Text
ПЕРЕЖИВАЮЩИЙ
СРЕЗ МОЗГА
академия НАУК СССР
ОТДЕЛЕНИЕ ФИЗИОЛОГИИ
МЕТОДЫ ФИЗИОЛОГИЧЕСКИХ ИССЛЕДОВАНИЙ
ПЕРЕЖИВАЮЩИЙ
СРЕЗ МОЗГА
КАК ОБЪЕКТ
НЕЙРОФИЗИОЛОГИЧЕСКОГО
И НЕЙРОХИМИЧЕСКОГО
ИССЛЕДОВАНИЯ
Ответственный редактор
М. И. МИТЮШОВ
ш
w
ЛЕНИНГРАД
ИЗДАТЕЛЬСТВО «НАУКА»
ЛЕНИНГРАДСКОЕ ОТДЕЛЕНИЕ
1986
УДК 612.8.23.965
Переживающий срез мозга как объект нейрофизиологического и нейрохимического
исследования / М. И. Митюшов, Н. А. Емельянов, А. А. Мокрушин, И. А. Войнер,
Т. Р. Багаева; Под ред. М. И. Митюшова. — Л..- Наука, 1986. — 127 с. — (Методы
физиологических исследований).
За последние десятилетия переживающий срез мозга стал весьма популярным л
объектом исследований в области нейрофизиологии и нейрохимии. Для нейрофи-
зиолога переживающий срез интересен как объект, в котором сохраняются интакт-
ные нейроны млекопитающих и полииейрональные комплексы, причем возможно
прецизионное электрофизиологическое исследование под контролем оптики любых
участков клетки или многоклеточной системы. Биохимику переживающий срез
дает возможность исследовать количественную динамику обмена интересующего |
вещества с высокой степенью точности. Авторы рассмотрели основные существую- «
щие на сегодняшний день приемы работы со срезами мозга и оценили их нач
основании собственного опыта. Библиогр. 340. Ил. 42. Табл. 27.
РЕДАКЦИОННАЯ КОЛЛЕГИЯ СЕРИЙ
«РУКОВОДСТВО ПО ФИЗИОЛОГИИ»
И «МЕТОДЫ ФИЗИОЛОГИЧЕСКИХ ИССЛЕДОВАНИЙ»:
И. Г. КОСТЮК (отв. редактор), Н. П. БЕХТЕРЕВА (зам. отв. редактора),
Т. М. ТУРПАЕВ (зам. отв. редактора), К. А. ЛАНГЕ (отв. секретарь), В. М. ХРУ-
ЩОБА (отв. секретарь), А. С. БАТУЕВ, А. Л. БЫЗОВ, О. Г. ГАЗЕНКО, В. А. ГО-
ВЫРИН, В. И. МЕДВЕДЕВ, Ю. В. НАТОЧИН, В. Л. СВИДЕРСКИЙ, И. В. СИ-
МОНОВ, Б. И. ТКАЧЕНКО, А. М. УГОЛЕВ. '
Рецензенты:
В. Н. МАЙОРОВ, М. Н. МАСЛОВА
2007020000-551
042(02)-86
281-86 — I
© Издательство «Наука», 1986 г.
П
ОГЛАВЛЕНИЕ
Стр.
Введение .............................................................. 3
Глава 1. Основы техники приготовления и инкубации (суперфузии)
тангенциальных переживающих срезов..................................... 5
Глава 2. Устройства и приемы для проведения нейрофизиологических
исследований на срезах мозга.......................................... 21
2.1. Общая характеристика установки для обеспечения длитель-
ного переживания срезов...................................... 21
2.2. Перфузионная камера и связанные с ней элементы установки 22
2.3. Области мозга, пригодные для приготовления переживающих
срезов....................................................... 28
2.4. Способы и устройства для приготовления ориентированных
переживающих срезов мозга.................................... 32
2.5. Среда, температура и время преинкубации................. 35
2.6. Контроль жизнеспособности срезов и формы электрической
активности, регистрируемой в них............................. 37
Глава 3. Основные направления использования срезов мозга для нейро-
физиологических исследований.......................................... 39
3.1. Электрофизиологические исследования..................... 39
3.1.1. Общая характеристика функционирования нейронов в пе-
реживающих срезах мозга ................................. 39
3.1.2. Дендритные потенциалы................................ 41
3.1.3. Тормозные постсинаптйческие потенциалы............... 44
3.1.4. Миниатюрные постсинаптические потенциалы............. 45
3.2. Фармакологические исследования.......................... 46
3.2.1. Метод введения фармакологического вещества в перфу-
зионный раствор............................................ 47
3.2.2. Подведение веществ методом микроэлектрофореза ... 50
3.2.3. Аппликация веществ нз микропипетки под давлением 53
3.3. Моделирование феноменов, являющихся нейрофизиологиче-
ской основой поведения ...................................... 54
3.4. Моделирование патологических процессов.................. 57
3.5. Заключение.............................................. 59
Глава 4. Применение срезов для изучения обмена органических соеди-
нений ................................................................ 61
4.1. Дыхание и гликолиз. Окисление меченых субстратов . ... 61
4.1.1. Дыхание..............................................,61
4.1.2. Гликолиз............................................. 66
4.1.3. Окисление меченых субстратов......................... 69
4.2. Изучение обмена аминокислот, медиаторов, белков, фосфо-
липидов ..................................................... 71
4.2.1. Общая схема эксперимента и характеристика каждого
этапа ..................................................... 71
4.2.2. Обмен аминокислот.................................. 75
4.2.3. Обмен медиаторов................................... 82
4.2.4. Обмен белков....................................... 91
4.2.5. Обмен фосфолипидов................................. 94
Глава 5. Компартментальный анализ обмена натрия в срезах мозга 100
Заключение........................................................... 112
Литература........................................................... 113
3
И
ВВЕДЕНИЕ
Около 60 лет назад Отто Варбург при исследовании дыхания
различных тканей, в том числе и ткани мозга, впервые применил
технику инкубации переживающих срезов толщиной около 0.5 мм ,
in vitro. Однако прошло немало времени до тех пор, пока этот
объект не получил широкого применения. В 50-х гг. Мак-Ильвейн
вновь обратился к этому объекту и показал, что он очень удобен
не только для биохимических, но и для нейрофизиологических
исследований. В дальнейшем переживающие срезы мозга стали
широко распространенным объектом исследования. '
В СССР следует отметить работы А. Г. Брагина, Н. А. Есаяна,
Л. Д. Лукьяновой, В. Г. Скребицкого и их сотрудников. Количество
исследований, выполненных на срезах мозга, лавинообразно нара-
стает. Это не случайно. В иерархической шкале объектов различной
степени сложности переживающий срез занимает особое место. '
Это система, в которой сохранены интактные клеточные элементы
и контролируются все «входы» и «выходы».
На срезах мозга можно изучать не только статику, но и дина- «
мику обмена веществ с высокой точностью, вплоть до измерения i
параметров кинетики. Полный контроль над составом среды инку-
бации делает этот объект весьма удобным для нейрофармакологи-
ческих исследований. i
Вместе с тем значительное количество исследований приводит J
к неоправданному многообразию методических приемов, не всегда |
оптимальных. Авторы сделали попытку систематизировать лучшие ’
из опубликованных приемов нейробиологических исследований,
проводимых на срезах мозга. Авторы будут благодарны за дополне-
ния и замечания.
4
ГЛАВА 1
ОСНОВЫ ТЕХНИКИ ПРИГОТОВЛЕНИЯ
И ИНКУБАЦИИ (СУПЕРФУЗИИ)
ТАНГЕНЦИАЛЬНЫХ ПЕРЕЖИВАЮЩИХ СРЕЗОВ
Срезы in vitro лишены нормального капиллярного кровотока.
Их обмен веществ осуществляется с помощью диффузии кисло-
рода, субстратов и метаболитов между инкубационной средой и
всей толщей среза, поэтому толщина среза должна быть такой,
чтобы обеспечить диффузию веществ на всю глубину. По мнению
большинства авторов, лимитирующим моментом является до-
ставка кислорода в толщу среза. Основоположник применения
срезов в биохимических исследованиях Отто Варбург (цит. по:
Elliott, 1969) разработал эмпирическую формулу, по которой
рассчитывается толщина среза в зависимости от интенсивности
окислительного обмена:
'-aFF
где d — толщина среза, см; с — давление кислорода, атм; D —
коэффициент диффузии кислорода в ткани, см2 • мин”' • атм1;
А — скорость поглощения кислорода тканью, мл • мин 1 • г”1. Без
существенной погрешности удельный весь ткани принимается
равным 1.
Например, для срезов неокортекса крыс поглощение кислорода
составляет в среднем 4.2 мл • г-1 • ч-1 (Емельянов, Гарина. 1970),
т. е. 0.07 мл • мин”1 • г-1; коэффициент диффузии кислорода
в ткани мозга составляет 2.3 • 10”5 см2 • мин”-1 • атм1 (Thews,
1960). Отсюда нетрудно подсчитать, что предельно допустимая
толщина среза коры мозга крыс при инкубации в атмосфере
чистого кислорода составляет 0.052 см, или 0.52 мм, а при инкуба-
ции в воздухе — 0.22 мм. Для тканей, обладающих менее интен-
сивным дыханием, допустимая толщина среза будет соответ-
ственно большей. Ввиду того, что толщина среза весьма сильно
сказывается на объеме центрального участка ткани, который на-
1 Лукьянова с соавторами (1982), а также Биигман и Кольде (Bingman,
Kolde, 1982) считают, что формула Варбурга неточна, так как О2 не диффундирует,
а транспортируется в ткань однако ее замены пока нет.
5
ходится в условиях недостаточного аэробиоза, желательна макси-
мальная воспроизводимость толщины среза. На устройствах,
обеспечивающих ее, мы остановимся ниже.
Второе условие успешной работы со срезами — минимальная
травмированность ткани. Обеспечение его начинается с декапи-
тации животного. Применение анестетиков нежелательно вслед-
ствие их влияния на нервную ткань. Оглушение животного приво-
дит к травматизации мозга. Мак-Ильвейн (McIlwain, 1963) реко-
мендует проводить декапитацию со стороны горла с помощью
опасной бритвы — это практически неудобно. Хорошо использо-
вать гильотину, но она мало пригодна при серийном отборе ма-
териала. Для мелких грызунов наиболее практична декапитация
с помощью больших ножниц; движение должно быть резким и
быстрым — при промедлении происходит сдавление подкожных
вен и артериальные кровоизлияния, которые травмируют ткань
мозга. Важнейшим условием минимальной травмы при непосред-
ственном приготовлении среза является употребление специаль-
ного технического устройства.
Третье условие, которое требует внимания, — это максимальная
скорость приготовления среза. Мак-Ильвейн с сотрудниками (см.
обзор: McIlwain, 1963) специально исследовали влияние интер-
вала между декапитацией и началом инкубации срезов на содер-
жание макроэргических фосфатов и поддержание трансмембран-
ного распределения ионов. Оказалось, что с ростом препаровоч- '•
ного интервала метаболическое состояние тканн ухудшается. Для
воспроизводимости результатов исследований необходимо вы-
брать средний препаровочный интервал и выдерживать его
с помощью секундомера с точностью до 15 с. В случае, когда срез
случайно приготовлен быстрее, его нужно подержать на крючке до
контрольной отметки времени. В наших опытах интервал от
декапитации до начала инкубации среза составлял всегда 4±
±0.25 мин. Л. Д. Лукьянова с соавторами (Лукьянова и др.,
1982) также говорит о необходимости того, чтобы этот интервал
не превышал 5 мин. В работе Такагаки с соавторами (Takagaki ;
et al., 1959) этот интервал достигал 20 мин — вероятно, вследствие s
этого скорость потребления О2 срезами у этих авторов была I
весьма низкой.
Если период приготовления среза оказывается продолжитель-
нее намеченного, такой препарат следует отбросить и не использо- 1
вать в экспериментах.
Для приготовления тангенциальных срезов стандартной
толщины и с минимальной травмой существуют несложные устрой-
ства. Так, Клейнцеллер и соавторы использовали лезвие безопас-
ной бритвы с держателем и направляющим предметным стеклом
под контролем глаза (Manometrische Methoden. . ., 1965). Стэди и
Риггс (Stadie, Riggs, 1944) сконструировали простой микротом
для воспроизводимого приготовления срезов толщиной 0.3—0.7 мм,
который хотя и получил широкое распространение (см. обзор:
Elliott, 1969), однако не лишен недостатков. Мы присоединяемся
6
Рис. 1. Направляющее стекло Мак-Ильвейна для приготовления срезов мозга
заданной толщины (по: McIlwain, Rodnight, 1962).
/ — предметное стекло; 2 — наклеенные полоски из покровных стекол, т — толщина
полосок, равная 0.28—0.30 мм.
Рис. 2. Характеристика деформирующего влияния на ткань мозга при использова-
нии различных типов режущих элементов в процессе приготовления препаративных
срезов.
А — нож Мак-Ильвейна или Стэдн-Риггса, Б — лезвие безопасной бритвы; В — использо-
ванная нами узкая полоска лезвня безопасной бритвы. / — предметное стекло; 2 — направ-
ляющие «полозья», регулирующие толщину среза; 3 — ткань мозга; 4 — режущий элемент”
Стрелками показаны направление и степень деформации ткани.
Рис. 3. Приготовление режущей полоски
лезвия бритвы.
1 — стяжной болт; 2— тиски; 3— лезвие.
Стрелкой показано направление резкого,
равномерного движения при отламывании
полоски.
к его критикам и считаем, что он удлиняет и усложняет процедуру
приготовления срезов.
В 60-х гг. Мак-Ильвейн и Роднайт (McIlwain, Rodnight, 1962)
предложил и простое устройство, выполненное из предметного
стекла с «полозьями», для приготовления срезов стандартной
толщины. Оно опробовано нами, и мы рекомендуем его к широкому
применению. Для изготовления направляющих «полозьев» исполь-
зуются покровные стекла размером 50x50 мм и толщиной 0.10—
0.15 мм. Тщательно отмытое водой и эфиром стекло с двух сторон
заливают расправленным очищенным парафином, так чтобы
стекло было покрыто его тонким слоем равномерно и без пузырей.
Через каждые 5 мм острым скальпелем по линейке наносят
насечку, так что парафиновый слой оказывается «разлинован-
ным». В вытяжном шкафу на «разлинованную» поверхность накла-
дывают тонкий слой ваты и на него наливают крепкую (не менее
40 %) фтористоводородную (плавиковую) кислоту. Через 2—3 ч
пинцетом удаляют вату с кислотой (бросать в большой сосуд
с водой!), нейтрализуют остатки кислоты 5 %-ным раствором г,
соды и смывают парафин бензином, петролейным или простым |
эфиром. При некотором навыке покровное стекло легко распа- 5
дается на полоски шириной 5 мм. На хорошо отмытое и высушен-
ное предметное стекло с помощью канадского бальзама наклеи-
вают по 1 полоске с каждого бока в соответствии с рис. 1, сушат
при комнатной температуре сутки, а затем наклеивают второй
слой полосок. Две полоски по 0.12 мм и 2 слоя канадского баль- I
зама обеспечивают выступание «полозьев» над плоскостью пред- |
метного стекла на 0.28—0.30 мм, что соответствует величине,
необходимой для приготовления срезов толщиной около 0.35 мм.
Для уменьшения адгезивных свойств стекла его покрывают
силиконовым гидрофобным слоем по методу 3. В. Широкшиной и
Н. В. Суйковской (1957): силиконируемые стекла смачивают
водой и помещают в стакан; туда же кладут ватный тампон,
смоченный диметилхлорсиланом, и плотно покрывают стакан.
Силиконирование парами диметилхлорсилана заканчивается через
45—60 мин. Силиконовый слой хорошо держится несколько
месяцев и значительно уменьшает прилипание ткани.
Большинство авторов применяют для приготовления срезов
лезвие безопасной бритвы или микротомный нож. Как видно
из рис. 2, то и другое плохо: движение безопасной бритвы,
параллельное «полозьям», приводит и к сдавливанию, и к адгезив-
8
Рис. 4. Станок для приготовления тканевых срезов с помощью кромки лезвия
бритвы (по: Емельянов, Гарина, 1970).
А — общий вид; Б — схема взаимодействия подвижных элементов каркаса. 1 — пружинная
скоба с приливами; 2 — рукоятка; 3 — опорный стержень; 4 — фиксатор натяжения лезвия;
5 — лезвие; 6 — пружинящие зажимы для крепления лезвия; 7 — распил прилива; 8—
винт, фиксирующий угол поворота лезвия; 9 — винт зажима лезвия.
ному смещению ткани; движение микротомного ножа не приводит
к сдавлению, но вызывает адгезивное смещение и травму ткани.
Мы применили узкую режущую кромку безопасной бритвы (в ос-
новном лезвие «Балтика», толщиной 0.08 мм), которая отламы-
вается в специальных тисках (рис. 3). Такая узкая полоска не
обладает ни сдавливающим, ни смещающим действием. Для
применения этой полоски нами сконструирован специальный дер-
жатель (рис. 4). Взаимоотношение направляющего стекла Мак-
Ильвейна, ограничительной планки и лезвия режущего станка
показаны на рис. 5. Необходимый угол поворота лезвия выстав-
ляется предварительно с помощью целого бритвенного лезвия,
как показано на рис. 6. Лезвие вставляется в станок так, чтобы
передная кромка совпадала с губкой зажима. Угол заточки
лезвия р равен 12°, а равен 6°. Синус 6° равен 0.105, ширина
лезвия (1) равна 21 мм. Следовательно, расстояние (гл) должно
составлять 2.2 мм (практически 2.0—2.1 мм). Изготовляют щуп
9
Рис. 5. Схема фиксированного положения
ножа и направляющего стекла при задан-
ной толщине последнего.
1 — лезвие, 2 — зажим крепления лезвия (6 на
рис. 4), 3— часть пружинной скобы станка,
4 — опорный стержень (3 на рис. 4), 5 — пред-
метное стекло, 6 — направляющие «полозья».
толщиной 2.0 мм, отворачивают винты (8, рис. 4) и поворачивают
лезвие так, чтобы расстояние от задней его кромки до полозьев
направляющего стекла равнялось толщине щупа, после чего
винты фиксации угла поворота лезвия затягивают. Угол поворота
режущей кромки держится стабильным неограниченно долго.
Правильность его установки проверяется по толщине среза (5).
Срезы удобно приготовлять на цилиндрическом металлическом
столике высотой и диаметром 60—70 мм, покрытом фильтроваль-
ной бумагой.
В литературе описано приготовление срезов различных отделов
мозга (см. обзор: Elliott, 1969). Наш личный опыт Ьхватывает
работу со срезами неокортекса, гиппокампа, мозжечка, мозоли-
стого тела. Тангенциальные срезы весьма удобны для биохими-
ческих исследований вследствие простоты изготовления, значи-
тельной цитоархитектонической однородности, целостности наруж-
ной поверхности. Однако они охватывают, как правило, несколько
полей и перерезают нервные отростки, поэтому для нейрофизио-
логических исследований в ряде случаев необходимы срезы иной
ориентации, приготовление которых описано ниже (с. 32).
Прежде чем приступать к серийным исследованиям, необхо-
димо проверить толщину приготовленных срезов. Для этого гото-
вят срез, взвешивают его и помещают в чашку Петри, запол-
ненную физиологическим раствором, на дно которой положена
Рис. 6. Установка с помощью щупа (<?) заданного угла а между направляющими
«полозьями» (2) и лезвием целой бритвы (4).
/п=/-81п а; а=О.50. После установки заданного угла винты зажима (5) (6 на рис. 4)
затягиваются; заданный угол сохраняется неограниченно долго при использовании узких
режущих кромок.
10
миллиметровка. Срез оконтуривают остро заточенным простым
карандашом и ставят возле контура номер среза. После приго-
товления 5—6 препаратов сливают жидкость и измеряют площадь
каждого среза в мм2. Частное от деления массы среза в мг на
его площадь в мм2 равно толщине среза в мм (при удельной
массе ткани, равной 1, один мг занимает объем один мм3).
Вычисляют среднюю толщину и ее стандартную ошибку. Если
толщина среза варьирует от заданного значения не более чем на
0.05 мм, процедуру приготовления можно считать удовлетвори-
тельной. В противном случае надо изменить угол наклона лезвия
или степень нажатия на направляющее стекло при приготовлении
среза.
Далее срезы взвешивают и переносят в инкубационный сосуд.
Для этого алюминиевую проволоку диаметром около 0.5 мм
расплющивают на конце и загибают крючком (общая длина
около 60 мм). С помощью такого крючка, предварительно взвешен-
ного, срез снимают расплющенным концом проволоки прямо
с направляющего стекла, к которому он слегка прилипает, и
взвешивают на торзионных весах, после чего помещают в инку-
бационный сосуд. Мы считаем при биохимических измерениях
наиболее правильным расчет результатов на единицу исходной
«свежей» массы среза поскольку при инкубации часть среза
может разрушиться. Однако обычно принято вести расчет относи-
тельно конечной влажной массы среза, конечной сухой массы
ткани среза и на единицу белка в ткани среза после инкубации
(наиболее часто практикуется определение белка по Лоури с соав-
торами (Lowry et al., 1951) и Итцхаки с соавторами (Itzhaki,
Gill, 1964).
При определении конечной влажной массы среза весьма важ-
ной является процедура «подсушки», т. е. отсасывания захвачен-
ной срезом среды инкубации. Описано несколько способов такой
«подсушки»; в частности, Мак-Ильвейн считает оптимальным
«протаскивание» среза по матовому стеклу. По нашему мнению,
оптимальным способом является следующий. Берут плотный бу-
мажный фильтр (СССР, «Реахим», фильтр с синей полоской;
ГДР, «Filtrak», фильтры № 90, 390), 1/3 его площади обмакивают
в среду инкубации (с. 13) на 1—2 с, вынимают фильтр и ждут
несколько секунд, пока раствор не распространится по фильтру
равномерно. Извлеченный алюминиевым крючком срез слегка
прижимают к влажной части фильтра в области ее границы
с сухой частью на 1—2 с каждой поверхностью среза и взвешивают
на том же крючке на торзионных весах.
При определении сухого веса среза после «подсушки» его
помещают во фторопластовую чашечку, взвешивают, сушат 18—
24 ч при температуре 105 °C, охлаждают в эксикаторе и вновь
взвешивают. Разность между результатами первого и второго
взвешивания равна содержанию воды; разность между вторым
взвешиванием и исходным весом чашки равна содержанию сухого
вещества.
п
Рис. 7. Простейшее устройство для приго-
товления фторопластовых чашечек в лабо-
раторных условиях.
1 — матрица; 2 — шайба; 3 — винт, прижи-
мающий шайбу; 4 — пуансон; 5 — фторопла-
стовая заготовка.
Чашечки из листового фторо-
пласта толщиной 0.5—1 мм легко
изготовить прямо в лаборатории
с помощью несложного устрой-
ства (рис. 7). На матрицу 1 кла-
дут вырубленный кружок фторо-
пластовой пластинки, зажимают
вииты 3, нагревают матрицу с при-
жатым фторопластовым кружком
и пуансон 4 в сушильном шкафу до 250—270 °C. После нагрева
следует снова поджать винты 3, затем в горячем состоянии пуан-
соном 4 вжимают фторопласт в гнездо матрицы, детали фиксируют
в сжатом положении «шведским» ключом или грузом и охлаждают
водопроводной водой. После охлаждения чашечка принимает
форму гнезда матрицы и служит неограниченно долго. Иглой
можно выгравировать на ней номер и составить таблицу веса
чашечек. Для работы с чашечками удобны микроаналитические
весы типа ВЛМ-1 (полуавтоматические, предел взвешивания —
1 г, точность взвешивания — 0.02 мг).
Очень важным является вопрос о составе инкубационной
среды. В литературе имеется множество рецептов сред инкубации.
Состав некоторых из них приведен в табл. 1.
По мнению большинства авторов, осмомолярность изотониче-
ской среды составляет 308—310 моем • л-1. Ряд авторов считают,
что среда инкубации должна приближаться по составу к ликвору
(см. обзор: Bradbury, 1979), однако это спорно: интерстициальная
жидкость может быть близкой по химическому составу к ультра-
фильтрату плазмы н отличаться как от плазмы, так и от ликвора.
Оценка некоторых параметров состава сред применительно
к задачам нейрофизиологического исследования будет дана ниже
в главе 2.5. Прежде всего по содержанию К выделяется среда
Уайта с сотрудниками (White et al., 1979). Она содержит около
3 мМ К, что близко к его содержанию в ликворе. Однако Фертцигер
и Раик (Fertziger, Ranck, 1970) показали, что в интерстициальной
жидкости мозга in situ уровень К может в процессе нервной
активности возрастать до 10 мМ и более. Поэтому мы считаем,
что более физиологичными являются те среды, в которых уровень К
превышает 5—6 мМ. Весьма варьирует уровень Са: от 0.75 до
3.1 мМ. В лаборатории Мак-Ильвейна было показано, что стацио-
нарное состояние срезов мозга по Са поддерживается тогда,
когда уровень Са в среде не превышает 0.75 мМ, поэтому Мак-Иль-
вейн и Роднайт (McIlwain, Rodnight, 1962) стали рекомендовать
12
Таблица 1
Состав наиболее часто встречающихся инкубационных сред (ммоль • л-1)
Компонент среды Номер среды
1 2 3 4 5 6 7 8 9
NaCl 118 137 125 131 137 124 122 124 102
КС1 4.7 5.5 5.0 4.5 5.4 4.9 3.1 5.0 5.0
СаС12 2.5 2.5 2.7 2.4 1.3 3.1 1.3 0.75—2.8 0.75
КН2РО4 1.2 1.4 1.25 1.1 0.4 1.2 0.4 1.24 1.3
MgSO4 1.2 1.4 1.25 — 0.4 1.3 1.2 1.3 0.6
MgCl2 — — — — 0.5 — — — 0.5
NaHCO3 25 4.1 3.75 — — 25.6 25 3.8 3.8
Na2HPO4 (буф.) — — 14 6.8 0.5 — — 8.3 8.3
Глюкоза 10 10 10 15 5.5 10 10 10 10
Глутамат — — — — — — — — 5
Пируват — .— — — — — — — 5
Фумарат — — — — — — — — 5
Примечание, i — Кребс—Рингер—бикарбонат; 2 — Кребс—Рингер—бикарбонат
«low»; 3 — Кребс—Рингер—фосфат; 4 — среда Робинсона; 5 — среда Хенкса; 6 — среда
по Данвидди—Лаицу (Dunwiddie, Lanch, 1978); 7 — среда по Вайту, (White et al., 1979);
у — среда Мак-Ильвейна (McIlwain, 1963); 9 — искусственная сыворотка Кребса (Mano-
metrische Methoden. . ., 1965).
среду с пониженным уровнем Са. Анализ роли Са в средах прове-
ден Клейнцеллером с сотрудниками (Manometrische Methoden. . .,
1965). По нашему опыту, при низком уровне Са дыхание срезов
становится весьма нестабильным, как и способность к поддержа-
нию ионных градиентов. Мы считаем оптимальной концентрацию
Са около 1.4—1.5 мМ.2
Кажется необходимым критически отнестись к средам Робин-
сона и Хэнкса (4, 5, табл. 1). Среда Робинсона не содержит
иона Mg и бикарбоната — это едва ли благоприятно для жизне-
деятельности срезов. Среда Хэнкса содержит только фосфатный,
но не бикарбонатный буфер, и притом в незначительном коли-
честве. По нашему мнению, эти среды не заслуживают широкого
применения. Все остальные среды делятся на две основные группы
по доминирующему буферу — бикарбонатные и фосфатные. Про-
тотипом всех бикарбонатных сред является «Кребс—Рингер—би-
карбонат» (1, табл. 1). Эти среды успешно применяются нейрофи-
зиологами, но они делают невозможным измерение дыхания мето-
дом Варбурга. Полярографическое же измерение дыхания имеет
свои ограничения. Это основное возражение против бикарбонат-
ных сред. Для того чтобы сделать возможным измерение дыхания,
Кребс применил среду «Кребс—Рингер—бикарбонат low» (цит.
по: Manometrische Methoden. . ., 1965; 2, табл. 1), при использова-
2 За последние годы роль Са в нервной ткани значительно пересматривается
(см. обзор: Костюк, 1979). Весьма возможно, что следует ожидать новых рекомен-
даций в отношении его уровня в среде инкубации.
13
• Таблица 2
Расчет приготовления маточных изотонических компонентов инкубационных сред
Номер Вещество Молярность раствора, М Количество вещества, г в I л раствора Условия приготовления
1 NaCl 0.154 9.01
2 КС1 0.154 11.48 —
3 СаС12 0.11 12.21 Сушка при температуре вы-
4 КН2РО4 >• 0.154 20.96 ше 250 °C. Титрование по хлориду.
5 MgSO4 0.154 12.94 Сушка выше 200 °C (или
6 MgCl2 0.11 10.47 37.96 г MgSO4 • 7Н2О). Сушка при температуре вы-
7 NaHCO3 0.154 12.94 ше 150 °C. Титрование по хлориду. Продувка СО2 в течение
- 8 Фосфатный бу- 0.11 13.21 20 мин. Сушка при температуре вы-
9 фер, pH 7.4, Na2HPO4 Глюкоза 0.31 55.8 ше 100 °C; добавить 20 мл 1 н НС17
Примечание. Титрование по хлориду: растворы AgNO3 0.10 и. — 16.99 г л-',
KjCrO, 5% —50 г ‘ л *1. Растворы хранятся при температуре около 0 °C в течение
.1—2 недель.
нии которой можно, хотя и трудно, измерять дыхание в аппарате
Варбурга. Однако буферная емкость этой среды невелика. Поэтому
во всех случаях, когда специфика задачи не накладывает особых
требований, кажется более целесообразным применение «фосфат-
ных» сред, которые имеют большую буферную емкость и содержат
физиологически активные количества бикарбоната. В качестве
буферных компонентов ряд авторов рекомендуют трис-солянокис-
лый и HEPES, однако при этом среды содержат мало физиологи-
чески активных ионов фосфата и бикарбоната. Нам эти буферные
смеси не кажутся удачными. К таким средам относятся «Кребс—
Рингер—фосфат» и среда Мак-Ильвейна (3, 8, табл. 1). Как
указано выше, количество Са желательно снизить до 1.4 мМ.
Обращает на себя внимание искусственная сыворотка Кребса
(9, табл. 1), которая в качестве субстратов содержит кроме
глюкозы еще глутамат, пируват и фумарат. Мы не нашли благо-
творного влияния дополнительных субстратов ни на ткань среза,
ни на дыхание, ни на содержание АТФ и КР, ни на ионный состав
тканн. Более того, глутамат в количестве, превышающем 0.2 мМ,
вызывает значительную потерю трансмембранных ионных гра-
диентов. По-видимому, применение этой среды не оправдано, и она
не получила широкого распространения. Более детальная характе-
ристика отдельных ионов инкубационных сред дана в монографии
Клейнцеллера с сотрудниками (Manometrische Methoden. . ., 1965,
с. 287—288) и обзоре Тейлера (Teyler, 1980).
14
Основные наши исследования проводились с применением
среды Мак-Ильвейна, при уровне Са, равном 1.4 мМ.
Приготовлять среды очень удобно из изотонических маточных
растворов, как это описал Клейнцеллер с сотрудниками (Manomet-
rische Methoden. . ., 1965; табл. 2).
Растворы СаС12 и MgCl2 готовят приблизительно удвоенной
концентрации (0.22 М, т. е. 0.44 н), затем титруют AgNO3 с до-
бавкой в качестве индикатора 5 %-ного К2СгО4. При окончании
титрования образуется стойкий осадок бурого хромата серебра.
При точном приготовлении раствора на 1 мл 0.22 М СаС12 или
MgCl2 пойдет 4.40 мл раствора AgNO3. В этом случае необходимо
0.50 л исходного раствора довести водой до 1 л. Если растворы
высушены недостаточно, то на их титрование пойдет меньший
объем (Vj) AgNO3. В этом случае число мл предварительного
раствора (К2), которое нужно взять и довести водой до 1 л, равно:
v = 500 • JL-fL.
vi
Окончательный раствор титруют повторно. На 1 мл 0.11 М рас-
твора должно пойти 2.20 мл AgNO3.
Особый вопрос — о газовой среде инкубационного сосуда. Не-
редко обсуждается токсичность чистого кислорода для ткани
(Лукьянова и др., 1982; Manometrische Methoden. . ., 1965) и да-
ются рекомендации об инкубации в воздушной атмосфере. Однако
допустимая толщина среза при инкубации в воздухе не превышает
0.22 мм.
Как показали и наши, и литературные данные, при изготов-
лении среза слой поврежденных структур достигает 0.05 мм; следо-
вательно, при малой толщине среза он составляет 25 % всей
массы ткани. С нашей точки зрения, это обстоятельство является
главным аргументом против применения тонких срезов. Кроме
того, для большинства биохимических и физиологических процес-
сов токсичность кислорода не проявляется. По-видимому, ее
следует принимать во внимание в основном при изучении окисли-
тельных ферментов, а в остальных случаях ею можно пренебречь
и использовать срезы толщиной до 0.52 мм с инкубацией в атмо-
сфере кислорода. Часто употребляют газовую смесь — 95 % О2
и 5 % СО2 (карбоген). В средах с чистым бикарбонатным буфером
такая смесь улучшает буферную емкость. В тех же случаях, когда
среда содержит доминирующий фосфатный буфер (3, 8, табл. 1, 3),
ее буферная емкость хорошо сохраняется в атмосфере чистого
кислорода. Кроме того, карбоген делает невозможным измерение
дыхания методом Варбурга. Поэтому мы рекомендуем в основном
среды с фосфатным буфером и инкубацию в атмосфере кислорода
во всех случаях, где не показана специально необходимость
наличия СО2 в газовой фазе.
После разлива инкубационной среды в инкубационные сосуды
(сосуды Варбурга, или колбочки емкостью 5 мл с НШ-14.5, или
15
Таблица 3
Составление некоторых инкубационных сред из маточных растворов
Маточный раствор 1 3 7 8
NaCl 0.154 М 100 100 77 145
КС1 0.154 М 4.0 4.0 2.0 5.8
СаС12 0.11 М 3.0 3.0 1.2 2.4
КН2РО4 0.154 М 1.0 1.0 0.25 1.4
MgSO4 0.154 М 1.0 1.0 0.8 1.5
NaHCO3 0.154 М 21 3.0 16 4.5
Фосфатный буфер, 0.154 М, pH 7.4 — 11.2 —• 15
Глюкоза 0.31 М 4.0 4.0 3.2 6
Общий объем расчетной пор- ции среды, мл 134 127.2 100.4 181.6
Примечание. Обозначения граф, как в табл. 1.
стаканчики с НШ-19) емкость сосуда в течение 1.5—2 мин про-
дувают кислородом или карбогеном, сосуд закрывают, и в течение
1 ч среда насыщается газом. Для наилучшего постоянного газо-
обмена толщина слоя среды не должна превышать 3 мм. Соотноше-
ние массы среды и среза должно быть не менее 30:1 для опытов,
длящихся не более 3 ч, и 50:1 —для более длительных.
Как показано многими авторами, в том числе и нами, после
препаративной травмы, при которой обмен веществ в ткани среза
нарушен на несколько минут, в течение первых минут инкубации
наблюдаются быстрое набухание среза, потеря ионных градиентов,
которые сменяются фазой репарации и установлением стационар-
ного состояния (рис. 8). В первые 30 мин инкубации в среду
выходят содержимое разрушенных клеток, кислые метаболиты,
которые снижают pH среды. Поэтому мы рекомендуем преинкуби-
роватЬ каждый срез 30 мин в первой порции среды, после чего
перенести его во вторую порцию среды, которая и является «рабо-
чей». Такой прием применялся нами и другими авторами и ка-
жется нам оправданным.
Со времен Мак-Ильвейна (McIlwain, 1963) при серийной работе
рекомендуется накапливать группу срезов, сохраняя их на холоду.
Этот прием, по нашему мнению, неудачен.3 На холоду сильно
замедляется окисление и активный транспорт ионов и наблюдается
сильное внутриклеточное набухание. При хранении на холоду
у последовательно приготовленных срезов интервал между декапи-
тацией и началом инкубации различен. Поэтому мы рекомендуем
не хранить срезы, а с минимальным постоянным интервалом от
начала декапитации помещать их сразу в прецнкубационные со-
3 В литературе есть аналогичные указания (Blaxter, 1983).
16
Рис, 8. Динамика водно-солевого состава срезов коры мозга крыс в процессе
их инкубации (по: Емельянов, Гарина, 1970).
По оси абсцисс — время, ч. По оси ординат: слева — инулиновое пространство (Vin) %,
кривая 3; общий Na ткани (Nat) мэкв/кг, кривая 5; общий К ткани (Kt), кривая 8;
кривые 4 и 7 отражают исходное содержание ионов; справа — отношение массы воды
к сухой массе, кривая 2; коэффициенты трансмембранного распределения Na (Wae/Wa,),
кривая 6 и К (Kj/Ke), кривая 9. Каждая точка кривых — среднее значение из 16—18 опытов.
Видно, что после препаративной травмы развивается стационарное состояние водно-
солевого состава в период от 0.5 до 3 ч и более.
2 Заказ 1012
17
00
в
Рис. 9. Комбинированный контейнер-электрод для инкубации и
электростимуляции срезов нервной ткани in vitro (по: Емелья-
нов и др., 1976).
А — общий вид; Б — разрез, показывающий взаимоотношение частей
электрода и расположение среза ткани (с) в п£остранстве между
токонесущими сетками; В — схема помещения электрода в инкуба-
ционной ячейке. Размеры даны в мм.
суды. При величине периода преинкубации, равном 30 мин, легко
можно в каждый эксперимент брать 6 последовательных срезов
и все дальнейшие процедуры с ними проводить также последова-
тельно с интервалом 5 мин. Такая структура каждого эксперимента
кажется нам оптимальной.
Для обеспечения нормального обмена веществ инкубируемого
среза необходимо постоянное перемешивание среды инкубации
с определенной скоростью. В сосуде Варбурга это делается путем
качаний, в полярографической ячейке — с помощью ротора маг-
нитной мешалки, в суперфузионной системе нейрофизиологиче-
ского эксперимента — путем притока жидкости. Скорость переме-
шивания может быть определена в каждом отдельном случае
путем ее последовательного наращивания. Можно рассчитывать
ее, исходя из того, что растворимость кислорода в среде составляет
при 37 °C 24 мкл • мл”1, скорость потребления кислорода срезом
массой 10 мг не превышает 0.1 мкл • мин”1 и допустимое падение
содержания О2 в среде, оттекающей от среза, не должно быть
более чем 5 мкл • мин”1. Практически при работе с аппаратом Вар-
бурга частота качаний должна быть 120 в минуту, в полярографи-
ческой ячейке скорость перемешивания рекомендуется равной 20—
400 оборотов в минуту (в зависимости от величины ротора),
а в проточной суперфузионной системе рекомендуется скорость
протока не менее 0.1 миллилитра в минуту на каждый миллиграмм
массы среза.
Доказательством высокой степени аэробиоза является высокий
уровень макроэргических фосфатов: АТФ — 2.2, КФ — 3 мкмоль X
Хг”1 (Богданова, Подвигина, 1976), приближающийся к усло-
виям in situ (АТФ — 2.5, КФ — 3.9 мкмоль • г”1) (Veech, Hawkins,
1974) и более высокий, чем уровень макроэргических фосфатов,
в срезах, полученных другими авторами (АТФ — 1.59, КФ —
1.75 мкмоль • г”1 — Ghosh et al., 1972).
В биохимических экспериментах весьма интересным приемом
является тотальная электростимуляция среза, которая охватывает
значительную часть клеточной популяции среза (о стимуляции
в нейрофизиологических экспериментах, когда она носит точно
направленный характер. Глава 2). Технически она является не-
простой задачей, так как ток в солевой среде достигает величины
сотен миллиампер. Фирма «Grass» в США разработала специаль-
ный сложный стимулятор для этих целей.
Мы предлагаем специальный контейнер-электрод, который поз-
воляет производить инкубацию среза без нарушения обмена со сре-
дой и в то же время осуществлять электрическую стимуляцию по
всей площади среза (рис. 9).
С. А. Евдокимов (Евдокимов, Емельянов, 1978) сконструи-
ровал специальный эмиттерный повторитель, который подает от
блоков питания Б5—8 стимулы, повторяющие по форме прямо-
угольные однополярные или альтернирующие стимулы любой
длительности.
Исследования содержания КРФ и ионного состава показали,
2 *
19
что в течение 2 мин электростимуляция вызывает существенные
изменения состава ткани; через 15—20 мин наблюдается стацио-
нарное состояние; при прекращении стимуляции ткань полностью
возвращается в исходное состояние. Предлагаемое устройство
является удобным для изучения метаболических реакций на
электростимуляцию в фазах нарастания реакции, стационарного
состояния и восстановления, в частности в опытах с радиоактив-
ными веществами. Принципиально возможно применение этого
контейнера-электрода и в полярографической ячейке, однако элек-
тролиз среды при значительной величине тока делает трудным
измерение потребления кислорода полярографическим методом,
как и методом Варбурга. Это ограничение не относится к изучению
включения метки из субстратов в СО2 и другим аспектам изучения
окислительного обмена.
Все приемы, описанные в настоящем разделе, не носят харак-
тера абсолютных рекомендаций. Прежде чем предпринять исследо-
вание на срезах мозга, необходимо провести методическую работу
по коррекции условий эксперимента применительно к конкретным
задачам исследования.
*
20
ГЛАВА 2
УСТРОЙСТВА И ПРИЕМЫ
ДЛЯ ПРОВЕДЕНИЯ НЕЙРОФИЗИОЛОГИЧЕСКИХ
ИССЛЕДОВАНИЙ НА СРЕЗАХ МОЗГА
2.1 ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА УСТАНОВКИ
ДЛЯ ОБЕСПЕЧЕНИЯ ДЛИТЕЛЬНОГО ПЕРЕЖИВАНИЯ СРЕЗОВ
Установка для проведения нейрофизиологических исследова-
ний срезов состоит из двух частей (деление условное). Одна из
них включает комплекс устройств и приборов, предназначенных
для обеспечения длительного переживания срезов. Другая —
комплекс приборов для стимуляции и отведения электрической
активности. Поскольку системы стимуляции и отведения в основ-
ном не отличаются от обычно применяемых в нейрофизиологи-
ческих исследованиях, то мы не будем останавливаться на их
описании.
Схема установки показана на рис. 10. Из резервуара 6 перфу-
зионная жидкость по трубке 5 втекает в рабочую камеру 2, при
этом жидкость нагревается до необходимой температуры в термо-
статнрующей водяной бане 1. Омывая срез 4, расположенный на
нейлоновой сетке 3, жидкость откачивается через трубку 11 пери-
стальтическим насосом 14 в сборный резервуар 15. Нагрев воды
в водяной бане осуществляется спиралью 9, питающейся постоян-
ным током от прибора 10. Контроль температуры жидкости в ка-
мере производится термодатчиком 17, соединенным с электро-
термометром 16, который включен в цепь регулирования темпера-
туры в приборе 10.
Перфузионная жидкость насыщается карбогеном в резерву-
аре 6. Через трубку 7 подогретый и увлажненный газ через
канал 18 входит в камеру, создавая в ней над срезом соответствую-
щую атмосферу. Для устранения активного перемешивания
атмосферы над срезом с окружающей газовой средой служит
крышка 12. Визуальный контроль осуществляется бинокулярной
лупой 13. Лампа 3 предназначена для освещения камеры снизу.
Описанная схема установки, разумеется, не является един-
ственным конструктивным решением. Существуют и, конечно,
возникнут новые решения. Так, например, приток и отток пер-
фузионной жидкости могут быть принудительными с помощью
перистальтического насоса (Tielen, Mollevanger, 1982). Число
камер в водяной бане можно увеличить до четырех и более (White
21
Рис. 10. Общая схема установки для проведения нейрофизиологических исследо-
ваний на переживающих срезах мозга (по: Teyler, 1980, с изменениями).
1 — водяная баня; 2 — рабочая камера; 3 — нейлоновая сетка; 4 — срез; 5 — трубка,
соединяющая резервуар (6) с рабочей камерой; 6 — резервуар с инкубационным раство-
ром; 7 — трубка для подачи карбогена (О2+СО2) в водяную баню; 8— лампа для
освещения снизу; 9 — нагревательная спираль; 10 — прибор для питания постоянным
током нагревательной спирали (9); 11 — трубка для откачивания перфузионной жидкости;
12 — крышка; 13 — бинокулярная лупа; 14 — перистальтический насос; 15 — сборный ре-
зервуар; 16 — электротермометр; 17 — термодатчик; 18 — канал в стенке рабочей камеры;
/9 — уровень жидкости в водяной бане; 20 — стимулирующий электрод; 21 — регистри-
рующий микроэлектрод. Стрелками обозначено направление тока жидкости.
et al., 1978; Teyler, 1980; Tielen, Mollevanger, 1982; Каранов,
Брагин, 1983), с тем чтобы одну из них использовать для отведения
активности, а другие — для инкубации срезов.
2.2. ПЕРФУЗИОННАЯ КАМЕРА
И СВЯЗАННЫЕ С НЕЙ ЭЛЕМЕНТЫ УСТАНОВКИ
Центральным элементом в установке является рабочая (перфу-
зионная) камера. Если объединить опыт работы с перфузионными
камерами, то можно сформулировать следующие основные требо-
вания, предъявляемые к ним: 1) обеспечение механической под-
держки и стабильной фиксации среза; 2) регулирование уровня
и скорости протока перфузионной жидкости, гашение гидроударов;
3) поддержание постоянной заданной температуры раствора;
4) насыщение раствора кислородом (или карбогеном) и создание
оксигенированной атмосферы над срезом; 5) камера должна быть
разборной, удобной для промывки, освещения и подведения элек-
тродов. В соответствии с этими требованиями конструируются
отдельные элементы — узлы камеры.
22
В настоящее время разработано большое количество конструк-
ций камер. Прототипами большинства из них послужили конструк-
ции камер, разработанных Мак-Ильвейном и сотрудниками (Li,
McIlwain, 1957; Hillman, McIlwain, 1961; Gibson, McIlwain, 1965).
По нашему мнению, наиболее полно удовлетворяют всем требова-
иям, отмеченным выше, конструкция камеры, описанная Лэнг-
моуном и Андерсеном (Langmoen, Andersen, 1981). Рассмотрим
ее подробнее. Срез располагается на нейлоновой сетке 1 (рис. 11).
Перфузионный раствор втекает по трубке 7, нагревается в водяной
бане 6 до необходимой температуры и втекает в небольшую пред-
камеру 4, которая служит для выхода пузырьков газа, возникаю-
щих в перфузионной системе. Затем через канал 2 раствор пере-
текает в рабочую камеру 3, омывает срез и по U-образной трубке
втекает в камеру 14, из которой он отсасывается через трубку 13.
Нагрев водяной бани осуществляется пропусканием постоянного
тока через проволоку 12, намотанную вокруг цилиндра 8. Из
трубки 10 карбоген проходит через дистиллированную воду, стано-
Рис. 11. Конструкция перфузионной камеры для проведения нейрофизиологических
исследований на переживающих срезах мозга (по; Langmoen, Andersen, 1981,
с изменениями).
1 — нейлоновая сетка; 2— канал между предкамерой и рабочей камерой; 3 — рабочая
камера; 4 — предкамера; 5 — источник света; 6 — водяная баня; 7 — трубка, по которой
втекает перфузионный раствор; 8 — стенка внутреннего цилиндра; 9 — зеркало для осве-
щения камеры снизу; 10 — трубка для продува карбогена (О2+СО2) в водяной бане;
11—осветительная лампа; 12—проволока для нагревания водяной бани; 13—трубка
отсоса; 14 — камера для отсоса жидкости; 15 — пластинка; 16 — отверстие для поступле-
ния карбогена в рабочую камеру. Объяснение в тексте.
23
вится нагретым, увлажненным и поступает через отверстие 16
в рабочую камеру. Благодаря пластике 15 над срезом сохраняется
оксигенированная атмосфера. Освещение осуществляется сверху
источником света 5 или снизу при помощи лампы И и зеркала 9.
Поступление перфузионного раствора в камеру происходит из
резервуара, расположенного примерно на высоте 1 м над камерой.
Содержимое резервуара в ходе эксперимента непрерывно проду-
вается карбогеном. Скорость перфузии составляет 1—3 мл • мин1
при объеме камеры 2 мл. Стенки водяной бани сделаны из толстого
оргстекла (плексигласа), чтобы избежать потери тепла. Ана-
логично этой схеме или с небольшими модификациями сделаны
камеры и у других исследователей (Lynch et al., 1975; Schwartz-
kroin, 1975; Dingledine et al., 1980; Hatton et al., 1980; Teyler, 1980;
Schwartzkroin, 1981; Wheal, 1981).
Рассмотрим возможные конструктивные решения отдельных
узлов камеры. В качестве основы, на которой располагают срез,
используется нейлоновая сетка чулочной ткани. Она имеет доста-
точно крупные ячейки для беспрепятственного тока жидкости,
надежно держит срез и оптически прозрачна при освещении
снизу.
Использование лабораторных мелкоячеистых нейлбновых сеток
также возможно, хотя они сплетены из нескольких жил и незначи-
тельно затрудняют проток жидкости. Их применение удобно в том
отношении, что, зная размеры ячейки, исследователь может
оценить расстояние между раздражающим и отводящим элек-
тродами, не делая специальных измерений.
Нередко при длительной работе со срезами они прилипают
к сетке, при этом их трудно просто убрать или использовать для
дальнейшего гистологического контроля. Чтобы устранить этот
недостаток, Тейлер (Teyler, 1980) предлагает использовать фильт-
ровальную бумагу. В качестве основы для крепления среза исполь-
зуют также мелкопористый поролон (White et al., 1978), сетку из
нержавеющей стали (Mollevanger et al., 1980), платиновую сетку
(Dore, Richards, 1974; Richards, Tegg, 1977; Richards, 1981).
Применение металлических сеток удобно в двух отношениях. Во-
первых, они значительно более долговечны, чем сетки, изготовлен-
ные из других материалов; во-вторых, их можно использовать
в качестве индифферентного электрода.
Материалом для изготовления камеры и водяной бани чаще
всего служит органическое стекло (плексиглас). Это связано с тем,
что оно не обладает токсичностью, легко обрабатывается и про-
зрачно. Вполне пригодны для этих целей полиэтилен, фторопласт,
а также другие нетоксичные пластические материалы.
Объем рабочей камеры, по литературным данным, колеблется
от 1 до 5, иногда 10 мл и выбирается опытным путем в зависимости
от задачи исследования и размеров срезов. При фармакологи-
ческих исследованиях стараются минимизировать «мертвое» про-
странство в камере, с тем чтобы обеспечить быструю смену рас-
твора с исследуемым веществом на контрольный. Самый малый
24
объем в таких исследованиях составляет 0.3—0.4 мл (Mollevanger
et al., 1980; Koerner, Cotman, 1983). С другой стороны, не меняя
объема камеры, такого же эффекта можно добиться увеличением
скорости перфузии.
Надежная фиксация среза на сетке в камере зависит от направ-
ления тока перфузионного раствора. Обычно ток жидкости в ка-
меру направляется снизу или сбоку. При высокой скорости тока
снизу срез приподнимается над сеткой, а при боковом направле-
нии смещается в сторону. Сходные трудности возникают при
переключении подачи одного перфузионного раствора на другой.
Гидродинамический удар, часто возникающий при таком переклю-
чении, механически дестабилизирует срез, снижая качество отведе-
ния. То же явление наблюдается при попадании пузырьков газа
в рабочую камеру.
Для борьбы с этими нежелательными явлениями разработаны
определенные меры. Так, фиксация между двумя сетками надежно
закрепляет срез (Scholfield, 1978а, Brown, Halliwell, 1981; Schol-
field, 1981). Это повышает качество отведения потенциалов как
при увеличении скорости перфузии от 2 до 10 мл • мин”1 (Сог-
rigall, Lucato, 1980), так и при переключении одного перфузион-
ного раствора на другой (Richards, Tegg, 1977; Nicoll, Alger,
1981). Срез можно закрепить на сетке при помощи стимулирующих
электродов (Скребицкий, Воробьев, 1978; Llinas, Sugimori, 1980а)
или серебряной проволоки диаметром 0.1—0.2 мм, прикреплен-
ной к его краю (Chujo et al., 1975; Kato, Ogawa, 1981; Yamamoto,
Sawada, 1981a). Для устранения гидроудара можно использовать
шарообразный клапан, препятствующий обратному току жидкости
(Dore, Richards, 1974; Richards, Tegg, 1977; Richards, 1981).
Нередко в рабочей камере на стенках и сетке образуются пу-
зырьки газа, которые выходят из оксигенированного раствора при
его нагревании в водяной бане. Появление пузырьков отрица-
тельно сказывается на жизнеспособности среза, нарушается его
неподвижность, в результате чего резко снижается качество ре-
гистрации потенциалов. Для активной борьбы с этим явлением
можно использовать две нейлоновые сетки: нижнюю — для
«ловли» пузырьков газа, верхнюю — для крепления среза (Lee et
al., 1981).'
На наш взгляд, лучше изменить конструкцию камеры так,
чтобы раствор не смещал срез или электроды. Возможные кон-
структивные решения могут быть следующими. Для гашения
гидроударов жидкость можно направить сначала в предкамеру,
а потом в камеру. Конструкция предкамеры может быть различной.
Ее можно изготовить либо в виде камеры небольшого объема
(Haas et al., 1979; Llinas, Sugimori, 1980a; Langmoen, Andersen,
1981; Brown, Halliwell, 1981), либо в виде желобка (White et al.,
1978; Koerner, Cotman, 1983).
Наличие предкамеры обязательно при использовании принуди-
тельной подачи раствора с помощью перистальтического насоса.
Без предкамеры пульсации от такого насоса регистрируются
25
отводящим электродом в виде волнообразных колебаний и мешают
отведению электрических потенциалов от среза. Предкамера при
такой системе перфузии является эффективным средством исклю-
чения артефактов. Кроме того, из камеры в предкамеру удобно
перенести индифферентный электрод и датчик температуры.
Эффективной мерой закрепления среза на сетке может быть
направление тока инкубационного раствора сверху'вниз (Schol-
field, 1981). По нашему опыту таксе направление движения
жидкости обеспечивает надежную фиксацию среза без примене-
ния дополнительных устройств.
Конструкция устройств, обеспечивающих отток (отсос) рас-
твора, имеет большое значение, поскольку зачастую с его помощью
регулируют уровень жидкости в камере. Наиболее часто исполь-
зуют два уровня: высокий и низкий. При первом — срез полностью
погружен в раствор (submerged slice). При втором — срез одной
поверхностью контактирует с жидкостью, а противоположной —
обращен к газовой оксигенированной среде. При высоком уровне
жидкости обеспечивается постоянное снабжение среза необходи-
мыми веществами и кислородом. Однако при этом возникает шун-
тирование как между стимулирующими, так и отводящими элек-
тродами. Подобного шунтирования не происходит (или оно сво-
дится к минимуму) при низком уровне перфузионной жидкости
в камере (Dingledine et al., 1980). Но в этом случае возникает
опасность подсыхания той поверхности среза, которая контакти-
рует с газом. Чтобы избежать этого, газ над срезом насыщают
увлажненным и подогретым кислородом или карбогеном. Для этой
цели в камере делают специальные щели, через которые газ,
продуваемый через термостатированную водяную баню, попадает
в камеру над срезом. Этот узел камеры в конструкциях многих
авторов идентичен решению Ленгмоуэна и Андерсена (Langmoen,
Andersen, 1981), речь о котором шла выше. Несколько иное реше-
ние применено в конструкции камеры К- М. Кулланды и Т. С. Соро-
киной (1974). В данном случае увлажненный и нагретый кислород
подавался со скоростью 50 мл • мин’ 1 через трубку прямо в камеру
на срез. Сверху камеры находилась крышка, которая способство-
вала созданию высокой концентрации кислорода над срезом. Ана-
логичное решение использовано в камере Коунер и Кутман (Kee-
ner, Cotman, 1983). Они хотя и применяли «погружные» срезы,
но интенсивное продувание раствора сверху из трубки приводило
к значительному перемешиванию всего объема жидкости в камере.
Обеспечение среза кислородом таким способом было настолько
эффективным, что позволило отказаться от непрерывной перфузии.
Возвращаясь к системе оттока, отметим, что он осуществляется
активным отсосом раствора или из самой камеры (Yamamoto,
1972а; Brown, Halliwell, 1981; Kato et al., 1981), или из малой
камеры, соединенной с рабочей камерой (Dingledine et al., 1980;
Langmoen, Andersen, 1981; Scholfield, 1981). Вертикальным пере-
мещением трубки отсоса можно регулировать уровень жидкости
в рабочей камере. Для активного отсоса жидкости из камеры
26
ла
используют перистальтический насос (Mollevanger et al., 1980;
Nicoll, Alger, 1981; Helen, Mollevanger, 1982).
Более простые решения узлов входа и оттока жидкости заклю-
чаются в подборе способа их балансирования за счет сил гравита-
ции. Так, приток инкубационного раствора можно осуществить
из резервуара с постоянным давлением водяного столба, а отток —
пассивно из рабочей камеры при достижении определенного
уровня жидкости в камере (Dore, Richards, 1974; Llinas, Sugimori,
1980a; Yamamoto, Sawada, 1981a).
Благодаря размещению камеры в термостатирующей водяной
бане и протеканию раствора по трубке, расположенной в ней,
осуществляются нагрев перфузионного раствора, втекающего в ка-
меру, и необходимый подогрев самой камеры. Нагрев водяной бани
производят или спиралью, питаемой постоянным током (чтобы
избежать артефактов при регистрации потенциалов), или от термо-
стата (Richards, Sercombe, 1970; Yamamoto 1972а; Chujo et al.,
1975; Yamamoto, Sawada, 1981a). Необходимый нагрев перфу-
зионной жидкости, протекающей в трубках, можно осуществить,
если расположить их в металлическом основании, которое нагрева-
ется спиралью (Scholfield, 1978а; Nicoll, Alger, 1981; Scholfield,
1981).
Очень важно контролировать температуру среды в непосред-
ственной близости от среза. С этой целью используют термисторы,
которые вводят в рабочую камеру вблизи от среза или в пред-
камеру, если она предусмотрена в конструкции.
Освещение камеры имеет серьезное значение для наблюдения
за состоянием среза, для идентификации его структур и введения
электродов в соответствующие области. Чаще всего предусматри-
вают освещение среза электрической лампой снизу. Свет при этом
проходит через водяную баню и нижнюю стенку камеры. Вслед-
ствии поглощения инфракрасных лучей водой и стенками срез
не перегревается. Очень удобны для освещения гибкие световоды,
позволяющие освещать срез и электроды как сверху, так и снизу
(Richards, Tegg, 1977; Richards, 1981).
По наличию или отсутствию непрерывной перфузии раствора
камеры делятся на перфузируемые и статические (Teyler, 1980).
Хотя в экспериментальной практике статические камеры исполь-
зуются сравнительно редко (Li, McIlwain, 1957; Hillman, McIl-
wain, 1961; Spencer et al., 1976; Lee et al., 1981), их применение
следует считать целесообразным при проведении фармакологи-
ческих исследований, в которых одним из лимитирующих факторов
может быть малое количество исследуемого вещества. В подобных
случаях смена раствора, осуществляемая дискретно при помощи
шприцов, вполне достаточна для обеспечения хорошей жизне-
деятельности среза и получения фармакологических эффектов
(Koerner, Cotman, 1983).
Особо следует отметить, что необходимым требованием к кон-
струкции камеры и связанных с ней частей является ее разбор-
ность (Yamamoto, Sawada, 1981). Это объясняется тем, что при
27
многократном использовании физиологического раствора на стен-
ках камеры и соединительных трубок развиваются бактерии. Для
их устранения камеру нужно промывать. Промывка упрощается
и качество ее повышается, если камеру можно разобрать и отсоеди-
нить от подходящих к ней трубок.
Мы рассмотрели требования к конструкциям камер, основные
их узлы и возможные технические решения. Перед начинающим
исследователем непременно возникнет задача выбора конструкции
ч камеры и ее изготовления. Можно выбрать за основу какую-либо
существующую конструкцию и попытаться ее изготовить или
самостоятельно сконструировать камеру, руководствуясь при этом
требованиями к ее основным узлам, сформулированными выше
2.3. ОБЛАСТИ МОЗГА, ПРИГОДНЫЕ
ДЛЯ ПРИГОТОВЛЕНИЯ ПЕРЕЖИВАЮЩИХ СРЕЗОВ
Срезы изготавливают из многих областей мозга. Однако сле-
дует иметь в виду, что для решения конкретной задачи существуют
наиболее удобные отделы мозга. Это определяется внутренней
организацией той или иной области мозга, быстротой ее выделения
и сохранением необходимых связей в срезе. К таким структурам
мозга можно, на наш взгляд, отнести обонятельную кору, гиппо-
камп, мозжечок, неокортекс, спинной мозг.
Чем же удобны отмеченные структуры? Чтобы ответить на этот
вопрос, обратимся к их нейрональной организации. В обонятель-
ной коре основной пучок афферентных волокон (латеральный
обонятельный тракт) проходит вдоль вентролатеральной поверх-
ности мозга (рис. 12, 13) и формирует многочисленные синапти-
ческие связи с апикальными дендритами пирамидных клеток
препириформной коры и прилежащих областей (рис. 13). Таким
образом, в этой мозговой структуре есть
афферентные проводники синаптические
/ Ц контакты и нейроны.
V II Гиппокамп относится к ламинарным
7k ] образованиям и его структуры располо-
/ ///Л жены послойно в вентродорсальном на-
/ //Ж~4 правлении (рис. 14). В нем дифференци-
д / /\ руются несколько нейрональных полей.
/ / И J На входе располагаются гранулярные
7 / /R W J s клетки, получающие импульсацию из энто-
/Г< ч Рис. 12. Строение вентральной поверхности мозга
/I \ крысы (по: Heimer, 1969, с изменениями).
/Ач / — обонятельная луковица, 2 — обонятельный бугорок;
/3 — кортикальное амигдаляриое ядро; 4 — эиторинальиая
' область; 5 — периамигдалярная кора; 6 — препириформ-
4 ная кора; 7—обонятельная борозда; 8 — латеральный
обонятельный тракт.
28
Рис. 13. Схема нейрональной организации продольного среза обонятельной коры
(по: Richards, 1981, с изменениями).
1 — волокна ЛОТ; 2 — пиальная поверхность; 3 — пирамидные клетки; 4 — раздражаю-
щий электрод; 5 — регистрирующий электрод. Схема дана в поперечном сечении. Слеза —
масштаб в мкм.
Рис. 14. Расположение гиппокампа в мозге крысы (по: Alger, Teyler, 1977,
с изменениями).
1 — левая половина гиппокампа; 2 — поперечный срез гиппокампа.
Рис. 15. Схема нейрональных полей и основных связей между ними в поперечном
срезе гиппокампа (по: Skrede, Westgaard, 1971, с изменениями).
1 — фимбрия (бахромка); 2 — коллатерали Шаффера; 3 - слой пирамидных клеток поля
СА1; 4 — альвеолярные волокна; 5 — борозда гиппокампа; 6 — волокна перфорантного
пути; 7 — слой гранулярных клеток; 8 — мшистые волокна, 9 — клеточные тела поля САЗ.
Стрелки указывают ортодромиое распространение возбуждения. Масштаб: 1 мм.
ринальной коры по волокнам перфорантного пути (рис. 15).
Аксоны гранулярных клеток формируют синапсы с дендритами
нейронов поля САЗ (рис. 15). Через коллатерали Шаффера они
образуют синапсы с дендритами пирамидальных нейронов поля
СА1 (рис. 15). Между полями СА1 и САЗ располагается поле СА2.
Можно регистрировать в одних и тех же клетках как орто-, так и
антидромные ответы. Так, раздражая перфорантный путь, в гра-
нулярных клетках можно зарегистрировать ортодромный ответ.
Стимуляция мшистых волокон вызывает в тех же нейронах анти-
дромный ответ. Несомненным достоинством гиппокампа является
возможность исследования ТПСП, возникающих при стимуляции
альвеолярных волокон (рис. 15). Наличие обширных дендритных
29
A
Б
Рис. 16. Ориентация плоскостей среза гиппокампа.
А — вид на дорсальную поверхность гиппокампа (по: Dingledine et al., 1980, с измене-
ниями); Б — ориентация плоскости среза в левой половине гиппокампа (по: Teyler,
1980, с изменениями). 1 — плоскости среза; 2 — перегородка; 3 — бахромка; 4 — правая
половниа гиппокампа: 5 — средняя линия; стрелка — ростральное направление; а — угол
между наружной поверхностью бахромки и плоскостью среза (около 70°); б — угол
между продольной осью и плоскостью среза (около 120°); в — угол между средней
линией и плоскостью среза (около 15°).
Рис. 17. Вид на дорсальную поверхность левой половины гиппокампа кролика
(по: Andersen et al., 1971, с изменениями).
А — направление мшистых волокон; Б — расположение альвеолярных волокон; В — на-
правление коллатералей Шаффера; Г — расположение кровеносных сосудов. 1 — бах-
ромка; 2— перегородка; стрелка справа от рисунка — средняя линия гиппокампа (ро-
стральное направление); сплошные стрелки (В А, В) — волокна, выявляемые при орто-
дромией стимуляции; пунктирные стрелки — волокна, выявляемые при антидромной стиму-
ляции; штрих-пунктирная линия — 15°, пунктирная — 30° к средней линии. Масштаб: 1 мм.
30
ветвлений клеток гиппокампа позволяет изучать свойства дендрит-
ной мембраны.
Мозжечок интересен тем, что его нейроны сконцентрированы
в ядрах и можно изучать их реакции при стимуляции соответствую-
щих проводящих волокон и исследовать процессы в дендритах.
Сегментарная организация спинного мозга дает возможность
проследить распространение импульса в рефлекторной дуге,
а также исследовать тормозные потенциалы.
Ценность среза как модели мозга заключается в том, что он
сохраняет основные нейрональные элементы и их связи такими же,
как и в соответствующем отделе мозга. Поэтому необходимо
ориентировать плоскости среза так, чтобы сохранить специфи-
ческую нейрональную организацию мозговой структуры в малом
объеме среза. Обратимся к примерам. Поперечный срез гиппо-
кампа, приготовленный перпендикулярно к его продольной оси,
наиболее оптимален для нейрофизиологических исследований, так
как в нем сохраняются нейроны и основные синаптические связи,
присущие целому гиппокампу (рис. 15). Практическая ориентация
плоскости срезов должна быть такой, как показано на рис. 16,
А, Б (Dinglidine et al., 1980; Teyler, 1980). Такая ориентация
объясняется направлением связей между отдельными полями
в гиппокампе кролика (Andersen et al., 1971). Для гиппокампа
крыс ориентация связей принципиально сходна с гиппокампом
кролика (Rawlins, Green, 1977). Следует отметить, что угол
наклона плоскости среза по отношению к средней линии гиппо-
кампа определяется конкретной задачей исследования. При ис-
следовании связей между гранулярными клетками и нейронами
поля САЗ этот угол равен 15°, поскольку в этом случае в срезе
сохраняется основная масса мшистых волокон (рис. 17, А). Для
изучения ортодромных ответов в пирамидных нейронах при сти-
муляции коллатералей Шаффера, по-видимому, необходимо увели-
чить этот угол до 30°. Альвеолярные волокна или кровеносные
сосуды в гиппокампе могут служить приблизительным ориентиром
для выбора угла при изготовлении срезов, поскольку их ход лишь
отчасти соответствует направлению основных волокон (рис. 17,
Б, Г). Тангенциальный срез гиппокампа, приготовленный с дор-
сальной поверхности, часто используемый для биохимических
исследований, менее ценен для нейрофизиологов при изучении
связей между полями, так как в нем остаются преимущественно
пирамидные нейроны и их отростки (рис. 18). Напротив, танген-
циальный срез обонятельной коры полноценен в смысле сохра-
нения основных связей.
Принимая во внимание сегментарную организацию спинного
мозга, плоскости срезов должны быть ориентированы перпенди-
кулярно к его продольной оси. Для сохранения основных связей
в кортикальных срезах плоскость срезов необходимо ориенти-
ровать перпендикулярно к поверхности коры головного мозга.
Может создаться впечатление, что следует работать только
на описанных выше мозговых структурах, а всеми остальными
31
1
Рис. 18. Поперечный срез гиппокампа.
1 — пирамидные клетки поля СА1; 2 — клетки поля САЗ; 3 — гранулярные клетки; пунк-
тирная линия — нижняя граница продольного среза.
пренебречь. Это не так. Другие области мозга имеют свою цен-
ность, готовить срезы из них и работать на них необходимо, хотя
часто это более трудоемкий процесс. И если исследователь ре-
шился работать с такими структурами, то он, по-видимому, должен
руководствоваться правилом: узнав внутреннюю организацию
области мозга, узнаешь ориентацию плоскости срезов.
Основное требование к этапу приготовления срезов заклю-
чается в аккуратности препарирования и быстроте. Необходимо
избегать сильного сжатия и растяжения выделяемой структуры.
Не имея возможности, из-за ограниченного объема главы, по-
дробно останавливаться на процессах выделения мозговых струк-
тур, мы лишь отметим, что выделение гиппокампа детально описы-
вается в работах Дингледин и соавторов (Dingledine et al., 1980),
Тейлера (Teyler, 1980), Шварцкроина (Schwarzkroin, 1981), гипо-
таламуса— в статье Хеттон и соавторов (Hatton et al., 1980),
латерального коленчатого тела — в статье Огава и др. (Ogawa
et al., 1980), мозжечка — в работе Ямамото и Савада (Yamamoto,
Sawada, 1981а).
2.4. СПОСОБЫ И УСТРОЙСТВА
ДЛЯ ПРИГОТОВЛЕНИЯ ОРИЕНТИРОВАННЫХ
ПЕРЕЖИВАЮЩИХ СРЕЗОВ МОЗГА
Устройства для приготовления срезов должны удовлетворять
следующим требованиям: а) минимально травмировать структуры
среза при его приготовлении; б) давать возможность изготовлять
срезы с определенным образом ориентированными структурами,
характерными для исследуемого отдела мозга; в) давать возмож-
ность получать достаточное количество срезов с мозга одного
животного; г) сводить к минимуму отклонения толщины срезов от
задаваемой величины.
32
Существует несколько способов и устройств для получения
переживающих срезов. Способы, рассмотренные в главе 1, чаще
используются в биохимических исследованиях. Для электрофизио-
логических экспериментов наиболее часто используются следую-
щие способы и устройства.
1. Изготовление срезов на вибротоме (Oxford Laboratories,
USA). По мнению Дингледина и соавторов (Dingledine et al.,
1980), этот способ дает хорошие результаты за счет того, что в срез
включаются структуры из соседних областей мозга, которые как бы
предохраняют структуры внутри среза. При помощи вибротома
можно сравнительно просто получить очень тонкие (менее
100 мкм) срезы, пригодные для проведения исследований с визу-
альным контролем отдельного нейрона и его отростков при помощи
микроскопа Номарского (Yamamoto, Chujo, 1978b).
2. Устройство, предложенное Даффи и Тейлером (Duffy,
Teyler, 1975), оказалось удобным для приготовления поперечных
срезов гиппокампа (Alger, Teyler, 1976; Teyler, 1980), срезов
гипоталамуса (Hatton et al., 1980) толщиной 400—500 мкм.
3. Устройство для приготовления переживающих срезов мозга
разработано одним из авторов этой книги совместно с С. П. Жили-
ным (Мокрушин, Жилин, 1983). Оно является модификацией
устройства Даффи и Тейлера, но в нем устранены недостатки
прототипа.
4. Специальный нож — блок лезвий, соединенных вместе. Эта
конструкция предложена Като и соавторами (Kato et al., 1981;
Kato, Ogawa, 1981). Она позволяет получать несколько срезов
одновременно.
Рассмотрим некоторые устройства подробнее. Принцип дейст-
вия станка Даффи и Тейлера заключается в следующем. Блок
ткани помещается на предметный столик, который перемещается
микровинтом перпендикулярно плоскости резания. Рычаг, к кото-
рому прикреплено лезвие безопасной бритвы, под действием силы
тяжести падает вниз и отделяет срез от блока ткани. Мы повторили
эту конструкцию и применили ее для изготовления поперечных
срезов гиппокампа. Оказалось, что она обладает рядом недостат-
ков. Среди них: травмирование срезов, возникающее вследствие
«подскока» рычага при ударе об ограничитель; трудность обеспе-
чения полного отсечения среза от блока; сложность изготовления
U-образной стойки.
Нами было сконструировано устройство для приготовления
срезов мозга, прототипом для которого послужил станок Даффи
и Тейлера (Мокрушин, Жилин, 1983). Схема устройства показана
на рис. 19. Отмеченные выше недостатки прототипа ликвидиро-
ваны следующим образом: а) устранен подскок рычага при ударах
об ограничитель — применен магнит 7 (рычаг 3 изготовлен из
железа); б) при помощи магнита сведены к минимуму латеральные
смещения рычага (соответственно и лезвия) при отсечении срезов,
поскольку, падая под действием собственной силы тяжести, рычаг
входит в магнитное поле, которое направлено так, что прижимает
3 Заказ 1012
33
Рис. 19. Устройство для получения переживающих срезов мозга.
1— основание; 2— лезвие безопасной бритвы; 3 — рычаг; 4 •—стойка, направляющая
движение рычага; 5 — стойка, на которой крепятся зажимы-держатели для крепления
винта; 6 — винт, ограничивающий подъем рычага; 7 — магиит; 8 — виит для крепления
лезвия к рычагу; 9 — виит, подающий столик; 10 — микровинт со шкалой; 11 — винтовые
зажимы для перемещения магнита; 12 — ось рычага. Объяснение в тексте.
рычаг к стойке 4 и заставляет двигаться его вдоль этой стойки
без латеральных отклонений; в) неполное отсечение среза устра-
нено вследствие изменения конструкции столика 9 так, что лезвие
2 может соприкасаться с поверхностью столика лишь на одну
треть своей длины. Кроме того, лезвие крепится к рычагу не жестко
на два винта, как в устройстве Даффи и Тейлера, а полужестко —
на один винт 8 через центральное отверстие в лезвии, что позволяет
при необходимости в процессе приготовления срезов быстро менять
его ориентацию, добиваясь параллельности кромки лезвия и по-
верхности столика.
Сконструированный резак применялся для получения попереч-
ных срезов гиппокампа крыс. За 1.5—2 мин удавалось изготовить
из одной половинки гиппокампа 10—15 срезов. Устройство легко
изготовить в лабораторных условиях. Так, в нашем варианте
реализация схемы, показанной на рис. 19, осуществлена с исполь-
зованием деталей стереотаксического прибора. Изготовить потре-
бовалось лишь рычаг 3, основание 1 и платформу подающего
34
Рис. 20. Устройство для приготовления переживающих
срезов мозга (по: Kato, Ogawa, 1981, с изменениями).
/ — ручка-держатель; 2 — прокладки между лезвиями; 3, 4 —
лезвия; стрелки — расстояние между лезвиями (0.7—1.0 м.м).
столика. Устройство легко и просто настраи-
вается, удобно и надежно в работе.
Для приготовления срезов из коры мозга
кошки Като и сотрудники (Kato et al., 1981;
Kato, Ogawa, 1981) применили специальный
нож, состоящий из 2—3 лезвий, скрепленных
вместе с расстоянием между ними 0.7—
1мм (рис. 20). Такой же способ использовали
Тайлен и Моллевангер для приготовления
поперечных срезов гиппокампа (Tielen, Mol-
levanger, 1982). Они использовали 5 скреп-
ленных между собой бритвенных лезвий
с расстоянием между ними в 400 мкм, полу-
чая сразу четыре среза. Данным способом можно быстро готовить
срезы, не извлекая необходимый для исследования отдел мозга.
К недостаткам этого способа следует отнести то, что получаемые
срезы всегда одной толщины, хотя нередко в эксперименте необхо-
димо применять срезы разной толщины. Последнее влечет за собой
изготовление «гребенки» с набором разных по величине прокладок
между лезвиями.
2.5. СРЕДА, ТЕМПЕРАТУРА И ВРЕМЯ ПРЕИНКУБАЦИИ
После изготовления срезы сразу же помещаются в инкубацион-
ную среду. Состав сред подробно обсуждался в предыдущей главе.
Здесь мы отметим лишь некоторые модификации составляющих
их компонентов, которые, как показали эксперименты^ оказывают
влияние на электрическую активность.
Прежде всего это касается концентрации ионов калия и каль-
ция. Концентрация калия в различных средах колеблется в преде-
лах 3—5.5 мМ (табл. 1). При инкубировании срезов в растворах
с повышенной концентрацией калия необходимо иметь в виду,
что он вызывает деполяризацию возбудимых тканей. Так, 6 мМ
концентрация ионов калия деполяризует клетки препириформной
коры и уменьшает их входное сопротивление (Scholfield, 1978а),
а в поперечных срезах гиппокампа приводит к возникновению
эпилептоформ ной активности (Ogata et al., 1976; Schwartzkroin,
Prince, 1978).
Оптимальной концентрацией ионов калия, как показывает
опыт, является 3.0—3.5 мМ (Dingledine et al., 1980). Такая
концентрация, не вызывая резкой деполяризации, поддерживает,
по-видимому, на должном уровне внутриклеточную концентрацию
калия.
3 *
35
Кальций оказывает существенное влияние на синаптическую
передачу. Чаще всего используется концентрация этого иона
в пределах 1.2—2.5 мМ. Снижение концентрации кальция до 0.8
и 0.27 мМ обратимо блокирует синаптическую передачу в поле САЗ
поперечных срезах гиппокампа (Yamamoto, 1972b). Регистрация
изменений концентрации кальция внутри гиппокампальных срезов
ионоселективными электродами также выявила зависимость эф-
фективности синаптической передачи от концентрации кальция
в инкубационной среде (Dingledine, Somjen, 1981).
В срезах обонятельной коры максимальная амплитуда ВПСП
возникала при концентрации ионов кальция 2.0 мМ. Дальнейшее
увеличение концентрации этого иона не сопровождалось ростом
ВПСП (Richards, Sercombe, 1970). Если допустить, что при такой
концентрации кальция потребности синаптической передачи
полностью удовлетворены, то становится понятным, почему макси-
мальная потенциация возникает при 2.5 мМ Са (Dunwidde,
Lynch, 1979).
Температура инкубационной среды является важным фактором
поддержания жизнедеятельности срезов: на первый взгляд, оче-
видным является то, что температура среды должна быть равна
температуре организма in vivo. Однако при исследовании зависи-
мости амплитуды вызванных ответов в срезах обонятельной коры
от температуры инкубационной среды выявилась закономерность:
потенциалы наибольшей амплитуды возникали при более низкой
температуре, равной 32 °C (30—34 °C), чем при 37 °C (Fujii,
Yoshizaki, 1976; Fujii, 1977). Возможно, в соответствии с этой
закономерностью некоторые исследователи работают на срезах
при этой температуре (White et al., 1978; Langmoen, Andersen,
1981; Воронин и др., 1984). Использование инкубационного раст-
вора с температурой 25 °C (Harvey et al., 1974; Scholfield, 1978a,
1978b) объясняется намерением уберечь внутренние структуры
толстых срезов (700 мкм) от гипоксии. Пока неясно, насколько
оправдана работа со срезами при сниженной температуре в плане
сравнения регистрируемых при этом данных с фактами, получен-
ными при температуре 37 °C.
Большинство исследователей начинают отводить электриче-
скую активность от срезов примерно через час после приготовления
и помещения их в инкубационную среду. Считается, что в этот
период срезы безжизненны. Их состояние сравнивается с распро-
страняющейся кортикальной депрессией (Teyler, 1980). Однако,
по данным Фуджи и Ешизаки (Fujii, Yoshizaki, 1976), через 5 мин
после начала инкубации в срезах обонятельной коры отчетливо
регистрируется пресинаптический (IS) компонент вызванного
ответа, т. е. распространение ПД по проводящим волокнам
(рис. 21). Синаптические процессы отчетливо появляются к 10 мин
инкубации. Об этом можно судить по наличию N-волны (рис. 21).
Ее амплитуда в дальнейшем растет, достигая максимума к 30 мин
(рис. 21). Пресинаптический компонент при этом не меняется.
Скорость достижения максимального постоянного уровня постси-
36
Рис. 21. Изменения амплитуды фокальных потенциалов обоня-
тельной коры, возникающих при стимуляции латерального
обонятельного тракта в срезах обонятельной коры (по: Fujii,
Yoshizaki, 1976, с изменениями).
1 — пресинаптический, 2 — постсинаптический компонент потен-
циала; а, б, в, г, д, е — вызванные потенциалы при различном
времени от начала инкубации до момента регистрации — 5, 10, 15,
30, 40, 60 мин соответственно. Калибровка: 1 мВ, 5 мс. Температура
инкубационного раствора 37 °C.
наптических ответов зависит от температуры. Она
максимальна при 37 °C. Приведенные данные сви-
детельствуют о том, что свежеприготовленные
срезы не мертвы, в них происходят активные процессы, направлен-
ные на восстановление функций нервной ткани. По нашему глубо-
кому убеждению процесс преинкубации, на который почти
не обращают внимания исследователи, может служить удобной
моделью для изучения процессов, возникающих при повреждении
нервной ткани in vivo, а также факторов, способствующих ее
восстановлению.
2.6. КОНТРОЛЬ ЖИЗНЕСПОСОБНОСТИ СРЕЗОВ
И ФОРМЫ ЭЛЕКТРИЧЕСКОЙ АКТИВНОСТИ,
РЕГИСТРИРУЕМОЙ В НИХ
Возникновение вызванного ответа на слабое электрическое
раздражение — важнейший критерий хорошего состояния среза
(Dingledine et al., 1980). Увеличение интенсивности стимуляции
должно сопровождаться возрастанием амплитуды популяционного
спайка и снижением латентного периода. При плохом состоянии
среза увеличение интенсивности приводит лишь к незначительному
росту амплитуды ответов. Очень пло-
хое состояние среза характеризуется
отсутствием роста амплитуды ответа
и неизменностью латентного периода
при возрастании интенсивности сти-
муляции (Dingledine et al., 1980).
Рис. 22. Фокальные потенциалы в препири-
формной коре, возникающие при стимуля-
ции ЛОТ в срезах обонятельной коры (по:
Richards, 1981, с изменениями).
А — схема потенциала и его компонентов. 1 —
схема потенциала действия ЛОТ; 2 — отметка
раздражения; 3 — популяционный ВПСП; 4 —
популяционные спайки; черта справа — поляр-
ность колебаний.
13 — оригинальная запись потенциала. Калиб-
ровка: 2 мВ, 2 мс. Объяснение в тексте.
37
4
1
Поскольку тормозные процессы наиболее чувствительны ко
всякого рода повреждениям, то именно они могут служить тонким
критерием состояния среза. Так, Дингледин и соавторы (Dingle-
dine et al., 1980) отмечают, что исчезновение возвратного тормо-
жения в поперечных срезах гиппокампа, возможно, сигнализирует
о серьезных нарушениях в срезе.
О хорошем функциональном состоянии среза можно судить,
если надежно отводится спонтанная нейрональная активность.
При внутриклеточном отведении величина мембранного потен-
циала вследствие его флуктуации, по-видимому, не может быть
надежным показателем состояния среза. Лишь генерация потен-
циала действия (с овершутом), его длительность, возникновение
возбуждающих или тормозных постсинаптических потенциалов
может свидетельствовать о хорошем состоянии среза.
Убедившись в том, что срез мозга находится в хорошем
состоянии, исследователь может в течение длительного времени
регистрировать вне-, внутриклеточную активность и фокальные
потенциалы. Рассмотрим последние более детально. Такие потен-
циалы отводятся металлическими или стеклянными микроэлектро-
дами с диаметром кончика до 10—20 мкм. По форм? они анало-
гичны вызванным потенциалам, отводимым in vivo в ответ на
стимуляцию афферентных нервов. Так, при раздражении латераль-
ного обонятельного тракта фокальный потенциал, регистрируемый
в препириформной коре, имеет вполне характерный вид (рис. 22).
Составными элементами этого потенциала является первоначаль-
ная позитивно-негативная волна. За ней следует отрицательное
колебание, на которое накладываются одна или более положитель-
ных волн. Проведенный анализ таких ВП показал, что начальная
двухфазная волна является составным потенциалом действия ЛОТ
и отражает распространение ПД по аксонам, формирующим этот
тракт. Отрицательная волна отражает синхронную деполяризацию
апикальных дендритов пирамидальных клеток в ответ на раздра-
жение, приходящее через ЛОТ, и свидетельствует о возникновении
локального возбуждения в нейронах. Ее, следовательно, можно
рассматривать как популяционный ВПСП. Позитивные волны
свидетельствуют о синхронном разряде пирамидальных нейронов
в ответ на приходящее раздражение. Они обозначаются как
популяционные спайки.
Таким образом, в ВП выражены все три компонента прохожде-
ния возбуждения: пресинаптический потенциал действия, синапти-
ческая волна (ВПСП популяции) и разряд клеток (популяцион-
ные спайки), поэтому фокальный потенциал является удобным и
надежным индикатором для исследования физиологии и фармако-
логии Процессов возбуждения в срезах мозга.
38
ГЛАВА 3
ОСНОВНЫЕ НАПРАВЛЕНИЯ ИСПОЛЬЗОВАНИЯ
СРЕЗОВ МОЗГА ДЛЯ НЕЙРОФИЗИОЛОГИЧЕСКИХ
ИССЛЕДОВАНИЙ
В настоящее время методика изучения мозга in vitro приме-
няется в электрофизиологических и нейрофармакологических ис-
следованиях, а также при моделировании поведенческих реакций.
Ограниченный объем главы не позволяет проанализировать все
работы, в которых используется методика исследования на срезах
(их число резко возросло в последние годы). Мы включили
только те публикации, которые, как нам представляется, наиболее
полно иллюстрируют возможности такого исследования.
3.1. ЭЛЕКТРОФИЗИОЛОГИЧЕСКИЕ ИССЛЕДОВАНИЯ
3.1.1. Общая характеристика функционирования
нейронов в переживающих срезах мозга
В табл. 4, не претендующей на исчерпывающую полноту
данных, приведены основные электрофизиологические характери-
стики нейронов в переживающих срезах из разных отделов мозга.
Видно, что МП разных нейронов варьирует в довольно широких
пределах 40—85 мВ, но чаще встречаются нейроны, обладаю-
щие МП, равным 50—70 мВ. На орто- и антидромную стимуляцию,
подпороговой для возникновения ПД величины, в клетках возни-
кает локальное возбуждение в виде ВПСП. Амплитуда и длитель-
ность ВПСП в разных нейронах неодинаковы, что, по-видимому,
связано, с одной стороны, со свойствами активируемой синапти-
ческой передачи, а с другой — с интенсивностью стимуляции.
При возрастании силы раздражения клетка генерирует один или
несколько ПД. Они могут возникать из ВПСП нли без него,
непосредственно от базовой линии МП (Langmoen, Andersen,
1981). Амплитуда ПД у большинства нейронов составляет 60—
80 мВ, при общем диапазоне значений 38—100 мВ. Спайки имеют
длительность 1.6—3 мс, а в обонятельной коре и гипоталамусе —
3—4 мс (Scholfield, 1978а, 1981; Yamashita, Inenaga, 1983). При
внутриклеточном отведении вслед за ПД регистрируется следовой
деполяризационный потенциал. Входное сопротивление мембраны
колеблется в пределах 20—50 Мом. Для клеток обонятельной
39
Таблица 4
Основные электрические характеристики нейронов в срезах мозга
Область мозга, из кото- рой изготовлены срезы; нейроны, в которых производилась регистрация Мембран- ный потен- циал, мВ ВПСП Потенциал действия Входное сопротив- ление мембраны, Мом Источник
Ампли- ' туда, мВ Длитель- ность, мс Ампли- туда, мВ Длитель- ность, мс
Спинной мозг, мото- нейроны Дорсальное ядро шва н периакведук- тальное серое ве- щество Гиппокамп, пира- мидные клетки поля СА1 72 + 5.0 57.7 + 1.1 54.3± 11.7 До 10 Около 20 84 + 8.2 60± 11.2 34 ± 11 190± 13 39± 10 Takahashi, 1978 Passive membrane. . 1983 Schwartzkro- in, 1975
Гиппокамп, пира- мидные клетки поля СА1 63 + 6 Длитель- ность до макси- мальной величины 3—10 71 ± 9 1.6—1.9 31 ± 12 Langmoen, Andersen, 1981
Гиппокамп, пира- мидные клетки поля СА1 Гиппокамп, нейроны поля САЗ Гиппокамп, нейроны поля САЗ Гиппокамп, нейроны поля САЗ 66.7 ± 12.0 40—60 49.7± 1.35 60—80 До 20 1—4 10 2—12 20—70 20—30 68.7± 12.4 60 53.7 ± 2.01 Более 50 1.6—3.0 32.8± 10.8 Wheal, 1981 Воробьев, Скребицкий, 1978 Misgeld et al.. 1979 Yamamoto, 1982
Гиппокамп, грану- лярные клетки 50—70 До 20 До 25 70— 120 57.2 Assaf et al., 1981
Гиппокамп, грану- лярные клетки 45—67 5—10 До макси- мума — 3 80—90 40.2±8.2 Frike, Prince. 1984
Гипоталамус, нейро- гипофизарные и ту- беринфундибуляр- ные нейроны Обонятельная кора Гипоталамус, ней- роны супраоптиче- ского ядра Мозжечок, клетки Пуркинье Латеральное колен- чатое тело Таламус 50—65 70—85 50—70 66.7±2.37 55 + 2 (У крыс) 44±2 (у кошек) 64±5 10 10—15 55—90 100 50—90 74.9 ±5.77 42 ± 1.5 (У крыс) 38±4 (у кошек) 80±7 2.2—3.3 4 70—180 70— 180 42 + 18 Bourque, Re naud, 1983a. 1983 b Constant!, Galvan, 1983 Yamashita, Inenaga, 1983 Llinas, Sugi- mori, 1980a Godfraind, Kelly, 1981 Jahnsen, Lli- nas, 1984
Зрительная кора Сенсо-моторная об- ласть коры 57.6 75 36.4 72 93.5 42.1 Kato et al., 1979 Connors et al., 1982
Обонятельная кора, нейроны препири- формной области 75.4±2.7 До 30 20—30 66—97 3—4 9—280 Scholfield, 1978a, 1978b, 1981
Клетки V слоя цин- гулярной коры 60±0.68 2.5 5—10 50±0.3 47±4.75 Vogt, Gor- man, 1982
40
коры этот диапазон равен 9—280 Мом (Scholfield, 1978а, 1981).
ТПСП возникает в нейронах при орто- и антидромной стимуляции
(см. ниже).
Некоторые нейроны в срезах мозга обладают спонтанной
активностью (Skrede, Westgaard, 1971; Брагин и др., 1977а,
19776), у других она отсутствует. В различных структурах мозга
соотношение спонтанно активных и «молчащих» клеток различно.
Так, по данным Миллера (Miller, 1981), в септуме преобладают
спонтанноактивные нейроны, тогда как в стриатуме до 78 %
молчащих клеток. Следует отметить, что спонтанная активность
нейронов может свидетельствовать о наличии в них5пейсмекерного
механизма. Это, по нашему мнению, может быть интересной
темой исследований на срезах.
Таким образом, нейроны переживающих срезов мозга обла-
дают принципиально теми же электрическими характеристиками,
что и нейроны целого мозга. К сожалению, провести точный
сравнительный анализ электрофизиологических характеристик
in vivo и in vitro чаще всего невозможно из-за малочисленности
и противоречивости сведений, полученных in vivo, что связано
с определенными методическими трудностями.
Из общей массы данных по электрофизиологии нейрональных
элементов и процессов в срезах мы ограничимся теми, которые,
как можно думать, дают определенный «прирост» к существую-
щим знаниям, или теми, о которых в условиях целого организма
можно судить только по косвенным данным.
3.1.2. Дендритные потенциалы
Способна ли мембрана дендритов возбуждаться и проводить
импульсы? — один из наиболее трудных вопросов нейрофизиоло-
гии. Наличие обширных дендритных ветвлений характерно для
многих нейронов головного мозга. Это заставляет думать, что они
должны играть определенную роль в интегративной деятельности
нейрона. Однако слишком малые размеры дендритов (диаметр
дендритов в молекулярном слое зубчатой фасции гиппокампа
на расстоянии 100—150 мкм от клеточного слоя не превышает
0.5—2 мкм; Frike, Prince, 1984) вызывали сомнение в их способно-
сти генерировать и проводить ПД, пока Хилду и Тасаки (Hild,
Tasaki, 1962) на культуре ткани мозжечка при внутриклеточном
отведении не удалось показать способность дендритов клеток
Пуркинье генерировать и проводить импульсы.
Срезы мозга являются исключительно удобным эксперимен-
тальным объектом для изучения электрофизиологии Дендритов
различных типов клеток. Первые сообщения о внутридендритном
отведении потенциала при помощи микроэлектрода появились
сравнительно недавно (Wong et al., 1979; Wong, Prince, 1979).
Как и следовало ожидать, функциональные характеристики мемб-
ран дендритов и сомы пирамидных нейронов поперечных срезов
гиппокампа, на которых проводились данные исследования, оказа-
лись различными. Если спонтанные вспышки разрядов являлись
доминирующими признаками активности в дендритах, то для тела
клетки были характерны одиночные разряды. Деполяризационный
импульс тока, пропущенный через дендритную мембрану при
помощи микроэлектрода, сопровождался появлением регулярных
вспышек разрядов по закону «все или ничего». Такое же воздей-
ствие на сому приводило к ритмической спайковой активности
только в период прохождения тока, при этом вспышки разрядов
наблюдались как исключение.
Ортодромная стимуляция подпороговой интенсивности для
генерации ПД вызывала возникновение ВПСП или ВПСП—ТПСП
в дендритах. При надпороговом синаптическом раздражении гене-
рировался спайк из высокоамплитудного ВПСП. Высокая скорость
последующей реполяризации указывает на активные (а не пассив-
ные) генератив.ные свойства дендритной мембраны. Отсутствие
вспышек разрядов в дендритах при ортодромной стимуляции
объясняется возникновением ТПСП в дендритах. В ответ на
деполяризационный импульс дендритная мембрана генерирует
вспышки разрядов. Активные свойства дендритной мембраны
обнаружены также и в гранулярных клетках в срезах гиппокампа
(Frike, Prince, 1984).
Особенно наглядно преимущество срезов при изучении электро-
физиологии дендритов проявилось в опытах Линас и Сугимори
(Llinas, Sugimori, 1980b). Они использовали, пожалуй, все
реально возможные достоинства этого метода в сочетании с дру-
гими приемами. Исследование проведено на тонких (менее
100 мкм) срезах мозжечка. Используя соответствующую оптику,
исследователи точно вводили микроэлектрод в желаемые точки
ден/ штного ветвления клетки Пуркинье. Возникающие при этом
реакции на деполяризационную стимуляцию через микроэлектрод
показаны на рис. 23. На уровне тела клетки отчетливо видны как
быстрые, так и медленные спайки. Быстрые спайки прогрессивно
затухают при удалении микроэлектрода от тела клетки, что свиде-
тельствует об их пассивном распространении по дендритам. Мед-
ленные дендритные потенциалы предельно выражены при макси-
мальном удалении от тела клетки, хотя и видны в разрядах на
соматическом уровне. Это, видимо, доказывает их активное прове-
дение по дендритам в сторону сомы. Детальный анализ ионных
процессов регистрируемой активности показал, что дендритная
активность осуществляется ионами Са, поскольку дендритные
разряды исчезали при замене в инкубационной среде Са на Со,
Мп — блокаторов кальциевых каналов или при перфузии срезов
бескальциевым раствором. При перфузии раствором с тетродоток-
сином дендритные разряды не исчезали. Быстрые спайковые
разряды, регистрируемые на уровне тела клетки Пуркинье, бло-
кировались тетродотоксином или перфузией раствором без ионов
Na, что доказывает «натриевую» природу «соматических» разря-
дов.
42
Рис. 23. Внутриклеточная запись потенциалов сомы и дендритов клетки Пуркинье
в срезах мозжечка, возникающих при пропускании деполяризующего тока через
регистрирующий электрод (по: Llinas, Sugimori, 1980b, с изменениями).
а — схема клетки Пуркинье с дендритными отростками; линия сверху — условная поверх-
ность мозжечка. 6, в, г — записи внутридендритных потенциалов в соответствующих
точках (показаны пунктиром) дендритного дерева; д — потенциалы в соме клетки. Калиб-
ровка: 20мВ, 50 мс. Объяснение в тексте.
Таким образом, на срезах получены убедительные и достовер-
ные сведения об активных процессах, происходящих в денд-
ритах.
Нельзя утверждать, что процессы, происходящие в дендритах,
невозможно изучать in vivo. Однако проведение таких исследова-
ний сопряжено с немалыми методическими трудностями, особенно
при внутридендритном отведении, и связано прежде всего с труд-
ностью локализации положения кончика микроэлектрода и его
неустойчивым состоянием вследствие пульсации мозговой ткани.
Первая попытка регистрации внутридендритных потенциалов in
vivo была осуществлена Вуди и сотрудниками (Woody et al.,
1984). Они обнаружили, что при отведении активности от сомы
клеток III и V слоев моторной коры кошки генерировались ПД
с овершутом, тогда как в (предполагаемых) дендритах регистри-
руемые ПД не демонстрировали овершута. Амплитуда ПД была
тем меньше, чем ниже был МП дендритной мембраны. Исследова-
тели пришли к выводу, что дендриты кортикальных нейронов
не обладают активными электрическими свойствами, а ПД, генери-
руемые в соме или в структурах вблизи нее, распространяются
в дендриты пассивно-электротонически. Является ли способность
дендритов мозжечка и гиппокампа к активным процессам приви-
43
легией этих структур или это общая закономерность деятельности
дендритов в центральной нервной системе — еще предстоит выяс-
нить в будущих исследованиях. Однако несомненно одно: эффек-
тивность таких исследований выше при использовании срезов,
чем изучение их in vivo.
3.1.3. Тормозные постсинаптические потенциалы
Теоретически торможение может осуществляться либо в ре-
зультате смещения мембранного потенциала в сторону деполяри-
зации, либо в направлении гиперполяризации. Исследование этих
процессов в настоящее время проводится на срезах. Гиперполя-
ризационные ТПСП надежно регистрируются в срезах гиппокампа
(Dingledine, Langmoen, 1980; Langmoen, Andersen, 1981), лате-
рального коленчатого тела (Ogawa et al., 1980; Godfraind, Kelly,
1981), зрительной коры (Kato et al., 1979b).
В срезах гиппокампа гнперполяризационные ТПСП в пирамид-
ных клетках возникают при стимуляции альвеолярных волокон.
Однако, как показали опыты, при изготовлении среза лезвие
должно быть ориентировано не под обычным углом 15—20°,
а под углом 35—45° к длинной оси гиппокампа. Только в этом
случае в пирамидных клетках возникают ТПСП (Dingledine,
Langmoen, 1980; Dingledine et al., 1980). Такую закономерность
можно объяснить особой локализацией нейрональных элементов,
ответственных за возникновение тормозных процессов. По-види-
мому, редкую регистрацию ТПСП в срезах латерального колен-
чатого тела при активации оптического тракта можно объяснить
неудачной ориентацией плоскостей среза (Godfraind, Kelly, 1981).
Характеризуя гиппокампальные ТПСП, полученные in vitro,
следует отметить, что их амплитуда и длительность меньше, чем
in vivo. Так, длительность ТПСП in vitro составляла 50—150 мс,
тогда как в условиях in vivo она достигала 600 мс. Амплитуда
in vitro не превышала 30—60 % максимально возможного уровня.
Тем не менее ТПСП эффективно блокировал спонтанную актив-
ность клетки на период, равный длительности ТПСП (Dingledine,
Langmoen, 1980). При исследовании механизма тормозного дейст-
вия ТПСП было показано, что он смещает МП в сторону реверсив-
ного потенциала и это надежно тормозит клетку следующими
двумя способами: во-первых, удаляет МП от критического уровня
деполяризации и, во-вторых, уменьшает амплитуду ВПСП (Lang-
moen, Andersen, 1981).
Деполяризационная природа торможения в головном мозге,
по-видимому, впервые была продемонстрирована в срезах обоня-
тельной коры Шолфилдом (Scholfield, 1978b). Было показано; что
при стимуляции латерального обонятельного тракта в поверх-
ностно расположенных нейронах регистрировался ВПСП и спайк,
вслед за которым возникал длительный (200—500 мс) следовой
деполяризационный потенциал с амплитудой 5—16 мВ. Стойкая
44
деполяризация блокировала клеточную активность и деполяриза-
ционный импульс тока, пропущенный через микроэлектрод, нахо-
дящийся в клетке, увеличивал деполяризацию, хотя та же вели-
чина тока в контроле вызывала генерацию ВПСП и спайка.
Деполяризационный ТПСП генерировался и без предшествующего
спайка, он угнетался при повторной стимуляции латерального
обонятельного тракта как при увеличении концентрации ионов Mg,
так и при снижении концентрации Са в перфузионном растворе.
Ионы С1 оказали наибольшее влияние на развитие деполяриза-
ционного ТПСП, поскольку перфузия среза раствором с минималь-
ным содержанием ионов С1 (не более 23 мМ) приводила к воз-
растанию и пролонгированию ТПСП.
Таким образом, эти данные свидетельствуют о существовании
деполяризационного торможения как активного специфического
вида торможения. Есть все основания полагать, что клетки обоня-
тельной коры — не единственные структуры в центральной нервной
системе, в которых существует эта форма торможения. Свидетель-
ством тому является возникновение деполяризационных ТПСП
в пирамидальных клетках срезов гиппокампа при перфузии его
инкубационным раствором, содержащим барбитураты (Alger,
Nicoll, 1982). Такие ТПСП возникают только при ортодромной
стимуляции, блокируются при подведении к нейронам бикукуллина
и увеличиваются при пониженной температуре инкубационного
раствора (22 °C).
3.1.4. Миниатюрные постсинаптические потенциалы
Характерной чертой синаптической передачи является спонтан-
ный выброс небольшого числа квантов медиатора. Этот процесс
происходит в отсутствии импульса, нерегулярен, устойчив к увели-
чению концентрации ионов Mg и к действию тетродотоксина.
При внутриклеточном отведении это явление регистрируется в виде
деполяризационных колебаний потенциала небольшой амплитуды
и длительности — миниатюрных возбуждающих постсинаптиче-
ских потенциалов (мВПСП), зарегистрированных, например,
в нейронах спинного мозга (Katz, Miledi, 1963).
Переживающие срезы, вероятно, наиболее адекватный объект
для наблюдения мВПСП в структурах головного мозга.
мВПСП отчетливо регистрируются при внутриклеточном отве-
дении от клеток срезов гиппокампа и проявляются в деполяриза-
ционных колебаниях МП, напоминающих ВПСП (Brown et al.,
1979). Амплитуда мВПСП доходит до 10 мВ, длительность
не превышает 5—10 мс (рис. 24). Одновременное введение в среду
тетродотоксина для блокирования генерации спайков и МпС12 для
блокады синаптической передачи не сопровождается полным ис-
чезновением мВПСП, а приводит к уменьшению числа мВПСП
и снижению их амплитуды (рис. 24).
45
Рис. 24. Синаптические потенциалы
в клетках поля САЗ срезов гиппокампа
(по: Brown et al., 1979, с изменениями)..
А — спонтанная синаптическая активность
и синаптические потенциалы (отмечены
звездочкой), возникающие в ответ на сти-
муляцию гранулярных клеток. Срез перфу-
зируется стандартным раствором. Для
предотвращения возникновения ПД МП ре-
гистрируемой клетки гиперполяризован до
70 мВ. Б — спонтанные миниатюрные по-
тенциалы в клетке через 3 ч после начала
перфузии среза стандартным раствором, со-
держащим тетродотокснн и МпС12. Калиб-
ровка: 5 мВ, 50 мс.
Таким образом,эти данные,
впервые полученные в структу-
рах головного мозга, доказы-
вают существование спонтан-
ного выброса медиатора при
отсутствии прихода ПД в си-
напс. Возможно, что подобные
мВПСП можно зарегистриро-
вать и в других отделах голов-
ного мозга и их исследование
будет способствовать пониманию
квантовой природы выделения
медиатора в центральных си-
напсах.
3.2. ФАРМАКОЛОГИЧЕСКИЕ ИССЛЕДОВАНИЯ
Срез мозга является весьма удобным объектом для изучения
действий широкого спектра биологически активных соединений
иа различные виды электрогенеза. Это обусловлено тем, что
.в срезе отсутствует гематоэнцефалический барьер и исследуемое
вещество доходит до мембран клеток среза.
По способу подведения изучаемых веществ к срезу все много-
численные работы в этом направлении можно разделить иа две
основные группы. В первой из них используется метод введения
вещества в перфузионный раствор. Во второй применяется метод
локального подведения фармакологических веществ к нейрону,
чаще при помощи микроэлектрофореза, реже из микроэлектрода
под давлением. В некоторых работах комбинируются оба указан-
ных метода.
46
\ sc 3.2.1. Метод введения фармакологического н 1
\ вещества в перфузионный раствор «
\ . К
\ Сравнительная простота введения изучаемого вещества в раст-
вор без специальных сложных устройств, возможность точной
дрзировки вводимого фармакологического агента, широкий класс
используемых веществ, в том числе и газообразных — вот те пре-
имущества, благодаря которым данный метод интенсивно исполь-
зуется в фармакологических исследованиях.
Для получения качественных эффектов того или иного веще-
ства оно просто вводится с помощью шприца, пипетки в перфу-
зионную жидкость или в предкамеру, илн в рабочую камеру, прн
этом регистрируется вызванная или спонтанная активность ней-
ронов.
Точная количественная оценка действия фармакологических
агентов требует определенной экспозиции среза в среде. Время,
через которое изучаемый раствор достигнет среза, легко выяснить,
добавив краситель в перфузионный раствор. Если скорость пер-
фузии не меняется от опыта к опыту, то это время будет постоянно
и нет необходимости проверять его перед каждым экспериментом.
Соответствует ли концентрация исследуемого вещества в рас-
творе концентрации его внутри структур среза и как быстро на-
ступает это равновесие? На эти вопросы нельзя дать однозначного
ответа. В экспериментальной практике обычно принято считать,
что фармакологические агенты при перфузии среза одинаково
быстро достигают всех структур среза. С теоретической точки
зрения диффузия фармакологических веществ в различные струк-
туры среза неодинаково зависит от ряда факторов: коэффициента
диффузии данного вещества в мозговой ткани, плотности «упа-
ковки» и биохимических особенностей нейрональных элементов
в конкретных местах среза. В поле СА1 гиппокампа клеточные
тела расположены близко друг к другу по сравнению с расположе-
нием клеток в поле САЗ. Эти анатомические особенности непре-
менно должны влиять на диффузию фармакологических агентов.
При изучении действия ГАМК на нейроны в срезах обонятель-
ной коры обнаружилась различная чувствительность к агенту
поверхностных и глубоких нейронов. Нейроны, расположенные
близко к поверхности, оказались более чувствительными, чем ней-
роны внутри среза (Galvan, Scholfield. 1978). Радиоизотопные
исследования показали сильное поглощение ГАМК внутри ткани
(Brown et al.. 1980Е Таким образом, в приведенном примере
различная реакция нейронов среза объясняется тем, что поверхно-
стные нейроны, поглощая ГАМК, все же отчетливо реагировали
на это вещество за счет притока его из раствора, тогда как нз-за
сильного поглощения последующими слоями клеток концентрация
этого вещества внутри среза была явно меньшей, чем в растворе.
Метод введения вещества в раствор и изучение его воздействия
на электрические реакции в срезе широко используется в экспери-
47
ментальной практике и позволяет получать интересные резуль-/
тэты. /
Влияние фармакологических агентов на электрическую ак1
тивность срезов методом их введения в раствор изучается при
внеклеточном, внутриклеточном отведении и при регистрации
фокальных потенциалов. При отведении активности от клетки
исследуются все те процессы, которые развиваются на уровне от-
дельного нейрона. Реакцию клеточной популяции на исследуемое
вещество можно изучить при отведении фокальных потенциалов.
Этот метод регистрации позволяет провести анализ изменений
пре- и постсинаптических процессов раздельно и выявить те из них,
на которые оказывает влияние данный фармакологический агент.
Наглядный пример такого анализа дан в работе Ричардса (Ri-
chards, 1973, 1981). В этих опытах изучалось влияние 0.4—2%
газовой смеси галотана с карбогеном на электрическую активность
срезов обонятельной коры. Срезы непрерывно перфузировались,
а сверху к ним подавалась газовая смесь с галотаном. При сти-
муляции латерального обонятельного тракта в препириформной
коре возникали потенциалы, в которых четко различался потен-
циал действия волокон ЛОТ, ВПСП и популяционный спайк
(рис. 25). Изменение амплитуд этих потенциалов анализировалось
отдельно. Из приведенного рис. 25 видно, что галотан вызывал
явное уменьшение амплитуд популяционного спайка и ВПСП,
тогда как амплитуда потенциала действия ЛОТ не изменялась.
Как можно интерпретировать полученные результаты? Совер-
шенно очевидно, что галотан не оказывает влияния на синхронную
афферентную волну ЛОТ, так как амплитуда и длительность ее
не меняются при воздействии галотана и они остаются стабиль-
ными на протяжении всего времени наблюдения. Кроме того,
стабильность потенциала действия ЛОТ свидетельствует о том, что
число активированных синапсов сохранялось неизменным.
Депрессия ВПСП указывает на уменьшение эффективности
синаптической передачи, которое может выражаться в уменьшении
выделения медиатора в ответ на приходящий импульс.
Снижение амплитуды популяционного спайка свидетельствует
о том, что общее число нейронов, генерирующих ПД, со временем
уменьшается. Другие нейроны, хотя и возбуждаются, но ВПСП
в иих является подпороговым для генерирования ПД.
Исходя из различного реагирования нейронов на галотан
(возникновение ПД и его отсутствие), можно допустить наличие
по крайней мере двух популяций синапсов, отличных по скорости
реагирования на анестетик. Одна популяция синапсов быстро
реагирует на воздействие галотана и их эффективность падает,
другая — резистентна к действию галотана и продолжает функ-
ционировать. Поиск таких типов синапсов был бы, как нам
представляется, интересным продолжением этих исследований.
Считается установленным и общепринятым фактом существо-
вание зависимости центральной синаптической передачи от кон-
центрации ионов Са' и Mg, которые являются компонентами
48
Рис. 25. Влияние галотана (0.8—1.0 %) на амплитуду различных компонентов
фокальных потенциалов, возникающих при стимуляции ЛОТ (по: Richards, 1973,
1981, с изменениями).
А — компоненты фокального потенциала, амплитуда которых измерялась в эксперименте;
Б—изменение величины популяционного спайка (2); В—изменение амплитуды потен-
циала действия ЛОТ (3), популяционного ВПСП (1) и напряжения галотана в газовой
среде, подаваемой на срез (4). По оси абсцисс: время, мни. По оси ординат: величина
первого популяционного спайка, условные единицы (5); амплитуда ВПСП н ПД ЛОТ,
мВ (В, слева) и концентрация галотана в газовой струе, % (В, справа).
перфузионных растворов. Перфузируя срезы обонятельной коры
растворами с различной концентрацией Са и регистрируя фокаль-
ные потенциалы, удалось показать зависимость эффективности
синаптической передачи от концентрации этих ионов. Она оказа-
лась сигмовидной (Richards, Sercombe, 1970). Перфузия среза
раствором с низким содержанием Са или без него приводила к об-
ратимому блокированию синаптической передачи. Увеличение
концентрации Са вызывало прогрессивное пропорциональное
возрастание N-волны, которая свидетельствовала о росте синапти-
ческой эффективности. Плато возникало при концентрации
Са 2—3 мМ. Mg действовал противоположным образом: обратимо
блокировал синаптическую передачу при увеличении его концен-
трации. Кривая такой зависимости имела почти экспоненци-
альный вид. N-волна и, соответственно, синаптическая передача
полностью блокировались при 10 мМ концентрации Mg.
4 Заказ 1012
49
Такие конкурентные влияния ионов Са и Mg на синап-
тическую передачу были впоследствии подтверждены при
исследовании на поперечных срезах гиппокампа (Yamamoto,/
1972а; White et al., 1978) и срезах обонятельной коры (Schol-
field, 1981).
Методика введения веществ в перфузионный ток позволяет
построить кривые доза—эффект. Такие исследования дают воз-
можность установить нелинейные зависимости электрической
активности от концентрации изучаемого вещества. Так, в недавнем
исследовании было показано, что введение в перфузионный
раствор 5 мкМ норадреналина сопровождается ростом амплитуды
популяционного спайка в срезах гиппокампа, 10—25 мкМ
концентрация агента вызывала фазные реакции — первоначаль-
ное увеличение амплитуды популяционного спайка с последующим
его угнетением. Дальнейшее возрастание концентрации
норадреналина (50 мкМ) сопровождалось только угнетением
регистрируемого спайка (Mueller et al., 1981). Описанный метод
позволяет исследовать в срезах мозга эффекты различных ве-
ществ, определять место и механизм их действия, вести целена-
правленный поиск новых лекарственных препаратов.
3,2.2. Подведение веществ методом микроэлектрофореза
Метод введения фармакологических веществ в раствор, омы-
вающий препарат, имеет тот недостаток, что исследуемое вещество
оказывает влияние на все структуры среза. Изучение реакций
отдельной клетки, идентификация медиатора, локализация хими-
ческих рецепторов на теле и отростках нейрона, установление
морфологической и физиологической связи между отдельными
нейронами — эти и другие задачи можно решать методом микро-
электрофоретического подведения веществ, и он с успехом исполь-
зуется в исследованиях на срезах.4 Идентификация медиаторов
в мозговых структурах остается одной из самых важных проблем
современной нейрофизиологии. Не представляется реальной воз-
можности проанализировать все исследования по этому вопросу. '
Думается, что было бы правильным продемонстрировать на
конкретном примере преимущества применения микроэлектрофо-
реза на срезах мозга. Это наиболее отчетливо видно из исследо-
ваний, проведенных японскими учеными (Chujo et al., 1975).
Теоретическая основа этих исследований заключалась в предпо-
ложении о различной региональной чувствительности к глутамату
сомы и апикальных дендритов клеток Пуркинье мозжечка. Эту
гипотезу можно проверить методом локальной аппликации глута-
4 Методы изготовления электродов, их заполнение исследуемым веществом,
описание устройств, расчет концентрации подводимых агентов и многие другие
вопросы, относящиеся к методу микроэлектрофореза, читатель найдет в руковод-
ствах Первис (Purves, 1983) и Александрова (1983).
50
1 NIIIIIIIIIIWMMIIIIlrtlllllllllllllllll
4
Рис. 26. Реакции клетки Пуркинье в срезах мозжечка при ионофоретической
аппликации L-глутамата (по: Chujo et al., 1975, с изменениями).
А — схема эксперимента. Внеклеточная активность отводилась от тела клетки электродом,
положение которого не менялось. Локализация ионофоретического электрода относи-
тельно мембраны клетки: / — электрод касается мембраны сомы нейроиа, 2 — расстояние
15 мкм, 3 — 30 мкм, 4 и 5 — электрод касается основного дендритного отростка, 6 -- 40 мкм,
7 — 40 мкм, 8 — 35 мкм. Б — осциллограммы, соответствующие локализации ионофоре-
тического электрода на А. Черта внизу — время аппликации глутамата. Калибровка:
0.5 мВ, 0.2 с. Объяснение в тексте.
мата к различным участкам нейрона. Хотя при изучении чувстви-
тельности пирамидных клеток гиппокампа подобный метод уже
применялся ранее (Dudar, 1974) и использовался впоследствии
(Schwartzkroin, Andersen, 1975; Richards, 1978; Yamamoto, 1978;
Langmoen, Andersen, 1981), но рассматриваемое исследование
японских физиологов имеет то преимущество, что они использо-
вали оптику Номарского (Х40, ЙД40/0.650, Carl Zeiss), которая
дает возможность рассмотреть отдельный нейрон и его части.
Схема опыта представлена на рис. 26. Ионофоретическая аппли-
кация L-глутамата вызывала учащение разрядов только при
непосредственной близости пипетки к соме нейрона, точнее на
границе сомы и дендритного отростка. Удаление ионофорети-
ческой пипетки на расстояние 30 мкм от нейрона не вызывает его
реакции, хотя время аппликации вдвое больше, чем в первом
случае. Сильная активация клетки Пуркинье возникала при аппли-
кации глутамата к основному дендритному отростку, причем она
возрастала при аппликации к дистальным участкам дендрита.
Чтобы сопоставить чувствительность сомы и дендритов, глута-
мат апплицировали к базальной части клеточного тела и в области
главного дендритного ветвления. В первом случае реакция была
слабой. Во втором, напротив, возникало резкое учащение клеточ-
ных разрядов. Эти данные свидетельствуют о более высокой
чувствительности дендритов, чем тела клетки. Кроме того, они
4 * 51
Г
Рис. 27. Клетка Пуркинье в срезе мозжечка (по: Yamamoto, Sawada, 1981а).
1 — тело нейрона, 2 — отросток клетки. Фотография сделана с применением оптики
Номарского. Толщина среза 70 мкм. Масштаб: 20 мкм.
указывают на то, что рецепторы глутамата локализованы глав-
ним образом в области дендритных ветвлений.
В этой работе, к сожалению, не приводится фотографии
наблюдаемых в эксперименте нейронов. Для иллюстрации приме-
нения оптики Номарского на рис. 27 воспроизведена фотография
клетки Пуркинье в срезе мозжечка, заимствованная из работы
Ямамото и Савада (Yamamoto, Sawada, 1981а). Отчетливо видны
тело нейрона и отходящий от него отросток.
Сопоставим полученные данные на срезах с возможностью их
получения при работе на целом организме. Следует, по-видимому,
согласиться с тем, что выяснить региональную чувствительность
нейрона к фармакологическому веществу, подводимому ионофоре-
тически, можно и на целом организме, как в поверхностно располо-
женных структурах мозга (кора, мозжечок и др.), так и с примене-
нием стереотаксической техники в подкорковых структурах, имею-
щих четкую организацию (например, гиппокамп). Исследование
этого вопроса в подкорковых структурах, не обладающих четкой
организацией, — задача крайне трудная, если не невозможная.
Даже при решении простой задачи —• исследовании реакций кле-
ток на апплицируемое вещество — возникают определенные труд-
ности при интерпретации результатов. Так, в условиях целого
организма клетки стриатума реагировали на АХ или торможением,
или возбуждением. Напротив, ионофоретическое подведение АХ
к тем же клеткам в срезах сопровождалось их активацией.
Вероятное объяснение таких противоречивых данных может за-
ключаться в том, что in vivo АХ могли апплицировать к различным
52
\ популяциям нейронов, реагирующих контрастно, тогда как в сре-
зах АХ подводили к одной и той же популяции клеток (Miller,
1981). Кроме того, большое влияние на исход экспериментов
может оказывать расстояние от ионофоретической пипетки до
чувствительных зон нейрона. Проконтролировать этот фактор,
особенно с применением специальной оптики, — задача более
простая при работе на срезах, чем на целом организме.
Работая на срезах, экспериментатор не сталкивается с таким
фактором, как влияние наркоза. Между тем хорошо известно,
что барбитураты пролонгируют процессы торможения (Nicoll et
al., 1975) и отсутствие, например, влияния предполагаемого воз-
буждающего медиатора на нейрон можно отнести к воздействию
наркоза, а не к отсутствию рецепторов к этому веществу. Если
отказаться от применения наркоза и работать только на курарези-
рованном препарате, то все равно комбинированный характер
воздействия ионофоретнчески апплицируемого вещества и миоре-
лаксанта на активность клеток остается неопределенным.
Наконец, существенное преимущество метода срезов при ионо-
форетических исследованиях заключается в возможности поисков
ионных механизмов, лежащих в основе наблюдаемых эффектов.
Так, в клетках срезов стриатума как ортодромная стимуляция,
так и аппликация ГАМК вызывают торможение. Оно уменьшается
или полностью исчезает при перфузии срезов раствором, в котором
отсутствуют ионы хлора, что указывает на зависимость регистри-
руемых тормозных процессов от этих ионов (Miller, 1981)
1 3.2.3. Аппликация веществ
из микропипетки под давлением
Ограничение метода микроэлектрофореза сводится, по-види-
мому, к двум положениям. Во-первых, пропускание тока через
микроэлектрод, который находится в непосредственной близости
от мембраны или касается ее, меняет, по крайней мере локально,
возбудимость мембраны. Вычленить это воздействие из фармако-
логического эффекта сложно. Во-вторых, вещества, не имеющие
электрического заряда или имеющие слабый заряд, не могут быть
апплицированы таким методом.
Чтобы не сталкиваться с этими ограничениями, применяют
метод локального подведения к клетке вещества из микроэлек-
трода под давлением. Схема такой установки приведена в работе
Дингледина и соавторов (Dingledine et al., 1980). В литературе
имеются сведения о сопоставлении методов аппликации микро-
электрофорезом и под давлением. Так, вещество Р выводилось из
микроэлектрода ионофорезом, тогда как его аналоги таким спо-
собом не выводились. Под давлением из микропипетки выводились
и вещество Р, и его аналоги, причем выход вещества Р был на
2—3 порядка выше, чем при использовании ионофореза (Dray et
al., 1983). Этим можно объяснить пролонгированный характер
53
возбуждения нейронов гиппокампа на аппликацию вещества Р
(Dingledine et al., 1980).
Данный метод находится в настоящее время в процессе ста-
новления, и, по-видимому, он найдет применение при аппликации
пептидов. Его с успехом можно применять и для аппликации
веществ, обладающих электрозарядами; при этом отмечается
более щадящий способ их подведения к нейронам, чем при микро-
электрофорезе (Отмахов, Брагин, 1982).
3.3. МОДЕЛИРОВАНИЕ ФЕНОМЕНОВ, ЯВЛЯЮЩИХСЯ {
НЕЙРОФИЗИОЛОГИЧЕСКОЙ ОСНОВОЙ ПОВЕДЕНИЯ
Можно ли на кусочках мозговой ткани — срезах смоделировать
сложные и неразгаданные стороны деятельности мозга, такие,
например, как память, научение, замыкание условной связи
и т. д.? Ответ на этот вопрос имеет значение не только для дальней-
шего перспективного использования срезов, но он важен и для
расшифровки сложной интегративной деятельности центральной
нервной системы. Доказательством тому служит модель потенциа-
ции. Этот феномен, как предполагается, является нейрофизиоло-
гической основой элементарных форм памяти (Частотная и сле-
довая. . ., 1978) и, возможно, научения (Harris, Teyler, 1984).
В исследованиях на срезах данное явление получило широкое
распространение.
Наиболее интенсивно исследуется длительная посттетаниче-
ская или следовая потенциация. Суть этого явления заключается
в усилении ответов нейронов после кратковременного ритмиче-
ского раздражения. По продолжительности появления увеличен-
ных ответов потенциацию делят на кратковременную (десятки
секунд, минуты) и долговременную (десятки минут, часы).
Впервые посттетаническая потенциация (ПТП) была обнару-
жена на целом организме (Bliss, L0mo, 1973). Специальные срав-
нительные исследования показали, что она в одинаковой мере
выражена как in vivo, так и in vitro в поле СА1 гиппокампа анесте-
зированных крыс и в поперечных срезах мозга при активации
коллатералей Шаффера (Teyler et al., 1977). Увеличенные ответы
сохранялись и в том и другом экспериментальном препарате в тече-
ние 150—180 мин (рис. 28). Такое сходство характеристик явлений
потенциаций in vivo и in vitro позволяет с успехом использовать
срезы для изучения этого уникального феномена.
Методически такие эксперименты относительно просты. Так,
для регистрации ПТП в поле СА1 сначала редкими одиночными
стимулами наносят электрическое раздражение на коллатерали
Шаффера. Возникающие на эту стимуляцию ответы служат
контролем. Затем в течение 10—15 с наносится стимуляция
с частотой 3—30 имп. «с-1 (Langmoen, Andersen, 1981). Сразу же
после окончания тетанизации тестирование возбудимости произ-
водится одиночными стимулами. В течение первых нескольких
54
Рис. 28. Развитие посттетаннческой по-
тенциации популяционных ВПСП
в иоле СА1 при стимуляции коллате-
ралей Шаффера в поперечных срезах
изолированного гиппокампа (/) и в гип-
покампе интактных крыс (2) (по: Teyler
et al., 1977, с изменениями).
По оси абсцисс: К — контрольный стимул
(частота предъявления 1 имп./ЗО с); С —
нанесение низкочастотного тетанического
раздражения с частотой 15 имп./с в течение
15с; Т — интервал времени после прекра-
щения стимуляции, мин. По оси ординат:
амплитуда ответов в процентах от кон-
трольной.
минут наблюдается депрессия ответов, выражающаяся в умень-
шении их амплитуды ниже контрольной величины. Затем ампли-
туда ответов прогрессивно растет (Alger, Teyler, 1976; Частотная и
следовая. . ., 1978). В зависимости от типа регистрируемых потен-
циалов картина наблюдаемых явлений после тетанического разд-
ражения различна. Так, при регистрации фокальных потенциалов
в поперечных срезах гиппокампа наблюдается прогрессивное уве-
личение амплитуды ВПСП и популяционного спайка. При внутри-
клеточном отведении потенциалов после тетанической стимуляции
наблюдается возрастание амплитуды ВПСП, увеличивается ве-
роятность генерации ПД, их латентный период сокращается. Эти
основные закономерности развития ПТП продемонстрированы
во многих работах, выполненных как in vivo, так и in vitro
(Schwartzkroin, Wester, 1975; Deadwyler et al., 1975; Alger, Teyler,
1976; Брагин и др., 1977; Andersen et al., 1977; Lynch et al., 1977;
Шаронова и др., 1978; Частотная и следовая. . ., 1978; Yamamoto,
Chujo, 1978; Misgeld et al., 1979).
Преимущество метода срезов в изучении таких пластических
свойств нервной системы, как ПТП, заключается в возможности
поиска механизмов наблюдаемых явлений. Фактические данные
указывают на то, что ПТП, как и другие формы пластичности
в гиппокампе, связана с процессами, происходящими в синапти-
ческой передаче. Очевидно их локализацию следует искать либо
в пре-, либо в постсинаптической области. Большинство исследо-
вателей склонны считать, что процессы, ответственные за ПТП,
локализованы в пресинаптической области. Особое значение в раз-
витии ПТП придается ионам Са, поскольку при увеличении его
концентрации в пресинаптической терминали возрастает выход
медиатора в синапсе. Так, перфузия срезов гиппокампа раствором
с пониженной концентрацией Са (1 мМ) [или повышенной концен-
трацией Mg (3.9, 10 мМ)] сопровождается развитием ПТП, но ее
амплитуда и длительность значительно меньше, чем при перфузии
55
контрольным раствором (2.5 мМ СаС12; 2.4 мМ MgSO4). Увели-
ченные фокальные ответы пирамидных клеток поля СА1 на стиму-
ляцию коллатералей Шаффера регистрировались лишь в течение
1 мин при перфузии раствором с редуцированной концентрацией
Са (Dunwidde, Lynch, 1979). Эти результаты указывают на то,
что ПТП является кальций-зависимым процессом. Подобная зако-
номерность отмечена и в других исследованиях (Yamamoto et al.,
1980; Yamamoto, Sawada, 1981b; Turner et al., 1982; Turner, Miller,
1982).
О роли ионов Са в развитии ПТП можно было бы судить более
точно, если измерить изменения его концентрации Са-чувствитель-
, ными электродами. Применение таких электродов на срезах гип-
покампа подтвердило важное значение Са в развитии ПТП. Уда-
лось продемонстрировать, что концентрация внеклеточного Са
. в поле СА1 снижается от 2 мМ до 0.7—1.2 мМ вслед за кратковре-
менной стимуляцией клеток поля САЗ с частотой 20 имп. • с-1.
Такая же тетаническая стимуляция приводит к возрастанию внут-
риклеточного Са (Chirwa et al., 1983). Снижение концентрации
внеклеточного кальция в клеточном слое поля СА1 срезов гип-
покампа было отмечено и при развитии другой формы пластич-
ности— частотном облегчении (Konnerth, Heinemann, 1983).
Усиливается ли выброс медиатора в синапсе при развитии
ПТП? На этот вопрос можно получить ответ, если использовать
квантовый анализ процесса выделения медиатора. Впервые такой
анализ удалось осуществить Ямамото (Yamamoto, 1982). В его
опытах регистрировались внутриклеточные унитарные ВПСП
в нейронах поля САЗ поперечных срезов гиппокампа в ответ на
стимуляцию гранулярных клеток. Оценивались два параметра
синаптической передачи: квантовый состав (т) и величина кванта
(</). Оказалось, что для данной синаптической передачи т = 8.3,
q = 0.28 мВ. При развитии частотной потенциации при неизменном
значении величины кванта наблюдалось двукратное увеличение
квантового состава, что указывает на увеличение числа выделяе-
мых квантов медиатора во время развития данной формы облегче-
ния в гиппокампе. Вероятно, использование такого метода на сре-
зах будет успешным при анализе других форм пластичности,
в том числе и ПТП.
Если об участии пресинаптических структур в формировании
ПТП и других форм проявления пластичности имеются дока-
зательства, то постсинаптические структуры с этой точки зрения
исследованы недостаточно. При введении в клетки ЭГТА, блоки-
рующего свободные ионы Са, в поле СА1 гиппокампа снижается
до 23 % число нейронов, в которых развивается потенциация
(Intracellular injections. . ., 1983), что косвенно указывает на
активное участие постсинаптических структур в ПТП. По-види-
мому, более правильно считать, что в развитии ПТП принимают
участие и пре- и постсинаптические процессы, хотя их удельное
участие может быть различным (Possible mechanisms for. . .,
1980; Bliss, Dolphin, 1982; Wigstrom, Gustafsson, 1983).
56
Срез мозга можно использовать для изучения и другой формы
пластичности — привыкания, т. е. уменьшения реакции на повтор-
ные ритмические раздражения. Так, стимуляция перфорантного
пути в поперечных срезах гиппокампа с частотой 1 имп • с-1 сопро-
вождается отчетливым снижением амплитуды фокальных ответов,
зарегистрированных в зубчатой фасции (Teyler, Alger, 1976; Al-
ger, Teyler, 1976; Turner, Miller, 1982). Оказалось, что привыкание
развивается по тем же закономерностям, что и кратковременное
привыкание поведенческих реакций (Teyler, Alger, 1976). Такое
соответствие открывает перспективы поиска механизмов, лежащих
в основе феномена привыкания, которое, как предполагается,
лежит в основе научения (Thorpe, 1956).
3.4. МОДЕЛИРОВАНИЕ ПАТОЛОГИЧЕСКИХ ПРОЦЕССОВ
Создание простой модели нарушений мозговой деятельности,
изучение их проявлений, выявление факторов, приводящих к таким
отклонениям, выяснение механизмов таких нарушений — имеют
несомненно большое практическое значение. Срез мозга с успехом
используется и для таких исследований. На переживающих срезах
мозга получена модель эпилептических разрядов — аналог эпилеп-
тических процессов, развивающихся в мозге целого организма.
Эпилептоформные разряды вызываются различными химиче-
скими факторами: отсутствием ионов хлора в перфузионном ра-
створе (Yamamoto, 1972b), снижением ионов кальция в перфузате
(Richards, Sercombe, 1970; Yaari et al., 1983), подведением каино-
вой кислоты к срезу (Westbrook, Lothman, 1983; Collingridge et al.,
1983) или конвульсантов — бикукуллина, пикротоксина (Wong,
Traub, 1983; Hablitz, 1984). Наиболее часто используется так
называемая «пенициллиновая» модель эпилептических разрядов.
Введение в перфузионный раствор натрий бензилпенициллина вы-
зывает в ткани высокую возбудимость, которая характеризуется
частыми разрядами (от 3 до 10 популяционных спайков), реги-
стрируемыми при фокальном отведении, а при внутриклеточном
отведении возникают значительной амплитуды и длительности
деполяризационная волна и вспышка разрядов в ответ на орто-
дромное раздражение.
Развитие такой гиперактивности в поперечных срезах гиппо-
кампа подчиняется определенным закономерностям. Она возни-
кает при концентрации пенициллина свыше 0.85 мМ; при кон-
центрации более 3.0—3.4 мМ гиперактивность не возрастает
(Langmoen, Andersen, 1981; Synaptic triggering..., 1981). Эпи-
лептические разряды возникают при температуре омывающего
раствора выше 38 °C (Teyler, 1980) и уменьшаются при ее сниже-
нии ниже 34 °C. Существенное значение имеет концентрация ионов
К и Са в среде. Так, возрастание содержания К от 3.25 мМ до
6.25—9.25 мМ сопровождается ростом гиперактивности (Lang-
moen, Andersen, 1981). Зависимость от ионов Са обратна: сниже-
ние концентрации приводит к повышению гиперактивности, увели-
57
чение— к уменьшению гиперактивности (Schwartzkroin, Prince,
1978; Langmoen, Andersen, 1981). Последний факт знаменателен
тем, что указывает на участие синаптических процессов в гене-
рации эпилептических разрядов. Применение микроперерезок или
одновременная регистрация потенциалов в полях СА1 и САЗ гиппо-
кампа выявили, что гипервозбудимость возникает в структурах
полей СА2—САЗ и затем передается к нейронам поля СА1
(Schwartzkroin, Prince, 1978; Langmoen, Andersen, 1981; Synaptic
triggering..., 1981; Wong, Traub, 1983; Hablitz, 1984).
При внутриклеточном отведении от гиперактивных клеток не
удалось выявить изменений мембранного потенциала, входного
сопротивления мембраны, ионных токов, участвующих в генера-
ции ПД (Schwartzkroin, Prince, 1978; Langmoen, Andersen, 1981;
Synaptic triggering..., 1981; Westbrook, Lothman, 1983).
Причины такой гиперактивности предстоит еще выяснить.
Одной из них является устранение (блокирование) тормозных
процессов (Dingledine, Gjerstad, 1980; Langmoen, Andersen,
1981). Возможно, другим фактором является повышенная реактив-
ность дендритной мембраны (Wong, Prince, 1979; Dingledine et al.,
1980). Для выяснения причин, вызывающих эпилептические
разряды, срезы мозга представляются удобной моделью.
Пластические изменения реактивности и судорожные разряды
в нервной ткани — не единственные процессы, которые можно смо-
делировать на срезах мозга. Так, на них можно изучать процессы
постнатального развития электрических процессов. Для этого
достаточно готовить срезы мозга животных, находящихся на
разных стадиях постнатального развития (Fujii et al., 1977, 1978;
Schwartzkroin, 1981). He представляет особых трудностей изуче-
ние на срезах процессов старения (Tielen et al., 1982). Сноу
и сотрудники (Snow et al., 1983) предложили интересную модель
для исследования феномена распространяющейся депрессии,
вызываемой кратковременной стимуляцией альвеолярных волокон
в срезах гиппокампа в течение 1 —10 с, с частотой 3—10 имп. • с-1.
Срез мозга как модель исследований далеко не исчерпал своих
возможностей. Так, было бы интересным изучение электрофизио-
логии процессов утомления, возникающих при длительной синап-
тической активации структур среза, или создание и исследование
подели гипо- или гипергликемии. Полезной была бы также модель
троцессов, протекающих при обезвоживании организма. Преиму-
цество такого экспериментального подхода заключается в воз-
можности комплексного исследования нервной деятельности раз-
еичнымн методами: электрофизиологическими, биохимическими,
истологическими и другими. В этом плане исследование раковой
ервной клетки, анализ влияний генетических мутаций на
ентральную нервную систему или аналогичные им другие модели
мели бы несомненное практическое значение.
3.5 ЗАКЛЮЧЕНИЕ
На предыдущих страницах настоящей главы мы рассмотрели
практическое применение срезов мозга. Было отмечено, что их
использование в нейрофизиологии по сравнению с традицион-
ными исследованиями на целом организме в некоторых случаях
имеет неоспоримые преимущества и позволяет получить такие
сведения о деятельности мозговых нейрональных структур,
о которых до использования срезов можно было только догады-
ваться.
Исследование срезов позволило выявить активные свойства
дендритов нейронов гиппокампа, дендритов клеток Пуркинье моз-
жечка, изучить кальциевые спайки в дендритах, обнаружить
мВПСП, выяснить дифференциальную чувствительность структур
клетки к различным веществам, осуществить успешный поиск
механизмов пластических изменений и эпилептических разрядов.
Нет сомнения в том, что будущие исследования, проведенные на
срезах, дадут много новых данных, которые углубят наши знания
о работе мозга.
Насколько закономерности, обнаруженные при исследовании
на срезах можно распространить на деятельность соответствую-
щих мозговых структур целого организма? Очевидно, чтобы отве-
тить на этот вопрос, необходимо доказать тождественность элект-
рофизиологических, морфологических и биохимических характери-
стик нервной ткани в срезе и в мозге целого организма. В данной
главе приведены некоторые доказательства тождественности
электрофизиологических характеристик. Как «простые» процессы
(МП, генерация ПД, синаптические потенциалы, развитие тормо-
жения и т. д.), так и «сложные» (потенциация) одинаково успешно
развиваются in vivo и in vitro.
Мы далеки от утверждения, что метод срезов единственный
и наилучший среди существующих методов и что необходимо
отказаться от традиционных методов исследований на целом
организме. Мы убеждены в том, что только параллельные, там где
это возможно, исследования могут способствовать прогрессу
нейрофизиологических знаний. В этой связи необходимо отметить
те ограничения и недостатки, которыми обладает, как и другие
методические приемы, метод срезов.
Не существует строгой идентичности в приемах при работе
со срезами. Это прежде всего относится к составу инкубационных
сред. Количество того или иного компонента в средах значительно
варьирует. Кроме того, применяются явно «обедненные» среды,
в которых многие органические вещества, обнаруженные в цере-
броспинальной жидкости, отсутствуют (кроме глюкозы). Воз-
можно, что отсутствие некоторых органических компонентов
в среде приводит к состоянию «уставшего среза» (Schwartzkroin,
Wester, 1975). Вместе с тем нельзя не видеть преимуществ «обед-
ненных» сред в том, что именно в них можно в «чистом» виде иссле-
довать влияние того или иного органического вещества.
59
До сих пор отсутствует точный количественный контроль
напряжения кислорода в растворе, чтобы поддерживать харак-
теристики жизнедеятельности срезов, близкие in vivo. Опасаясь
гипоксии, исследователи непрерывно продувают карбогеном пер-
фузионную жидкость, создают атмосферу над срезом, перенасы-
щенную кислородом. Однако такая кислородная избыточность
‘ даже вредна и может приводить к разрушению мембранных
'структур.
Выделение кусочков нервной тКаии несомненно сопровож-
дается определенными изменениями возбудимости мембраны и
синапсов в эксплантантах, и от такого воздействия наиболее
страдают те структуры, которые наиболее чувствительны ко вся-
кого рода механическим воздействиям, и, видимо, далеко не все
физиологические характеристики данной области мозга in vivo
можно зарегистрировать in vitro.
Срез позволяет проводить многочасовые исследования, однако
время, когда наступает спад его нормального функционирования,
неизвестно. Между тем это необходимо знать для того, чтобы
отдифференцировать нормальные реакции от патологических.
Возможность исследования на срезах длительных процессов
(в течение дней, недель) позволила бы исследовать процессы
обучения и памяти. В настоящее время использовать срез для
таких исследований не представляется возможным. Вероятно,
для устранения этого методического ограничения полезно было бы
использовать некоторые приемы, которые применяются при изу-
чении культуры нервной ткани.
Серьезные ограничения метода срезов, как такового, заклю-
чаются в следующем. Во-первых, срез нельзя использовать для
изучения поведенческих реакций, сенсорных процессов или дви-
гательных актов. В нем невозможно исследовать процессы, для
которых требуется интактность связей между анатомически
удаленными районами мозга. Однако срез дает возможность
изучения нейрофизиологических коррелятов этих явлений. Другое
ограничение можно сформулировать так: ограничение видов
стимуляции. Действительно, в условиях целого организма воз-
можна широкая гамма адекватных раздражителей: зрительные,
слуховые, тактильные. На срезе реальны только два вида стиму-
ляции: электрическая и химическая. В какой степени они соответ-
ствуют действию закодированных в импульсах естественных
раздражителей, предстоит выяснить.
Несмотря на все отмеченные недостатки и ограничения, метод
срезов, как модельный объект, несомненно ценен в изучении
сложной деятельности мозга.
60
ГЛАВА 4
ПРИМЕНЕНИЕ СРЕЗОВ ДЛЯ ИЗУЧЕНИЯ
ОБМЕНА ОРГАНИЧЕСКИХ СОЕДИНЕНИЙ
4.1. ДЫХАНИЕ И ГЛИКОЛИЗ.
ОКИСЛЕНИЕ МЕЧЕНЫХ СУБСТРАТОВ
, > - . • ’
4.1.1. Дыхание
Для нервной ткани, обладающей в основном аэробным типом
окисления, интенсивность дыхания является важнейшим парамет-
ром состояния, отражающим скорость энергетического обмена
(Weiss et al., 1972; Лукьянова и др., 1982).
Срезы нервной ткани весьма удобны для измерения скорости
дыхания, причем полученные величины близки к измеренным
in vivo.
В литературе широко используются 3 типа измерений окисли-
тельного обмена срезов мозга: с помощью аппарата Варбурга;
с помощью полярографа; по скорости выделения меченой СО2
при добавке в среду инкубации меченой глюкозы. Вкратце оста-
новимся на этих методах.
Измерение скорости дыхания с помощью
аппарата Варбурга. Впервые измерение скорости дыха-
ния срезов было, по-видимому, произведено Варбургом в 1931 г.
Техника измерения стандартна (Dixon, 1951; Umbreit et al., 1951;
Manometrische Methoden. . ., 1965).
Приготовленный срез (глава 1) взвешивают и помещают
в сосуд Варбурга, содержащий аэрированную среду инкубации.
Ввиду того что масса срезов различна, может понадобиться
различный объем среды для каждой пробы. Это затрудняет под-
счет константы перехода от манометрических показаний к объему
газов. При малой массе среза значительная емкость сосуда может
вызвать затруднения точного отсчета малых величин. Для того
чтобы избежать этих затруднений, мы предлагаем работать на
аппарате Варбурга с помощью не манометрического, а волю-
метрического метода (Емельянов, 1971). При этом переменные
объемы сред не имеют значения, большой сосуд можно при необ-
ходимости заменить на малый, а калибровке подвергается лишь
цена делений капилляра.
61
Однако применение волюметрического метода является лишь
технически более удобным, но не принципиально отличным от
манометрического метода.
При измерении величины поглощения О2 (мкл) за промежу-
ток времени t (мин) расчет скорости потребления кислорода
на грамм ткани в мкмолях за час производится по формуле:
_ Д7 • 1000 60
°2 ~ 22.4 • t М ’
где Г02— скорость потребления кислорода, мкмоль • г”1 • ч-1;
М — масса среза, мг.
В качестве поглотителя СО2 в рукав сосуда Варбурга в послед-
нее время часто помещают не 20 %-ный едкий калий, а 20 %-ный
гиамин-алкил (С9-С14)-бензил-триметиламмоний-гидроксид. По-
следний поглотитель удобнее тем, что в случае одновремен-
ного измерения количества меченой углекислоты он хорошо
растворяется в сцинтилляционной жидкости на толуоловой
основе.
Для того чтобы подсчитать одновременно количество погло-
щенного О2 и количество выделенной СО2, существуют специаль-
ные методы (Manometrische Methoden..., 1965), однако они
достаточно сложны. Проще в параллельных сериях опытов изме-
рить для группы срезов потребление кислорода обычным спо-
собом (Vj), а также изменение объема газовой фазы при отсут-
ствии поглотителя СО2 (V2).
В этом случае Vt = У02, aV2 = Vo2 —Vco2- Нетрудно подсчитать,
что ]/С02 = V2 — Vh а ДК равен 72 ~
Метод Варбурга широко применяется многими авторами для
изучения базальной интенсивности энергетического обмена ткани
мозга (см. обзор: Нейрохимия, 1979), для измерения влияния
различных ионов (Whittam, Blond, 1964), для анализа эффекта
фармакологических препаратов (Weiss et al., 1972) и для многих
других целей. Хочется остановиться лишь на одном аспекте его
применения: измерении скорости дыхания при замещении глюкозы
среды различными субстратами (рис. 29). В условиях пониженной
скорости дыхания, не достигающей максимума, когда собственно
дыхательная цепь работает с «недогрузкой», скорость потребле-
ния кислорода служит мерой лимитирующего звена, в случае
приведенных субстратов — мерой скорости их входа в ЦТК.
Величины потребления кислорода срезами нервной ткани
близки к величинам, найденным in vivo. Так, Гарина и Емельянов
(1970) нашли, что срезы неокортекса крыс поглощают кислород
со скоростью 200—220 мкмоль • г-1 • ч-1 — это очень близко
к измерениям in vivo (см. обзоры: Иванов, 1974; Nilsson, 1974;
Norberg, Sicsjo, 1974, Borgstrom et al., 1976; Sachs, 1983).
Измерения дыхания имеют большую ценность, когда они
сопровождаются измерениями состояния тех или иных компо-
62
Рис. 29. Динамика дыхания срезов коры мозга крыс при использовании различных
субстратов.
1 — 10 мМ глюкозы; 2 — без субстрата; 3 — 10 мМ глутамата; 4 — по 5 мМ аргинина,
пролииа, гистидина; 5 — по 5 мМ глицина, серина, треонина, цистеина. Число опытов
по группам: / — 12, 2 — 46, 3 — 12,4 и 5 — по 23. По оси абсцисс: время, ч. По оси ординат:
поглощение Ог, мкмоль/г.
нентов дыхательной цепи (Карнаухов и др., 1972). Обзор работ
подобного рода приведен в монографии Л. Д. Лукьяновой и соав-
торов (1982).
Полярографические измерения скорости
дыхания. Как указывает М. Н. Кондрашова (1973), полярогра-
фический метод имеет ряд преимуществ перед методом Вар-
бурга — в частности, он позволяет работать с меньшими массами
ткани, измерять динамику дыхания в короткие промежутки вре-
мени, а главное — измерять мгновенный эффект смены состава
среды инкубации, так как связанные с подобными сменами незна-
чительные колебания температуры для полярографических изме-
63
Рис. 30. Применение контейнера-электрода в полярографической ячейке.
/ — стенка ячейки; 2 — полярографический электрод Кларка; 3 — отверстие для гермети-
зации ячейки и для добавок веществ шприцем; 4 — термостатирующая баня; 5 — ванна;
6—ось стержня магнитной мешалки; 7 — его лопасти; стрелки — направление тока
воды.
рений не имеют значения, хотя в аппарате Варбурга вызывают
значительные артефакты.
Применение полярографического метода описано в соответ-
ствующих руководствах, в частности в специальном руководстве
по применению полярографии в биологических исследованиях
(Кондрашова, 1973). Изготовление простейшего кислородного
полярографического электрода описано А. А. Трушановым (1973).
Работа с измерением дыхания срезов возможна с применением
3 видов полярографических кювет: замкнутой, проточной и кюве-
той с подкачкой О2.
Замкнутая кювета. Разрез ее приведен на рис. 30. Срез помеща-
ется в сетчатом контейнере (Глава 1). Орошение среза и мембраны
полярографического электрода осуществляется «пропеллером»
магнитной мешалки; ее скорость не должна превышать 200—
400 оборотов в мин, так как иначе скорость подхода кислорода
к электроду будет избыточной и не даст зарегистрировать падение
напряжения кислорода в среде (скорость определяется экспери-
ментально). Скорость поглощения кислорода на единицу массы
среза за час рассчитывается по формуле:
64
_Ьр<\ а ро^0>) v 60-1000
К°г ~ t 22 • 4 • 760 М ’
где Ко,— скорость потребления кислорода, мкмоль • г-1 • ч-1;
ДРо2 — падение напряжения кислорода в среде за период измере-
ния, мм рт. ст.; t — период измерения, мин; а — коэффициейт
растворимости О2 в воде, мкл • мл'1 • атм' ; М — масса среза,
мг; V — объем среды инкубации в кювете, мл; РО!(О) — исходное
напряжение О2 в среде, мм рт. ст.
Открытая и проточная кюветы. Замкнутая кювета обладает
большим недостатком — время наблюдения ограничено периодом,
когда напряжение кислорода падает не более чем на 15—20 %.
Кроме того, в замкнутой кювете трудно сочетать измерение напря-
жения кислорода, например, с электрофизиологическим исследова-
нием. Эти недостатки в значительной мере устраняются при
использовании открытой кюветы с постоянным пополнением
уровня О2. Удачный пример такой кюветы описан Л. Д. Лукьяно-
вой с соавторами (1982, с. 222—224).
Описана очень удобная проточная кювета с 2 электродами
Кларка (Bull, Lutkenhof, 1973). В этом случае один полярогра-
фический электрод помещается на входе, а второй — на выходе
кюветы; разность показаний служит индикатором интенсивности
поглощения кислорода. Более точно интенсивность дыхания
рассчитывается по формуле:
_ “%(!) 60-1000
А°2 760 22.4 • 760 ’ М '
где Ко, — скорость потребления кислорода, мкмоль • г-1 • ч-1;
Л>2(1) —давление О2 на первом полярографическом электроде,
мм рт. ст.; Лэ., (2) —то же на втором электроде; а — расствори-
мость О2 в воде при температуре опыта, мкл • мл-1 • атм1;
V — скорость протока среды через кювету, мл • мин1; М — масса
среза, мг.
Если параметры системы постоянны, то формула приобретает
следующий вид:
где коэффициент А включает все постоянные параметры системы.
Проточная кювета дает возможность измерения дыхания дли-
тельное время, в том числе и в условиях суперфузии переменными
средами.
Несмотря на многие преимущества полярографического ме-
тода, в большинстве биохимических исследований применяется
все же метод Варбурга, так как полярографический эксперимент
возможен одновременно только с одним срезом. Кроме того,
5 Заказ 1012
65
он требует контроля за состоянием довольно сложной электронной
аппаратуры и электродов.
Большинство полярографических исследований могут быть
выполнены на отечественном полярографе типа ПА-2 или чешском
полярографе типа LP-7 с отличным чернильным регистраторов
(Line Recorder EZ-7). Простейший полярограф может быть сдела!
в лаборатории из аккумуляторной батареи, потенциометра г
регистрирующего микроамперметра.
Измерение дыхания по выделению мече
ной СО2. В некоторых исследованиях, на основании того, что ДЕ
мозга близок к 1, измеряют скорость дыхания и ее изменения при
разных воздействиях по скорости выделения меченой СО2 при
использовании в качестве субстрата меченой глюкозы (Migani
et al., 1982; Poli et al., 1983). Такой метод кажется нам не коррект-
ным: во-первых, помимо обычного гликолитического пути, в мозгу
есть и пентозофосфатный шунт, и их соотношение варьирует;
во-вторых, исходная метка разбавляется за счет глюконеогенеза
и утилизации неглюкозных субстратов (Quach et al., 1978);
в-третьих, часть лактата теряется в среду и не окисляется; наконец,
в-четвертых, даже при нормальном течении гликолиза и ЦТК часть
метки из глюкозы задерживается в сопряженных метаболических
циклах и входит в аминокислоты глутаматной группы, белки,
фосфолипиды и другие вещества (Allweis et al., 1960; Sachs, 1983).
Вследствие этого расчет дыхания по скорости выделения мече-
ной СО2 кажется нам приемом, который не следует рекомендовать
для прецизионной работы.
4.1.2. Гликолиз
Гликолиз, как и дыхание, является важнейшей характеристи-
кой энергетического обмена ткани, поэтому изучение процесса
гликолиза на срезах мозга является предметом весьма большого
количества исследований. При судорогах и функциональных
нагрузках наблюдается повышение гликолиза, которое превышает
рост ЦТК и окисления (Lowry et al., 1964; King et al., 1967; Bull,
Luikenhoff, 1973; Duffy et al., 1975; Chapman et al., 1977).
Срез является исключительно удобным объектом для изучения
гликолиза, так как дает легкую возможность изучения динамики
концентрации исходного продукта — глюкозы; конечного про-
дукта — лактата; и промежуточных продуктов, когда это необхо-
димо.
Изучение аэробного гликолиза. Поскольку ткань
мозга в основном функционирует в аэробных условиях, большой
интерес представляет изучение в этих условиях скорости глико-
лиза. Наиболее точным показателем скорости является динамика
утилизации глюкозы среды, хотя часть глюкозы метаболирует
в ткани и другими путями. Так, по данным Т. С. Богдановой и
Т. Т. Подвигиной (1976), скорость потребления глюкозы срезам
коры мозга в аэробных условиях составляет 27 мкмоль • г-1 • ч- ,
66
что приблизительно соответствует потреблению кислорода
180 мкмоль • Г1 • ч-1, т. е. величине, близкой к той, которая
обнаружена на срезах того же отдела мозга (Емельянов, Гарина,
1970) и близка к скорости дыхания in vivo. По данным других
второе, потребление глюкозы срезами мозга крыс варьирует
Ьт 18 до 46 мкмоль • г-1 • ч-1 (Lowry et al., 1964; Takagaki, 1968;
£ox et al., 1977; Benjamin, Verjee, 1980).
Вторым часто исследуемым показателем является концентра-
ция молочной кислоты в ткани или скорость выделения молочной
.кислоты в среду инкубации. Соотношение гликолиза, выделения
молочной кислоты в среду и дальнейшего превращения продуктов
гликолиза в цикле трикарбоновых кислот видно из приведенной
ниже схемы:
Qt
А, л
Kt в
•
На этой схеме Q, соответствует фосфоэнолпирувату, Q2 — пи-
рувату, Q3 — лактату, Q4 — ацетил-КоА. А — пируваткиназная
реакция, Б — лактатдегидрогеназная, В — пируватдегидрогеназ-
ная; А — константы скоростей реакций, указанных стрелками.
Реакции А и В практически необратимы.
Нетрудно подсчитать, что концентрация лактата связана
с интенсивностью собственно гликолиза непрямой зависимостью:
А2 ,
если -тА = const, то
Аз
Kt
Q3~a'Qi'~k;'
Концентрация лактата и пропорциональная ему скорость
выделения лактата в среду инкубации зависят как от скорости
гликолиза, таки от скорости утилизации пирувата в цикле Кребса.
Однако если принять во внимание, что этап от пирувата до
цитрата является лимитирующим в цикле Кребса (см. обзоры:
Нейрохимия, 1979; Hawkins, Mans, 1983), то концентрация лак-
тата и пропорциональная ему скорость выделения лактата в среду
инкубации имеют существенное значение как индикаторы интен-
сивности гликолиза, хотя и не прямые. Как показано во многих
5
67
работах (Takagaki, 1968; Богданова, Подвигина, 1976; Benjamin,
Verjee, 1980; Подвигина и др., 1982), отношение выделенного
лактата к поглощенной глюкозе далеко не достигает расчетной
величины — 2, однако качественно отражает ожидаемые измене-
ния гликолиза при различной степени снабжения кислородом.
Технически выполнение экспериментов весьма несложно. Взве-
шенные срезы подвергают преинкубации в течение 30 мин, затем
инкубируют в течение 2—3 ч в кислородной атмосфере в среде
с глюкозой (без лактата). Инкубация возможна не обязательно
в сосудах Варбурга, а в колбочках или плоскодонных стаканчиках
диаметром около 25 мм. Реакцию останавливают добавкой 0.2 мл
20 %-ной ТХУК- В фильтрате определяют концентрацию глю-
козы (глюкозооксидазным методом — с помощью тест-набора
реактивов фирмы «Boeringer» ФРГ; или орто-толуидиновым
методом с помощью тест-набора объединения «Реахим» СССР,
или фирмы «Chemapob ЧССР) и лактата (с помощью лактатде-
гидрогеназного метода — тест-набор фирмы «Boeringer» ФРГ; или
с помощью метода Баркера и Саммерсона (Barker, Sammerson,
1941).
Экстракция с помощью 20 %-ной ТХУК позволяет применить
для одной и той же пробы любой из указанных методов.
Скорость потребления глюкозы или выделения лактата вы-
числяют по формуле:
к-(С СУ 71 • 1000
где К — скорость потребления глюкозы (выделения лактата),
мкмоль • г-1 • ч~'; С2 и С, — конечное и начальное содержание
исследуемого вещества в реакционных пробах, мкг; V, — объем
среды инкубации + ТХУК, мл; V2 — объем экстракта, взятый
в аналитическую реакцию, мл; ММ — молекулярная масса
исследуемого вещества; М — масса среза, мг; t — время инкуба-
ции, ч.
Наибольший интерес представляет измерение интенсивности
гликолиза в сочетании с анализом содержания отдельных компо-
нентов гликолитической цепи, что позволяет установить, какие
звенья являются регуляторными при том или ином воздействии.
Срез чрезвычайно удобен для таких измерений, так как его можно
быстро (в течение 1 с) перенести из среды инкубации в жидкий
азот для параллельных микрохимических анализов. Такие экспе-
рименты позволили Лоури с сотрудниками (Lowry et al., 1964)
обнаружить лимитирующие реакции гликолиза в срезах коры
мозга, а другим авторам (Rolleston, Newsholme, 1967; Takagaki,
1968) исследовать механизм влияния различных веществ (калия,
цианидов) и других воздействий на скорость гликолиза также
в срезах коры. Возможности анализа гликолиза на срезах исполь-
зованы далеко не до конца.
68
Изучение анаэробного гликолиза. Хотя для
нервной ткани в основном характерен аэробный тип обмена,
однако в условиях патологии, а также в очаге повышенной актив-
ности нервная ткань испытывает кислородное голодание. В этих
условиях наблюдается резкое повышение интенсивности гликолиза
вплоть до полного замещения окисления анаэробным гликолизом
(Lowry et al., 1964; Rolleston, Newsholme, 1967). Поэтому мощ-
ность гликолиза в анаэробных условиях служит важным индика-
тором метаболической резистентности нервной ткани. В этих
условиях скорость гликолиза может быть измерена как по потреб-
лению глюкозы, так и по образованию лактата — конечного про-
дукта в этих условиях. В анаэробных условиях скорость погло-
щения глюкозы срезами коры мозга крыс достигает 140, а образо-
вание лактата — 300 мкмоль • г~ • ч (Богданова, Емельянов,
1974). Сходные величины получены Лоури с соавторами (Lowry
et al., 1964). Таким образом, поглощение глюкозы возрастает
по сравнению с аэробными условиями приблизительно в 5 раз и
может дать до 50 % энергии макроэргических фосфатов по
сравнению с аэробными условиями (до 70 %; Hawkins, Mans,
1983).
Техника измерения анаэробного гликолиза весьма проста.
После преинкубации срез помещают в среду, аэрированную
азотом; сосуд продувают чистым азотом 30—40 с. Обычный
технический азот содержит до 4 % кислорода и не пригоден для
подобных исследований. Время инкубации укорачивается до 20—
30 мин. Остановка реакции, методы анализа и расчета — те же,
что в аэробных условиях. Соотношение между выделенным лакта-
том и потребленной глюкозой в данном случае близко к 2. Пре-
вышение может свидетельствовать о дополнительных источниках
синтеза лактата.
Такой прием удобен для анализа тех или иных воздействий,
направленных непосредственно на процесс гликолиза. Так, подоб-
ным методом было показано, что гидрокортизон в ткани мозга
не тормозит, а усиливает процесс гликолиза (Богданова, Емелья-
нов, 1974).
4.1.3. Окисление меченых субстратов
Небольшой объем книги не позволяет рассмотреть сколько-ни-
будь полно многочисленные приемы, которые могут быть приме-
нены на срезах мозга для анализа процессов обмена и их регуля-
ции. Однако к числу наиболее демонстративных относится иссле-
дование окисления субстратов, в молекуле которых содержится
радиоактивный углерод.
Поскольку УР субстрата в среде является постоянной, а со-
стояние среза по изучаемому веществу — стационарным, то дина-
мика радиоактивности изучаемого продукта пропорциональна УР
и ОУР.
69
Окисление глюкозы. Детали техники исследования
описаны в работе Гейнер и соавторов (Gainer et al., 1962).
ОУР СО2 по отношению к глюкозе в течение 15—180 мин растет
от 0.5 до 0.8. Основной вывод заключается в том, что ОУР не рав-
няется 1 — это должно быть следствием того, что в течение всего
указанного срока ткань, помимо глюкозы, окисляет побочные
субстраты. Если рост дыхания при добавке ДНФ или при электро-
стимуляции приводит к снижению ОУР СО2, то прирост дыхания
связан с окислением в первую очередь неуглеводных субстратов.
В последние годы в качестве поглотителя СО2 все чаще исполь-
зуется 20 %-ный раствор органического основания гиамин-гид-
роксида (алкил С9—С14 фенилтриметиламмоний-гидроксид), ко-
торый хорошо растворяется в простом сцинтилляционном растворе
(РРО — 4 г, РОРОР — 0.05 г, толуол — до 1 л; Noola et al., 1981).
Интересно, что ОУР СО2 в условиях перфузии мозга (Otsuki
et al., 1968) также не превышает 55 %, хотя рассчитать ее в этих
условиях значительно сложнее.
Окисление неглюкозных субстратов. На сре-
зах мозга было количественно изучено окисление 14С-глицерола
(Sloviter et al., 1966; Tildon, Reder, 1980) и показано, что оно
может достигать 15 % от уровня окисления Глюкозы. Применен-
ное авторами сочетание различных объектов — срезов, гомогена-
тов и субклеточных частиц позволило указать метаболическую
точку приложения глицерола (фосфорелирование до глицеро-
фосфата) .
При измерении окисления 14С-ацетата Линдбом и Валлгре!)
(Lindbohm, Wallgren, 1966) показали изменение интенсивности
этого процесса в ответ на электростимуляцию срезов, а Терек
и Лассанова (Tursky, Lassanova, 1981) — на падение содержани:
кальция в среде. Представляет интерес изучение эффективност!
пентозофосфатного шунта по соотношению скоростей окисления
глюкозы, меченной по С, или С6. Теоретические основы такого
исследования изложены в ряде работ (O’Neill et al., 1965; Appel,
Parrott, 1970; Kimura et al., 1974; Noola et al., 1981),
Представляют большой интерес исследования, в которых,
наряду с окислением, измерялся вход метки из глюкозы и неглю-
козных субстратов в компоненты сопряженных метаболических
циклов — например, в глутамат, аспартат и другие вещества
(Potashner, 1976; Otsuki et al., 1968; Tursky, Lassanova, 1981).
На основании этих исследований были сделаны выводы о наличии
нескольких пулов ЦТК с различной степенью соотношения про-
цессов окисления и биосинтеза (Sze-Chuh Cheng, Brunner, 1978).
Следует отметить, что этот аспект метаболизма исследован
недостаточно. Не использованы возможности компартментального
анализа динамики метки органических соединений, которые
могли бы дать кинетические характеристики сопряженных про
цессов обмена.
Этот раздел нейрохимии обещает много новой информации,
однако требует тщательного соблюдения методических условий,
70
I
j а именно постоянства эффективности счета 0-радиоактивности
I материалов различного состава. Мы рекомендуем следующие
условия.
После преинкубации срез инкубировали в среде 8 (табл. 1)
в сосуде Варбурга с равномерно меченой глюкозой (в I мл среды
добавляется 10 мкл меченой глюкозы, т. е. 25 кбк • мл-1). В отро-
сток сосуда помещают фильтровальную бумажку размером
10x40 мм и 0.2 мл 10 %-ного раствора КОН для поглощения
выделяющегося СО2. После окончания инкубации фильтроваль-
ную бумажку из отростка и остаток щелочи переносят в виалу
для просчета радиоактивности пробы. Отросток сосуда троекратно
промывали водой по 0.5 мл, которую также сливают в виалу.
Для частичной нейтрализации щелочи добавляли 0.25 мл 1 и.
НС! при непрерывном помешивании (больший объем кислоты
может вызвать выделение радиоактивных паров в атмосферу).
Кроме того, в виалу приливают 15 мл сцинтиллятора (№ 11,
табл. 4). Для просчета радиоактивности инкубационной среды
-в виалу последовательно приливают: 20 мкл инкубационной среды
с меченой глюкозой, 0.2 мл 10 %-ного раствора КОН, 1.5 мл Н2О,
0.25 мл 1 н раствора НС1 и 15 мл сцинтиллятора (для идентич-
ности состава среды в виале и экспериментальной пробе).
4.2. ИЗУЧЕНИЕ ОБМЕНА
АМИНОКИСЛОТ, МЕДИАТОРОВ, БЕЛКОВ, ФОСФОЛИПИДОВ
Н
к 4.2.1. Общая схема эксперимента
1 и характеристика каждого этапа
Несмотря на широкий спектр изучаемых веществ, сам принцип
работы со срезами одинаков во всех случаях и различается лишь
небольшими особенностями (характером добавок в среду инкуба-
ции, временем инкубации, способом обработки среза после инку-
бации и др.)- Независимо от исследуемых веществ общая схема
эксперимента представляется следующим образом:
I II
71
я> Приготовление срезов и техника их инкубации подробно опи-
саны в предыдущих разделах. В данном разделе внимание будет
’ обращено на особенности применения к срезам различных методов
нейрохимических исследований.
При работе со срезами используются обычные методы разде-
ления и определения количества различных веществ. Следует
только обратить внимание на то, что количество исходного мате-
риала достаточно мало, так как вес среза неокортекса крысы
составляет 20—40 мг. В связи с этим чувствительность методов
должна быть достаточно высока.
Очень плодотворным оказалось применение к срезам метода
радиоактивной индикации. Здесь хорошо известна и регулируема
УР субстрата или предшественника, которую часто бывает затруд-
нительно определить при работе in vivo. Кроме того, применение
метода радиоактивной индикации in vitro технически более просто
и требует меньших затрат радиоактивного вещества.
При использовании метода радиоактивной индикации вещество
(предшественник, субстрат), меченное радиоактивным изотопом,
вводится в инкубационную среду на одном из этапов инкуба-
ции (II). Могут использоваться самые разные вещества, меченные
14С, 3Н или другими изотопами. Обычно УР вещества среды
регулируется добавлением нерадиоактивного носителя до 8—
10 тыс. имп • мин”1 • мкмоль” (0.13—0.17 кБк • мкмоль”1). Во
всех случаях руководствоваться нужно тем, что проба, взятая
для подсчета радиоактивности на жидкостном сцинтилляционном
счетчике, должна давать минимальный счет 1000 импульсов
за 10 мин. Это относится как к радиоактивности сред, так и к ра-
диоактивности тканевых экстрактов.
Для измерения радиоактивности (IV) порцию среды или ткане-
вого экстракта переносят в виалы и добавляют 10—16 мл сцинтил-
ляционной смеси. Состав сцинтилляционных смесей различен для
водных и неводных растворов. Рецепты некоторых из них пред-
ставлены в табл. 5.
Радиоактивность проб измеряют на сцинтилляционном счет-
чике.
Подробности, связанные с самим методом радиоактивной
индикации, можно узнать в , соответствующих руководствах
(например, Остерман, 1983).
Для приготовления тканевого экстракта (III) срез отделяют
от инкубационной среды, промывают для удаления радиоактив-
ной инкубационной среды и гомогенизируют в кислоте. Ряд авто-
ров отделяют срез от инкубационной среды либо центрифугиро-
ванием, либо фильтрованием на воронке Бюхнера (Blasberg,
Lajtha, 1965; Smith, 1967; Charles, Chang, 1981). Однако это
увеличивает время обработки и приводит к радиоактивному
загрязнению большого количества посуды. Наиболее просто и
быстро мржно отделить срез, взяв его из инкубационного сосуда
крючком или пинцетом и осторожно ополоснув в стаканчике
с 5—10 мл нерадиоактивной среды в течение 10—15 с. За это
72
Таблица 5
Состав сцинтилляционных смесей для измерения радиоактивности
Тип раствора Но- мер РРО. 0/ /0 РОРОР, о/ /о Растворитель Источник
Водные растворы 1 0.3 —- Ксилол—тритон Х-100 (2 : 1) Skerrit, Johnston, 1981
2 0.3 — Ксилол—тритон Х-114 (3 : 1) Davies, Johnston, 1976
3 0.75 0.0035 Толуол—мономе- тиловый эфир этиленгликоля 1 : 0.6) Blasberg, Lajtha, 1965
4 0.4 0.01 Толуол; на каждую пробу по 4 мл цел лозольва Iversen, Neal, 1968
5 0.5 0.005 Толуол—95 %-ный этанол—диоксан (1 : 1 : 1) Okomoto, Quastel, 1972
6 0.5 — Диоксан, 10 %-ный нафталин * Davies, Johnston, 1976
7 0.4 0.03 Диоксан, 10 %-ный нафталин Berl et al., 1968
8 3.0 600 мл ксилола, 257 мл Тритона Х-100 106 мл этанола, 37 мл этиленгли- коля («Tritosol») Fricke, 1975; Wieraszke, 1981
9 0.4 0.02 Диоксан—мета- нол—этиленгли- коль (50 : 5 : 1), 6 %-ный нафталин (Сцинтиллятор Брея) Остерман, 1983, с. 204
Липиды и спиртовые 10 0.4 0.01 Толуол Шаляпина и др., 1978
растворы 11 0.4 0.03 Толуол Флеров, Войнер, 1982
время происходит полное удаление внешнего радиоактивного
загрязнения. Следует заметить, что увеличение времени промывки
до 1.5 мин ведет к вымыванию радиоактивного изотопа из внекле-
точного пространства, а до 5 мин — к вымыванию внутриклеточ-
ных компонентов исследуемого среза.
Промытый срез обсушивают прикосновением к влажному
фильтру для удаления захваченной жидкости и быстро подвергают
дальнейшей обработке. Дальнейшая обработка сводится к выделе-
нию необходимых веществ и определению их количества и радиоак-
тивности. Обычно срез гомогенизируют в 2—4 мл 3—5 %-ной
перхлорной, сульфосалициловой или 10—20 %-ной ТХУК и гомо-
генат центрифугируют при 10—12 тыс. g 10—15 мин. Полученный
осадок может быть использован для анализа белков (Раз-
дел 4.2.4), а супернатант — для анализа аминокислот (Раз-
дел 4.2.2), медиаторов (Раздел 4.2.3) и других кислотораство-
римых компонентов. Для изучения липидов ткань гомогенизируют
в смеси хлороформ—метанол (2 : 1).
73
Если известно, что практически вся радиоактивность в ткани
среза принадлежит исследуемому веществу (это проверяется пу-
тем разделения и определения радиоактивности метаболитов),
или в случае измерения общей радиоактивности тканн можно
гомогенизировать ткань в физиологическом растворе и отобрать
аликвоту гомогената в виалу для счета (Wieraszke, 1981). Если
количество ткани невелико (1—2 мг), то ткань прямо на фильтре
(Charles, Chang, 1981) или без него (Сох et al., 1977) переносят
в виалу и растворяют ее одним из следующих способов: 1. С 1 мл
1 н. КОН 30 мин при 60 °C, затем нейтрализовать кислотой (Вапау-
Schwartz et al., 1971); 2. 45 °C в течение ночи в 1 М растворе ти-
амина гидрохлорида в метаноле (Сох et al., 1977).
В некоторых случаях изучаемое вещество (аминокислоты,
катехоламины) экстрагируют прямо из целого среза небольшим
количеством воды или этанола. Экстракцию проводят непосред-
ственно в виалах. При этом аминокислоты экстрагируют 1.0 мл
Н2О в течение 1 ч, а катехоламины— 1 мл этанола 18—20 ч
(Davies, Johnston, 1976; Шаляпина и др., 1978; Skerrit, Johnston,
1981). Измерение радиоактивности проводят после добавления
сцинтиллятора в эти же виалы. Результаты получают в имп • мин-1.
Зная УА вещества, можно легко определить его количество,
поглощенное срезом, при условии, что вещество в срезе не разбав-
ляется и не метаболирует. Для этого достаточно радиоактивность
данного вещества в срезе отнести к его УР:
/>А.
где 1 — количество вещества, мкмоль; РАТ — радиоактивность
тканевого экстракта, имп • мин-1; УР — удельная радиоактив-
ность вещества, имп • мин-1 • мкмоль-1.
Для доказательства того, что вся радиоактивность среза при-
надлежит поглощенному веществу, проводят ТСХ тканевого экст-
ракта и определяют количество радиоактивных продуктов.
Для определения концентрации вещества необходимо рассчи-
тать его количество на единицу массы или объема. Следует отме-
тить, что при работе со срезами имеется возможность отделить
внутриклеточный и внеклеточный компартмент вещества. Из-
вестно, что концентрация вещества во внеклеточном пространстве
равна его концентрации в инкубационной среде. Определив общее
содержание вещества в срезе и объем внеклеточного пространства,
можно рассчитггть концентрацию вещества внутри клетки. Такой
более точный количественный расчет является одним из важных
достоинств среза как объекта исследований.
Поскольку здесь речь идет о водорастворимых веществах,
то более точный расчет делается на количество воды внутри клетки.
Для расчета внутриклеточной воды (Н2ОИ) определяют объем
внеклеточного пространства, например по инулину (Емельянов,
Гарина, 1970). Количество внутриклеточной воды равно разности
между количеством тканевой воды (Н2ОТ) и количеством воды
внеклеточного пространства (Н2Ое):
Н2ОИ = Н2ОТ — Н2Ое.
Количество тканевой воды определяется по разности в массе
среза после инкубации и после высушивания его при 100 °C в те-
чение 12 ч. Обычно тканевая вода составляет в среднем влажной
массы среза 80 %. Количество внутриклеточной воды составляет
в среднем тканевой воды 50 % или влажной массы 40 %. Расчет
содержания вещества на внутриклеточную воду является хотя и
более точным, но также достаточно условным, так как неизвестно,
какая часть этой воды находится в связанном, а какая — в сво-
бодном состоянии. Поэтому расчет содержания на общую ткане-
вую воду или на влажную массу ткани является хотя и менее
точным, но таким же условным и допустимым, как и расчет на
внутриклеточную воду.
Таким образом, концентрация вещества во внутриклеточной
воде (S) будет вычисляться по следующей формуле:
„ Т-М•Е
где Т — концентрация вещества в тканевой воде Н2ОТ,
мкмоль • мл-1; М — внеклеточная концентрация, которая равна
концентрации в среде в конце инкубации, мкмоль • мл '; Е —
объем внеклеточного пространства среза, доля от 1.
Дальнейшие расчеты (например, скорости поглощения) осно-
ваны также на определении количества веществ, и они будут
описаны в каждом отдельном случае.
Ниже мы приведем некоторые конкретные примеры применения
срезов в нейрохимических исследованиях для изучения метабо-
лизма аминокислот, ряда медиаторов, белков и фосфолипидов,
а также обмена неорганических ионов.
4.2.2» Обмен аминокислот
Роль аминокислот в метаболизме живых клеток определяется
прежде всего тем, что они являются составляющими компонентами
белков. Аминокислоты могут входить в цикл трикарбоновых
кислот и быть источником энергии. Они необходимы для синтеза
целого ряда биологически активных веществ. Кроме того, они
играют важную роль в осмотическом балансе и формировании
мембранного потенциала.
Во всех этих процессах определяющее значение имеет уровень
свободных аминокислот, который отличается как в равных обла-
стях головного мозга, так и в разных клеточных и субклеточных
структурах. Регуляция уровня свободных аминокислот осуществ-
75
ляется главным образом их активным транспортом через мемб-
раны. Имеющиеся в литературе экспериментальные данные о меха-
низмах активного транспорта аминокислот в основном получены
при исследовании именно на срезах мозга. Исследования на срезах
позволяют изучить динамические характеристики этого процесса,
характер взаимодействия различных аминокислот в процессе их
транспорта, позволяют более строго количественно подходить
к вопросам регуляторных влияний.
Все типы экспериментов, связанных с изучением транспорта
аминокислот на срезах, по поставленным задачам и характеру
получаемых результатов можно разделить на 3 группы: 1) иссле-
дования количества поглощенной аминокислоты; 2) измерение
начальной скорости поглощения; 3) анализ высвобождения
аминокислоты.
Определение количества поглощенной аминокислоты. Для
определения количества поглощенной аминокислоты срезы преин-
кубируют 30 мин в среде необходимого состава (табл. 1)в аппа-
рате Варбурга при 37 °C в атмосфере кислорода. Затем их пере-
носят в колбочки с 4—5 мл той же среды, содержащей 0.1—2 мМ
радиоактивной аминокислоты с УР 1.1 —1.9 мБк • мкмоль-1.
Такой объем среды необходим для того, чтобы концентрация
аминокислоты в ней существенно не изменялась за время инкуба-
ции. Пробы аэрируют кислородом, закрывают и инкубируют
в течение 1 —1.5 ч. Такое время инкубации необходимо для уста-
новления равновесия между средой и срезом. По окончании
инкубации срез отделяют от среды, промывают 10—15 с и гомоге-
низируют в 2—4 мл 3 %-ной НС14. Экстракт, получившийся после
центрифугирования гомогената, и пробы инкубационной среды
используют для подсчета радиоактивности. Количество амино-
кислоты в срезе рассчитывают так, как описано выше (с. 74).
Таблица 6
Величина поглощения аминокислот (S—М) срезами мозга мышей в завнснмостн
от времени инкубации (по: Battistin et al., 1969)
Аминокислота S—М, мкмоль • мл—1
5 мин 15 мин 60 мин 90 мин *
D-глутамат 8.60±0.31 23.9+1.63 53.2 + 0.97 53.65 + 1.62
D-аспартат 13.30 ±0.31 36.9 + 2.21 88.2 ±0.99 55.70 ±2.41
Таурин 1.83 ±0.32 5.89 + 0.54 16.5±0.81 —
L-лизин 0.61 +0.09 2.81 ±0.41 6.76 + 0.5 11.42 + 0.34
L-аргинин 2.31 ±0.06 3.08 ±0.18 8.32 ±0.18 —
Глицин 8.54+0"37 22.7±0.60 42.4 + 0.91 —
L-аланин 6.30 + 0.11 12.7 + 0.25 17.4±0.48 —
L-лейцин 3.33 ±0.14 2.70 ±0.05 3.74 ±0.16 3.36 + 0.17
L-валин — 7.59 ±0.25 8.67 ±0.35 —
L-тирозин 7.84 ±0.12 — 14.7±0.52 —
ГАМК 5.89 ±0.08 22.5 ±0.71 35.5 ±2.8 26.94 ±0.90
Примечание. * по данным Margolis, Lajtha, 1968.
76
Таблица 7
Величина поглощения аминокислот (S/Ш) срезами мозга
морских свинок (no: Tsukada et al., 1963)
Аминокислота S/M Аминокислота S/M
ГАМК 3.42 L-аспартат 5.84
L-глутамат 17.8 Р-аланин 4.90
D-глутамат 18.1 L-валин 1.32
L-глутамин 1.61
Величина концентрирующего поглощения выражается обычно
как разность концентраций аминокислот в среде (М) и срезе
(S) —S—М, либо как отношение этих концентраций — S/M.
Примеры величин концентрирующего поглощения для разных
аминокислот приведены в табл. 6, 7.
Количество поглощенной аминокислоты зависит от ее кон-
центрации в среде, от состава среды, возраста животных, разли-
чается в разных областях мозга, зависит от функционального
состояния среза, присутствия активаторов и ингибиторов. Вели-
чина поглощения аминокислот может использоваться для анализа
действия фармакологических веществ (Levi, Lajtha, 1965; Levi
et al., 1967; Levi, 1970; Kervin, Pycock, 1980; Tews et al., 1981).
Ход эксперимента при определении скорости поглощения и
при определении количества поглощенной аминокислоты отли-
чается лишь временем инкубации. Если при определении величины
поглощения количество аминокислоты определяют на стадии насы-
щения, когда устанавливается равновесие между срезом и инку-
бационной средой, то при определении скорости поглощения вы-
бирают тот промежуток времени, когда наблюдается линейное
увеличение количества аминокислоты в срезе, т. е. отмечается
постоянная скорость. Реально это время колеблется в пределах
от 3 до 30 мин. Для определения скорости поглощения (ц) рас-
считывают количество аминокислоты (S), поглощенное за единицу
времени (t): v=S/t. Количество аминокислоты может быть
рассчитано как на тканевую или внутриклеточную воду, так и
на влажную массу ткани.
Для определения кинетических параметров процесса поглоще-
ния аминокислот (Vmax и Кт) изучают зависимость скорости
входа от концентрации аминокислоты в среде инкубации. Мате-
матически эта зависимость выражается следующей формулой:
• М
где v — скорость входа, мкмоль • мл'1 • мин-1; М — концентра-
ция аминокислоты в среде, мкмоль • мл-1; Vmax — максимальная
скорость входа • мкмоль • мл-1 • мин-1; Кт — кажущаяся кон-
станта Михаэлиса, мкМ; 7Q — константа диффузии, мкМ.
77
Рис. 31. Зависимость скорости входа триптофана от концентрации его в среде
(по: Korpi, 1983а, с изменениями).
1—экспериментальная кривая; 2— диффузионный компонент; 3— насыщаемый компо-
нент. Кт = 0.5 мМ, 7тах = 3.24 мкмоль • с”! • кг”1. По оси абсцисс: концентрация трипто-
фана в среде, мМ. По оси ординат: скорость входа триптофана, мкмоль «с • кг
При определении кинетических констант транспорта расчет
концентрации аминокислоты в срезе на его влажный вес вместо
внутриклеточной воды не влияет на величину Кп, и уменьшает
Vmax на величину отношения количества внутриклеточной воды
к влажной массе ткани.
Видно, что это уравнение состоит из двух компонентов: од-
ного — насыщаемого, подчиняющегося уравнению Михаэлиса-
Ментен, и другого — ненасыщаемого, диффузионного. Физиологи-
ческое значение диффузионного и насыщаемого процессов раз-
лично. Диффузионный процесс является нерегулируемым,
неспецифичным и приобретает большое значение при больших, не
физиологических концентрациях аминокислот. В то же время про-
цесс насыщаемого транспорта специфичен, действует при физио-
логических концентрациях, и именно на него направлены все
регуляторные влияния. В связи с этим именно процесс насыщае-
мого транспорта, подчинающийся уравнению Михаэлиса-Ментен,
подвергается детальному исследованию. Изменения кинетических
констант поглощения могут говорить о характере влияния регу-
лирующих веществ, о механизмах их действия.
Пример графического изображения зависимости скорости по-
глощения от концентрации аминокислоты в среде представлен
на рис. 31.
Построив графическую зависимость скорости поглощения
от концентрации аминокислоты в среде, можно по графику опре-
делить Vmax и К,т. Однако такое определение легче проводить,
если эту зависимость выразить по способу двойных обратных
величин (уравнение Лайнуивера-Берка):
1 _ ; > . ч.
’ ’ I/ А/ ’Т’ Г/ ’ 1
\
Рис. 32. Кинетический анализ входа |4С-глицина в срезы коры головного мозга
и срезы спинного мозга крысы (по: Johnston, Iversen, 1971, с изменениями).
1 — кора; 2 — спинной мозг. Кора: Km=2.0-10~4 М, 7тах=' -25 • 1О-7 моль-г-1Х
Хмии-'. Спинной мозг: Лга=0.3-10-4 М, Ктах=0.83 • 10-7 моль-г-1 • мии-По оси
абсцисс: величина, обратная концентрации 1/S, IO4 М. По оси ординат: величина,
обратная скорости реакции (1/V), 107 моль-1 • г мин.
Рис. 33. Кинетический анализ входа D-a-(/) и L-a-адипиновой кислоты (2)
в срезы коры мозга крыс (по: Charles, Chang, 1981, с изменениями).
По оси абсцисс: величина, обратная концентрации (1/S), мМ—'. По оси ординат: вели-
чина, обратная скорости реакции (1/V), 1.5-103 мкмоль-1 • мин• г (г — сырая масса).
В этом виде уравнение графически изображается прямой линией,
тангенс угла наклона которой равен Km/Vmax, точка пересечения
с осью ординат есть 1 / Vmax, а точка пересечения с осью абсцисс —
— 1 / Кт- Пример такого изображения представлен на рис. 32.
При высоких концентрациях субстрата на графике часто
отмечается перелом (рис. 33), связанный с существованием
диффузионного процесса (Smith, 1967; Iversen, Neal, 1968).
Таким образом, К|т, и Vmax можно определить как графически,
так и рассчитать их математически (Smith, 1967; Korpi, 1983а).
Кинетические константы поглощения аминокислот зависят от
влияний различных веществ, функционального состояния среза,
возраста животного (Levi, 1970; Kontro, 1983). Ниже приведена
таблица констант скоростей входа аминокислот по данным разных
авторов (табл. 8).
Определение скорости выхода аминокислот. При исследовании
высвобождения аминокислот срез сначала насыщают радиоактив-
ной аминокислотой, а затем помещают его в нерадиоактивную
инкубационную среду, свободную от аминокислот и определяют
количество аминокислоты, высвободившейся в среду и оставшейся
в срезе после периода инкубации. Эксперимент проводится со-
гласно общей схеме (с. 71). Насыщение радиоактивной аминокис-
лотой проводится в период преинкубацин (II). Концентрация
79
Таблица 8
Константы скоростей поглощения аминокислот срезами мозга
Аминокислота «Срод- ство» Вид животного мкМ шах’ мкмоль х ХМИН~1 Хг^1 Источник
L-аспартат Высокое Крыса 5.6 0.10 Davies, Johnston, 1976
Низкое Тот же 125.0 0.25 Тот же
D-аспартат Высокое > 13.7 0.25
N-метил- Низкое > 3000 0.77 Skerritt, Johnston, 1981
D-аспартат L-глутамат Высокое 27.3 Benjamin, Quastel,
Низкое 700 1976 Тот же
D-глутамат Низкое 2000 —
Гомоцистеин Низкое » 3000 1.69 Сох et al., 1977
Р-аланин Высокое Лягушка 31.3 0.01 Adair, Davidoff, 1977
Низкое Тот же 11.0 0.009 Тот же
Глицин Низкое Крыса 264 0.12 Johnston, Iversen, 1971
D-глутамат Низкое Цыпленок 1210 1.21а Levi, 1970
Лизин Низкое Тот же 450 0.28а Тот же
Лейцин Низкое » 800 0.8а »
Фенилаланин Низкое Крыса 860 0.646 Joanny et al., 1973
Тирозин Низкое Тот же 1640 0.956 Тот же '
Глицин Низкое 4500 2.56 Joanny et al., 1971
Триптофан Низкое 500 0.20 Korpi, 1983
Примечание, а — мкмоль • мл1 • ч~1 (мл — Н2О„); б—мкмоль • мл-1 • ч1
(мл — Н2ОТ).
аминокислоты в среде подбирается в зависимости от того, какую
концентрацию необходимо получить внутри клетки. Все условия,
методы и расчеты не отличаются от таковых при определении
величины поглощения (с. 77). При определении скорости высво-
бождения аминокислоты во всех случаях принимается, что ее УР
в срезе не меняется в ходе эксперимента, т. е. не происходит попол-
нения поглощенной аминокислоты за счет каких-то эндогенных
источников. Во время отмывки среза для поддержания стационар-
ных условий необходимо периодически менять среду инкубации,
чтобы избежать влияния уже высвободившейся аминокислоты
на процесс ее выхода из среза. Это может быть осуществлено с по-
мощью различных методических приемов: 1) смена среды в инку-
бационном сосуде (Levi et al., 1966); 2) быстрый перенос среза
в новый инкубационный сосуд (Тазалакян и др., 1980); 3) исполь-
зование перфузионной камеры (Skerritt, Johnston, 1981; Charles,
Chang, 1981). В последнее время наиболее часто используется
третий прием. В этом случае через определенные промежутки
времени отбираются пробы перфузата.
Для окончательного расчета скорости выхода аминокислоты
необходимо измерить радиоактивность срезов в конце инкубации
и радиоактивность каждой пробы перфузата или инкубационной
среды. Радиоактивность среза до начала данного периода инкуба-
80
Рис. 34. Влияние К+ на высвобождение М-метил-О-аспарагиновой кислоты из сре-
зов коры мозга крыс в отсутствии и в присутствии Са2+ (по: Skerrit, Johnston, 1981,
с изменениями).
Т — время действия КО. Стрелкой обозначено введение в среду перфузии Са2+. По оси
абсцисс: номер фракции перфузата. По оси ординат: постоянная скорости выхода, мин-1.
ции (РА0) рассчитывают как сумму радиоактивности среза в конце
этого периода (РЛТ) и общей радиоактивности инкубационной
среды (/Мср):
РА0 = РА, + РДср.
Выход аминокислоты можно выразить в процентах от ее исходного
содержания в срезе.
При исследовании влияния различных агентов скорость выхода
аминокислот в начале инкубации (перфузии) используется как
контроль. Затем в инкубационную (перфузионную) среду вводят
какое-либо вещество и наблюдают его влияние на высвобождение.
Когда прекращается действйе данного вещества (прекращается
его поступление в инкубационную среду), можно наблюдать его
последействие, а также процесс восстановления (Yamamoto, Mat-
sui, 1976; Charles, Chang, 1981; Thangnipon, Storm-Mathisen, 1981;
Toggenburger, Henke, 1981). Результаты одного из таких экспе-
риментов представлены на рис. 34.
Помимо этого можно рассчитывать абсолютную скорость
выхода аминокислот (и) из срезов. Зная радиоактивность срезов
до и после определенного времени (/) инкубации (РА0 и PAt)
и УР (с. 74), можно рассчитать концентрации аминокислот (So
и St, с. 75). Тогда скорость выхода будет определяться следующей
формулой: ........ .
/ (s0-sz)
v =-------. ‘ '
t И;- П':'
Скорость выражается в мкмоль • мин-1 • мл-1 (или мг-1).
График зависимости скорости выхода от концентрации амино-
кислоты в срезе представлен на рис. 35. Концентрация аминокис-
лоты в срезе берется как среднее значение ее концентрации
в начале и в конце инкубации. .
6 Заказ 1012
81
Рис. 35. Зависимость скорости выхода D-
глутамата от концентрации в срезе (no: Levi
et al., 1966, с изменениями).
По оси абсцисс: концентрация D-глутамата во
внутриклеточной воде, мМ. По оси ординат: ско-
рость выхода D-глутамата, 102 мкмоль • мл-' •
• мнн-'.
Выше мы привели примеры ис-
следований транспорта экзогенных
аминокислот. Исследование уровня и
высвобождения эндогенных амино-
кислот принципиально не отличается
от описанного выше. В случае изуче-
ния эндогенных аминокислот не про-
водится преинкубация с радиоактив-
ными аминокислотами, а их количе-
ство в среде и в тканевых экстрактах
определяется после их хроматогра-
фического разделения с, помощью
оптических методов (Benjamin, Quoustel, 1972; Collins, 1980;
Collins et al., 1981; Sandberg, Carazze, 1983).
На срезах можно изучать не только процессы транспорта, но
и синтеза аминокислот из радиоактивных предшественников (Min-
chin, 1977).
4.2.3. Обмен медиаторов
Поглощение, высвобождение и синтез медиаторов имеют боль-
шое физиологическое значение, так как связаны с передачей
нервного импульса. Техника изучения метаболизма медиаторов
очень сходна с изучением аминокислот.
Гамма-аминомасляная кислота. Определение
количества и скорости поглощения ГАМК проводят согласно
общей схеме. Инкубируют срезы в среде, содержащей 3Н- или
14С-ГАМК в концентрации 0.03 мкМ—20 мМ. Для предотвращения
метаболизма ГАМК в среду инкубации добавляют амино-окси-
уксусную кислоту (10 мкМ), которая является ингибитором амино-
бутират-аминотрансферазы (2.6.1.19) —фермента, расщепляю-
щего ГАМК- Чтобы определить время инкубации, следует построить
зависимость скорости поглощения ГАМК от времени. В том случае,
если необходимо исследовать динамику поглощения, нужно брать
тот промежуток времени, где эта зависимость линейна. Если зада-
чей является определение максимального количества поглощен-
ной ГАМК, то выбирается промежуток времени, когда концентра-
ция ГАМК уже не меняется. Для определения кинетических пара-
метров поглощения время инкубации составляет 10 мин с момента
добавки изотопа, а для определения максимального поглощения —
30—60 мин.
82
Большие вариации в концентрации ГАМК, вводимой в инкуба-
ционную среду разными авторами, могут быть обусловлены тем,
что система транспорта ГАМК, как и некоторых других аминокис-
лот, неоднородна: существуют системы как с высоким сродством
к ГАМК (требуют небольших количеств медиатора и имеют низ-
кую Кт), так и с низким сродством (включаются при высоких кон-
центрациях медиатора и имеют высокую Кт) (Kontro, Oja, 1981;
Kontro, 1982). Для определения кинетических констант этих систем
транспорта определяется скорость поглощения ГАМК при разной
ее концентрации в среде инкубации.
Обработка среза после инкубации проводится так, как описано
ранее (с. 74). Обычно срез после удаления внешнего радиоактив-
ного загрязнения гомогенизируют в 2—4 мл 3 %-ной сульфосали-
циловой кислоты и центрифугируют. Аликвоты инкубационных
сред и тканевого экстракта берут для подсчета радиоактивности
(с. 72). Меченую ГАМК можно экстрагировать прямо из среза,
помещая его в сцинтилляционную виалу и встряхивая в течение
примерно 20 мин в 0.2—1.0 мл дистиллированной воды (Iversen,
Neal, 1968).
Расчет количества ГАМК, скорости ее поглощения, кинетиче-
ских констант проводится, как и для любых аминокислот (с. 75,
77). Величина поглощения выражается как отношение ткань/
среда, а скорость входа измеряется в мкмоль • г-1 • мин’1. Вели-
чина поглощения зависит от концентрации ГАМК в инкубацион-
ной среде, от времени инкубации и различается в разных областях
мозга (табл. 9). В табл. 10 приведены константы скоростей подан-
ным разных авторов. Большой разброс данных, представленных
в табл. 10, может быть обусловлен недостаточной стандартиза-
цией условий эксперимента.
Определение высвобождения ГАМК можно проводить с по-
мощью любого методического приема, описанного для аминокислот
(с. 80). Чаще всего выход ГАМК определяют в условиях перфузи-
рования.
Срез преинкубируют в среде, содержащей 0.03—10 мкМ радио-
активной ГАМК и 10 мкМ аминооксиуксусной кислоты (для
предотвращения метаболизма ГАМК). После преинкубации срез
Таблица 9
Величина поглощения 3Н-ГАМК (S/М) срезами
различных областей мозга крыс (по: Iverson, Johnston
1971)
Область мозга
Кора больших полушарий
Мозжечок
Спинной мозг
Гиппокамп
Неостриатум
S/M
26.7 ± 1.30
12.8±0.90
2.5±0.17
21,0±2.16
11.7 ±0.62
6»
83
Таблица 10
Кинетические константы скоростей поглощения ГАМК
по данным разных авторов
Кт, мкМ у * тах> МКМОЛЬ • Г—1 • МИН-1 Источник
1580 1.71 Cohen, 1981
22 0.115 Iversen, Neal, 1968
31 0.043 Kontro, Oja, 1981
23.5 0.129 Iverson, Johnston,
1971
помещают в перфузионную камеру и промывают инкубационной
средой без ГАМК.. Через определенные промежутки времени
(например, каждые 2 мин) отбирают пробы перфузата по 0.1 —
0.8 мл и определяют в них радиоактивность. По окончании перфу-
зии срез взвешивают и определяют радиоактивность оставшейся
ГАМК, экстрагируя ее 1 мл 80 %-ного этанола прямо из ткани или
гомогенизируя срез в кислоте (с. 74). ,
Результаты обычно выражают в процентах высвободившейся
ГАМК- За 100 % принимается радиоактивность среза в начале
перфузии (с. 81) (Effects of anoxia. . ., 1983; Namima et al., 1983;
Kuriyama et al., 1984). Можно построить график изменения
радиоактивности в перфузате, где по оси абсцисс откладывают
номер пробы, а по оси ординат — ее радиоактивность. Пример
Рис. 36. Влияние Са2+ на вызванное К+ высвобождение 3Н-ГАМК из срезов коры
мозга крыс (по: Fan et al., 1982, с изменениями).
Сплошная линия — с Caz: ; пунктирная линия — без Са2+; темный прямоугольник — до-
бавка 25 мМ КС1. По оси абсцисс: время инкубации, мин. По оси ординат: высвобождение
’Н-ГАМК %-мин-1.
84
такого построения представлен на рис. 36. Здесь показано увели-
чение высвобождения 3Н-ГАМК в присутствии ионов К+ и влия-
ние Са2+ на этот процесс.
Моноамины. Следующую группу медиаторов представ-
ляют моноамины. Это дофамин, норадреналин, серотонин. Работа
с этими медиаторами проводится по обычной схеме (с. 71).
Для определения количества и скорости поглощения моноами-
нов приготовленные срезы после 30 мин преинкубации переносят
в новую порцию среды, в которую добавлен один из радиоактивных
моноаминов, меченных по 3Н или по |4С до конечной концентрации
порядка 10“7 М. В среду инкубации добавляют также ингибитор
моноаминоксидазы, чтобы предотвратить метаболизм этих медиа-
торов. В качестве ингибиторов обычно используют ипразид в коли-
честве 0.47 мг • мл-1 или ниаламид в концентрации 10 мкМ (Sney-
der et al., 1969; Kellog et al., 1971; Achilla et al., 1980; Тазалакян
и др., 1980; Minchin et al., 1983). Время инкубации от 5 до
30 мин.
По окончании инкубации срез извлекают, промывают 10—15 с
в нерадиоактивной среде (с. 72), помещают в виалу для счетчика
и добавляют 1 мл абсолютного этилового спирта. Пробы оставляют
на 18—20 ч для экстракции, а затем добавляют 10 мл сцинтил-
ляционной смеси 10 (табл. 5). Через 2 ч подсчитывают радиоактив-
ность на жидкостном сцинтилляционном счетчике. Срезы можно
гомогенизировать в 2 мл абсолютного этанола и брать на определе-
ние радиоактивности 0.5 мл супернатанта, полученного после
центрифугирования гомогената (Sneyder et al., 1969).
Так же как и в случае аминокислот, поглощение медиаторов
выражается в виде отношения концентраций моноаминов в ткани
и среде. Ниже приведены величины поглощения моноаминов сре-
зами разных областей мозга (табл. 11) и характер их зависимости
от времени инкубации (рис. 37).
Для определения кинетических параметров поглощения срезы
инкубируют в средах с концентрацией медиаторов от 0.5 до
20 • 10 М и определяют скорость поглощения в зависимости
от концентрации медиатора в среде. Ход эксперимента и расчеты
такие же, как для аминокислот (с. 77).
Таблица 11
Величина поглощения моноаминов (S/М) срезами мозга обезьян
Ateles geoffroyi (по: Sneyder et al., 1969)
Область мозга S/M
3Н-норадреналин 3Н-серотонин
Моторная кора 2.25±0.12 3.00 ±0.36
Хвостатое ядро 9.40±0.66 5.37±0.44
Бледный шар 3.00 ±0.11 3.84 ±0.62
Гипоталамус 5.05±0.61 5.77±0.78
Мозжечок 2.47 ±0.23 2.43±0.25
85
Рис. 37. Поглощение 3Н-норадреналина в срезах
больших полушарий 90-дневных цыплят (по: Kellog
et al., 1971, с изменениями).
1 — при 37 °C, 2 — при О °C. По оси абсцисс, время
инкубации, мин. По оси ординат: отношение 3Нткаиь/
среда.
По данным Минхина и сотрудников
(Minchin et al., 1983), Km для норадрена-
лина равна 1,03 • 10-7 М, а Vmax равна
0.14 нмоль • г-1 • мин-1. Группа японских
исследователей (Fujiwara et al., 1983)
установила, что срезы, взятые из области
бледного шара головного мозга крыс,
аккумулируют норадреналин двумя систе-
мами, одна из которых характеризуется
высокоаффинным захватом (Кт = 2.9 •
10-7 М; Утах = 1.4 нмоль • мг-1 • мин-1),
а другая — низкоаффинным (Кт = 1.6 •
10~ М; Утах = 5 нмоль • мг-1 • мин-1).
Следует отметить, что кинетика поглоще-
ния этих медиаторов изучена еще очень
мало. Почти отсутствуют данные о влия-
нии различных физиологических факторов на кинетические пара-
метры поглощения моноаминов.
Для изучения процесса высвобождения моноаминов из срезов
мозга первоначально проводят их преинкубацию с изотопом для
насыщения срезов 3Н- или 14С-моноамином (с. 72). Как при изу-
чении любых медиаторов, следует строго соблюдать постоянство
концентраций К+ и Са2+ в среде, так как при их увеличении наблю-
дается увеличение выброса медиаторов.
По окончании преинкубации (15—30 мин) срезы ополаски-
вают нерадиоактивной средой (10—15 с) и переносят в перфузион-
ную камеру. Пробу перфузата отбирают через определенные про-
межутки времени. Определяют радиоактивность перфузата и оста-
точную радиоактивность среза (с. 81).
На любом этапе перфузии в среду, омывающую срез, можно
вводить различные фармакологические вещества, менять ее ион-
ный состав, проводить электростимуляцию (Arbilla et al., 1980;
Jackisch et al., 1980; Enuis, Cox, 1981; Schoffelmer, Mulder, 1983;
Fujiwara et al., 1983). Результаты одного из таких экспериментов
представлены на рис. 38.
Можно проводить определение высвобождения и без перфу-
зионной камеры, с помощью второго методического приема,
описанного для аминокислот (с. 80). В этом случае срез после
преинкубации переносят в свежую среду, не содержащую радио-
активных моноаминов. Инкубация без изотопа продолжается
стандартное время, затем определяют радиоактивность среды
и среза, как в случае с поглощением (Шаляпина и др., 1978).
86
Рис. 38. Влияние дибутирил-ц-АМФ на высвобож-
дение 3Н-норадреналина из срезов коры мозга
крыс, вызванное 13 мМ К+ (по: Werner et al., 1982,
с изменениями).
Темный прямоугольник — среда с 13 мМ н 1.2 мМ
Са2+ дается для перфузии в течение 5 мни.; сплошная
линия — без дибутнрил-ц-АМФ; пунктирная линия —
с дибутнрил-ц-АМФ. По оси абсцисс: время супер-
фузни, мин. По оси ординат: постоянная скорости
выхода 3Н.
эндогенных моноаминов
Для определения динамики выхода
медиатора во время инкубации без
изотопа срез через определенные интер-
валы времени с помощью специального
держателя переносят в новый сосуд
со средой (Тазалакян и др., 1980).
Результаты по высвобождению мо-
ноаминов могут быть выражены в про-
центах высвободившегося моноамина
от исходного уровня, как отношение
среда/ткань (М/S), как постоянная
скорости (нг • мг-1 • мин-1).
Помимо исследования поглощения и
высвобождения экзогенных, меченных
радиоактивным изотопом моноаминов
широко распространено исследование
(Bennett et al., 1980; Schoepp, Azzoro, 1981; Yotsumoto, Nomura,
1981; Schlicker et al., 1981; Siniscalchi, Veratti, 1982). В этом случае
схема эксперимента не меняется (с. 71). После инкубации в экспе-
риментальных условиях ткань гомогенизируют в кислоте (с. 73)
и супернатант используют для разделения и определения моноами-
нов (Шаляпина, 1974; Hamlet et al., 1981). Определяют количе-
ство моноаминов и в инкубационной среде (или перфузате).
Высвобождение эндогенных моноаминов определяют либо по оста-
точному содержанию их в срезе (Есаян, Казарова, 1970), либо
по содержанию в перфузате (Okuma, Osuni, 1982). В табл. 12
представлены результаты исследований эндогенных моноаминов.
Ацетилхолин. АХ резко отличается по характеру мета-
болизма от моноаминов и ГАМК- Он обладает очень быстрой
скоростью обмена. Появившийся в ткани свободный АХ (высвобо-
дившийся в результате нервного импульса или введенный извне)
очень быстро разрушается ферментом — ацетилхолинэстеразой
(3.1.1.7). Накопление АХ в клетке осуществляется путем синтеза
его из предшественников, поступающих извне. Для АХ не имеют
большого значения процессы реабсорбции и обратного всасыва-
ния, а более важны поглощение предшественников и его синтез
внутри клетки.
Биосинтез АХ осуществляется из ацетил-КоА и холина
с помощью фермента холин-ацетилтрансферазы (2.3.1.6). По-
87
Таблица 12
Влияние ГАМК на содержание норадреналина в срезах
среднс~о мозга крыс (по: Есаян, Назарова, 1970)
Время инкубации (мин) Содержание норадреналина, мкг • г-1
Контроль i ммоль ГАМК
0 0.870 ±0.030
15 0.754 ±0.025 0.727 ±0.025
30 0.675±0.015 0.533 ±0.029
45 0.657±0.016 0.540±0.014
этому в качестве предшественников АХ могут быть использованы
как предшественники ацетил-КоА, так и холин. Предшествен-
никами ацильной группы ацетилхолина являются глюкоза и пиру-
ват, а также цитрат и p-гидроксибутират. Углерод из 2-14С-аце-
тата не включается в АХ (Browning, Schulman, 1968; Ksiezak,
Gibson, 1981; Dolezal, Tucek, 1981; Tucek et al., 1981; Sterlinget al.,
1981; Gibson, Petersen, 1983).
В качестве предшественника AX может быть исполцзован как
3Н-, так и |4С-холин (Browning, Schulman, 1968; Polak et al.,
1977). Возможные предшественники холина — этаноламин, серин,
метионин — не включаются в молекулу АХ (Browning, Schulman,
1968).
Время инкубации с радиоактивными предшественниками (кон-
центрация 10—200 мМ) составляет 0.5—3 ч. Следует тщательно
соблюдать постоянство концентраций К+ и Са2+, так как увели-
чение концентраций этих ионов вызывает выброс медиатора
из срезов. Кроме того, во избежание распада вновь синтезирован-
ного АХ в среду инкубации следует добавлять ингибиторы АХЭ.
В качестве ингибиторов могут быть использованы эзерин, зарин,
зоман, параоксон (табл. 13).
По окончании инкубации срез ополаскивают, гомогенизируют
в кислоте (с. 73). После центрифугирования гомогената супер-
натант используют для определения радиоактивности АХ, выде-
ленного из экстракта в чистом виде. Методы выделения АХ опи-
Т а б л и ц а 13 \
Ингибиторы ацетилхолинэстеразы
Концентрация
Ингибитор в инкубационной Источник
среде, М
Эзерин 2 . 10~4 Browning, Schulman, 1968
Sterling et al., 1981
Зарин 10'6 Heilbronn, 1969
Зоман 5 • 10~6 Polak et al., 1977
Параоксон («Sig- 0.058 Ksiezak, Gibson, 1981
ma Chemical Со.») Dolezal, Tucek, 1981
88
Таблица 14
Скорость синтеза ацетилхолина
Субстрат
U-14C-глюкоза
1-14С-глюкоза
6-'4С-глюкоза
2-'4С-пируват
2-14С-ацетат
14С-холин
Скорость синтеза,
нмоль • г—1 • ч*
Источник
12.0± 1.3
12.3± 1.6
10.0± 1.0
10.7±0.3
0.03
8.0
Browning, Schulman, 1968
Тот же
»
»
»
Polak et al., 1977
саны в соответствующих руководствах и статьях (Browning,
Schulman, 1968; Polak et al., 1977; Dolezal, Ticek, 1981; Sterling
et al., 1981).
При расчете количества AX следует учитывать, что для равно-
мерно меченой глюкозы берется только 1/3 ее УР, так как только
2 из 6 меченых атомов идет на формирование ацетильной группы
АХ. Для 1-14С-глюкозы и 6-14С-глюкозы УР делят пополам, так как
из двух образующихся триоз лишь одна, меченая, идет на синтез
АХ. Принимается, что радиоактивные субстраты не разбавляются
нерадиоактивными тканевыми субстратами. Для этого существуют
следующие основания: 1) сравнение количества АХ, синтезиро-
ванного из 14С-предшественников, с количеством, определенным
другими методами, дает сходные результаты; 2) включение аце-
тильной и холиновой группы в АХ примерно эквивалентно (Brow-
ning, Schulman, 1968). Для определения скорости синтеза изме-
ренное количество АХ необходимо разделить на время инкубации
с радиоактивным предшественником (нмоль • г'1 • мин-1).
По данным разных авторов скорость синтеза АХ в срезах коры
головного мозга крыс составляет в среднем 8—12 нмоль • г-1 • ч-1
(табл. 14).
Синтез зависит от уровня общего окислительного метаболизма
клетки. Он резко уменьшается при снижении парциального дав-
ления кислорода до 53 мм рт. ст. При аноксии синтез АХ в срезах
гиппокампа ингибируется на 77 %, а в его перегородке при этих
условиях не изменяется (Gibson, Peterson, 1983).
На скорость синтеза АХ влияет ионный состав среды (Polak
et al., 1977). Так, при низкой концентрации К+ (4.7 мМ) скорость
синтеза АХ составляет 8 нмоль • г-1 • ч-1, а при высокой концент-
рации К+ (25 мМ) — 32 нмоль • г-1 • ч-1. При увеличении кон-
центрации К+ увеличение синтеза АХ не сопровождается накопле-
нием его в срезах, так как одновременно возрастает высвобожде-
ние АХ из срезов в среднем в 2.8 раза (Grewaal, Quastel, 1973).
Для определения высвобождения АХ срез, инкубированный
с радиоактивным предшественником, переносят в свежую среду
без изотопа, содержащую ингибитор ацетилхолинэстеразы, и инку-
бируют при 37 °C 10—60 мин. По истечении заданного времени
89
Таблица 15
Скорость высвобождения 14С-ацетилхолина и 3Н-ацетилгомохол'ина
из срезов коры мозга, инкубированных с |4С-холином
и 3Н-гомохолином, и ее зависимость от наличия Са2+ в среде
(по: Boksa, Collier, 1980)
Характер высвобождения АХ, состав среды Скорость высвобождения (время измерения 5 мин), ? пмоль • г-1 • мин-1
|4С-ацетилхолин 3Н-ацетил- ) ГОМОХОЛИН V
Спонтанное высвобождение Нормальная среда с Са2 + Нормальная среда без Са2 + К + -вызванное высвобождение Нормальная среда с 46 мМ К+, с Са2 + Среда с 46 мМ К + , без Са2 + 26.8±3.6 15.4±2.1 834.0 ± 114.3 25.2±5.1 2.1 ±0.3 0.6 ±0.08 11.5+1.9 0.3 ±0.06
в среде и в срезе определяют радиоактивность АХ, предварительно
отделив его от других радиоактивных метаболитов (Browning,
Schulman, 1968). При изучении влияния различных веществ
и ионов на высвобождение АХ они добавляются в среду инкуба-
ции. Расчет количества проводится так, как уже было описано
(с. 89). Скорость определяется как количество АХ, высвободив-
шегося за единицу времени.
Полученные результаты показывают, что в состоянии покоя
из 1 грамма срезов коры головного мозга крыс за 1 час выделя-
ется АХ 10—18 наномоля (Richter, Marchbansk, 1971). При уве-
личении концентрации Вс до 30 мМ в среду выделяется
60 нмоль • г- • ч-1. Результаты по спонтанному и вызванному
выделению АХ из срезов коры мозга представлены в табл. 15.
Кроме высвобождения вновь синтезированного АХ можно
определить высвобождение эндогенного АХ. Для этого срез инку-
бируют в заданных условиях эксперимента, а затем в среде
и в ткани определяют содержание АХ биологическим, газово-
хроматографическим с масс-спектрофотометрией или другими
Таблица 16
Влияние дофамина иа скорость высвобождения
ацетилхолина из срезов коры мозга крыс
(по: Belleroche et. al., 1982)
Характер высвобождения Скорость высвобождения,
пмоль • мг • МИН
Контроль Дофамин !0-1 М
Высвобождение в покое 11 4
К+-стимулированное высво- бождение (56 мМ) 64 27
90
методами (A method for concurrent. . 1975; Casamenti et al., 1979;
Richter, Weiling, 1979; Belleroche et al., 1982; Meiler et al., 1982).
На высвобождение AX влияют дофамин, ГАМК, холинэргиче-
ские вещества (Boksa, Callier, 1980; Nordstrom, Bartfai, 1981;
Gold et al., 1982). Один из примеров такого влияния приведен
в табл. 16.
Таким образом, исследования на срезах позволяют охарактери-
зовать синтез, поглощение, высвобождение самых разнообразных
веществ в ткани мозга, получить точные количественные данные
об этих процессах. Однако возможности метода использованы
еще далеко не полностью. Очень мало работ, посвященных дина-
мике метаболизма, количественному определению влияния различ-
ных БАВ и функциональных воздействий на все рассмотренные
процессы.
4.2.4. Обмен белков
Роль белков в нервной системе подробно описана рядом
авторов (Палладии и др., 1972). Изучение их метаболизма пред-
ставляет несомненный интерес для понимания механизмов дея-
тельности мозга. Определение факторов, регулирующих скорость
метаболизма белков в условиях in vivo, связано с большими
техническими трудностями. В то же время подобные исследования
на срезах не вызывают серьезных затруднений.
Для определения скорости синтеза белков определяют включе-
ние в них аминокислот. Ход эксперимента осуществляется согласно
ОБЩАЯ СХЕМА АНАЛИЗА СИНТЕЗА БЕЛКА
9!
описанной ранее общей схеме (с. 71). Приготовленные срезы пре-
инкубируют в стандартной инкубационной среде. Затем срез поме-
щают в свежую среду, содержащую радиоактивный предшествен-
ник синтеза белков. Пробы аэрируют кислородом и ставят на инку-
бацию на 20—90 мин (до 4 ч) (Orrego, Lipman, 1967). В качестве
предшественника синтеза белков используют L-аминокислоты,
меченные как 14С, так и 3Н. Концентрация аминокислоты в среде
берется от 1 мкМ до 1 мМ (Lipton, Heimbach, 1977; Reith et al.,
1979). Удельная радиоактивность подбирается так, чтобы в среде
инкубации было 7—18 кБк • мл '
После инкубации срез извлекают из среды, промывают при-
мерно 1.5 мин нерадиоактивной средой и гомогенизируют в 2—4 мл
3%-ной сульфосалициловой кислоты. Гомогенат центрифугируют
при 10 тыс. g 6 мин. Супернатант и осадок используют для дальней-
шего анализа содержания и радиоактивности используемой амино-
кислоты.
Осадок белка, получившийся после центрифугирования суль-
фосалицилового гомогената, отмывают от посторонних примесей
по следующей схеме: 1) осадок ресуспензировать в 5 %-ной ТХУК
и центрифугировать; 2) снова ресуспензировать в свежей 5 %-ной
ТХУК, нагреть и держать при температуре 90 °C 15 мин,'отцентри-
фугировать; 3) осадок суспензировать в 2 мл метанола и центри-
фугировать; 4) осадок ресуспензировать в 2 мл хлороформ-мета-
нола (1:1) и центрифугировать; 5) осадок ресуспензировать
в 2 мл серного эфира и центрифугировать.
Количество белка в сухом осадке определяют по методу Ло-
ури (Lowrey, 1951) и путем взвешивания. Полученный белок ис-
пользуют для определения радиоактивности и аминокислотного
состава.
Для определения радиоактивности взвешенный белок (2—3 мг)
помещают в виалы для счетчика, растворяют в 2 мл 1 н NaOH,
нагревая в кипящей воде почти до высыхания (35—40 мин),
подкисляют образец 0.5 мл ледяной уксусной кислоты, добавляют
15 мл сцинтилляционной смеси 3 (табл. 4). Радиоактивность
подсчитывают на жидкостном сцинтилляционном счетчике. Ско-
рость включения аминокислот в белки выражают как имп • мин 1
• мг”1 • ч” (мг — белок).
Для определения аминокислотного состава часть белка гидро-
лизуют: 3—12 мг белка фиксируют под вакуумом с 5 мл 6 н НС1
и нагревают при 110 °C 24 ч. После высушивания на воздухе гидро-
лизат растворяют в цитратном буфере pH 2.2 (Reith et al., 1979)
и обрабатывают так же, как и сульфосалициловый экстракт для
определения количества и радиоактивности аминокислот.
Для определения радиоактивности аликвоты сульфосалицило-
вого экстракта, среды или гидролизата доводят до 2.4 мл и смеши-
вают с 12 мл сцинтилляционной смеси. Содержание аминокислот
определяют оптическими методами после хроматографического
разделения смеси.
В результате получаем следующие данные: 1) содержание
92
Таблица 17
Скорость включения аминокислот в белки
Аминокислота Скорость, нмоль X Хмг~‘ • ч”1 Источник
Триптофан 0.15 Korpi, Oja, 1981
Валин 0.36 Reith et al., 1979
Лизин 0.82 Lipton, Heimbach, 1977
Лейцин 1.0 Jones, McIlwain, 1971
Валин 0.3 Тот же
аминокислоты в среде до и после инкубации; 2) радиоактивность
среды. Зная радиоактивность среды и содержание в ней амино-
кислоты, до начала инкубации рассчитывают УР аминокислоты
(УРа ими • мин ' • мкмоль1); 3) содержание аминокислот
в сульфосалициловом экстракте; 4) радиоактивность сульфосали-
цилового экстракта. Зная содержание и радиоактивность амино-
кислоты в сульфосалициловом экстракте, можно определить
ее УРа в срезе (УРаср ); 5) скорость включения радиоактивной
аминокислоты в белок (РАб имп • мин”1 • мг”1 • ч”1). Зная РАб
и УРа, можно рассчитать количество аминокислоты (Аб), вклю-
чившейся в белок за единицу времени РАб/УРа (мкмоль • мг”1 •
• ч”1). Пример такого расчета представлен в табл. 17; 6) содержа-
ние аминокислот в белке (Sb, мкмоль • мг”1). По данным Данлопа
и соавторов (Dunlop et al., 1981) в 1 мг смеси белков мозга содер-
жится (мкмоль) ; треонина — 0.48, серина — 0.38, глутамата — 1.02,
аспартата — 0.80, глицина — 0.62, аланина — 0.66, валина —
0.58, лейцина — 0.75, метионина — 0.20, изолейцина — 0.45, тиро-
зина — 0.27, фенилаланина — 0.35, лизина — 0.60, гистидина —
0.20, аргинина — 0.41, триптофана — 0.08.
Исходя из количества аминокислоты, включившейся в белок
(Аб), и общего содержания аминокислоты в белке (S6), можно
рассчитать скорость синтеза белка (Ес, % • ч”1):
у = Л6- 100
s6 •
В табл. 18 представлены результаты разных авторов по изуче-
нию скорости синтеза белка из различных предшественников.
С помощью такой схемы эксперимента можно определить
не только скорость синтеза, но и распада белков. Если знать
содержание аминокислот в среде (М) до и после инкубации, содер-
жание белка в срезе (Б) и содержание аминокислоты в белке
(S6), то можно рассчитать истинную скорость распада белков
(К.р., % • ч”'):
v _ М • 100
V" P' S6- Б
93
о срезах мозга по данным разных авторов
Аминокислоты Скорость, % • ч 1 Источник
Лейцин 0.13 Jones, McIlwain, 1971
Валин 0.05 Lipton, Heimbach, 1977
Лизин 0.14 Korpi, Oja, 1981
Триптофан . •> 0.19 Тот же
Валин 0.06
Лизин 0.08--0.09
Валин 0.08—0.09 Dunlop et al., 1974
Г истидин 0.08—0.09 Тот же '
Фенилаланин ( 0.08—0.09 » .
Аргинин 0.08—0.09
Таблица 19
Скорость распада белков (% • ч ’) в срезах мозга
двухдневных крыс (по: Dunlop et al., 1981)
Скорость Время инкубации
30 мин 60 мин 100 мин '
Средняя скорость ис- 0.16 0.13 0.04
тинного распада (V». р.) Скорость синтеза (VJ 1.76 1.76 1.76
Скорость распада (Vp) 1.92 1.89 1.80
)бщая скорость распада белков (Ур) равна сумме скорости
х синтеза (Vc) и истинного распада (Уир):
ример таких расчетов представлен в табл. 19.
Истинный распад может быть отрицательной величиной (Dun-
р et al., 1981), если скорость распада будет меньше скорости
нтеза.
В настоящее время исследования метаболизма белков с по-
>щью срезов проводятся недостаточно широко, хотя именно этот
тод позволяет дать строгую количественную оценку различных
) сторон.
4.2,5. Обмен фосфолипидов ,, ;
Известно, что фосфолипиды являются важнейшими компонен-
и всех клеточных и субклеточных мембран. В последнее время
зос о роли фосфолипидов в регуляции метаболизма клетки,
функциональных свойств подвергается все более детальной
шботке (Крепе, 1981; Farese, 1983). Однако, исследования
влияния различных воздействий на метаболизм фосфолипидов
носят часто только качественный характер из-за трудности
определения абсолютных величин скоростей их синтеза. Эти труд-
ности легко преодолеваются при работе со срезами.
Определение интенсивности синтеза фосфолипидов проводится
по обычной схеме (с. 71). Приготовленные срезы преинкубируют
в среде Мак-Ильвейна 30 мин в атмосфере кислорода. Затем срезы
переносят в среду, содержащую радиоактивный предшественник
синтеза фосфолипидов в количестве 0.37—0.74 мБк • мл' В каче-
стве радиоактивных предшественников синтеза фосфолипидов
могут быть использованы NaH2 32РО4, ацетат, глицерол, глюкоза,
жирные кислоты, меченные как |4С, так и 3Н, а также |4С-холин,
14С-этаноламин, 3Н-инозитол и другие вещества. Использование
того или иного предшественника зависит от целей и задач иссле-
дования.
Время инкубации в среде с изотопом составляет 1—2 ч. По окон-
чании инкубации срезы извлекают из среды, ополаскивают 1.5 мин
и гомогенизируют в 3—5 мл смеси хлороформ—метанол (2:1) для
экстракции общей фракции липидов. Экстракция длится 20—
40 мин при встряхивании. Экстракт отфильтровывают в стакан-
чики через бумажные фильтры и отмывают от водорастворимых
примесей по методу Фолча (Folch et al., 1957). Полученный
экстракт высушивают и используют для получения отдельных
фракций фосфолипидов методом двумерной ТСХ (Pumphrey,
1969). Разделение проводят на тонком слое силикагеля КСК
(размер частиц 20—30 мкм) иа пластинках размером 20x20 см.
Первая система растворителей представляет собой смесь хлоро-
форма, метанола и 7н аммиака в отношении 60 : 35 : 5, а вто-
рая — хлороформа, метанола, ледяной уксусной кислоты и воды
в отношении 80:40:7.4:1.2. Угол между двумя направлениями
хроматографирования равен 90°. По окончании хроматографиро-
вания пластинки высушивают и проявляют в парах йода. Получен-
ные коричневые пятна обводят иглой и используют для определе-
ния количества и радиоактивности фосфолипидов. Количество
и радиоактивность определяют с двух параллельных пластинок,
на которые наносят липидный экстракт из расчета 40—60 мкг
липидиого фосфора на каждую пластинку, что соответствует коли-
честву экстракта с одного среза весом 20—40 мг (для одновремен-
, ного определения количества и радиоактивности необходимо брать
2 среза с одного мозга — по одному с каждого полушария).
Общий вид получаемых хроматограмм представлен на рис. 39.
Идентификацию отдельных фракций фосфолипидов проводят
по общепринятым методикам (Pumphrey, 1969; Флеров, Войнер,
1980). После идентификации пятна, сооветствующие отдельным
фракциям фосфолипидов, переносят с одной пластинки в виалы
для подсчета радиоактивности, а с другой — в пробирки для опре-
деления количества фосфолипидов.
Количество фосфолипидов оценивают, определяя содержание
фосфора в каждой фракции по методу Бартлетта (Barti₽H ,nrr"
BIBS"
Рис. 39. Общий вид двумерной хроматограммы липидного экстракта из срезов
коры мозга крыс.
I система растворителей (фронт /): хлороформ—метанол-7 и аммиак (60: 35 : 5); II си-
стема растворителей (фронт 11): хлороформ—метанол—уксусная кислота—вода (80 : 40 :
: 7.4 : 1.2). Ст — старт; 1 — лизофосфатидилхолин; 2 — сфингомиелин; 3 — фосфатидил-
серин; 4 — фосфатидилхолии; 5 — фосфатидилинозитол; 6 — фосфатидилэтаноламин; 7 —
фосфатидная кислота; 8 — неидентифицированная фракция.
;s Сжигание фосфолипидов до неорганического фосфата проводят
прямо на силикагеле в 1.0 мл 72%-ной хлорной кислоты при 200 °C
в течение 40 мин. В охлажденные пробы добавляют 2—3 мл воды
. , и центрифугируют при 10 тыс g. Центрифугат переносят в пробирки
. с меткой на 5 мл и силикагель промывают еще 1—2 мл воды
с последующим центрифугированием для полного извлечения фос-
фора. Центрифугаты объединяют и проводят цветную реакцию
для определения количества фосфора (Bartlett, 1959).
При сжигании фосфолипидов на силикагеле определяется
80—90 % фосфора. Часть фосфора теряется, по-видимому, из-за
, неполного сгорания и неполного вымывания с силикагеля. Расхож-
дение между параллельными пластинками составляет 1—2 %.
96
Количество каждой фракции фосфолипидов рассчитывав
на основании данных по определению неорганического фосфора.
Для пересчета используют коэффициенты, которые представляют
собой отношение молекулярной массы каждого фосфолипида
к атомной массе фосфора (табл. 20).
Таким образом, количество фосфолипидов в расчете на 1 мг
влажной массы ткани можно выражать как в микрограммах фос-
фора и микрограммах фосфолипида, так и в мкмоль фосфора, что
соответствует количеству фосфолипидов в микромолях.
В виалах подсчитывают радиоактивность отдельных фракций
фосфолипидов на сцинтилляционном счетчике в толуольном сцин-
тилляторе (11, табл. 5). Фон считают в виале с чистым сцинтил-
лятором.
Удельную радиоактивность по углероду и фосфору рассчиты-
вают следующим образом:
А —Ф А —Ф
УР -----4г ЮО; УРр
т Кс F Рн
где УРС — удельная радиоактивность вещества, рассчитанная
на 1 мг углерода (если используется предшественник, меченый
i4C); УРР—удельная радиоактивность вещества, рассчитанная
на 1 мг фосфора (если используется 32Р); А — радиоактивность
пробы, имп • мин“'; Ф — фоновая радиоактивность; т — коли-
чество данного вещества, мг; Кс — процентное содержание угле-
рода (табл. 19); Р„ — количество фосфора в данной пробе, опре-
деленное по методу Бартлетта.
При работе с 32Р-ортофосфатом в каждом опыте определяют
радиоактивность и количество фосфора в инкубационной среде,
вычисляют его УР. Это необходимо делать, так как 32Р — сравни-
Таблица 20
Содержание фосфора и углерода в отдельных фракциях
фосфолипидов и общих липидах мозга
Фракции Молеку- лярная масса Количе- ство Р, % Перевод- ной коэф- фициент Количе- ство С, % Перевод- ной коэф- фициент
Лизофосфатидил- холин 508 6.1 16.3 68.0 1.47
, Сфингомиелин 717 4.32 23.0 68.5 1.45
Фосфатидил серин 819 3.78 26.4 64.5 1.55
Фосфатидилхолин 746 4.15 24.1 675 1.48
Монофосфоинози- тид 566 3.57 28.0 65.0 1.54
фосфатидил этано- ламин 759 4.08 24.5 68.0 1.47
Фосфатидная кислота 706 4.40 22.8 66.4 1.51
Общие липиды 732 4.23 23.6 67.4 1.48
7 Заказ 1012
97
Таблица 21
Интенсивность обмена отдельных фракций фосфолипидов коры головного
мозга крыс при инкубации в среде с 2-|4С-ацетатом
- Фракция УРС*, имп ♦ мин 1X XMI--1 Ку, 10 • ч'1 6/;, сут
Сфингомиелин 17500 + 3254 1.085 27
Фосфатидил хол ин 14808 + 3167 0.918 31
Фосф атидилэтаноламин 5419+1923 0.336 86
Фосфат идилсерин 56021 + 1591 3.474 8
Фосфатидилинозитол 157009 + 26709 9.737 3
Фосфатидная кислота 47800 + 5922 2.964 10
Примечание. * мг — С. Условные обозначения на с. 99.
Таблица 22
Влияние прометазина на включение 32Р в фосфолипиды
срезов мозга крыс (по: Magee, Rossiter, 1963)
Концентрация прометазина, мМ УРр, имп • мнн 1X X мкг~' % от контроля
0 45
0.01 45 100
0.05 54 120
0.10 64 138 Оф-
0.5 58 129
1.0 4.5 10
Примечание. * мкг — Р. Условные обозначения на с. 97.
Таблица 23
Включение 32Р в фосфолипиды срезов различных областей мозга морской
свинки (Hokin, 1969)
Область мозга ' ' Г‘ с> Удельная радиоактивность фосфолипидов, * нмп • мин-1 • мкг"
фосфатидная кислота фосфатидил- инозитол фосфатндил- холин фосфатндилэта- ноламин + фос- фатидилсернн
Кора мозжечка 276 + 31 458 + 61 245 + 32 200 + 30
Обонятельная луковица 190+17 214 + 29 192 + 30 88±7
Кора больших полушарий 131 + 12 159 + 28 140 + 26 66±8 \
Гипоталамус 175 + 39 210±40 184 + 25 114 ± 23
Таламус 182 + 33 193 + 25 147 + 20 107±26
Полосатое тело 103± 17 54 ±4 66+10 33 + 4
Четверохолмие заднее 267 ±27 122+ 19 162 + 29 154 ±49
Четверохолмие переднее 263 ±32 117+21 199 + 33 177±43
Примечание. * мкг — Р.
98
тельно короткоживущий изотоп (период полураспада 14 дней)
и его УР существенно меняется при хранении и значительно отли-
чается от паспортных данных.
Зная УР предшественников, можно определить ОУР отдельных
фракций фосфолипидов и рассчитать константу скорости обмена
(/Q и период полураспада ((|/2):
0УР=^~
предш.
_ОУР _ 0.693
«V Г. <1/2
где УРфЛ. — удельная радиоактивность фосфолипидов (УРС
или УРр); УРпредш. — удельная радиоактивность предшествен-
ников; t—время инкубации среза. При t=l ч Ау = ОУР.
Данные, полученные нами при изучении интенсивности об-
мена фосфолипидов срезов коры головного мозга крыс, пред-
ставлены в табл. 21. В качестве радиоактивного предшественника
использовали 2-|4С-ацетат. Его УР в среде инкубации была
16 000 имп • мин”1 • мг”1 (мг — С).
Примеры, полученные разными авторами по интенсивности
метаболизма фосфолипидов, представлены в табл. 22, 23. Абсолют-
ные величины УР фосфолипидов сильно различаются в разных
работах, так как они зависят от УР предшественника, его коли-
чества, способа подсчета радиоактивности, от чувствительности
счетчика.
На этих примерах видно, что преимущества работы со срезами
еще очень мало использованы в исследованиях метаболизма
фосфолипидов, которые носят чаще всего относительный качест-
венный характер (Hokin, Hokin, 1955; Magee et al., 1956; Grossi
et al., 1960; Magee, Rossiter, 1963; Hokin, Brown, 1969; Hokin, 1969,
1970; Chan et al., 1982; DeScarnati et al., 1982; Incorporation
of. . ., 1982).
ГЛАВА 5
КОМПАРТМЕНТАЛЬНЫЙ АНАЛИЗ ОБМЕНА НАТРИЯ
В СРЕЗАХ МОЗГА
Обмен электрогенных ионов, и в первую очередь натрия, пред-
ставляет большой интерес для нейрофизиологии и нейрохимии.
Активный транспорт натрия через клеточную мембрану является
основной формой превращения энергии органического метабо-
лизма в ионные потоки. Пассивные потоки натрия по градиенту
концентрации являются основными носителями ВПСП и восходя-
щей части спайка (см. обзоры: Костюк, 1977; Hondenghem, 1978;
Костюк, 1979; Крышталь, 1979). Обмен натрия сопряжен с обме-
ном многих полярных соединений, особенно медиаторов (Fishman
et al., 1977; Глебов, Крыжановский, 1978).
Однако в противоположность простейшим объектам типа
аксона кальмара (Baker et al., 1969) и культуры клеток (Kukes
et al., 1976) обмен натрия в ткани мозга млекопитающих почти
не изучен, главным образом вследствие методических трудностей.
В 50-х гг. текущего столетия получил развитие так называемый
компартментальный анализ обмена веществ с использованием
изотопов. Вкратце сущность его заключается в том, что на осно-
вании динамики обмена веществ в сложной системе взаимо-
действующих фракций (компартментов) рассчитываются пара-
метры кинетики обмена каждой фракции в отдельности.
Основы математического аппарата компартментального ана-
лиза были описаны в 1960 г. Хаксли и Соломоном (Huxley, 1960;
Solomon, 1960), однако правильное применение компартменталь-
ного анализа встречается весьма редко.
В работах Соломона и Хаксли описан математический аппарат
для двухфракционной системы обмена, тогда как в действитель-
ности число фракций натрия в ткани больше. В интактном мозгу,
в условиях внутривенного введения или инфузии радиоактивного
натрия, его обмен с тканью весьма затруднен гемато-энцефали-
ческим барьером; периоды полуобмена натрия мозга составляют
30 мин и более (см. обзоры: Росин, 1978; Bradbury, 1983),
т. е. заведомо не отражают интенсивности трансмембранных
обменных потоков. Поэтому использование срезов мозга, лишен-
ных ГЭБ, дает большие преимущества для применения компарт-
ментального анализа. Этот метод изучения обмена натрия в срезах
мозга крыс был применен в работах Херц (Hertz, 1968), Кисеей
100
и Воллгрен (Keesey, Wallgren, 1965), в подробном исследовании
Франк (Franck, 1970), однако во всех случаях математический
аппарат метода использован неверно, а полученные численные
данные ошибочны. Прежде чем остановиться на технике анализа,
вернемся к его теоретическим основам.
Метод заключается в наблюдении динамики обмена радиоак-
тивного натрия ткани на нерадиоактивный натрий среды и даль-
нейшем расчете составляющих обменных потоков натрия. Важней-
шим необходимым условием такого расчета является возможность
описания потоков натрия с помощью уравнений кинетики реакций
первого порядка (см. обзор: Лев, 1975).
При условии стационарного распределения натрия в период
измерения скорость изменения количества радиоактивной метки
в каждом компартменте ткани и экспериментальном компартменте
(среда инкубации, не содержащая изотопа) можно представить
системой линейных дифференциальных уравнений, описывающих
обмен метки между компартментами в виде потоков:
где Qi(j) — количество радиоактивной метки в i-ом (j-ом) ком-
партменте; Кц — константа скорости обмена i-ro компартмента
с j-ым, т. е. часть ионов i-ro компартмента, перешедшая в j-ый
в единицу времени (/) через всю площадь раздела компартментов;
М — количество обменивающихся компартментов.
Суммарная динамика выхода метки из ткани должна иметь вид:
£
^(0 “ Z ‘ е ’
I = I
где Q(t) — количество радиоактивной метки в ткани в момент вре-
мени; Xj — экспоненциальная константа в i-ом экспоненциальном
члене уравнения, описывающего динамику выхода радиоактивной
метки; Я, — коэффициент в решении уравнения для i-ro компарт-
мента; М — число экспонент, соответствующее числу обмени-
вающихся компартментов.
Решив системы уравнений, на основании параметров экспонент
Я, и Xj можно рассчитать величины начального распределения
изотопа в тканевых компартментах (Qi, Qj. . .) и константы ско-
рости их обмена (/fy, Ку, . . .). Следует подчеркнуть, что во многих
работах делается ошибка — отождествление показателей X, с кон-
стантами скорости, а величин Н-, — с величиной компартментов.
Уже при двухкомпартментальной системе возможна трехкратная
ошибка в измерении «медленного» компартмента (Huxley, 1960),
а для трехкомпартментальной модели расчет истинных параметров
впервые был выполнен В. Л. Кузнецовым (1975).
101
Рис. 40. Пример разложения кривой динамики выведения Na-22 на составляющие
экспоненциальные процессы (по: Емельянов и др., 1980).
Вверху приведены некоторые случаи взаимодействия фракций системы. Объяснения в тек-
сте. По оси абсцисс: время, мин. По оси ординат: логарифм остаточной радиоактивности
ткани (1g Q).
На рис. 40 графически представлено разложение на состав-
ляющие динамики выхода 22Na из срезов коры мозга крыс.
Как следует из теоретических основ метода, при проведении
эксперимента должны быть предусмотрены два главных обстоя-
тельства: во-первых, достаточная степень стационарности состоя-
ния объекта по исследуемому веществу, в данном случае по Na;
во-вторых, проведение экспериментов с минимальной ошибкой
в каждой временной точке динамики выхода изотопа.
Мы рекомендуем следующую технику
эксперимента
Приготовление радиоактивной среды. Существуют 2 радиоак-
тивных изотопа натрия — 24Na и 22Na. 24Na имеет период полу-
распада около 14 ч, поэтому при его использовании можно в одних
и тех же пробах сначала измерять радиоактивность, а через
102
10—12 дней, когда радиоактивность падает практически до 0,
измерять методом пламенной фотометрии содержание Na. Однако
малый период полураспада имеет и большие неудобства: необхо-
димо ставить эксперименты в короткий период после получения
изотопа и даже в период измерения радиоактивности проб одного
опыта вносить в каждую пробу поправку на степень распада изо-
топа за период измерения. 22Na имеет период полураспада около
2.5 лет, поэтому его можно использовать в течение длительного
времени после получения и никаких поправок на изменение радио-
активности за период измерения не требуется. Однако невозможно
в одних и тех же пробах измерять и радиоактивность и содержа-
ние Na. Содержание Na приходится измерять в параллельных
опытах, поставленных в идентичных условиях, но без радиоактив-
ного изотопа. В целом кажется более предпочтительным использо-
вание изотопа 22Na.
Изотоп 22Na поставляется в виде фасовки активностью 19.5 мБк
или 39 мБк в малом объеме 1 н НС1. После вскрытия ампулы содер-
жимое отбирают пипеткой с тонким носиком и переносят в стакан-
чик. Добавляют 1 мл 0.154 н NaCl и титруют с помощью 0.31 н
NaOH до pH 7.4 (двойной объем щелочи по отношению к паспорт-
ному объему фасовки добавляют сразу, а затем титруют по каплям,
тонкой стеклянной палочкой перенося малые количества раствора
из стаканчика на индикаторную бумажку). При случайном пере-
титровывании необходимая величина pH достигается с помощью
0.31 н НС1. Стаканчик с раствором изотопа и индикаторные
бумажки должны находиться в чашках Петри, а те в свою оче-
редь — в кювете с подстилкой из фильтровальной бумаги, во избе-
жание радиоактивного загрязнения.
После нейтрализации подсчитывают объемы затраченных
растворов и доводят общий объем раствора изотопа с помощью
0.154 н NaCl до 5 или 10 мл в зависимости от дозы изотопа, так
чтобы радиоактивность стала равной 4 мБк • мл”1 (100 мккюри X
Хмл”1). Количество 22Na очень мало, поэтому им можно прене-
бречь и считать, что в стаканчике содержится 0.154 н 22NaCI.
Раствор расфасовывают по 1 мл во флакончики с резиновыми
пробками и помещают в свинцовые контейнеры. В дальнейшем
для опыта берут не более 1 контейнера.
В каждом опыте в среде инкубации 10 % конечного объема
среды замещается раствором изотопа, так что конечная радиоак-
тивность составляет 0.4 мБк • мл-1 (10 мккюри • мл”1). Для этого
готовят вначале так называемую неполноценную среду инкубации,
в которой количество 0.154 н NaCl ниже необходимого. Так,
при приготовлении 45 мл среды Мак-Ильвейна (Глава 1) коли-
чество 0.154 н NaCl составляет 31.7 мл. После этого среду делят
на 2 порции: первая порция предназначается для преинкубации —
на 9 мл «неполноценной» среды добавляют 1 мл нерадиоактивного
0.154 н NaCl; вторая порция предназначена для насыщения среза
изотопом, и в нее добавляют приготовленный ранее раствор
изотопа в количестве 0.1 мл на каждые 0.9 мл среды.
103
При компартментальном методе требуются довольно большие
! количества инкубационных сред. Например, на опыт с тремя сре-
зами готовят 450 мл среды; в «неполноценную» среду берут 317 мл
0.154 н NaCl, затем отбирают в 3 инкубационные колбы по 0.9 мл
среды и добавляют по 0.1 мл раствора изотопа; в остаток «неполно-
ценной» среды добавляют 44.7 мл (можно 45 мл) 0.154 н NaCl.
Для каждого среза приготовляют 1 мл нерадиоактивной среды
для преинкубации, 1 мл радиоактивной среды для насыщения изо-
топом, ставят в термостатированную ванну 20 стаканчиков Хаге-
дорна с круглым дном (по 5 мл нерадиоактивной среды в каждом)
для измерения динамики выхода изотопа, бюкс с 10 мл нерадио-
активной среды для первичного ополаскивания и готовят фторо-
пластовую чашечку для помещения среза после смыва (измерение
остаточной радиоактивности среза).
Преинкубация среза в нерадиоактивной среде для установ-
ления стационарного состояния по уровню натрия. Динамика
ионного состава срезов после препаровочной травмы представлена
на рис. 8. Видно, что в интервале 0.25—3 ч после приготовления
среза уровень натрия в нем держится достаточно стационарно.
Как указывалось (Глава 1), смена среды инкубации является
. экспериментальным приемом, который благотворно ^сказывается
на состоянии среза. Поэтому через 30 мин после преинкубации
среза в нерадиоактивной среде его переносят в среду того же
состава, содержащую радиоактивный изотоп.
Приготовление и преинкубация срезов проводятся, как обычно
(Глава 4). Поскольку все расчеты ведутся в процентах от исходной
радиоактивности, взвешивания срезов не требуется. После преин-
кубации срез переносят алюминиевым крючком в радиоактивную
среду и инкубируют еще 30 мин.
Расчет ОУР натрия срезов по отношению к натрию среды инку-
бации. Основной критерий длительности инкубации среза в среде
с радиоактивным изотопом — установление стационарного состоя-
ния, т. е. величины ОУР измеряемого вещества, близкой к 1
по отношению к предшественнику в среде. В данном случае речь
идет об ОУР натрия. В параллельных опытах без изотопа опреде-
ляют содержание натрия в среде инкубации и срезах. Затем изме-
ряют радиоактивность нескольких порций радиоактивной среды
(по 0.05 мл, пересчет в имп • с"1 • мл-1) и нескольких инкубиро-
ванных срезов (срезы необходимо предварительно взвесить, чтобы
рассчитать радиоактивность в импульсах в секунду на 1 грамм
исходной «свежей» массы). Пример расчета ОУР натрия срезов
коры мозга крысы; содержание Na в среде— 151 ±0 6 мкмольх
Хг"1; содержание Na в срезах — 87±1.4 мкмоль • г-1; радиоак-
тивность среды — 86 120±353 имп.• мл-1 • срадиоактивность
срезов — 47 684±241 имп. • г-1 • с-1; УР Na среды — 570±
±12 имп. хмкмоль-1 • с"1; УР Na среза — 548±5 имп. •
• мкмоль"1 • с"1; ОУР Na среза — 0.961 ±0.029.
Как показали специальные опыты, для трех отделов мозга —
неокортекса, гиппокампа и мозолистого тела — ОУР Na срезов
104
при инкубации в течение 30—60 мин изменяется не более чем
на 0.01 и составляет 0.94—0.97. 3—6 % общего натрия ткани
за этот промежуток времени в обмен не вступают. На это следует
сделать поправку при анализе экспериментального материала.
Измерение динамики выхода изотопа. Эта часть опыта требует
максимального внимания и точности для уменьшения эксперимен-
тальной ошибки, которая сильно сказывается на результатах
расчета (Atkins, 1972, 1974; Robertson, 1962).
Срез, насыщенный радиоактивным изотопом, необходимо
отмыть от наружного радиоактивного загрязнения, которое явля-
ется маловоспроизводимым и сильно искажает результаты изме-
рений. Для этого при включенном секундомере приблизительно
за 30 с до контрольного периода измерения динамики смыва срез
вынимают жестким гладким металлическим крючком из инкуба-
ционной колбы и точно за 10 с до контрольного периода погружают
в бюкс с 10 мл нагретой нерадиоактивной среды; срез слегка опо-
ласкивают и точно в момент прохождения стрелки секундомера
через нулевую отметку вынимают из бюкса, помещают в контейнер
для быстрого переноса и погружают в первый стаканчик со смыв-
ной средой. После различных проб мы остановились на том вари-
анте, при котором весь период измерения динамики выведения изо-
топа разбивается на одинаковые интервалы. Для изучения обмена
Na в срезах мозга удобным оказался пятиминутный период смыва,
который был разбит на 20 интервалов по 15 с. Весьма важно точно
соблюдать время извлечения контейнера со срезом из предшест-
вующего стаканчика, так чтобы отряхивание контейнера (постуки-
ванием о стенку стаканика) приходилось точно на конец соот-
ветствующего интервала. Некоторое запаздывание опускания кон-
тейнера со срезом в последующий стаканчик большого значения
не имеет, так как во время переноса происходит обмен изотопа
между тканью и каплей окружающего раствора, а затем очень
быстро капля обменивается с раствором последующего стакан-
чика. После переноса среза через все 20 стаканчиков и последнего
отряхивания срез извлекают пинцетом и помещают во фторопла-
стовую чашку. Если нет необходимости определять соотношение
влажной и сухой массы среза, можно помещать срез прямо
в пустой стаканчик Хагедорна для последующего измерения оста-
точной радиоактивности. Не следует путать первый пинцет, кото-
рым срез извлекали из бюкса, (он прикасался к ткани, обладающей
высокой радиоактивностью) и второй пинцет для конечного извле-
чения среза (этот пинцет должен быть радиоактивно чистым).
Контейнер для быстрого переноса среза. В литературе описаны
несколько конструкций подобного рода (Keesey, Wallgren, 1965;
Franck, 1970), однако опыт показал, что они затрудняют обмен
веществ среза и захватывают довольно большое и плохо учиты-
ваемое количество радиоактивной среды из предшествующей
пробы в последующую. Чтобы снизить ошибку, вызванную этим,
мы,сконструировали контейнер из фторопласта в виде перфориро-
ванного колодца. Перемешивание среды и поддерживание среза
105
Д
Б
Рис. 41. Фторопластовый контейнер для быстрого переноса среза ткани в опытах
с измерением динамики обмена радиоактивного Na.
А — общий вид; Б — схема применеиия. 1 — фторопластовый колодец; 2 — перфорации;
3 — несущий стержень из нержавеющей стали; 4 — капилляр для подведения кислорода;
5 — соединительный блок; 6—опорная плаика, регулирующая глубину погружения;
7 — стаканчик Хагедорна; 8 — срез ткани; 9 — инкубационная среда; 10 — термостатирую-
щая баня; стрелка— иаправление поддува О2.
во взвешенном состоянии осуществляется с помощью струи кисло-
рода, направленной снизу через капилляр под постоянным давле-
нием. Вид контейнера изображен на рис. 41.
Контейнер изготавливают из цилиндрического блока фторо-
пласта диаметром не менее 30 мм и длиной не менее 50 мм. Сфери-
чески заточенным сверлом в блоке высверливают круглодонный
колодец диаметром 15 мм, насаживают блок на 15-миллиметровый
шаблон со сферическим концом и обтачивают на токарном станке
до тех пор пока по всему профилю колодца толщина стенки не ста-
нет 0.5—0.7 мм. Затем вытачивают площадку для рукоятки 3
и отрезают заготовку нейтральнее площадки. Вручную ножницами
обрезают площадку до сектора 7—8 мм. Вырубкой в стенках
колодца, одетого на шаблон, делают отверстия диаметром
2.5—3 мм. Многолетний опыт применения этого контейнера
для быстрого переноса позволяет оценить его положительно.
С помощью такого контейнера ошибка во времени переноса
среза в каждый последующий стаканчик не превышает 0.3 с.
Кислород в капилляр контейнера подается от редуктора кислород-
ного баллона под контролем водного манометра, включенного
параллельно. Скорость кислородной струи значительно сказыва-
ется на перемешивании среды инкубации и вероятности травма-
тизации среза: оптимальное давление устанавливается на 20—
25 мм водного столба выше, чем необходимо для преодоления
поверхностного натяжения жидкости на кончике капилляра
и для начала тока кислорода. Давление следует поддерживать
постоянным в течение всей серии опытов с точностью до 2—3 мм
водного столба. Расход кислорода в течение 35 мин не превышает
20 л.
Редуктор, который не в состоянии поддержать требуемую ста-
бильность тока струи кислорода, следует заменить.
Измерение радиоактивности образцов. Мы измеряли радиоак-
тивность на радиометре «Волна» с помощью крупных сцинтилля-
ционных кристаллов NaJ, активированного Т1, с колодцами сече-
нием 32 мм, так что стаканчики Хагедорна с порциями отмытого
изотопа погружались в колодец целиком. Относительная ошибка
счета не должна превышать 1 %. После каждых 2 проб следует
просчитать фоновую импульсацию, так чтобы величину среднего
фона вычесть из каждого счета пробы. Если используется автома-
тический счетчик с малым объемом камеры, в счетные виалы отби-
рают по 1 или 2 мл из каждой пробы. Для наименьшего загрязне-
ния каждого раствора одним наконечником дозатора берут пробы
по нарастающей радиоактивности, т. е. от 20-го до 1-го стаканчика;
для следующей кривой берут другой наконечник дозатора. Срезы
с остаточной радиоактивностью помещают в виалы целиком.
Расчет результатов. Автор математического аппарата компарт-
ментального анализа В. Л. Кузнецов (1975) создал ряд программ
для полностью автоматизированного расчета результатов опыта
на ЭВМ М4030 в Межинститутском вычислительном центре.
АН СССР в селе Павлово (программы FM 1200, F 19 NA1 и послед-
107
няя, наиболее совершенная FTEQpp). Этапы вычисления сво-
дятся к следующему.
Радиоактивность всех проб (за вычетом фона) суммируется
и принимается за 100 %. По оси абсцисс откладывается время
в мин. Путем последовательного вычитания радиоактивности каж-
дой пробы вычисляется остаточная радиоактивность ткани в каж-
дый момент времени в процентах от исходной и откладывается
по оси ординат в логарифмическом масштабе. Следующим этапом
является вычисление количества и параметров экспоненциальных
составляющих суммарной кривой. Программа предусматривает
вычисление 2, 3, 4 и более экспонент, однако практически в ткани
воспроизводимо выделяются 3 экспоненциальных компонента
обмена 22Na. Ван Лью (Van Liew, 1967) разработал графический
ручной способ разложения кривой динамики на составляющие.
В. Л. Кузнецов (1975) предложил алгебраическое решение
на основании представления кривой как суммы экспонент и изго-
товил соответствующую программу для машинного решения.
Способ В. Л. Кузнецова является значительно более точным:
отклонение расчетной кривой от экспериментальной в каждой
;точке, как правило, не превышает 0.1 % от абсолютной остаточной
'радиоактивности в данной точке. Однако для наглядности этапов
вычисления на рис. 40 приведены результаты графического разло-
жения. Видно, что кривая разложена на 3 экспоненциальные
составляющие. Для каждой из них отрезок на оси ординат в нуле-
вой момент времени составляет величину данного компартмента
• в процентах. Тангенс угла наклона каждой составляющей есть
скоростная характеристика обмена данного компартмента.
Следующим этапом является приведение параметров к истин-
ному нулевому времени с учетом периода ополаскивания по фор-
муле:
— .г: Д Д(о) =Д .е“х'Л '
где t0 — период ополаскивания срезов (0.1666 мин); Д — значе-
ния величин Н, вычисленные в предположении, что начальным
моментом кривой динамики является момент конца ополаскива-
ния; /7i(o) — значения величин Н, вычисленные в истинный началь-
ный период времени.
После вычисления каждой /Уц0) их сумма приравнивается
к 100 %, и значение каждой Д вычисляется вновь в процентах.
Графически процедуру можно представить как экстраполяцию
левой части кривой путем сдвига оси ординат к истинному нуле-
вому времени — на 0.1666 мин влево. Эта поправка весьма значи-
тельна.
Наконец, последний этап. Если бы кинетические компартменты
были независимы друг от друга, параметры экспонент и были бы
параметрами обмена. Однако поскольку компартменты взаимосвя-
заны в общую систему обмена (рис. 40), то, для того чтобы на осно-
108
□
Рис. 42. Схема последовательной модели обмена применительно к нервной ткани
среза.
Qi — внеклеточный; Q2 — свободный внутриклеточный; Q3 - связанный внутриклеточный
Na. Объяснение в тексте.
3 5
вании параметров экспонент вычислить параметры обмена фрак-
ций, требуются сложные формулы перехода. Они также вычислены
В. Л. Кузнецовым и заложены в программу. Для ручного расчета
они опубликованы в работе В. Л. Кузнецова и соавторов (1974).
В итоге вычисляются следующие параметры обмена NarQ, —
величины кинетических фракций, мэкв • кг-1 (кг — ткань); —
константа скорости перехода натрия из фракции Q; во фракци
Qj мин-1; Рц — обменный поток Na из фракции Q: во фракци
Qi мэкв • кг-1 • ч-1; Рц^Кц • Qi • 60.
Программой FTEQ00 предусмотрен расчет обмена Na
в объеме трех тканевых фракций по двум моделям обмена —
«последовательной» и «параллельной» (рис. 42). Интерпретация
природы фракций Na — Q,, Q2, Q3 уже дана в литературе (Гарина,
Емельянов, 1976). Вкратце, при «последовательной» модели фрак-
ция Q| представляет собой Na внеклеточного пространства, Q2 —
свободный внутриклеточный и Q3 — связанный внутриклеточ-
ный Na. Конечно, эти модели являются предварительными. Более
точной была бы модель вида:
Q4 s=i Q2 si Q । si Q3 si Q3,
но она пока не может быть рассчитана.
До сих пор не разработана техника анализа нестационарных
состояний, при которых константы скорости являются перемен-
Таблица 24
Величина кинетических фракций натрия в некоторых отделах
мозга крыс при измерении компартментальным методом (по: Емель-
янов и др., 1980, 1983).
* Отделы мозга Фракции натрия, мэкв кг 1
Qi Q2 Q3
Неокортекс 64.6 15.5 1.4
Гиппокамп 57.4 30.0 8.4
Мозолистое тело 56.2 31.9 12.1
Примечание. Обозначения на с. 109.
109
Таблица 25
Константы скорости обмена различных фракций натрия в некоторых отделах
мозга крыс при измерении компартментальным методом (по: Емельянов и др.,
1980, 1983)
Отделы мозга Константы скорости, мин 1
к2, К,2 к32 К23
Неокортекс 1.374 0.347 0.241 0.022
Гиппокамп 1.304 0.429 0.368 0.055
Мозолистое тело 0.980 0.562 0.218 0.087
Примечание. Обозначения на с. 109.
Таблица 26
Обменные потоки натрия в ткани некоторых отделов
мозга крыс при измерении компартментальным методом
(по: Емельянов и др., 1980, 1983)
Потоки натрия,
л. Отделы мозга мэкв • кг ’ • ч 1
О ^21 = ?12 Рз2 = Р23 ,
Неокортекс 2760 254
Гиппокамп 2120 116
Мозолистое тело 1874 159
Примечание. Обозначения на с. 109.
Таблица 27
Затраты энергии на транспорт натрия (А) в срезах некоторых
отделов мозга крыс
Отделы мозга П, мкмоль X Хг“1 • ч^1 Б, ккал X Хкг 1 • ч’* А, ккал X Хкг"1 • ч1 А. % от Б
Неокортекс 200 22.0 3.747 17.0
Гиппокамп 150 16.5 4.490 27.3
Мозолистое тело 100 11.0 3.649 33.2
Примечание. П — потребление О2; Б — энергия дыхания. I ккал =
= 4.1868 кДж.
ными величинами. Это представляет собой задачу ближайшего
будущего. Однако и сейчас компартментальный анализ обмена Na
пригоден для сравнительного анализа обмена Na в разных отде-
лах мозга (табл. 24, 25, 26) и его сопоставления с энергетическими
и биоэлектрическими характеристиками; для вычисления отдель-
ных потоков Na через единицу поверхности мембраны ткани ЦНС
(такой анализ дан в работе И. А. Гариной и Н. А. Емельянова,
1976); для анализа стационарных эффектов медиаторов, нейро-
физиологических и других нейроактивных веществ.
НО
По данным Конвея (Conway, 1964), затраты энергии (AG°)
на перенос ионов выражаются формулой:
или при 37 °C:
/ Na \
AG° = L43(1^+1^)-
Поскольку (?! отражает долю внеклеточного Na ткани, кон-
центрация которого равна |Wae] среды, то объем внеклеточного
пространства (Ре) выражается в долях 1 и равен: Ve =
= Объем внутриклеточного пространства (V)) также
выражается в долях от 1 и равен: V-, = 1 — Ке. Внутриклеточная
концентрация Nai (Д)) может быть вычислена по формуле:
Nat — Nae Ve
где Nat — общее содержание Na в инкубируемой среде,
мэкв • кг1; — концентрация Na в среде, мэкв • л-1;
—внутриклеточная концентрация Na в инкубируемом срезе,
мэкв • кг’1 (масса внутриклеточной фракции); Vе — объем вне-
клеточного пространства, в долях от 1; V\— объем внутриклеточ-
ного пространства, в долях от 1.
Общие затраты энергии на транспорт Na (Л, ккал • кг'1X
Хч'1) рассчитываются по формуле:
А = AG° • Р21.
Величины таких затрат в некоторых отделах мозга крыс приведены
в табл. 27.
Компартментальный анализ пригоден для изучения обмена
органических соединений во всех случаях, когда стационарное
состояние может быть установлено за период инкубации до 6 ч
и когда можно с достаточной точностью измерить УР изучаемого
вещества, т. е. с точностью до 1—2 % можно измерить количество
данного вещества в ткани среза (при стационарном состоянии
достаточно однократного измерения в параллельных опытах
без радиоактивного изотопа).
ЗАКЛЮЧЕНИЕ
Несомненно, приведенные выше материалы являются непол-
ными и в значительной мере отрывочными, иллюстративными.
Малый объем книги не позволил их расширить. Однако, по нашему
мнению, приведенный материал в достаточной степени характе-
ризует пригодность срезов мозга как объектов для изучения дина-
мики функциональных и метаболических процессов. Главное —
эти процессы могут изучаться параллельно. Поэтому пережи-
вающий срез мозга приобретает все большее значение в функцио-
нальной нейрохимии.
Обращает на себя внимание то, что за последние годы растет
удельный вес исследований межнейрональных взаимодействий
на срезах. Подобное изучение интегративной деятельности нервной
системы несомненно приведет к новым методическим приемам.
Анализ обмена Na показал, что на срезе можно исследовать
параметры кинетики с высокой точностью, однако до сих пор ком-
партментальный анализ не был использован при изучении обмена
органических соединений. Переживающий срез является, веро-
ятно, единственным объектом, на котором достаточно точно можно
применить классическую триаду сопряженных биохимических
показателей: количество вещества, скорость его радиоизотопного
обмена и активность соответствующих ферментов.
Разумеется, не следует абсолютизировать значение срезов.
Это лишь один в огромном ряду объектов различной степени слож-
ности, и полученные на нем результаты должны быть сопоставлены
с результатами, достигнутыми на объектах других классов.
СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ
АМФ — аденозин-5'-монофосфат;
АТФ — аденозин-5'-трифосфат;
АХ — ацетилхолин;
БАВ — биологически активные ве-
щества;
ВП — вызванный потенциал;
ВПСП — возбуждающий постсинап-
тический потенциал;
ГАМК — гамма-аминомасляная кис-
лота;
ГЭБ — гемато-энцефалический ба-
рьер;
ДК — дыхательный коэффициент;
ДНФ — динитрофенол;
КФ — креатинфосфат;
ЛОТ — латеральный обонятельный
тракт;
мВПСП — миниатюрный возбуждаю-
щий постсинаптический по-
тенциал;
МП — мембранный потенциал;
ОУР — относительная удельная ра-
диоактивность;
ПД — потенциал действия;
ПСП — постсинаптический потенциал:
ПТП — посттетаническая потенциация:
РРО — 2,5-дифенилоксазол;
РОРОР — 1,4-ди(5-фенил-2-оксозолил-
бензол);
ТПСП — тормозный постсинаптиче
ский потенциал;
ТСХ — тонкослойная хроматогра-
фия;
ТХУК —трихлоруксусная кислота;
УР — удельная радиоактивность;
ЦТК — цикл трикарбоновых кислот.
112
ЛИТЕРАТУРА
Александров А. А. Метод микроэлектро-
фореза в физиологии. Л.: Наука,
1983. 148 с.
Богданова Т. С., Емельянов Н. А. Влия-
ние введений гидрокортизона на ско-
рость анаэробного гликолиза в срезах
коры головного мозга крыс. — Пробл.
эндокринол., 1974, т. 20, № 1, с. 47—
52.
Богданова Т. С., Подвигина Т. Т. Корти-
костероиды и энергетический обмен
мозга. — В кн.: Гипофизарно-адрена-
ловая система и мозг. Л.: Наука,
1976, с. 107—134.
Брагин А. Г., Виноградова О. С., Отма-
хов Н. А. Исследование непереклю-
ченных влияний перфорирующего
пути на нейроны поля САЗ гиппо-
кампа in vitro. — Докл. АН СССР,
1977а, т. 233, № 1, с. 249—252.
(Брагин А. Г., Жадина С. Д., Виногра-
дова О. С., Кожечкин С. Н.) Bra-
gin A. G., Zhadina S. D., Vinogra-
dova О. S., Kozhechkin S. N. Topo-
graphy and some characteristics of the
dentate fascia — field CA3 relations
investigated in hippocampal slices in
vitro. — Brain Res., 19776, vol. 135,
N 1, p. 55—66.
Воробьев В. С., Скребицкий В. Г. Внут-
риклеточное исследование ответов пи-
рамидных нейронов поля САЗ гиппо-
кампа при стимуляции зубчатой фас-
ции на переживающих срезах моз-
га. — В кн.: Современные проблемы
общей физиологии возбудимых обра-
зований. Киев: Наукова думка, 1978,
с. 152—158.
Воронин Л. Л., Башкис А. В., Булда-
кова С. Л., Скребицкий В. Г. Дли-
тельная потенциация реакций новой
коры целого мозга и переживающих
срезов коры. — Физиол. журн. СССР,
1984, т. 70, № 8, с. 1167—1177.
Гарина И. А., Емельянов Н. А. Влияние
гидрокортизона на кинетику обмена
натрия в срезах коры головного мозга
. интактных и адреналэктомированных
крыс. — В кн.: Гипофизарно-адрена-
ловая система и мозг. Л.: Наука,
1976, с. 135—154.
Глебов Р. Н., Крыжановский Г. Н.
Функциональная биохимия синапсов.
М.: Медицина, 1978. 328 с.
Евдокимов С. А., Емельянов Н. А. Бипо-
лярный стимулятор для раздражения
объектов с малым электрическим соп-
ротивлением. — Физиол. журн. СССР
1978, т. 64, № 11, с. 1673—1675.
Емельянов Н. А. Измерение выделения
или поглощения газов волюметриче-
ским методом с помощью аппарата
Варбурга. — Укр. биохим. журн.,
1971, № 3, с. 390—392.
Емельянов Н. А., Багаева Т. Р., Куз-
нецов В. Л., Дмитриева Н. И. Обмен
22Na в ткани мозолистого тела
крыс. — Физиол. журн. СССР, 1983,
т. 69, № 7, с. 895—899.
Емельянов Н. А., Богданова Т. С., Га-
рина И. А., Подвигина Т. Т. О воз-
можности моделирования изменений
обмена веществ в нервной ткани при
стрессе с помощью опытов на срезах
коры мозга in vitro. — В кн.: Гипофи-
зарно-адреналовая система и мозг.
Л.: Наука, 1976, с. 155—173.
Емельянов Н. А., Гарина И. А. Дина-
мика распределения электролитов и
поглощения кислорода срезами коры
мозга крыс при различных условиях
инкубации. — Укр. биохим. журн.,
1970, № 1, с. 50—55.
Емельянов Н. А., Кузнецов В. Л., Ба-
гаева Т. Р. Обмен 22Na в срезах гиппо-
кампа крыс. — Физиол. журн. СССР,
1980, т. 66, № 6, с. 816—822.
Есаян Н. А., Казарова Е. К. Неоргани-
ческие ионы в механизме действия
гамма-аминомасляной кислоты на вы-
свобождение норадреналина из сре-
зов среднего мозга. — В кн.: Вопросы
8 Заказ 1012
113
биохимии мозга. Ереван: Изд-во
АН АрмССР, 1970, т. 6, с. 161 — 166.
Иванов К- П. О биологических условиях
и физиологических механизмах снаб-
жения кислородом тканей головного
мозга. — Успехи физиол. наук, 1974,
т. 5, № 2, с. 128—144.
Каранов А. М., Брагин А. Г. Экспери-
ментальная камера для переживаю-
щих срезов мозга. — Журн. высш,
нерв, деятельности, 1983, т. 33, № 5,
с. 970—972.
Карнаухов В. Н., Лукьянова Л. Д., Хас-
пеков Л. Г., Браиловская В. Г. Дина-
мика окислительно-восстановитель-
ных состояний срезов коры головного
мозга. — В кн.: Биофизика живой
клетки. Пущино, 1972, вып. 3, с. 118—
123.
Кондрашова М. Н. Принципиальные
преимущества полярографического
изучения дыхания перед манометри-
ческим. — В ки.: Руководство по изу-
чению биологического окисления по-
лярографическим методом. М.: На-
ука, 1973, с. 86—93.
Костюк П. Г. Ионные механизмы элек-
трической возбудимости нервной
клетки. — В кн.: Современные тен-
денции в нейрофизиологии. Л.: На-
ука, 1977, с. 127—138.
Костюк П. Г. Активный транспорт ионов
в нервной клетке. — В кн.: Руковод-
ство по физиологии. Общая физиоло-
гия нервной системы. Л.: Наука,
1979, с. 182—217.
Крепе Е. М. Липиды клеточных мемб-
ран. М.: Наука, 1981. 339 с.
Крышталь О. А. Электрическая возбу-
димость тела нервной клетки. — В кн.:
Общая физиология нервной системы.
Л.: Наука, 1979, с. 112—148.
Кузнецов В. Л. Некоторые вопро-
сы компартментального анализа. —
В кн.: Прикладная математика и вы-
числительная техника в биологии. Сб.
науч. тр. Л., 1975, вып. 1, с. 53—62.
Кузнецов В. Л., Гарина И. А., Емелья-
нов Н. А. К анализу кинетики выве-
дения натрия-22 из срезов коры го-
ловного мозга крыс. — Физиол. журн.
СССР, 1974, т. 60, № 4, с. 507—512.
Кулланда К- М., Сорокина Т. С. Гипер-
поляризационные потенциалы по-
верхностных срезов коры больших по-
лушарий in vivo и in vitro. — Физиол.
журн. СССР, 1974, т. 60, № 9,
с. 1360—1368.
Лев А. А. Ионная избирательность кле-
точных мембраи. Л.: Наука, 1975.
323 с.
Лукьянова Л. Д., Балмуханов А. С.,
Уголев А. Т. Кислородзависимые про-
цессы в клетке и ее функциональное
состояние. М.: Наука, 1982. 301 с.
* Мокрушин А. А., Жилин С. П. Устрой-
ство для приготовления переживаю-
щих срезов мозга. — В кн.: Нейрон и
межнейронная интеграция. — Л.: На-
ука, 1983, с. 194—196.
Нейрохимия / Прохорова М. И., Ещен-
ко Н. Д„ Осадчая Л. М. и др. Л.:
Изд-во ЛГУ им. А. А. Жданова,
1979. 267 с.
Остерман Л. А. Исследование биологи-
ческих макромолекул электрофоку-
сированием, иммуноэлектрофорезом
и радиоизотопным методом. М.: Нау-
ка, 1983. 326 с.
(Отмахов Н. А., Брагин А. Г.) Ot-
makhov N. A., Bragin A. G. Effects of
norepinephrine and serotonin upon
spontaneous activity and responses to
mossy fibers stimulation of CA3 neu-
rons in hippocampal slices. — Brain
Res., 1982, vol. 253, N 1—2, p. 173—
183.
Палладии А. В., Белик Л. В., Поля-
кова H. М. Белки головного мозга и их
обмен. Киев: Наукова думка, 1972.
315 с.
Подвигина Т. Г., Богданова Т. С., Ми-
тюшов М. И. Интенсивность дыха-
ния и гликолиза в тканях коры, гип-
покампа и гипоталамуса крыс под
действием кортикостероидных гормо-
нов. — Нейрохимия, 1982, т. 1, № 2,
с. 189—198.
Росин я. А. Гемато-энцефалический
барьер. — Успехи физиол. наук, 1978,
т. 9, № 4, с. 7—24.
Скребицкий В. Г., Воробьев В. С. Отве-
ты нейронов поля САЗ на стимуляцию
зубчатой фасции на срезах гиппо-
кампа. — В кн.: Структурно-функ-
циональные основы организации моз-
га. М.: Медицина, 1978, вып. 7, с. 94—
98.
Тозалакян П. В., Аракелян Л. И., Гевор-
кян Г. А. Действие бикукуллина и
роль ионов кальция в высвобожде-
нии 3Н-норадреналина и |4С-гамма-
аминомасляной кислоты из срезов ме-
зо-диэнцефальной области мозга
крыс. — В кн.: Вопросы биохимии
мозга. Ереван: Изд-во АН АрмССР,
1980, вып. 14, с. 127—134.
Трушанов А. А. Изготовление в лабо-
раторных условиях закрытого поля-
рографического электрода Кларка. —
В кн.: Руководство по изучению био-
логического окисления полярографи-
114
ческим методом. М.: Наука, 1973,
с. 78- 79.
Флёров М. А., Войнер И. А. Метабо-
лизм отдельных фракций фосфолипи-
дов нейронов и нейроглии в процессе
миэлинизации. — Вопр. мед. химии,
1982, № 5, с. 81—84.
Частотная и следовая потенциация в
гиппокампальных путях / Скребиц-
кий В. Г., Воронин Л. Л., Во-
робьев В. С. и др. — Журн. высш,
нерв, деятельности, 1978, т. 28, № 3,
с. 650—657.
Шаляпина В. Г. Влияние кортикосте-
роидов на поглощение норадреналина
срезами коры головного мозга
крыс. — Пробл. эндокринол., 1974,
т. 20, № 4, с. 78—81.
Шаляпина В. Г., Милушева Ц. Б., Ма-
нухин Б. Н. Влияние гидрокортизона
на поглощение и высвобождение но-
радреналина срезами коры головного
мозга и изолированным гипоталаму-
сом белых крыс. — Физиол. журн.
СССР, 1978, т. 64, № 4, с. 454—457.
, Шаронова И. Н., Хаспеков Л. Г., Во-
робьев В. С., Скребицкий В. Г. Пла-
стические свойства нейронов гиппо-
кампа in vitro. — Вести. АМН СССР,
1978, № 12, с. 35—44.
Широкшина 3. В., Суйковская Н. В.
Разработка способов защиты про-
светленных оптических деталей от
разрушения в условиях тропиков. —
Оптико-механ. пром-сть, 1957, № 2,
с. 58—63.
Abdel-Latif A. A., Yan S. Y., Smith J. Р.
Effect of neurotransmitters on phos-
pholipids metabolism in rat cerebral
cortex slices — cellular and subcellu-
lar distribution. — J. Neurochem.,
1974, vol. 22, N 2, p. 383—393.
Adair R., Davidoff R. A. Studies of the
uptake and release of (3H) P-alanine
by frog spinal slices. — J. Neurochem.,
1977, vol. 29, N 2, p. 213—220.
Alger R. A., Nicoll В. E. Feed-forward
dendritic inhibition in rat hippocampal
pyramidal cells studied in vitro. —
J. Physiol. (Gr. Brit.), 1982, vol. 328,
N I, p. 105—123.
Alger В. E., Teyler T. J. Long-term and
short-ter[p plasticity in the CAI, CA3
and dentate regions of the rat hippo-
campal slice. — Brain Res., 1976,
vol. 110, N 3, p. 463—480.
Alger В. E., Teyler T. J. A monosynaptic
fiber track studies in vitro: evidence of
a hippocampal CAI associational sy-
stem? — Brain Res. Bull., 1977, vol. 2
N 2, p. 355—365.
Allweiss C. L„ Gainer H.. Chaikoff J. L.
Method for kinetic study of in vitro
conversion of a C14-labeled substrate
to CO2. — J. Appl. Physiol., 1960,
vol. 15, N 5, p. 949—952.
A method for concurrent measurement of
picomole quantities of acetylcholine,
dopamine, norepinephrine, serotonin,
5-hydroxytryptophan, 5-hydroxyindo-
lacetic acid, tryptophan, tyrosine, gly-
cine, aspartate, glutamate, alanine,
and gamma-amino-butyric acid in
single tissue samples from different
areas of rat central nervous system /
Smith J. G., Lane J. D., Scea P. A.
et al. — Analvt. Biochem., 1975,
vol. 64, p. 149—169.
Andersen P., Bliss T. V. P., Skrede К- K-
Lamellar organization of hippocampal
excitatory pathways. — Exp. Brain
Res., 1971, vol. 13, fasc. 2, p. 222—
238.
Andersen P., Sundberg S. H., Sveen O.,
Wigstrom H. Specific long-lasting po-
tentiation of synaptic transmission in
hippocampal slices. — Nature 1977,
vol. 266, N 5604, p. 736—737.
Appel S. H., Parrot B. L. Hexose mono-
phosphate pathway in synapses. —
J. Neurochem., 1970, vol. 17 N 12,
p. 1619—1626.
Arbilla S., Kamal L. A., Langer S. Z.
Presynaptic dopamine receptors modu-
late electrical stimulation but not
amphetamine-evoked release of 3H-do
patnine from rabbit caudate nucle-
us. — Brit. J. Pharmacol., 1980, vol. 70
N 1, p. 45—46.
Assaf S. G., Crunelli V., Kelly J. S.
Electrophysiology of the rat dentate
gyrus in vitro. — In: Electrophysio-
logy of isolated mammalian CNS pre-
parations. London e. a.: Acad. Press,
1981, p. 153—187.
Atkins G. L. Investigat' >n of the effect
of data error on the determination of
physiological parameters by means of
compartmental analysis. — Biochem.
J., 1972, vol. 127, N 2, p. 437—
438.
Atkins G. L. Weighting functions and
data truncation in the fitting of mul-
tiexponential functions. — Biochem. J.,
1974. vol. 138, N 1, p. 125—127.
Baker P. F., Blaustein M. P., Key-
nes R. D. The ouabain-sensitive fluxes
of sodium and potassium in squid
giant axons. — J. Physiol. (Gr. Brit.),
1969, vol. 200, p. 459—496.
8
115
Baney-Schwartz M., Piro L., Lajtha A.
Relationship of ATP levels to amino
acid transport in slices of mouse
brain. — Arch. Biochem. and Biophys.,
1971, vol. 145, N 1, p. 199—210.
Barker J. B., Summerset! W. H. The co-
lorimetric determination of lactic acid
in biological materials. — J. Biol.
Chem., 1941, vol. 138, p. 535—554.
Bartlett G. Phosphorus assay in column
chromatography. — J. Biol. Chem.,
1959, vol. 234, p. 466—469.
Battistin L., Grynbaum A., Lajtha A.
Energy dependence of amino acid up-
take in brain slices. — Brain Res.,
1969, vol. 16, N I, p. 187—197.
Belleroche J., de, Coutinho-Netto J.,
Bradford H. F. Dopa mine inhibition of
the release of endogenous acetylcho-
line from corpus striatum and cereb-
ral cortex in tissue sliced and synapto-
somes: a presynaptic responce? — .1.
Neurochem, 1982, vol. 39, N I, p. 217—
222.
Benjamin A. M., Quastel J. H. Localiza-
tion of amino acids in brain slices
from the rat. Tetrodotoxin-sensitive
release of amino acids. — Biochem. J.,
.1972, vol. 128, N 3, p. 631—646.
Benjamin A. M., Verjee L. H. Control of
aerobic grycolysis in the brain in vit-
ro. — Neurochem. Res., 1980, vol. 5,
N 9, p. 921—934.
Bingman D., Kolde G. RO2 profiles in
hippocampal slices of the guinea
pig. — Exp. Brain Res., 1982, vol. 48,
N 1, p. 89—96.
Benneth G. W., Marsden C. A., Sharp T.,
Stolz J. F. Simultaneous measurement
of endogenous release of dopamine,
noradrenaline, 5-hydroxytryptamine
and thyrotrophin releasing hormone
(TRH) from rat brain slices in vitro.—
Brit. J. Pharmacol., 1980, vol. 70, N 1,
p. 131.
Berl S., Nicklas W. J., Clarke D. D. Com-
partmentation of glutamic acid meta-
bolism in brain slices. — J. Neuro-
chem., 1968, vol. 15, N 2, p. 131 —140.
Blasberg R., Lajtha A. Substrate specifi-
city of steady-state amino acid tran-
sport in mouse brain slices. — Arch.
Biochem. a. Biophys., 1965, vol. 112,
N 2, p. 361—377.
Blaxter T. H. Storing brain slices. —
J. Neuroscience Methods, 1983, vol. 7,
N 4, p. 397—398.
Bliss T. V. P., Dolphin A. C. What is the
mechanism of longterm potentiation in
the hippocampus? — Trends Neuros-
ci.. 1982, vol. 5, N 2, p. 289—290.
Bliss T. V. P., L0mo T. Long-lasting
potentiation of synaptic transmission
in the dentate area of the anaestheti-
zed rabbit following stimulation of
the perforant path. — J. Physiol. (Gr.
Brit.), 1973, vol. 232, N 2, p. 331—356.
Boksa P., Collier B. Spontaneous and
evoked release of acetylcholine and
cholinergic false transmitter from bra-
in slices: comparison to true and false
transmitter in subcellular stores. —
Neuroscience, 1980, vol. 5, N 9,
p. 1517—1532.
Borgstrom L., Norberg K., Siesjo В. K-
Glucose consumption in rat cerebral
cortex in normoxia, hypoxia, and hy-
percapnia. — Acta physiol. Scand.,
1976, vol. 96, p. 569-574.
Bourque C. W., Renaud L. P. A perfused
in vitro preparation of hypothalamus
for electrophysiological studies on neu-
rosecretory neurons. — J. Neuroscien-
ce Methods, 1983a, vol. 7, N 3, p. 203—
214.
Bourque C. W., Renaud L, P. In vitro
neurophysiology of identified rat hy-
pothalamic «neuroendocrine» neu-
rons. — Neuroendocrinology, 1983b,
vol. 36, N 1, p. 161 — 164.
(Bradbury M.) — Бредбери M. Концеп-
ция гемато-энцефалического барь-
ера. M.: Медицина, 1983. 480 с.
Brown D. A., Collins G. G. S., Gal-
van М. Influence of cellular transport
on the interaction of amino acids with
GABA-receptors in the isolated gui-
nea-pig olfactory cortex. — Brit. J.
Pharmacol., 1980, vol. 68, N 1, p. 251 —
262.
Brown D. A., Halliwell J. V. An in vitro
preparation of the diencephalic interpe-
duncular nucleus. — In: Electrophy-
siology of isolated mammalian CNS
preparations. London e. a.: Acad.
Press, 1981, p. 285—308.
Brown T. H., Wong R. K- S., Prince D. A.
Spontaneous miniature synaptic poten-
tials in hippocampal neurons. — Bra-
in Res., 1979, vol. 177, N l,p. 194—199.
Browning E. T., Schulman M. P. 14C-ace-
tyicholine synthesis by cortex slices
of rat brain. — J. Neurochem., 1968,
vol. 15, N 12, p. 1391 — 1405.
Bull R. J., Lutkemhoff S. D. Early chan-
ges in respiration, a aerobic glycolysis
and cellular NAD(P)H in slices of rat
cerebral cortex exposed to elevated
concentrations of potassium. — J. Neu-
rochem., 1973, vol. 21, p. 913—922.
Caciagli F., Antonelli T., Veratti F., Bi-
anci C. Pharmacological investiga-
116
tions on electrically induced changes
of cyclic nucleotides in brain slices. —
Neurosci. Lett., 1979, vol. 13, suppi. 3,
p. 145.
Casamenti F. P., Mantovani P., Ama-
ducci L., Pepen G. Effect of phospha-
tidylserine on acetylcholine output
from the cerebral cortex of the rat. —
J. Neurochem., 1979, vol. 32, N 2,
p. 529—533.
Chan Pak Hoo, Yurko M., Fishman R. A.
Phospholipid degradation and cellular
edema induced by free radicals in
brain cortical slices. — J. Neurochem.,
1982, vol. 38, N 2, p. 525—531.
Chapman A. G., Meldrum B. S.,
Siesjo В. K. Cerebral metabolic chan-
ges during prolonged epileptic seizures
in rats. — J. Neurochem., 1977, vol. 28,
N 5, p. 1025—1035.
Charles A. K., Chang J. F. Uptake, re-
lease and metabolism of D- and L-
a-aminoadipate by rat cerebral cor-
tex.— J. Neurochem., 1981, vol. 36,
N 3, p. 1127—1136.
Chirwa S. S., Goh J. W., Maretic H.,
Sastry B. R. Evidence for a presynap-
tic role in long-term potentiation in the
rat hippocampus. — J. Physiol. (Gr.
Brit.), 1983, N 339, p. P4I—P42.
Chujo T., Yamada Y., Yamamoto C. Sen-
sitivity of Purkinje cell dendrites to
glutamic acid. — Exp. Brain Res.,
1975, vol. 23, fasc. 3, p. 293—300.
Cohen S. R. Kinetics of and rate equati-
ons for the uptake of alpha-amino-
isobutyric acid and gamma-aminobu-
tyric acid by mouse brain slices incu-
bated in a glucose-free medium contai-
ning pyruvate as the energy source. —
Brain Res., 1981, vol. 205, N I, p. 157—
168.
Collingridge G. L., Kehl S. J., Loo R.,
McLennan H. Effects of kainic and
other amino acids on synaptic excita-
tion in rat hippocampal slices: 1. Extra-
cellular analysis. — Exp. Brain Res.,
1983, vol. 52. fasc. 2, p. 170—178.
Collins G. G. S. Release of endogenous
amino acid neurotransmitter candida-
tes from rat olfactory cortex slices:
possible regulatory mechanisms and
the effects of pentobarbitone. — Brain
Res., 1980, vol. 190, N 2, p. 517—528.
Collins G. G. S., Anson J., Probett G. A.
Patterns on endogenous amino acid
release from slices of rat and guinea-
pig olfactory cortex. — Brain Res.,
1981, vol. 204, N I, p. 103—120.
Conners B. W., Gutnick M. J., Prin-
ce D. A. Electrophysiological proper-
ties of neocortical neurons in vitro. —
J. Neurophysiol., 1982, vol. 48 N 6,
p. 1302—1320.
Constant! S., Galvan M. M-current in
voltage-clamped olfactory cortex neu-
rons. — Neurosci. Lett., 1983, vol. 39,
N I, p. 65—70.
Conway E. J. New light on the active
sodium transport from skeletal mus-
cle. — Fed. Proc., 1964, vol. 23, N 3,
pt I, p- 681—683.
Corrigal W. A., Lucato R. A simple modi-
fication to permit fast-flow perfusion
of brain slices. — Brain Res. Bull.,
1980, vol. 5, N 4, p. 481—482.
Cox D. W. G., Headley M. H., Wat-
kins J. C. Action of L- and D-homo-
cysteate in rat CNS: a correlation
between low-affinity uptake and the
time courses of excitation by micro-
electrophoretically applied L-gluta-
mate analogues. — J. Neurochem.,
1977, vol. 29, N 3, p. 579—588.
Cox D. W. G., Osborne R. H., Wat-
kins J. C. Action of L-glutamate and
related amino acids on oxygen uptake,
lactate production and NADH levels of
rat brain in vitro. — J. Neurochem.,
1977, vol. 29, N 5, p. 1127—1130.
Davies L. P., Johnston G. A. R. Uptake
and release of D- and L-aspartate by
rat brain slices. — J. Neurochem.,
1976, vol. 26, N 5, p. 1007—1014.
Deadwyler S. A., Dudek F. E., Cot-
man C. W., Lynch G. Intracellular
responses of rat dentate granule cells
in vitro: posttetanic potentiation to per-
forant path stimulation. — Brain Res.,
1975, vol. 88, N I, p. 80—85.
DeScarnati О. C., Sato M., Robertis E.
Action of aspartate on the 32P incorpo-
ration into phospholipids of cerebral
cortex. — Neurochem. Res., 1982,
vol. 7, N 2, p. 213—220.
Dingledine R., Dodd J., Kelly J. S. The in
vitro brain slice as a useful neurophy-
siological preparation for intracellular
recording. — J. Neurosci. Meth., 1980,
vol. 2, N 4, p. 323—362.
Dingledine R., Langmoen L. A. Conduc-
tance changes and inhibitory actions
of hippocampal recurrent IPSPs. —
Brain Res., 1980, vol. 185, N 2,
p. 277—287.
Dingledine R., Gjerstad L. Reduced inhi-
bition during epileptiform activity in
the in vitro hippocampal slice. —
J. Physiol. (Gr. Brit.), 1980, vol. 305
p. 297—303.
Dingledine R., Somjen G. Calcium de-
pendance of synaptic transmission in
117
the hippocampal slice. — Brain Res.,
1981, vol. 207, N 1, p. 218—222.
Hxon M. Manometric methods. Cam-
bridge: Cambridge Univ. Press, 1951.
358 p.
lolezal V., Tucek S. Utilization of citrate
acetylcholine, acetate, piruvate and
glucose for the synthesis of acetylcho-
line in rat brain slices. — J. Neuro-
chem., 1981, vol. 36, N 4, p. 1323—
1330.
Dore C. F., Richards C. D. An improved
chamber for maintaining mammaliam
brain tissue slices for electrical recor-
ding.— J. Physiol. (Gr. Brit.), 1974,
vol. 239, p. 83—85.
Dray A., Hanley M. R., Pinnock R. D.,
Sandberg В. E. B. A comparison of the
release of substance P and some syn-
thetic analogues from micropipettes by
microiontophoresis or pressure. —
Neuropharmacology, 1983, vol. 22, № 7,
p. 859—863.
Dudar J. D. In vitro excitation of hippo-
campal pyramidal cell dendrites by
glutamic acid. — J. Neuropharmacol.,
1974, vol. 13, N 10/!!, p. 1083—1089.
Duffy C. J., Teyler T. H. A simple
tissue slicer. — Physiol, and Behav.,
1975, vol. 14, N 4, p. 525—526.
Duffy T. E., Howce D. C., Plum F. Cere-
bral energy metabolism during experi-
mental status epilepticus. — J. Neuro-
chem., 1975, vol. 24, N 5, p. 925—934.
Dunlop D. S., Elden W. van, Lajtha A.
Measurement of rate of protein synthe-
sis in rat brain slices. — J. Neuro-
chem., 1974, vol. 22, N 5, p. 821—830.
Dunlop D. S., Elden W. van, Lajtha A.
Optimal conditions for protein synthe-
sis in incubated slices of rat brain. —
Brain Res., 1975, vol. 99, N 2, p. 303—
318.
Dunlop D. S., Elden W. van, Plucinska 1.,
Lajtha A. Brain slice protein degrada-
tion and development. — J. Neuro-
chem., 1981, vol. 36, N 1, p. 258—265.
Dunwiddie T., Lynch G. Long-term po-
tentiation and depression of synaptic
responses in the rat hippocampus: loca-
lization and frequency dependency. —
J. Physiol. (Gr. Brit.), 1978, vol. 276,
p. 353—367.
Dunwiddie T., Lynch G. S. The relation-
ship between extracellular calcium
concentration and induction of hippo-
campal long-term potentiation. —
Brain Res., 1979, vol. 169, N 1, p. 102—
110.
Effects ot anoxia on the stimulated re-
lease of amino acid neurotransmitters
118
in the cerebellum in vitro./Bosley T. M.,
Woodnams P. L., Gordon R. D. et al.—
J. Neurochem., 1983, vol. 40, N 1,
p. 189—201.
Elliott К. A. C. The use of brain slices. —
In: Handbook of neurochemistry.
New York: Plenum Press, 1969, vol. 2,
p. 103—114.
Enuis С., Cox B. GABA enhancement
of 3H-dopamine release from slices of
rat striatum: dependence on slices
size. — Eur. J. Pharmacol., 1981,
vol. 70, N 3, p. 417—420.
Fan S. G., Lee С. M., Assaf S Y., Iver-
sen L. L. Endogenous GABA release
from slices of rat cerebral cortex and
hippocampus in vitro. — Brain Res.,
1982, vol. 235, N 2, p. 265—270.
Farese R. V. Phosphoinositide metabo-
lism and hormone action. — Endocri-
nol. Rev., 1983, vol. 4, N 1, p. 78—95.
Fertziger A., Ranck J. Potassium accu-
mulation in interstitial space during
epileptiform seizures. — Exp. Neurol.,
1970, vol. 27, p. 571—585.
Fishman R. A., Reiner M., than P. H.
Metabolic changes associated with iso-
osmotic regulation in brain cortex sli-
ces.— J. Neurochem., 1977, vol. 28,
N 5, p. 1061 — 1067.
Folch J., Leen M., Stoane-Stanley G. H.
A simple method for the isolation and
purification total lipid from animal tis-
sue.— J. Biol.Chem., 1957, vol. 266,
N 1, p. 497—499.
Franck G. Exchanges cationiques au ni-
veau des neurones et des cellules gird-
les du cerveau. — Arch, intern, phy-
siol. et biochem., 1970, t. 78, N 4, p. 613
—866.
Fricke R. A., Prince D. A. Electrophy-
siology of dentate gyrus granule cells.
— J. Neurophysiol., 1984, vol. 51, N 2,
p. 195—209.
Fricke U. Tritosol: a new scintillation
cocktail based on triton X 100. — Ana-
lyt. Biochem., 1975, vol. 63, N 2,
p. 555—558.
Fujii T. Effects of cooling on guinea pig
olfactory cortex maintained in vitro. —
Electroencephalogr. and clin. Neuro-
physiol., 1977, vol. 43, N 2, p. 238—247.
Fujii T., Mu ray am a K., Ibata Y. Deve-
lopmental changes of action potentials
olfactory cortex slice of guinea-pig. —
J. Physiol. Soc. Jap., 1977, vol. 39,
N 1, p. 59—61.
Fujii T., Murayama K., Ibata Y. The post-
natal development of cortical struc-
tures and electrical activities in the
guinea pig olfactory cortix slice. —
Brain Res., 1978, vol. 142, N 3, p. 546—
550.
Fujii T., Yoshizaki K. Temperature in-
fluence on the development of electri-
cal activities in mammalian brain slice
during incubation. —Jap. J. Physiol.,
1976, vol. 26, N 4, p. 355 365.
Fujiwara H., Fujii Y., Tanaka C. Labeled
norepinephrine uptake and release in
rat globus pallidus. — Brain Res.,
1983, vol. 279, N 1—2, p. 127—132.
Gainer H., Alweis C. L., Chaikoff I. L.
Precursors of CO2 produced by rat
brain slices stimulated electrically and
by 2,4-dinitrophenol. — J. Neurochem.
1962, vol. 9, N 7—8, p. 432—
442.
Galvan M., Scholfield C. N. Cellular
uptake of y-aminobutyric acid influen-
ces its potency on neurones of olfactory
cortex in vitro. — J. Physiol. (Gr.
Brit.), 1978, vol. 284, p. 129—130.
Ghosh H. K., Mukherji B., Sloviter H. A.
Metabolism of isolated rat brain perfu-
sed with glucose or mannose as sub-
strate. — J. Neurochem., 1972, vol. 19,
N 5, p. 1279—1286.
Gibson I. M., McIlwain H. Continuous
recording of changes in membrane po-
tential in mammalian cerebral tissues
in vitro; recovery after depolarization
by added substances. — J. Physiol.,
1965, vol. 176, N 2, p. 261—283.
Gibson G. E., Peterson C. Neurotran-
smitter and carbohydrate metabolism
during senencence. — Exp. Brain Res.,
suppl., 1982, N 5, p. 133—139.
Gibson G. E., Peterson C. Acetylcholine
and oxidative metabolism in septum
and hippocampus in vitro. — J. Biol.
Chem., 1983 vol. 258, № 2, p. 1142—
1145.
Godfraind J. M., Kelly J. S. Intracel-
lular recording from thin slices of the
lateral geniculate nucleus of rats and
cats. — In: Electrophysiology of isola-
ted mammalian CNS preparations.
London etc: Acad. Press, 1981,
p. 257—284.:
Gold R., Roddatz H., Bluth R., Oel-
ner W. Dopaminergic and GABAergic
control of acetylcholine release from
slices of rat nucleus accumbens. —
Wiss. Z. Humboldt — Univ. Berlin,
Math.-naturwiss. Res., 1982, vol. 31,
N 5, p. 525.
Grewaal D.. S., Quastel J. H. Control
of synthesis and release of radioactive
acetylcholine in brain slices from the
rat. — Biochem. J., 1973, vol. 132, N 1,
p. 1 — 14.
Grossi E., Paoletti P., Paoletti R. The in
vitro and in vivo effects of chlorprom-
azine on brain lipid sinthesis. — J. Ne-
urochem., 1960, vol. 6, N 1, p. 73—75.
Haas H. L., Schaerer B., Vosmansky M.
A simple perfusion chamber for the
study of nervous tissue slices in vitro.
J. Neurosci. Meth., 1979, vol. I N 4
p. 323—325.
Hablitz J. Picrotoxin-induced epilepti-
form activity in hippocampus: role of
endogenous versus synaptic factors.—
J. Neurophysiol., 1984, vol. 51, N 5,
p. 1011 — 1027.
Hamlet M. A., Rorie D. К., Tyce G. M.
Release of endogenous catecholamines
from slices of hypothalamus of rats. —
Brain Res., 1981, vol. 217, N 2 p. 315—
325.
Harris К. M., Teyler T. J. Developmental
onset of long-term potentiation in area
CAI of the rat hippocampus. — J. Phy-
siol. (Gr. Brit.), 1984, vol. 346, p. 27—
48.
Harvey J. A,, Scholfield C. N.. Brown D. A.
Evoked surface-positive potentials in
isolated mammalian olfactory cor-
tex. — Brain Res., 1974, vol. 76, N 2,
p. 235—245.
Hatton G. I., Doran A. D., Salm A. K.
Brain slice preparation: hypothala-
mus. — Brain Res. Bull., 1980, vol. 5,
N 4, p. 405—414.
Hawkins R. A., Mans A. M. Interme-
diary metabolism of carbohydrates
and other fuels (in brain). — In: Hand-
book of Neurochemistry. New York:
Plenum, 1983, vol. 3, p. 259—294.
Heald P. J.. McIlwain H. Techniques in
tissue metabolism: 4. Apparatus for
maintaining and rapidly transferring
tissue sections. — Biochem. J., 1956
vol. 63, N 2, p. 231—235.
Heilbronn E. The effect of phospholipases
on the uptake of atropine and acetyl-
choline by slices of mouse brain cortex.
— J. Neurochem., 1969 vol. 16, N 4,
p. 627—635.
Heimer L. The secondary olfactory con-
nection in mammals, reptiles and
sharks. — Ann. N.-Y. Acad. Sci., 1969
vol. 169, N 1, p. 129—146.
Hertz L. Potassium effects on ions trans-
port in brain slices. —J. Neurochem.
1968, vol. 15, N 1, p. 1 — 16.
Hild W. L., Tasaki I. Morphological
and physiological properties of neu-
rons and glial cells in tissue culture. —
J. Neurophysiol., 1962, vol. 25, N 2,
p. 277—304.
Hillman H. H.. McIlwain H. Membrane
119
potentials in mammalian cerebral tis-
sues in vitro: dependence on ionic
environment. — J. Phvsioi. (Gr. Brit.),
1961, vol. 157, p. 263—278.
Hokin M. R. Effect of norepinephrine
on 32P incorporation into individual
phosphatides in slices from different
areas of the guinea-pig brain. —
J. Neurochem., 1969, vol. 16, N 2,
p. 127—134.
Hokin M. R. Effects of dopamine, GABA
and 5-HT on incorporation of 32P into
phosphatides in slices guinea-pig
brain. — J. Neurochem., 1970, vol. 17,
N 3, p. 357—364.
Hokin M. R., Brown D. F. Inhibition by
hexachlorocyclohexane of acetylcho-
line-stimulated phosphatidylinositol
synthesis in cerebral cortex slices and
phosphatidic acid-inosito! transferase
in cerebral cortex particulate fraction.
— J. Neurochem., 1969, vol. 16, N 4,
p. 475—483.
Hokin L. E., Hokin M. R. Effect of
acetylcholine on the turnover of phosp-
horyl units in individual phospholipids
of brain cortex slices. — Biochem. and
Biophys. Acta, 1955, vol. 16, N 2,
p. 229—234.
Hokin L. E., Hokin M. R. Effect of
acetylcholine on phosphate turnover in
phospholipids of brain cortex in vitro.
— Biochem. and Biophys. Acta, 1955,
vol. 16, N 2, p. 229—234.
Hondenghem L. M. Validity of Vmax as
a measure of the sodium currents in
cardiac and nervous tissues. — Bio-
phys. J., 1978, vol. 23, N 1, p. 147—152.
Huxley A. F. Compartmental method in
kinetic analysis. — In: Mineral Meta-
bolism/ Eds. C. L. Comar, F. Bronner.
New York: Acad. Press, 1960, vol. I,
pt A, p. 163—166.
Incorparation of l-14C-palmitic acid into
neutral lipids and phospholipids of rat
cerebral cortex in vitro/ Mixobuchi M.,
Morisaki N., Matsuoka N. et al. —
J. Neurochem., 1982, vol. 38, N 5,
p. 1365—1371.
Intracellular injections of EGTA block
induction of hippocampal long-term
potentiation / Lunch G., Larson J.,
Kelso S., Barrionuevo G. et al. — Na-
ture 1983, vol. 305, N 5936, p. 719—
721.
Itzhaki R. F., Gill D. M. A micro-biuret
method for estimating proteins. —
Anal. Biochem., 1964, vol. 9, N 2,
p. 401—410.
Iversen L. L., Johnston G. A. R. GABA
uptake in rat central nervous system:
120
comparision of uptake in slices and
homogenates and the effects of some
inhibitors. — J. Neurochem., 1971,
vol. 18, N 10, p. 1939—1950.
Iversen L. L., Neal M. J. The uptake
of 3H-GABA by slices of rat cerebral
cortex. — J. Neurochem., 1968, vol. 15,
N 10, p. 1141 — 1149.
Jackisch R., Lumstein A., Hertting G.,
Starke K- Interneurones are probably
not involved in the presynaptic dopa-
minergic control of dopamine release
in rabbit caudate nucleus. — Naunyn-
Schnuedeberg’s Arch. Pharmacol.,
1980, vol. 314, N 2, p. 129—133.
Jahnsen H., Llinas R. Electrophysiolo-
gical properties of guinea-pig thalamic
neurones: an in vitro study. — J. Phy-
siol. (Gr. Brit.), 1984, vol. 349,
p. 205—226.
Joanny P., Barbosa E., Hillman H„ Cor-
riol J. The uptake and efflux of glycine
from rat cerebral cortex slices. — Bio-
chem. J., 1971, vol. 125, N 1, p. 255—
! 260.
Joanny P., Natali J-P., Hillman H., Cor-
riol J. The uptake and efflux of L-phe-
nylalanine and L-tyrosine from rat
brain cerebral cortex slices. — Bio-
chem. J., 1973, vol 136, N 1, p. 77—82.
Johnston G. A. P., Iversen L. L. Glycine
uptake in rat cerebral nervous system
slices and homogenates: evidence for
different uptake system in spinal cord
and cerebral cortex. — J. Neurochem.,
1971, vol. 18, N 10, p. 1951 — 1960.
Jones D. A., McIlwain H. Amino acid
distribution and incorporation into
protein in isolated electrically-stimu-
lated cerebral tissues. — J. Neuro-
hem., 1971, vol. 18, N 1, p. 41 —
58.
Kato H., Ito S., Ogawa T. Electrophysio-
logical properties of neurons of cat
visual cortex studied in vitro. — Neu-
rosci. Lett., 1979a, vol. 13, suppL N 2,
p. 41.
Kato H., Ito S., Ogawa T. Direct evidence
for recurrent inhibition in sliced brain
preparation of the cat’s visual cor-
tex. — Tohoku J. exp. Med., 1979b,
vol. 128, N !, p. 197—198.
Kato H., Ito S., Ogawa T. An improved
technique for preparation of slices of
visual cortex in vitro. — Akita J. Med.,
1981, vol. 7, N 1, p. 237—243.
Kato H., Ogawa T. A technique for
preparing in vitro slices of cat’s visual
cortex for electrophysiological experi-
ments. — J. Neurosci. Meth., 1981,
vol. 4, № !, p. 33—38.
Katz В., Miledi R. A study of spontane-
ous miniature potentials in spinal mo-
toneurons.— J. Physiol. (Gr. Brit.),
1963, vol. 168, p. 389—422.
Keesey J. C., Wallgren H. Movements
of radioactive sodium in cerebral cor-
tex slices in response to electrical sti-
mulation. — Biochem. J., 1965, vol. 95,
N 2, p. 301—310.
Kellogg C., Vernadakis A., Rutledge С. O.
Uptake and metabolism of ^-nor-
epinephrine in the cerebral hemisphe-
res of chick embryos. — J. Neurochem.
1971, vol. 18, № 10, p. 1931 — 1938.
Kerwin R. W., Pycock C. J. GABA inhibi-
tion of glycine release from rat sub-
stantia nigra. — Neurosci. Lett., 1980,
vol. 19, suppl. 5, p. 269.
Kimura H., Naito K-, Nakagawa K.,
Kurigama K. Activation of hexose mo-
nophosphate pathway in brain by elect-
rical stimulation in vitro. — J. Neuro-
chem., 1974, vol. 23, N 1, p. 79—
84.
King L. J., Lowry О. H., Passonnean J. V.,
Venson V. Effect of convulsants on
energy reserves in the cerebral cor-
tex.— J. Neurochem., 1967, vol. 14,
N 7, p. 599—611.
Koerner J., Cotman C. W. A microperfu-
sion chamber for brain slice pharmaco-
logy.— J. Neurosci. Meth., 1983,
vol. 7, N 3, p. 243—251.
Konnerth A., Heinemann U. Presynaptic
involvement in frequency facilitation in
the hippocampal slice. — Neurosci.
Lett., 1983, vol. 42, N 3, p. 255—260.
Kontro P. Effects of cations on taurine,
hypotaurine and GABA uptake in
mouse brain slices. — Neurochem.
Res., 1982, vol. 7, N 11, p. 1391 — 1401.
Kontro P. p-alanine uptake by mouse
brain slices. — Neuroscience, 1983,
vol. 8, N 1, p. 153—159.
Kontro P., Oja S. S Hypotaurine tran-
sport in brain slices: Comparison with
taurine and GABA. — Neurochem.
Res., 1981, vol. 6, N 11, p. 1179—1191.
Korpi E. R. Kinetics of tryptophan influx
into brain slices depleted of sodium
and loaded with L-histidine. — J. Neu-
rochem., 1983a, vol. 40. N 2, p. 428—
433.
Korpi E. R. Effects of sodium fluxes and
ouabain on brain-slice tryptophan
transport. — Acta phvsiol. Scand.,
1983b. vol. 118, N 1, p. 51—55.
Korpi E. R., Oja S. S. Distributive pro-
files of free and protein-incorporated
tryptophan and valine in cerebral cor-
tex slices from adult and 2-day-old
rats. — Brain Res., 1981, vol. 216, N 1,
p. 219—223.
Ksiezak H. J., Gibson G. E. Acetylcholine
synthesis and CO2 production from
variously labeled glucose in rat brain
slices and synaptosomes. — J. Neuro-
chem., 1981, vol. 37, N 1, p. 88—94.
Kukes G., Elul P., De Vellis J. The ionic
basis of the membrane potential in
a rat glial cell line. — Brain Res.,
1976, vol. 104, N 1, p. 71—92.
Kuriyama K., Kanmori H., Taguchi J.,
Yoneda Y. Stress-induced enchance-
ment of suppression of 3H-GABA re-
lease from striatal slices by presynap-
tic autoreceptor.—J. Neurochem.,
1984, vol. 42, N 4, p. 943—950.
Langmoen I. A., Andersen P. The hippo-
campal slice in vitro. A description
of the technique and some examples
of the opportunities it offers. — In:
Electrophysiology of isolated mamma-
lian CNS preparations. London etc.:
Acad. Press, 1981, p. 51 —105.
Lee K., Oliver M., Schottler F., Lynch G,
Electron microscopic studies of brain
slices: the effects of high-frequency sti-
mulation on dendritic ultrastructu-
re. — In: Electrophysiology of isolated
mammalian CNS preparation. London
etc.: Acad. Press, 1981, p. 198—211.
Levi G. Cerebral amino acid transport
in vitro during development: a kinetic
analysis. — Arch. Biochem. and Bio-
phys., 1970, vol. 138, N 1, P- 347—349.
Levi G., Blasberg R., Lajtha A. Substrate
specificity of cerebral amino acid exit
in vitro. — Arch. Biochern. and Bio-
phys., 1966, vol. 114, N 2, p. 339—
351.
Levi G., Kandera J., Lajtha A. Control
of cerebral metabolite levels. 1. Amino
acid uptake and levels in various spe-
cies. — Arch. Biochem. and Biophys.,
1967, vol. 119, N 1—3, p. 303—311.
Levi G., Lajtha A, Cerebral amino acid
transport in vitro. 2. Regional differen-
ces in amino acid uptake by slices
from the central nervous system of the
rat.—J. Neurochem., 1965, vol. 12,
N 7, p. 639—648.
Li C. L., McIlwain H. Maintenance of
resting membrane potentials in slices
of mammalian cerebral cortex and
other tissues in vitro. — J. Physiol.
(Gr. Brit.), 1957, vol 139, p. 178—190.
Lindbohm R,, Wallgren H. Oxidation of
acetate by rat cerebral cortex in vitro
and the effect of stimulation. — J. Ne-
urochem., 1966, vol. 13, N 7, p. 573—
577.
121
Lipton P. Effects of membrane depolari-
zation on nicotinamide nucleotide flu-
orescence in brain slices. — Biochem.
J., 1973, vol. 136, N 4, p. 999—1009.
Lipton P., Heimbach C. J. The effect
of extracellular potassium concentra-
tion on protein synthesis in guinea-
pig hippocampal slices. — J. Neuro-
chem., 1977, vol. 28, N6, p. 1347—1354.
Llinas R., Sugimori M. Electrophysiolo-
gical properties of in vitro Purkinje
cell somata in mammalian cerebellar
slices. — J. Physiol. (Gr. Brit.), 1980a,
vol. 305, p. 171 — 195.
Llinas R., Sugimori M. Electrophysiolo-
gical properties of in vitro Purkinje
cell dendrites in mammalian cerebellar
slices. — J. Physiol. (Gr. Brit.), 1980b,
vol. 305, p. 197—213.
Lowry О. H., Passonnean J. V., Hassel-
berger F. X., Schulz D. W. Effect of
ischemia on known substrates and co-
factors of the glycolytic pathway in
brain. — J. Biol. Chem., 1964, vol. 239,
N 1, p. 18—30.
Lowry О. H., Rosenbrough H. L.,
Farr A. L., Randall R. J. Protein mea-
surement with the Folin phenol rea-
gent. — J. Biol. Chem., 1951, vol. 193,
N 1, p. 265—275.
Lynch G. S., Dunwiddie T., Gribkoff V.
Heterosynaptic depression: a postsy-
naptic correlate of long-term potenti-
ation. — Nature, 1977, vol. 266,
N 5604, p. 737—739.
Lynch G. S., Smith R. L., Browning M. D,
Deadwyler S. Evidence for bidirecti-
onal dendritic transport of horseradish
peroxidase. — Adv. Neirol., 1975,
vol. 12, p. 297—313.
Magee W. L., Berry J. F., Rossiter R. J.
Effect of chlorpromazine and azacyclo-
nol on the labelling of phosphatides in
brain slices. — Biochem. and Biophys.
Acta, 1956, vol. 21, N 2, p. 408—409.
Magee W. L., Pritchard E. T., Strick-
land K. R. Chloropromazine and aza-
cyclonol and the in vitro labelling of
phosphatides in brain preparation. —
Feder. Proc., 1957, vol. 16, N 2, p. 215-
217.
Magee W. L., Rossiter R. J. Incorpora-
tion of inorganic 32P into phospholipids
of brain slices. Effect of certain tran-
quillizing drugs. — Canad. J. Bio-
chem. Physiol., 1963, vol. 41, N 5,
p. 1155—1156.
Manometrische Methoden und ihre An-
wendung in der Biologie und Bioche-
mie / Kleinzeller A., Janacek K., Ko-
tyk A. et al. Jena: Fischer, 1965, 620S.
Margolis R. K-, Lajtha A. Ion dependence
of amino acid uptake in brain slices. —
Biochem. and Biophys. Acta, 1968,
vol. 163, N 3, p. 374—385.
McIlwain H. Chemical exploration of the
brain. Amsterdam: Elsevier, 1963.
198 p.
McIlwain H., Rodnight R. Practical neu-
rochemistry. London: Churchill, 1962.
218 p.
Migani P., Poli A., Contestable A., Bis-
soli A. Effect of cainic acid, glutamate
and aspartate on CO2 production by
Goldfish tectal slices.—J. Neuro-
chem., 1982, vol. 39, N 4 p. 970—
975.
Miller J. J. Characteristics of neuronal
activity in striatal and limbic forebrain
regions maintained in vitro. — In: Ele-
ctrophysiology of isolated mammalian
CNS preparation. London etc.: Acad.
Press, 1981, p. 309—336.
Minchin M. C. W. Compartmentation of
amino acid metabolism in small slices
of rat spinal cord and cerebral cortex.
— Brain Res., 1977, 4vol. 127, N 2,
p. 302—306.
Minchin M. C. W., Williams J., Bow-
dler J. M., Green A. R. Effect of elect-
roconvulsive shock on the uptake and
release of noradrenaline and 5-hydro-
xytryptamine in rat brain slices. —
J. Neurochem., 1983, vol. 40, N 3,
p. 765—768.
Misgeld U., Sarvey J. M., Klee M. R.
Heterosynaptic postactivation potenti-
ation in hippocampal CA3 neurons:
Long-term changes of the postsynaptic
potentials. — Exp. Brain Res., 1979,
vol. 37, fasc. 2, p. 217—229.
Mollevanger W. J., Nijland R., Tie-
len A. M. A multicap brain slice perfu-
sion system. — Progr. Rep. Inst. Med.
Phys., TNO, Utrecht, 1980, N 7,
p. 57—60.
Morazain R. Effect of dichloroisopropy-
lanterenol on respiration, nucleotide-P
and phospholipids af slices of cerebral
cortex. — J. Neurochem., 1970, vol. 17,
N 3, p. 439—440.
Mueller A. L., Hoffer B. J., Dunwid-
die T. V. Noradrenergic responses in
rat hippocampus evidence for media-
tion by a and p receptors in the in vitro
slice. — Brain Res., 1981, vol. 214, N 1,
p. 113—126.
Namima M., Okamoto K-, Sakai Y. Mo-
dulatory action of taurine on the re-
lease of GABA in cerebellar slices of
the guinea pig. — J. Neurochem.,
1983, vol. 40. N 1, p. 1—9.
122
Nicoll R. A., Alger В. Ё. A simple cham-
ber for recording from submerged
brain slices. — J. Neurosci. Meth.,
1981, vol. 4, N 2, p. 153—156.
Nicoll R. A., Eccles J. C., Oshima T.,
Rubia F. Prolongation of hippocampal
inhibitory postsynaptic potentials by
barbiturates. — Nature, 1975, vol. 258,
N 5536, p. 625—627.
Nilsson B. Measurement of overall blood
flow and oxygen consumption in the
rat brain. — Acta Physiol. Scand.,
1974, vol. 92, N 1, p. 142—144.
Noola J., Kimura H., McGeer P, L. Glyco-
lysis in rat neostriatal slices following
kainic acid injection. — Brain Res.,
1981, vol. 214, N 2, p. 451—454.
Norberg K-, Siesjo В. K. Quantitative
measurement of blood flow and oxygen
consumption in the rat brain. — Acta
Physiol. Scand., 1974, vol. 91, N 2,
p. 154—164.
Nordstrom 0., Bartfai T. 8-Br-Cyclic
GMP mimics activation of muscarinic
autoreceptor and inhibite acetylcholine
release from rat hippocampal slices. —
Brain Res., 1981, vol. 213, N 2, p. 467—
471.
Ogata N., Hori N., Katauda N, The cor-
relation between extracellular potas-
sium concentration and hippocampal
epileptic activity in vitro. — Brain
Res., 1976, vol. 110, N 2, p. 371—375.
Ogawa T., Ito S., Kato H. P-cells and I-
cells in in vitro slices of the lateral ge-
niculate nucleus of the cat. — Toho-
ku J. exp. Med., 1980, vol. 130, N 2,
p. 359—368.
Okamoto K-, Quastel J. H. Uptake and
release of glutamate in cerebral cortex
slices from the rat. — Biochem. J.,
1972, vol. 128, N 5, p. 1117—1124.
Okuma Y., Osumi Y. Neurotensin-indu-
ced release of endogenous noradrena-
line from rat hypothalamic slices. —
Life Sci., 1982, vol. 30, N 1, p. 77—
84.
O’Neill J. J., Simon S. H., Shreeve W. W.
Alternative glycolytic pathways in bra-
in. A comparision between the action of
artificial electron acceptors and ele-
ctrical stimulation. — J. Neurochem.,
1965, vol. 12, N 8, p. 797—802.
Orrego F., Lipman F. Protein synthesis
in brain slices. Effect of electrical
stimulation and acidic amino acids. —
J. Biol. Chem., 1967, vol. 242, N 4,
p. 665—671.
Otsuki S., Watanabe K., Ninomiya K.,
Hoaki T. Correlation between U-I4C
glucose metabolism and function in
perfused cat brain. — J. Neurochem.
1968, vol. 15, N 8, p. 859—865.
Otten U. Trans-synaptic regulation of
neuronal enzyme synthesis by nerve
impulses. — Naunyn-Schmiedeberg’s
Arch. Pharmacol., 1979, vol. 308,
suppl., p. R2.
Passive membrane properties of neuro-
nes in the dorsal raphe and periaque-
ductal grey recorded in vitro/Cru-
nelli V., Forda S., Brooks P. A., Wil-
son К. С. P. et al. — Neurosci. Lett
1983, vol. 44, N 3, p. 263—268.
Polak R. L,, Molenaar P. C., Gelder M.
van. Acetylcholine metabolism and
choline uptake in cortical slices. —
J. Neurochem., 1977, vol. 29 N 3
p. 477—485.
Poli A., Migani P., Contestabile A., Bar-
nabei O. Study of differential effects
of cainic acid on metabolic rates, uti-
lizing exogenous and endogenous sub-
strates in rat brain slices. — J. Neuro-
chem., 1983, vol. 41, N 4, p. 989—993.
Possible mechanisms for long-lasting po-
tentiation of synaptic transmission in
hippocampal slices from guinea-pig/
Andersen P., Sundberg S. H., Sve-
en O„ Swann J. W. — J. Physiol. (Gr.
Brit.), 1980, vol. 302, p. 463—482.
Potashner S. J. Evoked release from gui-
nea-pig cerebral cortex slices of endo-
genous 14C-labeled amino acids labe-
led via D- U-14C-glucose. — Canad. J.
Physiol, and Pharmacol.. 1976, vol. 54.
N 6, p. 949—952.
Prives C., Quastel J. H. Effects of cereb-
ral stimulation on the biosynthesis in
vitro of nucleotides and RNA in
brain. — Nature, 1969, vol. 221,
N 5185, p. 1053.
Pumphrey A. M. Incorporation of 32P-
orthophosphate into brain slice phos-
pholipids and their precursos. Effects
of electrical stimulation. — Biochem.
J, 1969, vol. 112, N 1, p. 61—70.
(Purves R.) Первис P. Микроэлек-
тродные методы внутриклеточной ре-
гистрации и ионофореза. М.: Мир,
1983. 208 с.
Quach Т. Т., Rose С., Schwartz J, С.
3H-glycogen hydrolysis in brain slices:
responses to neurotransmitters and
modulation of noradrenaline recep-
tors. — J. Neurochem., 1978, vol. 30,
N 6, p. 1335—1341.
Rawlins J. N. P., Green K- F. Lamellar
organization in the rat hippocam-
pus. — Exp. Brain Res., 1977, vol. 28,
fasc. 3—4, p. 335—344.
Reith M. E., Schotman P., Lureten B. J.
123
van, Gispen W. H. The nature of the
amino acid pool used for protein syn-
thesis in rat brain slices. — J. Neuro-
chem., 1979, vol. 32, N 2, p. 413—420.
Richards C. D. On the mechanism of
halothane anaesthesia. — J. Physiol.
(Gr. Brit.), 1973, vol. 233, p. 439—456.
Richards C. D. Evidence of localization
of glutamate receptors in layer 1A of
dendritic field of neurones in the pre-
piriform cortex. — In: Iontophoresis
and transmitter mechanisms in the
mammalian central nervous system.
Elsevier: Amsterdam, 1978, p. 185—
187.
Richards C. D. The preparation of brain
tissue for electrophysiological stu-
dies. — In: Electrophysiology of isola-
ted mammalian CNS preparations.
London etc.: Acad. Press, 1981,
p. 107—132.
Richards C. D., Sercombe R. Calcium,
magnesium and the electrical activity
of guinea-pig olfactory cortex in vit-
ro. — J. Physiol. (Gr. Brit.), 1970,
vol. 211, p. 571—584.
Richards C. D., Tegg W. J. B. A super-
fusion chamber suitable for maintai-
ning mammalian brain tissue slices
for electrical recording. — Brit. J.
Pharmacol., 1977, vol. 59, N 3, p. 526.
Richter J. A., Marchbanks R. M. Synthe-
sis of radioactive acetylcholine from
3H-choline and its release from central
cortex slices in vitro. — J. Neurochem.,
1971, vol. 18, N 5, p. 691—703.
Richter J. A., Werling L. L. K-stimu-
lated acetylcholine release: inhibition
by several barbiturates and hydrate
but not by ethanol, chlordiazepoxidae
or 1 l-OH-A9-tetrahydrocannabinol. —
J. Neurochem., 1979, vol. 32, p. 935—
941.
Robertson J. S. Mathematical treatment
of uptake and release of indicator
substances in relation to flow analysis
in tissues and organs. — In: Hand-
. book of physiology. Washington:
Amer. Physiol. Soc., 1962, sect. 2,
vol. 2, p. 617—644.
Rodnight R., McIlwain H. Techniques in
tissue metabolism. 3. Study of tissue
fragments with little or no added
aqueous phase and in oils. — Biochem.
J., 1954, vol. 57, N 4, p. 649—661.
Roiieston F. S., Newsholme E. A. Cont-
. rol of glycolysis in cerebral cortex
slices. — Biochem. J., 1967, vol. 104,
N 2, p. 524—533.
Sachs W. Cerebral metabolism in vivo.—
In: Handbook of neurochemistry. New
York: Plenum Press, 1983, vol. 3,
p. 321—351.
Sandberg M., Corazzi L. Release of endo-
genous amino acids from superior col-
liculus of the rabbit: in vitro studies
after retinae ablation.—J. Neuro-
chem., 1983, vol. 40, N 4, p. 917—921.
Schliccker E., Huth H., Gothert M. Al-
pha-adrenoceptor-mediated modula-
tion of serotonin release from slices
of the rat brain cortex: Characteriza-
tion of the receptor subtype invol-
ved. — Naunyn-Schmiedeberg’s Arch.
Pharmacol., 1981, vol. 316, suppl.,
p. 66.
Schoepp D. D., Azzoro A. J. Alteration
of dopamine synthesis in rat striatum
subsequent to selective type A mono-
amine oxidase inhibition. —J. Neuro-
chem., 1981, vol. 37, N 2, p. 527—530.
Schoffelmeer A. N., Mulder A. H. ^-no-
radrenaline release from brain slices
induced by an increase in the intra-
cellular sodium concentration: role of
intracellular calcium stores. — J. Neu-
rochem., 1983, vol. 40, N 3, p. 615—
621.
Scholfield C. N. Electrical properties of
neurones in the olfactory cortex slice in
vitro. — J. Physiol. (Gr. Brit.), 1978a,
vol. 275, p. 535—546.
Scholfield C. N. A depolarizing inhibi-
tory potential in neurones of the ol-
factory cortex in vitro. — J. Physiol.
(Gr. Brit.), 1978b, vol. 275, p. 547—
557.
Scholfield C. N. Intracellular and extra-
cellular recordings in the isolated ol-
factory cortex slice and some problems
associated with assessing drug ac-
tion. — In: Electrophysiology of isola-
ted mammalian CNS preparations.
London etc.: Acad. Press, 1981,
p. 133—152.
Schwartzkroin P. A. Characteristics of
CAI neurons recorded intracellularly
in the hippocampal in vitro slice pre-
paration. — Brain Res., 1975, vol. 85,
N 3, p. 423—436.
Schwartzkroin P. A. To slice or not to
slice. — In: Electrophysiology of isola-
ted mammalian CNS preparations.
London etc.: Acad. Press, 1981, p. 15—
50.
Schwartzkroin P. A., Andersen P. Gluta-
mic acid sensitivity of dendrites in hip-
pocampal slices in vitro. — Adv. Neu-
rol., 1975, vol. 12, p. 45—51.
Schwartzkroin P. A., Prince D. A. Cel-
lular and field potential properties of
epileptogenic hippocampal slices. —
124
Brain Res., 1978, vol. 147, N 1, p. 117—
130.
Schwartzkroin P. A., Wester K. Long-
lasting facilitation of a synaptic poten-
tial following tetanization in the in
vitro hippocampal slice. — Brain Res.,
1975, vol. 89, N 1, p. 107—119.
Siniscalchi A., Veratti E. Effetto della
morfine sui contenuto di dopamine
e 5-HT in fettine di nucle caudato di
cavia. — Boll. soc. Ital. biol. sper.,
1982, t. 58, N 9, p. 567—571.
Skerritt J. M., Johnston G. A. R. Uptake
and release of N-methyl-2-aspartate
bv rat brain slices. — J. Neurochem.,
1981, vol. 36, N 3, p. 881—885.
Sloviter H. A., Shinikin P., Suhara K-
Glycerol as a substrate for brain meta-
bolism.— Nature, 1966, vol. 210,
N 5043, p. 1334—1336.
Smith S. E. Kinetics of neutral amino
acid transport in rat brain in vitro. —
J. Neurochem., 1967, vol. 14, N 3,
p. 291—300.
Snow R. W., Taylor С. P., Dudek F. E.
Electrophysiological and optical chan-
ges in slices of rat hippocampus during
spreading depression. — J. Neurophy-
siol.. 1983, vol. 50, N 3, p. 561—572.
Snyder S. H., Hendley E. D., Gfeller E.
Regional differences in accumulation
of tritium-labelled norepinephrine, 5-
hydroxytryptamine and gamma-ami-
nobutyric acid in brain slices of spider
and rhesus monkey. — Brain Res.,
1969, vol. 16, N 2, p. 469—477.
Solomon A. K. Compartmentai methods
of kinetic analysis. — In: Mineral me-
tabolism. New York: Acad. Press,
1960, vol. 1, pt A, p. 133—162.
Spencer H. J., Gribkoff V. K-, Cot-
man C. W., Lynch G. S. CDEE antago-
nism of iontophoretic amino acid exci-
tations in the intact hippocampus and
in the hippocampal slice preparation.—
Brain Res., 1976, vol. i05, N 3, p. 471 —
481.
Stadie W. C., Riggs В. C. Microtome
for the preparation of tissue slices for
metabolic studies of surviving tissues
in vitro. — J. Biol. Chem., 1944,
vol. 154, N 4, p. 687—690.
Sterling G. H., McCafferty M. R.,
O’Neill J. J. p-hydroxybutyrate as
a precursor to the acetyl moiety of ace-
tylcholine.— J. Neurochem., 1981,
vol. 37, N 5, p. 1250—1259.
Synaptic triggering of epileptiform di-
scharges in CAI pyramidal cells in
vitro/Gjerstad L., Andersen P., Lang-
moen I. A. et al. — Acta physiol.
Scand., 1981, vol. 113, N 2, p. 245—
252.
Sze-Chun Cheng, Brunner E. A. Altera-
tion of tricarboxylic acid cycle meta-
bolism in rat brain slices by ha-
lothane.— J. Neurochem., 1978, vol. 30,
N 6, p. 1421 — 1430.
Takagaki G. Control of aerobic glycolysis
and pyruvate kinase activity in ce-
rebral cortex slices. — J. Neurochem.,
1968, vol. 15, N 9, p. 903—916.
Takagaki G., Hirano S., Nagata Y. Some
observations on the effect of d-gluta-
mate on the glucose metabolism and
the accumulation of potassium ions in
brain cortex slices. — J. Neurochem.,
1959, vol. 4, N 2, p. 124—134.
Takahashi T. Intracellular recording
from visually identified motoneurons
in rat spinal cord slices. — Proc. Roy.
Soc. London, 1978, ser. B, vol. 202,
N 1148, p. 417—421.
Tews J. K., Bradford A. M., Harper A. E.
Induction of lysine imbalance in rats:
relation to competition for lysine trans-
port into the brain in vitro. — J. Nut-
rition, 1981, vol. Ill, N 6, p. 954—967.
Teyler T. J. Brain slice preparation:
Hippocampus. — Brain Res. Bull.,
1980, vol. 5, N 4, p. 391—404.
Teyler T. J., Alger В. E. Monosynaptic
habituation in the vertebrate forebrain:
the dentate gyrus examined in vitro. —
Brain Res., 1976, vol. 115, N 3, p. 413—
425.
Teyler T. J-, Alger В. E., Bergman T.,
Livingston K. A comparison of long-
term potentiation in the in vitro and in
vivo hippocampal preparations. — Be-
hav. Biol., 1977, vol. 19, N 1, p. 24—34.
Thaugnipon W., Storm-Mathisen J. K+-
evoked Ca2+-dependent release of D-
3H-aspartate from terminals of the cor-
ticopontine pathways. — Neurosci.
Lett., 1981, vol. 23, N 2, p. 181 — 186.
Thews G. Ein Verfahren zur Bestimmung
des O2-Diffusionskoeffizienten der O2-
Leitfahigkeit und des O.2-Loslichkeit-
koeffizienten im Gehirngewebe. —
Pfliiger’s Arch. ges. Physiol., 1960,
Bd 271, N 2, S. 227—244.
Thorpe W. H. Learning and instinct in
animals. London: McMillan, 1956.
493 p.
Tielen A. M., Mollevanger W. J. Prepa-
ration of and measurements in brain
slices. — Progr. Rep. Inst. Med. Phys.
TNO, 1982, N 8, p. 22—31.
Tielen A. M., Mollevanger W. J., Lopes
da Silva, Hollander C. F. Effect of
aging on neuronal plasticity. — Progr.
125
Rep. Inst. Med. Phys. TNO, 1982, N 8
p. 44—53.
Tildon J. T., Roeder L. M. Glycerol oxi-
dation in rat brain: subcellular locali-
zation and kinetic characteristics. —
,1. Neurosci. Res., 1980, vol. 5, N 1,
p. 7—17.
Toggenburger G., Henke H. Potassium
stimulated release of amino acids from
piceon tectal and rat cerebellar cor-
tex. — Neurosci. Lett., 1981, vol. 24,
suppl. 7, p. 67.
Tsukada Y., Nagata Y., Hirano S., Mat-
sutani T. Active transport of amino
acid into cerebral cortex slices. — J.
Neurochem., 1963, vol. 10, N 4,
p. 241—256.
Tucek S., Dolezal V., Sullivan A. C. Inhi-
bition of the synthesis of acetylcho-
line in rat brain slices by ( — )-hydro-
xycitrate and citrate. — J. Neuro-
chem., 1981, vol. 36, N 4, p. 1331 —
1337.
Turner R. W., Baimbridge K. G., Mil-
ler J. J. Calcium-induced long-term
potentiation in the hippocampus. —
Neuroscience 1982, vol. 7 N 6,
p. 1411 — 1416.
Turner R. W., Miller J. J. Effects of
extracellular calcium on low frequency
induced potentiation and habituation
in the in vitro hippocampal slice pre-
paration. — Canad. J. Physiol, and
Pharmacol. 1982, vol. 60, N 3, p. 266—
275.
Tursky T., Lassanova M. The effect of
Ca2 + -free medium on the two different
tricarboxylate cycles in rat brain cor-
tex slices. — Physiol. Bohemosl., 1981,
vol. 30, N 1, p. 11 — 17.
(Umbreit W. W., Burris R. H., Schtauf-
fer G. F.) Умбрейт В. В., Буррис Р. X.,
Штауффер Дж. Ф. Манометрические
методы изучения тканевого обмена.
М.: ИЛ, 1951. 421 с.
Van Liew Н. Graphic analysis of aggre-
gates of linear and exponential proces-
ses.— J. Theor. Biol., 1967, vol. 16,
N 1, p. 343—353.
Veech R. L., Hawkins R. A. Brain blo-
wing: a technique for in vivo study of
brain metabolism. — In: Research
methods in neurochemistry. New York;
London: Plenum Press, 1974, p. 171 —
182.
Vogt B. A., Gorman A. L. F. Responses
of cortical neurons to stimulation of
corpus callosum in vitro. — J. Neuro-
physiol., 1982, vol. 48. N 6, p. 1257—
1273.
Weiler M., Roed 1. S., Whittaker V. P.
The kinetics of acetylcholine turnover
in a resting cholinergic nerve terminal
and the magnitude of the cytoplasmic
compartment.—J. Neurochem., 1982,
vol. 38, N 5, p. 1187—1191.
Weiss G. B., Hertz L., Goodman F. R.
Drug-induced alterations in respira-
tion of rat brain cortex and striatum
slices in a carbon dioxide-bicarbo-
nate-buffered medium. — Biochem.
Pharmacol., 1972, vol. 21, N 5, p. 625—
634.
Werner J., Schoffelmeer A. N. M., Mul-
der A. H. Effects of cyclic AMP analo-
gues and phosphodiesterase inhibitors
on K+-induced 3H-noradrenaline rele-
ase from rat brain slices and on its
presynaptic a-adrenergic modula-
tion.— J. Neurochem., 1982, vol. 39,
N 2, p. 349—356.
Westbrook G. L., Lothman E. W. Cellu-
lar and synaptic basis of kainic acid-
induced hippocampal epileptiform acti-
vity. — Brain Res., 1983, vol. 273, N 1,
p. 97—109.
Wheal H. V. Characteristics of CAI cells
in the rat hippocampus in vitro. An
evaluation of a silicon chip extracellu-
lar microelectrode array (SCEMA
9). — In: Electrophysiology of isolated
mammalian CNS preparations. Lon-
don etc.: Acad. Press, 1981, p. 213—
231.
White W. F., Nadler J. V., Cotman C. W.
A perfusion chamber for the study of
CNS physiology and pharmacology in
vitro. — Brain Res., 1978, vol. 152,
N 3, p. 591—596.
White W. F., Nadler J. V., Cotman C. W.
Analysis of short-term plasticity at the
perforant path-granule cells sy-
napse.— Brain Res., 1979, vol. 178,
N 1, p. 41—53.
Whittam R., Blond D. M. Respiratory-
control by an adenosine—triphospha-
tase involved in active transport in
brain cortex. — J. Biochem., 1964,
vol. 92, N 1, p. 147—158.
Wieraszko A. Stimulation dependent up-
take of glutamic acid by hippocampal
slices. — Brain Res., 1981, vol. 207,
N 1, p. 209—213.
Wigstrom H., Gustaffson B. Heterosy-
naptic modulation of monosynaptic
long-lasting potentiation in the hippo-
campal slice. — Acta physiol. Scand.,
1983, vol. 119, N 4, p. 455—458.
Wong R. K. S., Prince D. A. Dendritic
mechanisms underlying penicillin-in-
duced epileptiform activity. — Science,
1979, vol. 204, N 4398, p. 1228—1231.
126
Wong R. К- S., Prince D. A., Basbaum A.
Intradendritic recordings in hippocam-
pal neurons. — Proc. Nat. Acad. Sci.
USA, 1979, vol. 76, N 2, p. 986—990.
Wong R. K. S„ Traub R. D. Synchroni-
zed burst discharge in disinhibited hip-
pocampal slice. I. Initiation in CA2—
CA3 region.—J. Neurophysiol., 1983,
vol. 49, N 2, p. 442—458.
Woody C. D., Gruen E., McCarley K.
Intradendritic recordings from neu-
rons of motor cortex of cats. — J. Neu-
rophysiol., 1984, vol. 51, N 5, p. 925—
938.
Yaari Y., Konnerth A., Heinemann II.
Spontaneous epileptiform activity of
CAI hippocampal neurons in low
extracellular calcium solutions.— Exp.
Brain Res., 1983, vol. 51, fasc. 1,
p. 153—156.
Yamamoto C. Activation of hippocampal
neurons by mossy fiber stimulation in
thin brain sections in vitro. — Exp.
Brain Res., 1972a, vol. 14, fasc. 4,
p. 423—435.
Yamamoto C. Intracellular study of sei-
zure-like afterdischarges elicited in
thin hippocampal sections in vitro. —
Exp. Neurol., 1972b, vol. 35, N 1,
p. 154—164.
Yamamoto C. Actions of glutamic acid
on cerebellar neurons. — In: Iontopho-
resis and transmitter mechanisms in
the mammalian central nervous sy-
stem. Amsterdam: Elsevier, 1978,
p. 197—199.
Yamamoto C. Quantal analysis of exci-
tatory postsynaptic potentials induced
in hippocampal neurons by activation
of granule cells. — Exp. Brain Res.,
1982, vol. 46, fasc. 1, p. 170—176.
Yamamoto C., Chujo T. Long-term po-
tentiation in thin hippocampal sections
studied by intracellular and extracel-
lular recordings. — Exp. Neurol.,
1978a, vol. 58, N 2, p. 242—250.
Yamamoto C., Chujo T. Visualization of
central neurons and recording of ac-
tion potentials. — Exp. Brain Res.,
1978b, vol. 31, fasc. 2, p. 299—301.
Yamamoto C., Matsui S. Effect of stimu-
lation of excitatory nerve tract of re-
lease of glutamic acid from olfactory
cortex slices in vitro. — J. Neuro-
chem., 1976, v. 26 № 3, p. 487—
491.
Yamamoto C., Matsumoto K-, Takagi M.
Potentiation of excitatory postsynaptic
potentials during and after repetitive
stimulation in thin hippocampal sec-
tions. — Exp. Brain Res., 1980,
v. 38, fasc. 4, p. 469—477.
Yamamoto C., Sawada S. The amoumt of
transmitter released from the optic
nerve terminal in thin slices from the
lateral geniculate nucleus in vitro. —
In: Electrophysiology of isolated mam-
malian CNS preparations. London
etc.: Acad. Press, 1981a, p. 233—255.
Yamamoto C., Sawada S. Important fac-
tors in induction of long-term potentia-
tion in thin hippocampal sections. —
Exp. Neurol., 1981b, vol. 74, N 1
p. 122—130.
Yamashita H., Inenaga K- Electrophysio-
logical characteristics of supraoptic
neurons in rat hypothalamic slice pre-
paration. — Appetite, 1983, vol. 4, N 3,
p. 234.
Yotsumoto J., Nomura Y. Ontogenesis of
the dopamine uptake into P2 fractions
and slices of the rat brain. — Jap. J.
Pharmacol., 1981, vol. 31, N2, p. 298—
300.
ПЕРЕЖИВАЮЩИЙ СРЕЗ МОЗГА
КАК ОБЪЕКТ НЕЙРОФИЗИОЛОГИЧЕСКОГО
И НЕЙРОХИМИЧЕСКОГО ИССЛЕДОВАНИЯ
В серии: Методы
физиологических исследований
Утверждено к печати
Отделением физиологии
Академии наук СССР
Редактор издательства А. Н. Князев
Художник И. П. К р ем л ев
Технические редакторы Л. И. К а р я е в а,
Е. М. Черножукова
Корректоры Г. А. Александрова
и С. В. Добрянская
ИБ № 21498
Сдано в набор 15.11.85. Подписано к пе-
чати 06.03.86. М-18598. Формат 60 Х90'/1б- Бумага
офсетная № 1. Гарнитура литературная. Печать
офсетная. Фотонабор. Усл. печ. л. 8. Усл. кр.-отт.
8.25. Уч.-изд. л. 9.12. Тираж 1100. Тин. зак. 1012.
Цена 1 р. 40 к.
Ордена Трудового Красного Знамени
издательство «Наука». Ленинградское отделение.
199034, Ленинград, В-34, Менделеевская линия, 1.
Ордена Трудового Красного Знамени
Первая типография издательства «Наука».
199034, Ленинград, В-34, 9 линия, 12.