и мочи к обменной клетке прикрепляют разделительную воронку (рис. 25).
В тех случаях, когда биохимические показатели определяют в малых количествах мочи, а также если нежелательно внесение консервантов, мочу забирают путем катетеризации животных. Для этого животное привязывают и фиксируют в положении на спине в
125
Рис. 25. Обменные клетки для — для кроликов; 2 — для крыс;
ройка.
кроликов и крыс.
3 — разделительная во-
специальном станке. Для катетеризации применяют резиновые катетеры от № 8 до № 18 в зависимости от величины кролика. Можно для придания катетеру жесткости вставить в него медную проволоку (в качестве ман-дрена). Введение катетера производят следующим образом: направляющий конец катетера сгибают на 90° и вводят постепенно в уретру; катетер необходимо держать строго по средней линии. Благодаря легкому нажатию направляющий конец катетера доводят до изгиба мочевого канала; преодоление изгиба и проведение катетера в мочевой пузырь достигается его опусканием книзу. Катетер вводят на 10—14 см, затем удаляют ман-дрен и из катетера должна начать вытекать моча. Если моча не выделяется, то катетер продвигают глубже или оттягивают на 1,5 см, а также надавливают на область мочевого пузыря (немного выше лобка). Если моча по-прежнему не выделяется, то в мочевой пузырь вводят с помощью шприца (через катетер) воздух. Катетер следует вводить спокойно, легкими толчками. Перед введением катетеры обязательно стерилизуют и слегка смазывают вазелином.
J26
17.2.2.	Определение pH мочи
При определении отдельных биохимических показателей требуется, чтобы моча была доведена до определенной pH. Для этого определяют реакцию мочи с помощью универсальной индикаторной бумаги. Для доведения pH до необходимой величины пользуются 1 или O,1N раствором щелочи или кислоты в зависимости от заданной и исходной величин pH мочи.
17.2.3.	Определение удельного веса мочи
Для определения удельного веса жидкостей можно пользоваться ареометрами. Это стеклянный цилиндр, нижняя часть которого (форма может быть различной) заполнена свинцовыми шариками. Кверху цилиндр резко суживается и переходит в тонкий стержень, на котором нанесены цифры (шкала). Если ареометр опустить в жидкость, то он погружается в нее до какой-либо цифры на стержне. Эта цифра и выражает величину удельного веса испытуемой жидкости.
Для исследования мочи применяют ареометры малого размера, чтобы можно было ограничиться малыми объемами мочи для определения ее удельного веса. Их называют урометрами. Обычно имеется два урометра: один для мочи более низкого удельного веса, другой для концентрированной. Начинают определение с первого урометра. Если он погружается очень мало, так, что стержень с цифрами оказывается вне жидкости, то замер производят вторым урометром.
Удельный вес мочи животных колеблется в следующем диапазоне: кролик — 1,010—1,040; собака — 0,015—0,060; кошка— 1,020—1,040.
Измерение удельного веса мочи производят следующим образом: в цилиндр на 100 мл наливают около 50 мл мочи и осторожно опускают в него сухой урометр (диаметр цилиндра должен быть больше на 1 см диаметра широкой части урометра). Отсчет производят по нижнему мениску; при этом следят, чтобы урометр не касался стенок цилиндра. Последнего добиваются тем, что заставляют урометр совершить несколько небольших движений вверх и вниз (ударяя слегка по верхушке урометра). Если урометр всплывает наверх или, наоборот, тонет, то его заменяют другим.
127
Необходимо учитывать, что урометр калиброван для определенной температуры, указанной на нем. Если определение производят при другом значении температуры, то в показания удельного веса вносят поправку: на каждые 3° выше или ниже указанной температуры к показаниям урометра соответственно прибавляют или вычитают по 0,001.
17.2.4.	Удаление белков из мочи
Нередко при определении биохимических показателей мочи присутствие белка мешает правильному ходу реакции, например при определении сахаров. В таких случаях необходимо белки удалить. Это можно достигнуть путем кипячения мочи с уксусной кислотой. Для этого слабокислую мочу нагревают до начала кипения. Если белки не выделяются в виде крупных хлопьев, а образуется муть, то осторожно по каплям добавляют разведенную уксусную кислоту и снова мочу нагревают в течение нескольких минут, пока не выпадут хлопья. После этого мочу охлаждают и фильтруют. Насколько полно осажден белок, проверяют следующим путем: несколько капель фильтрата переносят на часовое стекло, помещают сбоку каплю 20% раствора сульфасалициловой кислоты и дают стечь в фильтрат; появление мути указывает на присутствие белка. Если таким путем не удается избавиться от белка, то к моче добавляют 7ю ее объема ацетатного буфера pH 5,7—5,8 и кипятят в течение 30 секунд, охлаждают и фильтруют. Можно осаждать белки коллоидальным раствором гидрата окиси цинка. Для этого к 5 мл 1N раствора NaOH прибавляют 1 каплю фенолфталеина и добавляют 10% сернокислого цинка до исчезновения красного окрашивания. В последний раствор вносят 50 мл мочи, нагревают на кипящей водяной бане в течение 5 минут, охлаждают и осадок отделяют фильтрованием.
17.3.	Биохимический анализ в ткани органов
В настоящее время целый ряд биохимических показателей определяют в ткани различных органов. Ткань для анализа необходимо измельчить в определенном объеме жидкости и приготовить гомогенат или сделать из нее вытяжку — экстракт. Для приготовления гомоге
128
натов применяют растворы: 0,25 М сахарозы, 0,88 М сахарозы, 0,9% раствор хлористого натрия и д£>- Для приготовления экстрактов используются: бидистиллиро-ванная вода, растворы хлористого калия и хлористого натрия различной концентрации, буферные растворы, как правило, требующиеся для проведения анализа.
Гомогенаты получают двух типов: 1) с разрушенными субклеточными структурами, 2) с неразрушенными субклеточными структурами. Для приготовления гомогенатов с неразрушенными субклеточными структурами используют щадящие методы гомогенизации — стеклянные гомогенизаторы с тефлоновыми пестиками типа Поттера и Даунса. Для получения такого гомогената в стакан гомогенизатора вносят навеску ткани. Предварительно кусочек ткани промывают дважды в охлажденном растворе хлористого калия (если предполагается определение активности ферментов) и осушают на фильтре, быстро взвешивают на торсионных весах. При определении большинства биохимических показателей эта операция проводится при охлаждении. Стакан гомогенизатора с помещенной в него навеской ткани ставят на баню со льдом, измельчают ткань путем вращения пестика со скоростью 800—1000 об/мин в гомогенизаторе Поттера в течение V2—1 '/г минут или при многократном движении пестика вверх и вниз в гомогенизаторе Даунса. Приготовленные таким образом гомогенаты пригодны для биохимического исследования субклеточных структур.
Для приготовления гомогенатов с разрушенными субклеточными структурами пользуются жесткими методами гомогенизации. Для этого используют ступки с кварцевым песком или микро- и макрогомогенизаторы Уор-ринга. Если гомогенаты приготовлены в мягких условиях, то их следует дополнительно обработать, применяя неоднократное замораживание и оттаивание или другие способы (обработка ультразвуком и т. д.). Обломки субклеточных структур отделяют с помощью центрифугирования при 14 000 об/мин в теи“чие 30 минут.
17.4.	Количественный анализ биохимических показателей
В. лабораторной практике в настоящее время широко применяются оптические приборы, предназначенные для определения концентрации различных веществ в раство-
129
pax и взвесях. Эти приборы позволяют регистрировать изменения, происходящие с лучом света при прохождении через испытуемый раствор (рефрактометрия, фотометрия), а также излучение атомов и молекул исследуемого вещества (флуориметрия, пламенная фотометрия).
Рефрактометрический метод основан на измерении показателя преломления света. Показатель преломления света является для каждого вещества величиной постоянной и при определенных условиях зависит только от концентрации вещества в растворе. Рефрактометры применяются для определения концентрации белка в биологических жидкостях.
В основу фотометрического анализа положен принцип измерения интенсивности светового потока. В настоящее время до 3Д всех анализов, проводимых в биохимических лабораториях, основывается на фотометрическом определении. Существуют две разновидности фотометрического анализа: адсорбционная фотометрия (спектрофотометрия, нефелометрия) и эмиссионная фотометрия (флуориметрия, пламенная фотометрия). Диапазон фотометрических измерений составляет 190—2000 нанометров (нм). В зависимости от того, в какой области спектра идет измерение, различают: ультрафиолетовую фотометрию — измерение в области 190—400 нм; колориметрию— измерение в области 400—760 нм (видимая часть спектра); инфакрасную фотометрию — измерение в области 760—2000 нм. Измерение в области указанных длин волн производят на фотоэлектроколориметре и спектрофотометре.
Фотоэлектроколориметр предназначен для определения концентрации окрашенных растворов. О концентрации вещества судят по степени изменения силы тока. Сила тока регистрируется стрелочным гальванометром.
Спектрофотометры позволяют получать более моно-хроматичные пучки света благодаря кварцевым призмам. Они являются универсальными и очень точными приборами, работа которых основана на измерении поглощения света в широком диапазоне видимой и ультрафиолетовой частей спектра. Количественный фотометрический анализ следует начинать с построения стандартной кривой, которая позволяет перевести показатели экстинкции в концентрацию исследуемого вещества.
Нефелометрией называется определение концентрации взвешенного в жидкости вещества по сравнению его
130
мутности с мутностью стандарта. Непрозрачные растворы обладают способностью рассеивать часть световой энергии падающих на них лучей. Чем мутнее раствор, тем больше он рассеивает света и тем меньше он его пропускает. Концентрация раствора в определенных условиях находится в пропорциональной зависимости от его мутности. Нефелометрический анализ применяется для определения белков и липидов в биологических материалах. Современная промышленность выпускает ФЭК Н-57, этот прибор объединяет в себе колориметр и нефелометр.
Эмиссионная фотометрия. Флуориметрия. Многие вещества обладают способностью превращать свет, которым они облучаются, в свет с большей длиной волны. Таким образом возникает вторичное излучение, которое называют флуоресценцией. Флуориметрия — наиболее чувствительный из оптических методов и отличается высокой специфичностью. Количественное определение веществ основано на пропорциональной зависимости (при определенных условиях) между концентрацией и интенсивностью флуоресценции. Флуориметрический анализ находит применение при определении биогенных аминов (катехоламины, гистамин, серотонин), витаминов (рибофлавин, тиамин, пиридоксин), оксикортикостероидов, ферментов. Для определения витаминов используется прибор марки ЭФ-3 и ЭФ-ЗМ, выпускаемые отечественной промышленностью. Для определения других биохимических показателей применяют более чувствительные приборы, такие, как ИФ-1, флюоримет-ры марки ФЛЮМ и др.
Пламенная фотометрия. Метод спектрофотометрии пламени основан на способности электронов атомной оболочки металлов в условиях высокой температуры (в пламени горелки) захватывать часть тепловой энергии, возбуждаться и переходить на более высокий энергетический уровень. Поглощенная электронами энергия выделяется затем (при возвращении возбужденных электронов на исходный уровень) в виде кванта света. Измерение его интенсивности производится, как и в случае адсорбционной фотометрии. С помощью этого метода определяют содержание натрия и калия в биологических жидкостях. Количественные расчеты проводят по стандартным кривым.
131
часть
Техника патологоанатомического вскрытия и обработка материала
Т. А. Кочеткова
18.	КРАТКИЕ СВЕДЕНИЯ ОБ АНАТОМО-ФИЗИОЛОГИЧЕСКИХ ОСОБЕННОСТЯХ ВЗРОСЛЫХ ЛАБОРАТОРНЫХ ЖИВОТНЫХ
18.1.	Строение лабораторных животных (скелет)
Строение скелета всех лабораторных животных в общих чертах одинаково — основные части скелета у них одни И те же. У собак скелет более массивный, у кошек легкий, но крепкий; переломы у кошек бывают крайне редко. Скелет кошек более подвижен и эластичен, чем у собак. Скелет у кролика очень хрупкий. Достаточно неосторожного резкого движения и у кролика ломается позвоночник, что вызывает немедленный паралич задних конечностей. Перелом позвоночника может произойти по вине лаборанта, если кролик будет неправильно взят и приподнят. Но иногда и сами кролики, испугавшись чего-либо, делают такие резкие движения, что ломают себе позвоночник. В тех случаях, когда лаборант удерживает кролика за передние и задние лапки, необходимо между задними лапками вложить один из своих пальцев. Иначе при удерживании одна из ног (чаще .задних) будет сильно давить на другую, в результате чего также может произойти перелом кости ноги. У крыс и мышей скелет легкий, но не такой хрупкий, как у кроликов. Имеется опасность переломать ребра при .слишком тугом завертывании в тряпку для фиксирования животного.
Скелет подразделяют на скелет головы, туловища и конечностей. Скелет головы, или череп, имеет мозговой (задний) и лицевой (передний) отделы.
Кости туловища соединены позвоночным столбом, состоящим из позвонков. Позвоночные отверстия позвонков составляют позвоночный канал, в котором расположен спинной мозг. При переломе позвоночного .132
столба травмируется спинной мозг, что вызывает паралич конечностей. Чаще переломы позвоночного столба бывают в поясничной части. Перелом позвоночного столба неизлечим — животное необходимо забить. Позвоночный столб разделяется на шейный, грудной, поясничный, крестцовый и хвостовой отделы. Шейных позвонков 7, грудных 13 (у кроликов иногда 12), поясничных у собак 7, у кроликов и крыс 6—7, крестцовых 3—4. Эти позвонки, сросшиеся вместе, образуют крестцовую кость. Число хвостовых позвонков непостоянно: у собак от 18 до 22, у кроликов —15—16, у крыс 27—30, у морских свинок 6—7. У крыс и мышей часто берут кровь, надрезая или отрезая кончик хвоста. Следует помнить, что нельзя задевать позвонки, так как это может привести к серьезному заболеванию животного. К позвонкам грудного отдела подвижцо прикреплены ребра. Верхние ребра (их называют ложными ребрами) соединяются спереди с грудной клеткой, образуя грудную клетку (у собак девять пар, у кроликов семь, у морских свинок шесть). Грудная кость, или грудина, состоит из 5—6 сросшихся сегментов. В грудине различают рукоятку, тело, мечевидный отросток или хрящ. У морских свинок рукоятка и мечевидный отросток срастаются с телом грудины лишь у старых животных. К позвоночнику прикреплены также конечности. Различают передние и задние (или грудные и тазовые) конечности.
Передние конечности состоят из грудного или плечевого пояса и собственно конечностей. Грудной пояс включает лопатку и ключицу. Ключица у собак маленькая, у кошек она развита сильнее. Собственно конечность состоит из плечевой кости, двух костей предплечья, (лучевой и локтевой), запястья, пясти и костей пальцев. Кости предплечья с помощью запястного сустава соединяются с короткими костями запястья, которые в свою очередь соединены с пястными костями. К костям пясти присоединены кости пальцев, состоящих из отдельных фаланг. Задние конечности состоят из тазового пояса и собственно конечностей. Тазовый пояс создан тремя парами сросшихся костей: подвздошной, лонной и седалищной. Подвздошные кости в сложном суставе соединяются с бедренной костью — верхней костью собственно конечности. В нижней части бедренная кость соединяется с костями голени и образует ко
133
ленный сустав, в составе которого находится коленная чашечка. Кости голени состоят из большой берцовой и малой берцовой костей. У кроликов эти кости сросшиеся. В нижнем конце кости голени, соединяясь с костями заплюсны, образуют скакательный сустав. Заплюсна (или предполюсна) включает в себя короткие кости (семь у собак, шесть у кроликов), уложенных, как и кости запястья передней конечности, в три ряда. Нижний ряд костей заплюсны соединяется с костями плюсны. К костям плюсны прикреплены кости пальцев, состоящие из отдельных фаланг. На пальцах как передних, так и задних конечностей имеются когти. У кошек когти подвижные, острые. Ими кошки могут поранить кожу исследователя. О защите от когтей кошек см. в части 1.
18.2.	Кожный покров и его производные
Кожа является защитным покровом, барьером для проникновения микроорганизмов. Кроме того, кожа обладает выделительными функциями. В коже расположены многочисленные нервные окончания, поэтому кожа служит и органом осязания. Принимает участие кожа и в терморегулировании организма.
Кожа имеет три слоя. Первым слоем является надкожица, или эпидермис. Поверхностные слои эпидермиса состоят из ороговевших, постепенно отмирающих и слущивающихся клеток многослойного плоского эпителия. В глубокой части эпидермиса имеются живые клетки, постоянно размножающиеся путем деления. Так происходит обновление кожи. Вторым слоем является собственно кожа, или дерма. В этом слое находится очень много чувствительных нервных окончаний, капилляров, корней волос и желез. Третьим слоем является подкожная клетчатка. Толщина его зависит от скопления в нем жира. Этот слой у животных часто развит очень слабо. Несмотря на то что кожа человека также делится на эти три слоя, реакция кожи человека неодинакова с реакцией кожи животных. Так, например, при нанесении на кожу какого-либо раздражающего вещества у животных не удается получить пузыря. Чувствительность кожи животных также не идентична чувствительности кожи человека. Характерно, что кожа кролика обладает большей проницаемостью для ядов, чем
134
кожа человека. Кожа животных покрыта -волосами. Волос состоит из стержня и корня, образующего в нижней части луковицу волоса. У животных постоянно выпадает небольшая часть волос, заменяясь новйми. Но особенно выпадение волос увеличено в периоды так называемой линьки. У собак линька происходит в весенние и осенние месяцы. У кроликов линька происходит также в основном в эти периоды времени, но обычно сильно растягивается. У собак в периоды линьки следует вычесывать выпавшую шерсть. У кроликов, особенно у пород с длинной шерстью, надо выщипывать пух, иначе она сваливается и ее приходится обрезать.
На морде у животных имеются осязательные волосы («усы», вибриссы). Обрезать их нельзя. У крыс вибриссы в виде длинных волос расположены в основном на верхней губе, но есть также и над глазами и на нижней губе. У крыс вибриссы вопринимают не только соприкосновение с предметами, т. е. являются не только органами осязания, но и улавливают колебания воздуха. У кошек и кроликов вибриссы размещаются главным образом на верхней губе и под глазами. Поскольку весь Волосяной покров животных также выполняет функцию осязания, лаборант должен избегать лишний раз дотрагиваться до животных, производить такие действия, которые вызывают сильное движение воздуха.
В коже заложены железы — потовые и сальные. Потовые железы выделяют пот, с которым удаляются из организма некоторые вещества (гормоны, промежуточные продукты обмена веществ, некоторые яды и токсины). У собак потовые железы сконцентрированы на мякишах (характерные образования кожи в области лап) и на кончике носа. У кроликов потовые железы выражены слабо, локализованы главным образом в области мордочки. Молочные железы являются производными от потовых. Чаще у крольчихи имеется четыре-пять пар, реже шесть или три пары молочных желез. В каждом соске молочных желез открывается 12—14 молочных ходов.
Сальные железы вырабатывают кожное сало, которое покрывает кожу и волосы. У собак сальные железы хорошо развиты в коже мошонки. У кроликов сальные железы особенно хорошо развиты на наружном ухе.
Состояние волосяного покрова является хорошим показателем здоровья животных. У здоровых животных
135
волосяной покров гладкий, блестящий. У заболевших или отравленных животных волосяной покров взъерошенный, волосы тусклые, выпадают. Образуются плешины. Это хорошо видно на морде у собак и кошек. С возрастом волосы животных седеют, а у белых крыс принимают желтоватую окраску. Крысы к старости лысеют.
18.3.	Мышечная система
Мышечная система является активным аппаратом движения. На долю скелетной мускулатуры приходится более половины общего веса тела животного. Вся мышечная система подразделяется на произвольную скелетную (соматическую) и непроизвольную (висцеральную). К висцеральным мышцам относится мускулатура кишечника, сердца, сосудов.
Соматическая мускулатура состоит из поперечнополосатых мышечных волокон. Движение этой мускулатуры зависит от приказов, получаемых из коры головного мозга. Животное может произвольно двигать свою скелетную мускулатуру. Непроизвольная, висцеральная, мускулатура образована гладкомышечными волокнами. Движение этой мускулатуры подчинено другим отделам нервной системы — висцеральной нервной системе, и произвольным приказам не подчиняется.
18.4.	Нервная система
Нервной системе отводится важнейшая роль в регуляции функции органов в связи с изменившимися условиями, восстановлении жизнедеятельности организма в новых условиях. Такие факторы внешней среды, как токсические вещества, поступая в организм, также нарушают состояние его функций. Во многих случаях именно изменения в нервной системе являются наиболее показательными для воздействия ядов.
Вся нервная система подразделяется на центральную и периферическую.
В состав центральной нервной системы входит головной и спинной мозг.
Центральная нервная система кролика характеризуется примитивностью строения, так как слабо развита кора полушарий головного мозга. Полушария не имеют
136
борозд и извилин. Вес центральной нервной системы по отношению к весу тела кролика составляет от 0,6 до 1%, т. е. до 15—17 г. Полушария головного мозга кролика небольших размеров, сужены и заострены кпереди. Оба полушария разделены между собой мелкой продольной щелью. Спереди большого мозга выделяются значительные по объему обонятельные луковицы. Нечетко выражен варолиев мост. Мозжечок не имеет компактной формы, уплощен спереди назад, имеет небольшие боковые полушария. Морфологическое, биохимическое и электроэнцефалографическое созревание коры происходит к 10—15-му дню со дня рождения кролика.
Спинной мозг кролика в среднем весит 5 г. Он заполняет канал, позвоночника и имеет два утолщения: первое, слабо выраженное, находится на уровне нижних шейных позвонков, второе — на уровне III—IV поясничных позвонков. В центре спинного мозга проходит канал, наполненный ликвором, который на уровне II крестцового позвонка образует расширение под названием конечного желудочка. От серых рогов спинного мозга отходят брюшные (двигательные) и спинные (чувствительные) корешки. Оба корешка до выхода из межпозвоночного отверстия объединяются и образуют спинномозговые нервы. Количество пар этих нервов не отвечает числу позвонков (шейных, спинномозговых нервов восемь, т. е. больше, чем позвонков, а хвостовых— только шесть). Как и у других животных, у кролика головной и спинной мозг покрыт тремя оболочками— твердой, паутинной и мягкой.
По спинному мозгу проходят нервные импульсы с периферии в головной мозг и из центра на периферию. В спинном мозге расположено много жизненно важных центров, обеспечивающих большое количество двигательных рефлекторных актов, поддерживающих тонус поперечнополосатой мускулатуры, центр дефекации, центр, регулирующий функции мочеполовых органов. В спинном мозге также размещены центры вегетативной нервной системы, играющие важную роль в регуляции деятельности внутренних органов организма.
Периферическая нервная система образуется длинными отростками нервных клеток (аксоны или нейриты). Тысячи нейритов объединяются в нервные стволы, или нервы.
6—8178
137
У морских свинок весом от 250 до 650 г вес головного мозга колеблется от 2,8 до 3,2 г. Наружная поверхность мозговых полушарий разделяется на четыре доли: лобную, теменную, височную, затылочную. Кора больших полушарий головного мозга не имеет выраженных извилин, а лишь неровности, поэтому эти животные относятся к группе гладкомозговых. Имеются четыре борозды примитивного типа: ринальная передняя, риналь-ная задняя, гипокампова и борозда мозолистого тела. Кроме них, имеются еще сильвиева, носовая и каудальная. Поверхность большого мозга разделена сильвиевой бороздой на переднюю (лобно-теменную) и заднюю (височно-затылочную) области. Морская свинка по сравнению с другими животными рождается с наиболее развитым головным мозгом. К моменту рождения заканчивается морфологическое и биохимическое развитие коры головного мозга морской свинки.
Головной мозг у взрослой крысы весит в среднем 2,4—2,8 г. Варолиев мост развит очень слабо. Полушария переднего мозга гладкие. Обонятельные доли большие. Морфологическое развитие коры головного мозга заканчивается к 10-му дню со дня рождения. Строение головного и спинного мозга, отхождение черепномозговых и спинномозговых нервов примерно такое же, как и у других млекопитающих.
Строение и функции головного и спинного мозга мышей принципиально такие же, как и у других млекопитающих. Головной мозг взрослой мыши весит в среднем 0,27 г.
18.5.	Сердечно-сосудистая система
Сердце расположено в средостении между двумя легкими. С передней стороны оно достигает диафрагмы, а со стороны спины соприкасается с трахеей и бронхами. Сердце теплокровных лабораторных животных разделено на четыре части — продольная перегородка делит сердце на правую и левую половину, каждая из которых также делится на две части, соединенные клапанами. Нижние отделы называются желудочками, а верхние — предсердиями. Сердце находится в так называемой сердечной сумке (перикарде). Сердце кролика длиной 3,5—3,8 см, шириной в спиннобрюшном направлении — 2,2—2,5 см.
138
Вес сердца, лишенного крови, у взрослого кролика составляет 0,274% веса всего тела. Правый желудочек сердца большой, тонкостенный, левый несколько длиннее, имеет толстую стенку и образует верхушку сердца. Правое предсердие имеет хорошо развитое ушко и синусовую область, в которую впадают передняя и задняя полые вены. В левое предсердие впадают центральный, левопередний и правопередний коллекторные стволы легочных вен. Для кролика характерно отсутствие лакун легочных вен; мышечные волокна левого предсердия по стенкам легочных вен проникают в глубь легких. Такое внутрилегочное предсердие во многом благоприятствует кровообращению у животных с частым сердцебиением. У кроликов пристеночные створки трехстворчатого клапана слиты и полностью не разделены на две части; третья створка на перегородке выделена как самостоятельная. Левый двустворчатый клапан у кроликов имеет хорошо выраженную аортальную створку, в то время как пристеночная створка выражена слабо. В левом желудочке имеется два, а в правом три (четыре—пять) сосковидных мускула.
Сердце у морской свинки весит от 2 до 2,5 г, в среднем 2,3 г. Большая часть сердца покрыта долями легких.
Сердце крысы весит в среднем 1,3 г. Кровоснабжение сердца осуществляется за счет левой и правой венечных артерий. От дуги аорты отходят безымянная, левая общая сонная и левая подключичная артерии. Реже безымянная артерия отсутствует, и тогда от дуги аорты вместо нее отходят правая общая сонная и правая подключичная артерии. В правое предсердие впадает задняя полая вена, парные безымянные и сердечные вены. Передней полой вены, которая у других животных возникает от слияния безымянных вен, у крыс нет.
Сосуды большого круга кровообращения. Особенностями аорты у кролика являются резкая изогнутость дуги, ее низкое расположение и некоторое смещение влево. От дуги аорты сосуды отходят по рассыпному типу. От аорты отходят: 1) правая и левая венечные артерии; 2) плече-головная артерия, или безымянная, идущая несколько справа. Последовательно от этой артерии отходят левая общая сонная артерия, которая в ряде случаев может отходить и непосредственно от аорты, правая общая сонная артерия, после чего безы
5*
139
мянная артерия продолжается в виде правой подключичной артерии; 3) подключичные артерии. Вблизи околоушной железы под нижней челюстью общая сонная артерия справа и слева разделяется на более крупную наружную и более нежную внутреннюю сонные артерии. Последняя через канал височной кости проходит в полость черепа и снабжает кровью головной мозг, глаза и носовую полость. Наружная сонная артерия разветвляется на затылочную, большую ушную, подъязычную, наружную челюстную, околоушную, поверхностную височную и внутреннюю челюстную.
От грудной аорты отходят артерии к пищеводу, легким, мышцам грудной клетки и диафрагме. Брюшная аорта идет вдоль позвоночника -с некоторым отклонением влево. От нее отходят: 1) чревная артерия, снабжающая кровью печень, желудок, поджелудочную железу и небольшой участок тонкого кишечника; 2) передняя брыжеечная артерия; 3) правая и левая почечные артерии; 4) внутренние семенные артерии, снабжающие кровью у самцов семенники, а у крольчих яичники, фаллопиевы трубы и матку; 5) задняя брыжеечная артерия, образующая сосуды, идущие к ободочной и прямой кишкам; 6) парные поясничные артерии. На уровне VII поясничного позвонка брюшная аорта образует ряд ответвлений для кровоснабжения органов и стенок тазовой области и нижних конечностей.
18.6.	Органы дыхания
Легкие и дыхательная часть носовой полости кролика по сравнению с другими животными развиты недостаточно. Трахея у кролика включает 48—50 трахеальных колец овальной формы. Слизистая оболочка верхних дыхательных путей покрыта мерцательным эпителием, имеющим значительное число желез. Длина трахеи у морской свинки около 3,5 см, диаметр 3—5 мм. Хрящевые кольца сзади не замкнуты. Трахея у белой крысы состоит из 30 хрящевых полуколец и выстлана двуслойным мерцательным эпителием. Трахея белой мыши состоит из 15 хрящей. На уровне V грудного позвонка трахея делится на два основных бронха, входящих в левое и правое легкие.
Легкие представляют собой парные органы, занимающие большую часть грудной клетки и постоянно
140
меняющие свою форму в зависимости от фазы дыхания. У кролика легкие небольшие. Правое легкое разделено на четыре доли, левое — на три. Правое легкое тяжелее левого и весит 12 г, а левое— 11 г. Аналогичное строение легких у морских свинок. У крыс левое легкое состоит из одной, а правое из четырех долей. У молодых крыс весом 130—150 г правое легкое весит 0,45 г, а левое — 0,4 г. У крыс весом 200—250 г правое легкое весит 1,05 г, а левое — до 0,8 г. У мыши такое же строение легких, как и у крысы.
18.7.	Органы пищеварения
Большинство органов пищеварения расположено в брюшной полости и только язык и пищевод вне ее.
Язык у всех животных, кроме нитевидных сосочков, имеет у корня один или два валиковидных (по одному справа и слева) соска и большое количество грибовидных сосочков, которые концентрируются в основном на верхушке языка, а также имеются на спинке и по бокам его. В сосочках располагаются вкусовые точки. В ротовую полость открываются выводные протоки слюнных желез.
Длина пищевода у кролика 14—16 см. Слизистая оболочка пищевода богата железами. В области шеи пищевод идет поверх трахеи, в нижней трети шеи изгибаясь влево. В грудной части он по средостению и через левую ножку диафрагмы входит в брюшную полость. Особенностями брюшной полости кролика является ее большой объем (500—550 см3). Она значительно внедряется в грудную клетку. У крыс длина пищевода 7—8 см. Пищевод впадает в желудок посередине малой кривизны. Длина пищевода у мышей около 3 см.
Желудок размещен в левой части брюшной полости (живота). Объем желудка у морской свинки 20—30 мл. Он всегда наполнен пищей. У мыши желудок вмещает 1—1,5 мл, а у кролика — до 200 мл. Он также всегда наполнен пищей, как и у морских свинок. У кроликов форма желудка подковообразная.
У кроликов длина кишечника в 12 раз длинее тела, у морской свинки в 10 раз, у крысы в 5—9 раз, у мыши в 3—5 раз. Характерной особенностью кишечника кролика является чрезмерно выраженный толстый отдел и обильное распространение лимфатических образований.
141
В тонком кишечнике расположены скопления лимфоидной ткани, называющиеся пейеровыми бляшками. Поверхность кишечника увеличивается за счет имеющихся ворсинок слизистой оболочки кольцевидных складок.
18.8.	Пищеварительные железы
Печень — самая большая пищеварительная железа, составляющая 4—4,5% веса тела у кролика (около 80— 120 г), 3,9% веса тела у морской свинки (около 18,5 г), 4—6% веса тела у крысы (от 6,5 до 10—12 г); вес печени взрослой мыши 1,13 г. Печень у лабораторных животных расположена преимущественно в правой половине живота (у кролика в левой) темно-буровато-красного цвета, состоит из долей (у мыши из четырех долей). Между внутренней левой долей и правой у мышей находится желчный пузырь. У крыс желчного пузыря нет.
Поджелудочная железа расположена позади и кнаружи от желудка, в брыжейке; она бледно-розового цвета, состоит из двух долей. У кроликов она малых размеров и состоит из отдельных долек.
18.9.	Органы кроветворения
Основными кроветворными органами являются костный мозг, селезенка, лимфатические узлы и лимфатические образования кишечника. Селезенка расположена в левой, частично в средней части брюшной полости. У кролика она маленькая, темно-вишневого цвета, удлиненной формы. Вес селезенки у кроликов составляет 0,05% веса тела (с возрастом вес ее уменьшается). Селезенка у морской свинки в отличие от других грызунов плоская, а не трехгранная. Вес ее от 0,27 до 0,5 г соответственно весу морской свинки (200—250 и 500 г). У крыс весом 130—250 г вес селезенки колеблется от 0,7 до 2 г.
18.10.	Органы выделения
Почки у животных, как и у человека, расположены по обе стороны позвоночника забрюшинно и имеют бобовидную форму. Из ворот почек выходят мочеточники, которые впадают в мочевой пузырь. Мочеиспускательный канал кроликов-самцов расположен прямолинейно. У крольчих он оканчивается на нижней стенке влагалища, отверстие его прикрыто специальной складкой. Вес почек
142
кролика составляет 0,6—0,7% веса тела. Вес одной почки молодой морской свинки (при весе тела 200—250 г) — 2,6 г, а взрослой — 5 г. Правая почка мыши весит 0,14 г, а левая — 0,13 г. У крыс весом 130—150 г правая почка весит 0,63 г, а левая — 0,6 г; у крыс весом 200—250 г правая почка весит 2,05 г, левая — 2 г.
18.11.	Органы размножения (половые органы)
Самцы. Вес семенников кролика составляет 0,2—0,3% веса тела, у морской свинки — 2,3 г, у молодых крыс — 0,7 г, а у взрослых — 2,5 г. Семенники имеют эллиптическую форму, чаще располагаются в мошонке и могут втягиваться в паховые ходы. В большинстве левый семенник несколько больше правого. Из придаточных желез мужских половых органов сильно развиты пузырьковые железы, которые имеют вид длинных выростов.
Половые органы самок. Яичники расположены сзади и ниже почек. Они овальной формы у крольчих и у морских свинок и в виде скоплений типа просяных зерен у крыс и мышей. Яичники содержат фолликулы, в которых развиваются яйцеклетки. После овуляции яйцеклетки попадают в яйцеводы, где и оплодотворяются, затем перемещаются к матке. Матка двурогая; в полость влагалища каждый рог открывается отдельным отверстием. Мускулатура матки хорошо развита.
18.12.	Железы внутренней секреции (эндокринные железы)
Гипофиз состоит из трех долей: задней, передней и слабо развитой промежуточной. Вес гипофиза самок-крыс больше, чем у самцов.
Шишковидная железа (эпифиз) расположена между большими полушариями головного мозга и мозжечком в виде маленького пузырька.
Щитовидная железа парная, расположена на шее ниже надгортанника, имеет две доли и перешеек. Обе доли щитовидной железы уплощенной формы. Вес ее колеблется от 13 до 60 мг. У крысы весом 200 г. она весит 20— 23 мг. Щитовидная железа у кролика весом 2 кг составляет в среднем 0,2 г. Состоит так же, как у крыс, из двух долей и перешейка. У самок щитовидная железа больших размеров, чем у самцов. Щитовидная железа
143
мыши состоит из двух долей, вес ес составляет около 4 мг.
Зобная железа (тимус) расположена под грудиной, в переднем средостении. У молодых кроликов она развита лучше. У взрослого животного паренхима зобной железы заменяется жировой и соединительной тканью. Зобная железа у крыс довольно больших размеров. Расположена она под трахеей и состоит из двух долей.
Надпочечники у кроликов располагаются асимметрично, правый находится на уровне XII грудного позвонка у внутреннего края правой почки, а левый — на уровне II поясничного позвонка. Вес одного надпочечника составляет 0,021—0,026% веса тела. Надпочечники крысы желтоватого цвета и расположены кпереди и медиальнее почек. Вес надпочечников колеблется от 13 до 38 мг, причем у взрослых самок надпочечники более тяжелые, чем у самцов. Встречаются добавочные надпочечники. Надпочечники мыши имеют величину макового зерна (весом по 2—3 мг) и отличаются от окружающей жировой ткани оранжевым цветом. Располагаются они впереди и кнутри от почек, причем правый надпочечник лежит на соответствующей почке, а левый от почки несколько отдален.
19.	ОБЩИЕ ПРИНЦИПЫ ПАТОЛОГОАНАТОМИЧЕСКОГО ВСКРЫТИЯ
19.1.	Методы умерщвления лабораторных животных
Для умерщвления мелких грызунов чаще всего применяют следующие методы: декапитацию — обезглавливание; действие больших количеств летучих наркотиков (например эфира); замораживание в жидкой углекислоте. Наиболее приемлемым считается способ умерщвления декапитацией. Опыт убеждает, что при изучении органов дыхания лучшим методом является перерезка спинного мозга и сосудисто-нервного пучка в шейном отделе (не повреждается трахея). Для этого левую руку в кожаной перчатке (или обернутую тряпкой) кладут сверху, со спины на область шеи и лопаток и, слегка сжимая животное, быстро опрокидывают его на левый бок, затем прижимают к краю раковины или лотка, на котором умерщвляется животное. Одновременно правой
144
рукой с ножницами в положении «плашмя» острой браншей прокладывают кожу у основания правого уха па границе с затылочной костью. Продвигая несколько вглубь острую браншу, замыкают тупой траншей сверху ножницы и перерезают указанные ткани и спинной мозг.
Применение эфира может вызвать изменения, которые не всегда легко отличить от изменений, действием исследуемого вещества. Замораживание в жидкой углекислоте удобно в тех случаях, когда производится биохимический анализ органов и тканей. Умерщвление электротоком может привести к образованию кровоизлияний, которые трудно отличить в случае гибели подопытных животных от острой интоксикации, приводящей к расстройству кровообращения. Кроликов, как правило, умерщвляют введением воздуха в ушную вену. Для умерщвления мышей может быть применен следующий прием. Мышь кладут животом вниз на стол, большим и указательным пальцами захватывают кожу между ушами, крепко фиксируя животное. Затем резким движением правой рукой тянут мышь за хвост — этим достигается перелом позвоночника и моментальная смерть. Каждый способ умерщвления животных влечет за собой какие-то изменения органов и тканей, поэтому для подопытных и контрольных животных способ умерщвления должен быть одинаковым.
Кроме патологоанатомических изменений, вызванных действием исследуемого вещества, у животных могут быть обнаружены изменения в органах, связанные с заболеваниями, характерными для данного вида. В некоторых случаях они отражают неспецифическое действие токсических веществ. Следует учитывать, что трупы животных быстро (особенно в жаркое время) разлагаются, поэтому вскрытие погибших или умерщвленных животных следует производить незамедлительно. При вскрытии животных следует обращать внимание на возможность погрешностей опыта — прокол зондом пищевода, желудка и т. п.
19.2.	Подготовка и вскрытие животных
Патологоанатомическое вскрытие трупов лабораторных животных (секция, аутопсия) производят в специальном помещении (прозекторская, секционная), которое, как и
145
Рис. 26. Стол для вскрытия лабораторных животных.
все оборудование, в нем, должно содержаться в чистоте и асептическом состоянии.
Вскрытие производят на мраморном или деревянном секционном столе с приподнятыми бортами, обитом оцинкованными листами. В центре или на конце стола должно быть отверстие, снабженное идущей вниз под стол трубкой для стока жидкости в канализационную систему или в подставленный сосуд (рис. 26). На столе должен стоять сосуд с водой для промывания органов. Желательно, чтобы к столу была подведена вода (горячая и холодная). На стол ставят препаровочный столик, на который кладут вскрываемый труп животного, и столик для инструментов (столики могут быть заменены деревянными или пластмассовыми досками, кюветами, лотками). По краям досок должны быть приспособления (шурупы, гвозди), к которым привязывают лапы забитых или павших животных, чтобы во время вскрытия тушка была неподвижна. Стол ставят так, чтобы на него падало как можно больше естественного света или он должен равномерно освещаться бестеневыми лампами. На полу возле стола должна быть деревянная решетка или резиновый коврик, чтобы ноги вскрывающего не скользили.
Пол в прозекторской покрывают керамической гладкой плиткой (кафелем). При необходимости производства бактериологических исследований оборудуют отдельный столик. Запись протокола вскрытия производит
146
ся за отдельным столом в соответствующей книге или тетради.
Для хранения инструментов, халатов, перчаток, стеклянной посуды, реактивов, фиксирующих жидкостей и др. в секционной должны находиться шкафы. В секционной обязателен умывальник для мытья рук, перчаток, инструментов после вскрытия. Возле умывальника должны висеть полотенца для рук, чистые тряпки для осушения перчаток и инструмента, над умывальником на деревянной полке следует поставить сосуд с дезинфицирующей жидкостью.
Для вскрытия необходимо иметь набор секционных инструментов, чаще пользуются различного размера ножницами, анатомическими пинцетами, секционным ножом, скальпелем и щипцами (кусачками) для вскрытия полости черепа и отделения костей. Для производства детального вскрытия необходимы следующие инструменты: большой секционный нож для отделения конечно-стоей у крупных лабораторных животных, для рассечения печени; реберный нож; мозговой нож, узкий, обоюдоострый; бритва для рассечения органов мягкой консистенции, например спинного мозга; кишечные ножницы с выдающейся и закругленной на конце браншей; пуговчатые ножницы различной величины для вскрытия сосудов, бронхов, протоков желез и т. д.; ножницы с заостренными концами (препаровочные); реберные ножницы (одна из бранш тупая и вогнутая, другая острая и брюшистая); костные ножницы с короткими прочными браншами для откусывания костных частей; щипцы-костодержатели; пилы; молотки.
Кроме того, необходимы измерительная металлическая линейка, весы для взвешивания органов: аптечные и торсионные для взвешивания щитовидной, паращитовидных желез; измерительные цилиндры, лупа; точильный брусок для точки ножей; стеклянные банки различной емкости для фиксации кусочков органов, взятых во время вскрытия; халаты; перчатки (резиновые и нитяные); нарукавники; фартуки — для вскрывающего; салфетки, полотенца; тазы, тарелки, блюда; ведра с крышками (эмалированные); сосуды с дезинфицирующими жидкостями (стеклянные).
Вскрывающий поверх платья надевает халат и полиэтиленовый (прорезиненный) фартук и нарукавники, на руки — перчатки (хирургические или прорезиненные).
147
Вскрытие трупа лабораторного животного производят в положении его на спине с фиксированными конечностями. Смоченной в воде ватой увлажняют шерсть на шее, груди и животе (особенно при вскрытии кроликов). После этого начинается собственно вскрытие, общая схема которого такова: 1) наружный осмотр; 2) разрезы, отделение покровов, вскрытие полостей и внутренний осмотр положения и органов и состояния полостей; 3) исследование внутренних органов; 4) взятие костного мозга и костей.
При наружном осмотре трупов подопытных животных, погибших во время эксперимента, особенно при ингаляции исследуемых веществ, особое внимание обращается на состояние слизистых оболочек глаз, отверстий носа, морды, обращается внимание на наличие выделений, их характер: кровянистые, пенистые и др. У погибших животных, особенно у мышей, описывают состояние волосяного шерстяного покрова (блестящая или тусклая, взъерошенная, влажная, сухая, чистая, грязная шерсть), естественных отверстий (выделения вокруг них и др.), состояние кончиков ушей и конечностей. Указывают общее состояние (истощение, ожирение) животного, наличие язв, облысение и др.
После тщательного наружного осмотра пинцетом в левой руке захватывают и приподнимают кожу с подлежащей клетчаткой, снизу живота срезают лоскут шириной 0,5—1 см и делают срез ножницами снизу вверх до конца морды по средней линии. Кроме того, к середине паховых областей справа и слева делают по одному разрезу. В грудном отделе отпрепаровывают кожу с клетчаткой в направлении к подмышечным областям, а в шейном — в обе стороны от срединного разреза вдоль нижней челюсти.
Таким образом, обнажают брюшную полость и грудную клетку. Для вскрытия последней проводят разрезы (слева и справа) по бокам грудной клетки (от среднеподмышечной линии) косо кверху, перерезая ребра и мягкие ткани, середину ключицы и мышцы шеи, отбрасывают трацевидный лоскут с ребрами и мягкими тканями (рис. 27).
После вскрытия и осмотра этих полостей извлекают органы шеи, трахею, надгортанник, щитовидную железу, паратрахеальные, бифуркационные лимфатические узлы и из грудной клетки пищевод, легкие, сердце (мож-
148
Рис. 27. Расположение органов грудной полости:
1 — сердце; 2 — легкие.
но общим комплексом). Затем выделяют печень и селезенку, после этого — желудок, поджелудочную железу, кишечник; вслед за этим надпочечники, почки (в случае необходимости и мочевой пузырь), семенники с придатками (или матку с придатками). Затем следует вскрытие полости черепа и изъятие (взятие) головного мозга и гипофиза.
Для вскрытия полости черепа ножницами срезают кожно-мышечные покровы, обнажая костную ткань, затем щипцами «откусывают» шейные позвонки и затылочную кость, снимают ее. Подводя браншу кусачек (щипцов) под крышу черепа сбоку, откусывают теменновисочные кости с обеих сторон и снимают их. Открытый таким образом головной мозг приподнимают со стороны лобных долей кверху, перерезают зрительный тракт, поднимают мозг еще выше, подрезают с обеих сторон
149
твердую мозговую оболочку, покрывающую мозжечок, и вынимают головной мозг, перерезая спинной мозг в шейном отделе. В турецком седле остается под оболочками гипофиз. Разрезая оболочки, освобождают из ложа этот орган, взвешивают и опускают в банку с соответствующим фиксатором или передают на биохимическое исследование.
Костный мозг берут чаще из бедра грудины, позвонков и ребер, раздавливая мелкие кусочки кости и собирают костный мозг на кусочек марли, чтобы не потерять при фиксации и проводке материала, или из костного мозга делают на стекле мазки, отпечатки.
Извлеченные органы взвешивают, кладут на препаровальный столик, определяют и описывают размеры, форму, цвет, консистенцию, состояние поверхности. Затем производят разрезы органов, обычно на столике или на левой ладони руки, обернутой тряпкой для удержания скользящего органа.
Разрез ведут в направлении наиболее длинного размера органа. Например, печень кладут выпуклой частью кверху и проводят глубокий, «тянущий» разрез от одного края через середину до другого края (берут наибольшую долю). На поверхности разреза изучают рисунок ткани, степень кровенаполнения, сухость или влажность органа, цвет его и др. Затем проводят второй параллельно первому, разрез на расстоянии 0,5 см от него. Из этого кусочка печени берут материал для гистологического и гистохимического исследований.
Разрез почек проводят в поперечном направлении к воротам (т. е. к середине органа). Селезенку разрезают также поперек органа. Сердце чаще разрезают поперек двумя параллельными основанию и верхушке надрезами так, чтобы между ними было расстояние около 0,5 см.
Для разрезов полостных органов применяют не нож (скальпель), а ножницы. Из желудка после вскрытия его полости по большой кривизне вырезают полоску его ткани (параллельно первому разрезу), отступя от края на 0,5 см и захватывая кардиальный и пилорический отделы. Иногда эту вырезанную в виде полосы ткань (со стороны серозной оболочки) растягивают на фильтровальной бумаге и опускают в фиксирующую жидкость. Вырезанный кусочек желудка, кишки прополаскивают в воде, а затем кладут в фиксатор. Если необходимо
150
проследить изменения в желудке и кишечнике (двенадцатиперстной или тонкой кишке), то вырезанный длинный кусочек ткани того и другого органа растягивают на бумаге, смачивают в фиксаторе, а затем скатывают рыхло в рулон, завязывают ниткой и снова опускают в фиксатор. Можно иначе брать материал: из различных отделов кишечника поперечно отрезают куски толщиной по 0,5 см в виде «трубочек», прополаскивают в воде и опускают в фиксатор. Семенники разрезают поперек органа и кладут в фиксатор, а через день проводят второй разрез параллельно первому (этот орган очень своеобразно построен и может «рассыпаться» в фиксирующей жидкости, поэтому его необходимо «уплотнить» в фиксаторе, прежде чем вырезать для гистологической обработки). Яичники фиксируют полностью. От труб отрезают кусочки так же, как от кишок (поперечные «трубочки»). Матку берут полностью и разрезают параллельно дну. Поджелудочную и щитовидную железы, гипофиз, надпочечники фиксируют полностью.
Для исследования костного мозга непосредственно в канале или для изучения строения костной ткани чаще используется бедренная кость. Для этого вычленяют бедро из сустава, очищают кость от мягких тканей и после этого бедро опускают на сутки в фиксатор, а затем переносят в декальцинирующую жидкость.
После удаления внутренних органов тушку животного помещают в ведро с крышкой и затем уничтожают вместе с остатками органов, не взятых на исследование. Секционный стол, все его вспомогательные принадлежности, а также пол вокруг стола тщательно моют и дезинфицируют. Инструменты моют водой со щеткой и мылом и подвергают дезинфекции кипячением в воде с содой или погружением на 3—4 часа в раствор лизола. После этого инструменты насухо вытирают и убирают в предназначенное для них место или в шкаф. Полиэтиленовые фартуки, нарукавники моют мылом и щеткой и дезинфицируют. Перчатки вскрывающий моет на руках с мылом, вытирает насухо, присыпает тальком, а затем снимает, постепенно выворачивая (скатывая) их от лучезапястного сустава к пальцам. После инфицированных трупов руки в перчатках погружают на 2—3 минуты в дезинфицирующий раствор и лишь затем их моют.
15J
20.	АНАТОМИЧЕСКОЕ РАСПОЛОЖЕНИЕ
И ВЗАИМОСВЯЗЬ ВНУТРЕННИХ ОРГАНОВ ЖИВОТНЫХ
20.1.	Положение и внешний вид органов грудной полости
По удалении грудины осмотр начинают с плевральных полостей, определяют количество и качество содержимого (если оно есть), обращают внимание на степень расширения и спадения легких, на их внешний вид, наличие спаек (сращений) с грудной клеткой. В переднем средостении исследуют зобную железу, отмечают внешний вид больших сосудов, лежащих внутри полости перикарда, лимфатических узлов, расположенных у крыс по боковым поверхностям трахеи и на уровне ее бифуркации (раздвоения). Чтобы вскрыть сердечную сорочку, пинцетом захватывают перикард в середине передней его поверхности, приподнимают и ножницами прорезают отверстие, в которое вставляют браншу ножниц и разре-жимое полости и состояние перикарда. Обычно в полости перикарда. Из нижнего конца разреза делают еще два боковых: один книзу и вправо, а другой — книзу и влево до диафрагмы. Раскрыв сердечную сорочку, приподнимают сердце за верхушку и осматривают содержимое полости и состояние перикарда. Обычно в полости сердечной сумки находится капля или несколько капель прозрачной соломенно-желтого цвета жидкости. При продолжительной агонии животного количества ее может быть больше. Если обнаруживают мутное содержимое, то его подвергают цитологическому и бактериологическому исследованию (берут мазки и др.).
При осмотре легких обращают внимание на состояние плевры (цвет, степень кровенаполнения, блеск, тусклость, прозрачность, бугорки, узелки, опухоли). У крыс, как было сказано выше, левое легкое состоит из одной доли, правое —из нескольких (четыре и больше). Разрезы легких проводят, как правило, поперек, несколько косо снаружи в направлении ворот, слева на границе среднего и нижнего отдела, справа к середине нижней, верхней или средней доли. Поверхность разреза легкого контрольного животного гладкая, мягкая; цвет ткани розовый, в зависимости от степени кровенаполнения может быть несколько более темным. При наличии кровоизлияний ткань уплотнена, темно-красного цвета; при
152
эмфиземе, наоборот, бледно-розового цвета, слегка хрустящая. При отеке с поверхностей разрезов стекает пз-нистая жидкость. При воспалении ткань уплотнена, сероватого цвета, на разрезах шероховата (такой уплотненный кусочек тонет в воде).
20.2.	Положение и внешний вид органов брюшной полости
При осмотре брюшной полости обращают внимание на положение желудка и печени, выясняют отношение ее к диафрагме (нет ли сращения). Вскрытие желудка производят по большой кривизне, начиная от пищеводнокардиального отдела в направлении к двенадцатиперстной кишке. Затем осматривают печень. Увеличение печени наблюдается при нарушениях кровообращения, обмена веществ — белкового, жирового, гликогенного и др. Края печени могут быть или острыми (при уменьшении органа), или слишком круглыми (при увеличении органа). Цвет печени при белковом перерождении становится сероватым, при жировой инфильтрации — желтоватым, при истощении, в том числе старческом, буроватым; при застое желчи — зеленоватым. Консистенция может быть дряблой или плотной. Поверхность печени у контрольных животных должна быть гладкой, блестящей.
При остром воспалении брюшины она становится тусклой с наложениями на ней фибрина.
На разрезах органов брюшной полости обращают внимание на количество крови, которое является показателем кровенаполнения, особенно у павших животных. У декапитированных животных кровь почти полностью вытекает из перерезанных сосудов, особенно если животное долго держат после перерезки шейнего отдела вниз головой и оно длительное время находится в состоянии агонии. При застойных явлениях в органах увеличено кровенаполнение, при различных перерождениях — уменьшено. При венозном застое виден «мускатный» рисунок печени, при белковом, жировом и углеводном перерождении сосудистый рисунок слабо или совсем не выражен. Следует помнить, что у здоровых животных рисунок печени выражен также слабо, в связи с чем осмотр необходимо начинать именно с контрольных животных.
153
Рис. 28. Мочеполовая система самки (ох) и самца (£)
1 — почка; 2 — мочеточник; 3 — мочевой пузырь; 4 —- матка: 5 — яичники; б — семенник с придатком; 7 — половой член; 8 — предстательная железа; 9 — пузырьковая железа.
Селезенку осматривают неудаленной, так как возможно, ее сращение с желудком, диафрагмой и другими органами. Отмечается состояние капсулы (тонкая, гладкая, блестящая, мутная, отложения фибрина и др), консистенция органа, цвет с поверхности и на разрезе, количество крови, присутствие очагов уплотнения или размягчения, количество пульпы, выделяющейся при соскабливании скальпелем с поверхности разреза.
При осмотре кишечника отмечают его положение, цвет, состояние серозного покрова. Брыжейку рассматривают, растягивая ее на пальцах левой руки, при этом отчетливо видна дольчатая поджелудочная железа.
Над лобком виден мочевой пузырь (или сокращенный, маленький, или большой, если он растянут содержимым). В брюшной полости определяют содержимое, если оно имеется (как правило его не должно быть). Серозные покровы, брюшина должны быть влажными, блестящими, слегка розоватыми. Органы малого таза: матка с придатками (яичники, рога матки) и простатическая железа с придатками выстоят из полости малого таза, которую у животных можно отделять от брюшной
154
полости условно. Семенники находятся вне полости тела в кожно-мышечном мешке (мошонке) (рис. 28).
По удалении органов брюшной полости или отодвигании их в сторону хорошо видны по сторонам позвоночника ниже места прикрепления диафрагмы среди жировой ткани тесно прилежащие к аорте надпочечники, имеющие вид округлых, диаметром от 0,1 до 0,4 см желтоватых уплотнений. Ниже их расположены почки (чаще одна выше другой).
20.3.	Положение и внешний вид головного мозга
После удаления костей черепа изъятие головного мозга производят оттягиванием лобных долей несколько кзади и кверху. Затем перерезают оба зрительных нерва, сонные артерии, ножку придатка мозга. Слева и справа перерезают мозжечковый намет. Поддерживая головной мозг левой рукой, перерезают черепно-мозговые нервы, затем вводят конец скальпеля в позвоночный канал и перерезают спинной мозг, боковые артерии и нервы. Вынимают головной мозг вместе с мозжечком и продолговатым мозгом. После этого ножницами или кусачками отделяют костное ложе (углубление турецкого седла) вместе с гипофизом. Чтобы снять мозговую оболочку, ее захватывают пинцетом, находящимся в левой руке, подтягивают кверху и назад. Скальпелем, который держат в правой руке, делают круговой надрез, вскрывают твердую мозговую оболочку и извлекают гипофиз. Осмотр удаленного из полосы черепа головного мозга производят на столике (или на тарелке, на чашке Петри) в положении основанием кверху. Затем его переворачивают полушариями кверху и осматривают (рис. 29, 30). Потом мозг кладут затылочными долями к вскрывающему и в таком положении, раздвигая полушария, осматривают и затем кладут в фиксирующую жидкость.
Головной мозг кроликов подвергается вскрытию на месте, чтобы не произошло загнивания невскрытого мозга. Для этого производят фронтальные или поперечные (к длиннику больших полушарий) разрезы на уровне лобных, теменных, затылочной долей параллельно друг к другу. Можно делать продольный (сагиттальный) разрез по средней линии, делящий мозг на две разные половины. Боковые желудочки, лобные и затылочные доли (обоих полушарий) вскрывают продольными разреза-
155
Рис. 29. Головной мозг.
1 — полушарие большого мозга; 2 — обонятельная луковица; 3 — средняя продольная борозда; 4 — боковая продольная борозда; 5 — четверохолмие; 6 — червячок мозжечка; 7 — боковая часть мозжечка: 8 — спинной мозг.
Рис. 30. Основание головного мозга.
1 — обонятельная луковица;
2 — обонятельный тракт; 3 — зрительный перекрест: 4 — серый бугор с воронкой; 5 — гипофиз; 6 — боковая часть мозжечка; 7 — продолговатый мозг; 8 — спинной мозг.
ми. После этого разрезают по средней линии червячок мозжечка, вскрывая IV желудочек, затем от ножек мозжечка разрезы косо направляют через его полушария, обнажая ветвистый рисунок строения. Затем производят несколько фронтальных (поперечных) разрезов через четверохолмие с ножками головного мозга, продолговатый мозг с варолиевым мостом и начальную часть спинного мозга.
Вскрытие полости носа у крыс, мышей и кроликов можно производить после удаления твердого неба. Острую браншу ножниц вводят в левую (или правую) ноздрю и, несколько отступя от срединной линии, производят разрез костей: носовой, лобной, теменной и др.
Для извлечения и исследования глаза изогнутыми (изгиб средней величины) с притупленными концами
156
ножницами разрезают соединительнотканную оболочку, мышцы, глазной нерв и жировую клетчатку. После внешнего осмотра извлеченного наружу глазного яблока его разрезают ножницами по экватору на две половины и исследуют (рассечение производят над белой посудой, например над фарфоровым блюдцем). Иногда глазное яблоко опускают в консервирующую жидкость (3% раствор уксусной кислоты на 10% растворе формалина) и через несколько дней тонким ножом (лучше бритвой) разрезают по продольной оси или по экватору.
Вскрытие позвоночного канала, извлечение и исследование спинного мозга производят после предварительного освобождения позвоночного столба от конечностей, тазовых костей, с их мускулатурой и от ребер. Костными щипцами перекусывают дужки позвонков и осматривают положение и очертания спинномозгового шнура, состояние твердой мозговой оболочки (цвет, гладкость, напряженность и пр.). После осмотра перерезают корешки спинно-мозговых нервов, разрезают твердую мозговую оболочку и вынимают мозг в натянутом состоянии (в положении струны). Можно вынуть мозг вместе с твердой мозговой оболочкой, тогда спинной мозг вместе с оболочкой кладут на чистую тряпочку и вскрывают оболочку, начиная разрез (пуговчатыми ножницами) с шейного отдела. Пинцетом разводят края твердой мозговой оболочки и откидывают ее в сторону. Исследуют спинной мозг на всем его протяжении, отмечают уклонения в его конфигурации, толщине, цвете, плотности. Разрезы производят бритвой поперек спинного мозга (фронтально) на расстоянии 0,5 см.
Гистологическое исследование костного мозга проводится в мелких костях, где он и у взрослых особей остается кроветворным (красным), в то время как в трубчатых— становится жировым. При длительном истощении животных костный мозг трубчатых костей приобретает серый или светло-буроватый оттенок.
20.4.	Ведение протокола вскрытия
Состояние органов и тканей, изменения их, обнаруженные по ходу вскрытия и т. д., заносят в протокол вскрытия, составляемого примерно по следующему образцу.
157
1.	Вид вскрываемого лабораторного животного.
2.	Время воздействия исследуемым веществом на животное.
3.	Наименование и по возможности краткая физико-химическая характеристика воздействующего вещества.
4.	Время гибели или умерщвления животного.
5.	Протокол вскрытия, который распадается на две части: а) описательную и б) заключительную.
В первой части вскрывающий строго объективно воспроизводит картину исследуемых органов и частей трупа животного, а во второй — определяет суть (причину) обнаруженных изменений, объясняющих причину смерти. Краткое определение ее дает в существующих патологоанатомических терминах (названия процессов) врач, и от вскрывающего лаборанта этого не требуется.
Для примера приводим схему протокола вскрытия.
Протокол вскрытия №
от	числа (часы, день,
месяц, год) .... трупа (вид животного) . . . павшего . . . .умерщвленного . . . числа . . . месяца .... года. Анамнез (клинические наблюдения за поведением экспериментального животного, подвергавшегося воздействию исследуемого вещества) . .
А. Наружный осмотр
1.	Общая часть (общий осмотр)
1.	Пол, возраст, вес.
2.	Телосложение.
3.	Состояние упитанности.
4.	Трупные явления
2.	Специальная часть
5.	Кожные покровы и подкожная клетчатка.
6.	Голова: ушные раковины, глаза с конъюнктивами, отверстия носа, рта, зубы, язык.
7.	Шея, грудь, живот, подмышечные и паховые области, естественные отверстия (задний проход, половая щель), мошонка (состояние яичек). Спина, лапы.
8.	Большие полости тела. Общие данные о положении и состоянии органов и серозных покровов: 1) грудная полость: состояние средостения, объем легких, скопления жидкости, спайки в полостях плевры и перикарда и др.;
158
2) брюшная полость: смещения, скопления жидкости, спайки и т. д. Высота стояния диафрагмы; 3) органы кровообращения: сердце, сосуды; 4) органы дыхания: полость носа, гортань, трахея, бронхи, легкие, плевра; 5) органы пищеварения: рот, глотка, пищевод, желудок, кишечник, слюнные железы, печень, поджелудочная железа; 6) мочевые органы: почки, мочеточники, мочевой пузырь, мочеиспускательный канал; 7) половые органы; а) животных мужского пола — половой член, придаточные половые железы, семяпровод, яички; б) женского пола — влагалище, матка, яйцеводы, яичники, молочная железа; 8) костный мозг; 9) селезенка; 10) лимфатические узлы и лимфатические сосуды; 11) железы внутренней секреции: придаток мозга, шишковидная железа, щитовидная, паращитовидная, зобная железа, надпочечники; 12) мышечная система; 13) костная система и суставы; 14) нервная система: головной и спинной мозг с их оболочками, периферические нервы, вегетативная система; 15) органы чувств: зрение и слух.
При ведении записи по системам организма вскрывающий несколько раз вынужден возвращаться к внесению данных в ту или иную графу, под заголовком которой значится эта система: так, эндокринные железы исследуют неодновременно, так же обстоит дело и с пищеварительным трактом и рядом других систем. Кроме того, порядок вскрытия может меняться в зависимости от особенностей каждого случая. Поэтому целесообразно приготовить несколько листков с заголовками различных систем, куда вносят при осмотре отдельных частей трупа все то, что относится к той или иной системе.
21.	ПОДГОТОВКА МАТЕРИАЛА
К ГИСТОЛОГИЧЕСКОЙ ОБРАБОТКЕ
21.1.	Фиксация
Фиксация является первым этапом в обработке кусочков, вырезанных из различных органов и тканей для микроскопического исследования. Она имеет целью закрепить тканевые структуры в том состоянии, в котором они находятся в момент погружения в фиксирующую жидкость, и предохранить от дальнейшего разрушения. Фиксирующая жидкость считается тем лучше, чем меньшую деформацию будут претерпевать тканевые струк-
159
туры при фиксации и чем быстрее и глубже будет действие на ткань. Фиксация обычно, за редким исключением сопровождается уплотнением тканей.
Все фиксирующие средства делятся на простые и сложные в зависимости от числа веществ, входящих в их состав. К простым фиксирующим веществам относится формалин, этиловый спирт и ацетон; к сложным Ценкер-формол, жидкости Орта и Карнуа, смесь спирта с формалином. При работе с фиксирующими жидкостями необходимо соблюдать правила работы.
1.	Материал, взятый из трупа или иссеченный на операции, подлежит немедленному помещению в заранее подготовленную фиксирующую жидкость.
2.	Перед погружением в фиксирующею среду недопустимо обмывать кусочки водой (особенно при фиксации нервной ткани) за исключением желудка и кишечника.
3.	Объем фиксирующей жидкости должен в 5—10 раз превышать объем фиксируемых кусочков.
4.	Толщина каждого фиксируемого кусочка не должна превышать 0,5—1 см.
5.	При наличии большого числа кусочков на дно банки с фиксирующей жидкостью следует положить кусок марли или ваты во избежание прилипания отдельных кусочков друг к другу и к стенкам банки.
6.	Кусочки тонкостенных органов (кишечник, желчный пузырь и др.) перед фиксацией растягивают на сухой фильтровальной бумаге или картоне.
7.	Фиксацию обычно производят при комнатной температуре, но значительно быстрее она проходит в термостате при температуре 37—40°, что особенно желательно для тех фиксаторов, которые медленно проникают в глубину тканей (например, двухромовокислый калий).
21.2	Простые фиксирующие средства
Формалин. Наиболее распространенная и универсальная фиксирующая жидкость с характерным резким запахом. Готовят формалин из продажного 35—50% водного раствора формальдегида.
Для фиксации препаратов обычно употребляют 10—15—20% раствор формальдегида, который и называется формалином. Он хорошо проникает в ткани и 160
поэтому может применяться для фиксации довольно крупных объектов. Кусочки органов толщиной 0,5—1 см фиксируют в 10—20% растворе формалина в течение 24—48 часов. Объекты после фиксации либо режут на замораживающем микротоме, либо подвергают дальнейшей обработке для заливки в обволакивающую среду: целлоидин или парафин. Большое преимущество формалина — возможность хранения в нем объектов в течение долгого времени и после фиксации.
Этиловый спирт. Применяется как абсолютный, так и 96° спирт. Спирт обладает меньшей проникающей способностью, чем формалин, поэтому кусочки для фиксации берут не толще 0,3—0,5 см. Продолжительность фиксации от нескольких часов до суток, что зависит от плотности фиксируемых тканей и крепости спирта. Положительной стороной фиксации в спирте является то, что, помимо, фиксации, он приводит одновременно и к обезвоживанию, чем значительно сокращается вся процедура заливки кусочков в.целлоидин или парафин. Но спирт для гистологических исследований применяется редко (только для плотных тканей), так как ткани рыхлые, отечные или слизистоперерожденные в нем сильно сморщиваются.
Ацетон. Жидкость с характерным запахом. Смешивается с водой, хлороформом и ксилолом. Пользуются ацетоном в тех случаях, когда необходимо срочное исследование (ацетон — быстрофиксирующее средство), а замораживающий микротом не может быть применен. Но ацетон сильно сморщивает ткани, что затрудняет микроскопическое исследование. Фиксируют кусочки толщиной 0,2—0,3 см в течение 2—3 часов. Используется только бесцветный и безводный ацетон.
21.3.	Сложные фиксирующие жидкости
Ценкер-формол. Представляет собой 5% раствор сулемы на мюллеровской жидкости в смеси с формалином (добавляют 5 или 10 мл формалина из расчета на каждые 95 мл раствора).
Мюллеровская жидкость состоит из: двухромовокислого калия 2,5 г, сернокислого натрия 1 г, дистиллированной воды 100 мл. Продолжительность фиксации 8— 12—24 часа, после чего объекты промывают в проточной воде в течение 24—28 часов, обезвоживают в спир
161
тах и заливают в любую среду. Ценкер-формол является хорошим фиксатором, но употребляется, как правило, только для цитологических исследований. Сроки фиксации должны четко соблюдаться, так как передержка делает кусочки хрупкими и ведет к выпадению сулемовых осадков.
Жидкость Орта (мюллер-формол). Представляет собой 10% раствор формалина на мюллеровской смеси. Фиксация в течение 24—48 часов с дальнейшей промывкой проточной водой в течение 24—48 часов. После промывки кусочки тканей проводят через батарею спиртов и заливают в целлоидин или парафин.
Жидкость Карнуа. Состав жидкости Карнуа: спирта абсолютного 60 мл, хлороформа 30 мл, уксусной ледяной кислоты 10 мл. Кусочки толщиной 0,2—0,4 см фиксируют в ней от 2 до 3—4 часов. После фиксации переносят в чистый спирт (96° или абсолютный), а затем заливают.
Смесь спирта с формалином. Употребляется 5—10% раствор формалина на спирте различной крепости (абсолютный, 96°, 70°). Время фиксации 24—48 часов.
Ценкер-формол и жидкость Орта имеют один и тот же недостаток — не допускают передержки и требуют тщательной промывки в проточной воде в течение длительного времени (передержка ведет к выпадению сулемовых осадков и делает объект хрупким).
Иногда, например при срочных биопсиях, приходится прибегать к очень быстрой фиксации. Применяют при этом кипячение кусочков в 10—20% растворе формалина в течение ’/г—1 минуты, причем кусочки берут не толще 0,2—0,3 см. Срезы готовят на замораживающем микротоме.
После фиксации дальнейшую обработку объектов можно производить двояко: либо сразу подвергать резке на замораживающем микротоме (если данная фиксирующая жидкость это допускает), либо объекты следует обезвоживать в спиртах и заливать в плотную среду (целлоидин или парафин).
При работе с некоторыми объектами (кость или патологически обезвествленная ткань) существуют свои особенности.
Кости и патологически обезвествленные ткани фиксируют по общим правилам, но, поскольку такие ткани нельзя сразу резать на замораживающем микро
'.62
томе или залить в обволакивающую среду, предварительно их подвергают специальной обработке — декальцинации.
21.4.	Декальцинация
Декальцинация — это процесс извлечения извести из тканей, производится она всегда после фиксации. При проведении декальцинации необходимо соблюдать следующие правила.
1.	Подвергать декальцинации следует по возможности небольшие и тонкие куски костной ткани, аккуратно выпиленные из фиксированных объектов.
2.	Объем жидкости, в которой производится процесс декальцинации, должен быть в 25—50 раз больше объема объектов.
3.	Жидкость необходимо менять каждые 24—48 часов, так как декальцинация идет скорее при частой смене жидкости. Процесс считается законченным, когда препаровальная игла легко и свободно проходит сквозь ткань.
4.	Во избежание набухания тканей и для частичной нейтрализации кусочки костей после полной декальцинации переносят в 5% раствор алюмокалиевых квасцов на 12—24 часа. После этого производят тщательную промывку их в проточной воде в течение 24—48 часов.
Для извлечения солей из тканей используют как минеральные (азотная, соляная), так и органические кислоты (муравьиная, трихлоруксусная и др.).
При декальцинации азотной кислотой (HNO3) используют ее 3—5% или 10% раствор в зависимости от плотности объекта. Соляная кислота (НС1) в чистом виде не употребляется и ее используют в жидкости Эбнера: 12—15% водный раствор НС1 — 200 мл, крепкая НС1 (с удельным весом 1,19)-— 4 мл.
Муравьиная кислота употребляется: 1) в чистом виде (безводная кислота); 2) в смеси с 70—96° спиртом (пополам); 3) в смеси с 10—15% раствором формалина (пополам).
Во избежание набухания тканей после декальцинации муравьиной кислотой кусочки промывают в 70—96° спирте или 10—15% растворе формалина в течение нескольких дней.
163
21.5.	Методы заливки объектов и приготовление гистологических срезов
21.5.1.	Обезвоживание
Перед заливкой в целлоидин или парафин необходимо провести обезвоживание либо сразу после фиксации, либо после 24—48-часового промывания в проточной воде. Обезвоживание имеет целью подготовить ткани к пропитыванию целлоидином или парафином.
В основном обезвоживание производится в спирте. Вся процедура состоит в проведении материала через ряд восходящих по крепости спиртов (от 50—60° до абсолютного).
Если необходимо быстрое обезвоживание, достаточно ограничиться двумя спиртами: 96° и абсолютным, причем при перекладывании кусочков из 96° в абсолютный их осторожно подсушивают между двумя листками фильтровальной бумаги.
Перед пропитыванием парафином обезвоживание спиртом носит предварительный характер к дополнительной обработке хлороформом или ксилолом.
21.5.2.	Пропитывание
и заключение гистологических срезов
Для приготовления срезов из фиксированных тканей необходимо их более значительное уплотнение, что достигается пропитыванием этих тканей плотными массами: парафином, целлоидином, желатиной или замораживанием, например, углекислотой.
Уплотненный одним из способов кусочек ткани режут микротомным ножом на соответствующем цилиндрическом или санном, так называемом парафиновом, целлоидиновом, замораживающем микротоме.
Срезы ткани, полученные с помощью микротомного ножа, подлежат окрашиванию и «заключению», т. е. нанесению на срез консервирующего вещества типа канадского бальзама и покрытия среза покровным стеклом для последующего микроскопического исследования. (Подробные сведения о процессе приготовления гистологических срезов приведены в соответствующей специальной литературе.)
164
Микроскопическое исследование дополняет вскрытие и дает возможность правильно судить о причине заболевания или гибели экспериментального животного. Простые ориентировочные гистологические исследования могут быть осуществлены в короткий срок при небольшой аппаратуре (микроскоп с различными системами) и ограниченном количестве реактивов. Обстоятельное гистологическое исследование с применением специальных методик требует хорошо оборудованной лаборатории.
Материал можно пересылать в специальные учреждения, фиксируя (консервируя) органы, кусочки ткани в 10% растворе формалина, окружая их ватой, смоченной в том же формалине, и помещая в стеклянную банку или иную емкость (полиэтиленовые мешочки, резиновые перчатки и др.). Пересылают гистологический материал в деревянных ящиках, тщательно обернув емкости с органами пергаментной бумагой.
* * *
В заключение следует отметить, что в данной книге приведено краткое описание приемов и методов работы, которые необходимы для лаборанта-токсиколога. Не считая приведенные материалы исчерпывающими, авторы надеются, что книга поможет начинающим лаборантам-токсикологам в их работе.
Содержание
Введение (О. Н. Елизарова). .	3
1.	Требования, предъявляемые	к лаборанту-токсикологу. .	4
1.1.	Обязанности лаборанта.....................................4
1.2.	Возможность ошибок и	как их	избежать	...	6
2.	Меры безопасности в лабораторной	работе	...	6
3.	Рабочее место лаборанта......................................<10
Часть 1. Санитарно-токсикологические исследования (О. Н. Елизарова)	14
4.	Уход и обращение с лабораторными животными .	.	14
4.1.	Виды лабораторных животных........................14
4.2	Содержание животных н уход за ними ...	15
4.3.	Как брать животных................................18
4.4.	Маркировка животных..............................,23
5.	Пути проникновения ядовитых веществ в организм .	.	25
5.1.	Ингаляционный путь введения токсических веществ .	26
5.1.1.	Общие принципы устройства камер ....	27
5.1.2.	Статический метод ингаляционного введения .	.	28
5.1.3.	Динамический метод	ингаляционного воздействия .	31
5.2.	Введение химических веществ в желудочно-кишечный тракт	 37
5.2.1.	Введение в ротовую	полость......................37
5.2.2.	Введение в желудок	 40
5.2.3.	Введение химических веществ вместе с питьевой водой или пищей.....................................43
5.3.	Нанесение химических соединений	на	кожу .	.	44
5.4.	Нанесение химических соединений	на	слизистые оболочки глаза	 47
5.5.	Подкожное введение	 48
5.6.	Внутримышечное введение	...............48
5.7.	Внутрибрюшинное введение	..................49
5.8.	Внутривенное введение ............................49
6.	Определение токсичности химических соединений в опытах на животных	.............................50
6.1.	Наблюдение	за внешним видом животного.	.	.	52
6.2.	Наблюдение	за изменением веса животных.	.	.	54
6.3.	Наблюдение	за частотой и ритмом дыхания.	.	.	55
6.4.	Наблюдение за частотой сердцебиения	...	56
6.5.	Измерение температуры тела животных ...	57
166
7.	Методики, применяемые для выявления действия ядовитых веществ на животных....................................58
7.1.	Взятие крови и приемы клинического анализа крови 5.8
7.1.1.	Техника взятия крови для анализа ....	60
7.1.2.	Определение количества гемоглобина ....	62
7.1.3.	Определение количества эритроцитов и лейкоцитов .	63
7.2.	Работа с микроскопом...............................67
7.3.	Определение суммационной способности центральной нервной системы	 69
7.4.	Определение потребления	кислорода ....	71
7.5.	Определение мышечной работоспособности .	.	73
7.5.1.	Проба с плаванием (по М. Л. Рыловой) ...	73
7.5.2.	Проба с подвисанием..............................74
7.5.3.	Проба с поднятием грузиков (по С. В. Сперанскому)	 75
7.6.	Функциональные нагрузки...........................75
7.6.1.	Изменение режима питания	...............75
7.6.2.	Холодовая проба ..................................77
7.6.3.	Гексаноловая проба	 77
7.6.4.	Спиртовая проба ..................................77
7.7.	Проведение опытов на размножение ....	78
7.8.	Определение веса внутренних	органов животных	и
весовых коэффициентов	 80
8.	Проведение токсикологического	опыта.....................81
Часть 2. Лабораторная техника химии и биохимии (Л. В. Жидкова)	84
9. Лабораторные материалы			84
9.1. Стекло и обращение с ним		84
9.2. Пробки			85
9.3 Работа с резиновыми трубками и шлангами -	87
9.4. Смазки			87
10. Лабораторная посуда			87
10.1. Стеклянная посуда			88
10.2. Фарфоровая и кварцевая посуда ....	92
10.3. Мытье и сушка химической посуды ....	93
11. Весы и приемы взвешивания			95
lil.l. Виды весов			96
11.2. Приемы взвешивания			97
12. Реактивы, обращение с ними и очистка ....	99
12.1. Хранение реактивов		99
12.2. Обращение с реактивами		100
12.3. Очистка реактивов		102
12.4. Фильтрование			102
12.4.1. Обычное фильтрование при комнатной температуре.	103
12.4.2. Фильтрование с отсасыванием	....	105
12.4.3. Горячее фильтрование			105
12.4.4. Фильтрование через слой адсорбента	106
12.5. Перекристаллизация			106
12.6. Перегонка			107
12.7. Центрифугирование			109
13. Общие приемы биохимического анализа ....	110
13.1. Единицы измерения		110
13.2. Приготовление растворов			ПО
167
13.2.11 Техника приготовления точных реактивов из фик- саиалов . . '......................................115
Техника титрования	.	.	.	.	.	.	.116
14.1	. Расчеты результатов титрования ....	117
14.2	. Индикаторы	..........................118
15.	Определение концентрации	водородных ионов .	.	.119
16.	Буферные растворы	..........................120
17.	Подготовка биологического материала к биохимическому анализу	 121
17.1.	Биохимический анализ крови...................121
17.1.1.	Получение плазмы...........................122
17.1.2.	Получение сыворотки........................123
17.1.3.	Осаждение белков...........................124
47.2. Биохимический анализ мочи....................124
17.2.1	. Сбор мочи у лабораторных животных .	.	.	125
17.2.2	Определение pH мочи.........................127
17.2.3	. Определение удельного веса	мочи	.	.	.	.127
17.2.4	. Удаление белков из мочи...................128
17.3	. Биохимический анализ в ткани органов	....	128
17.4	. Количественный анализ биохимических	показателей	.	129
Часть 3. Техника патологоанатомического вскрытия и обработка материала (Т. А. Кочеткова) .	.	132
18.	Краткие сведения об анатомо-физиологических особенностях взрослых лабораторных животных ....	132
18.1.	Строение лабораторных животных (скелет) .	.	132
18.2.	Кожный покров и его производные	....	134
18.3.	Мышечная система.......................136
18.4.	Нервная система........................136
18.5.	Сердечно-сосудистая система............138
18.6.	Органы дыхания.........................140
18.7.	Органы пищеварения.....................141
18.8.	Пищеварительные железы	......	142
18.9.	Органы кроветворения...................142
18.10.	Органы выделения..................................142
18.41.	Органы размножения (половые органы) .	.	.	143
18.12.	Железы внутренней секреции (эндокринные железы)	143
19.	Общие принципы патологоанатомического вскрытия .	.	144
19.1.	Методы умерщвления лабораторных животных .	.	144
19.2.	Подготовка и вскрытие животных ....	145
20.	Анатомическое расположение и взаимосвязь внутренних органов животных...........................................152
20.1.	Положение	и	внешний вид органов грудной полости	.	152
20.2.	Положение	и	внешний вид органов брюшной полости	153
20.3.	Положение	и	внешний вид головного мозга .	.	155
20.4.	Ведение протокола вскрытия.........................157
21.	Подготовка материала к гистологической обработке .	.	159
21.1.	Фиксация ..........................................159
21.2.	Простые фиксирующие	средства.....................160
21.3.	Сложные фиксирующие	жидкости.....................161
21.4.	Декальцинация......................................163
21.5.	Методы заливки объектов и приготовление гистологических срезов..........................................164
21.5.1.	Обезвоживание	 164
21.5.2.	Пропитывание и заключение	гистологических срезов	164
168